JPWO2003000286A1 - 好酸球増多性疾患治療薬 - Google Patents
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Abstract
ＣＤ３０及び／又はＣＤ３０のシグナル伝達に関与する分子を介して好酸球アポトーシスを誘導する物質を有効成分とする好酸球増多性疾患治療剤。該治療剤はアレルギー疾患、呼吸器疾患、皮膚疾患、自己免疫疾患、免疫不全疾患、消化器疾患、腫瘍性疾患及び寄生虫感染性疾患に有効である。
Description
技術分野
本発明は、ＣＤ３０及び／又はＣＤ３０のシグナル伝達に関与する分子を介して好酸球アポトーシスを誘導する物質を有効成分とする、末梢血中又は組織中に増加した好酸球に起因する好酸球増多性疾患の治療薬又は治療方法等に関する。
背景技術
炎症の病態では、肥満細胞、リンパ球、好酸球、好塩基球等複数の炎症性細胞が複数のメディエーターを介して、複雑なネットワークを形成し組織障害をもたらしている。従来の炎症治療、特にアレルギー炎症治療は特異的ＩｇＥによる肥満細胞・好塩基球の脱顆粒／ケミカルメディエーター放出による組織反応、即ち炎症性細胞の遊走・浸潤・活性化をいかに阻止するかに主眼を置いてきた。また、減感作療法、脱顆粒阻害・ケミカルメディエーター遊離抑制薬、ケミカルメディエーター拮抗薬はアレルギー炎症治療に大きく貢献してきた。このＩｇＥ依存性メカニズムの抑制は、アレルギー治療の中心であり、現在でも新しいケミカルメディエーターとくにエイコサノイド合成阻害薬・拮抗薬が盛んに開発されている。
一方、近年の研究により、好酸球顆粒タンパクが直接組織障害や炎症を誘導することから、好酸球が炎症反応とくにアレルギー性炎症の中心的な役割を担っていることが明らかとなってきた。即ち、炎症病態における好酸球については、「骨髄での産生亢進」、「病変組織への選択的浸潤及び活性化」、そして「生存期間の延長」が知られている。その結果、生き延びた活性化好酸球の増加に伴い、細胞毒性のある好酸球顆粒タンパクの継続的な放出により重篤な組織障害がもたらされる。また、臨床所見からも、例えば慢性気管支喘息患者の末梢血好酸球増多が観察される。さらに、末梢血好酸球数又は肺胞洗浄液中好酸球数と気道過敏症とは相関すること、症状の改善とともに末梢血好酸球数が正常化することが報告されている。従って、アレルギー疾患、寄生虫感染症、自己免疫疾患など様々な疾患の基本病態は炎症反応であることから、好酸球の制御も炎症の重要な治療目標の一つである。
現在まで、好酸球を標的とした炎症治療の研究としては、「骨髄での産生亢進抑制」、「組織への選択的浸潤抑制」、「遊走阻害」、「活性化（脱顆粒）抑制」、「顆粒タンパク（ＭＢＰ，ＥＰＯ，ＥＣＰ，ＥＤＮ）又は活性酸素種の不活化」等が挙げられ、ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｏｐｏｉｅｔｉｃ ｃｙｔｏｋｉｎｅであるＩＬ−５のシグナル阻止（ＩＬ−５Ｒ抗体、ｓｏｌｕｂｌｅ ＩＬ−５Ｒ又はＩＬ−５抗体）によるアレルギー性炎症に対する臨床応用も進められている。しかし、現在まで、好酸球を標的とする治療法は臨床的には確立されていない。
さらに、炎症局所においてアポトーシスの抑制により好酸球の生存が延長され、増加した活性化好酸球がネクローシス（壊死）にいたり顆粒タンパクが流出することにより炎症が遷延化されること、及びアポトーシス抑制を担うＢｃｌ−２をほとんど発現していない好酸球は、生存を支えるサイトカイン（ＩＬ−３，ＩＬ−５，ＧＭ−ＣＳＦ，ＩＦＮ−γ等）の除去により容易にアポトーシスに誘導されることから、炎症の制御終息における好酸球のアポトーシス誘導が大変魅力ある課題となっている。換言すれば、炎症を終息させるためにはいかに好酸球のアポトーシスを誘導するかが重要である。
以前より好酸球にアポトーシスを誘導できるＴＧＦ−β、抗Ｆａｓ抗体、ＦａｓＬの治療への応用が考えられている。また、ステロイドの抗炎症作用の一部は好酸球に対するアポトーシス誘導であることが示唆されている（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８８：１９８２−１９８７，１９９１）。しかしながら、抗Ｆａｓ抗体投与は劇症肝炎を誘発し副作用が問題である（Ｃｅｌｌ，８８：３５５−３６５，１９９７）、又はステロイドの好酸球に対するアポトーシス誘導はＩＬ−５等により減殺される等の報告がある（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８８：１９８２−１９８７，１９９１）。即ち、現在まで好酸球に対するアポトーシス誘導による好酸球増多性疾患に有効な治療剤や治療方法はない。
一方、ＣＤ３０は１９８２年に、ホジキン病由来のＲｅｅｄ−Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ細胞株Ｌ４２８を抗原として作製された単クローン抗体Ｋｉ−１に認識される細胞表面分子として同定され、ホジキン病細胞特異的な抗原として報告された（Ｎａｔｕｒｅ，２９９：６５，１９８２）。その後、一部の非ホジキンリンパ腫、ａｎａｐｌａｓｔｉｃ ｌａｒｇｅ ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ、悪性黒色腫及び間葉系腫瘍等の腫瘍細胞、各種細胞株、マイトージェンで活性化されたＴ、Ｂ細胞、ウイルス（ＨＩＶ、ＨＴＬＶ−Ｉ，−ＩＩ、ＥＢＶ）によって形質転換したＴ、Ｂ細胞、活性化マクロファージ、活性化ＮＫ細胞、子宮脱落膜細胞等に発現していることが知られている。これまでの解析によりＣＤ３０からのシグナルは、Ｔ細胞の増殖や細胞死、サイトカイン産生の亢進等多岐に渡る作用を示すことが報告されている（Ｂｌｏｏｄ，８３：２０４５，１９９４）がまだ不明な点も多い。ＣＤ３０欠損マウスでは、胸腺のＣＤ４，８ ｄｏｕｂｌｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ細胞数の劇的な増加が観測され、胸腺細胞（自己反応性Ｔ細胞）に対するネガティブセレクションが阻害されていることが示唆されている（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８７：４２７−４３２，１９９８）。ＣＤ３０リガンド結合部位を認識するある種の単クローン抗体自体がａｎａｐｌａｓｔｉｃ ｌａｒｇｅ ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａに対する抗腫瘍効果を示すことが報告されている。従って、ＣＤ３０を介するシグナルはある種の細胞に対してアポトーシスを誘導することが示唆されている（臨床免疫，３４：６７−７１，２０００）。また、ＣＤ３０分子は細胞外ドメインの構造からＴＮＦレセプター（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーのメンバーに属し、ＣＤ３０リガンド（ＣＤ１５３）はＴＮＦスーパーファミリーのメンバーであることが示された。ＣＤ３０の細胞内ドメインはＦａｓなどに認められるｄｅａｔｈ ｄｏｍａｉｎをもたず、２ヶ所のＴＮＦＲ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｆａｃｔｏｒ（ＴＲＡＦ）結合部位をもち、ＴＲＡＦ分子を介してＮＦ−ｋＢを活性化することが報告されている（Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：２０３，１９９８）。
さらに最近、ＣＤ３０のシグナルはリガンドだけでなく、その発現レベルにも依存していること、即ち過剰発現自体により自己活性化を起こしリガンド非依存的にＮＦ−ｋＢを活性化することも報告された（臨床免疫，３４：８１２−８１９，２０００）。ＣＤ３０の発現レベルは細胞種、活性化、分化段階でかなり異なることから、ＣＤ３０の多様な作用の一因は発現レベルの差異によるものと考えられるが、単に発現レベルだけでは説明が付かない場合も多く、それ以外にも細胞内の刺激伝達系などの差違が細胞に与える作用を修飾していることが示唆されている。ＣＤ３０と疾患の関連としては、ホジキン病、ＡＩＤＳ、Ｂ型肝炎、アトピー性疾患、Ｏｍｅｎｎ症候群の患者、又は慢性関節リウマチや全身性エリテマトーデスなどの自己免疫疾患患者で可溶型ＣＤ３０の血清レベルの上昇が挙げられる（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９４：８６７０−８６７４，１９９７，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．，９７，１８２−１９０，１９９９，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃｉ．，１７１：４９−５５，１９９９，Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，４９：６０９−６１３，１９９８，Ｂｒ．Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，１４０：７３−７８，１９９９）。とくに、ホジキン病患者血清中の可溶型ＣＤ３０レベルが上昇していること、アトピー性皮膚炎における血清ＥＣＰ（Ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌ Ｃａｔｉｏｎｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ）レベル、又はＡＩＤＳのステージや予後と血清可溶型ＣＤ３０レベルが相関していることから、これらの疾患へのＣＤ３０の関与が示唆されている。
一方、ホジキン病では好酸球が増加していることも報告されている（Ａｎｎ．Ｏｎｃｏｌ．，８：８９−９６，１９９７，Ｂｌｏｏｄ，９５：１２０７−１２１３，２０００）が、その原因、メカニズムは不明であり、好酸球にＣＤ３０が発現しているという報告はない。したがって、好酸球の増多と可溶型ＣＤ３０レベルの上昇とを結びつけた報告は現在までに全くなされていない。
炎症を終息させるには、好酸球の新たな産生や病変組織への浸潤・活性化の抑制及び活性化好酸球の死滅が必要である。しかし、ネクローシス（壊死）による好酸球の死滅では、細胞膜破壊による顆粒タンパクの漏出により組織がさらに障害を受け炎症が悪化する。従って、本発明は好酸球に対し迅速で強力なアポトーシスを誘導する物質を用いる好酸球増多性疾患に対する治療剤又は治療方法等を提供することを目的とする。
発明の開示
本発明者はかかる課題を解決するべく鋭意検討した結果、抗ヒトＣＤ３０単クローン抗体等によるＣＤ３０を介するシグナルが好酸球に対し迅速で強力なアポトーシスを誘導し、アレルギー疾患を含む好酸球増多性疾患を有効に治療し得ることを新規に見出して、本発明を完成させるに至った。
今日まで、ヒトの末梢血好酸球にＣＤ３０分子が発現していること、及びＣＤ３０を介するシグナルが好酸球に対しアポトーシスを誘導するという生理活性はまったく知られておらず、本発明によって初めて明らかにされたものである。
本発明者は、ＣＤ３０は好酸球のアポトーシスを制御しており、可溶型ＣＤ３０によりアポトーシス誘導が阻害された場合、好酸球増多に起因する疾患や好酸球増多症を発症するとの仮説に基づき鋭意研究を進めた。その結果、ＣＤ３０を介するシグナルがヒト末梢血好酸球に対し選択的にアポトーシスを誘導し、しかも既知のシグナルよりも迅速で強力にアポトーシスを誘導でき、単にＩＬ−５による生存シグナルに対する拮抗ではなくＩＬ−５のシグナル伝達とは独立した経路によるという知見を得て本発明は完成された。詳細は実施例に示すが、ＣＤ３０リガンド結合部位を認識するある種の抗ヒトＣＤ３０単クローン抗体を固相化したプレートにて、ＩＬ−５の共存下ヒト末梢血好酸球を培養すると、５０％以上の好酸球が１−４時間という短時間でアポトーシスに導かれることを見いだした。
従って、ＣＤ３０及び／又はＣＤ３０のシグナル伝達に関与する分子を介して好酸球アポトーシスを誘導する物質が好酸球増多性疾患治療剤になりうるという知見を得て本発明を完成した。
すなわち、本発明としては以下のものを挙げることができる。
（１）ＣＤ３０及び／又はＣＤ３０のシグナル伝達に関与する分子を介して好酸球アポトーシスを誘導する物質を有効成分とする好酸球増多性疾患治療剤。
（２）ＣＤ３０及び／又はＣＤ３０のシグナル伝達に関与する分子を介して好酸球アポトーシスを誘導する物質が、Ｂｅｒ−Ｈ８又はＨＲＳ−４が認識する部位を認識する免疫グロブリン若しくはその活性フラグメント、ペプチド又は低分子化合物である上記（１）記載の好酸球増多性疾患治療剤。
（３）ＣＤ３０及び／又はＣＤ３０のシグナル伝達に関与する分子を介して好酸球アポトーシスを誘導する物質が、免疫グロブリン又はその活性フラグメント（これらは天然由来又は遺伝子組換え技術により得られるものを含む）である上記（１）記載の好酸球増多性疾患治療剤。
（４）少なくとも配列番号１記載のアミノ酸配列（ＣＤ３０のアミノ酸配列のうち、１１２−４１２位のアミノ酸配列）の一部又は全部を認識する免疫グロブリン又はその活性フラグメントである上記（２）記載の好酸球増多性疾患治療剤。
（５）免疫グロブリンがＢｅｒ−Ｈ８又はＨＲＳ−４である上記（４）記載の好酸球増多性疾患治療剤。
（６）ＣＤ３０及び／又はＣＤ３０のシグナル伝達に関与する分子を介して好酸球アポトーシスを誘導する物質が、ＣＤ３０リガンド又はその活性フラグメント（これらは天然由来又は遺伝子組換え技術により得られるものを含む）である上記（１）記載の好酸球増多性疾患治療剤。
（７）ＣＤ３０リガンドがＣＤ１５３である上記（６）記載の好酸球増多性疾患治療剤。
（８）ＣＤ３０及び／又はＣＤ３０のシグナル伝達に関与する分子を介して好酸球アポトーシスを誘導する物質が、ＣＤ３０リガンド又はその活性フラグメントをコードする核酸である上記（１）記載の好酸球増多性疾患治療剤。
（９）核酸が配列番号２（ＣＤ１５３のアミノ酸配列）記載のアミノ酸をコードするＤＮＡである上記（８）記載の好酸球増多性疾患治療剤。
（１０）ＣＤ３０及び／又はＣＤ３０のシグナル伝達に関与する分子を介して好酸球アポトーシスを誘導する物質が、ＣＤ３０リガンドの発現及び／又は分泌している貪食能を有する細胞である上記（１）記載の好酸球増多性疾患治療剤。
（１１）ＣＤ３０及び／又はＣＤ３０のシグナル伝達に関与する分子を介して好酸球アポトーシスを誘導する物質が、貪食能を有する細胞にＣＤ３０リガンドを発現及び／又は分泌させる物質である上記（１）記載の好酸球増多性疾患治療剤。
（１２）ＣＤ３０及び／又はＣＤ３０のシグナル伝達に関与する分子を介して好酸球アポトーシスを誘導する物質が、ＣＤ３０発現調節及び／又は凝集調節能を有する物質である上記（１）記載の好酸球増多性疾患治療剤。
（１３）好酸球増多性疾患が、アレルギー疾患、呼吸器疾患、皮膚疾患、自己免疫疾患、免疫不全疾患、消化器疾患、腫瘍性疾患、奇生虫感染性疾患又は特発性好酸球増加症候群から成る群から選ばれた疾患である上記（１）乃至（１２）記載の好酸球増多性疾患治療剤。
（１４）アレルギー疾患が、薬剤アレルギー、気管支喘息、アレルギー性鼻炎から成る群から選ばれた疾患である上記（１３）記載の好酸球増多性疾患治療剤。
（１５）呼吸器疾患が、好酸球肺浸潤症である上記（１３）記載の好酸球増多性疾患治療剤。
（１６）皮膚疾患が、アトピー性皮膚炎、蕁麻疹、血管浮腫、乾癬、木村氏病、Ｅｐｉｓｏｄｉｃ ａｎｇｉｏｅｄｅｍａ ｗｉｔｈ ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｉａ、好酸球性膿胞毛胞炎、リンパ腫瘍丘診から成る群から選ばれた疾患である上記（１３）記載の好酸球増多性疾患治療剤。
（１７）自己免疫疾患が、多発性動脈炎、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデスから成る群から選ばれた疾患である上記（１３）記載の好酸球増多性疾患治療剤。
（１８）免疫不全疾患が、高ＩｇＥ症候群、Ｗｉｓｃｏｔｔ−Ａｌｄｒｉｃｈ症候群、Ｏｍｅｎｎ症候群から成る群から選ばれた疾患である上記（１３）記載の好酸球増多性疾患治療剤。
（１９）消化器疾患が、アレルギー性胃腸炎、好酸球性胃腸炎、潰瘍性大腸炎、膵炎から成る群から選ばれた疾患である上記（１３）記載の好酸球増多性疾患治療剤。
（２０）腫瘍性疾患が、ホジキン病である上記（１３）記載の好酸球増多性疾患治療剤。
（２１）寄生虫感染性疾患が、アニサキス症、旋毛虫症、糞線虫症、日本住血吸虫症、肺吸虫症から成る群から選ばれた疾患である上記（１３）記載の好酸球増多性疾患治療剤。
（２２）ＣＤ３０及び／又はＣＤ３０のシグナル伝達に関与する分子を介して好酸球アポトーシスを誘導する物質を投与することからなる好酸球増多性疾患治療方法。
（２３）ＣＤ３０及び／又はＣＤ３０のシグナル伝達に関与する分子を介して好酸球アポトーシスを誘導する物質が、Ｂｅｒ−Ｈ８又はＨＲＳ−４が認識する部位を認識する免疫グロブリン若しくはその活性フラグメント又は低分子化合物を投与することからなる上記（２２）記載の好酸球増多性疾患治療方法。
（２４）ＣＤ３０及び／又はＣＤ３０のシグナル伝達に関与する分子を介して好酸球アポトーシスを誘導する物質が、免疫グロブリン又はその活性フラグメント（これらは天然由来又は遺伝子組換え技術により得られるものを含む）である上記（２２）記載の好酸球増多性疾患治療方法。
（２５）少なくとも配列番号１記載のアミノ酸配列（ＣＤ３０のアミノ酸配列のうち、１１２−４１２位のアミノ酸配列）の一部又は全部を認識する免疫グロブリン又はその活性フラグメントである上記（２３）記載の好酸球増多性疾患治療方法。
（２６）免疫グロブリンがＢｅｒ−Ｈ８又はＨＲＳ−４である上記（２４）記載の好酸球増多性疾患治療方法。
（２７）ＣＤ３０及び／又はＣＤ３０のシグナル伝達に関与する分子を介して好酸球アポトーシスを誘導する物質が、ＣＤ３０リガンド又はその活性フラグメント（これらは天然由来又は遺伝子組換え技術により得られるものを含む）である上記（２２）記載の好酸球増多性疾患治療方法。
（２８）ＣＤ３０リガンドがＣＤ１５３である上記（２７）記載の好酸球増多性疾患治療方法。
（２９）ＣＤ３０及び／又はＣＤ３０のシグナル伝達に関与する分子を介して好酸球アポトーシスを誘導する物質が、ＣＤ３０リガンド又はその活性フラグメントをコードする核酸である上記（２２）記載の好酸球増多性疾患治療方法。
（３０）核酸が配列番号２（ＣＤ１５３のアミノ酸配列）記載のアミノ酸をコードするＤＮＡである上記（２９）記載の好酸球増多性疾患治療方法。
（３１）ＣＤ３０及び／又はＣＤ３０のシグナル伝達に関与する分子を介して好酸球アポトーシスを誘導する物質が、ＣＤ３０リガンドの発現及び／又は分泌している貪食能を有する細胞である上記（２２）記載の好酸球増多性疾患治療方法。
（３２）ＣＤ３０及び／又はＣＤ３０のシグナル伝達に関与する分子を介して好酸球アポトーシスを誘導する物質が、貪食能を有する細胞にＣＤ３０リガンドを発現及び／又は分泌させる物質である上記（２２）記載の好酸球増多性疾患治療方法。
（３３）ＣＤ３０及び／又はＣＤ３０のシグナル伝達に関与する分子を介して好酸球アポトーシスを誘導する物質が、ＣＤ３０発現調節及び／又は凝集調節能を有する物質である上記（２２）記載の好酸球増多性疾患治療方法。
（３４）好酸球増多性疾患が、アレルギー疾患、呼吸器疾患、皮膚疾患、自己免疫疾患、免疫不全疾患、消化器疾患、腫瘍性疾患、寄生虫感染性疾患又は特発性好酸球増加症候群から成る群から選ばれた疾患である上記（２２）乃至（３３）記載の好酸球増多性疾患治療方法。
（３５）アレルギー疾患が、薬剤アレルギー、気管支喘息、アレルギー性鼻炎から成る群から選ばれた疾患である上記（３４）記載の好酸球増多性疾患治療方法。
（３６）呼吸器疾患が、好酸球肺浸潤症である上記（３４）記載の好酸球増多性疾患治療方法。
（３７）皮膚疾患が、アトピー性皮膚炎、蕁麻疹、血管浮腫、乾癬、木村氏病、Ｅｐｉｓｏｄｉｃ ａｎｇｉｏｅｄｅｍａ ｗｉｔｈ ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｉａ、好酸球性膿胞毛胞炎、リンパ腫瘍丘診から成る群から選ばれた疾患である上記（３４）記載の好酸球増多性疾患治療方法。
（３８）自己免疫疾患が、多発性動脈炎、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデスから成る群から選ばれた疾患である上記（３４）記載の好酸球増多性疾患治療方法。
（３９）免疫不全疾患が、高ＩｇＥ症候群、Ｗｉｓｃｏｔｔ−Ａｌｄｒｉｃｈ症候群、Ｏｍｅｎｎ症候群から成る群から選ばれた疾患である上記（３４）記載の好酸球増多性疾患治療方法。
（４０）消化器疾患が、アレルギー性胃腸炎、好酸球性胃腸炎、潰瘍性大腸炎、膵炎から成る群から選ばれた疾患である上記（３４）記載の好酸球増多性疾患治療方法。
（４１）腫瘍性疾患が、ホジキン病である上記（３４）記載の好酸球増多性疾患治療方法。
（４２）寄生虫感染性疾患が、アニサキス症、旋毛虫症、糞線虫症、日本住血吸虫症、肺吸虫症から成る群から選ばれた疾患である上記（３４）記載の好酸球増多性疾患治療方法。
（４３）血中の可溶性ＣＤ３０を測定し、その濃度の増減を指標とすることからなる好酸球増多性疾患の診断方法。
（４４）ＣＤ３０を介する好酸球アポトーシス誘導物質の選別方法であって、以下のステップ：（ア）ＣＤ３０発現細胞に対する抗ＣＤ３０抗体結合の阻害に基づく一次選別、（イ）末梢血、臍帯血又は骨髄由来培養好酸球のアポトーシス誘導に基づく二次選別、及び（ウ）末梢血好酸球のアポトーシス誘導に基づく三次選別、からなる当該選別方法。
発明を実施するための最良の形態
本発明において、ＣＤ３０のシグナル伝達に関与する分子とは、好酸球表面で発現するＣＤ３０に直接又は間接に作用する分子のみならず、ＣＤ３０の細胞内シグナル伝達に関わる分子を意味し、細胞表面から核までの細胞シグナル伝達の各ステップに関与する分子をも意味する。従って、本発明において、ＣＤ３０及び／又はＣＤ３０のシグナル伝達に関与する分子を介して好酸球アポトーシスを誘導する物質とは、細胞外であっても、あるいは細胞内であっても、このような種々のステップにおける各分子に直接又は間接に作用して好酸球アポトーシスを誘導する物質をいう。
ＣＤ３０及び／又はＣＤ３０のシグナル伝達に関与する分子を介して好酸球アポトーシスを誘導する物質としては、抗ＣＤ３０抗体のみならず、好酸球にアポトーシスを誘導できて臨床適用し得る条件を満たす限りにおいてどのような物質であってもよい。例えば、ＣＤ３０リガンド、ＣＤ３０リガンドを発現及び／又は分泌している貪食能を有する細胞、ＣＤ３０発現調節及び／又は凝集調節能を有する物質、貪食能を有する細胞にＣＤ３０リガンドを発現及び／又は分泌させる物質又は後述する選別法で得られるＣＤ３０を介する好酸球アポトーシス誘導物質が挙げられる。
ＣＤ３０リガンドを発現及び／又は分泌している貪食能を有する細胞、ＣＤ３０発現調節及び／又は凝集調節能を有する物質、貪食能を有する細胞にＣＤ３０リガンドを発現及び／又は分泌させる物質も、ＣＤ３０及び／又はＣＤ３０のシグナル伝達に関与する分子を介して好酸球アポトーシスを誘導することが期待できる。なお、ＣＤ３０リガンドを発現及び／又は分泌している貪食能を有する細胞、ＣＤ３０発現調節及び／又は凝集調節能を有する物質、貪食能を有する細胞にＣＤ３０リガンドを発現及び／又は分泌させる物質を選別するには、例えば抗ＣＤ３０リガンド抗体により、貪食細胞の免疫染色、貪食細胞の培養上清中のＣＤ３０リガンドのＥＬＩＳＡを用いることができる。
ＣＤ３０及び／又はＣＤ３０のシグナル伝達に関与する分子を介して好酸球アポトーシスを誘導する物質として好ましいのは、抗ＣＤ３０抗体であるＢｅｒ−Ｈ８又はＨＲＳ−４が認識する部位を認識する免疫グロブリン若しくはその活性フラグメント、ペプチド又は低分子化合物である。Ｂｅｒ−Ｈ８及びＨＲＳ−４はマウス抗ヒトＣＤ３０単クローン抗体として文献（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ １９，４３−４８，２０００）に記載されており、また市販されている（Ｂｅｒ−Ｈ８についてはＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡから、ＨＲＳ−４については、Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ，Ｍａｒｓｅｉｌｌｅｓ，Ｆｒａｎｃｅから入手できる）。
また、ＣＤ３０及び／又はＣＤ３０のシグナル伝達に関与する分子を介して好酸球アポトーシスを誘導する物質として特に好ましいのは、少なくとも配列番号１記載のアミノ酸配列（ＣＤ３０のアミノ酸配列のうち、１１２−４１２位のアミノ酸配列）の一部又は全部を認識する免疫グロブリン又はその活性フラグメントである。特に好ましい免疫グロブリンは抗ＣＤ３０単クローン抗体である。
抗ＣＤ３０単クローン抗体としては、高純度に精製された抗ＣＤ３０単クローン抗体であれば全て使用でき、その由来および種類を問わないが、特に哺乳動物由来の単クローン抗体が好ましい。
単クローン抗体の産生細胞の動物種は哺乳類であれば特に制限されず、ヒト抗体またはヒト以外の哺乳動物由来であってよい。ヒト以外の哺乳動物由来の単クローン抗体としては、その作製の簡便さからウサギあるいはげっ歯類由来の単クローン抗体が好ましい。げっ歯類としては、特に制限されないが、マウス、ラット、ハムスターなどが好ましく例示される。さらに、トランスジェニック動物を用いて作製したヒト抗体も好ましい例である。
このような抗ＣＤ３０単クローン抗体としては、Ｂｅｒ−Ｈ８又はＨＲＳ−４を例示することができるが、これに限定されない。抗ＣＤ３０単クローン抗体は、基本的には公知技術を使用して作製できる。すなわち、ＣＤ３０を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、単クローン抗体産生細胞をスクリーニングすることによって作製できる。
本発明に使用される単クローン抗体は、ハイブリドーマが産生する単クローン抗体に限られるものではなく、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変したものであってもよい。例えば、ヒト以外の哺乳動物、例えば、マウスの単クローン抗体の可変領域とヒト抗体の定常領域と＜ＴＸＦＦＲ＝０００２ ＨＥ＝２５０ ＷＩ＝０８０ ＬＸ＝１１００ ＬＹ＝０３００＞からなるキメラ抗体を使用することができ、このようなキメラ抗体は、既知のキメラ抗体の製造方法、特に遺伝子組換技法を用いて製造することができる。さらに、再構成（ｒｅｓｈａｐｅｄ）したヒト型化抗体を本発明に用いることもできる。これはヒト以外の哺乳動物、たとえばマウス抗体の相補性決定領域によりヒト抗体の相補性決定領域を置換したものであり、その一般的な遺伝子組換手法も知られている。その既知方法を用いて、本発明に有用な再構成ヒト型化抗体を得ることができる。
また、本発明では、ＣＤ３０及び／又はＣＤ３０のシグナル伝達に関与する分子を介して好酸球アポトーシスを誘導する物質として、ＣＤ３０リガンド又はその活性フラグメントであってもよい。好ましいＣＤ３０リガンドとしては、例えば配列番号２のアミノ酸配列を有するヒト由来ＣＤ１５３や配列番号５のアミノ酸配列を有するマウス由来ＣＤ１５３を挙げることができるが、これらに限定されない。さらに、ＣＤ３０及び／又はＣＤ３０のシグナル伝達に関与する分子を介して好酸球アポトーシスを誘導する物質は、ＣＤ３０リガンド又はその活性フラグメントをコードする核酸であってもよい。好ましいＣＤ３０リガンドをコードする核酸としては、例えば配列番号２（ヒト由来ＣＤ１５３のアミノ酸配列）記載のアミノ酸をコードするＤＮＡや配列番号５（マウス由来ＣＤ１５３のアミノ酸配列）記載のアミノ酸をコードするＤＮＡを挙げることができるが、これらに限定されない。
ＣＤ３０及び／又はＣＤ３０のシグナル伝達に関与する分子を介する好酸球アポトーシス誘導物質の選別法の一例としては、ＣＤ３０発現細胞（例えば、Ｌｕｒｋａｔ、Ｋ５６２、ＲＤなど）に対する抗ＣＤ３０抗体（例えば、ＨＲＳ−４、Ｂｅｒ−Ｈ８、ＹＭＳＭ６３６．４．１０など）結合の阻害に基づく一次選別、末梢血、臍帯血又は骨髄由来培養好酸球のアポトーシス誘導に基づく二次選別、及び末梢血好酸球のアポトーシス誘導に基づく三次選別による選別法が挙げられるが、これに限定されるものではない。
アポトーシス誘導効果を有しているか否かについては、好酸球細胞がアポトーシス特有の特徴を呈しているか否かを指標にして判断することができる。具体的には、細胞容積の減少、ＤＮＡの断片化、アポトーシス小体の形成などの形態学的特徴の透過電子顕微鏡による観察、あるいは好酸球細胞の生存率を指標にすることができる。細胞容積は、例えばＣｏｕｌｔｅｒ型細胞サイズ解析機による電子的サイズ決定技術により測定できる。ヌクレオソーム間のＤＮＡの断片化はＤＮＡラダーとして検出することができ、アポトーシス検出用の市販のラダー検出キット（例えば、Ｗａｋｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｌｔｄ．，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）を用いることができる。細胞生存率は、例えば比色ＭＴＴアッセイを用いるミトコンドリアデヒドロゲナーゼ活性により評価することができる。ＭＴＴに代えて、ＷＡＴ−１やＷＳＴ−８などのホルマザン試薬を用いることもできる。さらには、生存細胞がトリパンブルーを排除することを用いて細胞生存率を測定できる。あるいは、ＭＥＢＣＹＴＯ−Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｍｅｄｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｎａｇｏｙａ，Ｊａｐａｎ）などの市販キットを用いて、ＦＩＴＣ標識ＡｎｎｅｘｉｎＶの結合したアポトーシス細胞をフローサイトメーター（例えば、ＦＡＣＳｃａｎ Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）にて計測することもできる。
顆粒蛋白の漏出を伴う細胞のネクローシスの場合と異なり、アポトーシス後の好酸球細胞は、細胞膜破壊による顆粒タンパク漏出前にマクロファージ等の食細胞の貪食により無毒化処理を受け、周囲の組織・細胞に障害を生じさせずに除去される。
一般に、アポトーシス細胞に対する食細胞による貪食排除には以下の４つの過程があると考えられている。
１．アポトーシス細胞周辺への食細胞の遊走：炎症局所ではすでに食細胞はアポトーシス細胞と隣接している。
２．食細胞によるアポトーシス細胞の認識：食細胞は貪食受容体を介して、アポトーシス細胞表面上の貪食目印分子を認識する。貪食目印分子としては、フォスファチジルセリン（ＰＳ）が最もよく知られている。貪食受容体としては、ＰＳを認識するクラスＢスカベンジャーレセプタータイプＩ（ＳＲ−ＢＩ）やＬＯＸ−１（ｌｅｃｔｉｎ−ｌｉｋｅ ｏｘｉｄｄｉｚｅｄ ｌｏｗ−ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−１）が同定されている。
３．食細胞によるアポトーシス細胞の取り込み（貪食）：貪食受容体からのシグナルにより食細胞は貪食するが、シグナル伝達機構は不明である。
４．貪食されたアポトーシス細胞のリソゾームなど細胞内器官への輸送、処理。
好酸球増多性疾患の具体例としては、例えば、アレルギー疾患、呼吸器疾患、皮膚疾患、自己免疫疾患、免疫不全疾患、消化器疾患、特発性好酸球増加症候群、腫瘍性疾患（例えば、ホジキン病）及び寄生虫感染性疾患等を挙げることができる。
本発明の好酸球増多性疾患治療剤には、上記のようにして選別されたＣＤ３０及び／又はＣＤ３０のシグナル伝達に関与する分子を介して好酸球アポトーシスを誘導する物質を有効成分として含み、さらに通常の製剤化の際に用いられる担体や賦形剤、その他の添加剤を用いて調製される。
製剤用の担体や賦形剤としては、例えば、乳糖、ステアリン酸マグネシウム、デンプン、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アラビアゴム、オリーブ油、ゴマ油、カカオバター、エチレングリコールなどやその他常用されるものをあげることができる。
経口投与のための固体組成物としては、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤などが用いられる。このような固体組成物においては、少なくともひとつの有効成分が少なくともひとつの不活性な希釈剤、例えば、乳糖、マンニトール、ブドウ糖、ヒドロキシプロピルセルロース、微結晶性セルロース、デンプン、ポリビニルピロリドン、メタケイ酸アルミン酸マグネシウムなどと混合される。組成物は、常法にしたがって不活性な希釈剤以外の添加物、例えば、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、繊維素グリコール酸カルシウムのような崩壊剤、グルタミン酸またはアスパラギン酸のような溶解補助剤を含んでいてもよい。錠剤または丸剤は、必要によりショ糖、ゼラチン、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレートなどの糖衣や胃溶性または腸溶性物質のフィルムで被覆してもよいし、２つ以上の層で被覆してもよい。さらに、ゼラチンのような吸収されうる物質のカプセルも含まれる。
経口投与のための液体組成物は、薬剤的に許容される乳濁剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤、エリキシル剤などを含み、一般的に用いられる不活性な希釈剤、例えば精製水、エタノールなどを含んでいてもよい。この組成物は、不活性な希釈剤以外に湿潤剤、懸濁剤のような補助剤、甘味剤、風味剤、芳香剤、防腐剤などを含んでいてもよい。
非経口投与のための注射剤としては、無菌の水性または非水性の溶液剤、懸濁剤、乳濁剤が含まれる。水性の溶液剤、懸濁剤としては、例えば、注射用水および注射用生理食塩液が含まれる。非水性の溶液剤、懸濁剤としては、例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、エタノールのようなアルコール類、ポリソルベート８０（登録商標）などが含まれる。このような組成物は、さらに防腐剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤（例えば、乳糖）、溶解補助剤（例えば、グルタミン酸、アスパラギン酸）のような補助剤を含んでいてもよい。これらは、例えば、精密ろ過膜によるろ過滅菌、高圧蒸気滅菌のような加熱滅菌、あるいは、殺菌剤の配合などの通常の滅菌方法によって無菌化することが可能である。注射剤は溶液製剤であっても、使用前に溶解再構成するために凍結乾燥したものであってもよい。凍結乾燥のための賦形剤としては例えばマンニトール、ブドウ糖などの糖アルコールや糖類を使用することが出来る。
また、本発明の治療剤を遺伝子治療に用いる場合にはウイルスベクター、好ましくはレンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、更に好ましくはアデノウイルスベクター、又は化学合成リポソーム、ウイルスエンベロープ、若しくはウイルスエンベロープと合成リポソームの複合体等公知の遺伝子治療に適した媒体に、宿主細胞内で機能するようなプロモーター配列、例えばサイトメガロウイルスプロモーター（ＣＭＶｐｒｏｍｏｔｅｒ）等、の下流に、ＣＤ３０及び／又はＣＤ３０のシグナル伝達に関与する分子を介して好酸球アポトーシスを誘導する物質に係る核酸を組み込んだものを用いることができる。
本発明の好酸球増多性疾患治療剤は、医薬に一般に使用されている投与方法、例えば、経口投与方法、又は非経口投与方法によって投与するのが好ましい。有効成分が抗体である場合には通常非経口投与経路で、例えば注射剤（皮下注、静注、筋注、腹腔内注など）、経皮、経粘膜、経鼻、経肺などで投与されるが、経口投与も可能である。
本発明の製剤中に含まれる有効成分であるＣＤ３０及び／又はＣＤ３０のシグナル伝達に関与する分子を介して好酸球アポトーシスを誘導する物質の量は、治療すべき疾患の種類、疾患の重症度、患者の年齢などに応じて決定できるが、一般には最終投与濃度で０．０１〜５００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．１〜２００ｍｇ／ｍｌである。
産業上の利用可能性
本発明は、ＣＤ３０及び／又はＣＤ３０のシグナル伝達に関与する分子を介し好酸球アポトーシスを誘導する物質は好酸球増多性疾患の治療薬として有用であり、また、ＣＤ３０を介した好酸球アポトーシス誘導は新たな機序に基づく、好酸球増多性疾患に対する治療方法として有用である。このような疾患としては、好酸球が中心的な役割を担っている基本病態が炎症反応である、アレルギー疾患、寄生虫感染症、自己免疫疾患等が例示される。
本発明の好酸球増多性疾患治療薬は、従来好酸球のアポトーシスを誘導するとされている抗Ｆａｓ抗体と比較して、ヒト末梢血好酸球に対してはるかに迅速かつ強力にアポトーシスを誘導することができる。また、好酸球に対するアポトーシス誘導の細胞特異性が極めて高く、好中球、リンパ球、マスト細胞にはアポトーシスを誘導しない。さらには、本発明の好酸球増多性疾患治療薬の好酸球に対するアポトーシス誘導はＩＬ−５等により減殺されない。従って、本発明の好酸球増多性疾患治療薬は臨床的に極めて有用な治療薬として期待できる。
実施例
以下、実施例に基づいて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲をこれらの実施例に限定するものではない。
実施例１：ヒト末梢血好酸球におけるＣＤ３０発現解析
ヘパリン採血したヒト末梢血をＰＢＳで希釈し、Ｐｅｒｃｏｌｌ（比重１．０９０ｇ／ｍｌ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）に重層後、遠心分離（１５００ｒｐｍ，３０分間）した。最下層の顆粒球画分に低温精製水を加え溶血させた。ついで、抗ＣＤ１６抗体固相化ｍａｇｎｅｔｉｃ ｂｅａｄｓ（ＭＡＣＳ ＣＤ１６ ｍｉｃｒｏ ｂｅａｄｓ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｂｅｒｇｉｓｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いたｎｅｇａｔｉｖｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎにより好酸球画分を得た。好酸球の生存率（ｔｒｙｐａｎ ｂｌｕｅ ｄｙｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ法、ナカライ社製）及び純度（ＤＩＦＦ−ＱＵＩＣＫ染色、国際試薬株式会社製）はそれぞれ９９％以上であった。
分離したヒト好酸球を２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｔｕｂｅに調製し、１次抗体として、６種のマウス抗ヒトＣＤ３０単クローン抗体又はコントロールマウスＩｇＧ（１０μｇ／ｍｌ）を４℃にて３０分反応させた。洗浄後、２次抗体としてＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウスＩｇＧＦ（ａｂ’）２を用いて染色（４℃にて３０分反応）し、１％パラホルムアルデヒドにて固定後、フローサイトメーター（ＦＡＣＳｃａｎ Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）にて検出した。ＩＬ−５（１ｎｇ／ｍｌ，Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｉｎｅｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）で活性化（３７℃，３０分）した好酸球について同様に検討した。マウス抗ヒトＣＤ３０単クローン抗体としては、ＨＲＳ−４（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ，Ｍａｒｓｅｉｌｌｅｓ，Ｆｒａｎｃｅ）、Ｂｅｒ−Ｈ２（ＤＡＫＯ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）、Ｂｅｒ−Ｈ８（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ＡＣ−１０（Ａｎｃｅｌ，Ｂａｙｐｏｒｔ，ＭＮ）、１Ｇ１２（ＹＬＥＭ Ａｖｅｚｚａｎｏ，Ｒｏｍａ，Ｉｔａｌｙ）及びＫｉ−１（ＹＬＥＭ Ａｖｅｚｚａｎｏ，Ｒｏｍａ，Ｉｔａｌｙ）を、コントロールマウスＩｇＧとしてはＭＯＰＣ−２１（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を用いた。
６人の末梢血提供者の好酸球をフローサイトメトリーにより解析した結果、ヒト末梢血好酸球はＨＲＳ−４およびＡＣ１０により有意に染色され、ＣＤ３０発現が確認された（図１）。なお、ＡＣ１０染色による平均蛍光強度は８．９±３．２であり、好酸球におけるＣＤ３０発現はＩＬ−５受容体α鎖の発現と同程度であることが判明した。ＩＬ−５により活性化した場合は、ＡＣ−１０により有意な発現が観察され、またＨＲＳ−４又はＢｅｒ−Ｈ８により、発現増加傾向が認められた（図２）。
実施例２：ヒト末梢血好酸球におけるＣＤ３０ ｍＲＮＡ発現解析
ヒト末梢血好酸球をＩｓｏｇｅｎ（Ｎｉｐｐｏｎ Ｇｅｎｅ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）により溶解し、ＲＮＡを抽出後、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）のキットを用いてｃＤＮＡへ逆転写した。ヒトＣＤ３０遺伝子の３’−非翻訳領域を認識する上流域センスプライマー（５’−ＧＣＣ ＣＡＧ ＧＡＴ ＣＡＡ ＧＴＣ ＡＣＴ ＣＡＴ−３’）（配列番号３）及び下流域アンチセンスプライマー（５’−ＴＡＣ ＡＣＧ ＴＣＴ ＧＡＡ ＧＧＣ ＣＣＴ ＡＧＧ−３’）（配列番号４）を用い、サーマルサイクラー（Ｇｅｎｅ Ａｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００；ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）により５０１ｂｐの断片をＰＣＲ反応（９４℃１分１サイクルで変性、９４℃１分／５５℃１分／７２℃２分４０サイクル、最後に７２℃１０分１サイクルで伸長）により増幅した。反応終了後、０．０５％ ｅｔｈｉｄｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ（Ｓｉｇｍａ）を含む０．８％アガロースゲル（ＢＲＬ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）で電気泳動したところ、約５００ｂｐのバンドとして目的のＰＣＲ産物を確認した。ヒト末梢血好酸球にはＣＤ３０ ｍＲＮＡが発現していることが示された（図３）。
実施例３：ヒト末梢血好酸球に対する抗ヒトＣＤ３０単クローン抗体によるアポトーシス誘導の検討
抗ヒトＣＤ３０単クローン抗体をＰＢＳにより種々の濃度（０．０１，０．１，１及び１０μｇ／ｍｌ）に調製し、２４穴マイクロプレート（Ｃｏｓｔａｒ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）に１ｍｌ添加後、４℃にて１２時間静置し固相化した。洗浄後、１％ヒト血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）２ｍｌを添加し、３７℃にて２時間ブロッキングした。洗浄後、１０％ＦＣＳ，１０−５Ｍ ２−メルカプトエタノール（ＧＩＢＣＯ），Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（ＧＩＢＣＯ）及び１ｎｇ／ｍｌヒト組換えＩＬ−５（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を含むＩＭＤＭ（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ、ＧＩＢＣＯ）培地にて１ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調製した分離ヒト末梢血好酸球を加えた。３７℃、４時間培養後、細胞を集め洗浄後、アポトーシス細胞をＭＥＢＣＹＴＯ−Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｍｅｄｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｎａｇｏｙａ，Ｊａｐａｎ）にて検出した。ＦＩＴＣ標識ＡｎｎｅｘｉｎＶの結合したアポトーシス細胞をフローサイトメーター（ＦＡＣＳｃａｎ Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）にて計測した。
その結果、抗ヒトＣＤ３０単クローン抗体ＨＲＳ−４及びＢｅｒ−Ｈ８は濃度依存的にヒト末梢血好酸球に対してアポトーシスを誘導した。ＨＲＳ−４は１及び１０μｇ／ｍｌの濃度で固相化した場合、それぞれ１６．３％及び７８．８％の好酸球に、Ｂｅｒ−Ｈ８は０．０１，０．１，１及び１０μｇ／ｍｌの濃度で固相化した場合、それぞれ７．８％，１１．４％，４４．８％及び７１．９％の好酸球にアポトーシスを誘導した（図４）。なお、抗ヒトＣＤ３０単クローン抗体Ｂｅｒ−Ｈ２，ＡＣ１０，１Ｇ１２及びＫｉ１，ならびにコントロールマウスＩｇＧはヒト末梢血好酸球に対してアポトーシスをまったく誘導しなかった。
実施例４：抗ヒトＣＤ３０単クローン抗体によるヒト末梢血好酸球アポトーシス誘導における好酸球提供者の個人差の検討
３人の末梢血から分離した好酸球に対する抗ヒトＣＤ３０単クローン抗体のアポトーシス誘導能を検討した。抗ヒトＣＤ３０単クローン抗体は１０μｇ／ｍｌの濃度で固相化した。いずれの提供者の末梢血好酸球に対しても、抗ヒトＣＤ３０単クローン抗体ＨＲＳ−４及びＢｅｒ−Ｈ８は強力にアポトーシスを誘導した（図５：３人の平均値を示す）。従って、ＨＲＳ−４及びＢｅｒ−Ｈ８の末梢血好酸球アポトーシス誘導能には、好酸球提供者による個人差はないことが示された。なお、抗ヒトＣＤ３０単クローン抗体Ｂｅｒ−Ｈ２，ＡＣ１０，１Ｇ１２及びＫｉ１，ならびにコントロールマウスＩｇＧはいずれの提供者の好酸球に対してもアポトーシスを誘導しなかった。
実施例５：抗ヒトＣＤ３０単クローン抗体ＨＲＳ−４及びＢｅｒ−Ｈ８によるヒト末梢血好酸球アポトーシス誘導の経時変化
分離ヒト末梢血好酸球に対する抗ヒトＣＤ３０単クローン抗体ＨＲＳ−４及びＢｅｒ−Ｈ８のアポトーシス誘導の経時変化を検討した。ＨＲＳ−４及びＢｅｒ−Ｈ８を１０μｇ／ｍｌの濃度で固相化したプレートに好酸球を添加して培養した場合、いずれの抗体も１時間後にはほぼ５０％の好酸球にアポトーシスを誘導し、４時間後までにはアポトーシス好酸球は７０％まで増加した（図６）。従って、ＨＲＳ−４及びＢｅｒ−Ｈ８は末梢血好酸球に対して非常に迅速にアポトーシスを誘導することが判明した。
実施例６：抗ヒトＣＤ３０単クローン抗体ＨＲＳ−４及びＢｅｒ−Ｈ８によるヒト末梢血好酸球アポトーシス誘導（ＤＮＡ断片化を指標）
分離ヒト末梢血好酸球に対する抗ヒトＣＤ３０単クローン抗体ＨＲＳ−４及びＢｅｒ−Ｈ８のアポトーシス誘導をＤＮＡ断片化を指標として検討した。ＨＲＳ−４及びＢｅｒ−Ｈ８を１０μｇ／ｍｌの濃度で固相化したプレートに好酸球を添加して２４時間培養後、細胞を回収し、アポトーシスラダー検出キット（Ｗａｋｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｌｔｄ．，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）を用いてＤＮＡを抽出し、アガロース電気泳動にてＤＮＡ断片化を検討した。
ＨＲＳ−４及びＢｅｒ−Ｈ８はいずれも好酸球ＤＮＡの断片化を誘導した（図７）。なお、抗ヒトＣＤ３０単クローン抗体Ｂｅｒ−Ｈ２及びコントロールマウスＩｇＧはいずれも好酸球ＤＮＡの断片化を誘導しなかった。従って、ＨＲＳ−４及びＢｅｒ−Ｈ８のヒト末梢血好酸球に対するアポトーシス誘導はＤＮＡ断片化を指標とした場合でも確認できた。
実施例７：抗ヒトＣＤ３０単クローン抗体ＨＲＳ−４及びＢｅｒ−Ｈ８と抗ヒトＦａｓ単クローン抗体とのヒト末梢血好酸球アポトーシス誘導能の比較検討
分離ヒト末梢血好酸球に対する抗ヒトＣＤ３０単クローン抗体ＨＲＳ−４及びＢｅｒ−Ｈ８と抗ヒトＦａｓ単クローン抗体（ＣＨ−１１，Ｍｅｄｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｎａｇｏｙａ，Ｊａｐａｎ）とのアポトーシス誘導能を比較検討した。単クローン抗体を１０μｇ／ｍｌの濃度で固相化したプレートに好酸球を添加し、培養した。
ＨＲＳ−４及びＢｅｒ−Ｈ８は培養１時間後にはほぼ５０％の好酸球にアポトーシスを誘導し、４時間後までにはアポトーシス好酸球は７０％まで増加した。一方、抗ヒトＦａｓ単クローン抗体では培養２４時間後からアポトーシス好酸球が出現したが、７２時間後でもあまり増加しなかった（図８）。従って、抗ヒトＣＤ３０単クローン抗体ＨＲＳ−４及びＢｅｒ−Ｈ８は、抗ヒトＦａｓ単クローン抗体に比べて、ヒト末梢血好酸球に対して非常に迅速で、強力にアポトーシスを誘導することが判明した。
実施例８：抗ヒトＣＤ３０単クローン抗体ＨＲＳ−４及びＢｅｒ−Ｈ８のアポトーシス誘導能の細胞選択性の検討
ヘパリン採血したヒト末梢血をＰＢＳで希釈し、Ｐｅｒｃｏｌｌ（比重１．０９０ｇ／ｍｌ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）に重層後、遠心分離（１５００ｒｐｍ，１５分間）した。最下層の顆粒球画分に低温精製水を加え溶血させた。ついで、抗ＣＤ１６抗体固相化ｍａｇｎｅｔｉｃ ｂｅａｄｓ（ＭＡＣＳ ＣＤ１６ ｍｉｃｒｏ ｂｅａｄｓ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｂｅｒｇｉｓｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いたｐｏｓｉｔｉｖｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎにより好中球画分を得た。好中球の生存率は９９％であった。分離ヒト末梢血好中球に対する固相化抗ヒトＣＤ３０単クローン抗体のアポトーシス誘導能をフローサイトメーターにて計測した。
上述した６種の抗ヒトＣＤ３０単クローン抗体はいずれも、好中球に対してアポトーシスを誘導しなかった（図９）。６人の末梢血好中球を用いてさらに検討したが、６種の抗ヒトＣＤ３０単クローン抗体はいずれもアポトーシスを誘導しなかった。
次いで、ヘパリン採血したヒト末梢血にシリカゲル（免疫生物研究所）を添加し、３７℃で１時間作用させマクロファージを除去し、ＰＢＳで希釈後、ＬＳＭ（比重１．０７７ｇ／ｍｌ，ＩＣＮ社製）に重層後、遠心分離（１５００ｒｐｍ，１５分間）し、リンパ球画分を得た。リンパ球の生存率は９９％であった。同様に分離ヒト末梢血リンパ球に対する固相化抗ヒトＣＤ３０単クローン抗体のアポトーシス誘導能をフローサイトメーターにて計測した。好酸球に対してアポトーシスを誘導するＨＲＳ−４及びＢｅｒ−Ｈ８はいずれも、リンパ球に対してはアポトーシスを誘導しなかった（図１０）。
さらに、培養ヒトマスト細胞に対する固相化抗ヒトＣＤ３０単クローン抗体のアポトーシス誘導能をフローサイトメーターにて計測した。好酸球に対してアポトーシスを誘導するＨＲＳ−４及びＢｅｒ−Ｈ８はいずれも、培養ヒトマスト細胞に対してはアポトーシスを誘導しなかった（図１１）。培養ヒトマスト細胞としては、斎藤らの方法（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７，３４３−３５０，１９９６及びＪ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０６，３２１−３２８，２０００）に準じて得た末梢血由来成熟マスト細胞（Ｐ−Ｍａｓｔ）及び臍帯血由来成熟マスト細胞（Ｃ−Ｍａｓｔ）を用いた。
なお、ＣＤ３０陽性ヒト細胞株Ｊｕｒｋａｔ（Ｔ ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ）、Ｋ５６２（ｅｒｙｔｈｒｏｌｅｕｋｅｍｉａ）及びＲＤ（ｒｈａｂｄｏｍｙｏｓａｒｃｏｍａ）に対しても、ＨＲＳ−４及びＢｅｒ−Ｈ８はいずれも、アポトーシスを誘導しなかった。
従って、抗ヒトＣＤ３０単クローン抗体ＨＲＳ−４及びＢｅｒ−Ｈ８はヒト末梢血好酸球に選択的にアポトーシスを誘導することが判明した。
実施例９：抗ヒトＣＤ３０単クローン抗体ＨＲＳ−４及びＢｅｒ−Ｈ８によるヒト末梢血好酸球アポトーシス誘導に対する高濃度ＩＬ−５の影響
これまで、抗ヒトＣＤ３０単クローン抗体ＨＲＳ−４及びＢｅｒ−Ｈ８は、１０ｎｇ／ｍｌのヒト組換えＩＬ−５存在下、ヒト末梢血好酸球に対してアポトーシスを誘導することを確認した。しかし、高濃度のＩＬ−５が存在していれば好酸球自体の生存能が増強され、ＨＲＳ−４及びＢｅｒ−Ｈ８のアポトーシス誘導能は減殺される可能性がある。そこで、０，１，１０及び１００ｎｇ／ｍｌのＩＬ−５存在下、ＨＲＳ−４及びＢｅｒ−Ｈ８によるヒト末梢血好酸球アポトーシス誘導能を検討した。また、好酸球提供者の個人差を考慮し、４人の末梢血好酸球を用いて実施した。
ＨＲＳ−４はＩＬ−５の濃度依存的にアポトーシスを誘導し、ＩＬ−５非存在下ではアポトーシスをまったく誘導せず、１００ｎｇ／ｍｌ存在下でも誘導した。一方、Ｂｅｒ−Ｈ８は、ＩＬ−５の有無に関わらずアポトーシスを誘導した（図１２）。
従って、ＣＤ３０を介するヒト末梢血好酸球アポトーシスのシグナルにはＩＬ−５が関与する経路としない経路が存在していることが示唆された。しかし、少なくとも高濃度のＩＬ−５が存在していてもＨＲＳ−４及びＢｅｒ−Ｈ８のアポトーシス誘導は減殺されないことが判明した。
実施例１０：ヒト末梢血好酸球に対する抗マウスＣＤ３０単クローン抗体のアポトーシス誘導の検討
分離ヒト末梢血好酸球に対する抗マウスＣＤ３０単クローン抗体ＹＭＳＭ６３６．４．１０（Ｓｅｒｏｔｅｃ Ｌｔｄ，Ｏｘｆｏｒｄ ＵＫ）及び２ＳＨ１２−５Ｆ−２Ｄ（ＢＤ ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＵＳＡ）のアポトーシス誘導を検討した。ＹＭＳＭ６３６．４．１０を１０μｇ／ｍｌの濃度で固相化したプレートにヒト好酸球を添加して培養した場合、４時間後にはほぼ３０％の好酸球にアポトーシスを誘導した（図１３）。なお、２ＳＨ１２−５Ｆ−２ＤならびにラットコントロールＩｇＧはアポトーシスをまったく誘導しなかった。
実施例１１：ヒト末梢血好酸球に対するマウスＣＤ３０リガンドのアポトーシス誘導の検討
分離ヒト末梢血好酸球に対するリコンビナントマウスＣＤ３０リガンド（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＵＳＡ）のアポトーシス誘導を検討した。リコンビナントマウスＣＤ３０リガンドを１０及び１００μｇ／ｍｌの濃度で固相化したプレートにヒト好酸球を添加して培養した場合、４時間後にはそれぞれ２８％及び３５％の好酸球にアポトーシスを誘導した（図１４）。
実施例１２：ヒト末梢血好酸球に対するポリスチレンマイクロビーズ固相化抗ヒトＣＤ３０単クローン抗体ＨＲＳ−４及びＢｅｒ−Ｈ８によるアポトーシス誘導の検討
分離ヒト末梢血好酸球に対するポリスチレンマイクロビーズ固相化抗ヒトＣＤ３０単クローン抗体ＨＲＳ−４及びＢｅｒ−Ｈ８によるアポトーシス誘導を検討した。紀太らの方法（Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１８，：６７５−６８６，１９９８）に準じ、０．１Ｍホウ酸緩衝液にて洗浄した直径１．４４４μＭのポリスチレンマイクロビーズ（２．５６％ ｓｏｌｉｄ Ｌａｔｅｘ，Ｓｉｇｍａ）０．５ｍｌに、２００μｇの抗ヒトＣＤ３０単クローン抗体を添加後、４℃１２時間静置し固相化した。洗浄後、２．５％ヒト血清アルブミン０．５ｍｌを添加し、４℃にて２時間ブロッキングした。洗浄後、０．５ｍｌＰＢＳに懸濁し、ポリスチレンマイクロビーズ固相化抗ヒトＣＤ３０単クローン抗体とした。分離ヒト末梢血好酸球２ｘ１０５ｃｅｌｌｓ及びポリスチレンマイクロビーズ固相化ＨＲＳ−４及びＢｅｒ−Ｈ８（１０μｌ）を９６穴Ｕ底マイクロプレート（ＮＵＮＣ社）に加えた。３７℃、４時間培養後、アポトーシス細胞をフローサイトメーターにて計測した。なお、ポリスチレンマイクロビーズは前方散乱光及び側方散乱光のドットブロットにおけるゲーティングにより除外した。
ポリスチレンマイクロビーズ固相化ＨＲＳ−４は２７．９％の好酸球に、Ｂｅｒ−Ｈ８は４４．０％の好酸球にアポトーシスを誘導した（図１５）。なお、ポリスチレンマイクロビーズ固相化抗ヒトＣＤ３０単クローン抗体Ｂｅｒ−Ｈ２ならびにコントロールマウスＩｇＧはヒト末梢血好酸球に対してアポトーシスを誘導しなかった。従って、抗ヒトＣＤ３０単クローン抗体ＨＲＳ−４及びＢｅｒ−Ｈ８はマイクロプレートへの固相化と同様に、ポリスチレンマイクロビーズに固相化した場合でもヒト好酸球に対してアポトーシスを誘導することが判明した。
実施例１３：ポリスチレンマイクロビーズ固相化抗ヒトＣＤ３０単クローン抗体ＨＲＳ−４及びＢｅｒ−Ｈ８によりアポトーシスを誘導されたヒト末梢血好酸球に対する食細胞による貪食試験
ポリスチレンマイクロビーズ固相化抗ＨＲＳ−４及びＢｅｒ−Ｈ８によりアポトーシスを誘導された分離好酸球に対する食細胞による貪食試験を実施した。まず、Ｂｒｏｗｎらの方法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７５：５９８７−５９９６，２０００）に準じ、ヒト臍帯血単核球画分からＣＤ３４陰性細胞を分画し、１０ｎｇ／ｍｌのヒト組換えＭ−ＣＳＦ（Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ−ｃｏｒｏｎｙ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ、Ｒ＆Ｄ社）存在下、７日間培養し、成熟マクロファージを調製した。次いで、ポリスチレンマイクロビーズ固相化抗ＨＲＳ−４及びＢｅｒ−Ｈ８を３０分間反応させアポトーシス誘導途上にある好酸球を、Ｆａｄｏｋらの方法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６：１０７１−１０７７，２００１）に準じ、あらかじめチャンバースライド（ＮＵＮＣ社）上で２４時間培養した臍帯血由来マクロファージによる貪食試験に供した。好酸球単独培養及び好酸球／マクロファージ共培養による４時間後のそれぞれの培養上清中に漏出した好酸球顆粒タンパクＥＤＮ（Ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ）濃度の差を貪食作用の指標とした。ＥＤＮ濃度はＥＬＩＳＡキット（ＭＢＬ社）を用いて測定した。
ポリスチレンマイクロビーズ固相化ＨＲＳ−４及びＢｅｒ−Ｈ８によりアポトーシスを誘導された好酸球は臍帯血由来マクロファージとの共培養により貪食された結果、培養上清中に漏出したＥＤＮは減少した。とくに、ＨＲＳ−４によりアポトーシスを誘導した好酸球に対して、臍帯血由来マクロファージは顕著な貪食作用を示した（図１６）。なお、ポリスチレンマイクロビーズ固相化抗ヒトＣＤ３０単クローン抗体Ｂｅｒ−Ｈ２ならびにコントロールマウスＩｇＧを反応させた好酸球の場合、単独培養、共培養に関わらずＥＤＮ漏出は非常に少なかった。また、ヒト単球系細胞株Ｕ９３７（例えば、ＡＴＣＣから購入可能：ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ−１５９３．２）のマクロファージとしての機能を顕在化させて貪食能を引き出す目的で、１０ｎｇ／ｍｌ ＰＭＡ（Ｐｈｏｒｂｏｌ １２−Ｍｙｒｉｓｔａｔｅ １３−Ａｃｅｔａｔｅ、Ｓｉｇｍａ社）を用いて当該細胞を１時間刺激し、活性化した当該細胞を食細胞とした貪食試験でも同様の結果が得られた（図１７）。
従って、ＨＲＳ−４及びＢｅｒ−Ｈ８によりアポトーシスを誘導されたヒト末梢血好酸球は、細胞膜破壊による顆粒タンパク漏出前にマクロファージ等の食細胞の貪食により無毒化処理を受けることが示唆された。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
図１は、６種のマウス抗ヒトＣＤ３０単クローン抗体又はコントロールマウスＩｇＧを用いたヒト末梢血好酸球におけるＣＤ３０発現解析の結果を示すグラフである。
図２は、ＩＬ−５により活性化した好酸球を用いた場合の、６種のマウス抗ヒトＣＤ３０単クローン抗体又はコントロールマウスＩｇＧを用いたヒト末梢血好酸球におけるＣＤ３０発現解析の結果を示すグラフである。
図３は、ヒト末梢血好酸球におけるＣＤ３０ ｍＲＮＡの発現解析の結果を示す電気泳動の図である。
図４は、ヒト末梢血好酸球に対する抗ヒトＣＤ３０単クローン抗体によるアポトーシス誘導の試験結果を示すグラフである。
図５は、抗ヒトＣＤ３０単クローン抗体によるヒト末梢血好酸球アポトーシス誘導における好酸球提供者の個人差の検討結果を示すグラフである。
図６は、抗ヒトＣＤ３０単クローン抗体ＨＲＳ−４及びＢｅｒ−Ｈ８によるヒト末梢血好酸球アポトーシス誘導の経時変化を示すグラフである。
図７は、抗ヒトＣＤ３０単クローン抗体ＨＲＳ−４及びＢｅｒ−Ｈ８によるヒト末梢血好酸球アポトーシス誘導をＤＮＡ断片化を指標として試験した結果を示す電気泳動の図である。
図８は、抗ヒトＣＤ３０単クローン抗体ＨＲＳ−４及びＢｅｒ−Ｈ８と抗ヒトＦａｓ単クローン抗体とのヒト末梢血好酸球アポトーシス誘導能を比較検討した結果を示すグラフである。
図９は、抗ヒトＣＤ３０単クローン抗体ＨＲＳ−４及びＢｅｒ−Ｈ８の好中球に対するアポトーシス誘導能の検討結果を示すグラフである。
図１０は、抗ヒトＣＤ３０単クローン抗体ＨＲＳ−４及びＢｅｒ−Ｈ８のリンパ球に対するアポトーシス誘導能の検討結果を示すグラフである。
図１１は、抗ヒトＣＤ３０単クローン抗体ＨＲＳ−４及びＢｅｒ−Ｈ８の培養ヒトマスト細胞に対するアポトーシス誘導能の検討結果を示すグラフである。
図１２は、抗ヒトＣＤ３０単クローン抗体ＨＲＳ−４及びＢｅｒ−Ｈ８によるヒト末梢血好酸球アポトーシス誘導に対する高濃度ＩＬ−５の影響を示すグラフである。
図１３は、ヒト末梢血好酸球に対する抗マウスＣＤ３０単クローン抗体（ＹＭＳＭ６３６．４．１０）のアポトーシス誘導の検討結果を示すグラフである。
図１４は、ヒト末梢血好酸球に対するマウスＣＤ３０リガンドのアポトーシス誘導の検討結果を示すグラフである。
図１５は、ヒト末梢血好酸球に対するポリスチレンマイクロビーズ固相化抗ヒトＣＤ３０単クローン抗体ＨＲＳ−４及びＢｅｒ−Ｈ８によるアポトーシス誘導の検討結果を示すグラフである。
図１６は、ポリスチレンマイクロビーズ固相化抗ヒトＣＤ３０単クローン抗体ＨＲＳ−４及びＢｅｒ−Ｈ８によりアポトーシスを誘導されたヒト末梢血好酸球に対する、ヒト臍帯血由来マクロファージによる貪食試験の結果を示すグラフである。
図１７は、ポリスチレンマイクロビーズ固相化抗ヒトＣＤ３０単クローン抗体ＨＲＳ−４及びＢｅｒ−Ｈ８によりアポトーシスを誘導されたヒト末梢血好酸球に対する、ＰＭＡ刺激ヒト単球系細胞株Ｕ９３７細胞による貪食試験の結果を示すグラフである。
本発明は、ＣＤ３０及び／又はＣＤ３０のシグナル伝達に関与する分子を介して好酸球アポトーシスを誘導する物質を有効成分とする、末梢血中又は組織中に増加した好酸球に起因する好酸球増多性疾患の治療薬又は治療方法等に関する。
背景技術
炎症の病態では、肥満細胞、リンパ球、好酸球、好塩基球等複数の炎症性細胞が複数のメディエーターを介して、複雑なネットワークを形成し組織障害をもたらしている。従来の炎症治療、特にアレルギー炎症治療は特異的ＩｇＥによる肥満細胞・好塩基球の脱顆粒／ケミカルメディエーター放出による組織反応、即ち炎症性細胞の遊走・浸潤・活性化をいかに阻止するかに主眼を置いてきた。また、減感作療法、脱顆粒阻害・ケミカルメディエーター遊離抑制薬、ケミカルメディエーター拮抗薬はアレルギー炎症治療に大きく貢献してきた。このＩｇＥ依存性メカニズムの抑制は、アレルギー治療の中心であり、現在でも新しいケミカルメディエーターとくにエイコサノイド合成阻害薬・拮抗薬が盛んに開発されている。
一方、近年の研究により、好酸球顆粒タンパクが直接組織障害や炎症を誘導することから、好酸球が炎症反応とくにアレルギー性炎症の中心的な役割を担っていることが明らかとなってきた。即ち、炎症病態における好酸球については、「骨髄での産生亢進」、「病変組織への選択的浸潤及び活性化」、そして「生存期間の延長」が知られている。その結果、生き延びた活性化好酸球の増加に伴い、細胞毒性のある好酸球顆粒タンパクの継続的な放出により重篤な組織障害がもたらされる。また、臨床所見からも、例えば慢性気管支喘息患者の末梢血好酸球増多が観察される。さらに、末梢血好酸球数又は肺胞洗浄液中好酸球数と気道過敏症とは相関すること、症状の改善とともに末梢血好酸球数が正常化することが報告されている。従って、アレルギー疾患、寄生虫感染症、自己免疫疾患など様々な疾患の基本病態は炎症反応であることから、好酸球の制御も炎症の重要な治療目標の一つである。
現在まで、好酸球を標的とした炎症治療の研究としては、「骨髄での産生亢進抑制」、「組織への選択的浸潤抑制」、「遊走阻害」、「活性化（脱顆粒）抑制」、「顆粒タンパク（ＭＢＰ，ＥＰＯ，ＥＣＰ，ＥＤＮ）又は活性酸素種の不活化」等が挙げられ、ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｏｐｏｉｅｔｉｃ ｃｙｔｏｋｉｎｅであるＩＬ−５のシグナル阻止（ＩＬ−５Ｒ抗体、ｓｏｌｕｂｌｅ ＩＬ−５Ｒ又はＩＬ−５抗体）によるアレルギー性炎症に対する臨床応用も進められている。しかし、現在まで、好酸球を標的とする治療法は臨床的には確立されていない。
さらに、炎症局所においてアポトーシスの抑制により好酸球の生存が延長され、増加した活性化好酸球がネクローシス（壊死）にいたり顆粒タンパクが流出することにより炎症が遷延化されること、及びアポトーシス抑制を担うＢｃｌ−２をほとんど発現していない好酸球は、生存を支えるサイトカイン（ＩＬ−３，ＩＬ−５，ＧＭ−ＣＳＦ，ＩＦＮ−γ等）の除去により容易にアポトーシスに誘導されることから、炎症の制御終息における好酸球のアポトーシス誘導が大変魅力ある課題となっている。換言すれば、炎症を終息させるためにはいかに好酸球のアポトーシスを誘導するかが重要である。
以前より好酸球にアポトーシスを誘導できるＴＧＦ−β、抗Ｆａｓ抗体、ＦａｓＬの治療への応用が考えられている。また、ステロイドの抗炎症作用の一部は好酸球に対するアポトーシス誘導であることが示唆されている（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８８：１９８２−１９８７，１９９１）。しかしながら、抗Ｆａｓ抗体投与は劇症肝炎を誘発し副作用が問題である（Ｃｅｌｌ，８８：３５５−３６５，１９９７）、又はステロイドの好酸球に対するアポトーシス誘導はＩＬ−５等により減殺される等の報告がある（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８８：１９８２−１９８７，１９９１）。即ち、現在まで好酸球に対するアポトーシス誘導による好酸球増多性疾患に有効な治療剤や治療方法はない。
一方、ＣＤ３０は１９８２年に、ホジキン病由来のＲｅｅｄ−Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ細胞株Ｌ４２８を抗原として作製された単クローン抗体Ｋｉ−１に認識される細胞表面分子として同定され、ホジキン病細胞特異的な抗原として報告された（Ｎａｔｕｒｅ，２９９：６５，１９８２）。その後、一部の非ホジキンリンパ腫、ａｎａｐｌａｓｔｉｃ ｌａｒｇｅ ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ、悪性黒色腫及び間葉系腫瘍等の腫瘍細胞、各種細胞株、マイトージェンで活性化されたＴ、Ｂ細胞、ウイルス（ＨＩＶ、ＨＴＬＶ−Ｉ，−ＩＩ、ＥＢＶ）によって形質転換したＴ、Ｂ細胞、活性化マクロファージ、活性化ＮＫ細胞、子宮脱落膜細胞等に発現していることが知られている。これまでの解析によりＣＤ３０からのシグナルは、Ｔ細胞の増殖や細胞死、サイトカイン産生の亢進等多岐に渡る作用を示すことが報告されている（Ｂｌｏｏｄ，８３：２０４５，１９９４）がまだ不明な点も多い。ＣＤ３０欠損マウスでは、胸腺のＣＤ４，８ ｄｏｕｂｌｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ細胞数の劇的な増加が観測され、胸腺細胞（自己反応性Ｔ細胞）に対するネガティブセレクションが阻害されていることが示唆されている（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８７：４２７−４３２，１９９８）。ＣＤ３０リガンド結合部位を認識するある種の単クローン抗体自体がａｎａｐｌａｓｔｉｃ ｌａｒｇｅ ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａに対する抗腫瘍効果を示すことが報告されている。従って、ＣＤ３０を介するシグナルはある種の細胞に対してアポトーシスを誘導することが示唆されている（臨床免疫，３４：６７−７１，２０００）。また、ＣＤ３０分子は細胞外ドメインの構造からＴＮＦレセプター（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーのメンバーに属し、ＣＤ３０リガンド（ＣＤ１５３）はＴＮＦスーパーファミリーのメンバーであることが示された。ＣＤ３０の細胞内ドメインはＦａｓなどに認められるｄｅａｔｈ ｄｏｍａｉｎをもたず、２ヶ所のＴＮＦＲ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｆａｃｔｏｒ（ＴＲＡＦ）結合部位をもち、ＴＲＡＦ分子を介してＮＦ−ｋＢを活性化することが報告されている（Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：２０３，１９９８）。
さらに最近、ＣＤ３０のシグナルはリガンドだけでなく、その発現レベルにも依存していること、即ち過剰発現自体により自己活性化を起こしリガンド非依存的にＮＦ−ｋＢを活性化することも報告された（臨床免疫，３４：８１２−８１９，２０００）。ＣＤ３０の発現レベルは細胞種、活性化、分化段階でかなり異なることから、ＣＤ３０の多様な作用の一因は発現レベルの差異によるものと考えられるが、単に発現レベルだけでは説明が付かない場合も多く、それ以外にも細胞内の刺激伝達系などの差違が細胞に与える作用を修飾していることが示唆されている。ＣＤ３０と疾患の関連としては、ホジキン病、ＡＩＤＳ、Ｂ型肝炎、アトピー性疾患、Ｏｍｅｎｎ症候群の患者、又は慢性関節リウマチや全身性エリテマトーデスなどの自己免疫疾患患者で可溶型ＣＤ３０の血清レベルの上昇が挙げられる（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９４：８６７０−８６７４，１９９７，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．，９７，１８２−１９０，１９９９，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃｉ．，１７１：４９−５５，１９９９，Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，４９：６０９−６１３，１９９８，Ｂｒ．Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，１４０：７３−７８，１９９９）。とくに、ホジキン病患者血清中の可溶型ＣＤ３０レベルが上昇していること、アトピー性皮膚炎における血清ＥＣＰ（Ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌ Ｃａｔｉｏｎｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ）レベル、又はＡＩＤＳのステージや予後と血清可溶型ＣＤ３０レベルが相関していることから、これらの疾患へのＣＤ３０の関与が示唆されている。
一方、ホジキン病では好酸球が増加していることも報告されている（Ａｎｎ．Ｏｎｃｏｌ．，８：８９−９６，１９９７，Ｂｌｏｏｄ，９５：１２０７−１２１３，２０００）が、その原因、メカニズムは不明であり、好酸球にＣＤ３０が発現しているという報告はない。したがって、好酸球の増多と可溶型ＣＤ３０レベルの上昇とを結びつけた報告は現在までに全くなされていない。
炎症を終息させるには、好酸球の新たな産生や病変組織への浸潤・活性化の抑制及び活性化好酸球の死滅が必要である。しかし、ネクローシス（壊死）による好酸球の死滅では、細胞膜破壊による顆粒タンパクの漏出により組織がさらに障害を受け炎症が悪化する。従って、本発明は好酸球に対し迅速で強力なアポトーシスを誘導する物質を用いる好酸球増多性疾患に対する治療剤又は治療方法等を提供することを目的とする。
発明の開示
本発明者はかかる課題を解決するべく鋭意検討した結果、抗ヒトＣＤ３０単クローン抗体等によるＣＤ３０を介するシグナルが好酸球に対し迅速で強力なアポトーシスを誘導し、アレルギー疾患を含む好酸球増多性疾患を有効に治療し得ることを新規に見出して、本発明を完成させるに至った。
今日まで、ヒトの末梢血好酸球にＣＤ３０分子が発現していること、及びＣＤ３０を介するシグナルが好酸球に対しアポトーシスを誘導するという生理活性はまったく知られておらず、本発明によって初めて明らかにされたものである。
本発明者は、ＣＤ３０は好酸球のアポトーシスを制御しており、可溶型ＣＤ３０によりアポトーシス誘導が阻害された場合、好酸球増多に起因する疾患や好酸球増多症を発症するとの仮説に基づき鋭意研究を進めた。その結果、ＣＤ３０を介するシグナルがヒト末梢血好酸球に対し選択的にアポトーシスを誘導し、しかも既知のシグナルよりも迅速で強力にアポトーシスを誘導でき、単にＩＬ−５による生存シグナルに対する拮抗ではなくＩＬ−５のシグナル伝達とは独立した経路によるという知見を得て本発明は完成された。詳細は実施例に示すが、ＣＤ３０リガンド結合部位を認識するある種の抗ヒトＣＤ３０単クローン抗体を固相化したプレートにて、ＩＬ−５の共存下ヒト末梢血好酸球を培養すると、５０％以上の好酸球が１−４時間という短時間でアポトーシスに導かれることを見いだした。
従って、ＣＤ３０及び／又はＣＤ３０のシグナル伝達に関与する分子を介して好酸球アポトーシスを誘導する物質が好酸球増多性疾患治療剤になりうるという知見を得て本発明を完成した。
すなわち、本発明としては以下のものを挙げることができる。
（１）ＣＤ３０及び／又はＣＤ３０のシグナル伝達に関与する分子を介して好酸球アポトーシスを誘導する物質を有効成分とする好酸球増多性疾患治療剤。
（２）ＣＤ３０及び／又はＣＤ３０のシグナル伝達に関与する分子を介して好酸球アポトーシスを誘導する物質が、Ｂｅｒ−Ｈ８又はＨＲＳ−４が認識する部位を認識する免疫グロブリン若しくはその活性フラグメント、ペプチド又は低分子化合物である上記（１）記載の好酸球増多性疾患治療剤。
（３）ＣＤ３０及び／又はＣＤ３０のシグナル伝達に関与する分子を介して好酸球アポトーシスを誘導する物質が、免疫グロブリン又はその活性フラグメント（これらは天然由来又は遺伝子組換え技術により得られるものを含む）である上記（１）記載の好酸球増多性疾患治療剤。
（４）少なくとも配列番号１記載のアミノ酸配列（ＣＤ３０のアミノ酸配列のうち、１１２−４１２位のアミノ酸配列）の一部又は全部を認識する免疫グロブリン又はその活性フラグメントである上記（２）記載の好酸球増多性疾患治療剤。
（５）免疫グロブリンがＢｅｒ−Ｈ８又はＨＲＳ−４である上記（４）記載の好酸球増多性疾患治療剤。
（６）ＣＤ３０及び／又はＣＤ３０のシグナル伝達に関与する分子を介して好酸球アポトーシスを誘導する物質が、ＣＤ３０リガンド又はその活性フラグメント（これらは天然由来又は遺伝子組換え技術により得られるものを含む）である上記（１）記載の好酸球増多性疾患治療剤。
（７）ＣＤ３０リガンドがＣＤ１５３である上記（６）記載の好酸球増多性疾患治療剤。
（８）ＣＤ３０及び／又はＣＤ３０のシグナル伝達に関与する分子を介して好酸球アポトーシスを誘導する物質が、ＣＤ３０リガンド又はその活性フラグメントをコードする核酸である上記（１）記載の好酸球増多性疾患治療剤。
（９）核酸が配列番号２（ＣＤ１５３のアミノ酸配列）記載のアミノ酸をコードするＤＮＡである上記（８）記載の好酸球増多性疾患治療剤。
（１０）ＣＤ３０及び／又はＣＤ３０のシグナル伝達に関与する分子を介して好酸球アポトーシスを誘導する物質が、ＣＤ３０リガンドの発現及び／又は分泌している貪食能を有する細胞である上記（１）記載の好酸球増多性疾患治療剤。
（１１）ＣＤ３０及び／又はＣＤ３０のシグナル伝達に関与する分子を介して好酸球アポトーシスを誘導する物質が、貪食能を有する細胞にＣＤ３０リガンドを発現及び／又は分泌させる物質である上記（１）記載の好酸球増多性疾患治療剤。
（１２）ＣＤ３０及び／又はＣＤ３０のシグナル伝達に関与する分子を介して好酸球アポトーシスを誘導する物質が、ＣＤ３０発現調節及び／又は凝集調節能を有する物質である上記（１）記載の好酸球増多性疾患治療剤。
（１３）好酸球増多性疾患が、アレルギー疾患、呼吸器疾患、皮膚疾患、自己免疫疾患、免疫不全疾患、消化器疾患、腫瘍性疾患、奇生虫感染性疾患又は特発性好酸球増加症候群から成る群から選ばれた疾患である上記（１）乃至（１２）記載の好酸球増多性疾患治療剤。
（１４）アレルギー疾患が、薬剤アレルギー、気管支喘息、アレルギー性鼻炎から成る群から選ばれた疾患である上記（１３）記載の好酸球増多性疾患治療剤。
（１５）呼吸器疾患が、好酸球肺浸潤症である上記（１３）記載の好酸球増多性疾患治療剤。
（１６）皮膚疾患が、アトピー性皮膚炎、蕁麻疹、血管浮腫、乾癬、木村氏病、Ｅｐｉｓｏｄｉｃ ａｎｇｉｏｅｄｅｍａ ｗｉｔｈ ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｉａ、好酸球性膿胞毛胞炎、リンパ腫瘍丘診から成る群から選ばれた疾患である上記（１３）記載の好酸球増多性疾患治療剤。
（１７）自己免疫疾患が、多発性動脈炎、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデスから成る群から選ばれた疾患である上記（１３）記載の好酸球増多性疾患治療剤。
（１８）免疫不全疾患が、高ＩｇＥ症候群、Ｗｉｓｃｏｔｔ−Ａｌｄｒｉｃｈ症候群、Ｏｍｅｎｎ症候群から成る群から選ばれた疾患である上記（１３）記載の好酸球増多性疾患治療剤。
（１９）消化器疾患が、アレルギー性胃腸炎、好酸球性胃腸炎、潰瘍性大腸炎、膵炎から成る群から選ばれた疾患である上記（１３）記載の好酸球増多性疾患治療剤。
（２０）腫瘍性疾患が、ホジキン病である上記（１３）記載の好酸球増多性疾患治療剤。
（２１）寄生虫感染性疾患が、アニサキス症、旋毛虫症、糞線虫症、日本住血吸虫症、肺吸虫症から成る群から選ばれた疾患である上記（１３）記載の好酸球増多性疾患治療剤。
（２２）ＣＤ３０及び／又はＣＤ３０のシグナル伝達に関与する分子を介して好酸球アポトーシスを誘導する物質を投与することからなる好酸球増多性疾患治療方法。
（２３）ＣＤ３０及び／又はＣＤ３０のシグナル伝達に関与する分子を介して好酸球アポトーシスを誘導する物質が、Ｂｅｒ−Ｈ８又はＨＲＳ−４が認識する部位を認識する免疫グロブリン若しくはその活性フラグメント又は低分子化合物を投与することからなる上記（２２）記載の好酸球増多性疾患治療方法。
（２４）ＣＤ３０及び／又はＣＤ３０のシグナル伝達に関与する分子を介して好酸球アポトーシスを誘導する物質が、免疫グロブリン又はその活性フラグメント（これらは天然由来又は遺伝子組換え技術により得られるものを含む）である上記（２２）記載の好酸球増多性疾患治療方法。
（２５）少なくとも配列番号１記載のアミノ酸配列（ＣＤ３０のアミノ酸配列のうち、１１２−４１２位のアミノ酸配列）の一部又は全部を認識する免疫グロブリン又はその活性フラグメントである上記（２３）記載の好酸球増多性疾患治療方法。
（２６）免疫グロブリンがＢｅｒ−Ｈ８又はＨＲＳ−４である上記（２４）記載の好酸球増多性疾患治療方法。
（２７）ＣＤ３０及び／又はＣＤ３０のシグナル伝達に関与する分子を介して好酸球アポトーシスを誘導する物質が、ＣＤ３０リガンド又はその活性フラグメント（これらは天然由来又は遺伝子組換え技術により得られるものを含む）である上記（２２）記載の好酸球増多性疾患治療方法。
（２８）ＣＤ３０リガンドがＣＤ１５３である上記（２７）記載の好酸球増多性疾患治療方法。
（２９）ＣＤ３０及び／又はＣＤ３０のシグナル伝達に関与する分子を介して好酸球アポトーシスを誘導する物質が、ＣＤ３０リガンド又はその活性フラグメントをコードする核酸である上記（２２）記載の好酸球増多性疾患治療方法。
（３０）核酸が配列番号２（ＣＤ１５３のアミノ酸配列）記載のアミノ酸をコードするＤＮＡである上記（２９）記載の好酸球増多性疾患治療方法。
（３１）ＣＤ３０及び／又はＣＤ３０のシグナル伝達に関与する分子を介して好酸球アポトーシスを誘導する物質が、ＣＤ３０リガンドの発現及び／又は分泌している貪食能を有する細胞である上記（２２）記載の好酸球増多性疾患治療方法。
（３２）ＣＤ３０及び／又はＣＤ３０のシグナル伝達に関与する分子を介して好酸球アポトーシスを誘導する物質が、貪食能を有する細胞にＣＤ３０リガンドを発現及び／又は分泌させる物質である上記（２２）記載の好酸球増多性疾患治療方法。
（３３）ＣＤ３０及び／又はＣＤ３０のシグナル伝達に関与する分子を介して好酸球アポトーシスを誘導する物質が、ＣＤ３０発現調節及び／又は凝集調節能を有する物質である上記（２２）記載の好酸球増多性疾患治療方法。
（３４）好酸球増多性疾患が、アレルギー疾患、呼吸器疾患、皮膚疾患、自己免疫疾患、免疫不全疾患、消化器疾患、腫瘍性疾患、寄生虫感染性疾患又は特発性好酸球増加症候群から成る群から選ばれた疾患である上記（２２）乃至（３３）記載の好酸球増多性疾患治療方法。
（３５）アレルギー疾患が、薬剤アレルギー、気管支喘息、アレルギー性鼻炎から成る群から選ばれた疾患である上記（３４）記載の好酸球増多性疾患治療方法。
（３６）呼吸器疾患が、好酸球肺浸潤症である上記（３４）記載の好酸球増多性疾患治療方法。
（３７）皮膚疾患が、アトピー性皮膚炎、蕁麻疹、血管浮腫、乾癬、木村氏病、Ｅｐｉｓｏｄｉｃ ａｎｇｉｏｅｄｅｍａ ｗｉｔｈ ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｉａ、好酸球性膿胞毛胞炎、リンパ腫瘍丘診から成る群から選ばれた疾患である上記（３４）記載の好酸球増多性疾患治療方法。
（３８）自己免疫疾患が、多発性動脈炎、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデスから成る群から選ばれた疾患である上記（３４）記載の好酸球増多性疾患治療方法。
（３９）免疫不全疾患が、高ＩｇＥ症候群、Ｗｉｓｃｏｔｔ−Ａｌｄｒｉｃｈ症候群、Ｏｍｅｎｎ症候群から成る群から選ばれた疾患である上記（３４）記載の好酸球増多性疾患治療方法。
（４０）消化器疾患が、アレルギー性胃腸炎、好酸球性胃腸炎、潰瘍性大腸炎、膵炎から成る群から選ばれた疾患である上記（３４）記載の好酸球増多性疾患治療方法。
（４１）腫瘍性疾患が、ホジキン病である上記（３４）記載の好酸球増多性疾患治療方法。
（４２）寄生虫感染性疾患が、アニサキス症、旋毛虫症、糞線虫症、日本住血吸虫症、肺吸虫症から成る群から選ばれた疾患である上記（３４）記載の好酸球増多性疾患治療方法。
（４３）血中の可溶性ＣＤ３０を測定し、その濃度の増減を指標とすることからなる好酸球増多性疾患の診断方法。
（４４）ＣＤ３０を介する好酸球アポトーシス誘導物質の選別方法であって、以下のステップ：（ア）ＣＤ３０発現細胞に対する抗ＣＤ３０抗体結合の阻害に基づく一次選別、（イ）末梢血、臍帯血又は骨髄由来培養好酸球のアポトーシス誘導に基づく二次選別、及び（ウ）末梢血好酸球のアポトーシス誘導に基づく三次選別、からなる当該選別方法。
発明を実施するための最良の形態
本発明において、ＣＤ３０のシグナル伝達に関与する分子とは、好酸球表面で発現するＣＤ３０に直接又は間接に作用する分子のみならず、ＣＤ３０の細胞内シグナル伝達に関わる分子を意味し、細胞表面から核までの細胞シグナル伝達の各ステップに関与する分子をも意味する。従って、本発明において、ＣＤ３０及び／又はＣＤ３０のシグナル伝達に関与する分子を介して好酸球アポトーシスを誘導する物質とは、細胞外であっても、あるいは細胞内であっても、このような種々のステップにおける各分子に直接又は間接に作用して好酸球アポトーシスを誘導する物質をいう。
ＣＤ３０及び／又はＣＤ３０のシグナル伝達に関与する分子を介して好酸球アポトーシスを誘導する物質としては、抗ＣＤ３０抗体のみならず、好酸球にアポトーシスを誘導できて臨床適用し得る条件を満たす限りにおいてどのような物質であってもよい。例えば、ＣＤ３０リガンド、ＣＤ３０リガンドを発現及び／又は分泌している貪食能を有する細胞、ＣＤ３０発現調節及び／又は凝集調節能を有する物質、貪食能を有する細胞にＣＤ３０リガンドを発現及び／又は分泌させる物質又は後述する選別法で得られるＣＤ３０を介する好酸球アポトーシス誘導物質が挙げられる。
ＣＤ３０リガンドを発現及び／又は分泌している貪食能を有する細胞、ＣＤ３０発現調節及び／又は凝集調節能を有する物質、貪食能を有する細胞にＣＤ３０リガンドを発現及び／又は分泌させる物質も、ＣＤ３０及び／又はＣＤ３０のシグナル伝達に関与する分子を介して好酸球アポトーシスを誘導することが期待できる。なお、ＣＤ３０リガンドを発現及び／又は分泌している貪食能を有する細胞、ＣＤ３０発現調節及び／又は凝集調節能を有する物質、貪食能を有する細胞にＣＤ３０リガンドを発現及び／又は分泌させる物質を選別するには、例えば抗ＣＤ３０リガンド抗体により、貪食細胞の免疫染色、貪食細胞の培養上清中のＣＤ３０リガンドのＥＬＩＳＡを用いることができる。
ＣＤ３０及び／又はＣＤ３０のシグナル伝達に関与する分子を介して好酸球アポトーシスを誘導する物質として好ましいのは、抗ＣＤ３０抗体であるＢｅｒ−Ｈ８又はＨＲＳ−４が認識する部位を認識する免疫グロブリン若しくはその活性フラグメント、ペプチド又は低分子化合物である。Ｂｅｒ−Ｈ８及びＨＲＳ−４はマウス抗ヒトＣＤ３０単クローン抗体として文献（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ １９，４３−４８，２０００）に記載されており、また市販されている（Ｂｅｒ−Ｈ８についてはＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡから、ＨＲＳ−４については、Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ，Ｍａｒｓｅｉｌｌｅｓ，Ｆｒａｎｃｅから入手できる）。
また、ＣＤ３０及び／又はＣＤ３０のシグナル伝達に関与する分子を介して好酸球アポトーシスを誘導する物質として特に好ましいのは、少なくとも配列番号１記載のアミノ酸配列（ＣＤ３０のアミノ酸配列のうち、１１２−４１２位のアミノ酸配列）の一部又は全部を認識する免疫グロブリン又はその活性フラグメントである。特に好ましい免疫グロブリンは抗ＣＤ３０単クローン抗体である。
抗ＣＤ３０単クローン抗体としては、高純度に精製された抗ＣＤ３０単クローン抗体であれば全て使用でき、その由来および種類を問わないが、特に哺乳動物由来の単クローン抗体が好ましい。
単クローン抗体の産生細胞の動物種は哺乳類であれば特に制限されず、ヒト抗体またはヒト以外の哺乳動物由来であってよい。ヒト以外の哺乳動物由来の単クローン抗体としては、その作製の簡便さからウサギあるいはげっ歯類由来の単クローン抗体が好ましい。げっ歯類としては、特に制限されないが、マウス、ラット、ハムスターなどが好ましく例示される。さらに、トランスジェニック動物を用いて作製したヒト抗体も好ましい例である。
このような抗ＣＤ３０単クローン抗体としては、Ｂｅｒ−Ｈ８又はＨＲＳ−４を例示することができるが、これに限定されない。抗ＣＤ３０単クローン抗体は、基本的には公知技術を使用して作製できる。すなわち、ＣＤ３０を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、単クローン抗体産生細胞をスクリーニングすることによって作製できる。
本発明に使用される単クローン抗体は、ハイブリドーマが産生する単クローン抗体に限られるものではなく、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変したものであってもよい。例えば、ヒト以外の哺乳動物、例えば、マウスの単クローン抗体の可変領域とヒト抗体の定常領域と＜ＴＸＦＦＲ＝０００２ ＨＥ＝２５０ ＷＩ＝０８０ ＬＸ＝１１００ ＬＹ＝０３００＞からなるキメラ抗体を使用することができ、このようなキメラ抗体は、既知のキメラ抗体の製造方法、特に遺伝子組換技法を用いて製造することができる。さらに、再構成（ｒｅｓｈａｐｅｄ）したヒト型化抗体を本発明に用いることもできる。これはヒト以外の哺乳動物、たとえばマウス抗体の相補性決定領域によりヒト抗体の相補性決定領域を置換したものであり、その一般的な遺伝子組換手法も知られている。その既知方法を用いて、本発明に有用な再構成ヒト型化抗体を得ることができる。
また、本発明では、ＣＤ３０及び／又はＣＤ３０のシグナル伝達に関与する分子を介して好酸球アポトーシスを誘導する物質として、ＣＤ３０リガンド又はその活性フラグメントであってもよい。好ましいＣＤ３０リガンドとしては、例えば配列番号２のアミノ酸配列を有するヒト由来ＣＤ１５３や配列番号５のアミノ酸配列を有するマウス由来ＣＤ１５３を挙げることができるが、これらに限定されない。さらに、ＣＤ３０及び／又はＣＤ３０のシグナル伝達に関与する分子を介して好酸球アポトーシスを誘導する物質は、ＣＤ３０リガンド又はその活性フラグメントをコードする核酸であってもよい。好ましいＣＤ３０リガンドをコードする核酸としては、例えば配列番号２（ヒト由来ＣＤ１５３のアミノ酸配列）記載のアミノ酸をコードするＤＮＡや配列番号５（マウス由来ＣＤ１５３のアミノ酸配列）記載のアミノ酸をコードするＤＮＡを挙げることができるが、これらに限定されない。
ＣＤ３０及び／又はＣＤ３０のシグナル伝達に関与する分子を介する好酸球アポトーシス誘導物質の選別法の一例としては、ＣＤ３０発現細胞（例えば、Ｌｕｒｋａｔ、Ｋ５６２、ＲＤなど）に対する抗ＣＤ３０抗体（例えば、ＨＲＳ−４、Ｂｅｒ−Ｈ８、ＹＭＳＭ６３６．４．１０など）結合の阻害に基づく一次選別、末梢血、臍帯血又は骨髄由来培養好酸球のアポトーシス誘導に基づく二次選別、及び末梢血好酸球のアポトーシス誘導に基づく三次選別による選別法が挙げられるが、これに限定されるものではない。
アポトーシス誘導効果を有しているか否かについては、好酸球細胞がアポトーシス特有の特徴を呈しているか否かを指標にして判断することができる。具体的には、細胞容積の減少、ＤＮＡの断片化、アポトーシス小体の形成などの形態学的特徴の透過電子顕微鏡による観察、あるいは好酸球細胞の生存率を指標にすることができる。細胞容積は、例えばＣｏｕｌｔｅｒ型細胞サイズ解析機による電子的サイズ決定技術により測定できる。ヌクレオソーム間のＤＮＡの断片化はＤＮＡラダーとして検出することができ、アポトーシス検出用の市販のラダー検出キット（例えば、Ｗａｋｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｌｔｄ．，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）を用いることができる。細胞生存率は、例えば比色ＭＴＴアッセイを用いるミトコンドリアデヒドロゲナーゼ活性により評価することができる。ＭＴＴに代えて、ＷＡＴ−１やＷＳＴ−８などのホルマザン試薬を用いることもできる。さらには、生存細胞がトリパンブルーを排除することを用いて細胞生存率を測定できる。あるいは、ＭＥＢＣＹＴＯ−Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｍｅｄｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｎａｇｏｙａ，Ｊａｐａｎ）などの市販キットを用いて、ＦＩＴＣ標識ＡｎｎｅｘｉｎＶの結合したアポトーシス細胞をフローサイトメーター（例えば、ＦＡＣＳｃａｎ Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）にて計測することもできる。
顆粒蛋白の漏出を伴う細胞のネクローシスの場合と異なり、アポトーシス後の好酸球細胞は、細胞膜破壊による顆粒タンパク漏出前にマクロファージ等の食細胞の貪食により無毒化処理を受け、周囲の組織・細胞に障害を生じさせずに除去される。
一般に、アポトーシス細胞に対する食細胞による貪食排除には以下の４つの過程があると考えられている。
１．アポトーシス細胞周辺への食細胞の遊走：炎症局所ではすでに食細胞はアポトーシス細胞と隣接している。
２．食細胞によるアポトーシス細胞の認識：食細胞は貪食受容体を介して、アポトーシス細胞表面上の貪食目印分子を認識する。貪食目印分子としては、フォスファチジルセリン（ＰＳ）が最もよく知られている。貪食受容体としては、ＰＳを認識するクラスＢスカベンジャーレセプタータイプＩ（ＳＲ−ＢＩ）やＬＯＸ−１（ｌｅｃｔｉｎ−ｌｉｋｅ ｏｘｉｄｄｉｚｅｄ ｌｏｗ−ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−１）が同定されている。
３．食細胞によるアポトーシス細胞の取り込み（貪食）：貪食受容体からのシグナルにより食細胞は貪食するが、シグナル伝達機構は不明である。
４．貪食されたアポトーシス細胞のリソゾームなど細胞内器官への輸送、処理。
好酸球増多性疾患の具体例としては、例えば、アレルギー疾患、呼吸器疾患、皮膚疾患、自己免疫疾患、免疫不全疾患、消化器疾患、特発性好酸球増加症候群、腫瘍性疾患（例えば、ホジキン病）及び寄生虫感染性疾患等を挙げることができる。
本発明の好酸球増多性疾患治療剤には、上記のようにして選別されたＣＤ３０及び／又はＣＤ３０のシグナル伝達に関与する分子を介して好酸球アポトーシスを誘導する物質を有効成分として含み、さらに通常の製剤化の際に用いられる担体や賦形剤、その他の添加剤を用いて調製される。
製剤用の担体や賦形剤としては、例えば、乳糖、ステアリン酸マグネシウム、デンプン、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アラビアゴム、オリーブ油、ゴマ油、カカオバター、エチレングリコールなどやその他常用されるものをあげることができる。
経口投与のための固体組成物としては、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤などが用いられる。このような固体組成物においては、少なくともひとつの有効成分が少なくともひとつの不活性な希釈剤、例えば、乳糖、マンニトール、ブドウ糖、ヒドロキシプロピルセルロース、微結晶性セルロース、デンプン、ポリビニルピロリドン、メタケイ酸アルミン酸マグネシウムなどと混合される。組成物は、常法にしたがって不活性な希釈剤以外の添加物、例えば、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、繊維素グリコール酸カルシウムのような崩壊剤、グルタミン酸またはアスパラギン酸のような溶解補助剤を含んでいてもよい。錠剤または丸剤は、必要によりショ糖、ゼラチン、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレートなどの糖衣や胃溶性または腸溶性物質のフィルムで被覆してもよいし、２つ以上の層で被覆してもよい。さらに、ゼラチンのような吸収されうる物質のカプセルも含まれる。
経口投与のための液体組成物は、薬剤的に許容される乳濁剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤、エリキシル剤などを含み、一般的に用いられる不活性な希釈剤、例えば精製水、エタノールなどを含んでいてもよい。この組成物は、不活性な希釈剤以外に湿潤剤、懸濁剤のような補助剤、甘味剤、風味剤、芳香剤、防腐剤などを含んでいてもよい。
非経口投与のための注射剤としては、無菌の水性または非水性の溶液剤、懸濁剤、乳濁剤が含まれる。水性の溶液剤、懸濁剤としては、例えば、注射用水および注射用生理食塩液が含まれる。非水性の溶液剤、懸濁剤としては、例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、エタノールのようなアルコール類、ポリソルベート８０（登録商標）などが含まれる。このような組成物は、さらに防腐剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤（例えば、乳糖）、溶解補助剤（例えば、グルタミン酸、アスパラギン酸）のような補助剤を含んでいてもよい。これらは、例えば、精密ろ過膜によるろ過滅菌、高圧蒸気滅菌のような加熱滅菌、あるいは、殺菌剤の配合などの通常の滅菌方法によって無菌化することが可能である。注射剤は溶液製剤であっても、使用前に溶解再構成するために凍結乾燥したものであってもよい。凍結乾燥のための賦形剤としては例えばマンニトール、ブドウ糖などの糖アルコールや糖類を使用することが出来る。
また、本発明の治療剤を遺伝子治療に用いる場合にはウイルスベクター、好ましくはレンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、更に好ましくはアデノウイルスベクター、又は化学合成リポソーム、ウイルスエンベロープ、若しくはウイルスエンベロープと合成リポソームの複合体等公知の遺伝子治療に適した媒体に、宿主細胞内で機能するようなプロモーター配列、例えばサイトメガロウイルスプロモーター（ＣＭＶｐｒｏｍｏｔｅｒ）等、の下流に、ＣＤ３０及び／又はＣＤ３０のシグナル伝達に関与する分子を介して好酸球アポトーシスを誘導する物質に係る核酸を組み込んだものを用いることができる。
本発明の好酸球増多性疾患治療剤は、医薬に一般に使用されている投与方法、例えば、経口投与方法、又は非経口投与方法によって投与するのが好ましい。有効成分が抗体である場合には通常非経口投与経路で、例えば注射剤（皮下注、静注、筋注、腹腔内注など）、経皮、経粘膜、経鼻、経肺などで投与されるが、経口投与も可能である。
本発明の製剤中に含まれる有効成分であるＣＤ３０及び／又はＣＤ３０のシグナル伝達に関与する分子を介して好酸球アポトーシスを誘導する物質の量は、治療すべき疾患の種類、疾患の重症度、患者の年齢などに応じて決定できるが、一般には最終投与濃度で０．０１〜５００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．１〜２００ｍｇ／ｍｌである。
産業上の利用可能性
本発明は、ＣＤ３０及び／又はＣＤ３０のシグナル伝達に関与する分子を介し好酸球アポトーシスを誘導する物質は好酸球増多性疾患の治療薬として有用であり、また、ＣＤ３０を介した好酸球アポトーシス誘導は新たな機序に基づく、好酸球増多性疾患に対する治療方法として有用である。このような疾患としては、好酸球が中心的な役割を担っている基本病態が炎症反応である、アレルギー疾患、寄生虫感染症、自己免疫疾患等が例示される。
本発明の好酸球増多性疾患治療薬は、従来好酸球のアポトーシスを誘導するとされている抗Ｆａｓ抗体と比較して、ヒト末梢血好酸球に対してはるかに迅速かつ強力にアポトーシスを誘導することができる。また、好酸球に対するアポトーシス誘導の細胞特異性が極めて高く、好中球、リンパ球、マスト細胞にはアポトーシスを誘導しない。さらには、本発明の好酸球増多性疾患治療薬の好酸球に対するアポトーシス誘導はＩＬ−５等により減殺されない。従って、本発明の好酸球増多性疾患治療薬は臨床的に極めて有用な治療薬として期待できる。
実施例
以下、実施例に基づいて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲をこれらの実施例に限定するものではない。
実施例１：ヒト末梢血好酸球におけるＣＤ３０発現解析
ヘパリン採血したヒト末梢血をＰＢＳで希釈し、Ｐｅｒｃｏｌｌ（比重１．０９０ｇ／ｍｌ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）に重層後、遠心分離（１５００ｒｐｍ，３０分間）した。最下層の顆粒球画分に低温精製水を加え溶血させた。ついで、抗ＣＤ１６抗体固相化ｍａｇｎｅｔｉｃ ｂｅａｄｓ（ＭＡＣＳ ＣＤ１６ ｍｉｃｒｏ ｂｅａｄｓ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｂｅｒｇｉｓｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いたｎｅｇａｔｉｖｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎにより好酸球画分を得た。好酸球の生存率（ｔｒｙｐａｎ ｂｌｕｅ ｄｙｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ法、ナカライ社製）及び純度（ＤＩＦＦ−ＱＵＩＣＫ染色、国際試薬株式会社製）はそれぞれ９９％以上であった。
分離したヒト好酸球を２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｔｕｂｅに調製し、１次抗体として、６種のマウス抗ヒトＣＤ３０単クローン抗体又はコントロールマウスＩｇＧ（１０μｇ／ｍｌ）を４℃にて３０分反応させた。洗浄後、２次抗体としてＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウスＩｇＧＦ（ａｂ’）２を用いて染色（４℃にて３０分反応）し、１％パラホルムアルデヒドにて固定後、フローサイトメーター（ＦＡＣＳｃａｎ Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）にて検出した。ＩＬ−５（１ｎｇ／ｍｌ，Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｉｎｅｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）で活性化（３７℃，３０分）した好酸球について同様に検討した。マウス抗ヒトＣＤ３０単クローン抗体としては、ＨＲＳ−４（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ，Ｍａｒｓｅｉｌｌｅｓ，Ｆｒａｎｃｅ）、Ｂｅｒ−Ｈ２（ＤＡＫＯ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）、Ｂｅｒ−Ｈ８（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ＡＣ−１０（Ａｎｃｅｌ，Ｂａｙｐｏｒｔ，ＭＮ）、１Ｇ１２（ＹＬＥＭ Ａｖｅｚｚａｎｏ，Ｒｏｍａ，Ｉｔａｌｙ）及びＫｉ−１（ＹＬＥＭ Ａｖｅｚｚａｎｏ，Ｒｏｍａ，Ｉｔａｌｙ）を、コントロールマウスＩｇＧとしてはＭＯＰＣ−２１（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を用いた。
６人の末梢血提供者の好酸球をフローサイトメトリーにより解析した結果、ヒト末梢血好酸球はＨＲＳ−４およびＡＣ１０により有意に染色され、ＣＤ３０発現が確認された（図１）。なお、ＡＣ１０染色による平均蛍光強度は８．９±３．２であり、好酸球におけるＣＤ３０発現はＩＬ−５受容体α鎖の発現と同程度であることが判明した。ＩＬ−５により活性化した場合は、ＡＣ−１０により有意な発現が観察され、またＨＲＳ−４又はＢｅｒ−Ｈ８により、発現増加傾向が認められた（図２）。
実施例２：ヒト末梢血好酸球におけるＣＤ３０ ｍＲＮＡ発現解析
ヒト末梢血好酸球をＩｓｏｇｅｎ（Ｎｉｐｐｏｎ Ｇｅｎｅ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）により溶解し、ＲＮＡを抽出後、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）のキットを用いてｃＤＮＡへ逆転写した。ヒトＣＤ３０遺伝子の３’−非翻訳領域を認識する上流域センスプライマー（５’−ＧＣＣ ＣＡＧ ＧＡＴ ＣＡＡ ＧＴＣ ＡＣＴ ＣＡＴ−３’）（配列番号３）及び下流域アンチセンスプライマー（５’−ＴＡＣ ＡＣＧ ＴＣＴ ＧＡＡ ＧＧＣ ＣＣＴ ＡＧＧ−３’）（配列番号４）を用い、サーマルサイクラー（Ｇｅｎｅ Ａｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００；ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）により５０１ｂｐの断片をＰＣＲ反応（９４℃１分１サイクルで変性、９４℃１分／５５℃１分／７２℃２分４０サイクル、最後に７２℃１０分１サイクルで伸長）により増幅した。反応終了後、０．０５％ ｅｔｈｉｄｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ（Ｓｉｇｍａ）を含む０．８％アガロースゲル（ＢＲＬ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）で電気泳動したところ、約５００ｂｐのバンドとして目的のＰＣＲ産物を確認した。ヒト末梢血好酸球にはＣＤ３０ ｍＲＮＡが発現していることが示された（図３）。
実施例３：ヒト末梢血好酸球に対する抗ヒトＣＤ３０単クローン抗体によるアポトーシス誘導の検討
抗ヒトＣＤ３０単クローン抗体をＰＢＳにより種々の濃度（０．０１，０．１，１及び１０μｇ／ｍｌ）に調製し、２４穴マイクロプレート（Ｃｏｓｔａｒ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）に１ｍｌ添加後、４℃にて１２時間静置し固相化した。洗浄後、１％ヒト血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）２ｍｌを添加し、３７℃にて２時間ブロッキングした。洗浄後、１０％ＦＣＳ，１０−５Ｍ ２−メルカプトエタノール（ＧＩＢＣＯ），Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（ＧＩＢＣＯ）及び１ｎｇ／ｍｌヒト組換えＩＬ−５（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を含むＩＭＤＭ（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ、ＧＩＢＣＯ）培地にて１ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調製した分離ヒト末梢血好酸球を加えた。３７℃、４時間培養後、細胞を集め洗浄後、アポトーシス細胞をＭＥＢＣＹＴＯ−Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｍｅｄｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｎａｇｏｙａ，Ｊａｐａｎ）にて検出した。ＦＩＴＣ標識ＡｎｎｅｘｉｎＶの結合したアポトーシス細胞をフローサイトメーター（ＦＡＣＳｃａｎ Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）にて計測した。
その結果、抗ヒトＣＤ３０単クローン抗体ＨＲＳ−４及びＢｅｒ−Ｈ８は濃度依存的にヒト末梢血好酸球に対してアポトーシスを誘導した。ＨＲＳ−４は１及び１０μｇ／ｍｌの濃度で固相化した場合、それぞれ１６．３％及び７８．８％の好酸球に、Ｂｅｒ−Ｈ８は０．０１，０．１，１及び１０μｇ／ｍｌの濃度で固相化した場合、それぞれ７．８％，１１．４％，４４．８％及び７１．９％の好酸球にアポトーシスを誘導した（図４）。なお、抗ヒトＣＤ３０単クローン抗体Ｂｅｒ−Ｈ２，ＡＣ１０，１Ｇ１２及びＫｉ１，ならびにコントロールマウスＩｇＧはヒト末梢血好酸球に対してアポトーシスをまったく誘導しなかった。
実施例４：抗ヒトＣＤ３０単クローン抗体によるヒト末梢血好酸球アポトーシス誘導における好酸球提供者の個人差の検討
３人の末梢血から分離した好酸球に対する抗ヒトＣＤ３０単クローン抗体のアポトーシス誘導能を検討した。抗ヒトＣＤ３０単クローン抗体は１０μｇ／ｍｌの濃度で固相化した。いずれの提供者の末梢血好酸球に対しても、抗ヒトＣＤ３０単クローン抗体ＨＲＳ−４及びＢｅｒ−Ｈ８は強力にアポトーシスを誘導した（図５：３人の平均値を示す）。従って、ＨＲＳ−４及びＢｅｒ−Ｈ８の末梢血好酸球アポトーシス誘導能には、好酸球提供者による個人差はないことが示された。なお、抗ヒトＣＤ３０単クローン抗体Ｂｅｒ−Ｈ２，ＡＣ１０，１Ｇ１２及びＫｉ１，ならびにコントロールマウスＩｇＧはいずれの提供者の好酸球に対してもアポトーシスを誘導しなかった。
実施例５：抗ヒトＣＤ３０単クローン抗体ＨＲＳ−４及びＢｅｒ−Ｈ８によるヒト末梢血好酸球アポトーシス誘導の経時変化
分離ヒト末梢血好酸球に対する抗ヒトＣＤ３０単クローン抗体ＨＲＳ−４及びＢｅｒ−Ｈ８のアポトーシス誘導の経時変化を検討した。ＨＲＳ−４及びＢｅｒ−Ｈ８を１０μｇ／ｍｌの濃度で固相化したプレートに好酸球を添加して培養した場合、いずれの抗体も１時間後にはほぼ５０％の好酸球にアポトーシスを誘導し、４時間後までにはアポトーシス好酸球は７０％まで増加した（図６）。従って、ＨＲＳ−４及びＢｅｒ−Ｈ８は末梢血好酸球に対して非常に迅速にアポトーシスを誘導することが判明した。
実施例６：抗ヒトＣＤ３０単クローン抗体ＨＲＳ−４及びＢｅｒ−Ｈ８によるヒト末梢血好酸球アポトーシス誘導（ＤＮＡ断片化を指標）
分離ヒト末梢血好酸球に対する抗ヒトＣＤ３０単クローン抗体ＨＲＳ−４及びＢｅｒ−Ｈ８のアポトーシス誘導をＤＮＡ断片化を指標として検討した。ＨＲＳ−４及びＢｅｒ−Ｈ８を１０μｇ／ｍｌの濃度で固相化したプレートに好酸球を添加して２４時間培養後、細胞を回収し、アポトーシスラダー検出キット（Ｗａｋｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｌｔｄ．，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）を用いてＤＮＡを抽出し、アガロース電気泳動にてＤＮＡ断片化を検討した。
ＨＲＳ−４及びＢｅｒ−Ｈ８はいずれも好酸球ＤＮＡの断片化を誘導した（図７）。なお、抗ヒトＣＤ３０単クローン抗体Ｂｅｒ−Ｈ２及びコントロールマウスＩｇＧはいずれも好酸球ＤＮＡの断片化を誘導しなかった。従って、ＨＲＳ−４及びＢｅｒ−Ｈ８のヒト末梢血好酸球に対するアポトーシス誘導はＤＮＡ断片化を指標とした場合でも確認できた。
実施例７：抗ヒトＣＤ３０単クローン抗体ＨＲＳ−４及びＢｅｒ−Ｈ８と抗ヒトＦａｓ単クローン抗体とのヒト末梢血好酸球アポトーシス誘導能の比較検討
分離ヒト末梢血好酸球に対する抗ヒトＣＤ３０単クローン抗体ＨＲＳ−４及びＢｅｒ−Ｈ８と抗ヒトＦａｓ単クローン抗体（ＣＨ−１１，Ｍｅｄｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｎａｇｏｙａ，Ｊａｐａｎ）とのアポトーシス誘導能を比較検討した。単クローン抗体を１０μｇ／ｍｌの濃度で固相化したプレートに好酸球を添加し、培養した。
ＨＲＳ−４及びＢｅｒ−Ｈ８は培養１時間後にはほぼ５０％の好酸球にアポトーシスを誘導し、４時間後までにはアポトーシス好酸球は７０％まで増加した。一方、抗ヒトＦａｓ単クローン抗体では培養２４時間後からアポトーシス好酸球が出現したが、７２時間後でもあまり増加しなかった（図８）。従って、抗ヒトＣＤ３０単クローン抗体ＨＲＳ−４及びＢｅｒ−Ｈ８は、抗ヒトＦａｓ単クローン抗体に比べて、ヒト末梢血好酸球に対して非常に迅速で、強力にアポトーシスを誘導することが判明した。
実施例８：抗ヒトＣＤ３０単クローン抗体ＨＲＳ−４及びＢｅｒ−Ｈ８のアポトーシス誘導能の細胞選択性の検討
ヘパリン採血したヒト末梢血をＰＢＳで希釈し、Ｐｅｒｃｏｌｌ（比重１．０９０ｇ／ｍｌ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）に重層後、遠心分離（１５００ｒｐｍ，１５分間）した。最下層の顆粒球画分に低温精製水を加え溶血させた。ついで、抗ＣＤ１６抗体固相化ｍａｇｎｅｔｉｃ ｂｅａｄｓ（ＭＡＣＳ ＣＤ１６ ｍｉｃｒｏ ｂｅａｄｓ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｂｅｒｇｉｓｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いたｐｏｓｉｔｉｖｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎにより好中球画分を得た。好中球の生存率は９９％であった。分離ヒト末梢血好中球に対する固相化抗ヒトＣＤ３０単クローン抗体のアポトーシス誘導能をフローサイトメーターにて計測した。
上述した６種の抗ヒトＣＤ３０単クローン抗体はいずれも、好中球に対してアポトーシスを誘導しなかった（図９）。６人の末梢血好中球を用いてさらに検討したが、６種の抗ヒトＣＤ３０単クローン抗体はいずれもアポトーシスを誘導しなかった。
次いで、ヘパリン採血したヒト末梢血にシリカゲル（免疫生物研究所）を添加し、３７℃で１時間作用させマクロファージを除去し、ＰＢＳで希釈後、ＬＳＭ（比重１．０７７ｇ／ｍｌ，ＩＣＮ社製）に重層後、遠心分離（１５００ｒｐｍ，１５分間）し、リンパ球画分を得た。リンパ球の生存率は９９％であった。同様に分離ヒト末梢血リンパ球に対する固相化抗ヒトＣＤ３０単クローン抗体のアポトーシス誘導能をフローサイトメーターにて計測した。好酸球に対してアポトーシスを誘導するＨＲＳ−４及びＢｅｒ−Ｈ８はいずれも、リンパ球に対してはアポトーシスを誘導しなかった（図１０）。
さらに、培養ヒトマスト細胞に対する固相化抗ヒトＣＤ３０単クローン抗体のアポトーシス誘導能をフローサイトメーターにて計測した。好酸球に対してアポトーシスを誘導するＨＲＳ−４及びＢｅｒ−Ｈ８はいずれも、培養ヒトマスト細胞に対してはアポトーシスを誘導しなかった（図１１）。培養ヒトマスト細胞としては、斎藤らの方法（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７，３４３−３５０，１９９６及びＪ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０６，３２１−３２８，２０００）に準じて得た末梢血由来成熟マスト細胞（Ｐ−Ｍａｓｔ）及び臍帯血由来成熟マスト細胞（Ｃ−Ｍａｓｔ）を用いた。
なお、ＣＤ３０陽性ヒト細胞株Ｊｕｒｋａｔ（Ｔ ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ）、Ｋ５６２（ｅｒｙｔｈｒｏｌｅｕｋｅｍｉａ）及びＲＤ（ｒｈａｂｄｏｍｙｏｓａｒｃｏｍａ）に対しても、ＨＲＳ−４及びＢｅｒ−Ｈ８はいずれも、アポトーシスを誘導しなかった。
従って、抗ヒトＣＤ３０単クローン抗体ＨＲＳ−４及びＢｅｒ−Ｈ８はヒト末梢血好酸球に選択的にアポトーシスを誘導することが判明した。
実施例９：抗ヒトＣＤ３０単クローン抗体ＨＲＳ−４及びＢｅｒ−Ｈ８によるヒト末梢血好酸球アポトーシス誘導に対する高濃度ＩＬ−５の影響
これまで、抗ヒトＣＤ３０単クローン抗体ＨＲＳ−４及びＢｅｒ−Ｈ８は、１０ｎｇ／ｍｌのヒト組換えＩＬ−５存在下、ヒト末梢血好酸球に対してアポトーシスを誘導することを確認した。しかし、高濃度のＩＬ−５が存在していれば好酸球自体の生存能が増強され、ＨＲＳ−４及びＢｅｒ−Ｈ８のアポトーシス誘導能は減殺される可能性がある。そこで、０，１，１０及び１００ｎｇ／ｍｌのＩＬ−５存在下、ＨＲＳ−４及びＢｅｒ−Ｈ８によるヒト末梢血好酸球アポトーシス誘導能を検討した。また、好酸球提供者の個人差を考慮し、４人の末梢血好酸球を用いて実施した。
ＨＲＳ−４はＩＬ−５の濃度依存的にアポトーシスを誘導し、ＩＬ−５非存在下ではアポトーシスをまったく誘導せず、１００ｎｇ／ｍｌ存在下でも誘導した。一方、Ｂｅｒ−Ｈ８は、ＩＬ−５の有無に関わらずアポトーシスを誘導した（図１２）。
従って、ＣＤ３０を介するヒト末梢血好酸球アポトーシスのシグナルにはＩＬ−５が関与する経路としない経路が存在していることが示唆された。しかし、少なくとも高濃度のＩＬ−５が存在していてもＨＲＳ−４及びＢｅｒ−Ｈ８のアポトーシス誘導は減殺されないことが判明した。
実施例１０：ヒト末梢血好酸球に対する抗マウスＣＤ３０単クローン抗体のアポトーシス誘導の検討
分離ヒト末梢血好酸球に対する抗マウスＣＤ３０単クローン抗体ＹＭＳＭ６３６．４．１０（Ｓｅｒｏｔｅｃ Ｌｔｄ，Ｏｘｆｏｒｄ ＵＫ）及び２ＳＨ１２−５Ｆ−２Ｄ（ＢＤ ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＵＳＡ）のアポトーシス誘導を検討した。ＹＭＳＭ６３６．４．１０を１０μｇ／ｍｌの濃度で固相化したプレートにヒト好酸球を添加して培養した場合、４時間後にはほぼ３０％の好酸球にアポトーシスを誘導した（図１３）。なお、２ＳＨ１２−５Ｆ−２ＤならびにラットコントロールＩｇＧはアポトーシスをまったく誘導しなかった。
実施例１１：ヒト末梢血好酸球に対するマウスＣＤ３０リガンドのアポトーシス誘導の検討
分離ヒト末梢血好酸球に対するリコンビナントマウスＣＤ３０リガンド（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＵＳＡ）のアポトーシス誘導を検討した。リコンビナントマウスＣＤ３０リガンドを１０及び１００μｇ／ｍｌの濃度で固相化したプレートにヒト好酸球を添加して培養した場合、４時間後にはそれぞれ２８％及び３５％の好酸球にアポトーシスを誘導した（図１４）。
実施例１２：ヒト末梢血好酸球に対するポリスチレンマイクロビーズ固相化抗ヒトＣＤ３０単クローン抗体ＨＲＳ−４及びＢｅｒ−Ｈ８によるアポトーシス誘導の検討
分離ヒト末梢血好酸球に対するポリスチレンマイクロビーズ固相化抗ヒトＣＤ３０単クローン抗体ＨＲＳ−４及びＢｅｒ−Ｈ８によるアポトーシス誘導を検討した。紀太らの方法（Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１８，：６７５−６８６，１９９８）に準じ、０．１Ｍホウ酸緩衝液にて洗浄した直径１．４４４μＭのポリスチレンマイクロビーズ（２．５６％ ｓｏｌｉｄ Ｌａｔｅｘ，Ｓｉｇｍａ）０．５ｍｌに、２００μｇの抗ヒトＣＤ３０単クローン抗体を添加後、４℃１２時間静置し固相化した。洗浄後、２．５％ヒト血清アルブミン０．５ｍｌを添加し、４℃にて２時間ブロッキングした。洗浄後、０．５ｍｌＰＢＳに懸濁し、ポリスチレンマイクロビーズ固相化抗ヒトＣＤ３０単クローン抗体とした。分離ヒト末梢血好酸球２ｘ１０５ｃｅｌｌｓ及びポリスチレンマイクロビーズ固相化ＨＲＳ−４及びＢｅｒ−Ｈ８（１０μｌ）を９６穴Ｕ底マイクロプレート（ＮＵＮＣ社）に加えた。３７℃、４時間培養後、アポトーシス細胞をフローサイトメーターにて計測した。なお、ポリスチレンマイクロビーズは前方散乱光及び側方散乱光のドットブロットにおけるゲーティングにより除外した。
ポリスチレンマイクロビーズ固相化ＨＲＳ−４は２７．９％の好酸球に、Ｂｅｒ−Ｈ８は４４．０％の好酸球にアポトーシスを誘導した（図１５）。なお、ポリスチレンマイクロビーズ固相化抗ヒトＣＤ３０単クローン抗体Ｂｅｒ−Ｈ２ならびにコントロールマウスＩｇＧはヒト末梢血好酸球に対してアポトーシスを誘導しなかった。従って、抗ヒトＣＤ３０単クローン抗体ＨＲＳ−４及びＢｅｒ−Ｈ８はマイクロプレートへの固相化と同様に、ポリスチレンマイクロビーズに固相化した場合でもヒト好酸球に対してアポトーシスを誘導することが判明した。
実施例１３：ポリスチレンマイクロビーズ固相化抗ヒトＣＤ３０単クローン抗体ＨＲＳ−４及びＢｅｒ−Ｈ８によりアポトーシスを誘導されたヒト末梢血好酸球に対する食細胞による貪食試験
ポリスチレンマイクロビーズ固相化抗ＨＲＳ−４及びＢｅｒ−Ｈ８によりアポトーシスを誘導された分離好酸球に対する食細胞による貪食試験を実施した。まず、Ｂｒｏｗｎらの方法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７５：５９８７−５９９６，２０００）に準じ、ヒト臍帯血単核球画分からＣＤ３４陰性細胞を分画し、１０ｎｇ／ｍｌのヒト組換えＭ−ＣＳＦ（Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ−ｃｏｒｏｎｙ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ、Ｒ＆Ｄ社）存在下、７日間培養し、成熟マクロファージを調製した。次いで、ポリスチレンマイクロビーズ固相化抗ＨＲＳ−４及びＢｅｒ−Ｈ８を３０分間反応させアポトーシス誘導途上にある好酸球を、Ｆａｄｏｋらの方法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６：１０７１−１０７７，２００１）に準じ、あらかじめチャンバースライド（ＮＵＮＣ社）上で２４時間培養した臍帯血由来マクロファージによる貪食試験に供した。好酸球単独培養及び好酸球／マクロファージ共培養による４時間後のそれぞれの培養上清中に漏出した好酸球顆粒タンパクＥＤＮ（Ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ）濃度の差を貪食作用の指標とした。ＥＤＮ濃度はＥＬＩＳＡキット（ＭＢＬ社）を用いて測定した。
ポリスチレンマイクロビーズ固相化ＨＲＳ−４及びＢｅｒ−Ｈ８によりアポトーシスを誘導された好酸球は臍帯血由来マクロファージとの共培養により貪食された結果、培養上清中に漏出したＥＤＮは減少した。とくに、ＨＲＳ−４によりアポトーシスを誘導した好酸球に対して、臍帯血由来マクロファージは顕著な貪食作用を示した（図１６）。なお、ポリスチレンマイクロビーズ固相化抗ヒトＣＤ３０単クローン抗体Ｂｅｒ−Ｈ２ならびにコントロールマウスＩｇＧを反応させた好酸球の場合、単独培養、共培養に関わらずＥＤＮ漏出は非常に少なかった。また、ヒト単球系細胞株Ｕ９３７（例えば、ＡＴＣＣから購入可能：ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ−１５９３．２）のマクロファージとしての機能を顕在化させて貪食能を引き出す目的で、１０ｎｇ／ｍｌ ＰＭＡ（Ｐｈｏｒｂｏｌ １２−Ｍｙｒｉｓｔａｔｅ １３−Ａｃｅｔａｔｅ、Ｓｉｇｍａ社）を用いて当該細胞を１時間刺激し、活性化した当該細胞を食細胞とした貪食試験でも同様の結果が得られた（図１７）。
従って、ＨＲＳ−４及びＢｅｒ−Ｈ８によりアポトーシスを誘導されたヒト末梢血好酸球は、細胞膜破壊による顆粒タンパク漏出前にマクロファージ等の食細胞の貪食により無毒化処理を受けることが示唆された。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
図１は、６種のマウス抗ヒトＣＤ３０単クローン抗体又はコントロールマウスＩｇＧを用いたヒト末梢血好酸球におけるＣＤ３０発現解析の結果を示すグラフである。
図２は、ＩＬ−５により活性化した好酸球を用いた場合の、６種のマウス抗ヒトＣＤ３０単クローン抗体又はコントロールマウスＩｇＧを用いたヒト末梢血好酸球におけるＣＤ３０発現解析の結果を示すグラフである。
図３は、ヒト末梢血好酸球におけるＣＤ３０ ｍＲＮＡの発現解析の結果を示す電気泳動の図である。
図４は、ヒト末梢血好酸球に対する抗ヒトＣＤ３０単クローン抗体によるアポトーシス誘導の試験結果を示すグラフである。
図５は、抗ヒトＣＤ３０単クローン抗体によるヒト末梢血好酸球アポトーシス誘導における好酸球提供者の個人差の検討結果を示すグラフである。
図６は、抗ヒトＣＤ３０単クローン抗体ＨＲＳ−４及びＢｅｒ−Ｈ８によるヒト末梢血好酸球アポトーシス誘導の経時変化を示すグラフである。
図７は、抗ヒトＣＤ３０単クローン抗体ＨＲＳ−４及びＢｅｒ−Ｈ８によるヒト末梢血好酸球アポトーシス誘導をＤＮＡ断片化を指標として試験した結果を示す電気泳動の図である。
図８は、抗ヒトＣＤ３０単クローン抗体ＨＲＳ−４及びＢｅｒ−Ｈ８と抗ヒトＦａｓ単クローン抗体とのヒト末梢血好酸球アポトーシス誘導能を比較検討した結果を示すグラフである。
図９は、抗ヒトＣＤ３０単クローン抗体ＨＲＳ−４及びＢｅｒ−Ｈ８の好中球に対するアポトーシス誘導能の検討結果を示すグラフである。
図１０は、抗ヒトＣＤ３０単クローン抗体ＨＲＳ−４及びＢｅｒ−Ｈ８のリンパ球に対するアポトーシス誘導能の検討結果を示すグラフである。
図１１は、抗ヒトＣＤ３０単クローン抗体ＨＲＳ−４及びＢｅｒ−Ｈ８の培養ヒトマスト細胞に対するアポトーシス誘導能の検討結果を示すグラフである。
図１２は、抗ヒトＣＤ３０単クローン抗体ＨＲＳ−４及びＢｅｒ−Ｈ８によるヒト末梢血好酸球アポトーシス誘導に対する高濃度ＩＬ−５の影響を示すグラフである。
図１３は、ヒト末梢血好酸球に対する抗マウスＣＤ３０単クローン抗体（ＹＭＳＭ６３６．４．１０）のアポトーシス誘導の検討結果を示すグラフである。
図１４は、ヒト末梢血好酸球に対するマウスＣＤ３０リガンドのアポトーシス誘導の検討結果を示すグラフである。
図１５は、ヒト末梢血好酸球に対するポリスチレンマイクロビーズ固相化抗ヒトＣＤ３０単クローン抗体ＨＲＳ−４及びＢｅｒ−Ｈ８によるアポトーシス誘導の検討結果を示すグラフである。
図１６は、ポリスチレンマイクロビーズ固相化抗ヒトＣＤ３０単クローン抗体ＨＲＳ−４及びＢｅｒ−Ｈ８によりアポトーシスを誘導されたヒト末梢血好酸球に対する、ヒト臍帯血由来マクロファージによる貪食試験の結果を示すグラフである。
図１７は、ポリスチレンマイクロビーズ固相化抗ヒトＣＤ３０単クローン抗体ＨＲＳ−４及びＢｅｒ−Ｈ８によりアポトーシスを誘導されたヒト末梢血好酸球に対する、ＰＭＡ刺激ヒト単球系細胞株Ｕ９３７細胞による貪食試験の結果を示すグラフである。
Claims (9)
- ＣＤ３０及び／又はＣＤ３０のシグナル伝達に関与する分子を介して好酸球アポトーシスを誘導する物質を有効成分とする好酸球増多性疾患治療剤。
- ＣＤ３０及び／又はＣＤ３０のシグナル伝達に関与する分子を介して好酸球アポトーシスを誘導する物質が、Ｂｅｒ−Ｈ８又はＨＲＳ−４が認識する部位を認識する免疫グロブリン若しくはその活性フラグメント、ペプチド又は低分子化合物である請求項１記載の好酸球増多性疾患治療剤。
- ＣＤ３０及び／又はＣＤ３０のシグナル伝達に関与する分子を介して好酸球アポトーシスを誘導する物質が、免疫グロブリン又はその活性フラグメントである請求項１記載の好酸球増多性疾患治療剤。
- 少なくとも配列番号１記載のアミノ酸配列（ＣＤ３０のアミノ酸配列のうち、１１２−４１２位のアミノ酸配列）の一部又は全部を認識する免疫グロブリン又はその活性フラグメントである請求項２記載の好酸球増多性疾患治療剤。
- 免疫グロブリンがＢｅｒ−Ｈ８又はＨＲＳ−４である請求項４記載の好酸球増多性疾患治療剤。
- ＣＤ３０及び／又はＣＤ３０のシグナル伝達に関与する分子を介して好酸球アポトーシスを誘導する物質が、ＣＤ３０リガンド又はその活性フラグメントである請求項１記載の好酸球増多性疾患治療剤。
- ＣＤ３０及び／又はＣＤ３０のシグナル伝達に関与する分子を介して好酸球アポトーシスを誘導する物質が、ＣＤ３０リガンド又はその活性フラグメントをコードする核酸である請求項１記載の好酸球増多性疾患治療剤。
- 好酸球増多性疾患が、アレルギー疾患、呼吸器疾患、皮膚疾患、自己免疫疾患、免疫不全疾患、消化器疾患、腫瘍性疾患又は寄生虫感染性疾患から成る群から選ばれた疾患である請求項１記載記載の好酸球増多性疾患治療剤。
- アレルギー疾患が、薬剤アレルギー、気管支喘息、アレルギー性鼻炎から成る群から選ばれた疾患である請求項８記載の好酸球増多性疾患治療剤。
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