WO2001042426A1 - Produccion de penicilina mediante la utilización de cepas transgenicas merodiploides - Google Patents

Produccion de penicilina mediante la utilización de cepas transgenicas merodiploides Download PDF

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WO2001042426A1
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penicillin
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Teresa SUÁREZ GONZALEZ
Geoffrey Turner
Herbert Arst
Miguel Angel PEÑALVA SOTO
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Consejo Superior De Investigaciones Científicas
University Of Sheffield
Imperial College Of Science And Medicine
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    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi

Definitions

  • Penicillium chrysogenum and the phylogenetically related fungus Aspergillus nidulans synthesize benzylpenicillin (penicillin G) from the same amino acid and phenylacetate precursors.
  • penicillin G benzylpenicillin
  • PacC is synthesized inactively (674 amino acid residues) and is activated by proteolytic elimination of about 400 amino acids in its carboxyl-terminal region.
  • the resulting protein (approximately 250 residues) is a transcriptional activator of penicillin biosynthesis genes [Tilburn, J. et al. (1995) The Aspergillus PacC zinc finger transcription factor mediates regulation of both acid- and alkaline-expressed genes by ambient pH EMBO J. 14: 779-790; Orejas, M. et al. (1995) Activation of the Aspergillus PacC transcription factor in response to alkaline ambient pH requires proteolysis of the carboxy-terminal moiety. Gene Develop 9: 1622-1632]. This proteolytic processing occurs in response to a signal that is transmitted when the environment is alkaline.
  • pacC nidulans mutations in the pacC gene that produce a truncation in the carboxyl terminal region of the protein between amino acids 263 and 574 (considering the ATG codon at position 5 of the ORF as the main point of translation initiation) they cause the proteolytic activation independent of the environmental pH of the protein, mimic alkaline environmental conditions and result in a gain of pacC gene function, so that, whatever the pH of the medium, there is a high expression of the genes that must function at pH alkaline and a reduced expression of those that must function at acidic pH.
  • Alkaline genes whose expression is increased in this genetic background, include genes from the penicillin biosynthesis pathway.
  • pacC 0 mutations behave as codominant in heterozygous diploids with a wild allele pacC + .
  • the behavior of these mutations in merodiploid lines with two copies of the pacC gene (one of them pacC 0 and the second pacC + ) and the rest of the genome in their normal haploid condition is unknown.
  • Penicillium chrysogenum there is a homologue of the pacC gene of A. nidulans [Suárez T.
  • Pc-pacC a transcription factor that has approximately 64% amino acid sequence identity with its A. nidulans counterpart.
  • the 641 amino acid sequence deduced for Pc-PacC is shown in SEQ. ID NO 1.
  • Genetic engineering technology is very poorly developed in the industrial organism Penicillium chrysogenum in relation to the model organism A. nidulans. For example, it has been shown that gene inactivation by homologous recombination with null alleles of a gene is very inefficient [Pe ⁇ alva, MA et al. (1998) The optimization of penicillin biosynthesis in fungi. Trends in Biotechnology 16: 483-489].
  • the object of the present invention is the genetic engineering design of a transgenic merodiploid strain of Penicillium chrysogenum in which the activity of a regulatory gene that controls penicillin biosynthesis has been altered in a directed manner.
  • This invention represents the first case in which penicillin biosynthesis has been improved by manipulation of a regulatory gene, and therefore presents a remarkable novelty about previously used technologies.
  • the present invention proposes the generation of merodiploid strains that contain, in addition to the wild copy of the pacC gene, one or more additional copies of a mutant version of the pacC gene encoding a truncated protein in amino acid 477. All these merodiploid strains are remarkably superproductive of penicillin in relation to the maternal lineage and show elevated levels of transcription of at least two antibiotic biosynthesis genes, thus demonstrating the validity of the approach followed.
  • a series of merodiploid strains derived from P. chrysogenum NRRL1951 have been constructed.
  • the wild pacC gene of this strain encodes a 641 amino acid protein whose sequence is shown in SEQ ID NO 1.
  • these transgenic strains contain one or several copies of pacC33, an allelic variant of pacC of 481 residues that it codes for a normal PacC protein until its residue 477 after which four abnormal amino acids are added, due to a change in reading pattern resulting from truncation, with which it ends at its terminal carboxyl end (see SEQ ID NO 3).
  • the cDNA nucleotide sequence encoding this truncated protein is presented in SEQ ID NO 2).
  • the pacC gene of P chrysogenum has an intron from nucleotide 223 of 56 bp [not included in SEQ ID NO 2; Suárez T.
  • This truncated protein is designed to provide PacC function gain, by analogy to the situation in A. nidulans, regardless of the presence or absence of the signal transduced by the pal gene pathway.
  • the transformation marker used for the construction of several of the transgenic lines was the sC gene, which codes for the enzyme ATP-sulfurylase, which converts sulfate into adenosine 5'-phosphosulfate.
  • This conversion is an essential step for the use of inorganic sulfate as the sole source of sulfur for P chrysogenum and other fungi, so the sC ⁇ mutants are unable to grow in medium with sulfate as a source of sulfur, although they normally do so in medium. supplemented with sources of organic sulfur, such as L- or D-methionine.
  • the selection of the transformants in a sC ⁇ genetic background is made by their ability to grow in sulfate medium, which differentiates them from the sC parental line.
  • Selenate (Se0 4 2 " ) that penetrates cells through sulfate permease, is a toxic compound for fungi. For example, it inhibits the growth of P. chrysogenum NRRL1951 at 10 mM concentration, allowing the isolation of mutants resistant, which may have loss-of-function mutations in the sB gene (which codes for sulfate and selenate permease) or in the sC gene. These two mutant classes are distinguished, for example, because sB ⁇ mutants can grow using choline sulfate as the sole source of sulfur, while sC mutants do not. Therefore, mutants spontaneously resistant to selenate were selected in the recipient strain.
  • mutant clones were isolated and purified, their ability to grow in different compounds as a source of sulfur was analyzed to diagnose the inactivated gene in each case by the mutation that conferred selenate resistance [HN Arst, Jr. (1968) Genetic analysis of the final steps of sulphate metabolism ⁇ n Aspergillus nidulans. Nature 219: 268-270]. In this way several mutants presumably affected in the sC gene were identified. The frequency of reversal of five of these mutants was calculated and two of them were reversed with a frequency less than 2x10 "7.
  • a chimeric gene was also used as the marker in which the fleomycin resistance bacterial ble gene (antibiotic to which P chrysogenum is sensitive) is expressed under the control of transcription promoter sequences from the gpdA promoter of A. nidulans and of the CYC1 gene terminator of Saccharomyces cerevisiae.
  • the use of this chimeric gene, which behaves as a dominant marker for the selection of transformants in P. chrysogenum has been described by Kolar [Kolar, M. et al. (1988) Transformation of Penicillium chrysogenum, using dominant selection markers and expression of an Escherichia colilacZ fusion gene. Gene 62: 127-134]. Previous experiments (see Examples) allowed to establish that a concentration of 1 ⁇ g / ml of Fleomycin was optimal for the selection of transformants in the wild strain NRRL1951.
  • a mutant Pc-pacC gene (SEQ ID NO 2) encoding a truncated 481 amino acid protein (SEQ ID NO 3) was introduced into the vectors pPhleo and pPcsC to give rise to the recombinant plasmids pPacC33 (Phleo) and pPacC33 (sC ), respectively (Fig. 1 B and C).
  • This mutant Pc-pacC allele was called pacC33 and carries upstream of the translation initiator ATG, 1550 bp from the promoter region of the Pc-pacC gene.
  • the Pc-pacC gene promoter is a weak promoter [Suárez T.
  • plasmid pPacC (sC) was constructed, which differs from pPacC33 (sC) in that it carries the Pc-pacC + allele instead of pacC33 (see Figure 1 D, map of plasmids).
  • Plasmids were introduced by transformation into P chrysogenum NRRL1951 (pPacC33 (Phleo)) or into their mutant derived strain sC14 (pPacC33 (sC) and pPacC (sC)). After the selection and purification of the transformants and the analysis of the situation and number of copies of the plasmid integrated into the genome by Southern technique, the following transformants that have been deposited in the Spanish Type Culture Collection (CECT) were selected: TX5 (CECT 20328) is a strain of P. chrysogenum with 3 copies of pPacC33 (Phleo) integrated in tandem at an indeterminate position of the genome.
  • TSC4 (CECT 20329) is a strain of P. chrysogenum with a single copy of pPacC33 (sC) integrated into the sC locus.
  • TSC7 (CECT 20330) is a strain of P chrysogenum with a single copy of pPacC33 (sC) integrated into the pacC locus.
  • TSC03 (CECT 20331) is a strain of P. chrysogenum with a single copy of pPacC (sC) integrated into the pacC locus. All these lines are morphologically indistinguishable from the wild strain NRRL1951. Results of the application of this technology
  • the TX5, TSC4 and TSC7 merodiploid lineages are hyperproducers of penicillin G, compared to the NRRL1951 lineage and with its mutant strain NRRL1951 sC14 receptor of the transgenes, with which they showed no differences in growth or variation in the pH of the culture medium.
  • the production of penicillin and growth rate of the sC14 strains and their NRRL1951 parent was very similar, showing that the sC14 mutation does not affect the production of the antibiotic (Figure 2).
  • sucrose as a carbon source which normally suppresses the production of penicillin G
  • merodiploid lines reached, for example, levels at least 5 times higher than those obtained from strain sC14 (see detailed description and Figure 3).
  • strain TSC03 (with two copies of the wild pacC gene), is also hyperproductive of penicillin with respect to strain sC14, although to a much lesser extent than, for example, strain TSC7 with a copy of the wild gene and a second copy of the allele pacC33 (Figure 4).
  • These results validate the principles used in this invention of (i) designing transgenic lines with increased pacC function in order to overproduce penicillin and (i) design pacC mutations that provide gain in function and that behave as co-dominant in merodiploids with a copy of the wild pacC gene.
  • Strains TX5, TSC4 and TSC7 are also overproducers of penicillin in lactose media, where production levels are approximately double those obtained with sC14 or NRRL 1951 ( Figure 5).
  • RNA of the different transformants on different days of the penicillin G production cultures was analyzed by the northern technique with specific probes for the structural genes pcbAB, which codes for ACV synthetase, and pcbC, which codes for IPNS synthetase, of the penicillin biosynthesis pathway.
  • the quantification with Phosphorimager of the hybridization signals of the membranes allowed to determine the transcription profiles of these genes in the sC14 receptor strain grown under conditions of controlled inoculum and agitation. In this strain, transcripts of these genes were detected from day 3, with a maximum level on days 5-6 after sowing.
  • the transgenic strain TSC7 reproducibly showed, an increase of approximately two times in the maximum level of transcription of these two genes with respect to strain sC14 (Fig. 6).
  • the present invention describes a new method that allows to increase the synthesis of penicillin by the genetic manipulation of a regulatory gene, pacC.
  • a mutated form of this gene is presented for the first time in P chrysogenum, called pacC33, which encodes a protein with function gain and whose sequence (SEQ ID NO 2) forms part of the present invention.
  • This information allows to develop other mutated forms, complete or partial, both by synthesis of new DNA sequences and by isolation and identification of natural forms, of homologous genes in other ascomycetes, which encode new proteins with gain in function with respect to the wild PacC protein. , and form part of the present invention.
  • promoters for the expression of these mutated forms, different from the promoter of the pacC gene, whether they are conditional or constitutive promoters, is an obvious variant of this invention and is part of it.
  • transgenic merodiploid strains for the pacC gene of P chrysogenum that have a wild allele and another pacC mutant, modified in a directed manner are overproductive strains of penicillin and have elevated levels of transcripts of at least two genes involved in the penicillin biosynthesis
  • the pacC regulatory gene controls the synthesis of other secondary metabolites and numerous extracellular enzymes.
  • the use of this technology for the construction of transgenic P chrysogenum lines using the strategy described here (or variants thereof) to modify in a positive or negative sense the pacC function in order to increase the synthesis of extracellular metabolites and enzymes of utility or Preventing undesirable metabolites, such as aflatoxins, is covered by this application.
  • the transfer of the technology described in this application to other fungi of industrial interest such as, for example, Aspergillus niger or Thricoderma ressei is evident and is covered by this application.
  • the transfer of this technology to other ascomycete regulatory genes in order to increase the synthesis of useful extracellular metabolites and enzymes or to prevent undesirable metabolites is also covered by this application.
  • Example 1 Obtaining mutant strains in the gene encoding ATP-sulfurylase.
  • the wild strain of P chrysogenum NRRL1951 was obtained from CBS (Holland).
  • 1.5 x 10 8 spores of this strain were plated on 30 medium minimum plates [Cove, DJ (1966) The induction and repression of nitrate reduced in the fungus Aspergillus nidulans. Biochim.Biophys.Acta 113: 51-56] with 10 mM sodium selenate and 10 ⁇ g / ml D-methionine and 1% glucose and 10 mM ammonium tartrate, as a source of carbon and nitrogen, respectively.
  • the selenate resistant mutants appeared with a frequency of 1.5 x 10 "7 spores. Once purified, the phenotype of the mutants was checked by growth tests.
  • Selenate-resistant mutants can map at least two structural genes, sC (ATP-sulfurylase) and sB (sulfate permease). Mutants in the sC gene do not grow in a medium with choline sulfate as a source of S, a compound that is capable of supplementing permease deficiency, as it enters the cell through an alternative permease to sulfate / selenate. In this way, 7 sC ⁇ putative mutants were identified. In order to verify which of them were definitely sC ⁇ mutants, we proceeded to test by transformation with the plasmid pINESI (Fig.
  • Plasmid pINESI ( Figure 1A), from which the sC gene of P chrysogenum was obtained, is a derivative of pBR322 that includes a 1.5 kb EcoRI-EcoRV fragment with the pyr4 gene of Neurospora crassa and a 6.1 fragment kb EcoRV-Sa / l genomic DNA of P chrysogenum containing the sC gene.
  • Different plasmids were constructed bearing a wild allele or a pacC33 mutant allele of the pacC gene of P chrysogenum.
  • Plasmid pPacC33 (Phleo) ( Figure 1B) was constructed using pBluescript II SK + as the basis. This vector was digested with EcoRI and pt?
  • Plasmid pPacC33 (sC) ( Figure 1C), was constructed analogously to pPacC33 (Phleo), except that in this case, a functional sC gene was inserted into the ⁇ a HI site, instead of the fleomycin resistance gene, which it was obtained from pINES as a 4.3 kb BglU fragment ( Figure 1A).
  • Plasmid pPacC (sC) ( Figure 1 D) is a derivative of pBS-SK +, in which a 7.5 kb EcoRI-Sa / l fragment was first introduced, containing the wild allele of the pacC gene with the same promoter fragment present in plasmids pPacC33 (Phleo) and pPacC33 (sC). Subsequently, the DNA fragment containing the sC gene was introduced in the same manner as in pPacC33 (sC).
  • Penicillium transformation was carried out following the protocol described for A. nidulans [Tilburn, J. et al. (1983) Transformation by integration in Aspergillus nidulans. Gene 26: 205-211] with slight modifications.
  • the protoplasts were obtained as described in example 2.
  • the protoplasts were resuspended in STC (1 M sorbitol, 10 mM Tris HCI pH 7.5, 10 mM CaCI 2 ), washed twice in this buffer and resuspended at concentration of 1-2 x 10 7 protoplasts in 200 ⁇ l of STC.
  • the purified transformants were grown to obtain mycelium, from which the DNA was extracted following the Pérez-Esteban method [Pérez Esteban, B. et al. (1993) Molecular characterization of a fungal secondary me ⁇ abolism promo ⁇ er: transcription of the Aspergillus nidulans isopenicillin N synthetase gene is modulated by ups ⁇ ream negative elements. Mol.Microbiol. 9: 881-895].
  • Esie DNA was digested with the EcoRI or Xba ⁇ enzymes to determine the number of copies of the plasmid and its place of integration into the genome. The digested DNAs were loaded on 0.7% agarose gels to separate the restriction fragments, which were transferred to a nitrocellulose membrane.
  • This membrane was incubated 2 h at 80 ° to fix the DNA. Subsequently, it was pre-hybridized for 2 h at 42 °, in 50% formamide, 5X Denhart solution, 5X SSC and 0.1% SDS with 50 ⁇ g / ml DNA single-stranded sonic salmon sperm, after which 50 ng of the corresponding probe was added: either the 2.8 kb EcoRI-H / ndlII fragment containing the ble gene, or the 4.3 kb BglW fragment containing the sC gene or a 1.3 kb Hind ⁇ - Kpn ⁇ fragment of genomic DNA from P. chrysogenum belonging to the pacC gene, in all cases marked radioactively.
  • Hybridization was carried out for 18 to 42 °. Final washing of the filters was carried out for 15 min at 65 ° C in 0.2X SSC, 0.1% SDS. The filters were exposed to autoradiographic film or in Phosphorimager for radioactivity dejection.
  • the pacC gene probe revealed in the wild strain sC14 a 4 kb Xba ⁇ band that is transformed into two new 6 and 8.3 kb bands in the TSC7 (where the PacC33 (sC) plasmid is integrated into the locus pacC, Figures 7A and 8A).
  • the probe of the sC gene revealed in the wild strain sC14 a 7 kb band that becomes two bands of 6.5 and 10.8 kb in the TSC4 transform (pPacC33 (sC) embedded in the sC locus, Figures 7B and 8B ).
  • This last band is 3 times more intact if the band comes from the pacC residence gene and its mobility corresponds to the size of the plasmid, so it was considered that the TX5 merodiploid is an intraformity with 3 copies integrated in a modem in an undefined position. of the genome ( Figure 8C).
  • Example 6 Production of penicillin in sucrose as a carbon source
  • Figure 2 shows that the level of penicillin production of strain sC14 is very similar to that of strain NRRL 1951 from which it originates, indicating that the mutation does not affect antibiotic production.
  • the growth of the different strains was very similar in terms of biomass measurement and evolution of extracellular pH.
  • the TX5, TSC4 and TSC7 transgenic spirits reproducibly produced significantly higher levels of penicillin than the sC14 parental strain, both with sucrose ( Figure 3), and with lactose
  • RNAs were transferred to niylcellulose membranes, which were dried at 80 ° C to fix the RNA. These membranes were hybridized with probes that allowed to indicate the following genes: pacC (internal fragmenio Hind ⁇ - Kpn ⁇ of 1, 3 kb); pcbC (internal fragment Nco ⁇ -Bam ⁇ 0.9 kb); pcbAB (2.4 kb EcoRI fragmenio) and the 955 bp Nco ⁇ -Kpn ⁇ fragment of the acnA gene of A. nidulans, which codes for the acyin, and which was used as a homogeneity charge conirol between the samples.
  • pacC internal fragmenio Hind ⁇ - Kpn ⁇ of 1, 3 kb
  • pcbC internal fragment Nco ⁇ -Bam ⁇ 0.9 kb
  • pcbAB 2.4 kb EcoRI fragmeni
  • the hybridization conditions were identical to those described in example 5, except that the amount of probe added was 100 ng.
  • the final wash was performed in the same iampon, but at 42 ° C.
  • the northern experiments included a lane with 10 ⁇ g of mRNA obtained from a mycelium of the sC14 strain grown for 39 h in the medium of production of penicillin with 3% lacosase. All the nilrocellulose membranes, after washing, were exposed for 15-18 hours to a Phosphorlmager panicle, sensitive to the ⁇ emission of P 32 . These screens were subsequently read in a Phosphorlmager (Molecular Dynamics) and hybridization signals were quantified using ImageQuan ⁇ software from the same commercial house.
  • the membranes were hybridized with a probe that reveals the acryin mRNA.
  • the quaniifications of the bands revealed with the pcbC, pcbAB and pacC probes were normalized against the intensity obtained in the acline band in each lane. All these quotients for a given gene of the same membrane were normalized to the value of the common lane (mycelium RNA sample of slirpe sC14 grown in lac ⁇ osa during 39 h), in order to be able to compare intensity measures of different membranes. These measurements, with their standard deviation, are those shown in Figure 6, for the messenger RNAs of pcbAB and pcbC.
  • FIGURES Figure 1 Schematic restriction maps of plasmids used in the construction of merodiploid strains of P. chrysogenum.
  • the different genes are indicated with the following of: black, pyr4 gene of N. crassa; empty box, region of the sC gene of P. chrysogenum (the arrow indicates the approximate position of the gene and the direction of transcription); striped box, fleomycin resistance gene, with the vertical striped E.
  • the gray box indicates the region of the pacC gene of P chrysogenum, with the position, ashen of the silveslre allele as of the muian, indicated with an arrow.
  • Figure 2. Growth and production of penicillin of P. chrysogenum NRRL1951 and sC14 strains. Measures of penicillin production, pH and dry weight were repressed in cultures of strains NRRL1951 and sC14 carried out in penicillin production medium with 3% sucrose (A) or lactose (B), as the main source of carbon.
  • Figure 3 Growth and production of penicillin from the transgenic strains pacC + / pacC33. Measures of penicillin production and growth rate (pH and dry weight) in cultures of the TX5, TSC4 and TSC7 transgenic lineages, pacC + / pacC33 merodiploids, compared to the sC14 parenchymal line. The cul ⁇ ivos were made in the middle of penicillin production with sucrose as the main source of carbon.
  • Figure 4 Growth and production of penicillin from the transgenic strain pacC + / pacC *. Measurement of the growth iasa (exracellular pH, A) and the production of penicillin (B) of the TSC03 fransgenic strain, pacC * / pacC + merodiploid, compared to the sC14 parenchymal strain. The cul ⁇ ivos were made in the middle of penicillin production with sucrose as the main source of carbon. In panel B, the difference in the penicillin production between the pacC + / pacC + merodiploid (TSC03) and a pacC + / pacC33 merodiploid (TSC7).
  • TSC03 the difference in the penicillin production between the pacC + / pacC + merodiploid
  • TSC7 a pacC + / pacC33 merodiploid
  • Figure 5 Production of penicillin in medium with lactose. Measurement of the production of penicillin in lactose from the merodiploid strains pacC + / pacC33, TSC4, TSC7 and TX5, compared with the parenchial sirir sC14.
  • Figure 6 Quantification of the mRNA levels of pcbC and pcbAB in strains sc14 and TSC7. The measures are expressed in arbitrary units (UA). In abcisas the time of cul ⁇ ivo is indicated. Data are average of experiments and error bars indicate standard deviation.
  • Figure 7 - Analysis by the Southern method of merodiploid strains of P. chrysogenum. DNA samples from the dissimilar sphincters were digested with Xbal. The ulilized probe was a fragmentation of the pacC gene (A, C and D) or the sC (B) gene. The arrows indicate the hybridization bands obtained with the merodiploids and the receiving strain, as indicated in the text.
  • FIG. 8 Graphical scheme of plasmid recombination events.
  • the genome of the fungus is indicated by the thin line.
  • the box with thick stripes represents the sC gene (wild or mutant versions, sc14) and the white arrow indicates the direction of transcription.
  • the pacC + or pacC c 33 genes are represented by a white box with an internal arrow (indicating the direction of transcription).
  • the fleomycin resistance gene was indicated by a box with fine stripes and plasmid sequences, by a thick, conlinent line.

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Abstract

El objeto de la presente invención es un procedimiento de obtención de una cepa merodiploide transgénica de Penicillium chrysogenum en la que se ha alterado de manera dirigida la actividad de un gen regulador que controla la biosíntesis de penicilina por lo que esta cepa es hiperproductora de penicilina. Esta invención representa el primer caso en el que la biosíntesis de un metabolito de interés industrial ha sido incrementada por manipulación de un gen regulador, y por lo tanto presenta una notable novedad sobre las tecnologías previamente utilizadas.

Description

TÍTULO:
PRODUCCIÓN DE PENICILINA MEDIANTE LA UTILIZACIÓN DE CEPAS TRANSGÉNICAS MERODIPLOIDES.
SECTOR DE LA TÉCNICA
Biotecnología. Ingeniería genética de microorganismos. Síntesis de antibióticos. Penicilina
ESTADO DE LA TÉCNICA
Tanto Penicillium chrysogenum como el hongo filogenéticamente relacionado Aspergillus nidulans sintetizan benzilpenicilina (penicilina G) a partir de los mismos precursores aminoacídicos y de fenilacetato. Hasta el presente, se ha conseguido mejorar la producción de penicilina por ingeniería genética en estos hongos mediante, por ejemplo:
(i) un incremento en la expresión de uno o más de los tres genes estructurales responsables de convertir los precursores aminoacídicos y fenilacetil-CoA en penicilina G [Peñalva, M.A et al. (1998) The optimization of penicillin biosynthesis in fungí. Tren s in Biotechnology 16: 483-489], (i¡) la interrupción (en A. nidulans) de la ruta de catabolismo de fenilacetato y su consiguiente canalización hacia la biosíntesis de penicilina [Mingot, J. M. et al. (1999) Disruption of phacA, an Aspergillus nidulans gene encoding a novel cytochrome P450 monooxygenase catalyzing phenylacetate 2- hydroxylation, results in penicillin overproduction. J Biol Chem 274:14545- 14550; también Patente española P97700833],
(iii) la sobreexpresión (en P. chrysogenum) de una fenilacetil-CoA ligasa de origen bacteriano [Miñambres, B. et al. (1996). Molecular cloning and expression in different microbes of the DNA encoding Pseudomonas putida U phenyiacetyl-CoA ligase - Use of this gene to improve the rate of benzylpenicillin biosynthesis in Penicillium chrysogenum. J Biol Chem 271 :33531-33538; también Patente P9600664], y (iv) la canalización del precursor ácido α-aminoadípico hacia la biosíntesis de penicilina por interrupción de la biosíntesis de lisina a partir de dicho precursor [Casqueiro, J. et al. (1999) Gene targeting in Penicillium chrysogenum: disruption of the Iys2 gene leads to penicillin overproduction. J Bacteriol. 181 :1181-1188].
Todas estas estrategias se basan en la ganancia de función (mediante sobreexpresión) o en la inactivación de genes estructurales implicados en la biosíntesis de precursores de penicilina considerados individualmente. Esta invención cubre una posibilidad alternativa que no había sido previamente explorada, que es la manipulación por ingeniería genética de un gen regulador para incrementar simultáneamente la función de varios genes estructurales bajo su control. La ventaja es que es de aplicación general a otros metabolitos secundarios y no requiere la identificación previa de los genes estructurales cuya expresión se modifica en el organismo receptor. En A. nidulans [Espeso, E. A. et al. (1993) pH regulation is a major determinant in expression of a fungal penicillin biosynthetic gene. EMBO J. 12:3947-3956] y P. chrysogenum [Suárez T. y Peñalva M.A. (1996) Characterization of a Penicillium chrysogenum gene encoding a PacC transcription factor and its binding sites in the divergent pcbAB-pcbC promoter of the penicillin biosynthetic cluster. Mol.Microbiol. 20:529-540], la ruta de biosíntesis de penicilina está regulada positivamente por la proteína con dedos de zinc PacC (Tilburn, J. et al (1995) The Aspergillus PacC zinc finger transcription factor mediates regulation of both acid- and alkaline-expressed genes by ambient pH. EMBO J. 14:779-790]. En A. nidulans, PacC se sintetiza en forma inactiva (674 residuos aminoacídicos) y es activada mediante eliminación proteolítica de unos 400 aminoácidos en su región carboxilo- terminal. La proteína resultante (aproximadamente 250 residuos) es un activador transcripcionai de los genes de biosíntesis de penicilina [Tilburn, J. et al. (1995) The Aspergillus PacC zinc finger transcription factor mediates regulation of both acid- and alkaline-expressed genes by ambient pH. EMBO J. 14: 779-790; Orejas, M. et al. (1995) Activation of the Aspergillus PacC transcription factor in response to alkaline ambient pH requires proteolysis of the carboxy-terminal moiety. Gene Develop. 9:1622-1632]. Este procesamiento proteolítico se produce en respuesta a una señal que se transmite cuando el medio ambiente es alcalino.
En A. nidulans mutaciones (denominadas pacC ) en el gen pacC que producen un truncamiento en la región carboxilo terminal de la proteína entre los aminoácidos 263 y 574 (considerando el codon ATG en posición 5 de la ORF como punto principal de iniciación de traducción) causan la activación proteolítica independiente de pH ambiental de la proteína, mimetizan condiciones ambientales alcalinas y resultan en ganancia de función génica pacC, con lo que, cualquiera que sea el pH del medio, se produce una expresión elevada de los genes que deben funcionar a pH alcalino y una expresión reducida de aquellos que deben funcionar a pH ácido. Los genes "alcalinos", cuya expresión se ve incrementada en este fondo genético, incluyen genes de la ruta de biosíntesis de penicilina. En A. nidulans, las mutaciones pacC0 se comportan como codominantes en diploides heterozigóticos con un alelo silvestre pacC+. Se desconoce el comportamiento de estas mutaciones en estirpes merodiploides con dos copias del gen pacC (una de ellas pacC0 y la segunda pacC+) y el resto del genoma en su condición normal haploide. En el organismo industrial Penicillium chrysogenum existe un homólogo del gen pacC de A. nidulans [Suárez T. y Peñalva M.A. (1996) Characterization of a Penicillium chrysogenum gene encoding a PacC transcription factor and its binding sites in the divergent pcbAB-pcbC promoter of the penicillin biosynthetic cluster. Mol.Microbiol. 20: 529-540]. Dicho gen (que denominaremos Pc-pacC) posiblemente regula de manera positiva la ruta biosintética de penicilina G, con lo que un incremento en la función pudiera resultar en un incremento en los niveles de producción de este antibiótico. Pc- pacC (GenBank ID U44726) codifica para un factor de transcripción (Pc-PacC) que tiene aproximadamente un 64% de identidad de secuencia de aminoácidos con su homólogo de A. nidulans. La secuencia de 641 aminoácidos deducida para Pc-PacC se muestra en SEQ. ID NO 1. La tecnología de ingeniería genética está muy poco desarrollada en el organismo industrial Penicillium chrysogenum en relación con el organismo modelo A. nidulans. Por ejemplo, se ha demostrado que la inactivación génica por recombinación homologa con alelos nulos de un gen es muy ineficiente [Peñalva, M.A. et al. (1998) The optimization of penicillin biosynthesis in fungi. Trends in Biotechnology 16: 483-489].
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
Breve descripción
El objeto de la presente invención es el diseño por ingeniería genética de una cepa merodiploide transgénica de Penicillium chrysogenum en la que se ha alterado de manera dirigida la actividad de un gen regulador que controla la biosíntesis de penicilina. Esta invención representa el primer caso en el que la biosíntesis de penicilina ha sido mejorada por manipulación de un gen regulador, y por lo tanto presenta una notable novedad sobre las tecnologías previamente utilizadas.
Para evitar las dificultades tecnológicas antes mencionadas, en la presente invención se propone la generación de estirpes merodiploides que contienen, además de la copia silvestre del gen pacC, una o más copias adicionales de una versión mutante del gen pacC que codifica para una proteína truncada en el aminoácido 477. Todas estas cepas merodiploides son notablemente superproductoras de penicilina con relación a la estirpe materna y muestran niveles elevados de transcripción de al menos dos genes de la biosíntesis del antibiótico, demostrando así la validez del abordaje seguido.
Descripción detallada de la invención
Se han construido una serie de cepas merodiploides derivadas de P. chrysogenum NRRL1951. El gen pacC silvestre de esta estirpe codifica una proteína de 641 aminoácidos cuya secuencia se muestra en SEQ ID NO 1.
Además del gen pacC silvestre, estas cepas transgénicas contienen una o varias copias de pacC33, una variante aléiica de pacC de 481 residuos que codifica para una proteína PacC normal hasta su residuo 477 tras el que se añaden, debido a un cambio de pauta de lectura resultante del truncamiento, cuatro aminoácidos anormales, con los que termina en su extremo carboxilo terminal (ver SEQ ID NO 3). La secuencia de nucleótidos de cDNA que codifica esta proteína truncada se presenta en la SEQ ID NO 2). El gen pacC de P chrysogenum tiene un intrón a partir del nucleótido 223 de 56 pb [no se incluye en SEQ ID NO 2; Suárez T. y Peñalva M.A. (1996) Characterization of a Penicillium chrysogenum gene encoding a PacC transcription factor and its binding sites in the divergent pcbAB-pcbC promoter of the penicillin biosynthetic cluster. Mol.Microbiol. 20: 529-540]. Esta proteína truncada está diseñada para que proporcione ganancia de función PacC, por analogía a la situación en A. nidulans, independientemente de la presencia o ausencia de la señal transducida por la ruta de genes pal.
Selección de una cepa receptora de P. chrysogenum y de marcadores de transformación
El marcador de transformación utilizado para la construcción de varias de las estirpes transgénicas fue el gen sC, que codifica para el enzima ATP- sulfurilasa, que convierte el sulfato en adenosina 5'-fosfosulfato. Esta conversión es un paso esencial para la utilización de sulfato inorgánico como única fuente de azufre por P chrysogenum y otros hongos, por lo que los mutantes sC~ son incapaces de crecer en medio con sulfato como fuente de azufre, aunque lo hacen normalmente en medio suplementado con fuentes de azufre orgánico, como L- o D-metionina. La selección de los transformantes en un fondo genético sC~ se realiza por su capacidad de crecer en medio con sulfato, que les diferencia de la estirpe parental sC.
El selenato (Se04 2") que penetra en las células a través de la permeasa del sulfato, es un compuesto tóxico para los hongos. Por ejemplo, inhibe el crecimiento de P. chrysogenum NRRL1951 a concentración 10 mM, permitiendo el aislamiento de mutantes resistentes, que pueden tener mutaciones de pérdida de función en el gen sB (que codifica para la permeasa de sulfato y selenato) o en el gen sC. Estas dos clases mutantes se distinguen, por ejemplo, porque los mutantes sB~ pueden crecer utilizando sulfato de colina como única fuente de azufre, mientras que los mutantes sC no lo hacen. Por ello, en la cepa receptora se seleccionaron mutantes resistentes espontáneamente al selenato. Una vez aislados y purificados los clones mutantes, se analizó su capacidad de crecimiento en diferentes compuestos como fuente de azufre para diagnosticar el gen inactivado en cada caso por la mutación que confería resistencia a selenato [H. N. Arst, Jr.(1968) Genetic analysis of the final steps of sulphate metabolism ¡n Aspergillus nidulans. Nature 219:268-270]. De esta manera se identificaron varios mutantes presumiblemente afectados en el gen sC. Se calculó la frecuencia de reversión de cinco de estos mutantes y se seleccionaron dos de ellos que revertían con una frecuencia menor a 2x10"7. El gen funcional sC de P chrysogenum presente en el plásmido pINESI (Figura 1A) complementó las respectivas mutaciones presentes en estas estirpes, lo que sirvió para verificar que ambas eran mutantes sC De ellas se seleccionó aquélla que presentó una frecuencia de transformación más alta (45 transformantes por μg de pINESI). El alíelo sC mutante de esta estirpe se denominó sC14. Esta estirpe (sC14), que se usó como receptora de transformación, ha sido depositada en la CECT con el número 20327.
También se utilizó como marcador en la transformación un gen quimérico en el que el gen bacteriano ble de resistencia a fleomicina (antibiótico al que P chrysogenum es sensible) se expresa bajo el control de secuencias promotoras de la transcripción procedentes del promotor gpdA de A. nidulans y del terminador del gen CYC1 de Saccharomyces cerevisiae. La utilización de este gen quimérico, que se comporta como un marcador dominante para la selección de transformantes en P. chrysogenum ha sido descrita por Kolar [Kolar, M. et al. (1988) Transformation of Penicillium chrysogenum, using dominant selection markers and expression of an Escherichia colilacZ fusión gene. Gene 62:127-134]. Experimentos previos (ver Ejemplos) permitieron establecer que una concentración de 1 μg/ml de fleomicina era la óptima para la selección de transformantes en la cepa silvestre NRRL1951.
Preparación de los plásmidos transformantes, transformación y selección de las cepas transgénicas
Un gen Pc-pacC mutante (SEQ ID NO 2)que codifica para una proteína truncada de 481 aminoácidos (SEQ ID NO 3) se introdujo en los vectores pPhleo y pPcsC para dar lugar a los plásmidos recombinantes pPacC33(Phleo) y pPacC33(sC), respectivamente (Fig. 1 B y C). Este alelo Pc-pacC mutante se denominó pacC33 y lleva corriente arriba del ATG iniciador de traducción, 1550 pb de la región promotora del gen Pc-pacC. El promotor del gen Pc-pacC es un promotor débil [Suárez T. y Peñalva M.A. (1996) Characterization of a Penicillium chrysogenum gene encoding a PacC transcription factor and its binding sites in the divergent pcbAB-pcbC promoter of the penicillin biosynthetic cluster. Mol.Microbiol. 20:529-540]. Como control se construyó el plásmido pPacC(sC), que se diferencia de pPacC33(sC) en que lleva el un alelo Pc- pacC+ en lugar de pacC33 (ver Figura 1 D, mapa de los plásmidos).
Los plásmidos se introdujeron por transformación en P chrysogenum NRRL1951 (pPacC33(Phleo)) o en su estirpe derivada mutante sC14 (pPacC33(sC) y pPacC(sC)). Tras la selección y purificación de los transformantes y el análisis de la situación y número de copias del plásmido integradas en el genoma mediante la técnica de Southern, se seleccionaron los siguientes transformantes que se han depositado en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT): TX5 (CECT 20328) es una estirpe de P. chrysogenum con 3 copias de pPacC33(Phleo) integradas en tándem en una posición indeterminada del genoma. TSC4 (CECT 20329) es una estirpe de P. chrysogenum con una única copia de pPacC33(sC) integrada en el locus sC. TSC7 (CECT 20330) es una estirpe de P chrysogenum con una sola copia de pPacC33(sC) integrada en el locus pacC. TSC03 (CECT 20331) es una estirpe de P.chrysogenum con una sola copia de pPacC(sC) integrada en el locus pacC. Todas estas estirpes son morfológicamente indistinguibles de la cepa silvestre NRRL1951. Resultados de la aplicación de esta tecnología
Las estirpes merodiploides TX5, TSC4 y TSC7 son hiperproductoras de penicilina G, en comparación con la estirpe NRRL1951 y con su cepa mutante NRRL1951 sC14 receptora de los transgenes, con las que no mostraron diferencias de crecimiento o de variación del pH del medio de cultivo. La producción de penicilina y tasa de crecimiento de las cepas sC14 y su parental NRRL1951 fue muy similar, mostrando que la mutación sC14 no afecta la producción del antibiótico (Figura 2). Utilizando sacarosa como fuente de carbono (que normalmente reprime la producción de penicilina G) las estirpes merodiploides alcanzaron, por ejemplo, niveles al menos 5 veces superiores a los obtenidos de la cepa sC14 (ver descripción detallada y Figura 3). La estirpe TSC03 (con dos copias del gen pacC silvestre), también es hiperproductora de penicilina con respecto a la cepa sC14, aunque en mucha menor medida que, por ejemplo, la cepa TSC7 con una copia del gen silvestre y una segunda copia del alelo pacC33 (Figura 4). Estos resultados validan los principios utilizados en esta invención de (i) diseñar estirpes transgénicas con función pacC incrementada con objeto de sobreproducir penicilina y (¡i) diseñar mutaciones de pacC que proporcionen ganancia de función y que se comporten como co- dominantes en merodiploides con una copia del gen pacC silvestre. Las cepas TX5, TSC4 y TSC7 son también sobreproductoras de penicilina en medio con lactosa, donde los niveles de producción son aproximadamente el doble de los obtenidos con sC14 o NRRL 1951 (Figura 5).
El RNA de los distintos transformantes en diferentes días de los cultivos de producción de penicilina G se analizó por la técnica de northern con sondas específicas para los genes estructurales pcbAB, que codifica para la ACV sintetasa, y pcbC, que codifica para la IPNS sintetasa, de la ruta de biosíntesis de penicilina. La cuantificación con Phosphorimager de las señales de hibridación de las membranas, permitió determinar los perfiles de transcripción de estos genes en la cepa receptora sC14 cultivada en condiciones de inoculo y agitación controladas. En esta cepa, los transcritos de estos genes se detectaron a partir del día 3, con un nivel máximo en los días 5-6 tras la siembra. Como ejemplo, la cepa transgénica TSC7 mostró reproduciblemente, un aumento de aproximadamente dos veces en el nivel máximo de transcripción de estos dos genes con respecto a la cepa sC14 (Fig. 6).
En conclusión, la presente invención describe un nuevo procedimiento que permite incrementar la síntesis de penicilina mediante la manipulación genética de un gen regulador, pacC. Se presenta por primera vez una forma mutada de este gen en P chrysogenum, denominada pacC33, que codifica una proteína con ganancia de función y cuya secuencia (SEQ ID NO 2) forma parte de la presente invención.
Esta información permite desarrollar otras formas mutadas, completas o parciales, tanto por síntesis de nuevas secuencias de ADN como por aislamiento e identificación de formas naturales, de genes homólogos en otros ascomicetos, que codifiquen nuevas proteínas con ganancia de función respecto a la proteína salvaje PacC, y forman parte de la presente invención.
El uso de promotores, para la expresión de estas formas mutadas, diferentes del propio promotor del gen pacC, bien sean promotores condicionales o constitutivos, es una variante evidente de esta invención y forma parte de ella.
Estos resultados demuestran que cepas transgénicas merodiploides para el gen pacC de P chrysogenum que tienen un alelo silvestre y otro mutante de pacC, modificado de manera dirigida, son cepas sobreproductoras de penicilina y tienen niveles elevados de los transcritos de al menos dos genes implicados en la biosíntesis de penicilina.
El gen regulador pacC controla la síntesis de otros metabolitos secundarios y de numerosas enzimas extracelulares. El uso de esta tecnología para la construcción de estirpes transgénicas de P chrysogenum utilizando la estrategia aquí descrita (o variantes de ella) para modificar en sentido positivo o negativo la función pacC con el objeto de incrementar la síntesis de metabolitos y enzimas extracelulares de utilidad o de prevenir la de metabolitos indeseables, como las aflatoxinas, queda cubierta por esta solicitud. La transferencia de la tecnología descrita en esta solicitud a otros hongos de interés industrial como, por ejemplo, Aspergillus niger o Thricoderma ressei es evidente y queda cubierta por esta solicitud. La transferencia de esta tecnología a otros genes reguladores de ascomicetos con objeto de incrementar la síntesis de metabolitos y enzimas extracelulares de utilidad o de prevenir la de metabolitos indeseables queda asimismo cubierta por esta solicitud.
EJEMPLOS
Ejemplo 1. -Obtención de cepas mutantes en el gen que codifica la ATP- sulfurilasa.
La cepa silvestre de P chrysogenum NRRL1951 se obtuvo del CBS (Holanda). Con el objeto de seleccionar mutantes resistentes al selenato, se plaquearon 1 ,5 x 108 esporas de esta cepa en 30 placas de medio mínimo [Cove, D. J. (1966) The induction and repression of nitrate reducíase in the fungus Aspergillus nidulans. Biochim.Biophys.Acta 113:51-56] con 10 mM de selenato sódico y 10 μg/ml de D-metionina y 1 % de glucosa y 10 mM de tartrato amónico, como fuente de carbono y nitrógeno, respectivamente. Los mutantes resistentes al selenato aparecieron con una frecuencia de 1 ,5 x 10"7 esporas. Una vez purificados, el fenotipo de los mutantes se comprobó mediante tests de crecimiento.
Los mutantes resistentes al selenato pueden mapear, al menos, en dos genes estructurales, sC (ATP-sulfurilasa) y sB (permeasa de sulfato). Los mutantes en el gen sC no crecen en un medio con sulfato de colina como fuente de S, compuesto que sí es capaz de suplementar la deficiencia en la permeasa, ya que entra en la célula por una permeasa alternativa a la del sulfato/selenato. De esta manera se identificaron 7 mutantes sC~ putativos. Con el objeto de verificar cuáles de ellos eran definitivamente mutantes sC~, se procedió a probar mediante transformación con el plásmido pINESI (Fig. 1A) si las mutaciones eran complementables por el gen sC funcional de P chrysogenum, mediante selección de los transformantes en medio con sulfato como única fuente de S. Tras estos experimentos se seleccionó el mutante, sC14, ya que presentó la más alta frecuencia de transformación con pINESI (45 transformantes capaces de utilizar sulfato /μg de plásmido). Ejemplo 2.- Determinación de la sensibilidad de P. chrysogenum NRRL 1951 a la fleomicina.
Con el objeto de determinar la sensibilidad a fleomicina de la cepa NRRL1951 , se realizaron experimentos con protoplastos en placas de medio de regeneración, en las condiciones de selección de los transformantes. Los protoplastos se obtuvieron tras incubar micelio crecido durante 20 h a 25°C en medio mínimo (Cove, 1966), con 30 mg de Novozyma por gramo de micelio (peso escurrido) durante 2 h a 25° en una solución 0.9 M KCI, 10 mM tampón fosfato pH 5,8. Los protoplastos se agitaron brevemente en el vórtex, y se centrifugaron a 3000g, de tal modo que los protoplastos sedimentaron encima del micelio no digerido, del que se distinguen por su color blanquecino. 105 protoplastos viables de NRRL1951 se extendieron en placas de medio de regeneración de protoplastos (medio mínimo de Cove estabilizado osmóticamente con 1 M sorbitol y 0,1 M sacarosa) que contenían 0,05; 0,1 ; 0,5; 1; 5; 10; 20; 40 y 50 μg/ml de fleomicina (Cayla, Francia). A concentraciones superiores a 0,5 μg/ml no se observó crecimiento de colonias después de 10 días de incubación a 25°. Por ello se ha utilizado rutinariamente la concentración de 1 μg/ml de fleomicina en los experimentos de transformación en los que se ha usado la selección basada en este antibiótico. Ejemplo 3. -Plásmidos utilizados en la transformación de NRRL 1951
El plásmido pINESI (Figura 1A), de donde se obtuvo el gen sC de P chrysogenum, es un derivado de pBR322 que incluye un fragmento EcoRI- EcoRV de 1 ,5 kb con el gen pyr4 de Neurospora crassa y un fragmento de 6,1 kb EcoRV-Sa/l de DNA genómico de P chrysogenum que contiene el gen sC. Se construyeron diferentes plásmidos que llevan un alelo silvestre o un alelo mutante pacC33 del gen pacC de P chrysogenum. La presencia de un sitio de corte de Kpn\ en una posición del gen de P chrysogenum similar a aquella en la que se encuentra el triplete de terminación de traducción resultante de la mutación pacC° 4 en A. nidulans permitió crear una proteína truncada en el residuo 477, con 4 residuos adicionales en su carboxilo terminal antes de llegar a un codon de terminación de traducción (SEQ ID NO 2 y 3). El plásmido pPacC33(Phleo) (Figura 1B) se construyó utilizando como base pBluescript II SK+. Este vector se digirió con EcoRI y pt?l y se le insertó mediante técnicas convencionales de ingeniería genética un fragmento EcoRI- Kpn\ de DNA genómico de P chrysogenum NRRL 1951 de 3037 pb que incluye 1553 bp del promotor de Pc-pacC y la región de codificante de Pc-pacC hasta el codon 477 inclusive, para dar lugar al plásmido pPacC33. El alelo mutante resultante (denominado pacC33, SEQ ID NO 2) codifica para la proteína PacC truncada descrita en SEQ ID NO 3. En este plásmido se introdujo un gen quimérico consistente en el gen ble de E. coli bajo el control de señales promotoras y terminadoras fúngicas, que se obtuvo del plásmido pHS103 descrito por Kolar [Kolar, M. et al (1988) Transformation of Penicillium chrysogenum using dominant selection markers and expression of an Escherichia coli lacZ fusión gene. Gene 62:127-134] como un fragmento EcoRI-H/πdlll de 2,8 kb, cuyos extremos cohesivos se rellenaron con la DNA polimerasa de T4 para proceder a su inserción en el sitio único BamH/, convertido también en romo por el mismo método.
El plásmido pPacC33(sC) (Figura 1C), se construyó de manera análoga a pPacC33(Phleo), salvo que en este caso se insertó en el sitio βa HI, en lugar del gen de resistencia a fleomicina, un gen sC funcional, que se obtuvo de pINES como un fragmento BglU de 4,3 kb (Figura 1A). El plásmido pPacC(sC) (Figura 1 D) es un derivado de pBS-SK+, en el que se introdujo en primer lugar un fragmento EcoRI-Sa/l de 7,5 kb, que contiene el alelo silvestre del gen pacC con el mismo fragmento del promotor presente en los plásmidos pPacC33(Phleo) y pPacC33(sC). Posteriormente, el fragmento de DNA que contiene el gen sC se introdujo de igual manera que en pPacC33(sC).
Ejemplo 4.-Transformación de la cepa NRRL1951 de P. chrysogenum
La transformación de Penicillium se llevó a cabo siguiendo el protocolo descrito para A. nidulans [Tilburn, J. et al. (1983) Transformation by integration in Aspergillus nidulans. Gene 26:205-211] con ligeras modificaciones. Los protoplastos se obtuvieron como se describe en el ejemplo 2. Los protoplastos se resuspendieron en STC (sorbitol 1 M, 10 mM Tris HCI pH 7,5, 10 mM CaCI2), se lavaron dos veces en este tampón y se resuspendieron a una concentración de 1-2 x 107 protoplastos en 200 μl de STC. A cada alícuota se le añadieron 5 μg de plásmido circular (en un volumen inferior a 20 μl) y 20 μl de PEG 6000 50% (v/v) en STC, y las mezclas se incubaron durante 20 min en hielo. Después se añadió 1 mi de PEG a cada tubo y se incubó durante 5 min a 25°, se añadió 1 mi de STC, se mezcló suavemente y se centrifugó 5 min a 12000 rpm. Los protoplastos se resuspendieron suavemente en 500 μl de STC y se sedimentaron por centrifugación. Finalmente se resuspendieron en 200 μl de STC, y se extendieron sobre placas de medio estabilizado osmóticamente (medio mínimo de Cove [Cove, D. J. (1966) The induction and repression of nitrate reducíase in the fungus Aspergillus nidulans. Biochim.Biophys.Acta 113:51-56] con 0,1 M sacarosa y 1 M sorbiíol), iras mezclarlos con 3 mi del mismo medio con un 0,25% (p/v) de agar. Para la selección basada en la resisíencia a fleomicina, se incluyó el aníibiótico en el medio de regeneración a una concentración de 1 μg/ml. Para la selección basada en sC, se utilizó medio mínimo normal, que contiene sulfato como única fuente de azufre. Las placas se incubaron a 25°C. Las colonias capaces de crecer en los medios selecíivos aparecieron a los 6-7 días y se purificaron en medio selectivo sin estabilizador mediante el aislamiento de colonias individuales crecidas a partir de conidiosporas. Ejemplo 5. -Caracterización molecular de los transformantes
Los transformantes purificados se crecieron para obtener micelio, del que se extrajo el DNA siguiendo el método de Pérez-Esteban [Pérez Esteban, B. et al. (1993) Molecular characterizaíion of a fungal secondary meíabolism promoíer: transcription of the Aspergillus nidulans isopenicillin N synthetase gene is modulated by upsíream negative elements. Mol.Microbiol. 9:881-895]. Esíe DNA se digirió con las enzimas EcoRI o Xba\ para determinar el número de copias del plásmido y su lugar de integración en el genoma. Los DNAs digeridos se cargaron en geles del 0,7% de agarosa para separar los fragmentos de restricción, que se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa. Esta membrana se incubó 2 h a 80° para fijar el DNA. Posteriormente, se pre-hibridó durante 2 h a 42°, en 50% formamida, 5X solución de Denhart, 5X SSC y 0,1% de SDS con 50 μg/ml de DNA monocatenario de esperma de salmón sonicado, tras lo cual se añadieron 50 ng de la sonda correspondiente: bien el fragmento EcoRI-H/ndlII de 2,8 kb que contiene el gen ble, bien el fragmenlo BglW de 4,3 kb que contiene el gen sC o bien un fragmento Hind\\\-Kpn\ de 1 ,3 kb de DNA genómico de P. chrysogenum pertenecieníe al gen pacC, en todos los casos marcados radiactivameníe. La hibridación se llevó a cabo duraníe 18 h a 42°. El lavado final de los filtros se realizó durante 15 min a 65°C en 0,2X SSC, 0,1 % SDS. Los filtros se expusieron a película autorradiográfica o en Phosphorimager para la deíección de la radiactividad. Para el análisis de los transformantes se emplearon digestiones con
Xba\ (Figuras 7 y 8). La sonda del gen pacC reveló en la cepa silvestre sC14 una banda Xba\ de 4 kb que se íransforma en dos nuevas bandas de 6 y 8,3 kb en el íransformaníe TSC7 (en el que el plásmido PacC33(sC) está integrado en el locus pacC, Figuras 7A y 8A). La sonda del gen sC reveló en la cepa silvestre sC14 una banda de 7 kb que se convierte en dos bandas de 6,5 y 10,8 kb en el transformaníe TSC4 (pPacC33(sC) iníegrado en el locus sC, Figuras 7B y 8B ). El íransformaníe TX5, obíenido con el plásmido pPacC33(Phleo), présenla, con la sonda del gen pacC, una banda de 4 kb, oíra banda de 10-11 kb y oíra banda de cerca de 9 kb (Figuras 7C y 8C). Esta última banda es 3 veces más iníensa que la banda procedeníe del gen pacC resideníe y su movilidad se corresponde con el íamaño del plásmido, por lo que se consideró que el merodiploide TX5 es un íransformaníe con 3 copias inlegradas en íándem en una posición no deíerminada del genoma (Figura 8C). En un análisis similar, el íransformaníe TSC03 (Figuras 7D y 8D) presenía, con la sonda pacC, la misma banda X£>al de 4 kb que aparece en cepa sC14 y un nuevo fragmenío de 8,3 kb (un fragmenío iníerno del inserto pacC de ~ 2,2 kb y las secuencias del vector no se deíecían en esía hibridación, ver Figura 8D).
Ejemplo 6.- Producción de penicilina en sacarosa como fuente de carbono
Los íransformanles seleccionados, junio con las cepas conírol NRRL 1951 o su derivado sC14 se crecieron a 25°C con fueríe agiíación en medio de producción de penicilina (medio de Cove suplemeníado con 2,5% (p/v) de sólidos de corn sleep y 0,12% (p/v) de fenilacelaío sódico, y 3% de sacarosa o 3% laclosa (ambas p/v) como principal fueníe de carbono). En iodos los casos se inoculó a partir de una suspensión de conidiosporas, a una concenlración inicial de 1-2 x 106 esporas/ml, ulilizándose maíraces de 500 mi con 100 mi de medio. Se lomaron mueslras de medio a diferenies íiempos después del inoculo, en las que se midió la caníidad de penicilina producida uíilizando un bioensayo con Serratia marcescens. Para ello, se excavaron pocilios de 1 cm de diámelro en Medio Anfibiólico-1 (DIFCO) sólido que incluía una suspensión diluida de la bacleria (a una D.O600 de 0,0075). En eslos pocilios se colocaron 100 μl de una dilución apropiada de los sobrenadaníes. Las placas se incubaron duraníe 20 h a 37°, Iras lo cual se midió el halo de inhibición de crecimienlo bacíeriano y se calculó la caníidad de penicilina medíanle comparación con los halos producidos por dislinías diluciones de una solución esíandard de penicilina G sódica.
La Figura 2 muesíra que el nivel de producción de penicilina de la cepa sC14 es muy similar al de la cepa NRRL 1951 de la que procede, indicando que la mulación no afecta la producción de antibiótico. En medio con sacarosa o laclosa como fuente principal de carbono, el crecimiento de las distintas estirpes fue muy similar en cuanto a medida de biomasa y evolución del pH extracelular. Sin embargo, las esíirpes íransgénicas TX5, TSC4 y TSC7 reproduciblemente produjeron niveles sensiblemente más altos de penicilina que la estirpe parental sC14, tanto con sacarosa (Figura 3), como con lactosa
(Figura 5). En el primer caso, el incremento de producción fue de 4-5 veces aproximadamente, mientras que, en lactosa, los niveles de producción fueron aproximadamente dos veces los obtenidos con sC14 o NRRL 1951 (Figura 5). La esíirpe merodiploide TSC03 (con dos copias del gen pacC silveslre) tiene un crecimiento similar a sC14 (ver la evolución del pH exíracelular en la figura 4A) y íambién es hiperproducíora de penicilina con respeclo a la cepa sC14 (Figura
4B), aunque en mucha menor medida que las cepas TX5, TSC4 y TSC7, que lienen, además de una copia del gen silvesíre, una o más copias del alelo pacC33 (ver Figura 4B para la comparación de los niveles de producción de penicilina de TSC03 con los de TSC7 en sacarosa). Ejemplo 7.- Análisis transcripcional de los merodiploides
De culíivos de producción de penicilina, se cosecharon muesíras de micelio a lo largo del iiempo (desde el día 2 al día 10). De esíos micelios, se exírajo el RNA mediante el méíodo de Lockingion [Lockingíon, R. A.eí al (1985) Cloning and characlerisaíion of íhe eihanol uíilisaíion regulon in Aspergillus nidulans. Gene 33:137-149] y se cargaron 10 μg de cada muesíra en geles de agarosa del 1 ,2% con un 18% de formaldehido en íampón MOPS (40 mM MOPS pH 7,2; 10 mM aceíaio sódico; 0,5 mM EDTA). Los RNAs se íransfirieron a membranas de niírocelulosa, que se secaron a 80°C para fijar el RNA. Esías membranas fueron hibridadas con sondas que permiíían deíecíar los siguientes genes: pacC (fragmenío interno Hind\\\-Kpn\ de 1 ,3 kb); pcbC (fragmente interno Nco\-Bam \ de 0,9 kb); pcbAB (fragmenío EcoRI de 2,4 kb) y el fragmenío de 955 bp Nco\-Kpn\ del gen acnA de A. nidulans, que codifica para la acíina, y que se empleó como conírol de homogeneidad de carga eníre las disíinlas muesíras. Las condiciones de hibridación fueron idéníicas a las descritas en el ejemplo 5, salvo que la cantidad de sonda añadida fue de 100 ng. El lavado final se realizó en el mismo íampón, pero a 42°C. En lodos los experimentes de northern se incluyó en el gel un carril con 10 μg de mRNA obtenido a partir de un micelio de la cepa sC14 crecida durante 39 h en medio de producción de penicilina con 3% de lacíosa. Todas las membranas de nilrocelulosa, después de los lavados, se expusieron durante 15-18 h a una paníalla de Phosphorlmager, sensible a la emisión β del P32. Dichas panlallas se leyeron posteriormente en un Phosphorlmager (Molecular Dynamics) y se cuantificaron las señales de hibridación empleando el software ImageQuaní de la misma casa comercial. Además de hibridar las membranas con sondas que permiten revelar los franscrilos problema, íodas las membranas se hibridaron con una sonda que revela el mRNA de la acíina. Las cuaníificaciones de las bandas reveladas con las sondas pcbC, pcbAB y pacC, se normalizaron frente a la intensidad obtenida en la banda de la aclina en cada carril. Todos estos cocientes para un gen dado de una misma membrana se normalizaron al valor del carril común (muesíra de RNA de micelio de la eslirpe sC14 crecida en lacíosa durante 39 h), con el objeto de poder comparar medidas de intensidad de diferentes membranas. Estas medidas, con su desviación estándar, son las que aparecen en la figura 6, para los RNA mensajeros de pcbAB y pcbC.
FIGURAS Figura 1.- Mapas esquemáticos de restricción de los plásmidos empleados en la construcción de las cepas merodiploides de P. chrysogenum. A) plásmido pINES; B) plásmido pPacC33(Phleo); C) plásmido pPacC33(sC); y D) plásmido pPacC(sC). Los diferentes genes esíán indicados con las siguientes íramas: negro, gen pyr4 de N. crassa; caja vacía, región del gen sC de P. chrysogenum (la flecha indica la posición aproximada del gen y la dirección de íranscripción); caja rayada, gen de resistencia a fleomicina, con el gen ble de E. coli rayado vertical y el promotor y terminador de íranscripción indicados con rayado inclinado; finalmente, la caja gris indica la región del gen pacC de P chrysogenum, con la posición, íanío del alelo silveslre como del muíanle, indicada con una flecha.
Figura 2.- Crecimiento y producción de penicilina de las cepas de P.chrysogenum NRRL1951 y sC14. Se represenían las medidas de producción de penicilina, pH y peso seco en cultivos de las cepas NRRL1951 y sC14 realizados en medio de producción de penicilina con 3% de sacarosa (A) o lactosa (B), como principal fuente de carbono.
Figura 3.- Crecimiento y producción de penicilina de las cepas transgénicas pacC+/pacC33. Medidas de la producción de penicilina y la tasa de crecimiento (pH y peso seco) en cultivos de las estirpes íransgénicas TX5, TSC4 y TSC7, merodiploides pacC+/pacC33, en comparación con la eslirpe pareníal sC14. Los culíivos se realizaron en medio de producción de penicilina con sacarosa como principal fuente de carbono.
Figura 4 - Crecimiento y producción de penicilina de la cepa transgénica pacC+/pacC*. Medida de la íasa de crecimiento (pH exíracelular, A) y de la producción de penicilina (B) de la esiirpe fransgénica TSC03, merodiploide pacC*/ pacC+, en comparación con la esíirpe parenlal sC14. Los culíivos se realizaron en medio de producción de penicilina con sacarosa como principal fuente de carbono. En el panel B, se observa íambién la diferencia en la producción de penicilina entre el merodiploide pacC+/pacC+ (TSC03) y un merodiploide pacC+/pacC33 (TSC7).
Figura 5 - Producción de penicilina en medio con lactosa. Medida de la producción de penicilina en lactosa de las cepas merodiploides pacC+/pacC33, TSC4, TSC7 y TX5, en comparación con la esíirpe parenial sC14.
Figura 6 - Cuantificación de los niveles de mRNA de pcbC y pcbAB en las cepas sc14 y TSC7. Las medidas esíán expresadas en unidades arbiírarias (UA). En abcisas se indica el íiempo de culíivo. Los dalos son media de íres experimentos y las barras de error indican la desviación estándar. Figura 7 - Análisis por el método de Southern de las cepas merodiploides de P. chrysogenum. Las muestras de DNA de las disíinlas esfirpes fueron digeridas con Xbal. La sonda ulilizada fue un fragmenío del gen pacC (A, C y D) o del gen sC (B). Las flechas señalan las bandas de hibridación obtenidas con los merodiploides y la esíirpe receptora, según se indica en el texto. Figura 8.- Esquema gráfico de los sucesos de recombinación de los plásmidos. La interprelacíón gráfica de las bandas reveladas en el souíhern de la figura 7, se represenía aquí para las cepas sc14 (íipo silveslre), TSC7 (A), TSC4 (B), TX5 (C) y TSC03 (D). El genoma del hongo esfá indicado por la línea fina conlinua. La caja con rayas gruesas representa el gen sC (versiones silvestre o muíante, sc14) y la flecha blanca indica la dirección de íranscripción. Los genes pacC+ o pacCc33 esíán represeníados por una caja blanca con una flecha interna (que indica la dirección de íranscripción). El gen de resistencia a fleomicina esiá indicado por una caja con rayas finas y las secuencias plasmídicas, por una línea conlinua gruesa. En el íransformante TX5 no es posible determinar el lugar del suceso de integración, y se indica la repetición de íres copias del plásmido íransformaníe. Las líneas de coías mueslran los íamaños (en kb) de los fragmentes señalados en la hibridación de la Figura 7.

Claims

REIVINDICACIONES
1.- Procedimiento de obtención de eslirpes íransgénicas de hongos filamentosos caracterizado porque: a) las estirpes transgénicas son merodiploides para un gen regulador, b) está basado en la íransformación de dichas esíirpes con un plásmido inlegralivo que incluye una secuencia de nucleóíidos correspondiente a un alelo silvesíre ó muíanle dominante o codominante de dicho gen regulador, y porque c) estas estirpes presenían nuevas capacidades de pérdida o ganancia de función en la producción de mefaboliíos o enzimas exlracelulares.
2.- Procedimiento según la reivindicación 1 caracterizado porque se produce una ganancia de función del gen regulador.
3.- Procedimiento según la reivindicación 1 caracterizado porque se produce una pérdida de función del gen regulador.
4.- Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 3 caracterizado porque se incremenia la producción de un meíabolilo secundario.
5.- Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 4 caracterizado porque el ciíado meíabolilo secundario es una penicilina o cualquier oíro antibiótico beta-laclámico producido por hongos filamentosos.
6.- Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 5 caracterizado porque la secuencia de nucleólidos puede ser una versión genómica o de ADNc del gen regulador, obtenida por síntesis o por selección.
7.- Una esíirpe íransgénica merodiploide obtenida por un procedimienlo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 6 donde el hongo filamentoso pertenece al grupo de ascomicetos de interés económico o médico, aunque sin limitarse a éslos, como son Penicillium chrysogenum, Aspergillus niger, Aspergillus nidulans, Thricoderma ressei y Candida albicans.
8.- Secuencia de nucleóíidos según la reivindicación 1 caracterizada porque représenla un alelo del gen regulador pacC de Penicillium chrysogenum y codifica para una proleína mutante con ganancia de función.
9.- Secuencia de nucleólidos según la reivindicación 1 caracterizada porque representa un alelo del gen regulador pacC de Penicillium chrysogenum y codifica para una proteína mutante con pérdida de función.
10.- Secuencia de nucleótidos según la reivindicación 8 caracterizada porque esíá consíiíuida por la SEQ ID NO 2 y porque es el alelo pacC33 del gen regulador pacC.
11. Secuencia de nucleóíidos caracterizada porque presente una ideníidad de al menos un 30% con la secuencia según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a la 10.
12.- Plásmido según la reivindicación 1 caracterizado porque conliene una secuencia de nucleóíidos según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a la 11 y iodos los elementos necesarios para promover la expresión del gen regulador correspondiente a dicha secuencia.
13.- Plásmido según la reivindicación 12 caracterizado porque el marcador selectivo es el gen sC de P chrysogenum.
14.- Plásmido según la reivindicación 12 caracterizado porque el marcador selectivo es el gen sC de otros Penicillia, A. nidulans y oíros Aspergilli y oíros ascomicelos filamentosos o levad u rifo rmes.
15. Plásmido según la reivindicación 12 caracterizado porque presenta los rasgos identificativos del plásmido pPacC33.
16. Plásmido según la reivindicación 12 caracterizado porque presente los rasgos ideníificaíivos de pPacC33(sC).
17. Plásmido según la reivindicación 12 caracterizado porque presente los rasgos identificaíivos de pPacC33(Phleo) de la presente invención.
18.- Plásmido según la reivindicación 12 caracterizado porque incluye una secuencia de nucleótidos que codifica para cualquier alelo de ganancia o pérdida de función del gen pacC de P chrysogenum.
19.- Plásmido según la reivindicación 12 caracterizado porque incluye la secuencia de nucleótidos que codifica para cualquier alelo de ganancia o pérdida de función del gen regulador pacC de oíros Penicillia, oíros Aspergilli y oíros ascomiceíos filamentosos o levaduriformes.
20.- Plásmido según la reivindicación 1 caracterizado porque coníiene la secuencia de nucleóíidos de la forma silvestre del gen regulador pacC de P. chrysogenum.
21.- Plásmido según la reivindicación 20 caracterizado por los rasgos identificativos del plásmido pPacC(sC).
22.- Plásmido según la reivindicación 1 caracterizado porque coníiene la secuencia de nucleótidos de la forma salvaje del gen regulador pacC de otros
Penicillia, otros Aspergilli otros ascomiceíos filamentosos o levaduriformes.
23.- Esfirpe íransgénica merodiploide según la reivindicación 7 caracterizada porque contiene un plásmido que incluye un alelo silvestre ó muíante del gen regulador pacC.
24- Esíirpe íransgénica merodiploide según la reivindicación 23 caracterizada porque el alelo muíante del gen pacC es de ganancia de función.
25.- Estirpe íransgénica merodiploide según la reivindicación 23 caracterizada porque el alelo muíante del gen pacC es de pérdida de función.
26.- Esíirpe merodiploide transgénica según una cualquiera de las reivindicaciones 7 y 23 a la 25 caracterizada por contener un plásmido según una cualquiera de las reivindicaciones 12 a la 22.
27.- Estirpes merodiploides transgénicas según la reivindicación 26 caracterizadas porque presenían los rasgos identificaíivos de las cepas de P chrysogenum registradas en la CECT con los números 20328, 20329, 20330, y
20331.
28.- Uso de las estirpes merodiploides transgénicas según la reivindicación 7 para la producción de metabolitos y proteínas extracelulares de interés indusírial.
29.- Uso de las estirpes transgénicas según una cualquiera de las reivindicaciones 23 a la 27 para la producción de penicilina.
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