WO2001039758A2 - Verfahren mit thalidomid und antiinflammatorisches zitokin zur behandlung und/oder prophylaxe von il-12-bedingten erkrankungen - Google Patents

Verfahren mit thalidomid und antiinflammatorisches zitokin zur behandlung und/oder prophylaxe von il-12-bedingten erkrankungen Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to a combination therapy for the treatment of diseases which are caused by the formation of the inflammatory cytotoxic IL-12.
  • 1L-12 is a heterodimeric molecule consisting of a covalently linked p35 and p40 chain.
  • the molecule is formed by antigen-presenting cells (monocytes / macrophages, dendritic cells, B-lymphocytes).
  • monocytes / macrophages The formation of IL-12 by monocytes / macrophages is triggered either by various microbial products such as lipopolysaccharide (LPS), lipopeptides, bacterial DNA or in the interaction with activated T-lymphocytes (Trinchieri 1995. Ann. Re. Int ⁇ iuno L 13: 251).
  • LPS lipopolysaccharide
  • IL-12 is of central immunoregulatory importance and is responsible for the development of inflammatory till reactivities. If there is a TH L immune reaction against self-antigens, serious illnesses occur.
  • IL-12 is also involved in the regulation of cell survival. Uncontrolled cell growth is among other things regulated by apoptosis (programmed cell death). T lymphocytes have been shown to have an anti-apoptotic effect and promote the survival of T cells (Clerici et al. 1994. Proc.Natl. Acad. Sci. USA 91: 11811; Estaquier et al. 1995 J.Exp.Med. 182: 1759). Local overproduction of IL-12 can therefore contribute to the survival of tumor cells.
  • IL-10 is a cytokine which was originally described as a "cytokine synthesis inhibitory factor" (Fiorentino et al. 1989. J.Exp.Med. 170: 2081). This means that IL-10 inhibits the synthesis of the inflammatory monokines TNF ⁇ , ILA, IL-6, IL-8, IL-12 and GM-CSF by human and murine monocytes / macrophages (Fiorentino et al. 1991. J. Immunol. 146: 3444; De Waal Malefyt et al. 1991. J. Exp. Med. 174: 1209). This also leads to an indirect inhibition of the syn- thesis of IFN- ⁇ by TH1 lymphocytes. IL-10 is produced by various cells.
  • IL-10 deficient mice develop severe intestinal inflammation comparable to that of Crohn's disease (Kuhn et al. 1993. Cell 75: 263).
  • the clinical appearance improved by administration of IL-10 to diseased mice or rabbits (Powrie et al. 1994. Immunity 1: 553; Grool et al. 1996. Gas troenterology 110: A918).
  • local administration of IL-10 reduced the mucosal inflammation (Schreiber et al. 1995. Gastroenterology 108: 1434; Van Deventer et al. 1997.
  • IL-10 has therapeutic efficacy in skin diseases (psoriasis) in humans (Asadullah et al. 1998 ... Cl in. Luvest. 101: 783).
  • TGFß a number of other cytokines such as TGFß (D'Andrea et al. 1995. J. Exp. Med. 181: 537) and
  • IFN ⁇ / ⁇ (Cousens et al. 1997. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 634) was able to inhibit the formation of IL-12 in macrophages.
  • IL-11 provides protection against tissue inflammation and alleviates allergen-induced colitis in the rat (Pfeiffer and Qiu. 1995. Gastroenterology 108: A893).
  • 1L-11 is approved by the FDA for the treatment of chemotherapy-induced thrombocytopenia.
  • the systemic application of the anti-inflammatory cytokine TGFß has therapeutic potential in animal models for autoimmune diseases such as experimental allergic encephalomyelitis (Racke et al. 1991. J. Immunol. 146: 3012).
  • the interferons ⁇ and ß are already used for the therapy of multiple sclerosis.
  • thalidomide The immunomodulatory properties of thalidomide are already being used for a number of disease fields such as erythema nodosu leprosum (Sampaio et al. 1993. J. Infect. Dis. 168: 408), cutaneous systemic lupus erythematosus (Atra and Sato 1993. Clin .Exp. Rheumatism toi. 11: 487), Behcet's disease (Hamuryudan et al. 1998.
  • thalidomide is the pro-inflammatory cytokine TNF ⁇ (Sampaio et al. 1991. J.Exp.Med. 173: 699) and in particular IL-12 (Moller et al. 1997. J.Immunol. 159: 5157) which, as stated above, contribute significantly to the pathogenesis of autoimmune diseases and inflammatory reactions.
  • thalidomide in combination with other anti-inflammatory, in particular steroidal or non-steroidal, active substances for the therapy of rheumatoid arthritis (WO 95/04553) and the inhibition of angiogenesis (WO 98/19649).
  • an anti-inflammatory cytokine preferably IL-10, IJJ-11, TGFß, interferon- ⁇ or -ß, the IL-12 Inhibition syner ⁇ gistically enhanced.
  • the invention accordingly relates to a method for the treatment and / or prophylaxis of diseases which are caused by the formation of the inflammation-promoting cytokine IL-12, according to the invention simultaneously one of the above-mentioned thalidomide compounds and an anti-inflammatory cytokine, preferably one of the above mentioned, who applied ⁇ the.
  • the ⁇ -methyl-thalidomide (EM 978) is also particularly suitable as a thalidomide compound for the combination therapy.
  • the anti-inflammatory cytokine is administered parenterally, that is to say subcutaneously, intramuscularly or intravenously.
  • the thalidomide compound can be administered orally, rectally, ophthalmically (intravitreal, intracameral), nasally, topically (including buccal or sublingually), vaginally or parenterally (including subcutaneously, intramuscularly, intravenously, intradermally, intratracheally or epidurally).
  • Solvents Solvents, diluents, dyes and / or
  • Binder with which the respective active ingredient to a certain application form is processed depend on the type of application.
  • suspensions for oral application preparations, suspensions, easily reconstituted dry preparations and sprays are in the form of tablets, chewable tablets, coated tablets, capsules, granules, drops, juices or syrups, called for parenteral, topical and inhalatory administration Lösun ⁇ .
  • Thalidomide compounds to be used according to the invention in a depot in dissolved form, a carrier film or a plaster, optionally with the addition of agents which promote skin penetration are examples of suitable percutaneous administration forms.
  • the compounds can be released with a delay from formulations which can be used orally or percutaneously.
  • Ophthalmic forms of application include drops, ointments and gels.
  • the total amount of active ingredient to be administered to patients varies depending on the weight of the patient, the type of application, the indication and the severity of the disease. Usually 1 to 150 mg / kg of a combination according to the invention are applied.
  • the treatment method according to the invention is suitable for the therapy and / or prophylaxis of diseases in which an excessive IL-12 production is made responsible for the pathogenesis (including diseases of the intestine, skin, mucous membranes, vessels and autoimmune diseases).
  • the combined administration of thalidomide / analogs and anti-inflammatory cytokine is also suitable for the therapy of haematological diseases and other oncological diseases.
  • the synergistic effect of thalidomide / analogues with cytokines such as IL-10 is characterized by an almost complete inhibition of IL-12 production in LPS-activated mono- cyte out. Audi with combined suboptimal dosing results in higher levels of inhibition than with the individual doses.
  • the active compounds are used to treat de genann ⁇ th diseases in a dose range which serum concentrate i ones of 10-facl ⁇ under the EC to 100-fold above the EC ⁇ encloses used.
  • EC. Values for thalidomide / analogs are 50 to 100 ng / l, the EC value for IL-10 is 50 pg / ml.
  • the diseases above mentioned form circles öe ⁇ among other inflammatory skin pay (eg atoprsche dermatitis, psoriasis, eczema, Ski erodermi e), inflammations ⁇ developments of the respiratory tract (eg bronchitis, pneumonia, bronchial asthma, ARDS (adult resp tory distress syndrome), sarcoidosis , Silicosis / fibrosis), inflammation of the gastrointestinal tract (e.g.
  • gastric oduodenal ulcers Crohn's disease, ulcerative colitis
  • diseases such as hepatitis, I'ankreat itis, appendicitis, peritonitis, nephritis, aphthosis, conjunctivitis, keratitis, uveitis, retinopathy, rhinitis.
  • the autoimmune diseases include e.g. B. Diseases of the arthritic formal disease (eg rheumatoid arthritis, HLA-B27 associated diseases), distant] multiple sclerosis, juvenile diabetes or lupus erythematosus. Further indications are sepsis, bacterial Meningi ⁇ tis, chronic bacterial and chronic viral infec tions ⁇ (z. B. HIV / AIDS, hepatitis), cachexia, trans Plantat rejection reactions, graft-versus-hos t reac- tions, atherosclerosis and the reperfusion syndrome / heart failure and tumor diseases.
  • B. Diseases of the arthritic formal disease eg rheumatoid arthritis, HLA-B27 associated diseases
  • Further indications are sepsis, bacterial Meningi ⁇ tis, chronic bacterial and chronic viral infec tions ⁇ (z. B. HIV / AIDS, hepatitis), cachexia, trans Plantat rejection reactions
  • Haematol ogische diseases such multip ⁇ les myeloma and leukemias, as well as v / urther oncological diseases such as glioblastoma, and mammary carcinoma Prostatacar cinom to the diseases which are to be inhibited by theticianscfabe Thaliomdid / -AnaJ UCI and antiinflamma- toric cytokine.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • CD14 monocyte-specific surface molecule
  • CD14 superparamagnetic microbeads
  • the concentration of IL-12 in the cell culture supernatants was determined by means of sandwich ELISAs using two anti-IL-12 monoclonal antibodies (Biosource Europe, Fleurus, Belgium). A reference standard curve with human IL-12 was included. The detection limit of the IL-12 ELISA was 10 pg / ml.
  • thalidomide / analogs together with anti-inflammatory cytokines such as 1 -10, on the one hand a synergistic enhancement of [1, - 12 inhibition, on the other hand a reduction in the ⁇ be achieved constrained inhibitor dosage.
  • a combination therapy therefore allows much efficien ⁇ tere inhibition of pro-inflammatory mediator IL-12 should also be expected by reducing the need to inhibit individual doses a reduction of unwanted side effects.

Abstract

Es wird eine Kombinationstherapie zur Behandlung von Erkrankungen, die durch die Bildung des entzündungsfördernden Zytokins IL-12 hervorgerufen werden, beschrieben, wobei gleichzeitig eine Thalidomidverbindung und ein antiinflammatorisches Zytokin appliziert werden.

Description

Verfahren zur Behandlung und/oder Prophylaxe von IL-12-bedingten Erkrankungen
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine Kombinationstherapie zur Behandlung von Erkrankungen, die durch die Bildung des entzundungsfordernden Zyto- ki s IL-12 hervorgerufen werden.
1L-12 ist ein heterodimeres Molekül, welches aus einei kovalent verbundenen p35 und p40 Kette besteht. Das Molekül wird von antigenprasentierenden Zellen (Mono- zyten/Makrophagen, dendritische Zellen, B-LymphozyLen) gebildet. Die Bildung von IL-12 durch Mono- zyten/Makrophagen wird entweder durch verschiedene ikrobielle Produkte wie Lipopolysaccharid (LPS), Lipo- peptide, bakterielle DNA oder in der Interaktion mit aktivierten T-Lymphozylen ausgelost (Trinchieri 1995. Ann . Re . Intπiuno L . 13: 251) . IL-12 hat eine zentrale immunregulatorische Bedeutung und ist verantwortlich für die Entwicklung entzundungsfordernder Till Reaktivitäten. Beim Vorliegen einer TH L Immunreakti on gegen Eigenantigene kommt es zum Auftreten schwerer Erkrankungen .
Die Bedeutung von entzundungsfordernden Zytokinen wie ILA 2 für die Entwicklung und den Verlauf von Entzun- düngen bzw. Autoimmunerkrankungen ist aufgrund zahlreicher tierexperimenteller und erster klinischer Untersuchungen klar dokumentiert. In verschiedenen Tier odel- len für Erkrankungen wie rheuinatoi de Arthritis, mul¬ tiple Sklerose, Diabetes mellitus sowie entzündliche Darm-, Haut- und Schleimhauterkrankungen zeigt sich die pathophysiologische Bedeutung von IL-12 (Tre bleau et al. 1995. I unol. Today 16: 383; Muller et al . 1995. J.Immunol. 155: 4661; Neurath et al . 1995. J.Exp.Med. 182: 1281; Segal et al . 1998. J.Exp.Med. 187: 537; Powrie et al . 1995. Immunity 3: 171; Rudolphi et al . 1996. Eur. J.Immunol. 26: 1156; Bregenholt et al . 1998. Eur . J. Immunol . 28: 379). Durch Applikation von 1L-12 ließ sich die jeweilige Erkrankung auslösen bzw. nach Neutralisierung von endogenem IL-12 zeigte sich ein ab¬ geschwächter Krankheitsverlauf bis hin zu einer Heilung der Tiere. Die Anwendung von Antikörpern gegen IL-12 am Menschen steht derzeit bevor.
Zusammenfassend läßt sich sagen, daß ein Überschuß an ILA 2 die Pathophysiolo J e einer Vielzahl entzündlicher Erkrankungen bedingt. Ansätze zur Normalisierung des IL-12 Spiegels haben daher ein großes therapeutisches Potential .
Daneben ist IL-12 auch an der Regulation des Überlebens von Zellen beteiligt. Unkontrolliertes Zellwachstum wird u.a. durch Apoptose (programmierter Zelltod) reguliert. An T-Lymphozyten wurde gezeigt, daß IL-12 eine anti-apoptotische Wirkung besitzt und das Überleben von T-Zellen fördert (Clerici et al . 1994. Proc.Natl .Acad. Sei . USA 91: 11811; Estaquier et al . 1995. J.Exp.Med. 182: 1759). Eine lokale Überproduktion von IL-12 kann daher zum Überleben von Tumorzellen beitragen .
IL-10 ist ein Zytokin, welches ursprünglich als "cyto- kine synthesis inhibitory factor" beschrieben wurde (Fiorentino et al . 1989. J.Exp.Med. 170: 2081). Dies bedeutet, daß IL-10 die Synthese der entzündungsför- dernden Monokine TNFα, ILA, IL-6, IL-8, IL-12 und GM- CSF durch humane und murine Monozyten/Makrophagen inhi- biert (Fiorentino et al . 1991. J.Immunol. 146: 3444; De Waal Malefyt et al . 1991. J.Exp.Med. 174: 1209). Dies führt darüber hinaus indirekt zu einer Hemmung der Syn- these von IFN-γ durch TH1 Lymphozyten. IL-10 wird von verschiedenen Zellen produziert. Dazu gehören eine be¬ stimmte T-Lymphozytenpopulation, B-Lymphozyten sowie Monozyten/Makrophagen selbst. Interessanterweise tritt die Bildung von IL-10 durch Monozyten/Makrophagen mit einer geringen zeitlichen Verzögerung gegenüber der Synthese der entzündungsfördernden Zytokine auf. Neuere Untersuchungen zeigen, daß die entzündungsfördernden Zytokine TNFα und IL-12 selbst die Synthese von IL-10 durch Monozyten/ Makrophagen (van der Poll et al . 1994. J.Exp.Med. 180: 1985; Platzer et al . 1995. Int . Immunol . 7/4: 517) oder T-Zellen induzieren (Meyaard et al . 199G. J.Immunol. 1 6: 277G). Die Bedeutung von IL-A für die Regulation von mucosalen Entzündungen ist in verschiedenen Tiermodellen zu entzündlichen Darmerkrankungen gut untersucht. IL-10 defiziente Mäuse entwickeln eine schwere Darmentzündung, vergleichbar der des Morbus Crohn (Kuhn et al . 1993. Cell 75: 263). Durch Gabe von IL-10 in erkrankte Mäuse bzw. Kaninchen verbesserte sich das klinische Erscheinungsbild (Powrie et al. 1994. I munity 1:553; Grool et al . 1996. Gas troenterology 110: A918) . Darüber hinaus bildete sich in ersten klinischen Studien bei Patienten mit ulcerativer Colitis durch lokale Verabreichung von IL- 10 die mucosale Entzündung zurück (Schreiber et al . 1995. Gastroenterology 108: 1434; Van Deventer et al . 1997. Gastroenterology 113: 383). Auch die Entwicklung entzündlicher Hauterkrankungen in Mäusen kann durch IL- 10 verhindert werden (Enk et al . 1994. J.Exp.Med. 179: 1397) . Darüber hinaus hat IL-10 bei Hauterkrankungen (Psoriasis) des Menschen therapeutische Wirksamkeit (Asadullah et al . 1998. ..Cl in. luvest . 101: 783).
Neben IL-10 sind eine Reihe weiterer Zytokine wie TGFß (D'Andrea et al . 1995. J. Exp . Med. 181 : 537) sowie
IL-11 (Leng und Elias. 1997 J. Immunol. 159 : 2161) und
IFN α/ß (Cousens et al . 1997. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 94 : 634) in der Lage, die Bildung von IL-12 in Makrophagen zu hemmen. Über die Hemmung von IL-12 verleiht IL-11 Schutz vor Gewebsentzündungen und mildert eine Allergen-induzierte Colitis in der Ratte (Pfeiffer und Qiu. 1995. Gastroenterology 108 : A893). Darüber hinaus ist 1L-11 von der FDA zur Behandlung der Chemo- therapie-induzierten Thrombozytopenie zugelassen. Die systemische Applikation des antiinflammatorischen Zyto- kins TGFß hat therapeutisches Potential in Tiermodellen zu Autoimmunerkrankungen wie der experimentellen allergischen Encephalomyelitis (Racke et al . 1991. J. Immunol. 146 : 3012) . Die Interferone α und ß werden bereits zur Therapie der multiplen Sklerose eingesetzt.
Die immunmodulatorischen Eigenschaften von Thalidomid werden bereits für eine Reihe von Krankhei tsbi ldern wie Erythema nodosu leprosum (Sampaio et al. 1993. J. Infect . Dis . 168: 408), cutanem systemischen Lupus erythematosus (Atra und Sato 1993. Clin .Exp . Rheuma toi . 11: 487), Morbus Behcet (Hamuryudan et al . 1998.
Ann . Intern .Med. 128: 443) sowie Stomatitis aphthosa
(Grinspan et al . 1989. A .Acad . Dermatol . 20: 1060) therapeutisch genutzt. Zwar ist der zugrunde liegende
Mechanismus der Wirkung noch nicht geklärt, es ist je- doch hinlänglich gezeigt, daß Thalidomid die proinflam- matorischen Zytokine TNFα (Sampaio et al . 1991. J.Exp.Med. 173: 699) und insbesondere IL-12 (Moller et al . 1997. J.Immunol. 159: 5157) zu inhibieren vermag, die, wie oben ausgeführt, wesentlich zur Pathogenese von Autoimmunerkrankungen und Entzündungsreaktionen beitragen .
Es ist bekannt, Thalidomid in Kombination mit anderen entzündungshemmenden, insbesondere steroidalen oder nichtsteroidalen Wirkstoffen für die Therapie von rheu- matoider Arthritis (WO 95/04553) und die Inhibition der Angiogenese (WO 98/19649) einzusetzen. Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß bei einer Kombinationstherapie von Thalidomid, dessen α-Methylverbindung EM 978 oder EM 12 mit einem antiin- flammatorischen Zytokin, vorzugsweise IL-10, IJJ-11, TGFß, Interferon-α oder -ß, die IL-12 Inhibition syner¬ gistisch verstärkt wird.
Gegenstand der Erfindung ist dementsprechend ein Ver- fahren zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Erkrankungen, die durch die Bildung des entzündungsfördernden Zytokins IL-12 hervorgerufen werden, wobei erfindungsgemäß gleichzeitig eine der oben genannten Thalidomid- verbindungen und ein antiinflammatorisches Zytokin, vorzugsweise eines der oben genannten, appliziert wer¬ den .
Neben dem bevorzugten Thalidomid eignet sich für die Kombinationstherapie in besonderer Weise auch das α-Methyl-Thalidomid (EM 978) als Thalidomidverbindung.
Bei der gleichzeitigen kombinierten Gabe der Wirkstoffe wird das antiinflammatorische Zytokin parenteral, das heißt subkutan, intramuskulär oder intravenös verab- reicht.
Die Thalidomidverbindung kann oral, rektal, ophthal- misch (intravitreal, intracameral ) , nasal, topisch (einschließlich buccal oder sublingual) , vaginal oder parenteral (einschließlich subkutan, intramuskulär, intravenös, intradermal, intratracheal oder epidural) verabreicht werden.
Die Mengen der einzusetzenden Wirkstoffe sowie die Aus- wähl der Hilfsstoffe wie Trägermaterialien, Füllstoffe,
Lösungsmittel, Verdünnungsmittel, Farbstoffe und/oder
Bindemittel, mit denen der jeweilige Wirkstoff zu einer bestimmten Applikationsform verarbeitet ist, hängen von der Applikationsart ab.
Für die orale Applikation eignen sich Zubereitungen in Form von Tabletten, Kautabletten, Dragees, Kapseln, Granulaten, Tropfen, Säften oder Sirupen, für die parenterale, topische und inhalative Applikation Lösun¬ gen, Suspensionen, leicht rekonstituierbare Trockenzubereitungen sowie Sprays. Erfindungsgemäß einzusetzende Thalidomidverbindungen in einem Depot in gelöster Form, einer Trägerfolie oder einem Pflaster, gegebenenfalls unter Zusatz von die Hautpenetration fördernden Mitteln, sind Beispiele für geeignete perkutane Applikationsformen. Aus oral oder perkutan anwendbaren Zubereitungsformen können die Verbindungen verzögert freigesetzt werden. Ophthalmische Applikationsformen umfassen Tropfen, Salben und Gele.
Die an Patienten zu verabreichende Gesamtwirkstoffmenge variiert in Abhängigkeit vom Gewicht des Patienten, von der Applikationsart, der Indikation und dem Schweregrad der Erkrankung. Üblicherweise werden 1 bis 150 mg/kg einer erfindungsgemäßen Kombination appliziert.
Das erfindungsgemäße Behandlungsverfahren ist geeignet für die Therapie und/oder Prophylaxe von Erkrankungen, bei denen eine überschießende IL-12 Produktion für die Pathogenese verantwortlich gemacht wird (u.a. Erkrankungen des Darmes, der Haut, der Schleimhäute, der Gefäße sowie von Autoimmunerkrankungen) . Ferner eignet sich die kombinierte Gabe von Thalidomid/-Analoga und antiinflammatorischem Zytokin zur Therapie von hämato- logischen Erkrankungen und weiteren onkologischen Erkrankungen. Die synergistische Wirkung von Thalido- mid/-Analoga mit Zytokinen wie IL-10 zeichnet sich bei optimaler Dosierung durch eine fast vollständige Hemmung der IL-12 Produktion bei LPS-aktivierten Mono- zyten aus. Audi bei kombinierter suboptimaAr Dosierunq werden höhere Inhibitionsgrade erzielt als mit den jeweiligen Einzeldosierungen. Di Konzentrationen der unterschiedlichen Inhibitoren, die für den kombinierten Einsatz notig sind, L leeren somit niedriger als i be¬ nötigten Einzelkonzentrationen, wodurch mit weit weni¬ ger Nebenwirkungen der einzelnen Inhibitoren zu rechnen ist. Ferner kann zudem aufgrund der über einen weiten Dosisbereich sichtbaren synergist schen Wirkung eine je nach Schweregrad des Erkrankunαsbi 1 des ge ignet Dυ i' ermittelt werden, dA therapeutisch wirksam ist.
Die Wirkstoffe werden dabei zur Behandlung de genann¬ ten Erkrankungen in einem Dosisbereich, welcher Serum- konzentrat i onen von 10-faclι unter der EC bis 100-fach über der EC< einschließt, eingesetzt. EC. Werte für Thalidomid/Analoga liegen bei 50 bi 100 ng/ l, der EC Wert für IL-10 liegt bei 50 pg/ml .
Zu den Erkrankungen oben genannter Formenkreise zahlen unter anderem Entzündungen öeτ Haut (z.B. atoprsche Dermatitis, Psoriasis, Ekzeme, Ski erodermi e ) , Entzün¬ dungen der Atemwege (z.B. Bronchitis, Pneumonie, Asthma bronchiale, ARDS (adult resp ratory distress syndrome) , Sarkoidose, Silikose/Fibröse) , Entzündungen des Gastro- intestinaltraktes (z.B. gast oduodenale Ulcera, Morbus Crohn, ulcerative Colitis), ferner Erkrankungen wie Hepatitis, I'ankreat itis, Appendizitis, Peritonitis, Nephritis, Aphthosis, Konjunktivitis, Keratitis, Uveitis, Retinopathie, Rhinitis.
Die Autoimmunerkrankungen umfassen z . B . Erkrankungen des arthritischen F'ormenkr erses (z.B. rheumatoide Arthritis, HLA-B27 assoziierte Erkrankungen), ferne] multiple Sklerose, jugendlicher Diabetes oder Lupus erythematosus . Weitere Indikationen sind Sepsis, bakterielle Meningi¬ tis, chronisch bakterielle und chronisch virale Infek¬ tionen (z. B. HIV/AIDS, Hepatitis), Kachexie, Trans- plantat-Abstoßungsreaktionen, Graft-versus-Hos t Reak- tionen, Atherosklerose sowie das Reperfusionssyn- drom/Herzversagen und Tumorerkrankungen.
Ferner gehören hämatol ogische Erkrankungen wie multip¬ les Myelom und Leukämien sowie v/eitere onkologische Erkrankungen wie Glioblastom, Prostatacar cinom sowie Mammacarcinom zu den Krankheitsbildern, die durch die Kombinationscfabe Thaliomdid/-AnaJ oga und antiinflamma- torisches Zytokin zu inhibieren sind.
Beispiele
Tabelle 1. Eingesetzte Immunmodulatoren
Figure imgf000010_0001
Stimulation humaner Monozyten mit Lipopolysaccharid zur Sekretion von IL-12
Humane Monozyten wurden aus peripheren Blut-mononuclea- ren Zellen (PBMC), die mittels einer Ficoll-Dichtegra- dientenzentπ fugation von heparinisiertem Vollblut ge- wonnen wurden, isoliert. Dazu wurden die PBMC mit einem monoklonalen Antikörper inkubiert, der gegen das Mono- zyten-spezifische Oberflachenmolekul CD14 gerichtet ist und an den superparamagnetische Microbeads (Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach) gekoppelt sind. Zur positi- ven Selektion der markierten Monozyten aus dem Zellge- misch der PBMC wurde die Gesamtzellsuspension auf eine Säule mit ferromagnetischer Tragermatrix aufgebracht und diese in ein Magnetfeld gestellt. Dadurch wurden die Zellen, die im t Microbeads beladen waren, an die Tragermatrix gebunden, unmarkierte Zellen passierten die Säule und wurden verworfen. Nach Herausnehmen der Matrix aus dem Magnetfeld wurden die Antikorper-belade- nen Zellen durch Spulen der nun entmagnetisierten Säule mit Puffer eluiert. Die Reinheit dieser so erhaltenen CD14-positiven Monozytenpopulation betrug etwa 95 bis 98''.. Diese Monozyten wurden in einer Dichte von 10' Zellen/ml Kulturmedium (RPMI, supplementie t mit 10" foe- talem Kälberserum) mit den in DMSO-gelösten PrüfSub¬ stanzen für eine Stunde bei 37 °C und 5"-, CO inkubiert. Anschließend wurde 20 μg/ml LPS aus E. coli zugegeben. Nach 24 Stunden wurden zellfreie Kulturüberstände ge¬ nommen und auf den Gehalt an IL-12 getestet.
Die Konzentration von IL-12 in den Zellkulturüberstän- den wurde mittels Sandwich-ELlSAs unter Verwendung zweier anti-IL-12 monoklonaler Antikörper (Biosource Europe, Fleurus, Belgien) bestimmt. Eine Referenzstan- dardkurve mit humanem IL-12 wurde eingeschlossen. Das Detektionslimit des IL-12 ELISAs betrug 10 pg/ml .
Tabelle 2. Einfluß von Thalidomid und Interleukin-10, einzeln und in Kombination, auf die 1L-12 Produktion von LPS-aktivier en Monozyten.
Figure imgf000012_0001
'Ann. = "-- Inhibition der IL-12 Produktion der Kontrolle ohne Inhibitoren
Tabelle Einfluß von EM 978 und Interleukin-10, ein¬ zeln und in Kombination, auf die IL-12 Produktion von LPS-aktivierten Monozyten.
0 EM 978 EM 978 EM 978 0.5 μg/ml 0.05μg/ml 0. OOSμg/ l
IL-12 Produktion pg/ .Inh* pg/ Anh. pg/ Anh. pg/ ; I h . ml ml ml ml
0 4890 0 439 91 316 35 4571 7
1
IL-10 2538 47 191 96 155 68 2302 5 50 pg/ml 5
IL-10 4393 10 272 94 189 61 2922 40 5 pg/ml 7
Tabelle . Einfluß von EM 12 und Interleukin-10, ein¬ zeln und in Kombination, auf die IL-12 Produktion von LPS-aktivierten Monozyten.
0 EM 12 EM 12 EM 12 5 μg/ml 0.5 μg/ml 0.05 μg/ml
IL-12 Produktion pg/ Anh* pg/ Anh. pg/ Anh. pg/ Anh. ml ml ml ml
0 6537 0 2220 66 209 68 3478 47 8
IL-10 1237 81 546 92 649 90 589 91 50 pg/ml
IL-10 4581 30 1271 81 146 78 2944 55 5 pg/ml 2
Die in den Tabellen 2 bis 4 dargestellten Ergebnisse zeigen die von Thalidomid, EM 12, EM 978 sowie IL-10 ausgehende dosisabhängige, inhibitorische Wirkung auf die IL-12 Produktion LPS-stimulierter Monozyten. Überraschenderweise kann durch eine gleichzeitige kombi¬ nierte Gabe von IL-10 und Thalidomid/-Analoga eine deutlich gesteigerte Inhibition beobachtet werden. Die Steigerung der Inhibition ist sowohl bei optimalen als auch suboptimalen Konzentrationen beider Inhibitorklassen zu sehen. Eine fast vollständige Inhibition von IL-12 ist durch eine Kombination im Bereich der höheren Thalidomid/Analoga-Konzentrationen und höheren Inter- leukin-10-Konzentrationen zu erzielen.
Interessant ist, daß durch Einsatz der α-methyl-Verbin- dung von Thalidomid, dem EM 978, eine 10-fach geringere Konzentration als bei Thalidomid/EM 12 verwendet werden kann, um die gleichen Effekte zu erzielen.
Durch die kombinierte Gabe zweier unterschiedlicher Klassen von Immunmodulatoren, Thalidomid/-Analoga zusammen mit antiinflammatorischen Zytokinen wie 1 -10, wird zum einen eine synergistische Verstärkung der [1,- 12 Inhibition, zum anderen auch eine Reduktion der be¬ nötigten Inhibitordosierung erreicht. Eine Kombina- tionstherapie ermöglicht somit eine sehr viel effizien¬ tere Inhibition des entzündungsfördernden Mediators IL- 12. Ferner ist durch Reduktion der zur Inhibition benötigten Einzeldosen eine Verminderung unerwünschter Nebenwirkungen zu erwarten.

Claims

Patentansprüche
1) Verfahren zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Er¬ krankungen, die durch die Bildung des entzundungs- fordernden Zytokins IL-12 hervorgerufen werden, da¬ durch gekennzeichnet, daß gleichzeitig eine Thalido¬ midverbindung aus der das Thalidomid selbst, seine -Methylverbindung EM 978 und EM 12 umfassenden Gruppe und ein ant L inflammatorisches Zytokin appli- ziert werden.
2) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Thalidomidverbindung Thalidomid oder α-Methyl-Thalidomid (EM 978) eingesetzt wird.
3) Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, daß als antiinflammatorisches Zyto¬ kin IL-10, IL-11, TGFß, Interferon α oder Inter¬ feron ß eingesetzt wird.
4) Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Wirkstoffe jeweils in einem Dosisbereich appli ziert werden, welcher Serumkonzen¬ trationen von 10-fach unter bis lOOfach über der je¬ weiligen EC- einschließt.
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