WO2001038572A1

WO2001038572A1 - Methode d'amplification d'acides nucleiques

Info

Publication number: WO2001038572A1
Application number: PCT/JP2000/008073
Authority: WO
Inventors: Kazuhiko Aoyagi; Hiroki Sasaki; Masaaki Terada; Junichi Mineno; Kiyozo Asada; Ikunoshin Kato
Original assignee: Takara Bio Inc.
Priority date: 1999-11-19
Filing date: 2000-11-16
Publication date: 2001-05-31
Also published as: AU1413601A

Description

明細書核酸の増幅方法技術分野

本発明は、遺伝子工学分野、特に mRNAの発現のモニタリングにおいて有用な核酸の増幅方法、核酸増幅用キットおよび c D N Aライブラリ一または c R N Aライブラリーに関する。背景技術

近年、複数の試料間の各 mRNA群の存在比率を検出するために、 DNAマクロアレイ、 DNAマイクロアレイなどが使用されている。その中で特に DNAマイクロアレイは、遺伝子の発現解析、変異解析または多型解析を飛躍的に加速させる手段として非常に有用である。試料中における mRNAの発現を DNAマイクロアレイを用いて解析する場合においては、一般的に試料中の mRNAから得られる c DNAまたは c RNA (該 mRNAに相補的な配列を有する RNAをいう）について試料ごとに異なる蛍光物質で標識し、 DNAマイクロアレイ上で競合ハイプリダイゼーシヨンすることにより、それぞれの試料中の mRNA発現量の差が検出される。

DNAマイクロアレイ上で mRNA発現量の差を解析するための、上記の蛍光標識した c DNAまたは cRNAを検出するために必要な試料量は、標識方法によって異なる。例えば、ネィチヤ一ジヱネテイクスサプリメント（Nature G enetics Supplement)、第 21巻、 1 0〜 14頁（1 999)記載の逆転写酵素によって基質アナログを取り込ませて cDNAを標識する方法では、全 RNAを 1 0〃g以上必要とする。この 1 0 gの全 RNAを得るためには、一般的に 1 0^β 個の細胞が必要とされる。しかしながら、マイクロダイセクション法等を用いて採取された細胞から得られる全 RNAは、非常に少なく、 1 0〜1 0 O ng 程度である。大量の mRNAを得るため、大量の試料を使う方法が考えられる。しかしながら、例えば、生検（バイオプシー）等では、大量の試料を得ることが困難である場合がある。

したがって、 DNAマイクロアレイを用いた医薬品の開発や健康の維持管理方法の開発では、組織切片由来の全 RN Aを用いて遺伝子発現解析を行なう場合があり、必要試料量をさらに少なくすることが望まれている。

かかる課題の解決手段として、例えば、感度良く mRNAの発現量をモニタ一するために、試料由来の mRNAより cDNAを調製し、これを適当な核酸増幅方法で処理して得られる cDN Aライブラリーもしくは CRN Aライブラリ一を標識し、得られたライブラリーと DN Aマイクロアレイ上に固定化された核酸断片とをハイブリダィズさせる方法が挙げられる。このように cDN Aを铸型とした核酸増幅方法としては、ポリメラ一ゼチヱ一ンリアクション（PCR)法や日本国特許番号第 2650 1 59号公報に記載の核酸配列増幅（NASBA； nucleic acid sequence based amplification ) 法が挙げられる。

しかしながら、前記増幅方法により、試料中の微量の mRNAを铸型として c DNAライブラリーまたは c RNAライブラリ一を増幅した場合、試料中の個々の mRNA分子の発現量の違いにかかわらず、増幅産物がブラトーに達するまで増幅されてしまう可能性がある。すなわち、かかる増幅方法などの従来の方法によれば、試料中の mRNA群の存在比率を全く反映していない c DNAライブラリーまたは cRNAライブラリーが得られるため、試料中の mRNA群の存在比率を保持したままで増幅された cDN Aライブラリーまたは c RN Aライブラリ一を作製することが困難であるという欠点がある。

したがって、微量の試料中の mRNAについて、該試料中の mRNA群の存在比率を保持した cDN Aライブラリーまたは CRN Aライブラリーを作製しうる核酸増幅方法が求められている。発明の開示

本発明は、（1)試料中の mRNA群の存在比率を変えることなく保持した、試料中の mRN A由来の核酸を増幅することが可能な、核酸の増幅方法、（2) 該増幅方法で得られた c D N Aライブラリ一または c R N Aライブラリ一、および（3)該増幅方法を行ない、 cDNAライブラリーまたは cRNAライブラリ一を調製するための核酸増幅用キットを提供することを目的とする。

すなわち、本発明は、

〔1〕（I)第 1オリゴヌクレオチドプライマ一を用いて、試料中の mRNA に相補的な 1本鎖 DNA (第一铸型）を作製する工程、

(II)前記工程（I)で得られた 1本鎖 DNAに相補的な DNA鎖（第二铸型）を合成して、 2本鎖 DN Aを作製する工程、

(III) 1本鎖もしくは 2本鎖のアダプタ一 DNAを前記工程（II)で得られた 2 本鎖 DN Aの末端に付加して、 DN A鎖を得る工程、及び

(IV) プライマーが、該アダプター DNA中に存在する核酸配列を有するオリゴヌクレオチドである第 2ォリゴヌクレオチドプライマ一を用いて、前記工程（III ) で得られた DNA鎖を増幅させる工程

を含み、かつ試料中の mRNA群の存在比率を保持しながら当該 mRN A由来の塩基配列を有する核酸を増幅する、核酸の増幅方法；

〔2〕第 1オリゴヌクレオチドプライマーがオリゴ（dT)配列を含有するものである、前記〔 1〕記載の核酸の増幅方法；

〔3〕第 1オリゴヌクレオチドプライマ一が mRN Aに特異的な配列を含有するものである、前記〔 1〕記載の核酸の増幅方法；

〔4〕第 1オリゴヌクレオチドプライマ一が RN Aポリメラーゼプロモー夕一配列をさらに含有するものである、前記〔1：) 〜〔3〕いずれか記載の核酸の増幅方法； (5〕前記〔1〕記載の工程（II)が、ニックトランスレーション法により実施される、前記〔1〕〜〔4〕いずれか記載の核酸の増幅方法；

〔6〕前記〔1〕記載の工程（II)が、ランダムプライマ一エクステンション法により実施される、前記〔1：) 〜〔4〕いずれか記載の核酸の増幅方法；

〔7〕請求項 1記載の工程（II) と工程（III) との間に、

(ΙΓ )試料中の mRNA群の存在比率が保持される条件下で P C R増幅工程をさらに含む、前記〔1：) 〜〔6〕いずれか記載の核酸の増幅方法；

〔8〕前記〔1〕記載の工程（Π) と工程（III) との間に、

(II") ェンドヌクレアーゼにより 2本鎖 DNAを処理する工程

をさらに含む、前記〔1〕〜〔7〕いずれか記載の核酸の増幅方法；

〔9〕前記〔8〕記載の工程（ΙΓ) において、複数のエンドヌクレア一ゼにより独立して 2本鎖 DNAを処理し、得られた 2本鎖 DNAを混合し、それにより得られた混合物を前記〔1〕記載の工程（III) における 2本鎖 DNAとして用いる、前記〔8〕記載の核酸の増幅方法；

(1 0〕エンドヌクレアーゼが、制限酵素である、前記〔8〕または〔9〕記載の核酸の増幅方法；

〔1 1〕請求項 1記載の工程（II) と工程（III) の間に、

(ΙΓ'')工程（II)で得られた 2本鎖 DNAを铸型に 1本鎖 RNAを合成し、該 1本鎖 RNAを铸型とした逆転写反応により 1本鎖 cDNAを合成し、ついで該 1本鎖 c DNAを 2本鎖 DNAとする工程

を少なくとも 1回さらに含む、前記〔 1〕〜〔 7〕いずれか記載の核酸の増幅方法；

(12〕前記（1 1〕記載の工程（ΙΓ'') における 1本鎖 RNAの合成が、 R NAポリメラ一ゼにより行なわれる、前記〔1 1〕記載の核酸の増幅方法；

〔13〕前記〔1 1〕記載の工程（ΙΓ'') における逆転写反応が、 RNAボリメラ一ゼプロモータ一配列を含有するオリゴヌクレオチドプライマ一を用いて行なわれる、前記〔 1 1〕又は〔 1 2〕記載の核酸の増幅方法；〔1 4〕前記〔 1 1〕記載の工程（Π''') が、ニックトランスレーション法で行なわれる、前記〔1 1〕〜（： 1 3〕のいずれかに記載の核酸の増幅方法；〔1 5〕前記〔1 1〕記載の工程（ΙΓ'') が、ランダムプライマ一ェクステンシヨン法で行なわれる、前記〔1 1：) 〜〔1 3〕のいずれかに記載の核酸の増幅方法；

〔 1 6〕第 2オリゴヌクレオチドプライマ一が、アダプタ一 DNAにストリンジェントな条件下にハイブリダィズしうるオリゴヌクレオチドである、前記〔1 ：) 〜〔 1 5〕のいずれかに記載の核酸の増幅方法；

〔1 7〕前記〔1〕記載の（IV) 工程が PC R法により実施される、前記〔 1 〕〜〔1 6〕いずれかに記載の核酸の増幅方法；

〔1 8〕前記〔1〕〜（： 1 7〕のいずれかに記載の核酸の増幅方法で得られた cDNAライブラリ一または CRN Aライブラリー；

〔1 9〕前記〔1：) 〜〔1 7〕のいずれかに記載の核酸の増幅方法を行ない、 c DNAライブラリーまたは cRN Aライブラリーを調製するためのキットであつて、下記増幅用試薬：

逆転写酵素、逆転写反応用試薬、 DNAリガーゼ、 DNAポリメラ一ゼ、逆転写反応で得られた 2本鎖 DN Aの末端に付加される少なくとも 1つのアダプター D NA、 PCR用試薬および該アダプター DNAに内在する配列を含有したオリゴヌクレオチドプライマ一

を含有し、かつ前記増幅用試薬を用いて前記〔1〕〜 (： 1 7〕いずれか記載の核酸の増幅方法を行なう手順が指示された指示書を含有してなる、核酸増幅用キッ卜、

〔20〕制限酵素および該制限酵素に対応する処理用試薬をさらに含有してなる、前記〔 1 9〕記載の核酸増幅用キット、ならびに

〔2 1〕インビトロトランスクリプション用試薬をさらに含有してなる、前記〔1 9〕または〔20〕記載の核酸増幅用キット、

に関する。図面の簡単な説明

F i g. 1は、 T7 蛍光標識 cDNAライブラリー使用時の蛍光シグナルのシグナル強度と P C RZT 7 蛍光標識 cDNAライブラリ一使用時の蛍光シグナルのシグナル強度の閟係を示す図である。

F i g. 2は、 T7 蛍光標識 cDNAライブラリー使用時の蛍光シグナルのシグナル強度と T 7ZP CRZT 7 蛍光標識 c DN Aライブラリ一使用時の蛍光シグナルのシグナル強度の関係を示す図である。発明を実施するための最良の形態

本発明の核酸の増幅方法は、微量の mRNAから、該 mRNAに相補的な配列を有する核酸を合成し、得られた核酸とアダプタ一 DNAとを連結した産物を铸型として、該アダプター DNAに内在する核酸配列を有するプライマーで増幅することに 1つの大きな特徴がある。

本発明の核酸の増幅方法によれば、前記のように、アダプター DNAに内在する核酸配列を有するプライマーにより増幅する操作を行なうため、 mRNA群の存在比率を保持した cDNAライブラリーまたは c RNAライブラリーを得ることができるという優れた効果を発揮する。また、本発明は、前記 cDNAライブラリーを铸型として、インビトロトランスクリプションを少なくとも 1回行なうことにより、増幅前の各 cDNAの存在比率を保持したまま、 cDNAライブラリ一全体を増幅することができるという優れた効果を発揮する。

また、通常の RT— PCRでは、短鎖の核酸のほうが増幅効率が高いため、存在比率を保持できない場合があるが、本発明の核酸の増幅方法によれば、 mRN A群の存在比率を保持したまま c DNAライブラリーまたは cRNAライブラリ一を作製することができるという優れた効果を発揮する。

本発明の核酸の増幅方法の具体例としては、

( I ) 第 1オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、試料中の mR NAに相補的な 1本鎖 DNA (第一铸型）を作製する工程、

(I I) 前記工程（ I ) で得られた 1本鎖 DNAに相補的な DNA鎖（第二铸型）を合成して、 2本鎖 DNAを作製する工程、

(I I I) 1本鎖もしくは 2本鎖のアダプタ一 DNAを前記工程（I I) で得られた 2 本鎖 DN Aの末端に付加して、 DN A鎖を得る工程、及び

(IV) 該アダプター DNA中に存在する核酸配列を有する第 2オリゴヌクレオチドプライマ一を用いて、前記工程（I I I) で得られた DNA鎖を増幅させる工程を含み、かつ試料中の m R N A群の存在比率を保持しながら当該 m R N A由来の塩基配列を有する核酸を増幅する方法が挙げられる。

本明細書においては、「試料」とは、核酸を含有する試料すベてを意味する。すなわち、本発明の核酸の増幅方法に使用することができる試料としては、全 R N Aあるいは mRNAが得られる試料であれば、いずれもが好適に使用できる。また、前記試料は、天然物または人工的な産物（加工物）のいずれでもよい。このような核酸を含有する試料としては、例えば、天然物として、細胞、組織、血液のような生体由来試料が挙げられ、人工的な産物（加工物）として、食品、土壌、排水のような生物を含有する可能性のある試料が挙げられる。また、前記「試料」には、前記試料等を公知の方法で処理することによって得られる核酸含有調製物（例えば、組織または細胞より調製された RNA混合物）をも含まれる。前記核酸含有調製物としては、例えば、細胞破砕物やそれを分画して得られる試料、該試料中の核酸、あるいは特定の核酸分子群、例えば、 mRNAを富化した試料等が本発明に使用できる。

前記生体由来試料または人工的な産物（加工物）からの核酸の単離方法としては、慣用のあらゆる方法が挙げられ、かかる慣用の方法により核酸の単離を行なうことができる。具体的には、前記生体由来試料または人工的な産物（加工物）からの核酸の分離は、界面活性剤による溶解処理、音波処理、ガラスビーズを用いた振盪撹拌およびフレンチプレスの使用などにより行なわれうる。さらに、内在性ヌクレアーゼが存在する場合などには、単離された核酸を精製することが有利である。かかる場合において、核酸の精製は、フエノール抽出、クロマトグラフィ一、イオン交換、ゲル電気泳動または密度に依存した遠心分離により実施される。

本発明の方法において、「m R NA由来の塩基配列を有する核酸」とは、試料中から上記核酸の単離方法等により得られた全 R NA、 mR NA等の R NA群；または特定の RNA群より、逆転写反応によって得られた c D NA (第一铸型）を铸型として合成される核酸をいい、 D NA及び R NAのいずれもが包含される。また、前記第一铸型に相補的な第二铸型を合成して得られる 2本鎖 D NAも含まれる。

本発明の方法において、使用されるオリゴヌクレオチドプライマ一は、铸型となる DNAに実質的に相補的な塩基配列を有し、その 3 ' 末端より D NA鎖の伸長が可能であればよい。なお、ここで「実質的に相補的な塩基配列」とは、使用される反応条件、例えばラボマニュアル P C R (宝酒造、第 1 3頁〜第 1 7頁、 1 9 9 6年）に記載の Tm値を指標にしたストリンジヱントな条件において铸型となる D NAにァニーリングし、続く D N A伸長反応が可能な塩基配列を意味する。このようなオリゴヌクレオチドプライマーの設計は、当業者に公知であり、例えば、ラボマニュアル P C R (宝酒造、第 1 3頁〜第 1 6頁、 1 9 9 6年）を参考に設計する事ができる。また、市販のプライマー構築ソフト、例えば、 0LIG OT™ Primer Analysis software (宝酒造社製）を使用することができる。

また、前記オリゴヌクレオチドプライマ一は、その 5 ' 側に、铸型核酸配列と相補性のない修飾配列、例えば、 R NAボリメラーゼのプロモーターのような核酸配列を付加してもよい。かかる修飾配列は、铸型核酸配列と相補性のない塩基配列が好ましいが、铸型核酸配列によっては相補性のない塩基配列を特定できない場合もあり、その場合は限定はされない。前記修飾配列により、後の増幅反応の特異性が向上するという優れた効果を発揮しうる。さらに、前記 RNAポリメラーゼのプロモーターの種類は、インビトロトランスクリプションが実施できる RNAポリメラーゼのプロモーター配列であれば特に限定はなく、例えば、 T 7 RNAボリメラーゼ、 SP 6 RNAポリメラーゼあるいは T3 RNAポリメラーゼのプロモーター配列が好適に使用できる。

本発明の方法において使用されるオリゴヌクレオチドプライマ一は、約 1 1ヌクレオチドから約 1 00ヌクレオチドの長さのプライマーが望ましい。さらに好ましくは、約 20ヌクレオチドから約 40オリゴヌクレオチドの長さのプライマ一が望ましい。かかるオリゴヌクレオチドプライマーの配列は、 3' 末端側がストリンジェントな条件においてアニーリングするように、好ましくは、実質的に铸型の配列に相同であることが望ましい。

本発明の方法に使用されるオリゴヌクレオチドプライマ一は、任意の核酸配列を持つように、例えば AB I社（Applied Biosystera Inc.) の DN Aシンセサイザ一 394型を用いて、ホスホアミダイト法により合成されうる。また、別法としてリン酸トリエステル法、 H—ホスホネート法、チォホスホネート法等が挙げられるが、前記オリゴヌクレオチドプライマーは、いかなる方法で合成されたものであってもよい。

本発明の方法においては、工程（I) において、試料中の微量の mRNAを铸型として逆転写反応により、該 mRNAの相補的な 1本鎖 DNAを作製する。逆転写反応に用いられる酵素としては、 RNAを铸型とした cDNA合成活性を有するものであれば特に限定はなく、例えば、トリ骨髄芽球症ウィルス由来逆転写酵素（AMV RTa s e) 、モロニ一ネズミ白血病ウィルス由来逆転写酵素（MMLV RTa s e) , ラウス関連ウィルス 2逆転写酵素（RAV— 2 RTa s e)等、種々の起源の逆転写酵素が挙げられる。このほか、逆転写活性を併せ持つ DNAポリメラーゼを使用することができ、かかる DNAポリメ一ゼとしては、例えば、サ一マス属細菌由来 DNAポリメラ一ゼ（Tt h DNAボリメラーゼ等）、バチルス属細菌由来 DNAポリメラーゼ等が挙げられる。上記逆転写活性を持つ DNAポリメラ一ゼとしては、特に限定されないが、 Bacillus stearothermophilus由来 DNAポリメラ一ゼ（以下、 Bs t DNAポリメラーゼという）、 Bacillus cardotenax由来 DNAポリメラ一ゼ（以下、 Be a DNAポリメラーゼという）など例示され、これらの酵素の 5' →3' ヱキソヌクレアーゼ欠損体が特に好適である。

本明細書において、「アダプター DNA」としては、 1本鎖 DNAでも 2本鎖 DNAでもよく、目的とする DNAの末端にライゲ一シヨン可能な DNA、即ちその末端が制限酵素消化によって生じる末端と同じ形状である D N Aなどが挙げられ、かかるアダプタ一 DNAが本発明の方法に好適に使用されうる。また、前記アダプター DNAとしては、市販品を使用してもよい。かかる市販品としては、特に限定されないが、例えば、 Ec oR I— No t I一 BamH I アダプタ一（宝酒造社製）が好適に使用できる。さらに、前記アダプタ一 DNAには、上記の RNAボリメラーゼのプロモータ一配列が付加されていてもよい。さらに、前記アダプタ一 DN Aには、 PCR等による核酸増幅のためのプライマ一配列となる塩基配列を付加させてもよい。

前記アダプター DNAの末端の形状には特に限定はなく、 5' 突出末端型、 3 ' 突出末端型、平滑末端型のいずれもが好適に使用できる。かかる末端の形状としては、例えば、 Bg l I I、 EcoR I、 Hp a I I、 Hi nd i I I等の制限酵素処理によって生じるような 5' 突出末端型； Ps t I、 Kpn I、 Hha I、 P vu I等の制限酵素処理によって生じるような 3' 突出末端型； Sma l 、 Nru l、 Ρ νυ I I、 Ec oRV、 Sea I等の制限酵素処理によって生じるような平滑末端型などが挙げられる。

また、前記アダプター DNAは、その内部に適当な制限酵素の認識切断部位を有していてもよい。

本発明で使用するアダプタ一 DNAは、 2本鎖 D NAの両端にそれぞれ 1つずつ付加するように該ァダブターの一方の 5 ' 末端のみがリン酸化されているものが好ましい。

本発明の核酸の増幅方法において、第 1オリゴヌクレオチドプライマ一のブライマ一は、工程（ I ) における第一铸型の作製（逆転写反応）に用いられる。第 1オリゴヌクレオチドプライマ一としては、増幅対象の核酸に特異的にァニーリングするに十分な長さであればよく、铸型 RNAに相補的な特異的プライマ一、オリゴデォキシチミン（d T) 配列を有するプライマーなどが好適に使用できる。さらに、第 1オリゴヌクレオチドプライマーの 5'末端側に、任意の修飾配列（例えば、铸型核酸配列と相補性のない塩基配列）、前記 RNAボリメラーゼのプ口モーター配列を有していてもよい。なお、オリゴデォキシチミン（d T) 配列を有するプライマーを用いる場合、第二铸型合成に際して、他のオリゴヌクレオチドプライマ一（例えば、铸型核酸に特異的な塩基配列を有するプライマー、ランダムプライマ一など）を用いてもよい。

本発明の核酸の増幅方法において、第 2オリゴヌクレオチドプライマーは、ェ程（I I I) で得られた DNA鎖に特異的にァニーリングするに十分な長さであればよく、前記アダプター DNAに内在する塩基配列を有するものが好適に使用できる。

すなわち、第 2オリゴヌクレオチドプライマーは、アダプタ一 D NAにストリンジ工ントな条件下にハイブリダィズしうるオリゴヌクレオチドが好ましい。次に、本発明の核酸の増幅方法について、より具体的に説明する。

( 1 ) 本発明の核酸の増幅方法

工程（ I ) ：

第 1オリゴヌクレオチドプライマ一を用いて、試料中の mRNAに相補的な 1本鎖 DNA (第一铸型）を作製する。

まず、試料中の全 RN Aもしくは mRNAに第 1オリゴヌクレオチドプライマ一をアニーリングさせ、逆転写反応を行なって cDN Aを合成する。かかる逆転写反応には、前記逆転写酵素を使用することができる。反応条件は、用いる逆転写酵素、第 1オリゴヌクレオチドプライマーの配列、核酸の配列などにより適宜設定することができる。かかる条件は、例えば、モレキュラークロ —ニングァラボラトリ一マニュアル第 2版 [Sambrook et al, Molecu lar Cloning: A LABORATORY MANUAL SECOND EDITION (1989)] などに記載されており、また市販の c DNA合成キットの取扱説明書に従って設定することができる。工程（Π)：

前記工程（I)で得られた 1本鎖 DNAに相補的な DNA鎖（第二铸型）を合成して、 2本鎖 DNAを作製する。

第二铸型の合成（相補鎖合成反応）には、モレキュラークローニングァラボラトリーマニュアル第 2版（ 1 989 ) 第 8章記載の方法、あるいは該マニュアル第 1 0章記載のニックトランスレーション法；適当なプライマー、例えば、上記 cDNAに相補的な配列を有するプライマーやランダムプライマーなどを使用したプライマ一エクステンション法を利用することができ。

なお、前記工程（I) において、オリゴ dTプライマーを使用した場合は、第二铸型合成の際にさらにもう 1種類のオリゴヌクレオチドプライマ一、特に限定されなレ、が、例えば铸型核酸の特異的塩基配列又はランダムプライマ一を用いてもよい。前記工程（I) および（II)には、市販の cDNA合成キット、例えば、 cDN A シンセシスキット（cDNA Synthesis Kit. 宝酒造社製）等を使用することができる。本発明の方法は、特に限定はされないが、例えば、全 RNAが 100 ng以上、特に好ましくは 1 /zg以上の場合において、好適に適用されうる。工程（ΙΓ)

前記工程（II)と後述の工程（III) の間においては、必要に応じて、工程（II) で得られた 2本鎖 c DNAを試料中の mRNA群の存在比率を保持しうる範囲内で、 PCR法のような核酸増幅方法を用いて増幅する工程（ΙΓ) を行なってもよい。

ここで、「mRNA群の存在比率が保持される条件」としては、铸型核酸の種類又は量に応じて、また使用するサーマルサイクラ一の能力に応じて最適化することができ、例えば、夕カラ PCR サーマルサイクラ一 MPを用いた場合、 95°Cで 5分保持後、 95で、 1分— 72°C、 3分を 1サイクルとした 30サイクル反応、 72でで10分保持の条件が挙げられる。工程（II")

前記工程（II)と後述の工程（III) の間においては、必要に応じて、少なくとも 1種のェンドヌクレアーゼにより、工程（II)で得られた 2本鎖 c DN Aを処理する工程（ΙΓ) を行なってもよい。前述の平滑末端を有するアダプター DN Aを使用する場合は、かかる工程（ΙΓ) の制限酵素処理工程を省略してもよい工程（ΙΓ,')

前記工程（II)と後述の工程（III) の間においては、必要に応じて、工程（II" ) における制限酵素処理の代わりに、工程（II)で得られた 2本鎖 DNAを铸型に 1本鎖 RNAを合成し、該 1本鎖 RNAを铸型とした逆転写反応により 1 本鎖 cDNAを合成し、該 1本鎖 cDNAを 2本鎖 DNAとする工程（1 '）をさらに含んでもよい。この場合、かかる工程（ΙΓ'') は、少なくとも 1回、すなわち複数回繰り返して行なうこともできる。かかる工程（ΙΓ'') は、試料中の mRNA群の存在比率を保持しながら増幅する観点から、全 RNAが 1 Ong以上、特に全 RN Aが 100 ng以上の場合に好適である。また、試料中の RNA量がさらに少ない場合においては上記工程を 2回繰り返すことが好ましい。特に微量の mR NA群の存在比率を保持しながら増幅する観点から、全 RNAが 1 ng以上の場合には工程（1Γ'') を繰り返すことが有利である。なお、全 RNA 1 n g は、約 10² セルに相当する。

本工程（ΙΓ'') において、 1本鎖 RNAの合成は、 RNAポリメラ一ゼを用いて行なうことができる。また、上記逆転写反応のために、工程（II)で得られた 2本鎖 DNAを铸型として 1本鎖 RN Αを合成するに際して、 RNAポリメラーゼプロモーター配列を含有するオリゴヌクレオチドプライマ一を用いてもよい。

さらに、 1本鎖 cDNAから 2本鎖 DNAを得るために、ニックトランスレ —シヨン法あるいはランダムプライマ一エクステンション法で行なってもよい

工程（III)

1本鎖もしくは 2本鎖のアダプター DNAを前記工程（Π)で得られた 2本鎖 DNAの末端に付加して、 DNA鎖を得る。

本工程（III) においては、工程（II)で得られた 2本鎖 cDNAまたは工程（I I") で得られた制限酵素処理後の 2本鎖 cDNAまたは工程（ΙΙΓ'')で得られた 2本鎖 c D Ν Αに、適当な末端形状を有する上記アダプタ一 DNAをライゲ —シヨン反応により付加させる。例えば、 T4 DNAリガーゼを用いて、 2 本鎖 c DNAとアダプター DNAとをライゲ一シヨンさせ、アダプタ一付加 c DNAを調製することができる。さらに、前記工程（II") における制限酵素処理について、複数の制限酵素でそれぞれ処理した場合には、各制限酵素で処理した 2本鎖 cDN Aと同じ制限酵素で処理したアダプター DN Aとを付加した後、得られた 2本鎖 DNAを混合することにより、均一なライゲーシヨン反応処理物を調製することができる。

なお、前記〔1〕記載の工程（III) において、工程（11)、 (ΙΓ)、 (ID. および（ΙΓ'')からなる群より選ばれた 1つの工程で得られた 2本鎖 DNAの量に対して、十分な量のアダプタ一 DNAが存在することが望ましい。すなわち、上記工程後、 2本鎖の cDNAの両端にアダプタ一 DNAがライゲ一ションしたアダプター付加 cDN Aが高収率で得られる条件であればよい。工程（IV)

アダプター DNA中に存在する核酸配列を有する第 2オリゴヌクレオチドプライマ一を用いて、前記工程（III) で得られた DNA鎖を増幅させる。

本工程（IV)において、適当な遺伝子増幅方法、例えば第 2オリゴヌクレオチドプライマ一を用いたポリメラーゼチェーンリアクション（PCR； poly merase chain reaction ) により、前記工程（III)で得られた DNA鎖を増幅する。すなわち、アダプター付加 cDNAの両端のアダプター DNAに共通する塩基配列を、 PCRのプライマーの塩基配列とすることにより、全てのァダプ夕一付加 cDNAを同じ効率で増幅することができ、その結果、 mRNA群の存在比率を保持しながら増幅させることができる。本発明の核酸の増幅方法により得られた c D N Aライブラリ一は、全て同一のプライマーで増幅されたものであり、試料中の mRNA群の存在比率が変化することなく保持されているという優れた性質を有する。また、本発明の核酸の増幅方法によれば、該 cDNAライブラリーが RNAポリメラーゼのプロモーター配列を有する場合には、該プロモーター配列を認識する RNAポリメラ一ゼと反応させることにより、試料中の mRNA群の存在比率が変化することなく保持され '、ている c RN Aライブラリーも調製することができるという優れた効果を発揮する。

なお、本発明の mRNA群の存在比率を保持した核酸の増幅方法、または該方法を用いた c DNAライブラリーまたは c RNAライブラリ一の調製方法を紙面またはインターネットのような電子媒体上で示す行為は、本発明のキットに添付している指示書と同様に本発明の方法の利用に含まれる。

(2)本発明の cDN Aライブラリーまたは CRN Aライブラリー

前記核酸の増幅方法により得られた cDNAライブラリ一または cRNAライブラリーは、試料中の mRNA群の存在比率を保持しているため、遺伝子発現検出用ライブラリ一として好適に使用できる。また、本発明の cDNAライブラリ一または c RNAライブラリ一を調製する際に、標識されたデォキシヌクレオチドあるいは、リボヌクレオチドを使用すれば、標識化 cDNAライブラリーまたは標識化 cRNAライブラリーが調製できる。従って、このような標識化 cDN Aライブラリーまたは標識化 c RNAライブラリーも本発明の cDNAライブラリーまたは c RN Aライブラリーに含まれる。本発明の c DN Aライブラリーまたは cRNAライブラリ一は、通常のサザンハイブリダィゼ一シヨン法、ドットハイブリダィゼーシヨン法、ノーザンハイブリダィゼーシヨン法、及びメンブレン等のマクロアレイあるいは DN Aマイクロアレイを用いたハイプリダイゼーション法において好適に使用できる。

(3)本発明の方法に使用されうる、核酸増幅用キット

本発明の核酸増幅用キットとしては、具体的には、前記核酸の増幅方法を行なレ、、 c DNAライブラリーまたは c RN Aライブラリ一を調製するためのキットであって、下記増幅用試薬：

逆転写酵素、逆転写反応用試薬、 D NAリガーゼ、 DNAポリメラ一ゼ、逆転写反応で得られた 2本鏆 DNAの末端に付加される少なくとも 1つのアダプタ一 D NA、 P C R用試薬および該アダプター DNAに内在する配列を含有したオリゴヌクレオチドプライマー

を含有し、かつ前記増幅用試薬を用いて前記核酸の増幅方法を行なう手順が指示された指示書を含有したキットなどが挙げられる。

本発明の核酸増幅用キットを使うことにより、より簡便に効率よく試料中の m RN A群の存在比率を保持した c DNAライブラリーまたは c RNAライブラリ一を調製することができる。このようなキットとしては、 c DNAあるいは c R NAの合成を伴う反応に用いられるキットであればよく、試験管内での c DNA あるいは c RNA合成反応を行うためのキットが挙げられる。

本発明の核酸増幅用キットにおいては、逆転写酵素、逆転写用試薬、 D NAリガーゼ、 DNAポリメラーゼ、逆転写反応で得られた 2本鎖 DNAの末端に付加される少なくとも 1つの任意のアダプター DNA、 P C R用試薬および該ァダブ夕一 DNAに内在する配列を含有したォリゴヌクレオチドプライマ一を含有することを 1つの特徴とする。

さらに、本発明の核酸増幅用キットにおいては、上記 2本鎖 DNAあるいは該アダプター DNAを制限酵素処理するための制限酵素、該酵素処理用試薬あるレ、はインビトロトランスクリプション用試薬、例えば、 RNAポリメラ一ゼを含有してもよい。本発明の核酸増幅用キットに含まれる制限酵素は、複数であってもよい。即ち、本発明の試料中の mR NA群の存在比率を保持した c D NAライブラリーまたは c R N Aライブラリーを調製するための試薬（c DNAライブラリー調製用試薬または c RNAライブラリー調製用試薬という）の組み合わせを含んでいれば、本発明のキットに含まれる。本発明のキットには、包装材と該包装材中に封入された PCR用試薬からなる製造品であって、前記増幅用試薬などの、前記 cDNAライブラリー調製用試薬または c RNAライブラリ一調製用試薬を含有し、かつ該包装材に付されたラベルまたは包装材に添付された指示書に、前記ライブラリー調製用試薬を用いて指示された手順で前記核酸の増幅方法を行なうことにより、試料中の m R N A群の存在比率を保持した cDNAライブラリ一または cRNAライブラリ一に使用できることが表示されてなる、 cDNAライブラリーまたは cRNAライブラリ一調製用試薬の製造品も含まれる。

上記の「指示書」とは、当該キットの使用方法、例えば上記ライブラリー調製用試薬の調製方法、推奨される反応条件等を記載した印刷物であり、パンフレツト又はリーフレット形式の取り扱い説明書の他、キットに添付されたラベル、キットが納められたパッケージ等に記載されたものを含む。さらに、インターネット、 FD、 CD— ROMのような電子媒体を通し、開示、提供された情報も含まれる。ライプラリー調製用試薬の調製に関して、前述の各逆転写酵素、アダプタ — DNA、制限酵素、 DNAリガ一ゼ、 DNAポリメラーゼ、あるいは RNAポリメラーゼのそれぞれの使用条件を指示した指示書が添付されたキットあるいはインタ一ネットのような電子媒体を通して、本発明の方法が開示、提供されているキットも本発明のキットに包含される。本発明の核酸の増幅方法により、試料中の m R N A群の存在比率を保持した c DNAライブラリーまたは c RN Aライブラリーを大量に合成することができる。また、本発明の核酸の増幅方法を使用することにより、微量の铸型であっても効率良く試料中の m R N A群の存在比率を保持した c D N Aライブラリーまたは c RNAライブラリ一を大量に合成することができる。本発明の核酸の増幅方法により調製された c DNAライブラリーまたは c RN Aライブラリ一は、通常のサザンハイブリダイゼーション法、ドットハイブリダイゼーション法、ノ一ザンハイブリダイゼーション法、及びメンブレン等のマクロアレイあるいは DN Aマイクロアレイを用いたハイブリダイゼ一ション法において好適に使用できる。以下の実施例により、さらに詳細に本発明を説明するが、本発明は実施例の範囲に限定されるものではない。実施例 1

( 1 ) プライマーの合成

配列表の配列番号： 1〜42のオリゴヌクレオチドを DN Aシンセサイザ一 3 94型（AB I社製）を用いて合成した。

(2) cDNAの合成

胃がんの 1種であるスキルスのセルライン（HSC39、 HSC43— 1、 H SC44— 1、 HSC 58— 1、 HSC59— 1、 HSC 60— 1、 OCUM2 M— 1、 KATO I I I) から、全 RNAを抽出した。得られたそれぞれの全 RNAを、各 1 zgづっ混合し、合計 8 / gのスキルスセルラインミックスを得た。なお、 KATO I I Iは、大日本製薬社製であり、その他のセルラインは、国立がんセンター研究所から供与されたセルラインである。

上記スキルスセルラインミックスから 1 gを分取し、 RNa s eフリ一滅菌水で 1 0 1にフィルアップ（f i 1 1 up) した。次に、得られた溶液を 6 5でで1 0分間インキュベートした後、急冷し、配列表の配列番号： 1に記載の T7-DT24プライマ一 1 00 pmo 1を加えた。得られた混合物と、 cDNA Synthesis Kit (ベ一リンガーマンハイム社製）とを用いて 2本鎖 c DNAを合成した。その後、産物を、フエノール抽出、クロ口ホルム抽出し、イソプロパノールを加えて遠心分離した。ペレットを 70%エタノールでリンスした後、乾燥させ、 1 1 1の TE緩衝液で溶解し、 2本鎖 cDNA溶液を得た。 ( 3 ) 制限酵素処理

上記（1)で調製した 2本鎖 cDN A溶液を 2 1ずつ分注し、それぞれの溶液に 1 0Uの制限酵素 Sma I、 Nru I、 Pvu I I、 Ec oRV、 Se a l (いずれも宝酒造社製）、各制限酵素用 1 0 X反応緩衝液 2 / 1、及び滅菌水を加えて、全量を 20 1とした。得られた混合物を 37°Cで 30分間インキュべートした。反応終了後、各反応液に 80 1の TE緩衝液を加えてフエノール抽出し、すべての反応液を 1本に混合し、クロ口ホルム抽出し、 5種制限酵素消化 cDNA混合物を得た。

(4) アダプタ一 DNAライゲ一シヨン

上記（3) で調製した 5種制限酵素消化 cDNA混合物（5 enzyme-digested cDNAs mix ) に、 50pmo lの Ec oR I— No t l—BamH I アダプタ ― (宝酒造社製）、 35011の丁4 DNA リガ—ゼ（宝酒造社製）、 1 Om M ATP 1 1、 1 0 Xライゲ一シヨン用緩衝液 2 1及び滅菌水を加え、 20 u 1にした。得られた混合物を、 14 °Cで一晩インキュベーションした。次に、得られた溶液にエタノールを加えて遠心分離した。ペレツトを 70%ェタノールでリンスし、乾燥後、 1 0 1の TE緩衝液で溶解し、アダプタ一付加 cD NA溶液を得た。

(5) PCRZT7 cDNAライブラリーの調製

アダプター付加 cDNA溶液 1 1に、配列表の配列番号： 2に記載の ER 1 プライマ一 1 00pmo l、 2. 5mM dNTPミックス 1 0 / 1、 5 U の夕カラタック DNAポリメラーゼ（宝酒造社製）、 1 0XPCR用緩衝液 1 0 1及び滅菌水を加え、液量を 1 00 1にした。該反応液の入った反応チューブを TaKaRa PCR The rma l Cyc l e r MP (宝

2 o 酒造社製）にセットし、以下の反応条件で PC Rを行なつに (：

9 5で、 5分保持、

9 5°C、 1分一 72で、 3分を 1サイクルとした 30サイクル反応、

72で、 1 0分保持

反応終了後の反応液から 5 / 1をァガロース電気泳動に供し、増幅産物の確認を行なった。これにより、本発明の cDNAライブラリー溶液（PCRZT7 cDNAライブラリ一）を得た。 PCRZT7 c DNAライブラリ一の収量を測定したところ、であった。

(6) インビトロトランスクリプションによる R I標識

上記（5) で得られた PCR/T7 cDNAライブラリ一溶液（0. 5 / g 相当および 0. 05 g相当）のそれぞれに、 20Uの RNa s eインヒビター

(宝酒造社製）と、 0. 2M DTT 1 / 1 と、各 2 OmMの ATP、 CTP および GTPを 1. 5 / 1 と、 0. ImM UTP 0. 5 1 と、一³² P UTP (アマシャム社製、 5〃 1 ) と T7 RNAポリメラ一ゼ（宝酒造社製）

80 Uとを加え、全量を 20 tz 1にした。

得られた混合物を、 37 °Cで 4時間インキュベートした後、 50UORNa s eフリー DNa s e (宝酒造社製）を加えて、 37 °Cで 1 0分間インキュベートして、反応液を得た。クロマスピン 200 (クロンテック社製）を用いて、前記反応液をゲルろ過し、 300 1づっ分画し、フラクション 1およびフラクシヨン 2を得た。

前記（5) で得られた PCRZT7 cDNAライブラリ一溶液（0. 0 g相当）から得られた標識サンプルの各フラクション 1 Z 1のシンチレ一シヨンを測定した。ついで、前記（5) で得られた PCR/T7 c DNAライブラリ —溶液 0. 05 /g相当と 0. 5〃g相当の両サンプルのフラクション 1とフラクシヨン 2について 2%のァガロースゲルを用いた電気泳動にて、増幅サイズの確認を行なつた。

フラクション 1の 250 / 1を、最終濃度が 4 xS SC、 0. 08%SDS、 40%ホルムアミド、 2 Xデンハート溶液、 1 0 %デキストラン、サケ精子 DN A 1. 6mgとなるようにハイブリダィゼ一シヨン緩衝液〔組成： 5xSSC、 0. 1%SDS、 50%ホルムアミド、 2. 5 Xデンハート溶液、 12. 5 %デキストラン、 2mgサケ精子 DNA〕で希釈し、 PCRZT7 R Iプローブ溶液とした。なお、 1 xSSCの組成は、 0. 1 5M NaC l、 0. 0 1 5 M クェン酸ナトリウム、 pH7. 0である。

(7)ハイブリダィゼーシヨン用マクロメンブレン作製

ヒト由来の細胞から抽出 ·精製した mRNAおよび mRNAライブラリー（ォリジーン； OR I GENE社製）を铸型に、配列表の配列番号： 3〜26に記載のプライマーを用いて RT— PCR (逆転写一 PCR) 法により、 1 2種類の c DNA断片を増幅した。増幅された DN A断片の遺伝子遺伝子産物名及び使用プライマーについて表 1に示す。

表 1 遺伝子遺伝子産物名増幅用プライマ'

(配列番号）

RR1 3/4

CDC6 5/6

Cyclin E 7/8

Cyclin Dl 9/1 0 iS-actin 1 1/1 2

DNA Topoisomerase I 1 3/1 4

E2F-1 1 5/1 6

E2F-2 1 7/1 8

E2F-3 1 9/20 c- YC 2 1/22

HMGI/Y 23/24

HMGI-C 25/26

得られた増幅断片のそれぞれ 5 n g、 5 0 n g、 500 n g量について、アブライ時間を 0分、 1 5分又は 30分に変えて電気泳動した。電気泳動後のゲルより分離された核酸をナイロンメンブレンフィルターに転写した後、紫外線照射により、核酸をメンブランに固定化し、ハイブリダィゼ一シヨン用マクロメンブレンを得た。同様の方法で、ハイブリダィゼ一シヨン用マクロメンブレンをさらに 1枚得た。

(8) コントロール用 R Iプローブ作製

上記スキルスセルラインミックスから、オリゴテックス— dT30 くス一パー > mRNA Pu r i f i c a t i on K i t (宝酒造社製）を用いてポリ A+ RNAを精製した。得られたポリ A⁺ RNAのうち 0. 5 /gを取り、 RNa s eフリー滅菌水で 1 0 β 1にメスアップした。 6 5 °Cで 1 0分間ィンキュペート後、急冷し、配列表の配列番号： 1に記載の T7— DT24プライマ一 1 00 pmo 1を加えて、 cDNA Synthesis Kit (ベ一リンガーマンハイム社製）を用いて 2本鎖 cDNAを合成した。得られた産物を、フエノール抽出、クロロホルム抽出し、イソプロパノールを加えて遠心分離した。ペレットを 70% エタノールでリンスした後、乾燥させ、 5 1の TE緩衝液で溶解し、コント口ール用 T7 cDNA溶液（T7 cDNAライブラリー）を得た。

前記コントロール用 T7 cDNA溶液に、 20Uの RNa s eインヒビ夕一と、 0. 2M DTT 1 1と、各 2 OmMの ATP、 CTPおよび GTP 1. 5 « 1と、 0. I mM UTP 0. 5 / 1 と、 a— ³²P UTP ( 5 z 1 ：) と、 T7 RNAポリメラ一ゼ 80Uとを加え、全量を 20 μ.1 とした。得られた溶液を、 37 °Cで 4時間インキュベートし、さらに 50Uの RNa s eフリ一 DNa s eを加えて 37°Cで 1 0分間インキュベートして、反応液を得た。クロマスピン 200 (クロンテック社製）を用いて、前記反応液をゲルろ過し、 3 00 1づっ分画し、フラクション 1およびフラクション 2を得た。

上記フラクション 1の 25 0 / 1を、最終濃度が 4 xSSC、 0. 0 8%SD S、 4 0%ホルムアミド、 2 Xデンハート溶液、 1 0%デキストラン、サケ精子 DNA 1. 6 mgとなるように、ハイプリダイゼーシヨン緩衝液〔組成： 5 xS SC；、 0. 1 %SDS、 50%ホルムアミド、 2. 5 Xデンハート溶液、 1 2. 5%デキストラン、 2mgサケ精子 DNA〕で希釈し、コントロール用 T7 R Iプローブとした。上記 T7 R Iプローブと PCRZT7 R Iプローブとについて、 2%ァガロースゲル電気泳動により確認した。

(9) メンブレンハイブリダィゼ一シヨン

前記（7) で得られたハイプリダイゼーシヨン用マクロメンブレン 2枚に、それぞれ T7 R Iプローブ（ 1 31 01 200 c pm) と PCRZT7 R Iプローブ（ 14951 392. 5 c pm) を以下の条件でハイブリダィズ、洗浄した。

ハイブリダイゼ一ション条件：

ハイブリダィゼ一シヨン溶液〔最終濃度が、 4 XSSC、 0. 08%SDS、 40%ホルムアミド、 2 Xデンハート溶液、 1 0%デキストラン、サケ精子 DN A 1. 6mg) 10m 1中、 42 °C、ー晚ハイブリダィゼ一シヨンを行なった。その後、 0. l xSSC/0. 1 %SDSで 1 0分間室温にて 2回洗浄後、 0 . 1 xSSC/0. 1%SDSで 30分間、 68。Cにて 2回洗浄した。洗浄終了後、常法によりオートラジオグラムを得た。その結果、いずれの R I プローブを使用した場合でも同等のオートラジオグラムパターンになることを確認した。このことから、本方法が、 mRN A群の存在比率を変えずに増幅可能な方法であることが示唆された。実施例 2

(1) DN Aチップの調製

ヒト由来の細胞から抽出 ·精製した mRNAおよび mRNAライブラリ一（ォリジーン； OR I GENE社製）を铸型に、配列表の配列番号： 27〜42に記載のプライマ一を用いて、 RT—PCR (逆転写一 PCR)法により、 9種類の c DNA断片を増幅した。増幅された DNA断片の遺伝子 Z遺伝子産物名及び使用プライマーについて表 2に示す。表 2 遺伝子 Z遺伝子産物名増幅用プライマ- (配列番号）

Cytohesin-1 27/28 a-Catenin 29/30 TFR 3 1/32 CDC6 33/34 jS-Catenin 35/36 ifi-actin 37/38 KU AP P70 39/40 NDK B 4 1/42

増幅した c D N Aの塩基配列解析を行なつて、目的の断片であることを確認した。また、エタノール沈殿法により増幅断片を回収し、 1 0 OmM炭酸緩衝液（ PH9. 5) で 0. 5 ίΜとなるように溶解した。 DN Αチップ作製装置（Gene tic microsystems； GMS社製）を用いて、得られた溶解物をァミノ基導入スラィドガラス（シグマ社製）にスポッ卜し、紫外線照射により固定した。スライドを、順に 0. 2%SDS、蒸留水で洗浄乾燥して、 DN Aチップを得た。

(2) 標識化 cDNAライブラリーの調製

インビトロトランスクリプションキット（アンビオン社製）を用いて、実施例 1 (8) 記載のスキルスセルラインミックス由来の T 7 cDNAライブラリー 0. 5〃8と、実施例1 (5) 記載のスキルスセルラインミックス由来の PCRZT7 cDNAライブラリ一 0. 5〃 gから、それぞれ T 7 c R N Aライブラリ一および PCRZT7 c RNAライブラリ一を得た。

約 2 /gの上記 T 7 CRN Aライブラリーまたは PCRZT7 cRNAライブラリーと、ランダムへキサマー（6me r、 l O Opmo l) と、 T7 cRN Aライブラリーの場合は Cy 5— dUTPを含む dNTP、 PCR/T7 cR NAライブラリ一の場合は Cy 3— dUTPを含む dNTPと、逆転写酵素（ラィフサイエンス社製、 50U) を用いて cDN Aライブラリー合成を行なった。得られた産物を、ゲルろ過し、エタノール沈殿を行なった。得られた沈殿物を、最終濃度が 6 xSSC、 0. 2%SDS、 5 xデンハート溶液、 1. 5mgZm 1のヒト COT— 1 DNA (ライフテックオリエンタル社製）、 0. 8mg mlのポリ dA、 1 mg/m 1の酵母 t RNA及び 0. 1111£/1111のサケ0 N Aとなるようなハイブリダイゼーション溶液に溶解して蛍光標識 c D N Aライブラリー溶液〔それぞれ、 Cy 5—標識 cDNAライブラリー溶液および Cy 3 —標識 c DNAライブラリー溶液という〕を調製した。前記 Cy5—標識 cDN Aライブラリー溶液と Cy 3—標識 c DNAライブラリー溶液とを等量混合し、得られた混合物を熱変性させた。得られた混合物 1 0 1を DNAチップに滴下し、カバーガラスをかけて周囲をフィルムで密閉した。密閉後のチップを 65°C で 1 6時間インキュベートした後、カバーガラスを除いて、 2XSSCZ0. 2 %SDS中で 65°Cで 2分、次いで、 2XSSCZ0. 2%303中で55でで 30分を 2回、次いで 0. 05 xSSC中で 2分、洗浄し、風乾した。乾燥後のチップをマイクロスキャナ一（GMS社製）にかけて、各スポットの蛍光シグナルのシグナル強度を解析した。その結果を図 1に示す。図 1において横軸は、 T 7 蛍光標識 cDNAライブラリー使用時の蛍光シグナルのシグナル強度、縦軸は、 PCRZT7 蛍光標識 cDNAライブラリー使用時の蛍光シグナルのシグナル強度を示す。

図 1に示すように、すべてのスポットにおいて約 1. 5倍以下のシグナル比率であることが確認できた。即ち、本発明の核酸の増幅方法が、 mRNA群の存在比率を変えずに増幅可能であることが示唆された。実施例 3

(1) アダプター付加 cDNA溶液の調製

実施例 1 (1) で調製したスキルスセルラインミックス 1 Ongを実施例 1 ( 2) 記載の方法と同様にして 2本鎖 cDNA溶液を調製し、インビトロトランスクリプシヨンキット（アンビオン社製）を用いて、 T7 RNAポリメラーゼ反応により 1本鎖 cRNA (cDNAに相補的な配列を有する RNAを意味する）を合成した。

上記 1本鎖 cRNA、ランダムへキサマー及び cDNA シンセシスキット（ベ一リンガーマンハイム社製）を用いて 2本鎖 cDNAを合成した。得られた 2 本鎖 cDNAを、フエノールクロ口ホルム抽出、イソプロパノール沈殿により精製し、乾燥後 8 1の RNa s eフリー滅菌蒸留水に溶解した。次に、精製 2 本鎖 cDNAに、 l O Opmo lの Ec oR I— No t l— BamH Iアダプタ ― (宝酒造社製）と、 350 UOT4 DNAリガーゼ（宝酒造社製）と、 1 0 mM ATP 1〃 1と、 1 0 Xライゲージヨン用緩衝液 2 w 1と、滅菌水とを加え、 20 1とした。得られた溶液を、 1 6°Cで一晚インキュベーションし、アダプタ一付加 cDNA溶液を得た。

(2) PCR/T7 cDNAライブラリーの調製

アダプター DNAライゲ一シヨン溶液 1 1に、配列表の配列番号： 2に記載の ER 1プライマ一 300 pmo lと、 2. 5mM dNTPミックス 1 0 / 1と、 5Uの夕カラタック DNAポリメラ一ゼ（宝酒造社製）と、 1 0 XPCR用緩衝液 1 0 1と、滅菌水とを加え、液量を 1 00 1にした。得られた反応液の入った反応チューブを TaKaR a PCR The rma l Cyc l e r MP (宝酒造社製）にセットし、以下の反応条件で P C Rを行なつ Tこ o

95で、 5分保持、 95°C、 1分一 72°C、 3分を 1サイクルとした 30サイクル反応、

72で、 1 0分保持反応終了液から 5 u 1をァガロース電気泳動に供し、増幅産物の確認を行ない、 cDNAライブラリー溶液（T7ZPCR c DNAライブラリー）を得た。該 cDNAライブラリーの収量を測定したところ、 27 gであった。

前記インビトロトランスクリプションキツトを用いて、上記 T7ZPCR cDNAライブラリ一 0. 5 gおよび実施例 1 (8) 記載のスキルスセルラインミックス由来の T 7 cDNAライブラリー 0. 5 zgから、それぞれ丁ァ？じ尺丁ァ CRN Aライブラリーおよび T 7 cRN Aライブラリ一を得た。

約2 /8の上記丁7 ？〇1¾ 丁7 cRN Aライブラリーまたは T 7 cR N Aライブラリーと、ランダムへキサマー（ 1 O O pmo l ) と、 T7 cRNA ライブラリーの場合は Cy 5— dUTPを含む dNTPまたは T7ZPCRZT 7 cRNAライブラリーの場合は Cy 3— dUTPを含む dNTPと、逆転写酵素（ライフサイエンス社製、 5 0U) を用いて cDNAライブラリー合成を行なった。得られた産物を、ゲルろ過し、次いでエタノール沈殿した。得られた沈殿物を、最終濃度が 6 xSSC、 0. 2%SDS、 5 Xデンハート溶液、 1. 5 mgZm 1のヒト COT— 1 DNA、 0. 8mgZm lのポリ dA、 I mg/ m 1の酵母 t RNA及び 0. 1 mg/m 1のサケ精子 DNAとなるようなハイブリダイゼーション溶液に溶解して蛍光標識 cDNAライブラリ一溶液〔 C y 5— 標識 c DNAライブラリ一溶液と C y 3一標識 c DNAライブラリ一溶液〕を調製した。

前記 Cy 5—標識 c DNAライブラリ一溶液と Cy 3—標識 c DNAライブラリー溶液を等量混合し、得られた混合物を熱変性させた。得られた産物 1 0 1 をインテリジーンヒューマンキャンサーチップバ一ジョン 1 (宝酒造社製 ) に滴下し、カバーガラスをかけて周囲をフィルムで密閉した。密閉後のチップを 65°Cで 1 6時間保持した後、カバーガラスを除いて、 2XSSCZ0. 2% SDS中で 65。Cで 2分、次いで、 2XSSCZ0. 2 % S D S中で 55。Cで 3 0分を 2回、次いで 0. 05 xSSC中で 2分、洗浄し、風乾した。乾燥後のチップをマイクロスキャナー（ァフィメトリックス社製）にかけて各スポットの蛍光シグナルのシグナル強度を解析した。その結果を図 2に示す。図 2中 Aにおいて横軸は、 T7 蛍光標識 cDNAライブラリ一使用時の蛍光シグナルのシグナル強度、縦軸は、全 RNA 1 0 ngから調製した T7ZPCRZT7 蛍光標識 c DNAライブラリ一使用時の蛍光シグナルのシグナル強度を示す。さらに図 2中 Bにおいて横軸は、 T7 蛍光標識 cDNAライブラリー使用時の蛍光シグナルのシグナル強度、縦軸は、全 RNA 1 0 Ongから調製した T7ZPCR /T7 蛍光標識 cDNAライブラリー使用時の蛍光シグナルのシグナル強度を示す。

図 2に示すように、 70%のスポットにおいて 2倍以下のシグナル比率であることが確認できた。即ち、本発明の核酸の増幅方法が、 mRNA群の存在比率を変えずに増幅可能であることが示唆された。さらに上記と同じ方法で、 1 0 O n gの全 RNAから調製した c DNAライブラリーにおいても、 mRNA群の存在比率を変えずに増幅されていることが確認できた。実施例 4

(1) アダプター付加 cDNA溶液の調製

実施例 1 (1)で調製したスキルスセルラインミックス 1 ngを実施例 1 (2 ) 記載の方法と同様にして、 2本鎖 cDNA溶液を調製し、インビトロトランスクリプシヨンキット（アンビオン社製）を用いて、 T7 RNAポリメラーゼ反応により 1本鎖 cRNAを合成した。

上記 1本鎖 CRN Aと、ランダムへキサマー（60 Opmo 1) と cDNA シンセシスキット（ベ一リンガーマンハイム社製）とを用いて 2本鎖 cDNAを合成した。得られた cDNAを、フヱノール Zクロ口ホルム抽出、イソプロパノ —ル沈殿により精製し、乾燥させた。得られた産物を 8 1の RNa s eフリー滅菌蒸留水に溶解し、 2本鎖 cDNA溶液を得た。次に前記 2本鎖 cDNA溶液 8 iL 1を使用し、インビトロトランスクリプションキット（アンビオン社製 ) を用いて、 T7 RNAポリメラーゼ反応により 1本鎖 cRNAを合成した。得られた 1本鏆 cRNA全量を使用し、ランダムへキサマー（600 pmo 1) 及び cDNA シンセシスキット（ベ一リンガーマンハイム社製）を用いて 2本鎖 cDNAを合成した。得られた cDNAを、フエノール Zクロ口ホルム抽出、イソプロパノール沈殿により精製し、乾燥させた。得られた産物を 1 0 « 1の1¾ Na s eフリー滅菌蒸留水に溶解し、 cDNA溶液を得た。次に前記 cDNA溶液に、 1 O Opmo lの Ec oR I— No t I— BamH Iアダプター（宝酒造社製）と、 35011の丁4 DNAリガ一ゼ（宝酒造社製）と、 1 0mM AT P 1 1と、 1 Oxライゲ一シヨン用緩衝液 2 z 1と、滅菌水とを加え、 20 〃 1にした。得られた溶液を、 14 °Cで一晚インキュベーションし、アダプター付加 cDNA溶液を得た。

(2) T7/T7/PCR/T7 c DNAライブラリ一の調製

アダプター付加 cDNA溶液 1 Z 1に、配列表の配列番号： 2に記載の ER 1 プライマー 300 pmo lと、 2. 5 mM dNTPミックス 1 0 z 1と、 5 Uの夕カラタック DNAポリメラ一ゼ（宝酒造社製）と、 10XPCR用緩衝液 1 0 1と、滅菌水とを加え、液量を 1 00 1にした。得られた反応液の入った反応チューブを TaKaRa PCR The rma l Cyc l e r MP (宝酒造社製）にセットし、以下の反応条件で PC Rを行なった。

95 °C、 5分保持、

95°C、 1分一 72°C、 3分を 1サイクルとした 30サイクル反応、 72で、 1 0分保持

反応物のうち 5 / 1をァガロース電気泳動に供し、増幅産物の確認を行なった。これにより、 cDNAライブラリ一溶液（T7ZT7 PCR cDNAライブラリー）を得た。前記 T7ZT7ZPCR cDNAライブラリ一の収量を測定したところ、 27. であった。

インビトロトランスクリプションキットを用いて、上記 T7ZT7 PC R c DNAライブラリ一 0. および実施例 1 (8)記載のスキルスセルラインミックス由来の T 7 cDNAライブラリー 0. から、それぞれ丁ァ丁ァ？じ丁ァ CRN Aライブラリーおよび T 7 CRN Aラィブラリーを得た。

約2 /8の上記丁7/^/丁7 ？〇1¾/丁7 CRN Aライブラリーまたは T 7 CRN Aライブラリ一、ランダムへキサマー（l O O pmo l) と、 T7 cR N Aライブラリーの場合は Cy 5— dUTPを含む dNTPまたは T 7ZT7 PCR/T7 cRNAライブラリ一の場合は Cy 3— d UT Pを含む d NT P と、逆転写酵素（ライフサイエンス社製、 50U) とを用いて cDNA合成を行なった。得られた cDNAを、ゲルろ過、エタノール沈殿し、最終濃度が 6 XS SC、 0. 2%SDS、 5xデンハート溶液、 1. 5mgZm 1のヒト C o t I DNA、 0. 8mgZmlのボリ dA、 1 m g/m 1の酵母 t RN A、及び 0. 1 mg/m 1のサケ精子 DNAとなるようなハイプリダイゼ一シヨン溶液に溶解して蛍光標識 cDNAライブラリ一溶液を調製した。

前記 Cy 5—標識 c DNAライブラリー溶液と Cy 3—標識 c DNAライブラリー溶液とを等量混合し、得られた混合物を熱変性させた。得られた産物 1 0 z 1をインテリジーンヒューマンキャンサーチップバージョン 1 (宝酒造社製）に滴下し、カバ一ガラスをかけて周囲をフィルムで密閉した。密閉後のチップを 65°Cで 1 6時間保持した後、カバーガラスを除いて、チップを 2XSSC /0. 2%SDS中で 65°Cで 2分、次いで、 2XSSCZ0. 2%SDS中で 55。Cで 30分を 2回、次いで 0. 05 XSSC中で 2分、洗浄し、風乾した。風乾後のチップをマイクロスキャナー（ァフィメトリックス社製）にかけて各スボットの蛍光シグナルのシグナル強度を解析した。その結果、 l n gの全RNA から調製した cDNAライブラリーにおいても、 mRNA群の存在比率を変えずに増幅されていることが確認できた。配列表フリーテキスト

配列番号： 1は、 mRNAの一部を逆転写するためのオリゴヌクレオチドブライマ一の配列である。

配列番号： 2は、 ER 1と表示されるオリゴヌクレオチドプライマーの配列でめる。

配列番号： 3は、ヒト RR遺伝子の一部を増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマーの配列である。

配列番号： 4は、ヒト RR遺伝子の一部を増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマーである。

配列番号： 5は、ヒト CDC 6遺伝子の一部を増幅するためのオリゴヌグレオチドプライマ一の配列である。

配列番号： 6は、ヒト CDC 6遺伝子の一部を増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマ一の配列である。

配列番号： 7は、ヒトサイクリン E遺伝子の一部を増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマ一の配列である。

配列番号： 8は、ヒトサイクリン E遺伝子の一部を増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマ一の配列である。

配列番号： 9は、ヒトサイクリン D 1遺伝子の一部を増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマ一の配列である。

配列番号： 1 0は、ヒトサイクリン D 1遺伝子の一部を増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマ一の配列である。

配列番号： 1 1は、ヒト^ーァクチン遺伝子の一部を増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマ一の配列である。

配列番号： 1 2は、ヒト^ーアクチン遺伝子の一部を増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマ一の配列である。

配列番号： 1 3は、ヒト D NAトポイソメラ一ゼ 1遺伝子の一部を増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマ一の配列である。

配列番号： 1 4は、ヒト D NAトポイソメラ一ゼ 1遺伝子の一部を増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマ一の配列である。

配列番号： 1 5は、ヒト E 2 F— 1遺伝子の一部を増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマ一の配列である。

配列番号： 1 6は、ヒト E 2 F— 1遺伝子の一部を増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマ一の配列である。

配列番号： 1 7は、ヒト E 2 F— 1遺伝子の一部を増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマ一の配列である。

配列番号： 1 8は、ヒト E 2 F— 2遺伝子の一部を増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマ一の配列である。

配列番号： 1 9は、ヒト E 2 F— 3遺伝子の一部を増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマ一の配列である。

配列番号： 2 0は、ヒト E 2 F— 3遺伝子の一部を増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマ一の配列である。

配列番号： 2 1は、ヒト c _ m y c遺伝子の一部を増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマ一の配列である。

配列番号： 2 2は、ヒト c一 m y c遺伝子の一部を増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマ一の配列である。

配列番号： 2 3は、ヒト HM G I ZY遺伝子の一部を増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマ一の配列である。

配列番号： 2 4は、ヒト HMG I ZY遺伝子の一部を増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマ一の配列である。

配列番号： 2 5は、ヒト HMG I ZY遺伝子の一部を増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマ一の配列である。

配列番号： 2 6は、ヒト HMG I /Y遺伝子の一部を増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマ一の配列である。

配列番号： 2 7は、ヒトサイトへシン一 1遺伝子の一部を増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマ一の配列である。

配列番号： 2 8は、ヒトサイトへシン一 1遺伝子の一部を増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマ一の配列である。

配列番号： 2 9は、ヒトひ一力テニン遺伝子の一部を増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマ一の配列である。

配列番号： 3 0は、ヒト一力テニン遺伝子の一部を増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマ一の配列である。

配列番号： 3 1は、 T F R遺伝子の一部を増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマーの配列である。

配列番号： 3 2は、 T F R遺伝子の一部を増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマーの配列である。

配列番号： 3 3は、ヒト C D C 6遺伝子の一部を増幅するためのオリゴヌクレォチドプライマ一の配列である。

配列番号： 3 4は、ヒト C D C 6遺伝子の一部を増幅するためのオリゴヌクレォチドプライマ一の配列である。

配列番号： 3 5は、ヒト^ーカテニン遺伝子の一部を増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマ一の配列である。

配列番号： 3 6は、ヒト一力テニン遺伝子の一部を増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマ一の配列である。

配列番号： 37は、ヒト ;8—ァクチン遺伝子の一部を増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマ一の配列である。

配列番号： 3 8は、ヒト —ァクチン遺伝子の一部を増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマ一の配列である。

配列番号： 39は、ヒト KU AP P 70遺伝子の一部を増幅するためのォリゴヌクレオチドプライマ一の配列である。

配列番号： 40は、ヒト KU AP P 70遺伝子の一部を増幅するためのォリゴヌクレオチドプライマ一の配列である。

配列番号： 4 1は、ヒト NDK B遺伝子の一部を増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマ一の配列である。

配列番号： 42は、ヒト NDK B遺伝子の一部を増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマ一の配列である。産業上の利用可能性

本発明の方法によつて標本中の m R N Aをその m R N A群存在比率を保持しながら増幅することができ、 cDNAを大量に調製することができる。また、 RN Aポリメラーゼを用いたィンビトロトランスクリプションを組み合わせることにより、大量の cRNAを調製することができる。さらに本発明の方法を用いることにより、少量の铸型の場合でも DNAマイクロアレイあるいは、メンブレンマクロアレイを用いた遺伝子発現解析が可能となる。

Claims

請求の範囲

1. (I)第 1オリゴヌクレオチドプライマ一を用いて、試料中の mRN Aに相補的な 1本鎖 DNA (第一铸型）を作製する工程、

(III) 1本鎖もしくは 2本鎖のアダプター DNAを前記工程（II)で得られた 2 本鎖 DNAの末端に付加して、 DNA鎖を得る工程、及び

(IV) プライマーが、該アダプター DNA中に存在する核酸配列を有するオリゴヌクレオチドである第 2オリゴヌクレオチドプライマ一を用いて、前記工程（III ) で得られた DNA鎖を増幅させる工程

を含み、かつ試料中の mRN A群の存在比率を保持しながら当該 mRN A由来の塩基配列を有する核酸を増幅する、核酸の増幅方法。

2. 第 1オリゴヌクレオチドプライマーがオリゴ（dT)配列を含有するものである、請求項 1記載の核酸の増幅方法。

3. 第 1オリゴヌクレオチドプライマ一が mRNAに特異的な配列を含有するものである、請求項 1記載の核酸の増幅方法。

4. 第 1オリゴヌクレオチドプライマ一が RN Aポリメラーゼプロモータ一配列をさらに含有するものである、請求項 1〜 3いずれか記載の核酸の増幅方法。

5. 請求項 1記載の工程（II)が、ニックトランスレーション法により実施される、請求項 1〜 4いずれか記載の核酸の増幅方法。

6. 請求項 1記載の工程（II)が、ランダムプライマーエクステンション法により実施される、請求項 1〜 4いずれか記載の核酸の増幅方法。

7. 請求項 1記載の工程（II) と工程（III) との間に、

(ΙΓ)試料中の mRN A群の存在比率が保持される条件下で PC R増幅工程をさらに含む、請求項 1〜 6いずれか記載の核酸の増幅方法。

8. 請求項 1記載の工程（II) と工程（III) との間に、

(II") ェンドヌクレア一ゼにより 2本鎖 DNAを処理する工程

をさらに含む、請求項 1〜 7いずれか記載の核酸の増幅方法。

9. 請求項 8記載の工程（II") において、複数のエンドヌクレアーゼにより独立して 2本鎖 DNAを処理し、得られた 2本鎖 DNAを混合し、それにより得られた混合物を請求項 1記載の工程（III) における 2本鎖 DNAとして用いる、請求項 8記載の核酸の増幅方法。

10. エンドヌクレア一ゼが、制限酵素である、請求項 8または 9記載の核酸の増幅方法。

1 1. 請求項 1記載の工程（II) と工程（III) の間に、

を少なくとも 1回さらに含む、請求項 1〜 7いずれか記載の核酸の増幅方法。

12. 請求項 1 1記載の工程（ΙΓ'') における 1本鎖 RNAの合成が、 RNA ボリメラーゼにより行なわれる、請求項 1 1記載の核酸の増幅方法。

1 3. 請求項 1 1記載の工程（ΙΓ'') における逆転写反応が、 RNAポリメラーゼプロモータ一配列を含有するオリゴヌクレオチドプライマ一を用いて行なわれる、請求項 1 1又は 1 2記載の核酸の増幅方法。

14. 請求項 1 1記載の工程（ΙΓ'') が、ニックトランスレーション法により実施される、請求項 1 1〜1 3のいずれかに記載の核酸の増幅方法。

1 5. 請求項 1 1記載の工程（ΙΓ'') が、ランダムプライマ一ェクステンション法により実施される、請求項 1 1〜13のいずれかに記載の核酸の増幅方法。

1 6. 第 2オリゴヌクレオチドプライマーが、アダプタ一 DNAにストリンジェントな条件下にハイプリダイズしうるオリゴヌクレオチドである、請求項 1〜 1 5のいずれかに記載の核酸の増幅方法。

1 7. 請求項 1記載の（IV)工程が PC R法により行なわれる、請求項 1〜1 6いずれかに記載の核酸の増幅方法。

1 8. 請求項 1〜1 7のいずれかに記載の核酸の増幅方法で得られた cDNA ライブラリーまたは c RN Aライブラリ一。

1 9. 請求項 1〜1 7のいずれかに記載の核酸の増幅方法を行ない、 cDNA ライブラリーまたは cRN Aライブラリ一を調製するためのキットであって、下記増幅用試薬：逆転写酵素、逆転写反応用試薬、 DNAリガーゼ、 DNAポリメラーゼ、逆転写反応で得られた 2本鎖 DNAの末端に付加される少なくとも 1つのアダプタ一 D NA、 PCR用試薬および該アダプター DNAに内在する配列を含有したオリゴヌクレオチドプライマ一

を含有し、かつ前記増幅用試薬を用いて請求項 1〜1 7いずれか記載の核酸の増幅方法を行なう手順が指示された指示書を含有してなる、核酸増幅用キット。

20. 制限酵素および該制限酵素に対応する処理用試薬をさらに含有してなる、請求項 1 9記載の核酸増幅用キット。

2 1. インビトロトランスクリプション用試薬をさらに含有してなる、請求項 1 9または 20記載の核酸増幅用キット。