WO2001033224A1 - Particules composites et leurs conjugues avec des biomolecules - Google Patents

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WO2001033224A1
WO2001033224A1 PCT/FR2000/003086 FR0003086W WO0133224A1 WO 2001033224 A1 WO2001033224 A1 WO 2001033224A1 FR 0003086 W FR0003086 W FR 0003086W WO 0133224 A1 WO0133224 A1 WO 0133224A1
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WO
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monomers
chosen
phase
hydrophobic
azobιs
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Application number
PCT/FR2000/003086
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Inventor
Abdelhamid Elaissari
Eric Bosc
Bernard Mandrand
Jérôme Bibette
Olivier Mondain-Monval
Original Assignee
Bio Merieux
Centre National De La Recherche Scientifique
Pichot, Christian
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Definitions

  • the present invention relates to composite particles, their preparation process and their uses.
  • Polymer type microspheres are of interest as a support, vector or vehicle in the fields of biological engineering, diagnostics and pharmacy. To this end, they have been used in medical diagnosis as a solid support for biological molecules.
  • Colloidal particles have several advantages over traditional solid supports, such as tubes, plates, beads, in particular because they allow a large surface area for specific interactions and because they are easily chemically modifiable to introduce their surface of functional groups capable of reacting with other molecules, for example biological molecules such as antibodies or fragments of antibodies, proteins, polypeptides, polynucleotides, nucleic acids, fragments of nucleic acids, enzymes or chemical molecules such as catalysts, drugs, cage molecules, chelators.
  • magnetic latexes have aroused great interest in the analytical field and are used for example as a means for separating and / or detecting analytes, such as antigens, antibodies, biochemical molecules, nucleic acids and the like. .
  • Composite particles of polymer / magnetic type are usually classified into three categories on a size criterion: small particles with a diameter less than 50 nm, large particles with a diameter greater than 2 ⁇ m and intermediate particles with a diameter included between 50 and 1000 nm. But in order for them to be considered as good candidates, in particular for a diagnostic application, they must meet certain criteria. From a morphological point of view, it is preferable that they are relatively sphe ⁇ ques and that the magnetic charge is distributed relatively homogeneously in the polymer matrix. They must not aggregate irreversibly under the action of a magnetic field, which means that they can be redispersed easily, quickly and reversibly. Likewise, they must have a relatively low density to reduce the sedimentation phenomenon. Advantageously, they must have a narrow particle size distribution. We are also talking about monodisperse or isodisperse particles
  • Patent application EP 0 390 634 d writes magnetizable composite microspheres of hydrophobic crosslinked vinylaromatic polymer with a diameter of the order of 50 to 10 000 nm and comprising a solid core made up of magnetizable particles and a shell made up of a hydrophobic copolymer derived from at least one hydrophobic vinylaromatic monomer and from at least one polyethylenically unsaturated emulsifying polymer soluble in the vinylaromatic monomer (s) and capable of crosslinking with the monomer (s).
  • the particles are not homogeneous in size. It is therefore a set of polydisperse particles which must be sorted by application of a magnetic field to retain only the particles of expected size.
  • Dynal particles are microspheres consisting of a porous core of polystyrene and iron oxides, the iron oxides having been deposited by impregnation at the level of the pores available on the surface of the polystyrene, and of an envelope of another polymer which encapsulates iron oxides in porous microspheres. They have a diameter of 2.8 ⁇ m (M280 particles) and 4.5 ⁇ m (M450 particles) respectively and are relatively uniform in size. They are therefore considered to be isodispersed particles, but because of their large size have the aforementioned drawbacks. , mainly the phenomenon of sed imentation. In addition, their specific surface is low.
  • the composite particles of the invention include a hydrophobic polymer and inorganic nanoparticles and are characterized in that they have a diameter of the order of about 50 to 1000 nm, preferably about 1 00 to 500 nm, and advantageously about 1 00 to 250 nm, in that the hydrophobic polymer constitutes a polymer matrix and in that the inorganic nanoparticles are stabilized and distributed in a relatively homogeneous manner inside said matrix.
  • the composite particles of the invention have a diameter of 1 00 to 250 nm more or less approximately 5%, which means that their mean diameter by volume is defined to within approximately 5%.
  • the inorganic materials constituting the nanoparticles are chosen from metal oxides, such as iron, titanium, chromium, cobalt, zinc, copper, manganese, nickel oxides and in particular from magnetizable metal oxides, such than iron oxides; magnetite, hematite, ferrites such as manganese, nickel, manganese-zinc ferrites; cobalt, nickel alloys.
  • metal oxides such as iron, titanium, chromium, cobalt, zinc, copper, manganese, nickel oxides and in particular from magnetizable metal oxides, such than iron oxides; magnetite, hematite, ferrites such as manganese, nickel, manganese-zinc ferrites; cobalt, nickel alloys.
  • the inorganic materials are chosen from magnetizable metal oxides, preferably iron oxides.
  • the inorganic nanoparticles represent 5 to 95%, preferably 10 to 90% and advantageously 20 to 90% by mass relative to the total mass of the composite particle, preferably 25 to 85%.
  • the functional surfactants are in particular chosen from fatty acids or derivatives of fatty acids, in particular oleic acid or its derivatives, and a mixture of surfactants as defined above.
  • the suitable polymers of the matrix are the polymers of vinyl aromatic hydrophobic type, that is to say the homopolymers of water-insoluble vinylaromatic monomers, such as styrene, methylstyrene, ethylstyrene, tert-butylstyene, vinyltoluene, as well as the copolymers of these monomers with one another and / or with other co-monomers, such as acrylates and the alkyl methacrylates in which the alkyl group comprises from 3 to 10 carbon atoms, the esters of ethylenic acids having 4 or 5 carbon atoms and of alkyl having 1 to 8 carbon atoms, the methacrylic acids, styrenic derivatives, diene compounds
  • the polymer is a crosslinked polymer This is obtained by adding to the monomer (s) a small amount (less than 10% by weight) of molecules having at least two reactive double bonds, such as divinyl benzene
  • the composite nanoparticles of the invention can also include a marker, such as a fluorescent, luminescent or radioactive marker, it being understood that the marker is introduced during the preparation of the emusion as described in Examples 1 and 2 which follow .
  • a marker such as a fluorescent, luminescent or radioactive marker
  • the present invention also relates to a process for the preparation of the above-mentioned composite particles which makes it possible to directly obtain particles of desired diameter and isodispersed without requiring a step of sorting according to the diameter
  • a stable and isodisperse starting emulsion consisting of two immiscible phases, a hydrophobic phase A consisting of droplets containing inorganic nanoparticles dispersed in an organic phase containing a surfactant. active, said phase A being dispersed in a hydrophilic phase B;
  • hydrophobic monomers which penetrate inside phase A are introduced into the hydrophilic phase B;
  • said hydrophobic momomers are polymerized inside phase A by presence of an initiating agent chosen from organosoluble, insoluble or poorly soluble initiators in hydrophilic phase B and water-soluble initiators under predetermined conditions.
  • the monomers used must form hydrophobic polymers. They are insoluble in the hydrophilic phase and chosen from vinylaromatic monomers such as styrene, methylstyrene, ethylstyrene, tert-butyl-styrene, amino-methylstyrene, vinyltoluene. They are used alone or as a mixture or alternatively as a mixture with other water-insoluble polymerizable monomers such as acrylates, alkyl methacrylates, esters of ethylenic and alkyl acids, methacrylic acids, styrenic derivatives, ethylenic acids, diene compounds.
  • vinylaromatic monomers such as styrene, methylstyrene, ethylstyrene, tert-butyl-styrene, amino-methylstyrene, vinyltoluene. They are used alone or as a mixture or alternatively as
  • hydrophobic crosslinking agent for example a crosslinking monomer of divinylbenzene, dimethacrylate type, in particular vinyl dimethacrylate.
  • the organosoluble initiator is chosen from initiators of the azobis type, such as 2,2'-azob ⁇ s (2,4-d ⁇ méthyl valéronit ⁇ le), 2,2'- azob ⁇ s (4-methoxy-2,4-d ⁇ méthylvaléron ⁇ t ⁇ le), 2 , 2'-azob ⁇ s (2- cyclopropylpropionit ⁇ le), 2, 2'-azob ⁇ s (2-methylprop ⁇ on ⁇ tr ⁇ le), 2, 2'-azob ⁇ s (2- methylbutyronit ⁇ le), 1, 1 '-azob ⁇ s (cyclohexane-l-carbon ⁇ tr ⁇ le), 1 - ((1-cyano- 1-methylethyl) azo) formamide, 2-phenylazo-4-methoxy-2,4-d ⁇ méthyl- valéronit ⁇ le, dimethyl 2, 2'-azob ⁇ s (2-methyl!
  • a water-soluble or slightly water-soluble initiator such as peroxides, hydroperoxides and persulfates, it generates a beginning of polymerization in the hydrophilic phase which propagates in the hydrophobic phase.
  • Persulfates in particular ammonium persulfate, sodium persulfate and potassium persulfate are soluble in the aqueous phase. heat they decompose and generate sulfate radical anions which will help charge the composite nanosphere.
  • Hydrogen peroxide is soluble in the aqueous phase and generates uncharged hydroxyl radicals.
  • the decomposition of hydroperoxides generates a hydroxyl and an oxygen radical which will share in one of the phases depending on the nature of the peroxide used.
  • cumene peroxide in the case of the polymerization of styrene, is supposed to decompose at the interface between the monomer particles and water, the hydroxyl radicals enter the aqueous phase and the non-polar radicals diffuse towards the particle.
  • the cationic or anionic nature of the initiator will depend on the cationic or anionic nature of the particle and of the conjugate resulting from the invention.
  • the initiator is introduced into the hydrophilic phase and enters the hydrophobic phase (a) either simultaneously with the introduction of the hydrophobic monomers, (b) or prior to the step of introducing the hydrophobic monomers, (c) or after the step of introducing said hydrophobic monomers.
  • step (iii) of polymerization is carried out by raising the temperature to approximately 60 to 90 ° C., in particular to a temperature of 70 ° C. in the presence of the polymerization initiator, being it is understood that the conditions of the polymerization will be determined by a person skilled in the art depending on the nature of the initiator retained, or by photochemistry using radiation, for example ultra violet radiation or a laser beam or d other sources of energy.
  • the organic phase is a phase comprising an aliphatic or cyclic hydrocarbon chosen from compounds comprising from 5 to 1 2 carbon atoms, their isomers and their mixtures or a phase comprising all or part of an organic compound polymerizable by the radical route.
  • the hydrocarbon is chosen from pentane, hexane, heptane, octane, nonane, decane, undecane and dodecane
  • the organic radical polymerizable compound is chosen from vinyl aromatic monomers insoluble in water, such as styrene, methylstyrene , ethylstyrene, tert-butyl-styrene, vinyltoluene, as well as the copolymers of these monomers with one another, it being understood that it is within the reach of the skilled person to adapt the polymerization conditions according to the choice of or of the hydrocarbon (s) retained and of the nature of the initiator chosen In particular, if the polymerization is carried out by raising the temperature or causing a rise in temperature, the reaction assembly must be adapted to volatile solvents, such that pentane
  • the hydrophilic phase is an aqueous phase, such as water.
  • the particles are functionalized by introduction into phase B and penetration into phase A of functional reactive groups
  • the functional reactive groups are provided for example by weakly hydrophilic monomers capable of polymerizing with the hydrophobic monomers of the polymer matrix
  • the functional reactive groups are provided by hydrophilic monomers chosen from the monomers of acrylic, methacrylic, ethylenic and sulfonic acids, alone or as a mixture, or alternatively as a mixture with hydrophobic monomers; it being understood that it is within the capacity of a person skilled in the art to determine the composition of the mixture.
  • the functional groups allow the subsequent reactions but also provide the colloidal stabilization necessary for the subsequent applications
  • the functional groups are introduced into phase B and penetrate inside phase A (a) either simultaneously with the penetration of hydrophobic monomers from step (n), (b) either prior to the penetration of the monomers hydrophobic of step (n), (c) either after the penetration of the hydrophobic monomers of step (n).
  • step (m) is followed by a step of partial or total evaporation of the organic phase A with formation of porous composite particles.
  • Another subject of the invention is functionalized composite particles which have reactive functional groups on their surface, such as carboxy, amino, thiol, hydroxyl or tosyl hydrazine groups which are capable of reacting with at least one gand.
  • the functionalized composite particles, non-porous or porous, thus formed will be likely to immobilize a gand, for example a biological molecule, such as an antibody, an antibody fragment, a protein, a polypeptide, an enzyme, a polynucleotide.
  • the present invention also relates to conjugates derived from composite particles coupled to at least one hgand as defined above and their uses
  • said conjugates are used in immunoassays for the detection and / or quantification of proteins, antigens, antibodies in a biological sample or in assays using probe technology for detection and / or the quantification of a nucleic acid fragment in a biological sample.
  • probes for the detection and / or quantification of a nucleic acid in a sample is well known to those skilled in the art and the sandwich hybridization technique may be mentioned by way of illustration.
  • conjugates of the invention can be used as “priming agents” for an amplification reaction of nucleic acids in a sample, for example by PCR (Polymerase Chain Reaction) or any other appropriate amplification technique , thus allowing the detection and / or quantification of nucleic acids in the biological sample.
  • PCR Polymerase Chain Reaction
  • the present invention therefore also relates to a reagent and a diagnostic composition further comprising said conjugates and the use of said reagent in a diagnostic test.
  • Conjugates also find application in the therapeutic field as a vehicle or vector for a medicinal substance, d a defective gene repair agent, an agent capable of blocking the expression of a gene, such as an antisense probe in therapy or an agent capable of blocking the activity of a protein and this fact they can be used in a therapeutic or prophylactic composition
  • the conjugates of the invention are capable of carrying a drug substance in a therapeutic or prophylactic composition which comprises said conjugate in association with an appropriate and pharmaceutically acceptable adjuvant and / or diluent and / or excipient, said drug substance being capable to be released in vivo Definitions of pharmaceutically acceptable excipients and adjuvants are described for example in Remington's Pharmaceutical Sciences 16 th ed, Mack Pubhshing Co.
  • the conjugates of the invention are also capable of carrying a gene of therapeutic interest coding for at least a protein of interest or a fragment of a protein of interest, it being understood that by protein is meant both a protein in its most generally used definition and an antibody Of course, such a conjugate is incorporated in a therapeutic composition or prophylactic which also includes the elements necessary for the expression of said gene of therapeutic interest.
  • the conjugates of the invention can also be used, when incorporated into a therapeutic or prophylactic composition, for the in vivo transfer of nonsense probes or oligonucleotides.
  • Antisense is capable of specifically interfering with the synthesis of a target protein of interest, by inhibiting the formation and / or functioning of the polysome according to the positioning of the mRNA in the target. Therefore, the frequent choice of the sequence surrounding the translation initiation codon as a target for inhibition by an antisense oligonucleotide aims to prevent the formation of the initiation complex.
  • anti-sense oligonucleotides antisense are also complementary to DNA sequences and can therefore interfere at the level of transcription by the formation of a triple helix, the antisense oligonucleotide appearing by hydrogen bonds called Hoogsteen at the level of the large groove of the DNA double helix.
  • antisense oligonucleotides can be strictly complementary to the DNA or RNA target to which they must hybridize, but also not strictly complementary to the condition that they hybridize to the target. Likewise, they may be antisense oligonucleotides which are unmodified or modified at the level of inter-nucleotide bonds. All of these concepts are part of the general knowledge of those skilled in the art.
  • the present invention therefore relates to a therapeutic composition
  • a therapeutic composition comprising, inter alia, a vector conjugate of an antisense oligonucleotide as defined above
  • the conjugates are capable of forming complexes of the cage molecule / cryptate, chelating / chelated molecule type or of serving as a vehicle for catalysts in a chemical application.
  • the composite particles and the conjugates of the invention are obtained by in situ emulsion polymerization according to the protocol described in the examples which follow.
  • a stable, isodisperse starting emulsion was prepared according to either of the protocols described in this example.
  • the primary emulsion was prepared using an emulsification process by gradually incorporating, while shearing using a colloid mill (Ika: trade name), the dispersed phase, formed of 45% by weight of iron oxides in octane, in the continuous phase formed from sodium dodecyl sulfate at a concentration of 50% by weight in water until fractions comprising 80% are obtained. weight of organic ferrofluid.
  • the mixture thus defined was fragmented in a PG398 type quilt at a previously determined shear rate.
  • the primary emulsion thus prepared is a polydisperse emulsion characterized by a wide distribution of the diameter of the droplets which is then treated by successive magnetic sorts to obtain the starting emulsion isodisperse in size.
  • the primary emulsion was prepared using an emulsification process by rapidly adding the dispersed phase, formed of octane, of 73% by weight of iron oxides and of a surfactant. lipophilic active ingredient of monoglycerol or polyglycerol type of poly ⁇ soleate (1 to 10% by weight), with the continuous phase formed of surfactant of tergitol NP10 type (31% by weight) using a spatula. The mixture thus defined is then fragmented in a PG398 type quilt at a previously defined shear rate.
  • the primary emulsion thus prepared is an emulsion relatively isodisperse characterized by a small distribution of the droplet diameter which is then treated by successive magnetic sortings to obtain the starting emulsion isodisperse in size.
  • phase A consisting of droplets of 180 nm more or less 5 nm in diameter containing nanoparticles of 10 nm iron oxides in octane and a mixture of surfactants (sodium dodecyl sulfate (SDS) and oleic acid), dispersed in aqueous phase B (concentration 1%, at 0.8 times the critical micellar concentration (CMC) of the SDS) are placed in a polymerization reactor.
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • CMC critical micellar concentration
  • 2,2'-azob ⁇ s (2,4-d ⁇ méthyl valéronit ⁇ le), as initiator of the polymerization solubilized in hexane (215 ⁇ l at 20 g / l) is introduced into the emulsion.
  • the mixture is subjected to homogenization for one hour and 80 mg of styrene monomers are then introduced.
  • the styrene monomers diffuse inside phase A for two hours.
  • the polymerization is initiated by heating the solution to a temperature of 70 ° C and continued for 12 hours thirty minutes, with slow stirring. After completion of the polymerization, the composite particles obtained have a diameter of 188 nm and a polydispersity index of the order of 1.1.
  • phase A consisting of droplets of 206 nm more or less 5 nm in diameter containing 10 nm iron oxide nanoparticles in octane and a mixture of surfactants (SDS and acid oleic), dispersed in the aqueous phase B (3.3% concentration, 0.8 times the critical micelle concentration (CMC) of SDS) are placed in a polymerization reactor.
  • the emulsion is degassed for 9 hours with nitrogen.
  • 2, 2'-azob ⁇ s (2,4-d ⁇ méthyl valéronit ⁇ le), as initiator of the polymerization dissolved in heptane (21 5 ⁇ l at 20 g / l) is introduced into the emulsion. The mixture is subjected to homogenization for 30 minutes and 223 mg of styrene monomer are then introduced. Diffusion of the styrene monomer in phase A takes place for 9 hours. The polymerization is initiated by heating the solution to a temperature of 70 ° C and continued for 12 hours, with slow stirring. After completion of the polymerization, the composite particles obtained have a diameter of 238 nm plus or minus 10 nm.
  • Example 4 20 ml of the stable and isodisperse starting emulsion prepared according to the protocol of Example 1 (n), consisting of two immiscible phases: phase A consisting of droplets of 206 nm in diameter containing nanoparticles of iron oxides of 10 nm in octane and a mixture of SDS and oleic acid, dispersed in the aqueous phase B (concentration 3.3%, at 0.8 times the critical micelle concentration (CMC) of SDS ) are placed in a polymerization reactor. The emulsion is degassed for 14 hours with nitrogen.
  • phase A consisting of droplets of 206 nm in diameter containing nanoparticles of iron oxides of 10 nm in octane and a mixture of SDS and oleic acid, dispersed in the aqueous phase B (concentration 3.3%, at 0.8 times the critical micelle concentration (CMC) of SDS
  • CMC critical micelle concentration
  • phase A consisting of droplets of 206 nm in diameter containing iron oxide nanoparticles of 10 nm in octane and a mixture of SDS and oleic acid, dispersed in the aqueous phase B (concentration 3.3%, at 0.8 times the critical micellar concentration (CMC) of SDS) are placed in a polymerization reactor.
  • the emulsion is degassed for 14 hours with nitrogen. 240 mg of styrene monomers are added to the reaction mixture which then undergoes a homogenization step for 5 minutes.
  • phase A consisting of droplets of 206 nm more or less 5 nm in diameter containing nanoparticles iron oxides of 10 in octane and a mixture of SDS and oleic acid, dispersed in the aqueous phase B (concentration 3.3%, at 0.8 times the critical micelle concentration (CMC) of the SDS) are placed in a polymerization reactor.
  • the emulsion is degassed for 9 hours with nitrogen.
  • 2,2'-azob ⁇ s (2,4-d ⁇ méthyl valéronitrile), as initiator of the polymerization dissolved in heptane (21 5 ⁇ l at 20 g / l) is introduced into the mixture which is then homogenized for 30 minutes. 223 mg of styrene monomers are introduced into the reaction mixture and the styrene monomers are left to diffuse in phase A for 9 hours.
  • the polymerization is initiated by heating the solution to a temperature of 70 ° C and continued for 12 hours, with slow stirring. After completion of the polymerization, the composite particles obtained have a diameter of 206 nm plus or minus 5 nm.
  • Example 7 20 ml of the stable and isodisperse starting emulsion prepared as described in Example 1 (n), consisting of two immiscible phases: phase A consisting of droplets containing 206 nm more or less 5 nm in diameter iron oxide nanoparticles of 10 nm in octane and a mixture of SDS and oleic acid, dispersed in the aqueous phase B (concentration 3.3%, at 0.8 times the critical micellar concentration ( CMC) from SDS) are placed in a polymerization reactor. The emulsion is degassed for 14 hours with nitrogen.
  • phase A consisting of droplets containing 206 nm more or less 5 nm in diameter iron oxide nanoparticles of 10 nm in octane and a mixture of SDS and oleic acid, dispersed in the aqueous phase B (concentration 3.3%, at 0.8 times the critical micellar concentration ( CMC) from SDS
  • CMC critical micellar
  • phase A consisting of droplets of 206 nm more or less 5 nm in diameter containing 10 nm iron oxide nanoparticles, octane and a mixture of SDS and oleic acid, dispersed in aqueous phase B (concentration 3.3%, at 0.8 times the critical micellar concentration (CMC) of the SDS) are placed in a polymerization reactor.
  • the emulsion is degassed for 14 hours with nitrogen.
  • styrene monomers 240 mg are introduced and then the mixture is allowed to homogenize for 5 minutes Le (2,2'-azob ⁇ s (2,4-d ⁇ méthyl valéronitrile)) solubilized in heptane (215 ⁇ l at 20 g / l) is then added and the mixture undergoes homogenization for 10 minutes.
  • the styrene is left to diffuse in phase A for 9 hours.
  • the polymerization is then initiated by raising the temperature to 70 ° C. and followed for 12 hours, with slow stirring.
  • the composite particles obtained have a diameter of 206 nm more or less 5 nm. .
  • phase A consisting of droplets of 206 nm more or less 5 nm in diameter containing nanoparticles of 10 nm iron oxides in octane and SDS, dispersed in the aqueous phase B (concentration 3.3%, at 0.8 times the critical micellar concentration (CMC) of SDS) are placed in a reactor polymerization.
  • the emulsion is degassed for 14 hours with nitrogen. 200 mg of styrene monomers, then 22 mg of methacrylic acid are introduced into the reaction mixture. The mixture is subjected to homogenization for 5 minutes.
  • phase A consisting of droplets of 164 nm more or less 5 nm in diameter containing iron oxide nanoparticles of 10 nm in octane and SDS
  • phase B concentration 3.3%, at 0.8 times the critical micellar concentration (CMC) of SDS
  • CMC critical micellar concentration
  • Example 11 To 240 ⁇ l of a 3% magnetic latex, obtained as described previously in examples 9, are successively added, 60 ⁇ l of Tween 20 (1%), 636 ⁇ l of phosphate buffer (10 mM to pH 6, 9), 60 ⁇ l of N- (3-dimethylam ⁇ nopropyl) -N'-ethylcarbod ⁇ m ⁇ ded ⁇ hydrochlorure (25 mg / ml), 1 56 ⁇ l of N-hydroxysulfosuccinimide (25 mg / ml) and streptavidin (48 ⁇ l to 1 mg / ml).
  • the mixture is incubated for one hour at room temperature and the particles are then concentrated by application of a magnetic field, then redispersed in the buffer containing surfactant (10 mM phosphate, pH 6.9 + Tween 20 0.05 %). 9.9 ⁇ l of a 1 7-seas biotinylated oligonucleotide (ODN) having a mass of 5753 g / mole at a concentration of 338 nmol / ml) are added to 400 ⁇ l of particles covered with streptavidin previously synthesized to constitute the positive control .
  • ODN biotinylated oligonucleotide
  • the two controls are incubated for 30 minutes at room temperature, separated three times and redispersed the first time with a basic buffer (10 mM phosphate, pH 9.9 + SDS, 5 times the critical micellar concentration, the second time with a buffer at neutral pH (10 mM phosphate, pH 6.9 + 0.05% Tween 20) and the third time in 280 ⁇ l of PEG containing salmon sperm DNA.
  • a basic buffer 10 mM phosphate, pH 9.9 + SDS, 5 times the critical micellar concentration
  • the second time with a buffer at neutral pH (10 mM phosphate, pH 6.9 + 0.05% Tween 20
  • the third time in 280 ⁇ l of PEG containing salmon sperm DNA.
  • 20 ⁇ l of ODN complementary to the ODN of the positive control marked with horseradish peroxidase (17 seas, concentration 9 nmol / ml) are added.
  • the two controls are again incubated for one hour at room temperature and are further separated in order to be dispersed again in 400 ⁇ l of PEG containing salmon sperm DNA.
  • the positive control gives an optical density of 2,000 units of O.D, while the negative control gives a density of 1,000 units of O.D.
  • the size was measured by light scattering.
  • the fluctuation in the size observed, before and after polymerization is attributed to the combination of the following two phenomena: a) possible evaporation of part of the organic phase and b) conversion of the polymerization from one example to the other.
  • the level of iron oxide after polymerization is relatively of the same order of magnitude as in the emulsion used before the polymerization.

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Abstract

Particules composites comprenant un polymère hydrophobe et des nanoparticules inorganiques, lesdites particules présentant un diamètre de l'ordre d'environ 50 à 1000 nm, de préférence d'environ 100 à 500 nm et avantageusement d'environ 100 à 250 nm et comprenant le polymère hydrophobe qui constitue une matrice polymère et les nanoparticules inorganiques stabilisées et distribuées de manière relativement homogène à l'intérieur de ladite matrice ; conjugués dérivés desdites particules composites ; leur procédé de préparation et leurs utilisations.

Description

PARTICULES COMPOSITES ET LEURS CONJUGUES AVEC DES BIOMOLECULES
La présente invention a pour objet des particules composites, leur procédé de préparation et leurs utilisations. Les microsphères de type polymère présentent un intérêt comme support, vecteur ou véhicule dans les domaines de l'ingénierie biologique, du diagnostic et de la pharmacie. A cet effet, elles ont été utilisées dans le diagnostic médical comme support solide pour des molécules biologiques . Les particules colloïdales présentent plusieurs avantages par rapport aux supports solides traditionnels, tels que tubes, plaques, billes notamment parce qu'elles permettent de disposer d'une grande surface pour des interactions spécifiques et parce qu'elles sont facilement modifiables chimiquement pour introduire à leur surface des groupements fonctionnels susceptibles de réagir avec d 'autres molécules, par exemple des molécules biologiques telles que des anticorps ou des fragments d'anticorps, des protéines, des polypeptides, des polynucléotides, des acides nucléiques, des fragments d 'acides nucléiques, des enzymes ou des molécules chimiques telles que des catalyseurs, des médicaments, des molécules cages, des chélatants .
Parmi les particules colloïdales, les latex magnétiques ont suscité un grand intérêt dans le domaine analytique et sont utilisés par exemple comme moyen pour séparer et/ou détecter des analytes, tels que des antigènes, des anticorps, des molécules biochimiques, des acides nucléiques et autres.
Les particules composites de type polymère/magnétique sont habituellement classées en trois catégories sur un critère de taille: les petites particules ayant un diamètre inférieur à 50 nm, les grosses particules ayant un diamètre supérieur à 2 μm et les particules intermédiaires d'un diamètre compris entre 50 et 1 000 nm. Mais pour qu'elles puissent être considérées comme de bons candidats, en particulier pour une application diagnostique, elles doivent répondre à certains critères. D'un point de vue morphologique, il est préférable qu'elles soient relativement spheπques et que la charge magnétique soit répartie de façon relativement homogène dans la matrice polymère . Elles ne doivent pas s'agréger de manière irréversible sous l'action d' un champ magnétique, ce qui signifie qu'elles puissent être redispersées facilement, rapidement et de manière réversible. De même, elles doivent présenter une densité relativement faible pour réduire le phénomène de sédimentation Avantageusement, elles doivent présenter une distribution granulométπque étroite. On parle encore de particules monodisperses ou isodisperses
Ainsi, en raison de leur taille et de leur densité, les grosses particules magnétiques en suspension dans une phase liquide ont tendance à rapidement sédimenter. Par ailleurs, elles tendent à s'agréger après avoir été soumises à un champ magnétique car elles sont susceptibles d'avoir été de ce fait magnétisées de manière permanente (aimantation rémanente) . Elles ne constituent donc pas un bon candidat.
A contrario, les petites particules magnétiques ont tendance à rester en suspension du fait de leur mouvement Brownien et sont difficilement attirées, voire pas du tout, par un aimant, en particulier si le champ magnétique applique est relativement faible Elles ne sont donc pas bien appropriées pour les utilisations développées ci-dessus.
Il existe donc un intérêt évident à produire des particules composites de type polymère/magnétique, présentant une taille intermédiaire entre 50 et 1 000 nm, qui à la fois pallient les inconvénients précités et répondent aux critères établis ci-dessus. Mais l'invention n'est pas limitée à des particules composites magnétisables, comme décrit ci après. La demande de brevet EP 0 390 634 d écrit des microsphères composites magnétisables de polymère vinylaromatique réticulé hydrophobe d ' un diamètre de l'ord re de 50 à 1 0 000 nm et comprenant un coeur solide constitué de particules magnétisables et d ' une écorce constituée d ' un copolymère hydrophobe dérivé d 'au moins un monomère vinylaromatique hydrophobe et d 'au moins un polymère émulsifiant polyéthyléniquement insaturé soluble dans le ou les monomères vinylaromatiques et susceptible de réticuler avec le ou lesd its monomères . Toutefois, bien qu'elles puissent répondre à l'exigence de la taille, elles présentent l' inconvénient de ne pas avoir une répartition homogène de la charge magnétique qui est localisée à l' intérieur d u cœur. Par ailleurs, et comme cela ressort à l'évidence des figures annexées, les particules ne sont pas homogène en taille . I l s'agit donc d ' un ensemble de particules polydisperses qui devront être triées par application d ' un champ magnétique pour ne retenir que les particules de taille attend ue .
On peut également citer les particules Dynal (nom commercial) . Ces particules sont des microsphères constituées d ' un coeur poreux de polystyrène et d 'oxydes de fer, les oxydes de fer ayant été déposés par imprégnation au niveau des pores disponibles à la surface du polystyrène, et d ' une enveloppe en un autre polymère qui encapsule les oxydes de fer des microsphères poreuses . Elles présentent un d iamètre respectivement de 2, 8 μm (particules M280) et de 4, 5 μm (particules M450) et sont relativement uniformes en taille Elles sont donc considérées comme des particules isodisperses mais en raison de leur taille élevée présentent les inconvénients précités, principalement le phénomène de séd imentation . De plus, leur surface spécifique est faible .
Selon l' invention on dispose maintenant de nouvelles particules composites qui répondent aux critères précités .
Les particules composites de l' invention comprennent un polymère hydrophobe et des nanoparticules inorganiques et sont caractérisées en ce qu'elles présentent un diamètre de l 'ordre d 'environ 50 à 1 000 nm, de préférence d 'environ 1 00 à 500 nm, et avantageusement d'environ 1 00 à 250 nm, en ce que le polymère hydrophobe constitue une matrice polymère et en ce que les nanoparticules inorganiques sont stabilisées et d istribuées de manière relativement homogène à l' intérieur de ladite matrice. Avantageusement, les particules composites de l' invention présentent un d iamètre de 1 00 à 250 nm plus ou moins environ 5 %, ce qui signifie que leur diamètre moyen en volume est défini à plus ou moins environ 5 % près . Les matériaux inorganiques constituant les nanoparticules sont choisis parmi les oxydes métalliques, tels que les oxydes de fer, de titane, de chrome, de cobalt, de zinc , de cuivre, de manganèse, de nickel et en particulier parmi les oxydes métalliques magnétisables, tels que les oxydes de fer; la magnétite , l' hématite , les ferrites telles que les ferrites de manganèse, nickel, manganese-zinc ; les alliages de cobalt, nickel .
Avantageusement , les matériaux inorganiques sont choisis parmi les oxydes métalliques magnétisables, préferentiellement les oxydes de fer.
Les nanoparticules inorganiques représentent 5 à 95 %, de préférence 1 0 à 90% et avantageusement 20 à 90% en masse par rapport à la masse totale de la particule composite, de préférence 25 à 85 % .
Elles sont stabilisées par des agents de stabilisation choisis parmi les chaînes polymère amphiphiles, les agents tensio-actifs ioniques ou non ioniques, fonctionnels ou non fonctionnels, polymérisables ou non polymérisables . Les agents tensio-actifs fonctionnels sont en particulier choisis parmi les acides gras ou des dérivés d 'acides gras, en particulier l'acide oléique ou ses dérives, et un mélange d 'agents tensio-actifs tels que définis précédemment.
Les polymères appropriés de la matrice sont les polymères de type vinylaromatiques hyd rophobes, c'est à d ire les homopolymeres de monomères vinylaromatiques insolubles dans l'eau, tels que styrène, méthylstyrène, éthylstyrène, tertio-butyl-styi ene, vinyltoluène, ainsi que les copolymères de ces monomères entre eux et/ou avec d'autres co- monomères, tels que les acrylates et les methacrylates d 'alkyle dans lequels le groupement alkyle comprend de 3 a 1 0 atomes de carbone, les esters d'acides éthyléniques possédant 4 ou 5 atomes de carbone et d'alkyle possédant 1 à 8 atomes de carbone, les acides méthacry ques, les dérivés styréniques, les composés diéniques Préferentiellement, le polymère est un polymère réticulé Ceci est obtenu en ajoutant dans le ou les monomères une faible quantité (inférieure a 1 0% en poids) de molécules ayant au moins deux doubles liaisons reactives, telles que le divinyl benzène, le méthacrylate de vinyle, le cyanurate de trial ly le , le diacrylate de mono ou de polyéthylèneglycol.
Les nanoparticules composites de l'invention peuvent également inclure un marqueur, tel qu' un marqueur fluorescent, luminescent ou radioactif, étant entendu que le marqueur est introduit lors de la préparation de l'émusion telle que décrite dans les exemples 1 et 2 qui suivent.
La présente invention a également pour objet un procédé de préparation des particules composites précitées qui permet d'obtenir directement des particules de diamètre souhaité et isodisperses sans nécessiter d'étape de tri en fonction du diamètre
Selon le procédé de l'invention, (i) on dispose d'une émulsion de départ stable et isodisperse constituée de deux phases non miscibles, une phase A hydrophobe constituée de gouttelettes contenant des nanoparticules inorganiques dispersées dans une phase organique contenant un agent tensio-actif , ladite phase A étant dispersée dans une phase B hydrophile; (n) on introduit dans la phase hydrophile B des monomères hydrophobes qui pénètrent à l'intérieur de la phase A; (m) on polyméπse lesdits momomères hydrophobes à l'intérieur de la phase A en présence d'un agent amorceur choisi parmi les amorceurs organosolubles, insolubles ou faiblement solubles dans la phase hydrophile B et les amorceurs hydrosolubles dans des conditions prédéterminées.
Les monomères mis en œuvre doivent former des polymères hydrophobes. Ils sont insolubles dans la phase hydrophile et choisis parmi les monomères vinylaromatiques tels que styrène, méthylstyrène, éthylstyrène, tertio-butyl-styrène, amino-méthylstyrène, vinyltoluène. Ils sont utilisés seuls ou en mélange ou bien encore en mélange avec d'autres monomères polymérisables insolubles dans l'eau tels que les acrylates, les methacrylates d'alkyle, les esters d'acides ethyleniques et d'alkyle, les acides méthacry ques, les dérives styréniques, les acides ethyleniques, les composés diéniques.
Il est possible d'ajouter au monomère ou au mélange de monomères un agent de réticulation hydrophobe, par exemple un monomère reticulant de type divinylbenzene, diméthacrylate, en particulier diméthacrylate de vinyle.
L'amorceur organosoluble est choisi parmi les amorceurs de type azobis, tels que les 2,2'-azobιs(2,4-dιméthyl valéronitπle), 2,2'- azobιs(4-méthoxy-2,4-dιméthylvaléronιtπle), 2, 2'-azobιs(2- cyclopropylpropionitπle), 2, 2'-azobιs(2-méthylpropιonιtrιle), 2, 2'-azobιs(2- méthylbutyronitπle), 1, 1 '-azobιs(cyclohexane-l-carbonιtrιle), 1-((1-cyano- 1-méthyléthyl)azo)formamιde, 2-phénylazo-4-méthoxy-2,4-dιméthyl- valéronitπle, diméthyl 2, 2'-azobιs(2-méthy!propιonate, 4, 4'-azobιs(4-acιde cyanovaléπque) et 2, 2'-azobιs(2-(hydroxyméthyl)propιonιtrιle). Si on choisit un amorceur hydrosoluble ou faiblement hydrosoluble, tels que les peroxydes, les hydroperoxydes et les persulfates, il engendre un début de polymérisation dans la phase hydrophile qui se propage dans la phase hydrophobe. Les persulfates, en particulier le persulfate d'ammonium, le persulfate de sodium et le persulfate de potassium sont solubles en phase aqueuse. Sous l'action de la chaleur, ils se décomposent et génèrent des anions à radicaux sulfate qui contribueront à charger la nanosphère composite. Le peroxyde d'hydrogène est soluble en phase aqueuse et génère des radicaux hydroxyles non chargés. La décomposition des hydroperoxydes génère un hydroxyle et un radical oxygéné qui se partageront dans une des phases en fonction de la nature du peroxyde utilisé. Ainsi, le peroxyde de cumène, dans le cas de la polymérisation du styrène, est supposé se décomposer au niveau de l'interface entre la particules de monomères et l'eau, les radicaux hydroxyles entrent dans la phase aqueuse et les radicaux non polaires diffusent vers la particule. De la nature cationique ou anionique de l'amorceur dépendra le caractère cationique ou anionique de la particule et du conjugué résultant de l'invention.
L'amorceur est introduit dans la phase hydrophile et pénètre dans la phase hydrophobe (a) soit simultanément à l'introduction des monomères hydrophobes, (b) soit préalablement à l'étape d'introduction des monomères hydrophobes, (c) soit postérieurement à l'étape d'introduction desdits monomères hydrophobes .
Dans un mode de réalisation préféré l'étape (iii) de polymérisation est effectuée par élévation de la température jusqu'à environ 60 à 90° C, en particulier à une température de 70 ° C en présence de l'amorceur de polymérisation, étant entendu que les conditions de la polymérisation seront déterminées par l'homme du métier en fonction de la nature de l'amorceur retenu, ou par photochimie à l'aide de rayonnements, par exemple de rayonnements ultra violets ou d'un faisceau laser ou d'autres sources d'énergie.
La phase organique est une phase comprenant un hydrocarbure aliphatique ou cyclique choisi parmi les composés comprenant de 5 à 1 2 atomes de carbone, leurs isomères et leurs mélanges ou une phase comprenant tout ou partie d'un composé organique polyméπsable par voie radicalaire. De préférence, l'hydrocarbure est choisi parmi le pentane, l' hexane, l'heptane, l'octane , le nonane, le decane, le undécane et le dodécane, et le composé organique polyméπsable par voie rad icalaire est choisi parmi les monomères vinylaromatiques insolubles dans l'eau, tels que styrène, méthylstyrene , ethylstyrene, tertio-butyl-styrène, vinyltoluène, ainsi que les copolymeres de ces monomères entre eux, étant entendu qu 'il est à la portée de l' homme d u métier d ' adapter les cond itions de polymérisation en fonction d u choix d u ou des hyd rocarbure(s) retenu(s) et de la nature de l ' amorceur choisi En particulier, si la polymérisation est effectuée par élévation de la température ou engendre une élévation de température, le montage reactionnel devra être adapté aux solvants volatils, tels que le pentane
De manière préférentielle la phase hyd rophile est une phase aqueuse, telle que de l'eau .
Dans des modes de réalisation préférentiels de la présente invention, les particules sont fonctionnalisées par introd uction dans la phase B et pénétration dans la phase A de groupements réactifs fonctionnels Les groupements reactifs fonctionnels sont apportés par exemple par des monomères faiblement hyd rophiles susceptibles de polyméπser avec les monomères hyd rophobes de la matrice polymère En particulier, les groupements reactifs fonctionnels sont apportés par des monomères hydrophiles choisis parmi les monomères des acides acryliques, méthacryliques , ethyleniques et sulfoniques, seuls ou en mélange, ou encore en mélange avec des monomères hydrophobes ; étant entend u qu'il est à la portée de l ' homme d u métier de déterminer la composition d u mélange. Les groupements fonctionnels permettent les réactions ultérieures mais apportent également la stabilisation colloïdale nécessaire pour les applications ultérieures Les groupements fonctionnels sont introduits dans la phase B et pénètrent à l'intérieur de la phase A (a) soit de manière simultanée à la pénétration des monomères hydrophobes de l'étape (n) , (b) soit préalablement à la pénétration des monomères hydrophobes de l'étape (n ) , (c) soit postérieurement à la pénétration des monomères hydrophobes de l'étape (n) .
Dans un mode de réalisation particulier, et si souhaité, l'étape (m) est suivie d 'une étape d'évaporation partielle ou totale de la phase organique A avec formation de particules composites poreuses .
L' invention a aussi pour objet des particules composites fonctionnalisées qui présentent à leur surface des groupements fonctionnels réactifs, tels que des groupements carboxy que, aminé, thiol , hydroxyl , tosyl hydrazine, susceptibles de réag ir avec au moins un gand . Les particules composites fonctionnalisées, non poreuses ou poreuses, ainsi formées seront s usceptibles d ' immobiliser un gand, par exemple une molécule biologique, telle qu' un anticorps, un fragment d 'anticorps, une protéine, un polypeptide, une enzyme, un polynucléotide, une sonde, une amorce, un fragment d'acide nucléique ; des molécules chimiques, telles que des polymères chimiques, des substances médicamenteuses, des molécules cages, des agents chélatants, des catalyseurs , la biotine ; étant entend u que lorsque les particules composites sont dites « poreuses » , elles ont atteints un degré de porosité déterminé par évaporation totale ou partielle de la phase organique . Aussi, la présente invention a également pour objet des conjugués dérivés des particules composites couplés à au moins un hgand tel que défini ci-dessus et leurs utilisations
A titre d'exemple, lesdits conjugués sont utilisés dans des tests immunologiques pour la détection et/ou la quantification de protéines, d 'antigènes, d'anticorps dans un échantillon biologique ou dans des essais utilisant la technologie des sondes pour la détection et/ou la quantification d'un fragment d'acide nucléique dans un échantillon biologique. L'utilisation de sondes pour la détection et/ou la quantification d ' un acide nucléique dans un échantillon est bien connue de l' homme d u métier et on peut citer à titre d'illustration la technique d 'hybridation sandwich . De même, les conjugues de l'invention peuvent être utilises comme « agents porteurs d'amorces » pour une reaction d'amplification d'acides nucléiques dans un échantillon, par exemple par PCR (Polymerase Chain Reaction) ou toute autre technique d'amplification appropriée, permettant ainsi la détection et/ou la quantification d acides nucléiques dans l'échantillon biologique.
La présente invention a donc également pour objet un réactif et une composition diagnostiques comprenant en outre lesdits conjugués et l'utilisation dudit réactif dans un essai diagnostique Les conjugues trouvent également une application dans le domaine thérapeutique comme véhicule ou vecteur d'une substance médicamenteuse, d'un agent réparateur de gènes défectueux, d'un agent susceptible de bloquer l'expression d'un gène, tel qu'une sonde anti-sens en thérapie ou d'un agent susceptible de bloquer l'activité d'une protéine et de ce fait ils peuvent être utilises dans une composition thérapeutique ou prophylactique
Ainsi, les conjugues de l'invention sont susceptibles de véhiculer une substance médicamenteuse dans une composition thérapeutique ou prophylactique qui comprend ledit conjugué en association avec un adjuvant et/ou diluant et/ou excipient approprié et pharmaceutiquement acceptable, ladite substance med'camenteuse étant capable d'être relarguee in vivo Les définitions des excipients et adjuvants pharmaceutiquement acceptables sont décrits par exemple dans Remington's Pharmaceutical Sciences 16th ed , Mack Pubhshing Co. Les conjugues de I invention sont également susceptibles de véhiculer un gène d'intérêt thérapeutique codant pour au moins une protéine d'intérêt ou un fragment d'une protéine d'intérêt, étant entendu que par protéine on entend a la fois une protéine dans sa définition la plus généralement utilisée et un anticorps Bien entendu, un tel conjugué est incorporé dans une composition thérapeutique ou prophylactique qui comprend également les éléments nécessaires a l 'expression dudit gène d' intérêt thérapeutique .
Les conjugués de l' invention sont également utilisables, quand incorporés dans une composition thérapeutique ou prophylactique, pour le transfert in vivo de sondes ou oligonucléotides a nti-sens . Les anti-sens sont capables d ' interférer spécifiquement avec la synthèse d ' une protéine cible d 'intérêt, par inhibition de la formation et/ou d u fonctionnement du polysome selon le positionnement de l' ARNm dans la cible . Donc le choix fréquent de la séquence entourant le codon d ' initiation de la traduction comme cible pour une inhibition par un oligonucléotide anti-sens vise a prévenir la formation d u complexe d ' initiation D'autres mécanismes dans l'inhibition par des oligonucléotides anti-sens impliq uent une activation de la πbonucléase H qui digère les hybrides oligonucléotide anti-sens/ARNm ou une interférence au niveau de sites d 'epissage par des oligonucléotides anti-sens dont la cible est un site d ' epissage de l'ARNm Les oligonucléotides anti-sens sont également complémentaires de séquences ADN et peuvent donc interférer au niveau de la transcription par la formation d ' une triple hélice, l' oligonucléotide anti-sens s'appaπant par des liaisons hyd rogène dites de Hoogsteen au niveau d u grand sillon de la double hélice d 'ADN . Dans ce cas particulier, on parle plus précisément d'oligonucléotides antigènes I I est bien entend u que les oligonucléotides anti-sens peuvent être strictement complémentaires de la cible ADN ou ARN à laquelle ils doivent s' hybπder, mais aussi non strictement complémentaires à la condition qu'ils s' hybπdent à la cible . De même, il peut s'agir d'oligonucléotides anti-sens non modifiés ou modifiés au niveau des liaisons inter-nucleotid iques Toutes ces notions font partie des connaissances générales de l' homme de l'art
La présente invention concerne donc une composition thérapeutique comprenant, entre autres, un conj ugué vecteur d ' un oligonucléotide anti-sens tel que définis ci-dessus Enfin, les conjugués sont susceptibles de former des complexes du type molécule cage/cryptate, chélatant/molécule chélatée ou de servir de véhicule pour des catalyseurs dans une application chimique.
Les particules composites et les conjugués de l'invention sont obtenus par polymérisation en émulsion in situ selon le protocole décrit dans les exemples qui suivent.
Exemple 1 .
Une émulsion de départ stable et isodisperse a été préparée conformément à l'un ou l'autre des protocoles décrits dans cet exemple.
(i) L'émulsion primaire a été préparée à l'aide d'un procédé d'émuisification en incorporant progressivement, tout en cisaillant à l'aide d'un moulin colloïdal (Ika : nom commercial), la phase dispersée, formée de 45% en poids d'oxydes de fer dans de l'octane, à la phase continue formée de dodécyl sulfate de sodium à une concentration de 50% en poids dans l'eau jusqu'à l'obtention de fractions comprenant de 80% en poids de ferrofluide organique. Le mélange ainsi défini a été fragmenté dans une couette de type PG398 à un taux de cisaillement préalablement déterminé. L'émulsion primaire ainsi préparée est une émulsion polydisperse caractérisée par une distribution large du diamètre des gouttelettes qui est ensuite traitée par des tris magnétiques successifs pour l'obtention de l'émulsion de départ isodisperse en taille.
(u) L'émulsion primaire a été préparée à l'aide d'un procédé d'émuisification en ajoutant rapidement la phase dispersée, formée d'octane, de 73% en poids d'oxydes de fer et d'un agent tensio-actif lipophile de type monoglycérol ou polyglycérol de polyπsinoléate (1 à 10% en poids), à la phase continue formée de tensio-actif de type tergitol NP10 (31% en poids) grâce à une spatule. Le mélange ainsi défini est ensuite fragmenté dans une couette de type PG398 à un taux de cisaillement préalablement défini. L'émulsion primaire ainsi préparée est une émulsion relativement isodisperse caractérisée par une distribution faible du diamètre des gouttelettes qui est ensuite traitée par des tris magnétiques successifs pour l'obtention de l'émulsion de départ isodisperse en taille.
Exemple 2 :
20 ml de l'émulsion de départ stable et isodisperse préparée selon le protocole de l'exemple 1(ι) et constituée de deux phases non miscibles : la phase A constituée de gouttelettes de 180 nm plus ou moins 5 nm de diamètre contenant des nanoparticules d'oxydes de fer de 10 nm dans de l'octane et un mélange de tensio-actifs (dodecyl sulfate de sodium (SDS) et acide oléique), dispersée dans la phase aqueuse B (concentration 1%, à 0,8 fois la concentration micellaire critique (CMC) du SDS) sont placés dans un réacteur de polymérisation. L'émulsion est dégazée pendant 7 heures à l'azote. Du 2,2'-azobιs(2,4-dιméthyl valéronitπle), comme amorceur de la polymérisation, solubilisé dans l'hexane (215 μl à 20 g/l) est introduit dans l'émulsion. Le mélange est soumis à homogénéisation pendant une heure et 80 mg de monomères de styrène sont ensuite introduits. Les monomères de styrène diffusent à l'intérieur de la phase A pendant deux heures. La polymérisation est amorcée par chauffage de la solution à une température de 70°C et poursuivie pendant 12 heures trente minutes, sous agitation lente. Après achèvement de la polymérisation, les particules composites obtenues présentent un diamètre de 188 nm et un indice de polydispersité de l'ordre de 1,1.
Exemple 3 :
20 ml de l'émulsion de départ stable et isodisperse préparée selon le protocole décrit dans l'exemple 1 (u), constituée de deux phases non miscibles : la phase A constituée de gouttelettes de 206 nm plus ou moins 5 nm de diamètre contenant des nanoparticules d'oxydes de fer de 10 nm dans de l'octane et un mélange d'agents tensio-actifs (SDS et acide oléique), dispersée dans la phase aqueuse B (concentration 3, 3%, à 0,8 fois la concentration micellaire critique (CMC) du SDS) sont placés dans un réacteur de polymérisation. L'émulsion est dégazée pendant 9 heures à l'azote. Du 2, 2'-azobιs(2,4-d ιméthyl valéronitπle), comme amorceur de la polymérisation, solubilisé dans l'heptane (21 5 μl à 20 g/l) est introduit dans l'émulsion. Le mélange est soumis à homogénéisation pendant 30 minutes et 223 mg de monomère de styrène sont ensuite introduits. La diffusion des monomère de styrène dans la phase A s'effectue pendant 9 heures. La polymérisation est amorcée par chauffage de la solution à une température de 70 °C et poursuivie pendant 1 2 heures, sous agitation lente. Après achèvement de la polymérisation, les particules composites obtenues présentent un diamètre de 238 nm plus ou moins 10 nm.
Exemple 4 : 20 ml de l'émulsion de départ stable et isodisperse préparée selon le protocole de l'exemple 1 (n), constituée de deux phases non miscibles : la phase A constituée de gouttelettes de 206 nm de diamètre contenant des nanoparticules d 'oxydes de fer de 1 0 nm dans de l'octane et un mélange de SDS et d'acide oléique, dispersée dans la phase aqueuse B (concentration 3, 3 %, à 0, 8 fois la concentration micellaire critique (CMC) du SDS) sont placés dans un réacteur de polymérisation. L'émulsion est dégazée pendant 1 4 heures à l'azote. 223 mg de monomères de styrène, puis 374 μl à 57, 5 g/l d'amino-méthyl styrène sont introduits dans le mélange reactionnel . Le mélange est soumis à homogénéisation pendant 5 minutes . Du 2, 2'-azobis(2,4-dιméthyl valéronitrile), comme amorceur de la polymérisation, solubilisé dans l'heptane (21 5 μl à 20 g/l) est introduit dans le mélange qui est ensuite homogénéisé pendant 1 0 minutes . Le styrène et le dérivé styrénique diffusent dans la phase A pendant 9 heures. La polymérisation est amorcée par chauffage de la solution à une température de 70°C et poursuivie pendant 12 heures, sous agitation lente. Après achèvement de la polymérisation, les particules composites obtenues présentent un diamètre de 203 nmplus ou moins 5 nm.
Exemple 5 :
20 ml de l'émulsion de départ stable et isodisperse préparée selon le protocole de l'exemple 1 (n), constituée de deux phases non miscibles : la phase A constituée de gouttelettes de 206 nm de diamètre contenant des nanoparticules d'oxydes de fer de 10 nm dans de l'octane et un mélange de SDS et d'acide oléique, dispersée dans la phase aqueuse B (concentration 3,3%, à 0,8 fois la concentration micellaire critique (CMC) du SDS) sont placés dans un réacteur de polymérisation. L'émulsion est dégazée pendant 14 heures à l'azote. 240 mg de monomères de styrène sont ajoutés au mélange reactionnel qui subit ensuite une étape d'homogénéisation pendant 5 minutes. Du 2,2'- azobis(2,4-diméthyl valéronitrile), comme amorceur de la polymérisation, solubilisé dans l'heptane (215 μl à 20 g/l) est introduit dans le mélange qui est ensuite homogénéisé pendant 10 minutes La pénétration des monomères de styrène dans la phase A s'effectue pendant 9 heures. La polymérisation est amorcée par chauffage de la solution à une température de 70°C et poursuivie pendant 12 heures, sous agitation lente. Après achèvement de la polymérisation, les particules composites obtenues présentent un diamètre de 206 nmplus ou moins 5 nm.
Exemple 6 :
20 ml de l'émulsion de départ stable et isodisperse préparée selon le protocole de l'exemple 1 (ii), constituée de deux phases non miscibles : la phase A constituée de gouttelettes de 206 nm plus ou moins 5 nm de diamètre contenant des nanoparticules d'oxydes de fer de 10 dans de l'octane et un mélange de SDS et d'acide oléique, dispersée dans la phase aqueuse B (concentration 3, 3 %, à 0, 8 fois la concentration micellaire critique (CMC) du SDS) sont placés dans un réacteur de polymérisation. L'émulsion est dégazée pendant 9 heures à l'azote. Du 2,2'-azobιs(2,4-dιméthyl valéronitrile) , comme amorceur de la polymérisation, solubilisé dans l' heptane (21 5 μl à 20 g/l) est introduit dans le mélange qui est ensuite homogénéisé pendant 30 minutes. 223 mg de monomères de styrène, sont introduits dans le mélange reactionnel et on laisse diffuser les monomères de styrène dans la phase A pendant 9 heures. La polymérisation est amorcée par chauffage de la solution à une température de 70 °C et poursuivie pendant 1 2 heures, sous agitation lente. Après achèvement de la polymérisation, les particules composites obtenues présentent un diamètre de 206 nm plus ou moins 5 nm.
Exemple 7 : 20 ml de l'émulsion de départ stable et isodisperse préparée comme décrit dans l'exemple 1 (n), constituée de deux phases non miscibles : la phase A constituée de gouttelettes contenant de 206 nm plus ou moins 5 nm de diamètre des nanoparticules d'oxydes de fer de 1 0 nm dans de l'octane et un mélange de SDS et d 'acide oléique, dispersée dans la phase aqueuse B (concentration 3, 3 %, à 0,8 fois la concentration micellaire critique (CMC) du SDS) sont placés dans un réacteur de polymérisation. L'émulsion est dégazée pendant 1 4 heures à l'azote. 223 mg de monomères de styrène et 374 μl à 57, 5 g/l d'amino-méthyl styrène sont introduits simultanément dans le mélange reactionnel. Le mélange est soumis à homogénéisation pendant 5 minutes . Du 2, 2'-azobιs(2,4-dιméthyl valéronitrile), comme amorceur de la polymérisation, solubilisé dans l'heptane (21 5 μl à 20 g/l) est introduit dans le mélange qui est ensuite homogénéisé pendant 10 minutes. Le styrène et le dérivé styrénique diffusent dans la phase A pendant 9 heures . La polymérisation est amorcée par chauffage de la solution à une température de 70°C et poursuivie pendant 12 heures, sous agitation lente. Après achèvement de la polymérisation, les particules composites obtenues présentent un diamètre de 206 nm plus ou moins 5 nm
Exemple 8 :
20 ml de l'émulsion de départ stable et isodisperse obtenue selon le protocole décrit dans l'exemple 1 (u), constituée de deux phases non miscibles : la phase A constituée de gouttelettes de 206 nm plus ou moins 5 nm de diamètre contenant des nanoparticules d'oxydes de fer de 10 nm, de l'octane et un mélange de SDS et d'acide oléique, dispersée dans la phase aqueuse B (concentration 3,3%, à 0,8 fois la concentration micellaire critique (CMC) du SDS) sont places dans un réacteur de polymérisation. L'émulsion est degazée pendant 14 heures à l'azote. On introduit 240 mg de monomères de styrène puis on laisse le mélange s'homogénéiser pendant 5 minutes Le (2,2'-azobιs(2,4-dιméthyl valéronitrile)) solubilisé dans l'heptane (215 μl a 20 g/l) est ensuite ajouté et le mélange subit une homogénéisation pendant 10 minutes. On laisse le styrène diffuser dans la phase A pendant 9 heures La polymérisation est ensuite amorcée par élévation de la température a 70°c et suivie pendant 12 heures, sous agitation lente Les particules composites obtenues présentent un diamètre de 206 nm plus ou moins 5 nm.
Exemple 9 .
20 ml de l'émulsion de départ stable et isodisperse péparée selon le protocole de l'exemple 1 (n), constituée de deux phases non miscibles : la phase A constituée de gouttelettes de 206 nm plus ou moins 5 nm de diamètre contenant des nanoparticules d'oxydes de fer de 10 nm dans de l'octane et du SDS, dispersée dans la phase aqueuse B (concentration 3,3%, à 0,8 fois la concentration micellaire critique (CMC) du SDS) sont placés dans un reacteur de polymérisation. L'émulsion est dégazée pendant 14 heures à l'azote. 200 mg de monomères de styrène, puis 22 mg d'acide méthacrylique sont introduits dans le mélange reactionnel. Le mélange est soumis à homogénéisation pendant 5 minutes. Du 2,2'-azobis(2,4-dιméthyl valéronitrile), comme amorceur de la polymérisation, solubilisé dans l'heptane (215 μl à 20 g/l) est introduit dans le mélange qui est ensuite homogénéisé pendant 10 minutes. Le styrène et l'acide méthacrylique diffusent dans la phase A pendant 9 heures. La polymérisation est amorcée par chauffage de la solution à une température de 70°C et poursuivie pendant 12 heures, sous agitation lente. Après achèvement de la polymérisation, les particules composites obtenues présentent un diamètre de 238 nm plus ou moins 10 nm.
Exemple 10 :
20 ml de l'émulsion de départ stable et isodisperse préparée selon le protocole décrit dans l'exemple 1 (i), constituée de deux phases non miscibles : la phase A constituée de gouttelettes de 164 nm plus ou moins 5 nm de diamètre contenant des nanoparticules d'oxydes de fer de 10 nm dans de l'octane et du SDS, dispersée dans la phase aqueuse B (concentration 3,3%, à 0,8 fois la concentration micellaire critique (CMC) du SDS) sont placés dans un réacteur de polymérisation. L'émulsion est dégazée pendant 14 heures à l'azote. 79 mg de monomères de styrène, puis 22 mg d'acide méthacrylique sont introduits dans le mélange reactionnel. Le mélange est soumis à homogénéisation pendant 5 minutes. Du 2,2'-azobis(2,4-dιméthyl valéronitrile), comme amorceur de la polymérisation, solubilisé dans l'heptane (215 μl à 10 g/l) est introduit dans le mélange qui est ensuite homogénéisé pendant 10 minutes. Le styrène et l'acide méthacrylique diffusent dans la phase A pendant 9 heures. La polymérisation est amorcée par chauffage de la solution à une température de 70°C et poursuivie pendant 12 heures, sous agitation lente. Après achèvement de la polymérisation, les particules composites obtenues présentent un diamètre de 1 60 nmplus ou moins 5 nm.
Exemple 1 1 : A 240 μl d'un latex magnétique à 3 %, obtenu comme décrit précédemment dans l'exemples 9, sont ajoutés successivement, 60 μl de Tween 20 ( 1 %), 636 μl de tampon phosphate ( 1 0 mM à pH 6, 9) , 60 μl de N-(3-diméthylamιnopropyl)-N'-éthylcarbodιιmιdedιhydrochlorure (25 mg/ml) , 1 56 μl de N-hydroxysulfosuccinimide ( 25 mg/ml) et de la streptavidine (48 μl à 1 mg/ml) .
Le mélange est incube pendant une heure à température ambiante et les particules sont ensuite concentrées par application d'un champ magnétique, puis redispersées dans le tampon contenant du tensio- actif (phosphate 1 0 mM, pH 6, 9 + Tween 20 0,05 % ) . 9,9 μl d'un oligonucléotide biotinylé (ODN) de 1 7 mers présentant une masse de 5753 g/mole à une concentration de 338 nmoles/ml) sont ajoutés à 400 μl de particules recouvertes de streptavidine synthétisées précédemment pour constituer le témoin positif. 20 μl d'un oligonucléotide non biotinylé et non aminé de 1 7 mers (masse : 6452 g/mole à une concentration de 1 67 nmoles/ml) sont ajoutés à 400 μl de particules recouvertes de streptavidine synthétisées précédemment pour constituer le témoin négatif .
Les deux témoins sont incubés 30 minutes à température ambiante, séparés trois fois et redispersés la première fois avec un tampon basique (phosphate 1 0 mM, pH 9, 9 + SDS, 5 fois la concentration micellaire critique, la seconde fois avec un tampon à pH neutre (phosphate 1 0 mM, pH 6,9 + Tween 20 0,05 % ) et la troisième fois dans 280 μl de PEG contenant de l'ADN de sperme de saumon . Dans les deux cas 20 μl d'ODN complémentaire à l'ODN du témoin positif marqués à la peroxydase de raifort ( 1 7 mers, concentration 9 nmoles/ml) sont ajoutés .
Les deux témoins sont à nouveau incubés une heure à température ambiante et sont encore séparés pour être dispersés de nouveau dans 400 μl de PEG contenant de l' ADN de sperme de saumon.
50 μl d'ortho-phénylènediamine sont ajoutés à 50 μl de particules. La réaction enzymatique est effectuée pendant 5 minutes et arrêtée par l'addition de 50 μl d'acide sulfuπque ( 1 M) . Les particules sont séparés d u surnageant et ce dernier est dosé par méthode coloπmétπque sur un appareil Axia Microreader (nom commercial, bioMéπeux) à 492 et 630 nm.
Le témoin positif donne une densité optique de 2 000 unités de D.O, alors que le témoin négatif donne une densité de 1 000 unités de D.O .
Dans les exemples ci-dessus, la taille a été mesurée par diffusion de la lumière. La fluctuation de la taille observée, avant et après polymérisation, est attribuée à la combinaison des deux phénomènes suivants : a) une éventuelle évaporation d ' une partie de la phase organique et b) la conversion de la polymérisation d' un exemple à l'autre. Le taux d'oxyde de fer après polymérisation est relativement du même ordre de grandeur que dans l'émulsion utilisée avant la polymérisation.

Claims

REVENDICATIONS
1 . Particules composites comprenant un polymère hydrophobe 5 et des nanoparticules inorganiques, caractérisées en ce qu'elles présentent un diamètre de l'ordre d'environ 50 a 1 000 nm, de préférence d'environ 100 à 500 nm et avantageusement d'environ 1 00 à 250 nm, en ce que le polymère hydrophobe constitue une matrice polymère et en ce que les nanoparticules inorganiques sont stabilisées et distribuées de manière K) relativement homogène à l'intérieur de lad ite matrice
2. Particules selon la revendication 1 , caractérisées en ce qu'elles présentent une taille moyenne comprise entre 1 00 et 250 nm plus ou moins environ 5 %.
3. Particules selon la revendication 1 ou 2, caractérisées en ce 15 que les nanoparticules sont constituées de matériaux inorganiques choisis parmi les oxydes métalliques de fer, de titane, de cobalt, de zinc, de cuivre, de manganèse, de nickel , la magnétite , l'hématite, les ferrites telles que les ferrites de manganèse, nickel, manganèse-zinc; les alliages de cobalt, nickel 20 4. Particules selon la revendication 3, caractérisées en ce que les matériaux organiques sont choisis parmi les oxydes métalliques magnétisables, tels que l'oxyde de fer, la magnetite et l'hématite.
5 Particules selon la revendication 3 ou 4, caractérisées en ce que les matériaux inorganiques représentent de 5 à 95 %, de préférence de 25 10 à 90%, de manière encore plus préférée de 20 à 90% et avantageusemant de 25 a 85 % en masse par rapport à la masse totale desdites particules.
6. Particules selon l'une des revendications précédentes, caractérisées en ce que les nanoparticules inorganiques sont stabilisées 30 par des agents de stabilisation choisis parmi les groupements ioniques , les chaînes polymère, les agents tensio-actifs, les agents tensio-actifs fonctionnels, tels que les acides gras ou les dérives d 'acides gras, et les mélanges d'agents tensio-actifs .
7. Particules selon la revend ication 6, caractérisées en ce que 5 les agents tensio-actifs sont le dodecyl sulfate de sod ium ou un mélange de dodecyl sulfate de sod ium et d ' acide oléique .
8. Particules selon la revend ication 1 , caractérisées en ce que la matrice polymère est une matrice de type polymère vinylaromatique hyd rophobe choisie parmi les homopolymeres de monomères
H) vinylaromatiques insolubles dans l ' eau , tels que styrène, methylstyrène, éthylstyrène, tertio-butyl-styrene , vinyltoluene, ainsi que les copolymères de ces monomères entre eux et/ou avec d ' autres comonomères, tels que les acrylates d 'alkyle et les methacrylates d ' alkyle dans lequels le groupement alkyle comprend de 3 à 1 0 atomes de carbone, les esters
15 d'acides ethyleniques possédant 4 ou 5 atomes de carbone et d 'alkyle possédant 1 à 8 atomes de carbone, les acides méthacryhques, les dérivés styréniques, les composés d iéniques
9. Particules selon la revendication 7 , caractérisées en ce que le polymère est un polymère réticulé
20 1 0. Particules selon les revend ications précédentes, caractérisées en ce qu'elles comprennent de plus un marqueur choisi parmi les marqueurs fluorescent, luminescent ou radioactif
1 1 . Procédé de préparation de particules composites selon les revendications précédentes, caractérisé en ce que
25 (i ) on dispose d ' une émulsion de départ stable et isodisperse constituée de deux phases non miscibles , une phase A hydrophobe constituée de gouttelettes contenant des nanoparticules inorganiques dispersées dans une phase organique contenant un agent tensio-actif , ladite phase A étant dispersée dans une phase B hydrophile ; (n) on introduit dans la phase hyd rophile B des monomères hydrophobes qui pénètrent à l' intérieur de la phase A , et
(ni) on polyméπse lesdits momomeres hydrophobes à l'intérieur de la phase A en présence d ' un agent amorceur choisi parmi les amorceurs
5 organosolubles ou faiblement solubles dans la phase hydrophile et les amorceurs solubles dans la phase hydrophile dans des conditions prédéterminées
1 2. Procédé selon la revendication 1 1 , caractérisé en ce que les monomères hydrophobes sont choisis parmi les monomères
H) vinylaromatiques tels que styrène, methylstyrène, éthylstyrène, tertio- butyl-styrène, amino-méthylstyrene, vinyltoluene, seuls ou en mélange, ou bien encore en mélange avec d'autres monomères polymérisables insolubles dans l'eau tels que les acrylates, les methacrylates d'alkyle, les esters d 'acides ethyleniques et d 'alkyle, les acides méthacryhques, les
15 dérivés styréniques, les acides ethyleniques, les composes diéniques
1 3. Procédé selon la revendication 1 1 ou 1 2, caractérisé en ce que on ajoute au monomère ou au mélange de monomères un agent de réticulation hydrophobe, tel qu un monomère reticulant de type divinylbenzene, diméthacrylate, en particulier diméthacrylate de vinyle
20 14 Procédé selon la revendication 1 1 , caractérise en ce que l'agent amorceur organosoluble est choisi parmi amorceurs de type azobis, tels que les 2,2'-azobιs(2,4-dιmethylvaleronιtπle) , 2, 2'-azobιs(4-méthoxy- 2,4-dιméthylvaléronιtrιle), 2, 2' azobιs(2-cyclopropylpropιonιtrιle), 2, 2'- azobιs(2-méthylpropιonιtrιle), 2, 2' azobιs(2-methylbutyronιtrιle), 1 , 1 '-
25 azobιs(cyclohexane- 1 carbonitπle) , 1 -(( 1 -cyano-1 - méthyiéthyl)azo)formamιde, 2-phenvlazo-4-méthoxy-2,4-dιméthyl- valéronitπle, diméthyl 2, 2'-azobιs(2 methylpropionate, 4, 4'-azobιs(4-acιde cyanovaléπque) et 2, 2'-azobιs(2-(hydroxyméthyl)propιonιtrιle) et l'amorceur faiblement soluble ou soluble dans la phase hydrophile est
30 choisi parmi les amorceurs radicalaires de type peroxyde, tels que les peroxydes, les hydroperoxydes, en particulier l'hydroperoxyde de cumène, et les amorceurs de type persel, tels que les persulfates, en particulier le perulfate d'ammonium, le persulfate de sodium et le persulfate de potassium. 1 5. Procédé selon les revend ications 1 1 et 1 4, caractérisé en ce que l'agent amorceur est introduit dans la phase hydrophile soit simultanément à l'introduction des monomères hydrophobes décrite dans l'étape (iι) , soit préalablement à l'étape (n) , soit postérieurement à l'étape (ϋ) . 1 6. Procédé selon la revendication 1 1 , caractérisé en ce que la polymérisation (ni) est effectuée par chauffage jusqu' à une température de 60 à 90°C, de préférence de 70° C.
1 7. Procédé selon la revendication 1 1 , caractérisé en ce que la polymérisation (iii) est effectuée par photochimie. 1 8. Procédé selon la revendication 1 1 , caractérisé en ce que la phase organique hydrophobe A est une phase comprenant un hydrocarbure aliphatique ou cyclique choisi parmi les composés comprenant de 5 à 1 2 atomes de carbone, leurs isomères et leurs mélanges ou une phase comprenant tout ou partie d'un composé organique polymerisable par voie radicalaire choisi parmi les monomères vinylaromatiques insolubles dans l'eau, tels que styrène, methylstyrène, éthylstyrène, tertio-butyl-styrène, vinyltoluene, ainsi que les copolymères de ces monomères entre eux.
1 9. Procédé selon la revendication 1 8, caractérisé en ce que l'hydrocarbure est choisi parmi le pentane, l'hexane, l' heptane, l'octane, le nonane, le décane, le undécane, le dodécane, et le composé organique polymerisable par voie radicalaire est choisi parmi les .
20. Procédé selon la revendication 1 1 , caractérisé en ce que la phase B est une phase aqueuse, telle que de l'eau.
21 . Procédé selon la revendication 1 1 , caractérisé en ce qu'il comprend de plus une étape de fonctionalisation des particules composites par pénétration dans la phase organique A de groupements réactifs fonctionnels apportés par des monomères faiblement hydrophiles susceptibles de polyméπser avec les monomères hydrophobes.
22. Procédé selon la revendication 21 , caractérisé en ce que les groupements réactifs fonctionnels sont des groupements acide apportés par des monomères faiblement hydrophiles choisis parmi les monomères des acides acryliques, méthacryhques, ethyleniques, sulfoniques et les monomères polymérisables choisis parmi les monomères vinylaromatiques insolubles dans l'eau, tels que styrène, methylstyrène, éthylstyrène, tertio- butyl-styrène, vinyltoluene, ainsi que les copolymères de ces monomères entre eux, seuls ou en mélange avec d'autres monomères hydrophobes.
23. Procédé selon les revendications 1 1 , 21 et 22, caractérisé en ce que lesdits monomères faiblement hydrophiles sont apportés dans la phase organique A, soit simultanément à l'étape (n) , soit préalablement à l'étape, ou postérieurement à l'étape (n) .
24. Procédé selon les revendications 1 1 et 21 , caractérisé en ce qu'il comprend de plus après l'étape de polymérisation (m), une étape d'évaporation totale ou partielle de la phase organique A.
25. Particules composites telles que définies selon les revendications 1 à 1 0, caractérisées en ce qu'elles présentent de plus des groupements fonctionnels réactifs à leur surface, tels que des groupements carboxyhque, aminé, thiol, aldéhyde, hydroxyl, tosyl, hydrazine, susceptibles de réagir avec au moins un hgand .
26. Conjugués dérives de particules composites telles que définies dans la revendication 25, caractérisés par le fait qu'ils sont couplés à au moins un hgand choisi parmi un anticorps, un fragment d'anticorps, une protéine, un polypeptide, une enzyme, un polynucléotide, un fragment d'acide nucléique et la biotine.
27. Réactif, comprenant en outre au moins un conjugué tel que défini dans la revendication 26
28. Composition diagnostique comprenant en outre un réactif tel que défini dans la revendication 27.
5 29. Utilisation d ' un reactif tel que défini dans la revendication
27 dans un test de diagnostic
30. Conjugués dérives de particules composites telles que définies dans la revendication 22, caractérisés par le fait qu'ils sont couplés à au moins un hgand choisi parmi les substances
K) médicamenteuses, les sondes anti-sens, les agents réparateurs de gènes, les agents bloquant ou inhibant une activité protéique
31 Utilisation des conjugues tels que définis dans la revendication 27 dans une composition thérapeutique
32. Conjugués dérives de particules composites telles que 15 définies dans la revendication 25, caractérisés par le fait qu'ils sont couplés à au moins un hgand choisi parmi les molécules cages, les agents chélatants et les catalyseurs
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