WO2001020332A1 - Procede de recherche d'une substance permettant de lutter contre le virus de la grippe - Google Patents

Procede de recherche d'une substance permettant de lutter contre le virus de la grippe Download PDF

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WO2001020332A1
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influenza virus
miniplasmin
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virus
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Hiroshi Kido
Meiko Murakami
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Kyorin Pharmaceutical Co., Ltd.
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    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value

Definitions

  • the present invention relates to a method for searching for a substance having an anti-influenza virus activity.
  • the first is to develop vaccines as substances with anti-influenza virus activity. Inactivated influenza vaccines and live vaccines have been developed.
  • the second is a method of emitting Open explore the ion channel M 2 protein of influenza virus as a substance having anti fin full E stanza virus act Chiya down channel blockers that target.
  • sialic acid is known to be the receptor on the membrane of cells infected with influenza virus
  • sialic acid-targeted anti-influenza virus-active substance Is a way to explore and develop.
  • the outer membrane glycoprotein of influenza virus is often recognized as an antigen. Therefore, the effect of the vaccine developed by this method could not always be expected.
  • the searched how emits open the ion channel M 2 protein of the second influenza virus as a substance having anti-influenza virus activity of Chiya down channel blockers that target, for example, its effectiveness is broadcast as one of the conventional anti-Parkinson's disease drugs this is called amantadine, which is tell have been searched, to block M 2 protein
  • amantadine which is tell have been searched
  • the problem to be solved by the present invention is to provide a method capable of solving the drawbacks of the conventional technology and efficiently searching for a substance having an anti-influenza virus action based on a different action from the conventional technique. It is to be.
  • miniplasmin The major influenza virus activator in Japan is miniplasmin, which means that miniplasmin is critically involved in the activation of influenza virus and Sendai virus, that is, influenza virus and Sendai virus They succeeded in finding that miniplasmin must have a structure-converting action to an activated form in order to exert infectivity.
  • the present inventors have searched for a substance that inhibits the influenza virus activating effect of miniplasmin, that is, a miniplasmin inhibitor, and have found that it can be used as a pharmaceutical. It was found that it was effective in searching for a substance having an anti-influenza virus effect.
  • the present invention is characterized in that miniplasmin is used as a probe.
  • the present invention relates to a method for searching for a substance having an anti-influenza virus activity. Further, the present invention provides a method for reacting a substance to be detected with miniplasmin as a probe and Sendai virus or influenza virus as a substrate, and using the amount of subunit of the outer membrane glycoprotein precursor of the substrate virus in the reaction solution as an index.
  • the present invention relates to a method for searching for a substance having an anti-influenza virus activity.
  • the present invention relates to a method for reacting a substance to be investigated with miniplasmin as a probe, using Sendai virus or influenza virus as a substrate, and reacting the substrate virus after the reaction with dog kidney cells (Mard in Darby canine kidney, (Hereinafter abbreviated as “MDCK cells”).
  • MDCK cells Mard in Darby canine kidney, (Hereinafter abbreviated as “MDCK cells”).
  • miniplasmin which is mainly formed in a local area where neutrophils have leached in large quantities due to a pathological condition such as inflammation, adheres to and exists on a local cell membrane, and Is infected with an influenza virus, the non-infectious influenza virus or non-infectious Sendai virus that grows and germinates from inside the cell can be infected with miniplasmin that can infect cells in the respiratory tract. It has been found that it has the effect of converting it to a virus.
  • the present inventors can establish a method for searching for a specific inhibitor for miniplasmin by utilizing this characteristic of miniplasmin, if the drug discovered by the method can be used, influenza virus associated with various inflammatory reactions We thought it would be possible to stop the spread of the infection.
  • the details are as follows.
  • the present inventors have found that, compared to plasmin, as shown in Table 1, the remarkably hydrophobic nature of plasmin as compared to plasmin, the plasmin force produced by human granulocyte-derived elastase It was predicted that, due to the increased number of cells, they would easily adhere to the surface of various cell membranes and, as a result, would be critically involved in the degradation of proteins, that is, the conversion of viruses to infectious forms.
  • influenza virus and Sendai virus that grow by infecting the respiratory tract are infected.
  • Influenza virus the outer membrane glycoprotein precursor hemagglutinin (HA) is converted to the hemagglutinin 1 subunit ( ⁇ ,).
  • Guruchinin 2 subunit (HA 2) the Sendai virus Tilia one John protein is the outer membrane glycoprotein precursor (F.) is Fusion Protein 1 Sabuyu knit (F and winter one John protein 2 subunit (F 2)
  • it must be cleaved by the protease of the host, because the cleavage of the outer membrane glycoprotein precursor only allows the virus to exhibit membrane fusion and infectivity to cells.
  • miniplasmin degrades the outer membrane glycoproteins of these viruses to a limited extent, resulting in membrane fusion and infectivity. It was examined whether it is involved in expression. It was revealed that the outer membrane glycoprotein was limitedly degraded, and the non-infectious virus was infected and showed infectivity.
  • a substance to be examined for anti-influenza virus activity is introduced into a reaction system containing human miniplasmin and its substrate, for example, Sendai virus or influenza virus, and reacted.
  • influenza virus when influenza virus is used as a substrate in the reaction vessel, hemagglutinin 1 (HA and hemagglutinin 2 ( ⁇ ⁇ ,)) generated by cleavage of hemagglutinin (HA), a precursor of its outer membrane glycoprotein.
  • HA hemagglutinin 1
  • ⁇ ⁇ , hemagglutinin 2
  • the Sendai virus is used as a substrate, the presence of the (F) and (F 2 ) subunits caused by cleavage of the outer membrane glycoprotein precursor (F fl ) Analyze whether to do.
  • the infectivity titer of cells when infecting MDCK cells with influenza virus may be used.
  • a substance to be tested for the presence or absence of anti-influenza virus activity is introduced into a reaction system containing human miniplasmin and its substrate influenza virus, and the reaction is carried out. The virus is removed, MDCK cells are infected, the number of infected cells is detected with a fluorescently labeled anti-influenza antibody, and the CIU is calculated.
  • the method for searching for a miniplasmin inhibitor using an artificial substrate as an index as shown in Table 3 is compared with the method for searching using a protein or an actual virus as a substrate.
  • ⁇ indicates an artificial substrate with high specificity 3 Inhibitor specificity of human minebrasmin
  • ⁇ indicates an inhibitor that showed strong inhibition
  • ⁇ indicates an inhibitor that became more inhibitory by increasing the concentration
  • Figure 1 shows the results of SDS-polyacrylamide gel electrophoresis of the purified human myniplasmin.
  • miniplasmin showed an almost single protein band of about 36-38 kDa, and in the presence of a reducing agent, separated into two protein bands of 28 kDa and 12 kDa. From this fact, it was revealed that miniplasmin has an S—S bond between a 28 kDa protein and a 12 kDa protein. After 28 kDa and 12 kDa protein bands were plotted on the PVDF membrane, the amino acid sequence of about 20 residues was analyzed from each N terminal.
  • the 12 kDa protein band showed the sequence of VVAPPPVVLLPNVETPSEED—
  • the 28 kDa protein band showed the sequence of VVGGCVAHPHSWP WD VSLRY—.
  • the human granulocyte was treated with Erasase, the protein bands of 12 kDa and 28 kDa showed exactly the same amino acid sequence.
  • Miniplasmin thus obtained differs in various properties from plasmin. As shown in Table 1, the molecular weight of miniplasmin decreases from 94 kDa to 38 kDa because it lacks the Kringle 1 to 4 region (angiostin) present on the N-terminal side of plasmin. And the hydrophobicity increases significantly. As a result, miniplasmin binds tightly to the cell membrane surface, such as 0.5M NaCl or 0.5% Triton X (trade name: Sigma polyoxyethylene octyl ether). It changes so that it cannot be solubilized unless a surfactant is used.
  • Triton X trade name: Sigma polyoxyethylene octyl ether
  • microplasmin excluding miniplasmin excluding K ring 1 e5 becomes extremely unstable in the neutral pH range, and its activity is reduced to 50% or less by autolysis within a few minutes.
  • miniplasmin is unstable for several hours under the same conditions Activity is maintained.
  • Table 2 shows the substrate properties of human miniplasmin.
  • the artificial substrates of various trypsin type proteases the artificial substrate Boo-G1u-Lys-Lys-MCA of plasmin, in particular, showed the highest cleavage activity.
  • Glu (G1u) —X—Arg which is the same type as the cleavage site recognition amino acid sequence (cleavage motif) commonly found in human influenza viruses reported so far, For the artificial substrate group having the sequence, after Arg was cleaved well.
  • the artificial substrate Boc—I1e—G1y—Arg—MCA of factor Xa a proteolytic enzyme that exhibits trypsin-like activity as one of the blood coagulation factors, and one of the lysosomal enzymes
  • the catabsin B artificial substrate Bz-Arg-MCA showed almost no cleavage activity.
  • Table 3 shows the inhibitory specificity of hitomiplasmin.
  • aprotinin AproUnine
  • Kunitz-type soybean trypsin inhibitor Yuichi
  • Bowman Burk trypsin inhibitor Yuichi
  • anti-leukoprotease also known as MPI or SLPI
  • benzomidine which inhibits the activity of trypsin, is highly inhibited at high concentrations such as 1 mM to 1 OmM in the case of phenyl fluorosulfonate and phenylmethylsulfonyl fluoride. Showed activity.
  • the infectious titer (CIU) of the cells when MDCK cells were infected with influenza virus treated with miniplasmin was examined (Fig. 4). Specifically, non-infectious influenza A / Aichi / 2/68 (H3N2) strains were treated with various concentrations of miniplasmin at 37 in the presence of PBS for 15 minutes, and then the virus was transferred to MDCK cells. And the number of infected cells was detected with a fluorescently labeled anti-influenza AZA ichi / 2/68 (H 3 N 2) antibody to calculate CIU.
  • miniplasmin As a result, a remarkable increase in the infectious titer was observed depending on the concentration of miniplasmin, and reached a plateau at 10,4 mU / m 1 or more.
  • the activity of miniplasmin shown here was defined as 1 unit with an enzyme that decomposes the artificial substrate B0c-G1u-A1a-Arg-MCA by 1 mol per minute.
  • FIG. 1 shows the results of electrophoresis measurement showing SDS-PAGE of human miniplasmin.
  • FIG. 2 shows the primary of human plasminogen and human miniplasmin It is a figure showing a structure.
  • Figure 3 shows HA and Sendai virus F of influenza AZA iCh i / 2/68 caused by miniplasmin.
  • 4 shows the results of an electrophoresis measurement showing limited decomposition of.
  • Uninfected influenza A / Aichi / 2/68 / H3N2
  • various concentrations of miniplasmin ((), or 20 mU / ml miniplasmin is added to a final concentration of 1 M biprotinin ( ⁇ )
  • FITC fluorescent dye labeled anti-influenza A / Aichi antibody.
  • Figure 5 shows the purified enzyme preparation using [ 3 H] -labeled Sendai virus as a substrate.
  • the supernatant was applied to a soybean trypsin inhibitor sepharose 4B column to absorb miniplasmin, and after sufficient washing, the adsorbed portion was treated with 5 OmM glycine-hydrochloric acid buffer (PH2.8). /0.5 ⁇ Na C 1 This was applied to a gel filtration HPLC column (Superdex200: trade name, manufactured by Amersham Pharmacia Biotech) to remove impurities, and a final sample was obtained.
  • PH2.8 OmM glycine-hydrochloric acid buffer
  • 3 L of a 3 L concentrated sample buffer for electrophoresis (6% SDS, 30% glycerol, 0.2 M Tris-HCl buffer, pH 6.8) was added to the reaction solution 10 three times. Heat treatment was immediately performed at 100 ° C for 5 minutes. The samples were then run on a 10-20% gradient SDS-polyacrylamide gel and electrophoresed. Electrophoresis was performed at 30 mA per polyacrylamide gel for 2 hours. After electrophoresis, fix the SDS-polyacrylamide gel in a fixing solution (methanol 50%, acetic acid 50%) for 1 hour, and then use a sensitizing solution (Amplify: trade name: Amersham Life Science) for 20 minutes. Processed.
  • a fixing solution methanol 50%, acetic acid 50%
  • the autoradiograph was RX-U (trade name: manufactured by Fuji Photo Film Co., Ltd.), exposed to light at -80 for 3 days, developed and fixed. , It became a row the detection of FF 2 band.
  • Benzamidine was added to the same reaction system as in Example 1, it was treated 37 with 3 hours, was confirmed by the method described the presence of Sabuyuni' Bok bets F 2 in the reaction system in Example 1.
  • a sample of miniplasmin (944 mU / mg) was added to the non-infectious influenza AZA ichi Z2Z68 (H 3 N 2) strain in the presence of PBS at 37 ° C for 15 minutes (0, 1.2, 5.
  • Each infectivity showed (0 (undetectable values), 1 X 1 0 6, 1. 3 X 1 0 7, 7. 5 X 1 0 7, 9. 6 X 1 0 7) CIU.
  • IM aprotinin (Aprotinin) was added to miniplasmin (10.4 mUZm 1), which showed a plateau, treated at 37 ° C for 15 minutes, and CIU was treated in the same manner as above. Was calculated.
  • miniplasmin As a probe, a substance having an anti-influenza virus effect can be efficiently searched in vitro.

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Description

明 細 書 抗インフルエンザウイルス作用を有する物質の探索方法 技術分野
本発明は、 抗ィンフルェンザウィルス作用を有する物質を探索する方法に関す るものである。 背景技術
従来の抗インフルエンザウイルス作用を有する物質の開発は大きく分けて 3つ の方向で検討されてきた。
第 1は、 ワクチンを抗インフルエンザウイルス作用を有する物質として開発す る方法で、 不活性化インフルエンザワクチンや生ワクチンが開発されてきた。 第 2は、 インフルエンザウイルスのイオンチャンネル M2蛋白を標的としたチヤ ンネルブロッカーを抗ィンフルェンザウィルス作用を有する物質として探索し開 発する方法である。
第 3は、 インフルエンザウイルスに対する感染細胞の膜上のレセプ夕一はシァ ール酸であることが知られていることから、 このシアール酸を標的とした抗ィン フルェンザウィルス作用を有する物質を探索し開発する方法である。
しかし、 上記の従来の開発方法では、 以下のような欠点があった。
第 1のワクチンを抗ィンフルェンザウィルス作用を有する物質として開発する 場合は、 インフルエンザウイルスの外膜糖蛋白質が抗原として認識されることが 多いが、 インフルエンザウイルスの抗原は、 毎年流行する度に変異によって異な るため、 この方法で開発されたワクチンの効果が必ずしも期待できなかった。 第 2のインフルエンザウイルスのイオンチャンネル M2蛋白を標的としたチヤ ンネルブロッカーを抗インフルエンザウイルス作用を有する物質として探索し開 発する方法では、 例えば従来抗パーキンソン氏病薬の一つとしてその有効性が報 告されているアマンタジンが探索されているが、 M2蛋白をブロックするというこ とが、 同時に中枢神経系への作用も強く発生するという面も持ち合わせているた め、 現時点では使用に制限を生じ、 全てのインフルエンザウイルスの疾患患者に 用いるのは困難な物質である。 つまり、 この方法による抗インフルエンザウィル ス作用を有する物質の探索方法では、 得られた物質による中枢神経に関する問題 を必ずしも解決できる現状にはない。
第 3のィンフルェンザウィルスに対する感染細胞の膜上のレセプターであるシ アール酸を標的とした抗インフルエンザウイルス作用を有する物質を探索し開発 する方法は、 その有効性が報告されているが、 必ずしもその効果が十分に発揮さ れている現状にあるとは言えない。 また、 この探索方法は本発明とは全く別の作 用点および作用機序に基づくものである。 発明の開示
本発明が解決しょうとする課題は、 このような従来技術の欠点を解消し、 かつ 従来とは異なる作用に基づく抗インフルエンザウイルス作用を有する物質の採索 を効率的に行なうことのできる方法を提供することである。
このような状況下にあって、 本発明者らは、 ミニプラスミンとインフルエンザ ウィルス及びセンダイウィルスとの関係に関する研究を鋭意積み重ねる中で、 特 に急性、 慢性炎症など、 好中球の浸潤を伴う肺での主要なインフルエンザウィル ス活性化酵素がミニプラスミンであり、 つまり、 ミニプラスミンがインフルェン ザウィルスやセンダイウィルスの活性化に重大に関与していること、 すなわち、 インフルエンザウイルスやセンダイウィルスが人体においてその感染力を発揮す るには、 ミニプラスミンによる活性化体への構造変換作用が不可欠であるとの知 見を得ることに成功した。
本発明者らは、 以上の研究により知り得た知見を検討した結果、 ミニプラスミ ンのインフルエンザウイルス活性化作用を阻止する物質、 つまりミニプラスミン 阻害物質を探索し、 それを医薬品として実用化することが、 抗インフルエンザゥ ィルス作用を有する物質の探索に有効であることを見出した。
すなわち、 本発明は、 ミニプラスミンをプローブとして用いることを特徴とす る抗ィンフルェンザウィルス作用を有する物質の探索方法に関するものである。 さらに本発明は、 ミニプラスミンをプローブとし、 センダイウィルスまたはィ ンフルェンザウィルスを基質として被探索物質と反応させ、 反応液中の基質ウイ ルスの外膜糖蛋白質前駆体のサブュニット量を指標とする抗ィンフルェンザウイ ルス作用を有する物質の探索方法に関するものである。
さらにまた本発明は、 ミニプラスミンをプローブとし、 センダイウィルスまた はィンフルェンザウィルスを基質として被探索物質と反応させ、 反応後の基質ゥ ィルスを犬の腎細胞 （Mard i n Darby c an i ne ki dney, 以下 「M D C K細胞」 と略 称する） に感染させたときの感染価を指標とする抗インフルエンザウイルス作用 を有する物質の探索方法に関するものである。
本発明者らは、 炎症などの病的な状態のため好中球が多量に浸出した局所にお いて主として形成されるミニプラスミンが、 局所の細胞膜上に付着し存在するこ と、 そしてその細胞がインフルエンザウイルスに感染していた場合、 細胞内から 新たに増殖し出芽してくる非感染型インフルエンザウイルスや非感染型センダイ ウィルスに対し、 そのミニプラスミンが気道の細胞への感染が可能な感染型ウイ ルスに変換させる作用を有することを見出した。
本発明者らは、 ミニプラスミンのこの特徴を利用することにより、 ミニプラス ミンに対する特異的阻害剤の探索方法が確立できれば、 それにより見出された薬 剤によって、 種々の炎症反応に伴うインフルエンザウイルス感染の増悪の阻止が 可能になると考えた。
さらに詳しくは、 次の通りである。 本発明者らは、 ヒトの顆粒球由来のエラス 夕一ゼゃブ夕の降臓に由来するエラス夕一ゼによって作られるミニプラスミン力 プラスミンに比較して、表 1に示すように著しく疎水性が増加しているため、種々 の細胞膜表面に付着しやすく、 その結果、 蛋白質の分解、 つまりウィルスの感染 型への変換に重大な関与をしていることを予測した。
一方、気道に感染して増殖するインフルエンザウイルスやセンダイウィルスは、 感染するにあたり、 ィンフルェンザウィルスではその外膜糖蛋白質前駆体である ヘムァグルチニン （H A) がへムァグルチニン 1サブユニット （Η Α ,) とへムァ グルチニン 2サブユニット （HA2) に、 センダイウィルスではその外膜糖蛋白質 前駆体であるフユ一ジョンプロテイン （F。） がフュージョンプロテイン 1サブュ ニット （F とフユ一ジョンプロテイン 2サブユニット （F 2) に、 宿主側のプロ テア一ゼによって切断されなくてはならない。 なぜならば、 外膜糖蛋白質前駆体 の切断によってはじめてウィルスは膜融合能と細胞への感染性を示すようになる からである。
そこでこれら気道に感染する代表的なウィルスである、 ィンフルェンザウィル スとセンダイウィルスを標的にして、 ミニプラスミンがこれ等のウィルスの外膜 糖蛋白質を限定的に分解して膜融合性と感染性の発現に関与するかを検討した。 の外膜糖蛋白質は限定分解され、 非感染型ウィルスは感染化されて感染性を示す ことが明かとなった。
以下に本発明の方法を説明する。
まず、 ヒトミニプラスミンとその基質、 例えばセンダイウィルスやインフルェ ンザウィルスが混入された反応系に、 抗インフルエンザウイルス作用の有無を探 索したい物質を投入し、 反応を行なわせる。 反応後、 反応容器中より、 基質とし てィンフルェンザウィルスを用いた場合は、 その外膜糖蛋白質前駆体であるヘム ァグルチニン （H A) の切断によって生じるヘムァグルチニン 1 (H A とヘム ァグルチニン 2 (Η Α,) のサブユニットが存在するか否か、 また基質にセンダイ ウィルスを用いた場合は、 その外膜糖蛋白質前駆体 （F fl) の切断によって生じる ( F ,) と （F 2) のサブユニットが存在するかを否かを分析する。
もし、 それらサブユニットが存在した場合は、 ヒトミニプラスミンの作用が発 揮されたことを示すため、 当該投入物質には抗ィンフルェンザウィルス作用を有 さないことが証明され、 反対にそれらのサブユニットが存在しない場合には、 ヒ トミ二プラスミンの作用が阻害されたことを示すため、 当該投入物質が坊インフ ルェンザウィルス作用を有することが証明されたことになる。
このようにして、 抗ィンフルェンザウィルス作用を有する物質を探索すること が可能となる。 なお、 ヒトミ二プラスミンの作用が阻害されたか否かを調べる方法としては、 上記の他に、 インフルエンザウイルスを M D C K細胞に感染させたときの細胞へ の感染価 （C I U： Ce l l Inf ec t i ng Un i t) を用いる方法でも良い。 具体的には、 ヒトミニプラスミンとその基質であるィンフルェンザウィルスが混入された反応 系に、 抗インフルエンザウイルス作用の有無を探索したい物質を投入し、 反応を 行なわせた後、 反応溶液中より、 インフルエンザウイルスを取り出し、 MD C K 細胞に感染させ、感染した細胞数を蛍光標識した抗インフルエンザ抗体で検出し、 C I Uを算出する。 探索物質を添加してミニプラスミンによって活性化されたと きの I U値が、 探索物質の投与群での無添加群に比べて低い値を示すときは、 抗ィンフルェンザウィルス作用を示したことになる。 このような C I U値の評価 により、 当該投入物質が抗ィンフルェンザウィルス作用を有するか否かを探索す ることが可能である。
ところで、 本発明方法における基質の選択方法であるが、 表 3に示したような 人工基質を指標にしたミニプラスミン阻害物質の探索方法では、 基質として蛋白 や実際のウィルスを使用した探索方法と比べ、 それぞれの基質の立体構造の違い のために異なった阻害効率を示すことが考えられる。 従って、 本発明では、 実際 のインフルエンザウイルスやセンダイウィルスを基質として用いることが好まし い。
表 1 ブラスミ とミニプラスミンの比較
Figure imgf000007_0001
：ヒ卜
k2 ： Eisenberg等の方法で計算した疎水性度
表 2 ヒトミ二ブラスミンの基質特異性 Substrate Activity (mil/ml) % *
Boc-Leu-Thr-Arg-MCA 3.4 10.6
Boc-Phe-Ser-Arg-MCA 5.0 - 15.4
Boc-Val-Pro-Arg- CA 5.0 15.4
Boc-Gln-Gly-Arg-MCA 8,1 25.0
Boc-Ala-Gly-Pro-Arg-MCA 2.5 7.7
Boc-lle-Gln-Gly-Arg-MCA 1.6 4.8
Pro-Phe-Arg-MCA 5.0 15.4
Bz-Arg-MCA 0.0 0.0
Boc-Gln-Arg-Arg-MCA 16.1 50.0
•a 1
Boc-Giy-Lys-Arg-N4CA i 9.6
Boc-Leu-Arg-Arg-MCA 3.1 9.6
Boc-Vat-Leu-Lys-MCA 17.7 54.8
;;;; ^ ;;;;;;;;;;) ^
Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-MCA 0.0 0.0
Suc-Ala-Ala-Pro-Phe- CA 0.0 0.0
* Activity as a percentage of that with Boc-Gln-Ala-Arg- CA 蛍光標識人工基質である Boc-Gin-Ak-Arg-MCAに対する活性を 1 0 0% とした時の各基質に対する活性を％で表記してある。
Ξは人工基質として特異性の高いものを示している 3 ヒトミ二ブラスミンのインヒビター特異性
Final Relative ' concentration • activity
Addition
Figure imgf000009_0001
None 100.0
O Phenyl methytsulfonyl fluoride 1 m 95.1
29.5
10m
O Diisopropylfluorophosphate 65.6
10mM 3.3 l OitM 0.0
Q Aprotinin
97.4
AntHeuko protease
18.6 @ し eupeptin
Elastatinal 1 0μ 69.2
〇 Benzamidine I O 67.6
1 m 22.9
© unitz-type soybean trypsin inhibitor 10μΜ 0.0
Cymostatin l OwM 100.0
© Bowman-Btrk soybean trypsin inhibitor 10/iM 3.7
α T -Antitrypsin 10μ. 1 00.0
E-64 Ι ΟϋΜ 61.5
Pepstatin A I O 64.0
Phosphoramidon 10 Λ 100.0
* Activity as a percentage of that with Boc-Glu-Lys-Lys-MCA 精製酵素に対して最も特異性の高かった人工基質 Boc-GIu-Lys-Lys- MCAを用いて、 インヒビタ一のなしの時の活性を I 0 0 %とした時 の各種ィンヒビターの阻害特異性を0 /0で表記してある。
◎は強い阻害を示したィンヒビター、 〇は攙度を高くすることによ' り阻害力 強くなつたインヒビターを示す。 試験例
1. ヒ卜ミニプラスミンの構造
精製されたヒトミ二プラスミンの SDS—ポリアクリルアミドゲル電気泳動の 結果を図 1に示す。 還元剤非存在下で、 ミニプラスミンは約 36— 38 kD aの ほぼ単一の蛋白バンドを示し、 還元剤存在下では 28 kD aの蛋白と 12 kD a の 2本の蛋白バンドに分離した。 この事からミニプラスミンは、 28 kDaの蛋 白と 12 kD aの蛋白が S— S結合していることが明らかになった。 28 kD a と 12 kD aの蛋白バンドを PVDF膜にプロッ卜した後、 それぞれ N端末から 約 20残基のアミノ酸シークェンスの解析を行なった。 その結果、 12 kDaの 蛋白バンドは、 VVAPPPVVLLPNVETPSEED—の配列を、 28 k D aの蛋白バンドは VVGGCVAHPHSWP WD V S L R Y—の配列を示 した。 なおヒトの顆粒球のエラス夕ーゼで処理した場合も、 12 kD a、 28 k D aの蛋白バンドは全く同一のアミノ酸配列を示した。
以上のことから図 2に示すように、 ヒトのミニプラスミンは、 12 kDa蛋白 は V441から始まるクリングル （K r i n g 1 e) 5を、 28 k D aは V56'から始 まるミクロプラスミンからなることが明らかになった。
2. ヒトミ二プラスミンの性質
このようにして得られたミニプラスミンはプラスミンと比較して種々の性質を 異にする。 表 1に示すようにミニプラスミンはプラスミンの N端末側に存在する クリングル （K r i n g 1 e) 1〜 4の領域 （アンギオス夕チン） を欠くことか ら分子量は 94 kDaから 38 k D aに減少すると共に疎水性が著しく増加する。 その結果ミニプラスミンは細胞膜表面に強固に結合することになり、 0. 5M以 上の NaC lか 0. 5%トリ トン X (商品名： シグマ社製のポリオキシエチレン ォクチルェ一テル） のような界面活性剤を用いないと可溶化できないように変化 する。
なお、 ミニプラスミンの K r i n g 1 e 5を除いたミクロプラスミンは、 pH が中性領域において極めて不安定となり、 数分のうちに自己分解により活性が 5 0%以下に減少する。 しかし、 ミニプラスミンは同じ条件下でも数時間は不安定 な活性が保たれている。
3. ヒトミニプラスミンの基質特異性
表 2にヒトミ二プラスミンの基質特性を示す。 種々のトリプシン型プロテア一 ゼの人工基質の中で、 特にプラスミンの人工基質 B o o-G 1 u-Ly s -Ly s— MCAが最も高い切断活性を示した。 次いで、 これまでに報告されているヒ 卜のインフルエンザウイルスに共通して認められている切断部位認識アミノ酸配 列 （切断モチーフ） と同じタイプである G l u (G 1 u) — X— Ar gの配列を 持つ人工基質群に対し、 A r gの後を良く切断した。
しかし、 血液凝固因子の 1つでトリプシン様活性を示す蛋白分解酵素であるフ アクター Xaの人工基質 B o c— I 1 e—G 1 y—A r g— MCAや、 リソゾ一 ム酵素の 1つであるカテブシン Bの人工基質 B z— A r g— MCAには殆ど切断 活性を示さなかった。
4. ヒトミ二プラスミンのインヒビ夕一特異性
表 3にヒトミ二プラスミンのインヒビ夕一特異性を示す。 種々のプロテアーゼ インヒビターの中でゥシの肺に由来するァプロチニン （AproUnine) 、 植物に由 来するクニックタイプソィビーントリプシンィンヒビ夕一 （Kunitz- type soybean trypsin inhibitor) とボウマンバークトリプシンインヒビ夕一 （Bowman-Bi rk trypsin inhibitor) はミニプラスミンのプロテアーゼ活性を強く阻害した。 しか し、 エラス夕一ゼゃトリプシンの活性を阻害するアンチロイコプロテアーゼ (Anti- leukoprotease:別名 MP I、 S L P I ) は殆どミニプラスミンの活性を阻 害しない。 またトリプシンの活性を阻害するべンザミジン （Benzamizine) ゃジィ ソプロピルフルオロフォスフエ一ト （Di isopropyl fluorophosphate) 、 フエニル メチルスルフォニルフルオライド （phenylmethylsulfonyl fluoride) の場合 1 m M〜 1 OmMといった高濃度で強い阻害活性を示した。
5. ヒトミ二プラスミンのィンフルェンザウィルス、 センダイウィルスの活性化 作用
図 3に示すように [3H] ダルコサミンでラベルした非感染型インフルエンザゥ ミニプラスミン （1. 5 /x g) とそれぞれ 37でで 15分、 37 で 60分処理することにより、 インフルエンザウイルスの殆ど全 ての HAは、 HA,と HA2のサブユニットに、 センダイウィルスの F。は約 1Z3 が F ,と F 2のサブュニットに分解された。なおセンダイウィルスに関しては更に 3 時間まで処理を延長することにより全ての F„を F,と F2のサブュニッ卜に分解で きた （図 5) 。
そこで、 ミニプラスミンで処理したインフルエンザウイルスを MDCK細胞に 感染させたときの細胞への感染価 （C I U) を調べた （図 4) 。 具体的には、 非 感染型インフルエンザ A/A i c h i /2/68 (H 3 N 2) 株に種々の濃度の ミニプラスミンを P B S存在下に 37でで 1 5分間処理した後にウィルスを MD CK細胞に感染させ、 感染した細胞数を蛍光標識した抗インフルエンザ AZA i c h i /2/68 (H 3 N 2) 抗体で検出して C I Uを算出した。
その結果、ミニプラスミンの濃度に依存して、著しい感染価の増加が認められ、 10, 4mU/m 1以上でプラト一に達した。 なおここで示したミニプラスミン の活性は人工基質 B 0 c -G 1 u - A 1 a— Ar g— MCAを 1分間に 1 mo 1分解する酵素をもって 1 u n i tとした。
上記結果より、 ヒトミニプラスミンが、 非感染型インフルエンザウイルスゃセ ンダイウィルスを感染型へ変換する活性を有することが分かった。 図面の簡単な説明
図 1は、 ヒトミニプラスミンの SDS— PAGEを示す電気泳動測定結果を示 す。
1 ：分子量マーカー *
2 ： ヒトミニプラスミン （0. 2 y g)
3 ：分子量マーカー *
4 ： ヒトミニプラスミン （0. 2 /z g)
1、 2は非還元下で、 3、 4は還元下で電気泳動を行った後、 銀染色を行った。 *分子量マーカー： rabbi t muscle phosp olase B (97.2kDa),BSA
(66. kDa), ovalmin(45. OkDa), carbonic anhydrase (29. OkDa) , soybean trypsin inhibitor (20. lkDa), lysozyme (14.3kDa) 図 2は、 ヒトプラスミノーゲンとヒトミニプラスミンの 1次構造を示す図であ る。
ヒトのプラスミノ一ゲン （ 1— 7 9 0残基） とミニプラスミン （44 1一 7 9 0残基） を示す。 図 3は、 ミニプラスミンによるインフルエンザ AZA i c h i /2/6 8の H Aとセンダイウィルス F。の限定分解を示す電気泳動測定結果を示す。
1 ： [3H] Glucosamine - labeled Influenza virus A/Aichi/2/68
2 ： [3H] Glucosamine- labeled Influenza virus A/Aichi/2/68+mini-plasmin
(1.5 ig) incubated for 15min. at 37で
3 ： [3H] Glucosamine- labeled Sendai virus
4 ： [3H] Glucosamine - labeled Sendai virus I mini-plasmin(l. g) incubated for 60min. at 37で 図 4は、 非感染型インフルエンザ AZA i c h i /2/6 8 (H 3 N 2) のミ 二プラスミンによる感染型への変換と、 ァプロチニンによる阻害効果を示すグラ フである。
非感染型インフルエンザ A/Aichi/2/68/ (H3N2)を種々の濃度のミニプラスミン (·) で処理するか、 20mU/mlのミニプラスミンに最終濃度 1 Mびァプロチニン (□) を加え、 3 7でで 1 5分間処理した後 MDCK細胞に投与して 1 0時間後 の感染細胞数を蛍光色素 （F I TC) 標識抗インフルエンザ A/Aichi抗体によって 検出した。 図 5は、 [3H] 標識センダイウィルスを基質としたときの精製酵素標品のイン
11/1
差替え用紙 （規則 26) ヒビター特異性を示す電気泳動測定結果を示す。
Final concentration
(P-M)
0 :[3H]標識センダイウィルスのみ
0' : [3H]標識センダイウィルスのみ +精製酵素 *
1 : [3H】標識センダイウィルスのみ +精製酵素 +PMSF ImM
2 ： [3H]標識センダイウィルスのみ +精製酵素 +DFP ImM
3 ： [3H]標識センダイウィルスのみ +精製酵素 +Aprotinin
4 ： 標識センダイウィルスのみ +精製酵素 +Anti-leuko protease \UU 5 ： 標識センダイウィルスのみ +精製酵素 +Leupeptin lUM
6 ： [3H]標識センダイウィルスのみ +精製酵素 +Elas tinal 1 M.
7 ： [3H]標識センダイウィルスのみ +精製酵素 +Benzamidine
8 ： [3H]標識センダイウィルスのみ +精製酵素 +Knitze-type
soybean trypsin inhibitor
9 : 標識センダイウィルスのみ +精製酵素 +0-phenanthlorin lUM 10 :[3H]標識センダイウィルスのみ +精製酵素 +Chymostatin
11/2 差替え用紙 （規則 26) 発明を実施するための最良の形態
参考例 1 ヒトプラスミンからのヒトミニプラスミンの作成
ヒトプラスミン （シグマ社製） lmgとブ夕陴エラスターゼ 3 gを 5 OmM トリスー塩酸緩衝液 （PH8. 0) に溶解し、 3時間 1 5分間まわしながら反応 させた。 反応後、 終濃度 50 となるようにエラス夕チナールを加え、 更に 3 0分まわしながら室温で反応させた。 反応後、 終濃度 5 OmMトリスー塩酸緩衝 液（PH8. 0) /0. 5M N aC l となるように N a C lを含む緩衝液を加え、 14, O O O x gで、 30分遠心レた。 上清をソイビ一ントリプシンインヒビ夕 —セファロ一ス soybean trypsin inhibitor sepharose) 4 Bカラムに力けてミ 二プラスミンを吸着させ、 十分に洗浄した後吸着部分を 5 OmMグリシン一塩酸 緩衝液 （PH2. 8) /0. 5M N a C 1で溶出した。 これをゲルろ過 HPLC カラム （Superdex200:商品名、 アマシャム フアルマシア バイオテク社製） に かけ、 不純物を取り除いた後、 最終標品を得た。
参考例 2 ヒ卜プラスミンからのヒ卜ミニプラスミンの作成
ヒ卜プラスミン （シグマ社製） lmgとヒト顆粒球エラス夕ーゼ 3 gを 50 mMトリスー塩酸緩衝液 （pH8. 0) に溶解し、 3時間 1 5分間まわしながら 反応させた。 反応後、 終濃度 50 Mとなるようにエラス夕チナールを加え、 更 に 30分まわしながら室温で反応させた。 反応後、 終濃度 5 OmMトリスー塩酸 緩衝液 （PH8. 0) /0. 5M N a C 1 となるように N a C 1を含む緩衝液を 加え、 14， 0ひ O x gで、 30分遠心した。 上清をソィビーントリプシンイン ヒヒ夕ーセファロ一ス (soybean trypsin inhibitor sepharose) 4Bカラムにか けてミニプラスミンを吸着させ、 十分に洗浄した後吸着部分を 5 OmMグリシン —塩酸緩衝液 （PH2. 8) /0. 5Μ Na C 1で溶出した。 これをゲルろ過 H PLCカラム （Superdex200:商品名、 アマシャム フアルマシア バイオテク社 製） にかけ、 不純物を取り除いた後、 最終標品を得た。
12
差替え用紙 （規則 26) 実施例 1
始めに [3H]標識センダイウィルスに、参考例 1で得られたミニプラスミン（0. 1 β g) を 37でで 3時間処理したところ、 F。が殆ど全て と F2のサブュニッ 卜に限定分解されたことを確認した （図 5) 。
そこでこの反応系に 1 mMジィソプロピルフルオロフォスフエ一卜
(Diisopropylfluorophosphate) を加え、 37 °Cで 3時間処理した後、 反応系の と F2のサブュニットの存在を以下の方法で確認した。
すなわち、 反応後、 反応液 10 に 3 Lの 3倍に濃縮された電気泳動用サ ンプル緩衝液 （6%SDS、 30%グリセロール、 0. 2Mトリス—塩酸緩衝液、 pH6. 8) を加え、 すみやかに 100°Cで 5分間加熱処理を行なった。 サンプ ルはその後 10— 20 %濃度勾配 S D S _ポリアクリルアミドゲルにかけ、 電気 泳動を行なった。 泳動は 1枚のポリアクリルアミドゲル当たり 30 mAで 2時間 行なった。 電気泳動後、 SD S—ボリアクリルアミドゲルを固定液 （メタノール 50%、 酢酸 50%) 中で 1時間固定した後、 増感液 （Amplify：商品名：アマシ ャム ライフ サイエンス社製） で 20分間処理した。 増感液で処理した SDS —ポリアクリルアミドゲルを加熱乾燥した後、 オートラジオグラフを行なった。 オートラジオグラフは RX— U (商品名：富士写真フィルム社製） を用いて、 3 日間— 80でで被爆した後、 現像定着をして、 F。、 F F2のバンドの検出を行 なった。
その結果、 ほぼ完全に F。から F,と F2への変換を阻止したことが確認され、 ジ ィソプロピルフルオロフォスフエー卜がミニプラスミンの阻害物質であることを 確認した。
実施例 2
実施例 1と同様の反応系に 1 ァプロチニン （Aprotinin) を加え、 37°Cで 3時間処理した後、反応系中の F ,と F 2のサブユニットの存在を実施例 1に記載し た方法で確認した。
その結果、 ほぼ完全に F。から F,と F2への変換を阻止したことが確認され、 ァ プロチニンがミニプラスミンの阻害物質であることを確認した。
13 実施例 3
実施例 1と同様の反応系に 1 ベンザミジン （Benzamidine) を加え、 37 で 3時間処理した後、反応系中の と F2のサブュニッ卜の存在を実施例 1に記載 した方法で確認した。
その結果、 ほぼ完全に F。から F,と F2への変換を阻止したことが確認され、 ベ ンザミジンがミニプラスミンの阻害物質であることが確認された。
実施例 4
実施例 1と同様の反応系に、 1 Mクニックタイプソィビーントリプシンィン ヒビ夕一 （Kunitz- type soybean trypsin inhibitor) を加え、 3 7 °Cで 3時間処 理した後、反応系中の F,と F2のサブュニッ卜の存在を実施例 1に記載した方法で 確認した。
その結果、 ほぼ完全に F„から と F2への変換を阻止したことが確認され、 ク ニックタイプソィビーントリプシンインヒビ夕一がミニプラスミンの阻害物質で あることが確認された。
実施例 5
始めに非感染型インフルエンザ AZA i c h i Z2Z68 (H 3 N 2) 株に、 ミニプラスミン （944mU/mg) の標品を P B S存在下に 37 °Cで 1 5分間 それぞれ （0、 1. 2、 5. 2、 1 0. 4、 52mUZm 1 ) の濃度で処理した 後ウィルスを MD CK細胞に感染させ、 感染した細胞数を蛍光標識した抗インフ ルェンザ AZA i c h i / 2 / 6 8 (H 3 N 2 ) 抗体で検出して感染価 （ C I U) を算出した。 感染価はそれぞれ （0 (検出不能値） 、 1 X 1 06、 1. 3 X 1 07、 7. 5 X 1 07、 9. 6 X 1 07) C I Uを示した。
次に、 この反応系の中でプラト一を示したミニプラスミン （ 1 0. 4mUZm 1 ) に I Mァプロチニン （Aprotinin) を加え、 37 °Cで 1 5分間処理した後、 上記と同様の方法で C I Uを算出した。
その結果、 I Mァプロチニン （AproUnin) を処理することにより、 感染価は 3. 7 X 1 03C I U値を示した。 探索物質の無添加群におけるミニプラスミンに よって活性化されたウィルスの C I U値が 7. 5 X 1 07C I Uであることから、
14 C I Uの値がァプロチニン （Apro t inin) の処理により減少し、 ァプロチニン (Apro t inin) はほぼ完全に非感染型インフルエンザウイルスから感染型のウィル スへの変換を抑制したことが判明した。 産業上の利用可能性
ミニプラスミンをプローブとすることにより、 抗インフルエンザウイルス作用 を有する物質をインビトロで、 効率的に探索することができる。
15

Claims

請求の範囲
1 . ミニプラスミンをプローブとして用いることを特徴とする抗インフルエンザ ウィルス作用を有する物質の探索方法。
2 . ミニプラスミンをプローブとし、 センダイウィルスを基質として被探索物質 と反応させた後、 反応液中のセンダイウィルスのフュージョンプロティン 1サブ ユニット （F i) およびフュージョンプロテイン 2サブユニット （F 2) の量を指標 とすることを特徴とする請求項 1に記載の抗インフルエンザウイルス作用を有す る物質の探索方法。
3 . ミニプラスミンをプローブとし、 インフルエンザウイルスを基質として被探 索物質と反応させた後、 反応液中のインフルエンザウイルスのヘムァグルチニン 1サブユニット （ΗΑ,) およびへムァグルチニン 2サブユニット （Η Α2) の量を 指標とすることを特徴とする請求項 1に記載の抗ィンフルェンザウィルス作用を 有する物質の探索方法。
4 . ミニプラスミンをプローブとし、 センダイウィルスを基質として被探索物質 と反応させた後、 反応後のセンダイウィルスを M D C K細胞に感染させたときの 感染価を指標とすることを特徴とする請求項 1に記載の抗インフルエンザウィル ス作用を有する物質の探索方法。
5 . ミニプラスミンをプローブとし、 インフルエンザウイルスを基質として被探 索物質と反応させた後、 反応後のィンフルェンザウィルスを M D C K細胞に感染 させたときの感染価を指標とすることを特徴とする請求項 1に記載の抗インフル ェンザウィルス作用を有する物質の探索方法。
16
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