WO2001012814A1 - Ml-236b biosynthesis-associated dna - Google Patents

Ml-236b biosynthesis-associated dna Download PDF

Info

Publication number
WO2001012814A1
WO2001012814A1 PCT/JP2000/005420 JP0005420W WO0112814A1 WO 2001012814 A1 WO2001012814 A1 WO 2001012814A1 JP 0005420 W JP0005420 W JP 0005420W WO 0112814 A1 WO0112814 A1 WO 0112814A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
pcr
primer
sequence
nucleotide
seq
Prior art date
Application number
PCT/JP2000/005420
Other languages
French (fr)
Japanese (ja)
Inventor
Yuki Abe
Masahiko Hosobuchi
Hiroji Yoshikawa
Original Assignee
Sankyo Company, Limited
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sankyo Company, Limited filed Critical Sankyo Company, Limited
Priority to AU64758/00A priority Critical patent/AU6475800A/en
Publication of WO2001012814A1 publication Critical patent/WO2001012814A1/en

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria

Definitions

  • the present invention provides a DNA characterized by improving the ML-236B-producing ability of an HMG-CoA reductase inhibitor ML-236B-producing bacterium, a nucleic acid molecule that hybridizes with the DNA, A recombinant DNA vector incorporating the DNA, a host cell transformed with the recombinant DNA vector, a method for producing ML-236B, and a PCR designed based on the nucleotide sequence of the DNA.
  • a DNA characterized by improving the ML-236B-producing ability of an HMG-CoA reductase inhibitor ML-236B-producing bacterium, a nucleic acid molecule that hybridizes with the DNA, A recombinant DNA vector incorporating the DNA, a host cell transformed with the recombinant DNA vector, a method for producing ML-236B, and a PCR designed based on the nucleotide sequence of the DNA.
  • HMG—CoA reductase inhibitor pravastatin which is used clinically as a hyperlipidemia ameliorating agent, uses ML-236B produced by Penicillium citrinum for Streptomyces ′ (Streptomyces carbophilus) by microbial conversion (Endo, A., et al., J. Antibiot., 29, 1346 (1976): Matsuoka, S., et al., Eur. J. Biochem., 184, 707 (1989)).
  • pravastatin precursor ML-236B and the HMG-CoA inhibitor lovastatin which shares a partial structure with pravastatin, have been shown to be biosynthesized via polyketides (Moore, RN, et al.). al., J. Am. Chem. Soc., 107, 3694 (1955): described in Shiao, M. and Don, HS, Proc. Natl. Sci. Counc. ROC., 11, 223 (1987)).
  • Polyketide is a general term for compounds derived from 3-keto carbon chains resulting from the continuous condensation reaction of low molecular weight carboxylic acid residues such as acetic acid, propionic acid, and butyric acid.
  • PKS Polyketide synthase
  • the inventors cloned the gene or gene cluster of the enzyme responsible for ML-236B biosynthesis of Penicillium citrinum from the genomic DNA library of ML-236B-producing bacteria, and obtained It has been found that the productivity of TML-236B in the producing bacterium is improved by transforming the producing bacterium using the recombinant DNA vector thus obtained, and thus the present invention has been completed.
  • the present invention is a.
  • nucleotides represented by nucleotide numbers 1 to 324 of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing A DNA comprising the sequence, wherein the DNA is introduced into a ML-236B-producing bacterium to improve the ML-236B-producing ability of the bacterium;
  • DNA characterized by the following:
  • a method for producing ML-236B comprising culturing the host cell according to (8) or (9), and then recovering ML-236B from the culture.
  • SEQ ID NO: 2 in the sequence listing a sequence consisting of at least 10 bases having 5'-terminal at the adenine at nucleotide number 2304 5 or at the 5'-side thereof. Having PCR primers Al,
  • a primer A2 having at least 70% homology with the nucleotide sequence of the primer A1 for PCR described in (13) and containing a sequence consisting of at least 10 bases (However, the PCR primer A2 has a N-terminal methionine residue coded by the nucleotide numbers 23045 to 23047 of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing. Can be used for PCR to amplify cDNA encoding the peptide) '
  • a primer A3 for PCR having at least 80% homology with the nucleotide sequence of primer A1 for PCR described in (13) and containing a sequence consisting of at least 10 bases
  • the primer A3 for PCR is a polypeptide having a methionine residue encoded by a nucleotide number 23045 to 23047 of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing as an N-terminal. Can be used for PCR to amplify cDNA),
  • a primer A4 for PCR having at least 90% homology with the nucleotide sequence of the primer A1 for PCR according to (13) and containing a sequence consisting of at least 10 bases
  • the primer A4 for PCR is a polypeptide having a methionine residue encoded by the nucleotide number 23045 to 23047 of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing as an N-terminal. Can be used for PCR to amplify the encoding cDNA),
  • SEQ ID NO: 1 consisting of at least 10 bases with the 5'-terminal base of cytosine or 5'-side of the nucleotide number 1479 as the 5'-terminal A primer for PCR having a sequence B1,
  • a PCR primer B2 having at least 70% homology with the nucleotide sequence of the primer for PCR B1 according to (17), comprising a sequence consisting of at least 10 bases
  • the PCR primer B2 encodes a polypeptide having a C-terminal alanine residue encoded by the nucleotide numbers 32720 to 32272 of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing. Can be used for PCR to amplify cDNA
  • a primer B3 for PCR containing a sequence consisting of at least 10 bases and having a homology of 80% or more with the nucleotide sequence of the primer B1 for PCR described in (17).
  • the primer B3 for PCR is a primer having a C-terminal alanine residue encoded by the nucleotide numbers 3227 to 32272 of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing. Can be used for PCR to amplify cDNA encoding the peptide), (20) A PCR primer B4 having at least 90% homology with the nucleotide sequence of the PCR primer B1 according to (17) and containing a sequence consisting of at least 10 bases
  • the PCR primer B4 is a primer having a C-terminal alanine residue coded by nucleotide numbers 32720 to 32272 of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing. Can be used for PCR to amplify cDNA encoding the peptide),
  • PCR primer C1 having
  • a primer for PCR C2 having a homology of 70% or more with the nucleotide sequence of primer C1 for PCR described in (21) and containing a sequence consisting of at least 10 bases
  • the primer C2 for PCR uses a polypeptide having a methionine residue encoded by the nucleotide number 11174 to 11750 of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing as an N-terminal. Can be used for PCR to amplify the cDNA to be encoded),
  • a primer for PCR that has a homology of 80% or more with the nucleotide sequence of the primer C1 for PCR described in (21) and contains a sequence consisting of at least 10 bases C3
  • the primer for PCR is C3; a polymethod having an N-terminal methionine residue encoded by the nucleotide numbers 1 1 7 4 8 to 1 1 7 0 of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing) It can be used for PCR to amplify cDNA that encodes a peptide
  • a primer for PCR that has a homology of 90% or more with the nucleotide sequence of the primer C1 for PCR described in (21) and contains a sequence consisting of at least 10 bases C4
  • PCR primer C4 has a N-terminal methionine residue encoded by the nucleotide numbers 11174 to 11750 of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing. Can be used for PCR to amplify cDNA
  • SEQ ID NO: 1 comprises at least 10 bases, with the thymine of nucleotide number 14432 or the 5'-side base 5'-terminal to the 5'-terminal.
  • a primer for PCR having a sequence D1 is provided.
  • PCR primer D1 having a sequence consisting of at least 10 bases (provided that the primer D2 has a nucleotide number of 198 of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing). 37 to 1983 can be used for PCR to amplify cDNA which encodes a polypeptide having a serine residue at the C-terminus),
  • a primer D3 for PCR that has at least 80% homology with the nucleotide sequence of the primer D1 for PCR described in (25) and contains a sequence consisting of at least 10 bases (provided that The primer D3 for PCR is a polypeptide having a C-terminal serine residue coded by nucleotide numbers 198 337 to 198 39 of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing. Can be used for PCR to amplify cDNA),
  • SEQ ID NO: 1 in the sequence listing a sequence consisting of at least 10 bases having 5'-terminal at the adenine of nucleotide number 11976 or at the 5'-side thereof is referred to as Having a primer for PCR E1,
  • the PCR primer E2 (H) having at least 70% homology with the nucleotide sequence of the PCR primer E1 according to (29) and containing a sequence consisting of at least 10 bases.
  • the PCR primer E2 is a polypeptide having a methionine residue encoded by the nucleotide number 11796 to 11798 of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing as an N-terminal. It can be used for PCR to amplify the encoding cDNA),
  • a primer E3 for PCR that has at least 80% homology with the nucleotide sequence of primer E1 for PCR described in (29) and contains a sequence consisting of at least 10 bases (provided that The PCR primer E3 comprises a polypeptide having a methionine residue encoded by the nucleotide number 11796 to 11798 of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing as an N-terminal. Can be used for PCR to amplify cDNA
  • Primer E4 containing a sequence consisting of at least 10 bases, provided that the primer has a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. Or can be used for PCR to amplify cDNA which encodes a polypeptide having a methionine residue encoded by 117898 as an N-terminus),
  • nucleotide consists of at least 10 bases having a 5'-terminal at the thymine or 5'-side of nucleotide 20723.
  • a PCR primer F2 having at least 70% homology with the nucleotide sequence of the primer F1 for PCR described in (33) and containing a sequence consisting of at least 10 bases (provided that A primer having a C-terminal cysteine residue encoded by the nucleotide numbers 1347 to 13478 of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. Can be used for PCR to amplify the coding cDNA)),
  • the polypeptide having the cysteine residue encoded by the nucleotide number 1347 to 13478 of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing as the C-terminus is encoded.
  • a PCR primer G3 having at least 80% homology with the nucleotide sequence of the primer G1 for PCR described in (37) and containing a sequence consisting of at least 10 bases (provided that A primer G3 for PCR; a polynucleotide having a methionine residue encoded by nucleotide numbers 243211 to 24324 of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing at the N-terminus. Can be used for PCR to amplify the cDNA encoding the peptide),
  • a primer G4 for PCR having at least 90% homology with the nucleotide sequence of the primer G1 for PCR described in (37) and containing a sequence consisting of at least 10 bases (provided that The primer G4 for PCR; encodes a polypeptide having a N-terminal methionine residue encoded by the nucleotide number 2432 21 to 243223 of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. c can be used for PCR to amplify DNA)),
  • SEQ ID NO: 2 in the sequence listing a sequence consisting of at least 10 bases having a thymine having a nucleotide number of 6312 or a 5′-terminal base 5′-terminal to the 5′-terminal Including PCR primer H1,
  • the primer H2 for PCR is a polypeptide having a C-terminal arginine residue encoded by nucleotide numbers 278787 to 27889 of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. Can be used for PCR to amplify the encoding cDNA)
  • the primer H3 for PCR having at least 80% homology with the nucleotide sequence of the primer H1 for PCR described in (41) and containing a sequence consisting of at least 10 bases
  • the primer H3 for PCR is a polypeptide having a C-terminal arginine residue encoded by nucleotide numbers 278787 to 27889 of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. Can be used for PCR to amplify cDNA encoding
  • a primer H4 for PCR having at least 90% homology with the nucleotide sequence of the primer H1 for PCR described in (41) and containing a sequence consisting of at least 10 bases
  • the primer H4 for PCR is the nucleotide number of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
  • No. 278887 to 278889 can be used for PCR to amplify cDNA encoding a polypeptide having a C-terminal arginine residue encoded by arginine residue
  • (45) a sequence consisting of at least 10 bases, with the adenine at nucleotide number 354 5 or the 5'-side nucleotide at the 5'-end thereof as the 5'-terminal in SEQ ID NO: 2 of the sequence listing PCR primers I 1, including
  • a PCR primer I2 having at least 70% homology with the nucleotide sequence of the PCR primer I1 according to (45) and containing a sequence consisting of at least 10 bases (provided that The PCR primer I2 is a cDNA encoding a polypeptide having a methionine residue at the N-terminus, which is encoded by nucleotide numbers 3545 to 3547 of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing. Can be used for PCR to amplify
  • a PCR primer I 3 having at least 80% homology with the nucleotide sequence of the PCR primer I 1 according to (45) and containing a sequence consisting of at least 10 bases (provided that The PCR primer I 3 A cDNA encoding a polypeptide having a N-terminal methionine residue encoded by the nucleotide number 3545 to 3547 of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing Can be used for PCR to amplify
  • the PCR primer I4 (having at least 90% homology with the nucleotide sequence of the PCR primer I1 according to (45) and comprising a sequence consisting of at least 10 bases. However, the PCR primer I4 encodes a polypeptide having the N-terminal methionine residue encoded by the nucleotide numbers 3545 to 3547 of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing. c can be used for PCR to amplify DNA)),
  • SEQ ID NO: 1 consists of at least 10 bases, with the thymine at nucleotide number 28472 or the 5'-side base 5'-terminal to the 5'-terminal, PCR primer J1, including the sequence
  • a primer J2 for PCR that has at least 70% homology with the nucleotide sequence of the primer J1 for PCR described in (49) and contains a sequence consisting of at least 10 bases (provided that The PCR primer J2 is a polypeptide having a C-terminal alanine residue encoded by the nucleotide number 5727 to 5729 of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing.
  • SEQ ID NO: 2 including a sequence consisting of at least 10 bases, with adenine having a nucleotide number of 400 or a 5'-terminal base 5'-terminal to the 5'-terminal PCR primer K1,
  • a primer for PCR K2 which has at least 70% homology with the nucleotide sequence of the primer K1 for PCR described in (53) and contains a sequence consisting of at least 10 bases (provided that CDNA that encodes a polypeptide wherein the PCR primer K2 has a N-terminal methionine residue encoded by nucleotide numbers 400 to 402 of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing Can be used for PCR to amplify
  • a PCR primer K4 having at least 90% homology with the nucleotide sequence of the PCR primer K1 described in (53) and containing a sequence consisting of at least 10 bases (provided that The primer for K4 is a cDN encoding a polypeptide having a methionine residue at the N-terminus, which is encoded by the nucleotide number 400 to 402 of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing.
  • A can be used for PCR to amplify A)
  • Primer for PCR L 1 including
  • the PCR primer L2 encodes a polypeptide having a C-terminal alanine residue encoded by nucleotide numbers 1912 to 1914 of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing. Can be used for PCR to amplify cDNA)
  • c DN A can be used for PCR to amplify A), and.
  • a primer L4 for PCR having at least 90% homology with the nucleotide sequence of the primer L1 for PCR described in (57) and containing a sequence consisting of at least 10 bases (provided that The PCR primer L4 encodes a polypeptide having a C-terminal alanine residue encoded by nucleotide numbers 1912 to 1914 of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing.c DN which can be used for PCR to amplify A).
  • the present invention provides a DNA derived from the genome of the bacterium, which is characterized by improving the ability of the bacterium to produce ML-236B by being introduced into the ML-236B-producing bacterium.
  • ML—236B biosynthesis-related DNA it is referred to as “ML—236B biosynthesis-related DNA.”.
  • the ML-236B-producing bacterium refers to a microorganism having an ML-236B-producing ability innately.
  • ML-236B-producing bacteria include, for example, Penicillium
  • Penicillium including ML-236B-producing bacteria, such as Penicillium citrinum, Penicillium brevicompactum: Brown, AG, et al., J. Chem. Soc. Perkin-1., 1165 (1976)), Penicillium cyclopium: Doss, SL, et al., J. Natl. Prod., 49, 357 (1986)).
  • Penicillium citrinum Penicillium citrinum
  • Penicillium brevicompactum Brown, AG, et al., J. Chem. Soc. Perkin-1., 1165 (1976)
  • Penicillium cyclopium Doss, SL, et al., J. Natl. Prod., 49, 357 (1986)
  • u-nispium-SP M6603 described in Eupenicillium sp. M6603: Endo, A., et al., J.
  • Pacilomyces viridis FERM P-6236 Patent Publication No. 58-98092
  • Pacilomyces viridis FERM P-6236 Pascilomyces viridis FERM P-6236 sp. M2016: Endo, A., et al., J. Antibiot.-Tokyo, 39, 1609 (1986)
  • Trichoderma 'guchi ngibrachiatum M6735 Trichoderma longibrachiatum M6735: Endo, A., et al., J.
  • Trichoderma 'Piride IFO 5836 Trichoderma viride IF05836: Tokushou 62- No. 195, published in Japanese Patent Application Publication No.
  • IFO9022 (Eupenicillium reticulisporum IF09022: described in JP-B-6-19-159).
  • it is Penicillium 'Citrimum, and more preferably, it is Penicillium' Citrimum S ANK13380 strain.
  • L-236B biosynthesis-related DNA is a DNA sequence from a filamentous fungus that is presumed to have a similar function to the genomic DNA library of ML-236B-producing bacteria. It is obtained by performing screening using a probe designed based on the above.
  • the method for preparing the genomic DNA library is not particularly limited as long as it is a method for preparing a genomic DNA library of eukaryotes in general.
  • Mania Fish et al. C03 ⁇ 4 "j3 ⁇ 4 Maniati s, ⁇ ., et al., Molecular cinging, a laboratory manua 1, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989). Listed).
  • the genome DNA of the ML-236B-producing bacterium can be obtained by recovering the cells from the culture of the producing bacterium, physically disrupting the bacterium, and then extracting and purifying the nuclear DNA.
  • the culture of the ML-236B-producing bacteria can be performed under conditions suitable for each ML-236B-producing bacteria.
  • the preferred ML-236B-producing bacterium, Penicillium'citrine was cultured from the slant in which the cells were cultured in an MBG3-8 medium (composition: 7% (w / v) glycerol).
  • the slant is prepared by inoculating the cells and incubating at 22 to 28 ° (for 3 to 7 days while shaking.
  • the slant is prepared by dissolving PGA agar medium (composition: 200 g).
  • the cells of the ML-236B-producing bacteria cultured in a liquid medium are centrifuged, and the cells of the bacteria cultured in a solid medium are scraped off with a cell scraper or the like. Each can be collected.
  • Physical disruption of the cells can be performed by crushing the cells with a mortar and pestle while freezing the cells with liquid nitrogen or the like. Extraction of DNA in the nucleus of the disrupted cells can be carried out using a surfactant such as sodium dodecyl sulfate (sodimuddodecylssulphate: hereinafter referred to as "SDS").
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • the extracted genomic DNA is deproteinized by performing phenol-close-form extraction, and can be recovered as a precipitate by performing ethanol precipitation.
  • the obtained genomic DNA is digested with appropriate restriction enzymes and fragmented.
  • the restriction enzyme used for the restriction digestion is not particularly limited as long as it is a commonly available restriction enzyme, and examples thereof include Sau3AI.
  • Fragmented DN A Is subjected to gel electrophoresis, and DNA is recovered from a gel containing an appropriately sized genomic DNA.
  • the size of the DNA fragment is not particularly limited, but is preferably 20 kb or more.
  • the DNA vector for preparing a genomic DNA library is not particularly limited as long as it has a nucleotide sequence necessary for replication in a host cell transformed with the DNA vector.
  • a plasmid vector First, a phage vector, a cosmid vector, a BAC vector and the like are preferable, and a cosmid vector is preferable. Further, these DNA vectors may be expression vectors.
  • the DNA vector preferably has a base sequence that confers the selectivity of a phenotypic trait (phenotype; Phenotype) to a host cell transformed with the DNA vector.
  • the DNA vector is preferably one that can be used for both cloning and functional expression.
  • the DNA vector it is preferable to use a shuttle vector that can be transformed into a plurality of microorganism groups.
  • the shuttle vector has at least a nucleotide sequence necessary for replication in a host cell of one of the microorganism groups. Further, the shuttle vector preferably has a base sequence that imparts selectivity of a phenotypic trait to a host of a plurality of microorganism groups.
  • the combination of microorganisms transformed by the shuttle vector is not particularly limited as long as one of the microorganisms is applicable for cloning and the other has ML-236B-producing ability.
  • Examples include a combination of a bacterium and a filamentous fungus, a combination of a yeast and a filamentous fungus, and preferably a combination of a bacterium and a filamentous fungus.
  • the bacterium is not particularly limited as long as it is usually used for genetic engineering, and examples thereof include Escherichia coli and Bacillus subtilis. Escherichia coli is preferred, and E. coli X is more preferred. 1-8 1 1 6 ⁇ 11 shares.
  • the yeast is not particularly limited as long as it is usually used for genetic engineering, and examples thereof include Saccharomyces cerevisiae.
  • the filamentous fungi include the ML-236B-producing bacteria described above.
  • the microorganism group is selected from bacteria, filamentous fungi and yeast.
  • Such shuttle vectors include, for example, cosmid vectors having an appropriate phenotypic selectable marker gene and a cos (cos) site, and preferably the Escherichia coli hygromycin B phosphotransferase gene.
  • the plasmid (pSAK333) having the sequence (described in Japanese Patent Application Laid-Open No.
  • Heisei 3-2-264886 contains the cosmid (cos) portion of the cosmid vector pWE15 (manufactured by ST RATAG ENE).
  • P SAK cos 1 created by insertion, but is not limited thereto. The procedure for constructing pSAK cos1 is described in FIG.
  • a desired genomic DNA library is completed by introducing into a host cell a shuttle vector obtained by ligating the above-mentioned genomic DNA fragment of the ML-236B-producing bacterium.
  • Escherichia coli more preferably Escherichia coli XL1-B1ue MR strain, is preferably used as the host cell.
  • the introduction is carried out by invitro packaging.
  • the term “transformation” also refers to the introduction of foreign DNA by invitro packaging, and cells into which exogenous DNA has been introduced by invitro knocking are also included in the meaning of transformed cells.
  • an antibody or a nucleic acid probe is used, and preferably a nucleic acid probe is used.
  • the nucleic acid probe can be prepared based on the nucleotide sequence of a gene related to polyketide biosynthesis of a filamentous fungus. Such genes are not particularly limited as long as their involvement in polyketide biosynthesis has been confirmed and their nucleotide sequences are known. Examples thereof include Aspergillus flavus and Aspergillus flavus. 'Aflatoxin PKS gene of Norasitycus (Aspergillus parasiticus), Aspergillus' stridama tocystin PKS gene of Aspergillus nidulans, and the like.
  • the nucleic acid probe was prepared by synthesizing an oligonucleotide probe consisting of a partial base sequence of genomic DNA based on the above-mentioned known nucleotide sequence, and also preparing an oligonucleotide primer to form the genomic DNA into a ⁇ type.
  • Polymerase chain reaction hereinafter referred to as iPC Rj: Saiki, RK, et al., Science, 239, 487 (1988)
  • iPC Rj Saiki, RK, et al., Science, 239, 487 (1988)
  • cDNA reverse transcriptase
  • reverse transcriptase reverse transcriptase
  • PCR or RT-PCR primer used for PCR
  • PCR primers is preferably designed based on the nucleotide sequence of a polyketide biosynthesis-related gene whose nucleotide sequence is known, preferably Aspergillus flavus or Aspergillus flavus. ⁇ Noreginoles '' Paracitycus
  • a primer for PCR can be designed by reducing an amino acid sequence with high interspecies conservation to a base sequence on the amino acid sequence of any one of these PKSs.
  • a method for reducing an amino acid sequence to a base sequence a method of deriving a single sequence in consideration of the codon usage of the host or a mixed sequence using multiple codons (hereinafter referred to as “mixed sequence”). ⁇ It is called "primer.” In the latter case, the multiplicity can be reduced by including hypoxanthine in the base sequence.
  • the PCR for primer scratch in addition to the nucleotide sequence for ⁇ strand Aniri ring, 5 of the primer '- the ends c its good UNA nucleotide sequence it is possible to adding appropriate nucleotide sequence
  • the primer is not particularly limited as long as the primer can be used for PCR.
  • examples include a base sequence that is convenient for performing a subsequent cloning operation on the PCR product.
  • a restriction enzyme recognition sequence and a base sequence containing the restriction enzyme recognition sequence are exemplified.
  • the sum of the number of guanine bases and the number of cytosine bases is preferably 40 to 60% of the total number of bases.
  • both PCR primers do not easily anneal to each other.
  • the number of bases of the primer for PCR is not particularly limited as long as it can be applied to PCR, but the lower limit of the range is 10 to 14, the upper limit is 40 to 60, and the preferred range is 14 to 60. 40.
  • the primer for PCR is preferably DNA.
  • the nucleosides constituting the primer include deoxyadenosine, deoxycytidine, deoxythymidine, deoxyguanosine, adenosine, cytidine, peridine and guanosine, as well as deoxyinosine and inosine.
  • the 5'-position of the nucleoside located at the 5'-end of the PCR primer is a force that is a hydroxyl group or a state in which monocarboxylic acid is ester-bonded to the hydroxyl group.
  • PCR primers can be synthesized by a method usually used for nucleic acid synthesis, for example, a phosphoramidite method. For such a method, a DNA automatic synthesizer is suitable. Used for
  • Genome DNA of ML-236B-producing bacterium can be used as type II of PCR, and mRNA of ML-236B-producing bacterium can be used as type II of RT-PCR.
  • mRNA of ML-236B-producing bacterium can be used as type II of RT-PCR.
  • all RNAs can be used instead of mRNAs.
  • the PCR product or RT-PCR product can be cloned by incorporating the PCR product or the RT-PCR product into a DNA vector suitable for this.
  • the DNA vector used for the cloning is not particularly limited as long as it is a DNA vector usually used for closing a DNA fragment.
  • kits for easily cloning PCR products or RT-PCR products are commercially available. Such kits include, for example, Original TACI oning Kit (manufactured by Invitrogen: a DNA vector). PCR 2.1 is used.) Is preferably used.
  • the cloned pCR product can be obtained by culturing transformed host cells that have been confirmed to contain the desired PCR product, extracting and purifying plasmid from the cells, and inserting the inserted DNA fragment from the obtained plasmid. It can be done by collecting Culture of the transformed host cells can be performed under conditions suitable for each host cell. Culture of a transformant of Escherichia coli, which is a suitable host cell, is performed in LB medium (l% (w / v) tryptone, 0.5% (w / v) yeast extract, 0.5% (w / v). v) Sodium chloride) at 30 to 37 ° (:, for 18 hours to 2 days).
  • Plasmid is prepared from a culture of a transformed host cell by collecting cells of the host cell and removing genomic DNA and proteins. Preparation of a plasmid from a culture of a transformant of Escherichia coli, which is a suitable host cell, is performed by the Manoleatis method (Maniatis, T., et al., Molecular cloning, a laboratory raanua 1, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)). In addition, kits for obtaining a higher purity plasmid are commercially available. As such a kit, for example, P1asmidMiniKit (manufactured by QIAGEN) is suitably used.
  • a kit for preparing a large amount of plasmid is commercially available.
  • Plasmid MaxiKit manufactured by QIAGEN
  • the purity of the DNA can be calculated from the ratio of the absorbance at the wavelengths of 280 and 260 nm.
  • Labels of nucleic acid probes are broadly classified into radioactive labels and non-radioactive labels.
  • Radionuclides used in radioactive-labeled usually not particularly limited as long as it can be used, for example, 3 2 P, 35 S, 1 4 C and the like can be mentioned, preferably 32 P It is.
  • the reagent used for non-radioactive labeling is not particularly limited as long as it is generally used for labeling nucleic acids. Examples thereof include digoxigenin and biotin, and digoxigenin is preferred.
  • the method of labeling a nucleic acid probe is not particularly limited as long as it is a commonly used method.
  • Examples thereof include a method of incorporating the product into a product using a PC using a labeled substrate, a nick translation method, and a random primer. Method, end labeling method, method of synthesizing oligo DNA using a labeled substrate, etc., and can be appropriately selected from these methods depending on the type of nucleic acid probe, etc. You.
  • the presence of the nucleotide sequence of the nucleic acid probe in the genome of the ML-236B producing bacterium can be confirmed by Southern blot hybridization using the genomic DNA of the producing bacterium.
  • the Southern blot hybridization method was performed according to the method of Mania noted et al. (Maniat 1s, T., et al, Molecular cloning, a laboratory manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)). Described) ⁇ You can do it.
  • the target clone can be screened from the genomic DNA library.
  • the screening method is not particularly limited as long as it is a method usually used for gene cloning, but is preferably a suitable method such as colony 'Niffif', Rita, Isesion method (Maniatis, T. et al. , et al., Molecular cloning, a laboratory manual, 2nd ed., Cod Spring Harbor Laboratory, old Spring Har.bor, NY (1989)) can be used.
  • the culture of colonies used for colonization and hybridization can be performed under conditions suitable for each host cell, and the culture of a transformant of Escherichia coli, which is a suitable host cell, is performed using LB agar medium (1% ( (w / v) tryptone, 0.5% (w / v) distract extract, 0.5% (w / v) sodium chloride, 1.5% (w / v) agaguchi 1)
  • LB agar medium 1% ( (w / v) tryptone, 0.5% (w / v) distract extract, 0.5% (w / v) sodium chloride, 1.5% (w / v) agaguchi 1
  • the above can be carried out by keeping the temperature at 30 to 37 C for 18 hours to 2 days.
  • Preparation of a recombinant DNA vector from a positive clone obtained by colony'hybridization is performed by extracting and purifying plasmid from a culture of the positive clone.
  • the transformed Escherichia coli E. colip ML48 S ANK 711 199 strain obtained as a positive clone obtained in the present invention was produced by the Ministry of International Trade and Industry on July 7, 1999. It was deposited internationally with the Institute of Biotechnology, Industrial Technology Research Institute (Tsukuba East, Ibaraki Prefecture, Japan, Japan, Japan, Japan, Japan), and was assigned the accession number FE RM BP—680.
  • the recombinant DNA vector contained in the E. colip ML48 SANK711 9199 strain was named pML48.
  • the fact that the recombinant DNA vector possessed by the positive clone contains the desired ML-236B biosynthesis-related DNA can be determined by determining the inserted nucleotide sequence of the recombinant DNA vector, Southern blot hybridisation. Can be confirmed by the expression or function expression.
  • the nucleotide sequence of DNA can be determined by the chemical modification method of Maxam-Gilbert (described in Maxiam, AMM and Gilbert, W., Methods in Enzymology, 65, 499 (1980)) or the dideoxynucleotide chain termination method (Messing, J. and Vieira). , J., Gene, 19, 269 (1982)).
  • Maxam-Gilbert described in Maxiam, AMM and Gilbert, W., Methods in Enzymology, 65, 499 (1980)
  • the dideoxynucleotide chain termination method Messing, J. and Vieira.
  • J., Gene, 19, 269 (1982) a sample with higher purity is preferable.
  • the inserted base sequence of pML48 is shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
  • the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing is completely complementary to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • the nucleotide sequence of the genome DNA has a genetic polymorphism (polymorphism: pol'ymorphysm) within the same species.
  • polymorphism pol'ymorphysm
  • the present invention provides an ML-236B biosynthesis-related DNA which hybridizes to a DNA having a nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 1 to 342 of SEQ ID NO: 1 or 2 in the sequence listing, and ML-236B biosynthesis-related DN that hybridizes under stringent conditions to DNA having the nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 1 to 342 of SEQ ID NO: 1 or 2 in the sequence listing A is also included.
  • These DNAs are those in which one or more nucleotide substitutions, deletions, and deletions or additions have occurred in the nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 1 to 342 of SEQ ID NO: 1 or 2 in the sequence listing.
  • hybridization means that two single-stranded nucleic acids form a double-stranded region in a region complementary to each other or in a region having high complementarity.
  • the composition of the hybridization solution is 6 XSSC
  • composition of 1 XSSC is 150 mM NaCl, 15 mM trisodium citrate.
  • the incubation temperature at the time of hybridization is 55 ° C. Review
  • the gene region in the genome DNA sequence can be estimated by using existing gene analysis programs (GeneFinding program (hereinafter referred to as "GRAIL")) and sequence homology search programs (BLASTN and BLASTN). LA STX).
  • GeneFinding program hereinafter referred to as "GRAIL”
  • BLASTN and BLASTN sequence homology search programs
  • LA STX LA STX
  • GRAIL divides the genomic sequence into seven parameters that evaluate the “likeness of the gene sequence,” and integrates the results using a neural net method to generate structural genes on the genome DNA. (Uberbacher, E. & Mural, RJ, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 88, 11261 (1991) fBi), and ApoCom G RA ILT oolkit (APOC OM) ) Is preferably used.
  • BLAST is a program using an algorithm for homology search of nucleic acid sequence and amino acid sequence (described in Altechul, SF, Madden, T., et al., Ucl. Acids Res., 25, 3389 (1997)). .
  • the position and direction of the structural gene on the test DNA sequence can be estimated.
  • the divided genomic DNA sequence is translated into an amino acid sequence according to six translation frames (three in each of a sense sequence and an antisense sequence), and the amino acid sequence is homologous to the peptide database.
  • the position and direction of the structural gene on the DNA sequence to be removed can also be estimated.
  • the coding region of a structural gene contained in a genomic DNA sequence may be interrupted by an intron sequence, and the analysis of a structural gene having such a gap is a gap.
  • BLAST for contained sequences is more effective, and Gapped—BLAST (BLAST2: mounted on WIS CON SIN GC G packagever. 10.0) is preferably used.
  • the total RNA of the ML-236B producing bacterium to be used for the Northern blot can be obtained from a culture of the bacterium.
  • a suitable ML-236B producing bacterium Penicillium citrinum
  • the strain is inoculated from a slant of the bacterium into a MGB3-8 medium, and the bacterium is cultured at a temperature of 22 to 28 ° (: For 1 to 4 days by keeping the temperature while shaking.
  • RNA from ML-236B-producing bacteria is not particularly limited as long as it is a method generally used for preparing total RNA.
  • guanidine 'thiosinate' hot phenol method guanidine-thiosine Monoguanidine ⁇ hydrochloric acid method.
  • kits for preparing higher-purity total RNAs include, for example, RNeasyPlantMiniKit (manufactured by QIAGEN).
  • mRNA can be obtained by adding total RNA to an oligo (dT) column and collecting the fraction adsorbed on the column.
  • Transfer of the RNA to the membrane, preparation of the probe, hybridization, and detection of the signal can be performed in the same manner as in the Southern blot 'hybridization described above.
  • RACE rapidammpliificantionanofcDNAEnds
  • RACE uses mRNA as a type III and converts cDNA containing the region from the base sequence to the 5'-end or 3'-end region where the base sequence has not been determined by RT-PCR.
  • the first strand of cDNA is formed by reverse transcriptase reaction using oligo-DNA (1) on the antisense side, which is designed based on a known portion of the base sequence, with mRNA as type III. After synthesizing, a homopolymeric (homopolymeric: consisting of a single base) nucleotide chain at the 3'-end of the first strand of the cDNA is obtained by terminal deoxynucleotidyl transferase. Is added.
  • the oligo DNA present on the sense side which has the first strand of cDNA as a type II and contains a nucleotide sequence complementary to the homopolymeric nucleotide sequence, and an oligo present on the antisense side.
  • This method amplifies the double-stranded cDNA in the 5'-terminal region by PCR using the oligo DNA (2) present on the 3 'side of the DNA (1) as the primer (Frohman, MA , Methods in Enzymol., 218, 340 (1993)).
  • Kits for 5 'RACE are commercially available. As such a kit, for example, 5' RACLS ystemior Rapid Am pliiicationofc DNA ends, Version 2.0 (manufactured by GIBCO) and the like are preferable. Used for
  • 3 ′ RACE is a method that utilizes the poly A region present at the 3′-end of mRNA. That is, after the cDNA is synthesized as a type I cDNA, the first strand of the cDNA is synthesized by a reverse transcriptase reaction using the oligo d (T) adapter as a primer, and then the first strand of the cDNA is expressed as a type II.
  • the oligo DNA (3) on the sense side designed based on the known portion of the nucleotide sequence and the P'CR with the oligo d (T) adapter on the antisense primer as the primer 3 ' This method amplifies double-stranded cDNA in the terminal region.
  • Kits for 3 'RACE are commercially available. Examples of such kits include: Ready—To—Go—Primed First—Strand Kit (Pharmacia) Is preferably used.
  • the analysis results of the above 1) and 2) can be suitably used for designing a primer based on a known portion of the base sequence in RACE.
  • the direction of the structural gene on the genomic DNA sequence, the position of the transcription start point, the position of the translation start codon, and the translation stop codon in the structural gene And its position can be estimated. Based on this information, each structural gene and its cDNA can be obtained.
  • mlcA, mlcB, mlcC, mlcD, mlcE and m1 c Named R are coding regions on the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing. It was presumed that mlc C and mlc D had a coding region on the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
  • Methods for obtaining cDNA include cloning by RT-PCR using a primer that can be designed based on the above-mentioned information, and cDNA cloning using a DNA probe obtained based on such information. Cloning and the like. In order to express the function of the cDNA obtained by these methods, it is necessary to obtain a full-length cDNA. In addition, in order to obtain cDNA capable of functional expression by RT-PCR, the RT-PCR product contains a translation initiation codon at its original position and is contained in a translation frame initiated by the translation initiation codon. It is essential to design a primer so that it does not contain a translation termination codon other than its original position.
  • PCR primers XI (X is selected from any of A, C, E, G, I and K. A1 is (13), C1 is (21), E1 is (29), G1 is described in (37), I1 is described in (45), K1 is described in (53).) Or PCR primer 1 ( ⁇ is ⁇ , D, F, H, J or L is selected from B, B1 is (17), D1 is (25), F1 is (33), HI is (41), J1 is (49), L1 is
  • the base sequence of the primer for PCR can selectively anneal to the type I strand and can function as a primer for PCR or RT-PCR, it can be completely integrated with a part of the type I strand. Need not be complementary to ⁇
  • PCR primers X2 to X4 (X is selected from any of A, C, E, G, I and K, ⁇ 2 is (14), A3 is (15), ⁇ 4 is ( 1 6), C 2 is (2 2), C 3 is (2 3), C 4 is (24), ⁇ 2 is (30), ⁇ 3 is (3 1), ⁇ 4 (3 2) , G2 is (38), G3 is (39), G4 is (40), I2 is (46), 13 is (47), 14 is (48), K 2 is described in (54), K3 is described in (55)., K4 is described in (56).) X of PCR primers XI (XI and X2 to X4 is the same alpha-base).
  • A1 represents A2 to A4, C1 represents C2 to C4, El represents E2 to E4, G1 represents G2 to G4, and I1 represents a group of bits.
  • I2 to I4, and K1 corresponds to K2 to K4, respectively.
  • PCR primers Y2 to Y4 (Y is selected from any of B, D, F, H, J or L, B2 is (18), B3 is (19), B4 is ( 20), D2 is (26), D3 is (27), D4 is (28), F2 is (34), F3 is (35), F4 is (36) ), H 2 is (4 2), H 3 is (4 3), H 4 is (4 4), J 2 is (50), J 3 is (5 1), J 4 is (5 2), L2 is described in (58), L3 is described in (59), L4 is described in (60).) Y1 of PCR primer Yl (Y1 and Y2 to Y4 is the same) Represents a group of alphabets; B1 is B2 to B4, D1 is D2 to D4, F1 is F2 to F4, HI is H2 to H4, J1 Correspond to J2 to J4, and L1 corresponds to L2 to L4, respectively.) Has a homology of 70% or more, preferably 80% or more. More
  • PCR primers X1 to X4 (X is selected from any one of A, C, E, G, I and K) and PCR primers ⁇ 1 to ⁇ 4 ( ⁇ ⁇ , D, F, H, J, or L) PCR or RT-PCR can be performed using any one of the primers as a primer.
  • the six structural genes (mlc A, mlc B, mlc C, mlc D, m1cE and m1c) were placed on the pML48 insert sequence of the recombinant DNA vector obtained in the present invention.
  • R was estimated.
  • the cDNA of these six structural genes was obtained by combining RT with a reverse transcription reaction and PCR using any one of the PCR primers X1 to X4 and any one of the PCR primers Y1 to Y4. I) It can be obtained by PCR.
  • each of the structural genes uses any one of the primers X1 to X4 for PCR and any one of the primers Y1 to Y4 for PCR as primers to generate the ML-236B-producing bacteria.
  • Genomic DNA can be obtained by PCR using type III.
  • cDNA that is full-length and can be expressed in a suitable host cell
  • a combination of any one of the primers A1 to A4 for PCR and any one of the primers B1 to B4 for PCR is suitably used.
  • any one of PCR primers C1 to C4 and any one of PCR primers D1 to D4 are preferably used. .
  • a combination of any one of the primers E1 to E4 for PCR and any one of the primers F1 to F4 for PCR is suitably used.
  • a combination of any one of the primers G1 to G4 for PCR and any one of the primers HI to H4 for PCR is suitably used.
  • a combination of any one of primers I1 to 14 for PCR and any one of primers J1 to J4 for PCR is preferably used.
  • a combination of any one of primers K1 to K4 for PCR and any one of primers L1 to L4 for PCR is suitably used.
  • primers XI to X4 for PCR have the following requirement (1).
  • PCR primers X1 to X4 are located in the original positions of the PCR products using any one of the PCR primers X1 to X4 and any one of the PCR primers Y1 to Y4 as primers.
  • the translation frame is designed so as to contain a translation initiation codon atg and to include no translation termination codon other than the original position in the translation frame started from the translation initiation codon (see SEQ ID NO: Nucleotide number 1 to 3 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2
  • the position of the translation initiation codon of each structural gene estimated in the present invention in the nucleotide sequence shown in 4203 is described in Table 4).
  • Primer XI for PCR has a 5′-terminal at the a or 5′-side base thereof in the translation initiation codon atg of cDNA.
  • the primers for PCR X2 to X4 are on the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 1 to 324203 or the nucleotide numbers 1 to 34 in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing. Selectively anneals to a specific region on the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 03 (The entire nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing is completely complementary to the entire nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. is there. ) .
  • PCR primers X2 to X4 contain a nucleotide sequence 3 'to the translation initiation codon atg, translation starting from the initiation codon atg on the nucleotide sequence 3' to the translation initiation codon atg
  • the base sequence (taa, tag, or tga) that is a codon in the frame is not included.
  • the translation frame starting from the start codon atg is a sequence consisting of three bases generated when the base sequence 3'-side from the translation start codon atg is divided into three base units from the translation start codon atg. Say.
  • PCR primers X2 to X4 a base or base sequence (“base or base sequence”) corresponding to the translation initiation codon a, & 1 or & 18 (referred to as “base or base sequence m”) at that position.
  • base or base sequence m a base or base sequence corresponding to the translation initiation codon a, & 1 or & 18
  • base or base sequence m a base or base sequence corresponding to the translation initiation codon a, & 1 or & 18
  • the base or base sequence m is atg
  • the base or base sequence m ' is atg
  • a in the atg of the base or base sequence m' is the first and 3 X is counted in the 3'-direction.
  • the nucleotide sequence of the trinucleotide is taa. , Tag or tga.
  • the 3'-end of the PCR primers X2 to X4 is When a is the first nucleotide in the 3 X n + l (n is an integer of 1 or more) counting in the 3′-direction with a being the first, the PCR primers X2 to X4 are used as one of the primers.
  • the 3Xn + 1st The nucleotide sequence of a trinucleotide consisting of a nucleotide and a dinucleotide adjacent to the 3′-side is not taa, tag, or tga.
  • Terminal is 3 X n + 2 (n is 1 RT-PCR product that uses the PCR primers X2 to X4 as one primer and the RNA or mRNA of the ML-236B-producing bacterium as the ⁇ -type nucleotide.
  • n is 1 RT-PCR product that uses the PCR primers X2 to X4 as one primer and the RNA or mRNA of the ML-236B-producing bacterium as the ⁇ -type nucleotide.
  • a trinucleotide consisting of a 3Xn + 2nd nucleotide and two mononucleotides adjacent to its 3′- and 5′-sides
  • the base sequence may not be any of taa, tag and tga.
  • the 3'-end of the PCR primers X2 to X4 is 3Xn + 3 (n is an integer of 1 or more) in the 3'-direction, with a in the translation initiation codon atg as the first.
  • the nucleotide sequence of the trinucleotide consisting of the 3 ⁇ n + 1 to 3 ⁇ n + 3 nucleotides is not any of taa, tag and tga.
  • primers Y1 to Y4 for PCR have the following requirement (3).
  • the PCR primers Y1 to Y4 are prepared by PCR using any one of the PCR primers X1 to X4 and any one of the primers Y1 to Y4 as primers.
  • (Mlc A, mlc B, mlc C, mlc D, mlc E and m1cR) are designed to amplify cDNA encoding the N-terminal to C-terminal of the peptide encoded by it. .
  • the PCR primer Y1 is used for the base sequence near the translation termination region on the cDNA.
  • the primer is not particularly limited as long as it is a PCR primer having a complementary base sequence, but is preferably a base complementary to the 3′-terminal base of the translation termination codon or a base 5 ′ to one side thereof.
  • the positions of the nucleotide sequences represented by the nucleotide numbers 1 to 324 of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing and those represented by the nucleotide sequences represented by the nucleotide numbers 1 to 324 of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing are as follows. , Tables 8-10).
  • the primers for PCR Y 2 to Y 4 are the nucleotide numbers 1 to 3 4 0 on the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 2 in the sequence listing. Selectively anneals to a specific region on the base sequence shown in 3. '
  • a nucleotide sequence should be appropriately added to their 5'-ends.
  • a base sequence is not particularly limited as long as the primer can be used for PCR, and examples thereof include a base sequence that is convenient for performing a subsequent cloning operation on the PCR product. Examples of the sequence include a restriction enzyme recognition sequence and a base sequence containing the restriction enzyme recognition sequence.
  • the design of the primers X1 to X4 for PCR and the primers Y1 to Y4 for PCR are performed in accordance with the above description on the design of the primer for PCR.
  • Functional expression of the recombinant DNA vector possessed by the positive clone should be performed by transforming cells with the recombinant DNA vector and measuring the ML-236B-producing ability of the transformed cells. Can be.
  • the cells that express the function the above-mentioned ML-236B-producing bacteria or ML-236B non-producing bacteria can be used.
  • a cell transformed with the DNA vector is particularly preferable.
  • non-producing mutants of the above-mentioned ML-236B-producing bacteria and the like can be mentioned.
  • the production of ML-236B is restored by transforming the mutant strain, it can be estimated that the recombinant DNA vector has a desired function.
  • a transformation method for expressing the function is appropriately selected depending on the host cell. Transformation of a suitable ML-236B producing bacterium, P. citrinum, is performed by preparing a protoplast from the spores of P. citrinum and adding a recombinant DNA vector to the protoplast. It can be performed by introduction (described in Nara, F., et al., Curr. Genet. 23, 28 (1993)).
  • Protoplasts are prepared as follows.
  • the bacteria are inoculated on a PGA agar plate from the slant in which Penicillium 'citrinum has been cultured, incubated at 22 to 28 ° (for 10 to 14 days), and spores are collected from the plate. and, spores 1 X 1 0 7 to 1 X 1 0 9 pieces of 5 0 to 1 0 0 ml of YPL - 2 0 medium (composition; 0.
  • Germinated spores are collected from the culture and treated with a cell wall degrading enzyme to obtain protoplasts.
  • the cell wall degrading enzyme is not particularly limited as long as it degrades the cell wall of Penicillium citrinum and does not exert a harmful effect on the bacterium. Examples thereof include zymoliase and chitinase. Is mentioned.
  • Culture of the transformed ML-236B-producing bacteria can be carried out under conditions suitable for each host cell, but the preferred ML-236B-producing bacteria, Benicillium citrinum
  • the cell wall is regenerated by culturing the transformed protoplasts under appropriate conditions before producing ML-236B.
  • the cell wall was regenerated by transforming VGS medium agar medium containing the transformed penicillium and citrinum protoplasts (composition: Voge 1 minimal medium, 2% (w / v) dalcose, 1 M glucitol, 2% (w / v) agar) VGS lower layer agar medium (composition: Voge 1 minimal medium, 2% (w / v) glucose, 1M glucitol, 2.7% (w / v) agar ) And VGS upper layer agar medium (composition: Voge 1 minimal medium, 2% (w / v) Darcos, 1M glucitol, 1.5% (w / v) agar), 22 to 2
  • the strain can be subcultured on a PGA medium while keeping the temperature at 22 to 28 ° C.
  • the strain can be subcultured on a PGA medium at a temperature of 22 to 28 ° C.
  • the slant prepared in the medium is inoculated with a platinum loop, kept at 22 to 28 ° ⁇ for 10 to 14 days, and stored at 0 to 4.C.
  • ML-236B Purification of ML-236B from cultures of ML-236B-producing bacteria is accomplished by combining techniques commonly used for the purification of natural products. Examples of the various techniques include, but are not limited to, centrifugation, solid-liquid separation by filtration, alkali or acid treatment, extraction with an organic solvent, phase transfer, adsorption and distribution, and various types of chromatography, crystallization, and the like. No. ML-236B takes the form of both the hydroxy and lactone forms, which are converted to each other, and the hydroxy form forms stable salts.
  • ML-236B hydroxy acid form hereinafter referred to as “free hydroxy acid”
  • ML-236B hydroxy acid salt hereinafter referred to as “free hydroxy acid”
  • hydroxylate a lactone form of ML-236B
  • lactone a lactone form of ML-236B
  • the culture is opened by heating or at room temperature to hydrolyze and hydrolyze to convert to a hydroxylate, the reaction solution is acidified and filtered, and the filtrate is not mixed with water.
  • the target compound By extracting with an organic solvent, the target compound can be obtained as free hydroxy acid.
  • the organic solvent that is immiscible with water is not particularly limited; for example, aliphatic hydrocarbons such as hexane and heptane, aromatic hydrocarbons such as benzene and toluene, methylene chloride, and the like.
  • Halogenated hydrocarbons such as black form, ethers such as getyl ether, ethenolees such as ethyl formate and ethyl acetate, Examples thereof include a mixed solvent of two or more thereof.
  • the target compound can be obtained as a hydroxy acid salt by dissolving the free hydroxy acid in an aqueous solution of an alkali metal salt such as sodium hydroxide.
  • the target compound can be obtained as a lactone by dehydrating the free hydroxy acid by heating in an organic solvent or by closing the ring by another method.
  • the free hydroxy acid, hydroxy acid salt and lactone thus obtained can be purified and isolated by column chromatography or the like.
  • column chromatography or the like.
  • Sephadex LH-20 manufactured by Pharmacia
  • HP-20 manufactured by Mitsubishi Chemical Corporation
  • silica gel examples thereof include silica gel, and a reversed-phase carrier, and a C18-based carrier is preferred.
  • the method for quantifying ML-236B is not particularly limited as long as it is a method usually used for the quantification of organic compounds.
  • reverse-phase HPLC reverse-phase high-performance chromatography
  • cultures of ML-236B-producing bacteria were hydrolyzed with alkali, and the soluble fraction was subjected to reversed-phase HPLC using a C18 column to measure ultraviolet absorption. This can be done by quantifying the absorption.
  • the C18 column is not particularly limited as long as it is a C18 column used for ordinary reversed-phase HPLC.
  • the mobile phase is not particularly limited as long as it is a solvent usually used for reverse phase HPLC.For example, 75% (v / v) methanol-0.1% (v / v) triethylamine-0.1 1% (v / v) acetic acid and the like.
  • adenine is described as “a”
  • guanine is described as “g”
  • thymine is described as “mo”
  • cytosine is described as “c”.
  • the nucleotide sequence shown in each SEQ ID NO in the sequence listing is described in accordance with “Guidelines for Preparation of Specifications and the like Containing Base Sequence or Amino Acid Sequence (published by the Patent Office, June 2010)”.
  • Figure 1 Construction diagram of pSAK cos1, a DNA vector that can be introduced into E. coli and filamentous fungi and can insert a long DNA.
  • Figure 2 Structural gene analysis of the pML48 insertion sequence.
  • Figure 3 Northern blot, hybridization of the pML48 insertion sequence.
  • Plasmid pSAK333 (described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 3-226486) having a hygromycin B phosphotransferase gene derived from Escherichia coli was replaced with a restriction enzyme BamHr (Takara Shuzo Co., Ltd.). ) And blunt-ended with T4 DNA polymerase (Takara Shuzo Co., Ltd.).
  • a strain carrying a plasmid lacking the BamHI site was selected from the transformed Escherichia coli, and the plasmid carried by this strain was transformed into pSAK. It was named 360.
  • pSAK365 was digested with the restriction enzyme PvuII, and then subjected to an alkaline phosphatase treatment, followed by dephosphorylation of the 5 'end.
  • a [Sa1I—Sca.I] fragment (about 3 kb) containing a cosm (cos) site was obtained from the cosmid vector pWEl5 (manufactured by STRATAG ENE), and T4 DNA polymerase was obtained. After blunting the ends, the ligation was carried out at the PVuII site of pSAK365, and the JM109 strain was transformed.
  • pSAKcosl has one restriction site for each of BamHI, EcoRI and NotI derived from pWE15. Also, pSAK cosl has an ampicillin resistance gene and a hidalomycin resistance gene as selection markers.
  • the ANK 13380 strain was inoculated with a platinum loop and kept at 26 ° C for 14S. This slant was stored at 4 ° C.
  • the main culture was performed by liquid aeration culture.
  • the above slant 5 mm square cells A 500 ml Erlenmeyer flask containing ml of MBG3-8 medium was inoculated, and cultured under shaking at 26 ° C and 210 rpm for 5 days.
  • the culture obtained in 1) was centrifuged at room temperature under a condition of 10000 XG for 10 minutes to collect the cells.
  • Cells having a wet weight of 3 g were crushed in a mortar cooled with dry ice until they became powder.
  • 20 ml of 62.5 mM EDTA ⁇ 2Na (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) — 5% (w / v) SDS—50 mM Tris (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
  • the mixture was placed in a centrifuge tube filled with a monohydrochloric acid (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) buffer (pH 8.0), mixed gently, and allowed to stand at 0 ° C. for 1 hour.
  • the restriction enzyme reaction was stopped by adding EDTA ( ⁇ 8.0).
  • the obtained partially digested DNA fragment was separated by agarose gel electrophoresis, and an agarose gel containing a DNA fragment having a size of 30 kb or more was recovered.
  • the collected gel was finely crushed and placed in an Ultrafree C3 centrifugal filtration unit (manufactured by Nippon Miripore Co., Ltd.). — After cooling at 80 ° C for 15 minutes and freezing the gel, it was kept at 37 ° C for 10 minutes to melt the gel. Centrifugation was performed at 5,000 XG for 5 minutes to obtain a DNA extract. The DNA extract was subjected to phenol / chloroform extraction and ethanol precipitation, and the resulting precipitate was dissolved in a small amount of TE.
  • the genomic DNA fragment (2 / g) described in 1) above and the pretreated pSAK cosl (lg) described in 2) above were mixed, and DNA ligationkit Ver. 2 (Takara Shuzo Co., Ltd.) was used.
  • a Reigesion reaction was performed at 16 ° C for 16 hours.
  • the reaction-terminated liquid was subjected to phenol / chloroform extraction and ethanol precipitation, and the resulting precipitate was dissolved in 5 ⁇ l of water.
  • the resulting mixture was subjected to in vitro packaging using the recombinant DNA vector to obtain transformed E. coli containing the recombinant DNA vector.
  • recovery liquid 2 (This is referred to as recovery liquid 2.)
  • a mixture of recovered solutions 1 and 2 with glycerin added to a final concentration of 18% is called Escherichia coli germ fluid, and the genomic DNA library of Penicillium 'Citulinum SANK 13380 strain is used. For storage, it was stored at 180 ° C.
  • Example 4 Amplification of PKS gene fragment by PCR using genomic DNA of Penicillium 'citrinum S ANK13380 as type III
  • n represents the base of inosine (hypoxanthine)
  • y represents t or c
  • s represents g or c
  • k represents g or t
  • r represents Represents g or a
  • w represents a or t, respectively.
  • the primers for PCR (100 pmo 1 each) described in 2) above, the genomic DNA (500 ⁇ g) of the Penicillium 'citrineum S ANK 13380 strain obtained in Example 2, 0.2 mM d ATP, 0.2 mM d CTP, 0.2 mM d GTP, 0.2 mM d TTP, 50 mM potassium chloride, 2 mM magnesium chloride and 1.25 50 ⁇ l of the reaction solution containing the unit of EX.Taq DNA polymerase (Takara Shuzo Co., Ltd.) was added at 94 ° C (1 minute, 58 ° C for 2 minutes, 70 ° C). For 3 minutes at, and subjected to a cycle reaction consisting of three consecutive steps. Thus, the DNA fragment was amplified. PCR was carried out using TaKaRa PCRT herma 1 Cycler MP TP3000 (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.).
  • an agarose gel containing a DNA fragment having a size of about 1.0 to 2.0 kb was recovered.
  • the DNA was recovered from the gel and subjected to phenol / chloroform extraction and ethanol precipitation. The resulting precipitate was dissolved in a small amount of TE.
  • Preparation of a recombinant DNA vector from this culture was performed using the alkaline method (Maniatis, T., et a ⁇ ., Molecular cloning, a laboratory manual, 2nd ed., Co ⁇ d Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)). That is, 1.5 ml of the culture solution was centrifuged at room temperature under a condition of 10000 XG for 2 minutes, and the cells were collected by precipitation.
  • the genomic DNA (10 ⁇ g) of the Penicillium ′ citrinum S ANK 13 380 strain obtained in Example 2 was ligated with the restriction enzymes EcoRI, Sail, and Hindi.
  • Digestion was performed using I I or Sac I (both manufactured by Takara Co., Ltd.) and subjected to agarose gel electrophoresis.
  • Agarose gel was prepared using Agarose L03 "TAKARA" (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.). After the electrophoresis, the gel was immersed in 0.25N hydrochloric acid (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and gently shaken at room temperature for 1 minute. This gel was transferred into 0.4 N sodium hydroxide (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and gently shaken at room temperature for 30 minutes.
  • the PKS gene fragment DNA (1 mg) obtained in Example 4 was labeled with DIGDNA Labeling Kit (manufactured by Boehringer Mannheim), boiled for 10 minutes immediately before use, and quenched.
  • DIGDNA Labeling Kit manufactured by Boehringer Mannheim
  • a hybridization solution DIG Easy Hive: manufactured by Boehringer Mannheim
  • TITEC Multi Shaker 'Oven HB
  • the sample was processed with KitforNucleicAcids (manufactured by Boehringer Mannheim) and exposed to an X-ray film (Noremi Film: manufactured by Behringer Mannheim). Exposure was performed using Fuji Medical Film Processor F PM800A (FujiFi1m).
  • Example 6 Screening of genomic DNA library of Penicillium 'Citrinaum S ANK 133 80 strain using PKS gene fragment as probe
  • the cloning of the genomic DNA containing the PKS gene was performed by the Koguchi 21 hybridization method.
  • Escherichia coli bacterial fluid (described in Example 3) stored as a genomic DNA library of Penicillium 'Citulinum SA NK13380 strain was added to a plate of LB agar medium. 5,000 to 10,000 colonies were diluted and scattered so as to grow. The plate was kept at 26 ° C for 18 hours and then cooled at 4 ° C for 1 hour. Hybond TM — N + (Amersham) was placed on the plate and indirectly contacted for 1 minute. Carefully separate the membrane with the colonies from the plate and place 200 ml of 1.5 M sodium chloride—0.5N with the column contact side up.
  • the PKS gene fragment DNA (1 ⁇ g) obtained in Example 4 was labeled with DIG DNA Labeling Kit (manufactured by Behringer Mannheim), and after boiling for 10 minutes immediately before use The quenched one was used.
  • the membrane described in 1) is immersed in a hybridization solution (DIG Easy Hive: manufactured by Behringer Mannheim), and prehybridization is performed at 42 ° C for 2 hours while shaking at 20 rpm. After that, the above-mentioned labeled probe is added to the hybridization solution, and hybridization is performed at 42 ° C for 18 hours while shaking at 20 rpm using a multi-shaker Oven HB (manufactured by AITEC). Was performed.
  • the membrane subjected to hybridization was washed three times with 2 XSSC at room temperature for 20 minutes, and washed with 0.1 XSSC at 68 ° (: twice for 30 minutes. Each was done.
  • the sample was processed with KitforNucleiccAcids (manufactured by Boehringer Mannheim) and exposed to an X-ray film (Noremi film: manufactured by Behringer Mannheim). Exposure was performed using Fuji Medical Film Processor F PM800A (FujiFi1m).
  • a clone in which a positive signal was detected in the first screening was scraped around the colony, suspended in LB medium, diluted appropriately, and spread on a plate, followed by culture in the same manner. was screened to purify the positive clones.
  • Example 6 The cultivation of the E.co1ipML48SANK71199 strain obtained in Example 6 and the preparation of a recombinant DNA vector from the culture were performed according to the method described in Example 4.
  • the obtained recombinant DNA vector was designated as pML48.
  • the pML48 insertion sequence was subcloned by digesting with various restriction enzymes and incorporating it into pUC119 (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.). Using the obtained subclone as a probe, Southern plot hybridization was carried out according to the method described in Example 5. That is, the various restriction enzyme digests of pML48 were subjected to electrophoresis, and the DNA was transferred to the membrane, and hybridization was performed.
  • nucleotide sequence of the inserted sequence of each of the above-mentioned subclones was determined using a DNA Sequencer-1 model 377 (manufactured by Perkin-Elma Japan KK), and the entire nucleotide sequence of pML48 was determined.
  • the inserted sequence of pML48 was a total of 342 003 bases.
  • the base sequence of the inserted sequence of PML48 is described in SEQ ID NOs: 1 and 2 in the sequence listing.
  • the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 1 and 2 in the sequence listing are completely complementary to each other.
  • mlc A, mlc B, mlc C, mlc D, mlc E and mlc R are In the nucleotide sequence described in SEQ ID No. 2 in the sequence listing, it is presumed that m1cC and m1cD each have a code region in the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO. 1 in the sequence listing. It was done. Further, the relative position and size of each putative structural gene in the inserted sequence were estimated.
  • Penicillium citrineum S ANK 1 330 The strain of 5 mm square from the slant (described in Example 2) was cultured in 100 ml of 100 ml of MGB3-8 medium. The mixture was inoculated into a 1-volume Erlenmeyer flask and cultured with shaking at 26 ° C for 3 days.
  • RNA from the culture was carried out using RNeasyPlAntMiniKit (manufactured by Qiagen) utilizing the panidine-isothiocane method. That is, the culture was centrifuged at room temperature under the condition of 5,000 XG for 10 minutes to collect the cells, and the cells with a wet weight of 2 g were frozen with liquid nitrogen and then placed in a mortar. Crushed to a powder. This crushed product was suspended in 4 ml of a cell lysis buffer (included in this kit) containing guanidine / isothiothionate.
  • RNA sample was used for 65. After keeping the mixture at C for 10 minutes, it was rapidly cooled in ice water and subjected to agarose gel electrophoresis.
  • the electrophoresis gel was prepared by combining 10 ml of 10 XMOPS and 1 g of Agarose L03 “TAKA RA” (Takara Shuzo Co., Ltd.) with 72 ml of Pyro-Kyoroné Bonic's acid gel. It was prepared by mixing chill ester (manufactured by Sigma) with treated water, heating to dissolve the agarose, cooling, and adding 18 ml of formaldehyde. As a sample buffer, 1 XMO PS (10 X MO PS diluted 10-fold with water) was used. The RNA in the gel was transferred to Hybond TM —N + (Amersham) in 10 XSSC.
  • DNA fragments (a, b, c, d and e) obtained by digesting the pML48 insertion sequence with restriction enzymes 1 and 2 shown in Table 1 below were used as probes.
  • restriction enzyme recognition site Restriction of restriction enzyme recognition site Restriction of restriction enzyme recognition site — _ enzyme Nucleotide number * Enzyme 2 Nucleotide number * a. EcoRI 6319— 6324 EcoRI 15799 to 15804
  • Each nucleotide number is based on SEQ ID No. 1 in the sequence listing. Probe labeling, hybridization and signal detection were performed according to the Southern blot hybridization of Example 5. FIG. 3 shows the results of this example.
  • Each signal indicates the presence of a transcript homologous to the nucleotide sequence of each probe.
  • mlcB, mlcD, mlcE and m1cR were:
  • each signal does not indicate the relative size of the transcript.
  • Table 2 shows the nucleotide sequence of the oligosense DNA (1) on the antisense side designed based on the nucleotide sequence located on the 3'-side of each structural gene.
  • the nucleotide sequence of oligo-DNA (2) on the antisense side designed based on the nucleotide sequence located at (1) is described.
  • Table 2. Oligo DNA (1) gene used for 5'-terminal sequence analysis by 5 'R ACE SEQ ID NO in the Sequence Listing: Base sequence _
  • mlcE Sti system number 15 ggaaggcaaagaaagtgtac
  • mlcR C column number 1: agattcattgctgttggcatc oligo DNA (1) was used as the primer, and penicillium.
  • the chain was synthesized. That is, the 24 // 1 reaction mixture containing l ⁇ g of total RNA, 2.5 pmol of oligo DNA (1), and 1 ⁇ l of SUPERSCRIPT TM II reversetranscriptase (included in this kit) was After incubating at 16 ° C for 1 hour, the product was added to the GLAS SMAX spin cartridge contained in this kit to purify the cDNA first strand.
  • the tertiary chain C was added to the terminaldeleoxyrivibonuc1eottidy1transsieraisasei contained in this kit.
  • 3 ' Contains the first strand of cDNA with a poly C chain added at the end, 40 pmo 1 of oligo DNA (2) and 40 pmol of Bridged Anchor Primer (included in this kit) Incubate 50 ⁇ l of the reaction solution at 94 ° C for 2 minutes, then continue at 94 ° C for 30 seconds, 55 ° C for 30 seconds, and 72 ° C. The reaction was performed 35 times for 2 minutes in a cycle of 2 minutes, and then incubated at 72 ° C for 5 minutes and at 4 ° C for 18 hours.
  • the nucleotide sequence of the cDNA fragment containing the 5 'end was determined, and the positions of the transcription start point and the translation start codon were estimated.
  • Table 4 shows the sequence numbers of the sequence listings describing the base sequence of the 5'-terminal cDNA fragment corresponding to each structural gene obtained by 5 'RACE.
  • Table 5 shows the transcription start point of each structural gene, the sequence number where translation starts, the position of transcription start point, and the position of translation start point.
  • Table 4 SEQ ID No. in the sequence listing showing the nucleotide sequence of each 5'-terminal cDNA fragment
  • the nucleotide sequence of the 3′-side fragment of the obtained cDNA was determined, and the position of the translation termination codon was estimated.
  • Table 7 summarizes the sequence numbers of the sequence listings describing the base sequence of the 3′-terminal cDNA fragment corresponding to each structural gene obtained by 3 ′ RACE. Also, in Table 8, the translation termination codon of each structural gene and the position of the codon are described based on SEQ ID NO: 1 or 2 in the sequence listing. Table 7. Sequence number in the sequence listing showing the nucleotide sequence of each 3'-terminal c DNA fragment
  • Residue C-terminal The amino acid is transferred to the trinucleotide SEQ ID NO: 1 or 2.
  • the trinucleotide in the presence of the trinucleotide is present.
  • Penicillium 'citrinum Transformation of Penicillium 'citrinum was performed according to the method of Nara et al. (Described in Nara, F., et al., Curr. Genet. 23, 28 (1993)).
  • a PGA agar medium was inoculated with a platinum loop from a slant obtained by cultivating Penicillium citrinum S ANK 133 0 8 strain, and incubated at 26 ° C for 14 days. Spores of 1 3 3 8 0 shares the culture by repeller Nishiri um 'citrate Rinamu SANK were collected and IX 1 0 8 spores were inoculated into YPL- 2 0 medium 8 0 ml, the 2 6 ° C For one day.
  • the germinated spores were centrifuged at room temperature under the condition of 500.times.XG for 10 minutes, and the spores were collected as a precipitate. The spores were washed three times with sterile water, and then protoplasted. That is, 200 mg of Zymoryase 20 T (manufactured by Seikagaku Corporation) and 100 mg of chitinase (Sig was dissolved in 10 ml of 0.5M magnesium chloride, and centrifuged at room temperature under the condition of 500 XG for 10 minutes.
  • m 1 Enzyme solution and 0.5 g wet weight of germinated spores were placed in a 100-ml Erlenmeyer flask and gently shaken at 30 ° C for 60 minutes to form protoplasts. After confirmation by microscopic observation, the reaction solution was filtered through a 3G-2 glass filter (manufactured by HARIO). The filtrate was centrifuged at room temperature under a condition of 1000 XG for 10 minutes, and the protoplast was collected as a precipitate.
  • the protoplast obtained in 1) was washed twice with 30 ml of 0.5 M magnesium chloride solution, and 30 ml of 0.5 M magnesium chloride- 50 mM calcium chloride 10 mM 3-methylene chloride solution. Wash once with morpholinopropanesulfonic acid ( ⁇ ⁇ 6.3: hereafter referred to as “ ⁇ CM solution”), and add 100% of 4/1 (w / v) polyethylene glycol 800-10 mM 3-morpholinopropanesulfonic acid-0.025% (w / v) heparin (manufactured by Sigma)-50 mM Shiridani Magnesium
  • transformation solution (pH 6.3: hereinafter, referred to as “transformation solution”). About 5 X 1 0 7 single mixing 1 0 mu 1 of TE containing pro Topurasu transformation of 9 6 beta 1 including bets solution ⁇ Pi 1 2 0 / xg pML 4 8 DNA in ice for 3 0 minutes It was left still. To this was added 1.2 ml of 20% (w / v) polyethylene glycol-50 mM magnesium chloride-10 mM 3-morpholinopropanesulfonic acid (pH 6.3), and the mixture was moderately diluted. This was pipetted and allowed to stand at room temperature for 20 minutes. To this, 10 ml of an MCM solution was added, mixed gently, and centrifuged at room temperature under a condition of 1000 XG for 10 minutes. Transformation protoplasts were recovered from the precipitate.
  • the transformation protoplast obtained in 2) was suspended in 5 ml of a liquid VGS medium agar medium, and layered on a solidified 10 ml VGS lower agar medium plate. After culturing the plate at 26 ° C for 1 day, 10 ml of liquid VGS upper agar containing 5 mg of hygromycin B (Sigma) per plate was used. The medium was overlaid (final concentration of hygromycin B was 200 ⁇ g Z ml). The strain obtained by incubation at 26 ° C for 14 days was subcultured on PGA agar medium containing SOO / igZml of hygromycin B, and then inoculated on the slant prepared on PGA agar medium. And incubated at 26 ° C for 14 days.
  • Test Example 1 Comparison of ML-236B production ability of transformed strain and parent strain
  • Example 9 The transformed strain obtained in Example 9 and the parent strain Penicillium 'citrinum S ANK 13380 strain were cultured, and the amount of ML-236B in the culture was measured.
  • a 5 mm square cell from the slant (described in Example 9) in which the transformed strain was cultured (described in Example 9) or the slant (in Example 2) in which the penicillium 'citrine S ANK 13380 strain was cultured was added to 1O. After inoculating a 10 O m1 Erlenmeyer flask containing m1 MBG3-8 medium and culturing with shaking at 26 ° C for 2 days, 50% of 3.5 m1 ( (w / v) Dalyceline solution was added, and the cells were further cultured with shaking at 26 ° C for 10 days.
  • the HPLC column used was SSC-ODS-262 (diameter 6 mm, length 100 mm: manufactured by Sensyu Kagaku Co., Ltd.), and the mobile phase was 75% (v / v) methanol 0.1% (v / v) triethylamine—eluted with 0.1% (v / v) acetic acid at room temperature at a flow rate of 2 ml / min. Under these conditions, ML-236B was eluted 4.0 minutes after column loading. Detection was carried out by setting the absorption wavelength of the UV detector to 236 nm, and among the c- transformed strains, 5 strains with improved ML236B-producing ability were obtained. On average 12% higher.
  • the DNA obtained from the ML-236B-producing bacterium improves the ML-236B-producing ability of the producing bacterium by being introduced into the producing bacterium.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

A DNA which has been cloned from a genomic DNA library of an ML-236B producing microorganism and is characterized by being capable of improving the ML-236B productivity of this strain when transferred thereinto, etc. When transferred into the ML-236B producing strain, the above DNA improves the ML-236B productivity of this strain.

Description

明細書  Specification
M L - 2 3 6 B生合成関連 D N A  M L-2 3 6 B Biosynthesis-related D N A
「技術分野」 "Technical field"
本発明は、 HMG— C o A還元酵素阻害剤 ML - 2 3 6 B生産菌の ML - 2 3 6 B生産能を改善することを特徴とする D NA、 該 DNAとハイプリ ダイズする 核酸分子、 該 DNAを組み込んだ組換え DNAベクタ一、 該組換え DNAベクタ 一で形質転換された宿主細胞、 ML— 2 3 6 Bの製造法、 該 DNA上.の塩基配列 に基いて設計された P C R用プライマー等に関する。  The present invention provides a DNA characterized by improving the ML-236B-producing ability of an HMG-CoA reductase inhibitor ML-236B-producing bacterium, a nucleic acid molecule that hybridizes with the DNA, A recombinant DNA vector incorporating the DNA, a host cell transformed with the recombinant DNA vector, a method for producing ML-236B, and a PCR designed based on the nucleotide sequence of the DNA. Related to primers and the like.
「背景技術」 "Background technology"
高脂血症改善薬として臨床において使用されている HMG— C o A還元酵素阻 害剤プラバスタチンは、 ぺニシリ ゥム · シ ト リナムが生産する ML— 2 3 6 Bを ス ト レプトミセス ' 力ノレボフィラス （Streptomyces carbophilus) により微生 物変換することにより得られる （Endo,A. ,et al. , J. Antibiot. , 29, 1346 (197 6) ： Matsuoka, S. , et al.， Eur. J. Biochem. , 184, 707 (1989)記載） 。  HMG—CoA reductase inhibitor pravastatin, which is used clinically as a hyperlipidemia ameliorating agent, uses ML-236B produced by Penicillium citrinum for Streptomyces ′ (Streptomyces carbophilus) by microbial conversion (Endo, A., et al., J. Antibiot., 29, 1346 (1976): Matsuoka, S., et al., Eur. J. Biochem., 184, 707 (1989)).
プラバスタチンの前駆体 ML— 2 3 6 B、 及び、 プラバスタチンと部分構造を 共有する HMG— C o A阻害剤ロバスタチンは、 ともにポリケチドを経て生合成 されることが示されている （Moore, R. N. , et al.， J. Am. Chem. Soc. , 107， 3694(198 5) ： Shiao, M. and Don, H. S. , Proc. Natl. Sci. Counc. ROC.， 11, 223 (1987)記載） 。 ポリケチドとは、 酢酸、 プロピオン酸、 酪酸などの低分子カルボン酸残基の連 続的な縮合反応から生じる ]3—ケト炭素鎖から導かれる化合物の総称であり、 各 ケトカルボニル基の縮合 ' 還元様式により、 多様な構造が導かれる （Hopwoo d, D. A. and Sherman, D. H. , Annu. Rev. Genet. , 24, 37-66(1990) ： Hutchinson, C. R. and Fuji i, I., Annu. Rev. Genet. , 49, 2(U - 238 (1995)記載） 0 Both the pravastatin precursor ML-236B and the HMG-CoA inhibitor lovastatin, which shares a partial structure with pravastatin, have been shown to be biosynthesized via polyketides (Moore, RN, et al.). al., J. Am. Chem. Soc., 107, 3694 (1955): described in Shiao, M. and Don, HS, Proc. Natl. Sci. Counc. ROC., 11, 223 (1987)). Polyketide is a general term for compounds derived from 3-keto carbon chains resulting from the continuous condensation reaction of low molecular weight carboxylic acid residues such as acetic acid, propionic acid, and butyric acid. A variety of structures are derived by the style (Hopwoo d, DA and Sherman, DH, Annu. Rev. Genet., 24, 37-66 (1990): Hutchinson, CR and Fujii, I., Annu. Rev. Genet. , 49, 2 (described in U-238 (1995)) 0
ポリケチドの合成を担うポリケチド · シンターゼ （P o l y k e t i d e S y n t h a s e : 以下、 「P K S」 とレ、う。 ） は糸状菌ゃ細菌の有する酵素であ ることが知られており、 糸状菌では該酵素の分子生物学的研究がなされている (Feng, G. H. and し eonard, T. J. , J. Bacter iol.， 177, 6246 (1995) ： Takano, Y. , et a 1. Mol. Gen. Genet.249, 162 (1995)記載） 。 ロバスタチン生産菌であるァスぺノレギ ノレス ' テレウス （Aspergillus terreus) については、 ト リオ—ノレ P K S遺伝子 の解析がなされている （特表平 9— 5 0 4 4 3 6号公報記載） 。 Polyketide synthase (PKS), which is responsible for polyketide synthesis, is known to be an enzyme possessed by filamentous fungi and bacteria. Biological research is being done (Feng, GH and Shionard, TJ, J. Bacteriol., 177, 6246 (1995): Takano, Y., et al 1. Mol. Gen. Genet. 249, 162 (1995)). Aspergillus terreus, a lovastatin-producing bacterium, has been analyzed for the Trio-Nore PKS gene (described in Japanese Patent Publication No. 9-504443).
ところで、 糸状菌の二次代謝産物の生合成関連遺伝子は、 ゲノム上でクラスタ —を形成していることが少なくない。 ポリ ケチドの生合成系にて、 該系に関与す る遺伝子クラスタ一の存在が知られている。 ァスペルギルス ' フラヴァス （Aspe rgi 1 lus f lavus) 、 ァスぺノレ ノレス · ノヽフシティカス (Aspergillus parasitic us) の生産するポリケチドであるアフラ トキシンの生合成では、 P K Sその他ポ リケチドの生合成に関与する酵素蛋白質をコードする遺伝子がクラスタ一構造を 形成していることが知られており、 両菌のアフラ トキシン生合成関連遺伝子のゲ ノム比較解析が行なわれている （Yu, J. , et al, Appl. Environ. Microbiol. , 61, 23 65 (1995)記載） 。 ァスぺノレギルス . ニジュランス （Aspergillus nidulans) の 生産するステリ グマ トシスチンの生合成においては、 生合成関連遺伝子が、 ゲノ ム上の連続する約 6 0 k bの領域においてクラスター構造を形成していることが 報告されている (Brown, D. W. , et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 1418 (1996) 記載） 。  By the way, genes related to biosynthesis of secondary metabolites of filamentous fungi often form clusters on the genome. In a polyketide biosynthesis system, the existence of a gene cluster involved in the system is known. In the biosynthesis of aflatoxin, which is a polyketide produced by Aspergillus' flavas (Aspergillus lulav flavus) and Aspernole noles novif ヽ cicus (Aspergillus parasitic us), PKS and other enzymatic proteins involved in poliketide biosynthesis Is known to form a cluster-like structure, and genomic comparative analysis of aflatoxin biosynthesis-related genes of both bacteria has been conducted (Yu, J., et al, Appl. Environ. Microbiol., 61, 2365 (1995)). In the biosynthesis of sterigmatocystin produced by Aspergillus nidulans, biosynthesis-related genes form a cluster structure in a continuous region of about 60 kb on the genome. It has been reported (Brown, DW, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 1418 (1996)).
ML - 2 3 6 B生合成に関する分子生物学的研究は、 現在まで十分にはなされ ていなかった。  To date, molecular biological studies on ML-236B biosynthesis have not been adequately performed.
「発明の開示」 "Disclosure of the invention"
発明者らは、 ぺニシリ ゥム · シト リナムの ML— 2 3 6 B生合成を担う酵素 の遺伝子又は遺伝子クラスターを、 ML— 2 3 6 B生産菌のゲノム D N Aライブ ラリーよりクローニングし、 得られた組換え DN Aベクタ一を用いて該生産菌を 形質転換することによ り、 該生産菌におい TML— 2 3 6 Bの生産性が改善され ることを見出し、 本発明を完成した。  The inventors cloned the gene or gene cluster of the enzyme responsible for ML-236B biosynthesis of Penicillium citrinum from the genomic DNA library of ML-236B-producing bacteria, and obtained It has been found that the productivity of TML-236B in the producing bacterium is improved by transforming the producing bacterium using the recombinant DNA vector thus obtained, and thus the present invention has been completed.
本発明は、  The present invention
( 1 ) 配列表の配列番号 1のヌク レオチ ド番号 1乃至 3 4 2 0 3で示される塩基 配列を含むことカゝらなり、 ML— 2 3 6 B生産菌内に導入されることによ り該菌 の M L— 2 3 6 B生産能を改善することを特徴とする D N A、 (1) nucleotides represented by nucleotide numbers 1 to 324 of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing A DNA comprising the sequence, wherein the DNA is introduced into a ML-236B-producing bacterium to improve the ML-236B-producing ability of the bacterium;
( 2 ) 形質転換大腸菌 E. c o 1 i p ML 4 8 S ANK 7 1 1 9 9株 （F E RM B P— 6 7 8 0 ) より得ることができる、 （ 1 ) 記載の DNA、  (2) The DNA according to (1), which can be obtained from the transformed E. coli E.co1ip ML48S ANK71119 (strain FERMBP-670).
( 3 ) ( 1 ) 又は （ 2 ) 記載の DNAとハイブリ ダィズし、 ML— 2 3 6 B生産 菌内に導入されることによ り該菌の ML - 2 3 6 B生産能を改善することを特徴 とする D N A、  (3) To improve the ML-236B-producing ability of the microorganism by hybridizing with the DNA described in (1) or (2) and being introduced into the ML-236B-producing microorganism. DNA characterized by the following:
(4 ) ( 1 ) 又は （ 2 ) 記載の D N Aとス トリ ンジェントな条件下でハイブリ ダ ィズし、 ML— 2 3 6 B生産菌内に導入されることによ り該菌の ML— 2 3 6 B 生産能を改善することを特徴とする DNA、  (4) The DNA described in (1) or (2) is hybridized under stringent conditions and introduced into an ML-236B-producing bacterium, whereby the ML- 3 6 B DNA, characterized by improving productivity
( 5 ) ( 1 ) 乃至 （4 ) のいずれか一つに記載の DNAを含む組換え DNAべク  (5) A recombinant DNA vector containing the DNA according to any one of (1) to (4).
(6 ) 形質転換大腸菌 E. c o 1 i p ML 4 8 S ANK 7 1 1 9 9株 （F E RM B P— 6 7 8 0 ) に保持される、 （ 5 ) 記載の組換え D N Aベクタ一、(6) the recombinant DNA vector according to (5), which is maintained in the transformed E. coli E.co1ip ML48 SANK 711 199 strain (FERMBP-680)
( 7 ) ( 5) 又は （6 ) 記載の組換え DN Aベクタ一で形質転換された宿主細胞、(7) a host cell transformed with the recombinant DNA vector according to (5) or (6),
(8 ) ML— 2 3 6 B生産菌であることを特徴とする （ 7 ) 記載の宿主細胞、(8) the host cell according to (7), which is a ML-236B-producing bacterium;
( 9 ) ぺニシリ ウム ' シト リナム （Penicillium citrinum) であることを特徴 とする、 （8 ) 記載の宿主細胞、 (9) The host cell according to (8), which is Penicillium citrinum.
( 1 0 ) (8 ) 又は （ 9 ) 記載の宿主細胞を培養し、 次いで該培養物から ML— 2 3 6 Bを回収することを特徴とする、 ML— 2 3 6 Bの製造法、  (10) A method for producing ML-236B, comprising culturing the host cell according to (8) or (9), and then recovering ML-236B from the culture.
( 1 1 ) 大腸菌であることを特徴とする、 （ 7 ) 記載の宿主細胞、  (11) the host cell of (7), which is Escherichia coli;
( 1 2) 形質転換大腸菌 E. c o l i p M L 4 8 S ANK 7 1 1 9 9 ( F E RM B P— 6 7 8 0 ) である、 （ 1 1 ) 記載の宿主細胞、  (12) The host cell according to (11), which is a transformed E. coli E. coli ip M L 48 S ANK 711 9 9 (F ERM BP—6780).
( 1 3 ) 配列表の配列番号 2において、 ヌク レオチド番号 2 3 0 4 5のアデニン 又はそれより 5 ' —側の塩基を 5 ' —末端とする、 少なく とも 1 0個の塩基から なる配列を有する P C R用プライマー A l、  (13) In SEQ ID NO: 2 in the sequence listing, a sequence consisting of at least 10 bases having 5'-terminal at the adenine at nucleotide number 2304 5 or at the 5'-side thereof. Having PCR primers Al,
( 1 4) ( 1 3 ) 記載の P C R用プライマー A 1の塩基配列と 7 0 %以上の相同 性を有し、 少なく とも 1 0個の塩基からなる配列を含む P C R用プライマー A 2 (但し、 該 P C R用プライマー A 2は、 配列表の配列番号 2のヌク レオチド番 号 2 3 0 4 5乃至 2 3 0 4 7によ り コー ドされるメチォニン残基を N末端とする ポリぺプチドをコ一ドする c DN Aを増幅させるための P C Rに用いられ得る） '(14) A primer A2 having at least 70% homology with the nucleotide sequence of the primer A1 for PCR described in (13) and containing a sequence consisting of at least 10 bases (However, the PCR primer A2 has a N-terminal methionine residue coded by the nucleotide numbers 23045 to 23047 of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing. Can be used for PCR to amplify cDNA encoding the peptide) '
( 1 5) ( 1 3 ) 記載の P C R用プライマ一 A 1の塩基配列と 8 0 %以上の相同 性を有し、 少なく とも 1 0個の塩基からなる配列を含む P C R用プライマー A 3(15) A primer A3 for PCR having at least 80% homology with the nucleotide sequence of primer A1 for PCR described in (13) and containing a sequence consisting of at least 10 bases
(但し、 該 P C R用プライマ一 A 3は、 配列表の配列番号 2のヌク レオチド番 号 2 3 0 4 5乃至 2 3 0 4 7により コー ドされるメチォニン残基を N末端とする ポリぺプチドをコ一ドする c D N Aを増幅させるための P C Rに用いられ得る） 、(However, the primer A3 for PCR is a polypeptide having a methionine residue encoded by a nucleotide number 23045 to 23047 of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing as an N-terminal. Can be used for PCR to amplify cDNA),
( 1 6 ) ( 1 3 ) 記載の P C R用プライマー A 1の塩基配列と 9 0 %以上の相同 性を有し、 少なく とも 1 0個の塩基からなる配列を含む P C R用プライマー A 4(16) A primer A4 for PCR having at least 90% homology with the nucleotide sequence of the primer A1 for PCR according to (13) and containing a sequence consisting of at least 10 bases
(但し、 該 P C R用プライマ一 A 4は、 配列表の配列番号 2のヌク レオチド番 号 2 3 0 4 5乃至 2 3 0 4 7により コードされるメチォニン残基を N末端とする ポリぺプチドをコードする c DNAを増幅させるための P C Rに用いられ得る） ,(However, the primer A4 for PCR is a polypeptide having a methionine residue encoded by the nucleotide number 23045 to 23047 of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing as an N-terminal. Can be used for PCR to amplify the encoding cDNA),
( 1 7 ) 配列表の配列番号 1において、 ヌク レオチド番号 1 4 7 9のシトシン又 はそれよ り 5 ' —側の塩基を 5 ' —末端とする、 少なく とも 1 0個の塩基からな る配列を有する P C R用プライマ一 B 1、 (17) In the sequence listing, SEQ ID NO: 1, consisting of at least 10 bases with the 5'-terminal base of cytosine or 5'-side of the nucleotide number 1479 as the 5'-terminal A primer for PCR having a sequence B1,
( 1 8 ) ( 1 7 ) 記載の P C R用プライマ一 B 1の塩基配列と 7 0 %以上の相同 性を有する、 少なく とも 1 0個の塩基からなる配列を含む P C R用プラ マー B 2  (18) A PCR primer B2 having at least 70% homology with the nucleotide sequence of the primer for PCR B1 according to (17), comprising a sequence consisting of at least 10 bases
(但し、 該 P C R用プライマー B 2は、 配列表の配列番号 2のヌク レオチド番 号 3 2 7 2 0乃至 3 2 7 2 2により コードされるァラニン残基を C末端とするポ リペプチ ドをコードする c DN Aを増幅させるための P C Rに用いられ得る） 、 (However, the PCR primer B2 encodes a polypeptide having a C-terminal alanine residue encoded by the nucleotide numbers 32720 to 32272 of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing. Can be used for PCR to amplify cDNA)
( 1 9 ) ( 1 7 ) 記載の P C R用プライマー B 1の塩基配列と 8 0 %以上の相同 性を有する、 少なく とも 1 0個の塩基からなる配列を含む P C R用プライマー B 3 (19) A primer B3 for PCR containing a sequence consisting of at least 10 bases and having a homology of 80% or more with the nucleotide sequence of the primer B1 for PCR described in (17).
(但し、 該 P C R用プライマ一 B 3は、 配列表の配列番号 2のヌク レオチド番 号 3 2 7 2 0乃至 3 2 7 2 2によりコー ドされるァラニン残基を C末端とするポ リぺプチドをコ一ドする c DNAを増幅させるための P C Rに用いられ得る） 、 ( 2 0 ) ( 1 7 ) 記載の P C R用プライマー B 1の塩基配列と 9 0 %以上の相同 性を有する、 少なく とも 1 0個の塩基からなる配列を含む P C R用プライマー B 4 (However, the primer B3 for PCR is a primer having a C-terminal alanine residue encoded by the nucleotide numbers 3227 to 32272 of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing. Can be used for PCR to amplify cDNA encoding the peptide), (20) A PCR primer B4 having at least 90% homology with the nucleotide sequence of the PCR primer B1 according to (17) and containing a sequence consisting of at least 10 bases
(但し、 該 P C R用プライマー B 4は、 配列表の配列番号 2のヌク レオチ ド番 号 3 2 7 2 0乃至 3 2 7 2 2により コー ドされるァラニン残基を C末端とするポ リぺプチドをコ一ドする c DN Aを増幅させるための P C Rに用いられ得る） 、 (However, the PCR primer B4 is a primer having a C-terminal alanine residue coded by nucleotide numbers 32720 to 32272 of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing. Can be used for PCR to amplify cDNA encoding the peptide),
( 2 1 ) 配列表の配列番号 2において、 ヌク レオチド番号 1 1 7 4 8のアデニン 又はそれよ り 5 ' —側の塩基を 5 ' —末端とする、 少なく とも 1 0個の塩基から なる配列を有する P C R用プライマ一 C 1、 (21) A sequence consisting of at least 10 bases, with the adenine at nucleotide number 1 1 7 4 or the 5'-side base 5'-terminal thereof in SEQ ID NO: 2 of the sequence listing. PCR primer C1 having
( 2 2 ) ( 2 1 ) 記載の P C R用プライマ一 C 1の塩基配列と 7 0 %以上の相同 性を有し、 少なく とも 1 0個の塩基からなる配列を含む P C R用プライマー C 2 (22) A primer for PCR C2 having a homology of 70% or more with the nucleotide sequence of primer C1 for PCR described in (21) and containing a sequence consisting of at least 10 bases
(但し、 該 P C R用プライマー C 2が、 配列表の配列番号 2のヌク レオチ ド番 号 1 1 7 4 8乃至 1 1 7 5 0により コードされるメチォニン残基を N末端とする ポリぺプチドをコー ドする c DNAを増幅させるための P C Rに用いられ得る） 、(However, the primer C2 for PCR uses a polypeptide having a methionine residue encoded by the nucleotide number 11174 to 11750 of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing as an N-terminal. Can be used for PCR to amplify the cDNA to be encoded),
( 2 3 ) ( 2 1 ) 記載の P C R用プライマー C 1の塩基配列と 8 0 %以上の相同 性を有し、 少なく とも 1 0個の塩基からなる配列を含む P C R用プライマ一 C 3(23) A primer for PCR that has a homology of 80% or more with the nucleotide sequence of the primer C1 for PCR described in (21) and contains a sequence consisting of at least 10 bases C3
(但し、 該 P C R用プライマ一 C 3力；、 配列表の配列番号 2のヌク レオチ ド番 号 1 1 7 4 8乃至 1 1 7 5 0により コー ドされるメチォニン残基を N末端とする ポリぺプチドをコ一 ドする c D N Aを増幅させるための P C Rに用いられ得る）(Provided that the primer for PCR is C3; a polymethod having an N-terminal methionine residue encoded by the nucleotide numbers 1 1 7 4 8 to 1 1 7 0 of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing) It can be used for PCR to amplify cDNA that encodes a peptide)
( 2 4) ( 2 1 ) 記載の P C R用プライマー C 1の塩基配列と 9 0 %以上の相同 性を有し、 少なく とも 1 0個の塩基からなる配列を含む P C R用プライマ一 C 4(24) A primer for PCR that has a homology of 90% or more with the nucleotide sequence of the primer C1 for PCR described in (21) and contains a sequence consisting of at least 10 bases C4
(但し、 該 P C R用プライマー C 4が、 配列表の配列番号 2のヌク レオチド番 号 1 1 7 4 8乃至 1 1 7 5 0によ り コー ドされるメチォニン残基を N末端とする ポリペプチドをコー ドする c D N Aを増幅させるための P C Rに用いられ得る）(Provided that the PCR primer C4 has a N-terminal methionine residue encoded by the nucleotide numbers 11174 to 11750 of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing) Can be used for PCR to amplify cDNA)
( 2 5 ) 配列表の配列番号 1において、 ヌク レオチド番号 1 4 3 6 2のチミン又 はそれより 5 ' —側の塩基を 5 ' —末端とする、 少なく とも 1 0個の塩基からな る配列を有する P C R用プライマ一 D 1、 (25) In the sequence listing, SEQ ID NO: 1 comprises at least 10 bases, with the thymine of nucleotide number 14432 or the 5'-side base 5'-terminal to the 5'-terminal. A primer for PCR having a sequence D1,
( 2 6 ) ( 2 5 ) 記載の P C R用プライマ一 D 1の塩基配列と 7 0 %以上の相同 性を有し、 少なく とも 1 0個の塩基からなる配列を含む P C R用プライマ一 D 2 (但し、 該 P C R用プライマ一 D 2は、 配列表の配列番号 2のヌク レオチ ド番 号 1 9 8 3 7乃至 1 9 8 3 9によ り コー ドされるセリ ン残基を C末端とするポリ ペプチドをコードする c DN Aを増幅させるための P C Rに用いられ得る） 、(26) 70% or more homology with the nucleotide sequence of PCR primer D1 described in (25) PCR primer D2 having a sequence consisting of at least 10 bases (provided that the primer D2 has a nucleotide number of 198 of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing). 37 to 1983 can be used for PCR to amplify cDNA which encodes a polypeptide having a serine residue at the C-terminus),
( 2 7 ) ( 2 5 ) 記載の P C R用プライマー D 1の塩基配列と 8 0 %以上の相同 性を有し、 少なく とも 1 0個の塩基からなる配列を含む P C R用プライマ一 D 3 (但し、 該 P C R用プライマ一 D 3は、 配列表の配列番号 2のヌク レオチ ド番 号 1 9 8 3 7乃至 1 9 8 3 9により コー ドされるセリ ン残基を C末端とするポリ ぺプチドをコ一ドする c D N Aを増幅させるための P C Rに用いられ得る） 、(27) A primer D3 for PCR that has at least 80% homology with the nucleotide sequence of the primer D1 for PCR described in (25) and contains a sequence consisting of at least 10 bases (provided that The primer D3 for PCR is a polypeptide having a C-terminal serine residue coded by nucleotide numbers 198 337 to 198 39 of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing. Can be used for PCR to amplify cDNA),
( 2 8 ) ( 2 5 ) 記載の P C R用プライマー D 1の塩基配列と 9 0 %以上の相同 性を有し、 少なく とも 1 0個の塩基からなる配列を含む P C R用プライマー D 4 (但し、 該 P C R用プライマー D 4は、 配列表の配列番号 2のヌク レオチド番 号 1 9 8 3 7乃至 1 9 8 3 9によ り コー ドされるセリ ン残基を C末端とするポリ ペプチドをコードする c DNAを増幅させるための P C Rに用いられ得る） 、(28) A PCR primer D4 having a homology of 90% or more with the nucleotide sequence of the PCR primer D1 according to (25) and containing a sequence consisting of at least 10 bases (provided that The primer D4 for PCR encodes a polypeptide having a C-terminal serine residue encoded by nucleotide numbers 198 37 to 198 39 of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing. Can be used for PCR to amplify cDNA)
( 2 9) 配列表の配列番号 1において、 ヌク レオチド番号 1 1 7 9 6のアデニン 又はそれより 5 ' —側の塩基を 5 ' —末端とする、 少なく とも 1 0個の塩基から なる配列を有する P C R用プライマ一 E 1、 (29) In SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, a sequence consisting of at least 10 bases having 5'-terminal at the adenine of nucleotide number 11976 or at the 5'-side thereof is referred to as Having a primer for PCR E1,
( 3 0 ) ( 2 9 ) 記載の P C R用プライマ一 E 1の塩基配列と 7 0 %以上の相同 性を有し、 少なく とも 1 0個の塩基からなる配列を含む P C R用プライマ一 E 2 (但し、 該 P C R用プライマ一 E 2が、 配列表の配列番号 1のヌク レオチド番 号 1 1 7 9 6乃至 1 1 7 9 8により コー ドされるメチォニン残基を N末端とする ポリぺプチドをコードする c DNAを増幅させるための P C Rに用いられ得る） ， (30) The PCR primer E2 (H) having at least 70% homology with the nucleotide sequence of the PCR primer E1 according to (29) and containing a sequence consisting of at least 10 bases. However, the PCR primer E2 is a polypeptide having a methionine residue encoded by the nucleotide number 11796 to 11798 of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing as an N-terminal. It can be used for PCR to amplify the encoding cDNA),
( 3 1 ) ( 2 9) 記載の P C R用プライマ一 E 1の塩基配列と 8 0 %以上の相同 性を有し、 少なく とも 1 0個の塩基からなる配列を含む P C R用プライマー E 3 (但し、 該 P C R用プライマー E 3が、 配列表の配列番号 1のヌク レオチド番 号 1 1 7 9 6乃至 1 1 7 9 8により コー ドされるメチォニン残基を N末端とする ポリぺプチドをコ一ドする c DNAを増幅させるための P C Rに用いられ得る） 、(31) A primer E3 for PCR that has at least 80% homology with the nucleotide sequence of primer E1 for PCR described in (29) and contains a sequence consisting of at least 10 bases (provided that The PCR primer E3 comprises a polypeptide having a methionine residue encoded by the nucleotide number 11796 to 11798 of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing as an N-terminal. Can be used for PCR to amplify cDNA
( 3 2 ) ( 2 9 ) 記載の P C R用プライマー E 1の塩基配列と 9 0 %以上の相同 性を有し、 少なく とも 1 0個の塩基からなる配列を含む P C R用プライマ一 E 4 (但し、 該 P C R用プライマー E 4が、 配列表の配列番号 1のヌク レオチド番 号 1 1 7 9 6乃至 1 1 7 9 8によりコー ドされるメチォニン残基を N末端とする ポリぺプチドをコー ドする c D NAを増幅させるための P C Rに用いられ得る） ，(32) homology of 90% or more with the nucleotide sequence of the primer E1 for PCR described in (29) Primer E4 containing a sequence consisting of at least 10 bases, provided that the primer has a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. Or can be used for PCR to amplify cDNA which encodes a polypeptide having a methionine residue encoded by 117898 as an N-terminus),
( 3 3 ) 配列表の配列番号 2において、 ヌク レオチド番号 2 0 7 2 3のチミン又 はそれよ り 5 ' —側の塩基を 5 ' —末端とする、 少なく とも 1 0個の塩基からな る配列を有する P C R用プライマー F 1、 (33) In SEQ ID NO: 2 in the sequence listing, the nucleotide consists of at least 10 bases having a 5'-terminal at the thymine or 5'-side of nucleotide 20723. PCR primer F1,
(3 4 ) ( 3 3 ) 記載の P C R用プライマー F 1の塩基配列と 7 0 %以上の相同 性を有し、 少なく とも 1 0個の塩基からなる配列を含む P C R用プライマ一 F 2 (但し、 該 P C R用プライマ一 F 2力；、 配列表の配列番号 1のヌク レオチド番 号 1 3 4 7 6乃至 1 3 4 7 8により コー ドされるシスティン残基を C末端とする ポリぺプチドをコ一ドする c DN Aを増幅させるための P C Rに用いられ得る） 、 (34) A PCR primer F2 having at least 70% homology with the nucleotide sequence of the primer F1 for PCR described in (33) and containing a sequence consisting of at least 10 bases (provided that A primer having a C-terminal cysteine residue encoded by the nucleotide numbers 1347 to 13478 of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. Can be used for PCR to amplify the coding cDNA)),
( 3 5 ) ( 3 3 ) 記載の P C R用プライマ一 F 1の塩基配列と 8 0 %以上の相同 性を有し、 少なく とも 1 0個の塩基からなる配列を含む P C R用プライマー F 3 (但し、 該 P C R用プライマー F 3力 配列表の配列番号 1のヌク レオチド番 号 1 3 4 7 6乃至 1 3 4 7 8により コー ドされるシスティン残基を C末端とする ポリぺプチドをコ一ドする c DNAを増幅させるための P C Rに用いられ得る） 、(35) A PCR primer F3 having at least 80% homology with the base sequence of the primer F1 for PCR described in (33) and containing a sequence consisting of at least 10 bases (provided that The primer F3 for PCR The polypeptide having the cysteine residue encoded by the nucleotide number 1347 to 13478 of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing as the C-terminus is encoded. Can be used for PCR to amplify cDNA)
( 3 6 ) ( 3 3 ) 記載の P C R用プライマー F 1の塩基配列と 9 0 %以上の相同 性を有し、 少なく とも 1 0個の塩基からなる配列を含む P C R用プライマー F 4 (但し、 該 P C R用プライマ一 F 4が、 配列表の配列番号 1のヌク レオチド番 号 1 3 4 7 6乃至 1 3 4 7 8によりコードされるシスティン残基を C末端とする ポリペプチドをコ一ドする c D N Aを増幅させるための P C Rに用いられ得る） 、(36) A PCR primer F4 having a homology of 90% or more with the nucleotide sequence of the PCR primer F1 according to (33) and containing a sequence consisting of at least 10 bases (provided that The primer F4 for PCR encodes a polypeptide having a cysteine residue encoded by the nucleotide numbers 1347 to 13478 of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing as a C-terminal. c can be used for PCR to amplify DNA),
( 3 7 ) 配列表の配列番号 1において、 ヌク レオチド番号 2 4 3 2 1のアデニン 又はそれより 5 ' —側の塩基を 5 ' —末端とする、 少なく とも 1 0個の塩基から なる配列を有する P C R用プライマー G 1、 (37) In the SEQ ID No. 1 in the sequence listing, a sequence consisting of at least 10 bases having the adenine of nucleotide number 2432 1 or the 5'-side base 5'-terminal to the 5'-terminal thereof is used. Having PCR primer G1,
( 3 8 ) ( 3 7 ) 記載の P C R用プライマー G 1の塩基配列と 7 0 %以上の相同 性を有し、 少なく とも 1 0個の塩基からなる配列を含む P C R用プライマ一 G 2 (但し、 該 P C R用プライマー G 2が、 配列表の配列番号 1のヌク レオチド番 号 2 4 3 2 1乃至 2 4 3 2 3でコードされるメチォニン残基を N末端とするポリ ぺプチ ドをコー ドする c DNAを増幅させるための P C Rに用いられ得る） 、 .(38) A PCR primer G2 having at least 70% homology with the nucleotide sequence of the PCR primer G1 described in (37) and containing a sequence consisting of at least 10 bases (provided that The primer G2 for PCR is the nucleotide number of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. Nos. 243211 to 243223 can be used for PCR to amplify cDNA encoding a polypeptide having a methionine residue at the N-terminus).
( 3 9 ) ( 3 7 ) 記載の P C R用プライマ一 G 1の塩基配列と 8 0 %以上の相同 性を有し、 少なく とも 1 0個の塩基からなる配列を含む P C R用プライマー G 3 (但し、 該 P C R用プラ マー G 3力；、 配列表の配列番号 1のヌク レオチ ド番 号 2 4 3 2 1乃至 2 4 3 2 3でコ一 ドされるメチォニン残基を N末端とするポリ ぺプチドをコードする c DNAを増幅させるための P C Rに用いられ得る） 、(39) A PCR primer G3 having at least 80% homology with the nucleotide sequence of the primer G1 for PCR described in (37) and containing a sequence consisting of at least 10 bases (provided that A primer G3 for PCR; a polynucleotide having a methionine residue encoded by nucleotide numbers 243211 to 24324 of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing at the N-terminus. Can be used for PCR to amplify the cDNA encoding the peptide),
(4 0 ) ( 3 7 ) 記載の P C R用プライマー G 1の塩基配列と 9 0 %以上の相同 性を有し、 少なく とも 1 0個の塩基からなる配列を含む P C R用プライマ一 G 4 (但し、 該 P C R用プライマー G 4力；、 配列表の配列番号 1のヌク レオチド番 号 2 4 3 2 1乃至 2 4 3 2 3でコー ドされるメチォニン残基を N末端とするポリ ペプチドをコードする c DN Aを増幅させるための P C Rに用いられ得る） 、(40) A primer G4 for PCR having at least 90% homology with the nucleotide sequence of the primer G1 for PCR described in (37) and containing a sequence consisting of at least 10 bases (provided that The primer G4 for PCR; encodes a polypeptide having a N-terminal methionine residue encoded by the nucleotide number 2432 21 to 243223 of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. c can be used for PCR to amplify DNA)),
(4 1 ) 配列表の配列番号 2において、 ヌク レオチド番号 6 3 1 2のチミン又は それよ り 5 ' —側の塩基を 5 ' —末端とする、 少なく とも 1 0個の塩基からなる 配列を含む P C R用プライマー H 1、 (41) In SEQ ID NO: 2 in the sequence listing, a sequence consisting of at least 10 bases having a thymine having a nucleotide number of 6312 or a 5′-terminal base 5′-terminal to the 5′-terminal Including PCR primer H1,
(4 2 ) (4 1 ) 記載の P C R用プライマ一 H Iの塩基配列と 7 0 %以上の相同 性を有し、 少なく とも 1 0個の塩基からなる配列を含む P C R用プライマ一 H 2 (4 2) Primer H 2 for PCR having at least 70% homology with the nucleotide sequence of primer H I for PCR according to (41) and containing a sequence consisting of at least 10 bases
(但し、 該 P C R用プライマ一 H 2は、 配列表の配列番号 1のヌク レオチド番 号 2 7 8 8 7乃至 2 7 8 8 9でコー ドされるアルギニン残基を C末端とするポリ ペプチドをコードする c DN Aを増幅させるための P C Rに用いられ得る） 、(However, the primer H2 for PCR is a polypeptide having a C-terminal arginine residue encoded by nucleotide numbers 278787 to 27889 of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. Can be used for PCR to amplify the encoding cDNA)),
(4 3 ) (4 1 ) 記載の P C R用プライマー H 1の塩基配列と 8 0 %以上の相同 性を有し、 少なく とも 1 0個の塩基からなる配列を含む P C R用プライマー H 3(43) The primer H3 for PCR having at least 80% homology with the nucleotide sequence of the primer H1 for PCR described in (41) and containing a sequence consisting of at least 10 bases
(但し、 該 P C R用プライマ一 H 3は、 配列表の配列番号 1のヌク レオチド番 号 2 7 8 8 7乃至 2 7 8 8 9でコ一 ドされるアルギニン残基を C末端とするポリ ペプチドをコードする c DN Aを増幅させるための P C Rに用いられ得る） 、(However, the primer H3 for PCR is a polypeptide having a C-terminal arginine residue encoded by nucleotide numbers 278787 to 27889 of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. Can be used for PCR to amplify cDNA encoding
(4 4) (4 1 ) 記載の P C R用プライマー H 1の塩基配列と 9 0 %以上の相同 性を有し、 少なく とも 1 0個の塩基からなる配列を含む P C R用プライマ一 H 4(44) A primer H4 for PCR having at least 90% homology with the nucleotide sequence of the primer H1 for PCR described in (41) and containing a sequence consisting of at least 10 bases
(但し、 該 P C R用プライマー H 4は、 配列表の配列番号 1のヌク レオチド番 号 2 7 8 8 7乃至 2 7 8 8 9でコ一ドされるアルギニン残基を C末端とするポリ ぺプチ ドをコ一ドする c DN Aを増幅させるための P C Rに用いられ得る） 、(However, the primer H4 for PCR is the nucleotide number of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. No. 278887 to 278889 can be used for PCR to amplify cDNA encoding a polypeptide having a C-terminal arginine residue encoded by arginine residue),
(4 5 ) 配列表の配列番号 2において、 ヌク レオチド番号 3 54 5のアデニン又 はそれよ り 5 ' —側の塩基を 5 ' —末端とする、 少なく とも 1 0個の塩基からな る配列を含む P C R用プライマ一 I 1、 (45) a sequence consisting of at least 10 bases, with the adenine at nucleotide number 354 5 or the 5'-side nucleotide at the 5'-end thereof as the 5'-terminal in SEQ ID NO: 2 of the sequence listing PCR primers I 1, including
(4 6 ) (4 5) 記載の P C R用プライマー I 1の塩基配列と 7 0 %以上の相同 性を有し、 少なく とも 1 0個の塩基からなる配列を含む P C R用プライマー I 2 (但し、 該 P C R用プライマー I 2が、 配列表の配列番号 2のヌク レオチド番 号 3 5 4 5乃至 3 5 4 7でコー ドされるメチォニン残基を N末端とするポリぺプ チドをコードする c D N Aを増幅させるための P C Rに用いられ得る） 、 (46) A PCR primer I2 having at least 70% homology with the nucleotide sequence of the PCR primer I1 according to (45) and containing a sequence consisting of at least 10 bases (provided that The PCR primer I2 is a cDNA encoding a polypeptide having a methionine residue at the N-terminus, which is encoded by nucleotide numbers 3545 to 3547 of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing. Can be used for PCR to amplify
(4 7 ) (4 5 ) 記載の P C R用プライマー I 1の塩基配列と 8 0 %以上の相同 性を有し、 少なく とも 1 0個の塩基からなる配列を含む P C R用プライマー I 3 (但し、 該 P C R用プライマー I 3力 配列表の配列番号 2のヌク レオチド番 号 3 5 4 5乃至 3 5 4 7でコードされるメチォ二ン残基を N末端とするポリぺプ チドをコードする c DNAを増幅させるための P C Rに用いられ得る） 、(47) A PCR primer I 3 having at least 80% homology with the nucleotide sequence of the PCR primer I 1 according to (45) and containing a sequence consisting of at least 10 bases (provided that The PCR primer I 3 A cDNA encoding a polypeptide having a N-terminal methionine residue encoded by the nucleotide number 3545 to 3547 of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing Can be used for PCR to amplify
(4 8 ) (4 5 ) 記載の P C R用プライマ一 I 1の塩基配列と 9 0 %以上の相同 性を有し、 少なく とも 1 0個の塩基からなる配列を含む P C R用プライマ一 I 4 (但し、 該 P C R用プライマー I 4が、 配列表の配列番号 2のヌク レオチド番 号 3 5 4 5乃至 3 5 4 7でコー ドされるメチォニン残基を N末端とするポリぺプ チドをコードする c DN Aを増幅させるための P C Rに用いられ得る） 、(48) The PCR primer I4 (having at least 90% homology with the nucleotide sequence of the PCR primer I1 according to (45) and comprising a sequence consisting of at least 10 bases. However, the PCR primer I4 encodes a polypeptide having the N-terminal methionine residue encoded by the nucleotide numbers 3545 to 3547 of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing. c can be used for PCR to amplify DNA)),
(4 9 ) 配列表の配列番号 1において、 ヌク レオチド番号 2 8 4 7 2のチミン又 はそれより 5 ' —側の塩基を 5 ' —末端とする、 少なく とも 1 0個の塩基からな る配列を含む P C R用プライマー J 1、 (49) In the sequence listing, SEQ ID NO: 1 consists of at least 10 bases, with the thymine at nucleotide number 28472 or the 5'-side base 5'-terminal to the 5'-terminal, PCR primer J1, including the sequence
( 5 0 ) (4 9 ) 記載の P C R用プライマー J 1の塩基配列と 7 0 %以上の相同 性を有し、 少なく とも 1 0個の塩基からなる配列を含む P C R用プライマ一 J 2 (但し、 該 P C R用プライマー J 2は、 配列表の配列番号 2のヌク レオチド番 号 5 7 2 7乃至 5 7 2 9によ り コードされるァラニン残基を C末端とするポリぺ プチドをコ一ドする c D N Aを増幅させるための P C Rに用いられ得る） 、 ( 5 1 ) (4 9) 記載の P C R用プライマー J 1の塩基配列と 8 0 %以上の相同 性を有し、 少なく とも 1 0個の塩基からなる配列を含む P C R用プライマー J 3 (但し、 該 P C R用プライマー J 3は、 配列表の配列番号 2のヌク レオチ ド番 号 5 7 2 7乃至 5 7 2 9により コ一ドされるァラニン残基を C末端とするポリぺ プチ ドをコー ドする c D N Aを増幅させるための P C Rに用いられ得る） 、(50) A primer J2 for PCR that has at least 70% homology with the nucleotide sequence of the primer J1 for PCR described in (49) and contains a sequence consisting of at least 10 bases (provided that The PCR primer J2 is a polypeptide having a C-terminal alanine residue encoded by the nucleotide number 5727 to 5729 of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing. Can be used for PCR to amplify cDNA) (51) A PCR primer J3 having at least 80% homology with the nucleotide sequence of the PCR primer J1 according to (49) and containing a sequence consisting of at least 10 bases (provided that The PCR primer J3 codes for a polypeptide having a C-terminal alanine residue encoded by the nucleotide numbers 572 to 572 of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing. Can be used for PCR to amplify cDNA)
( 5 2 ) (4 9 ) 記載の P C R用プライマー J 1の塩基配列と 9 0 %以上の相同 性を有し、 少なく とも 1 0個の塩基からなる配列を含む P C R用プライマ一 J 4 (但し、 該 P C R用プライマ一 J 4は、 配列表の配列番号 2のヌク レオチ ド番 号 5 7 2 7乃至 5 7 2 9によ り コー ドされるァラニン残基を C末端とするポリべ プチ ドをコー ドする c D N Aを増幅させるための P C Rに用いられ得る） 、(52) A PCR primer J4 having at least 90% homology with the nucleotide sequence of the PCR primer J1 described in (49) and containing a sequence consisting of at least 10 bases (provided that The primer J4 for PCR is a polypeptide having an alanine residue coded by nucleotide numbers 57 227 to 57 229 of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing as a C-terminal. Can be used for PCR to amplify cDNA),
( 5 3 ) 配列表の配列番号 2において、 ヌク レオチド番号 4 0 0のアデニン又は それよ り 5 ' —側の塩基を 5 ' —末端とする、 少なく とも 1 0個の塩基からなる 配列を含む P C R用プライマー K 1、 (53) In the sequence listing, SEQ ID NO: 2, including a sequence consisting of at least 10 bases, with adenine having a nucleotide number of 400 or a 5'-terminal base 5'-terminal to the 5'-terminal PCR primer K1,
( 5 4 ) ( 5 3 ) 記載の P C R用プライマー K 1の塩基配列と 7 0 %以上の相同 性を有し、 少なく とも 1 0個の塩基からなる配列を含む P C R用プライマ一 K 2 (但し、 該 P C R用プライマ一 K 2が、 配列表の配列番号 2のヌク レオチド番 号 4 0 0乃至 4 0 2により コー ドされるメチォニン残基を N末端とするポリぺプ チドをコードする c D N Aを増幅させるための P C Rに用いられ得る） 、 (54) A primer for PCR K2 which has at least 70% homology with the nucleotide sequence of the primer K1 for PCR described in (53) and contains a sequence consisting of at least 10 bases (provided that CDNA that encodes a polypeptide wherein the PCR primer K2 has a N-terminal methionine residue encoded by nucleotide numbers 400 to 402 of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing Can be used for PCR to amplify
( 5 5 ) ( 5 3 ) 記載の P C R用プライマー K 1の塩基配列と 8 0 %以上の相同 性を有し、 少なく とも 1 0個の塩基からなる配列を含む P C R用プライマ一 K 3 (但し、 該 P C R用プライマー K 3が、 配列表の配列番号 2のヌク レオチド番 号 4 0 0乃至 4 0 2によりコー ドされるメチォニン残基を N末端とするポリぺプ チ ドをコードする c D N Aを増幅させるための P C Rに用いられ得る） 、(55) A PCR primer K3 having at least 80% homology with the nucleotide sequence of the PCR primer K1 described in (53) and containing a sequence consisting of at least 10 bases (provided that The PCR primer K3 is a cDNA encoding a polypeptide having a methionine residue at the N-terminus encoded by nucleotide numbers 400 to 402 of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing. Can be used for PCR to amplify
( 5 6 ) ( 5 3 ) 記載の P C R用プライマー K 1の塩基配列と 9 0 %以上の相同 性を有し、 少なく とも 1 0個の塩基からなる配列を含む P C R用プライマ一 K 4 (但し、 該 P C R用プライマ一 K 4力 配列表の配列番号 2のヌク レオチ ド番 号 4 0 0乃至 4 0 2により コー ドされるメチォニン残基を N末端とするポリぺプ チドをコードする c DN Aを増幅させるための P C Rに用いられ得る） 、 ( 5 7 ) 配列表の配列番号 1において、 ヌク レオチド番号 3 2 2 8 7のシトシン 又はそれよ り 5 ' —側の塩基を 5 ' —末端とする、 少なく とも 1 0個の塩基から なる配列を含む P C R用プライマ一 L 1、 (56) A PCR primer K4 having at least 90% homology with the nucleotide sequence of the PCR primer K1 described in (53) and containing a sequence consisting of at least 10 bases (provided that The primer for K4 is a cDN encoding a polypeptide having a methionine residue at the N-terminus, which is encoded by the nucleotide number 400 to 402 of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing. A can be used for PCR to amplify A), (57) A sequence consisting of at least 10 bases having a 5'-terminal cytosine or a 5'-side nucleotide at nucleotide number 32228 in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. Primer for PCR L 1, including
( 5 8 ) ( 5 7 ) 記載の P C R用プライマ一 L 1の塩基配列と 7 0 %以上の相同 性を有し、 少なく とも 1 0個の塩基からなる配列を含む P C R用プライマ一 L 2 (但し、 該 P C R用プライマ一 L 2は、 配列表の配列番号 2のヌク レオチド番 号 1 9 1 2乃至 1 9 1 4により コードされるァラニン残基を C末端とするポリぺ プチ ドをコー ドする c DNAを増幅させるための P C Rに用いられ得る） 、 (58) A PCR primer L2 having at least 70% homology with the base sequence of the PCR primer L1 according to (57) and containing a sequence consisting of at least 10 bases. However, the PCR primer L2 encodes a polypeptide having a C-terminal alanine residue encoded by nucleotide numbers 1912 to 1914 of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing. Can be used for PCR to amplify cDNA)
( 5 9 ) ( 5 7 ) 記載の P C R用プライマー L 1の塩基配列と 8 0 %以上の相同 性を有し、 少なく とも 1 0個の塩基からなる配列を含む P C R用プライマー L 3 (但し、 該 P C R用プライマー L 3は、 配列表の配列番号 2のヌク レオチ ド番 号 1 9 1 2乃至 1 9 1 4により コードされるァラニン残基を C末端とするポリぺ プチドをコー ドする c DN Aを増幅させるための P C Rに用いられ得る） 、 及び.(59) A PCR primer L3 having at least 80% homology with the nucleotide sequence of the PCR primer L1 according to (57) and containing a sequence consisting of at least 10 bases (provided that The PCR primer L3 encodes a polypeptide having a C-terminal alanine residue encoded by nucleotide numbers 1912 to 1914 of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing.c DN A can be used for PCR to amplify A), and.
( 6 0 ) ( 5 7 ) 記載の P C R用プライマー L 1の塩基配列と 9 0 %以上の相同 性を有し、 少なく とも 1 0個の塩基からなる配列を含む P C R用プライマ一 L 4 (但し、 該 P C R用プライマー L 4は、 配列表の配列番号 2のヌク レオチド番 号 1 9 1 2乃至 1 9 1 4により コードされるァラニン残基を C末端とするポリぺ プチドをコー ドする c DN Aを増幅させるための P C Rに用いられ得る） 、 に関する。 (60) A primer L4 for PCR having at least 90% homology with the nucleotide sequence of the primer L1 for PCR described in (57) and containing a sequence consisting of at least 10 bases (provided that The PCR primer L4 encodes a polypeptide having a C-terminal alanine residue encoded by nucleotide numbers 1912 to 1914 of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing.c DN Which can be used for PCR to amplify A).
本発明は、 ML— 2 3 6 B生産菌内に導入されることにより該生産菌の ML - 2 3 6 B生産能を改善することを特徴とする、 該生産菌のゲノムに由来する D N A (以下、 「ML— 2 3 6 B生合成関連 D N A」 という。 ） 等に関する。  The present invention provides a DNA derived from the genome of the bacterium, which is characterized by improving the ability of the bacterium to produce ML-236B by being introduced into the ML-236B-producing bacterium. Hereinafter, it is referred to as “ML—236B biosynthesis-related DNA.”)
本発明において、 M L— 2 3 6 B生産菌とは、 ML— 2 3 6 B生産能を先天的 に有する微生物をいう。 ML— 2 3 6 B生産菌としては、 例えば、 ぺニシリ ウム In the present invention, the ML-236B-producing bacterium refers to a microorganism having an ML-236B-producing ability innately. ML-236B-producing bacteria include, for example, Penicillium
(Penicillium) 属に属する M L— 2 3 6 B生産菌が挙げられ、 ぺニシリ ウム シ卜 リナム、 ぺニシリ ウム · ブレビコンノ クタム (Penicilium brevicompactu m： Brown, A. G. , et al. , J. Chem. Soc. Perkin - 1. , 1165 (1976)記載） 、 ぺニシリ ウ ム · シクロピウム (Penicillium cyclopium： Doss, S. L. , et al. , J. Natl. Prod. , 49, 357 (1986)記載） 等が例示される。 さらに、 これら以外に、 ュ一ぺニシリ ウ ム - エスピー M 6 6 0 3 ( Eupenicillium sp. M6603 ： Endo, A. , et al. , J. Ant ibiot. -Tokyo, 39, 1609(1986)記載） 、 ぺシロ ミセス ' ビリデイス F E RM P - 6 2 3 6 (Paecilomyces viridis FERM P-6236 ： 特開昭 5 8— 9 8 0 9 2号 公報記載） 、 ぺシロ ミセス ' エスピー M 2 0 1 6 (Paecilomyces sp. M2016 ： Endo, A. , et al. , J. Antibiot. - Tokyo, 39, 1609 (1986)記載） 、 ト リ コデルマ ' 口 ンギブラチアタム M 6 7 3 5 (Trichoderma longibrachiatum M6735 ： Endo, A. , et al. , J. Antibiot. -Tokyo, 39, 1609(1986)記載） 、 ヒポミセス ' ク リ ソスぺ ノレムス I F O 7 7 9 8 (Hypomyces chrysospermus IF0 7798 ： Endo, A. , et al. , J. Antibiot. -Tokyo, 39, 1609(1986)記載） 、 ダリオクラディ ウム ' エスピー(Penicillium), including ML-236B-producing bacteria, such as Penicillium citrinum, Penicillium brevicompactum: Brown, AG, et al., J. Chem. Soc. Perkin-1., 1165 (1976)), Penicillium cyclopium: Doss, SL, et al., J. Natl. Prod., 49, 357 (1986)). In addition, in addition to these, it is also possible to use the following method: u-nispium-SP M6603 (described in Eupenicillium sp. M6603: Endo, A., et al., J. Ant ibiot.-Tokyo, 39, 1609 (1986)) Pacilomyces viridis FERM P-6236 (Patent Publication No. 58-98092); Pacilomyces viridis FERM P-6236, Pascilomyces viridis FERM P-6236 sp. M2016: Endo, A., et al., J. Antibiot.-Tokyo, 39, 1609 (1986)), Trichoderma 'guchi ngibrachiatum M6735 (Trichoderma longibrachiatum M6735: Endo, A., et al., J. Antibiot.-Tokyo, 39, 1609 (1986)), Hypomyces chrysosnoremus IFO 7798 (Hypomyces chrysospermus IF07798: Endo, A., et al., J. Antibiot. -Tokyo, 39, 1609 (1986)), Dario Cradium 'SP
Y J — 9 5 1 5 (Gliocladium sp. YJ-9515： WO 9 8 0 6 8 6 7号公報記 載） 、 ト リ コデルマ ' ピリデ I F O 5 8 3 6 (Trichoderma viride IF0 58 36： 特公昭 6 2— 1 9 1 5号公報記載） 、 ユーぺニシリ ウム ' レチク リスポルムYJ — 9515 (Gliocladium sp. YJ-9515: published in WO98668767), Trichoderma 'Piride IFO 5836 (Trichoderma viride IF05836: Tokushou 62- No. 195, published in Japanese Patent Application Publication No.
I F O 9 0 2 2 (Eupenicillium reticulisporum IF0 9022 ： 特公昭 6 2 - 1 9 1 5 9号公報記載） 等が挙げられる。 これらの ML— 2 3 6 B生産菌のう ち、 好適にはぺニシリ ウム ' シト リナムであり、 よ り好適にはぺニシリ ウム ' シ ト リナム S ANK 1 3 3 8 0株である。 ぺニシリ ウム ' シト リナム S ANK 1 3 3 8 0株は、 平成 4年 （ 1 9 9 2年） 1 2月 2 2 日付けで通商産業省工業技 術院生命工学工業技術研究所 （日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番 3号） に国際 寄託され、 受託番号 F E RM B P— 4 1 2 9を付された。 IFO9022 (Eupenicillium reticulisporum IF09022: described in JP-B-6-19-159). Among these ML-236B-producing bacteria, preferably, it is Penicillium 'Citrimum, and more preferably, it is Penicillium' Citrimum S ANK13380 strain. Nisiridium 'Citrineham S ANK 13380 shares was established on February 22, 1992 by the Institute of Biotechnology and Industrial Technology, the Institute of Industrial Technology, Ministry of International Trade and Industry of Japan (Japan). Deposited internationally at 1-3-1-3 Higashi, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture, and assigned accession number FE RM BP—4 12 9.
L - 2 3 6 B生合成関連 D NAは、 ML— 2 3 6 B生産菌のゲノム D N Aラ イブラ リーに対して、 類似の機能を有するものと推測される糸状菌由来の DN A の塩基配列に基いて設計されるプローブを用いてスク リーニングを行なうことに より得られる。  L-236B biosynthesis-related DNA is a DNA sequence from a filamentous fungus that is presumed to have a similar function to the genomic DNA library of ML-236B-producing bacteria. It is obtained by performing screening using a probe designed based on the above.
ゲノム DN Aライブラ リ一の作成法と しては、 通常真核生物のゲノム DNAラ イブラ リーを作製するための方法であれば特に限定されないが、 例えば、 マニア フ ィ スら C0¾"j¾ (Maniati s, Γ. , et al. , Molecular c丄 oning, a laboratory manua 1, 2nd ed. , Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989)記 載） 等が挙げられる。 The method for preparing the genomic DNA library is not particularly limited as long as it is a method for preparing a genomic DNA library of eukaryotes in general. For example, Mania Fish et al. C0¾ "j¾ (Maniati s, Γ., et al., Molecular cinging, a laboratory manua 1, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989). Listed).
ML - 2 3 6 B生産菌のゲノム DN Aは、 該生産菌培養物から菌体を回収して 物理的に破砕した後、 核内 DN Aを抽出、 精製することにより得られる。  The genome DNA of the ML-236B-producing bacterium can be obtained by recovering the cells from the culture of the producing bacterium, physically disrupting the bacterium, and then extracting and purifying the nuclear DNA.
ML— 2 3 6 B生産菌の培養は、 各 ML - 2 3 6 B生産菌に適した条件下で行 なう ことができる。 好適な ML— 2 3 6 B生産菌であるぺニシリ ウム ' シト リナ ムの培養は、 該菌体を培養したスラントから、 MB G 3— 8培地 （組成 ； 7 % (w /v)グリ セリ ン、 3 % (w/v)グルコース、 l % (w/v)大豆粉、 l % (w/v)ペプトン (極東製薬工業 （株） 製） 、 1 % (w/v)コーンスチ一プリカ一 （ホーネンコーポ レーシヨ ン （株） 製） 、 0. 5 % (w/v)硝酸ナト リ ウム 、 0. 1 % (w/v)硫酸マ グネシゥム七水和物、 p H 6. 5) へ該菌体を接種し、 2 2乃至 2 8 ° (：、 3乃至 7 日間、 振盪しつつ保温することにより行なうことができる。 該スラントは、 溶 解させた P G A寒天培地 （組成 ； 2 0 0 g/L馬鈴薯抽出液、 1 5% (w/v)グリセ リ ン、 2% (w/v)寒天） を試験管に注ぎ、 傾斜させつつ固化させたものに、 白金 耳を用いてぺニシリ ウム ' シト リナムを接種し、 2 2乃至 2 8°C、 7乃至 1 5 日 保温することによ り作製する。 該スラントを 0乃至 4 °Cで保存することにより、 該スラント上で該菌を継続的に生存させることができる。  The culture of the ML-236B-producing bacteria can be performed under conditions suitable for each ML-236B-producing bacteria. The preferred ML-236B-producing bacterium, Penicillium'citrine, was cultured from the slant in which the cells were cultured in an MBG3-8 medium (composition: 7% (w / v) glycerol). , 3% (w / v) glucose, l% (w / v) soy flour, l% (w / v) peptone (manufactured by Far Eastern Pharmaceutical Co., Ltd.), 1% (w / v) corn starch (Manufactured by Honen Corporation), 0.5% (w / v) sodium nitrate, 0.1% (w / v) magnesium sulfate heptahydrate, pH 6.5) The slant is prepared by inoculating the cells and incubating at 22 to 28 ° (for 3 to 7 days while shaking. The slant is prepared by dissolving PGA agar medium (composition: 200 g). / L potato extract, 15% (w / v) glycerin, 2% (w / v) agar) into a test tube, solidify it while tilting it, and use a platinum ear to '' Inoculate with citrinum, 22 to 28 ° C, 7 to 15 The slant is stored at 0 to 4 ° C to allow the bacteria to survive on the slant continuously.
液体培地で培養した ML— 2 3 6 B生産菌の菌体は、 遠心分離によ り、 固体培 地で培養した該菌の菌体は、 セル · スク レーパー等でかきとることによ り、 それ ぞれ回収することができる。  The cells of the ML-236B-producing bacteria cultured in a liquid medium are centrifuged, and the cells of the bacteria cultured in a solid medium are scraped off with a cell scraper or the like. Each can be collected.
菌体の物理的破碎は、 菌体を液体窒素等で凍結しつつ乳鉢と乳棒ですり潰すこ とによ り行なうことができる。 破砕された菌体の核内 D N Aの抽出は、 ドデシル 硫酸ナト リ ウム （ s o d i u m d o d e c y l s u l p h a t e : 以下、 「 S D S」 という。 ） 等の界面活性剤を用いて行なうことができる。 抽出されたゲノ ム D NAは、 フエノール ' ク ロ 口ホルム抽出を行なうことにより除タンパクされ、 ェタノール沈澱を行なうことにより沈澱と して回収することができる。  Physical disruption of the cells can be performed by crushing the cells with a mortar and pestle while freezing the cells with liquid nitrogen or the like. Extraction of DNA in the nucleus of the disrupted cells can be carried out using a surfactant such as sodium dodecyl sulfate (sodimuddodecylssulphate: hereinafter referred to as "SDS"). The extracted genomic DNA is deproteinized by performing phenol-close-form extraction, and can be recovered as a precipitate by performing ethanol precipitation.
' 得られたゲノム DN Aを適当な制限酵素で限定分解させ、 断片化する。 限定分 解に使用される制限酵素としては、 通常入手可能な制限酵素であれば特に限定さ れないが、 例えば、 S a u 3 A I等を挙げることができる。 断片化された DN A をゲル電気泳動に供し、 適当なサイズのゲノム DN Aを含むゲルから DN Aを回 収する。 D N A断片のサイズには特に限定はないが、 好適には 2 0 k b以上であ る。 'The obtained genomic DNA is digested with appropriate restriction enzymes and fragmented. The restriction enzyme used for the restriction digestion is not particularly limited as long as it is a commonly available restriction enzyme, and examples thereof include Sau3AI. Fragmented DN A Is subjected to gel electrophoresis, and DNA is recovered from a gel containing an appropriately sized genomic DNA. The size of the DNA fragment is not particularly limited, but is preferably 20 kb or more.
ゲノム DNAライブラリ一作製用の D NAベクターとしては、 該 DNAベクタ 一で形質転換された宿主細胞内で複製されるのに必要な塩基配列を有するもので あれば特に限定されないが、 例えば、 プラスミ ドベクタ一、 ファージベクター、 コスミ ドベクター、 B ACベクタ一等が挙げられ、 好適にはコスミ ドベクターで ある。 また、 これら DN Aベクターは発現ベクターであってもよレ、。 さらに、 該 DNAベクターは、 該 DNAベクターで形質転換された宿主細胞に表現形質 （表 現型 ； P h e n o t y p e ) の選択性を付与する塩基配列を有していることが好 ましい。  The DNA vector for preparing a genomic DNA library is not particularly limited as long as it has a nucleotide sequence necessary for replication in a host cell transformed with the DNA vector.For example, a plasmid vector First, a phage vector, a cosmid vector, a BAC vector and the like are preferable, and a cosmid vector is preferable. Further, these DNA vectors may be expression vectors. Furthermore, the DNA vector preferably has a base sequence that confers the selectivity of a phenotypic trait (phenotype; Phenotype) to a host cell transformed with the DNA vector.
該 DNAベクターは、 クローニング及ひ'機能発現の双方に適用できるものであ ることが好ましい。 該 DNAベクターと しては、 複数の微生物群に形質転換可能 なシャ トルベクターを用いることが好ましい。 該シャ トルベクターは、 少なく と も一方の微生物群の宿主細胞において複製されるのに必要な塩基配列を有する。 また、 シャ トルベクターは複数の微生物群の宿主にそれぞれ表現形質の選択性を 付与する塩基配列を有していることが好ましい。  The DNA vector is preferably one that can be used for both cloning and functional expression. As the DNA vector, it is preferable to use a shuttle vector that can be transformed into a plurality of microorganism groups. The shuttle vector has at least a nucleotide sequence necessary for replication in a host cell of one of the microorganism groups. Further, the shuttle vector preferably has a base sequence that imparts selectivity of a phenotypic trait to a host of a plurality of microorganism groups.
該シャ トルベクターにより形質転換される微生物群の組合わせとしては、 一方 の微生物群がクローニングに適用でき且つ他方が ML— 2 3 6 B生産能を有して いれば特に限定されないが、 例えば、 細菌及び糸状菌の組合わせ、 酵母及び糸状 菌の組合わせ等が挙げられ、 好適には細菌及び糸状菌の組合わせである。 細菌と しては、 通常遺伝子工学に使用されるものであれば特に限定されないが、 例えば、 大腸菌、 枯草菌等を挙げることができ、 好適には大腸菌であり、 より好適には大 腸菌 Xし 1 ー 8 1 1 6 ^11 株でぁる。 酵母としては、 通常遺伝子工学に用いられ るものであれば特に限定されないが、 例えば、 サッカロ ミセス . セレピシェ （Sa ccharomyces cerevisiae) 等を挙げることができる。 糸状菌と しては、 上述の ML— 2 3 6 B生産菌等が挙げられる。 なお、 本発明において微生物群は、 細菌、 糸状菌及び酵母から選択される。 このよ うなシャ トルベクタ一としては、 例えば、 適当な表現型選択マーカー遺 伝子及びコス （ c o s ) 部位を有するコスミ ドベクター等を挙げることができ、 好適には大腸菌ハイグロマイシン Bホスフォ トランスフエラーゼ遺伝子配列を有 するプラスミ ド p S AK 3 3 3 (特開平 3 - 2 6 2 4 8 6号公報記載） にコスミ ドベクタ一 pWE 1 5 (S T RATAG E N E社製） の有するコス （ c o s ) 部 位を挿入して作製された p S A K c o s 1 が挙げられるが、 これらに限定されな レ、。 p S AK c o s 1の構築手順については図 1に記載されている。 The combination of microorganisms transformed by the shuttle vector is not particularly limited as long as one of the microorganisms is applicable for cloning and the other has ML-236B-producing ability. Examples include a combination of a bacterium and a filamentous fungus, a combination of a yeast and a filamentous fungus, and preferably a combination of a bacterium and a filamentous fungus. The bacterium is not particularly limited as long as it is usually used for genetic engineering, and examples thereof include Escherichia coli and Bacillus subtilis. Escherichia coli is preferred, and E. coli X is more preferred. 1-8 1 1 6 ^ 11 shares. The yeast is not particularly limited as long as it is usually used for genetic engineering, and examples thereof include Saccharomyces cerevisiae. Examples of the filamentous fungi include the ML-236B-producing bacteria described above. In the present invention, the microorganism group is selected from bacteria, filamentous fungi and yeast. Such shuttle vectors include, for example, cosmid vectors having an appropriate phenotypic selectable marker gene and a cos (cos) site, and preferably the Escherichia coli hygromycin B phosphotransferase gene. The plasmid (pSAK333) having the sequence (described in Japanese Patent Application Laid-Open No. Heisei 3-2-264886) contains the cosmid (cos) portion of the cosmid vector pWE15 (manufactured by ST RATAG ENE). P SAK cos 1 created by insertion, but is not limited thereto. The procedure for constructing pSAK cos1 is described in FIG.
上述の ML - 2 3 6 B生産菌ゲノム D N A断片をライゲ一シヨンしたシャ トル べクタ一を宿主細胞に導入することによ り、 所望のゲノム DNAライブラ リーが 完成する。 宿主細胞には、 好適には大腸菌、 より好適には大腸菌 X L 1 — B 1 u e MR株がそれぞれ使用される。 宿主細胞が大腸菌の場合、 該導入は i n v i t r oパッケージングによ り行なう。 本発明において、 形質転換とは、 i n V i t r oパッケージングによる外来 DNAの導入も意味し、 i n v i t r oノ ッケ一ジングによ り外来 D N Aを導入された細胞も形質転換細胞の意味に包含さ れる。  A desired genomic DNA library is completed by introducing into a host cell a shuttle vector obtained by ligating the above-mentioned genomic DNA fragment of the ML-236B-producing bacterium. Escherichia coli, more preferably Escherichia coli XL1-B1ue MR strain, is preferably used as the host cell. When the host cell is Escherichia coli, the introduction is carried out by invitro packaging. In the present invention, the term “transformation” also refers to the introduction of foreign DNA by invitro packaging, and cells into which exogenous DNA has been introduced by invitro knocking are also included in the meaning of transformed cells.
所望のクローンのスク リーニングには、 抗体又は核酸プローブを用い、 好適に は、 核酸プローブを用いる。 該核酸プロ一ブは、 糸状菌のポリケチド生合成関連 遺伝子の塩基配列に基づいて作製することができる。 このような遺伝子と しては、 ポリ ケチドの生合成への関与が確認され且つ塩基配列が公知のものであれば特に 限定されないが、 例えば、 ァスペルギルス · フラヴァス （Aspergillus flavu s) 及びァスぺノレギノレス ' ノ ラシティカス (Aspergillus parasiticus) のァフ ラ トキシン P K S遺伝子、 ァスペルギルス ' 二デュランス （Aspergillus nidul ans) のス ト リ ダマ トシスチン P K S遺伝子等を挙げることができる。  For screening of a desired clone, an antibody or a nucleic acid probe is used, and preferably a nucleic acid probe is used. The nucleic acid probe can be prepared based on the nucleotide sequence of a gene related to polyketide biosynthesis of a filamentous fungus. Such genes are not particularly limited as long as their involvement in polyketide biosynthesis has been confirmed and their nucleotide sequences are known. Examples thereof include Aspergillus flavus and Aspergillus flavus. 'Aflatoxin PKS gene of Norasitycus (Aspergillus parasiticus), Aspergillus' stridama tocystin PKS gene of Aspergillus nidulans, and the like.
該核酸プローブは、 上述の公知の塩基配列に基づいて、 ゲノム DNAの部分塩 基配列からなるオリ ゴヌク レオチドプローブの合成により、 またオリ ゴヌク レオ チドプライマ一を作製し、 ゲノム DN Aを铸型としたポリ メラーゼ連鎖反応 （P o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n : 以下、 i P C Rj とレヽ う。 ： Saiki，R.K. ,et al. , Science, 239, 487 (1988)記載） を行なうことによ り、 又は、 m R N Aを踌型として、 逆転写酵素 （ r e v e r s e t r a n s c r i p t a s e ) で c DN Aを合成し 後、 P C Rを行なう方法 （逆転写 P C R ： r e v e r s e t r a n s c r i p t a t i o n— Pし R : 以下、 i R i'— Pし R」 という。 ） 等によ り、 取得することができる。 The nucleic acid probe was prepared by synthesizing an oligonucleotide probe consisting of a partial base sequence of genomic DNA based on the above-mentioned known nucleotide sequence, and also preparing an oligonucleotide primer to form the genomic DNA into a 铸 type. Polymerase chain reaction (hereinafter referred to as iPC Rj: Saiki, RK, et al., Science, 239, 487 (1988)) Alternatively, using mRNA as a type II, cDNA is synthesized with reverse transcriptase (reverse transcriptase), and then PCR is performed. It is possible to obtain it.
核酸プローブの ML— 2 3 6 B生産菌からの P C R又は RT— P C Rによる取 得方法は、 以下の通りである。 P C R又は RT— P C Rに使用するプライマ一 The method for obtaining a nucleic acid probe from an ML-236B-producing bacterium by PCR or RT-PCR is as follows. PCR or RT—primer used for PCR
(以下、 「P C R用プライマー」 という。 ） の設計は、 塩基配列が公知であると ころのポリケチド生合成関連遺伝子の塩基配列に基づいて、 好適にはァスペルギ ノレス ' フラヴァス （Aspergillus flavus) 、 ァスぺノレギノレス ' パラシティカス(Hereinafter, referred to as “PCR primers”) is preferably designed based on the nucleotide sequence of a polyketide biosynthesis-related gene whose nucleotide sequence is known, preferably Aspergillus flavus or Aspergillus flavus.ぺ Noreginoles '' Paracitycus
(Aspergillus parasiticus) のアフラ トキシン P K S遺伝子又はァスぺノレギノレ ス ' 二デュランス （Aspergillus nidulans) のス ト リ グマ トシスチン P K S遺 伝子の塩基配列に基づいて設計することができる。 これらのうちいずれか一つの P K Sのァミ ノ酸配列上で種間保存性の高いァミノ酸配列を塩基配列に還元する ことによ り、 P C R用プライマ一を設計することができる。 アミ ノ酸配列から塩 基配列に還元する方法と しては、 宿主のコ ドン使用頻度を考慮して単一の配列を 導く方法又は多重コ ドンを使用して混合配列 （以下、 「ミ ックス · プライマ一」 という。 ） を導く方法の二通りが使用できる。 後者の場合、 塩基配列にヒポキサ ンチンを含有させることにより多重度を下げることができる。 (Aspergillus parasiticus) aflatoxin PKS gene or Aspergillus nidulans stridumatocystin PKS gene base sequence. A primer for PCR can be designed by reducing an amino acid sequence with high interspecies conservation to a base sequence on the amino acid sequence of any one of these PKSs. As a method for reducing an amino acid sequence to a base sequence, a method of deriving a single sequence in consideration of the codon usage of the host or a mixed sequence using multiple codons (hereinafter referred to as “mixed sequence”). · It is called "primer." In the latter case, the multiplicity can be reduced by including hypoxanthine in the base sequence.
また、 P C R用プライマ一には、 铸型鎖とアニーリ ングするための塩基配列に 加え、 該プライマーの 5 ' —末端に適宜塩基配列を付加させることが可能である c そのよ うな塩基配列と しては、 該プライマーが P C Rに使用可能であれば特に限 定されないが、 例えば、 P C R産物についてその後のクローニング操作を行なう のに便利な塩基配列等が挙げられ、 このよ うな塩基配列と して、 制限酵素認識配 列及び該制限酵素認識配列を含む塩基配列が挙げられる。 Further, the PCR for primer scratch, in addition to the nucleotide sequence for铸型strand Aniri ring, 5 of the primer '- the ends c its good UNA nucleotide sequence it is possible to adding appropriate nucleotide sequence The primer is not particularly limited as long as the primer can be used for PCR.Examples include a base sequence that is convenient for performing a subsequent cloning operation on the PCR product. A restriction enzyme recognition sequence and a base sequence containing the restriction enzyme recognition sequence are exemplified.
さ らに、 P C R用プライマーの設計においては、 グァニン塩基の数とシトシン 塩基の数の和が総塩基数の 4 0乃至 6 0 %であることが好ましい。 また、 自己ァ 二一リ ングし難いことが好ましい。 一組の P C R用プライマーにおいては、 双方 の P C R用プライマ一同士がアニーリ ングし難いことが好ましい。 また、 P C R用プライマ一の塩基数は、 P C Rに適用できれば特に限定されな いが、 その範囲の下限は 1 0乃至 1 4、 上限は 4 0乃至 6 0であり、 好適な範囲 は 1 4乃至 4 0である。 Further, in designing PCR primers, the sum of the number of guanine bases and the number of cytosine bases is preferably 40 to 60% of the total number of bases. In addition, it is preferable that self-alignment is difficult. In one set of PCR primers, it is preferable that both PCR primers do not easily anneal to each other. The number of bases of the primer for PCR is not particularly limited as long as it can be applied to PCR, but the lower limit of the range is 10 to 14, the upper limit is 40 to 60, and the preferred range is 14 to 60. 40.
さらに、 P C R用プライマーは、 好適には DNAである。 該プライマーを構成 するヌク レオシドと しては、 デォキシアデノシン、 デォキシシチジン、 デォキシ チミジン、 デォキシグアノシン、 アデノシン、 シチジン、 ゥリ ジン及びグアノシ ンに加え、 デォキシイ ノシン、 .イノシン等が挙げられる。  Further, the primer for PCR is preferably DNA. Examples of the nucleosides constituting the primer include deoxyadenosine, deoxycytidine, deoxythymidine, deoxyguanosine, adenosine, cytidine, peridine and guanosine, as well as deoxyinosine and inosine.
また、 P C R用プライマーの 5 ' —末端に位置するヌク レオシドの 5 ' —位は. 水酸基である力 、 又は、 該水酸基に一リ ン酸がエステル結合した状態である。 さらに、 P C R用プライマーの合成は、 通常核酸の合成に使用される方法、 例 えば、 ホスフォロアミダイ ト法によ り行なうことができ、 このよ うな方法には、 DN A自動合成機が好適に使用される。  The 5'-position of the nucleoside located at the 5'-end of the PCR primer is a force that is a hydroxyl group or a state in which monocarboxylic acid is ester-bonded to the hydroxyl group. Furthermore, PCR primers can be synthesized by a method usually used for nucleic acid synthesis, for example, a phosphoramidite method. For such a method, a DNA automatic synthesizer is suitable. Used for
P C Rの铸型としては、 ML— 2 3 6 B生産菌のゲノム D N Aが、 RT— P C Rの铸型としては、 ML— 2 3 6 B生産菌の mRN Aが、 それぞれ使用できる。 なお、 RT— P C Rの铸型としては、 mRN Aの代わりに全 RN Aを使用するこ とも可能である。  Genome DNA of ML-236B-producing bacterium can be used as type II of PCR, and mRNA of ML-236B-producing bacterium can be used as type II of RT-PCR. In addition, as the type II of RT-PCR, all RNAs can be used instead of mRNAs.
P C R産物又は R T - P C R産物をこのものに適した DNAべクターに組込む ことによ り、 該 P C R産物又は RT— P C R産物をクローニングすることができ る。 該クローニングに用いる DNAベクターと しては、 通常 DNA断片をクロー ユングするのに使用される DN Aベクターであれば特に限定されない。 また、 P C R産物又は RT— P C R産物のクローニングを簡便に行なぅキッ トが市販され ており、 このよ うなキッ トとして、 例えば、 O r i g i n a l T A C I o n i n g K i t ( I n v i t r o g e n製 ： DNAベクタ一と して p C R 2. 1 を使用している。 ） が好適に使用される。  The PCR product or RT-PCR product can be cloned by incorporating the PCR product or the RT-PCR product into a DNA vector suitable for this. The DNA vector used for the cloning is not particularly limited as long as it is a DNA vector usually used for closing a DNA fragment. In addition, kits for easily cloning PCR products or RT-PCR products are commercially available. Such kits include, for example, Original TACI oning Kit (manufactured by Invitrogen: a DNA vector). PCR 2.1 is used.) Is preferably used.
クローニングした p C R産物の取得は、 所望の P C R産物を含んでいることを 確認した形質転換宿主細胞を培養し、 該細胞からプラスミ ドを抽出、 精製し、 得 られたプラスミ ドから挿入 DN A断片を回収することによ り行なうことができる。 形質転換宿主細胞の培養は、 各宿主細胞に適した条件下で行なうことができる。 好適な宿主細胞である大腸菌の形質転換体の培養は、 L B培地 （ l % (w/v) ト リ プトン、 0. 5 % (w/v)イース トエキス トラク ト、 0. 5 % (w/v)塩化ナト リ ウ ム） で、 3 0乃至 3 7 ° (：、 1 8時間乃至 2 日間、 振盪しつつ保温することによ り 行なうことができる。 The cloned pCR product can be obtained by culturing transformed host cells that have been confirmed to contain the desired PCR product, extracting and purifying plasmid from the cells, and inserting the inserted DNA fragment from the obtained plasmid. It can be done by collecting Culture of the transformed host cells can be performed under conditions suitable for each host cell. Culture of a transformant of Escherichia coli, which is a suitable host cell, is performed in LB medium (l% (w / v) tryptone, 0.5% (w / v) yeast extract, 0.5% (w / v). v) Sodium chloride) at 30 to 37 ° (:, for 18 hours to 2 days).
形質転換宿主細胞の培養物からのプラスミ ドの調製は、 該宿主細胞の菌体を回 収し、 ゲノム DNAやタンパク質を除去することによりなされる。 好適な宿主細 胞である大腸菌の形質転換体の培養物からのプラスミ ドの調製は、 マニアテイス りのァノレカリ法 (Maniatis, T. , et al. , Molecular cloning, a laboratory raanua 1, 2nd ed. , Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989)記 載） によ り行なうことができる。 また、 よ り純度の高いプラスミ ドを得るための キッ トが市販されており、 このようなキッ トとして、 例えば、 P 1 a s m i d M i n i K i t (Q I A G E N社製） が好適に使用される。 さらに、 プラスミ ドの大量調製を行うキッ トが市販されており、 このようなキッ トとして、 例えば、 P l a s m i d M a x i K i t (Q I A G E N社製） が好適に使用される。 得られたプラスミ ドの DNA濃度は、 D N A試料を適宜希釈して波長 2 6 0 η mにおける吸光度を測定し、 吸光度 l =DNA 5 0 /z g Zm l として算出するこ とができる。 DNAの純度は、 波長 2 8 0及び 2 6 0 n mの吸光度の比率から算 出することができる。  Plasmid is prepared from a culture of a transformed host cell by collecting cells of the host cell and removing genomic DNA and proteins. Preparation of a plasmid from a culture of a transformant of Escherichia coli, which is a suitable host cell, is performed by the Manoleatis method (Maniatis, T., et al., Molecular cloning, a laboratory raanua 1, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)). In addition, kits for obtaining a higher purity plasmid are commercially available. As such a kit, for example, P1asmidMiniKit (manufactured by QIAGEN) is suitably used. Further, a kit for preparing a large amount of plasmid is commercially available. As such a kit, for example, Plasmid MaxiKit (manufactured by QIAGEN) is suitably used. The DNA concentration of the obtained plasmid can be calculated by appropriately diluting the DNA sample, measuring the absorbance at a wavelength of 260 ηm, and calculating the absorbance l = DNA 50 / z g Zm l. The purity of the DNA can be calculated from the ratio of the absorbance at the wavelengths of 280 and 260 nm.
核酸プローブの標識は、 放射性標識及び非放射性標識に大別される。 放射性標 識に使用される放射性核種としては、 通常使用されるものであれば特に限定され ないが、 例えば、 3 2 P, 35 S、 1 4 C等を挙げることができ、 好適には32 Pで ある。 非放射性標識に用いる試薬としては、 通常核酸の標識に用いられるもので あれば特に限定されないが、 例えば、 ジゴキシゲニン、 ピオチン等が挙げられ、 好適にはジゴキシゲニンである。 核酸プローブを標識する方法としては、 通常使 用される方法であれば特に限定されないが、 例えば、 標識基質を用いた P C に より該産物中に取り込ませる方法、 ニック · トランスレーション法、 ランダム · プライマー法、 末端標識法、 標識基質を用いてオリ ゴ DNAを合成する方法等を 挙げることができ、 核酸プローブの種類等により これらの方法から適宜選択でき る。 Labels of nucleic acid probes are broadly classified into radioactive labels and non-radioactive labels. Radionuclides used in radioactive-labeled, usually not particularly limited as long as it can be used, for example, 3 2 P, 35 S, 1 4 C and the like can be mentioned, preferably 32 P It is. The reagent used for non-radioactive labeling is not particularly limited as long as it is generally used for labeling nucleic acids. Examples thereof include digoxigenin and biotin, and digoxigenin is preferred. The method of labeling a nucleic acid probe is not particularly limited as long as it is a commonly used method. Examples thereof include a method of incorporating the product into a product using a PC using a labeled substrate, a nick translation method, and a random primer. Method, end labeling method, method of synthesizing oligo DNA using a labeled substrate, etc., and can be appropriately selected from these methods depending on the type of nucleic acid probe, etc. You.
核酸プローブの塩基配列が ML— 2 3 6 B生産菌のゲノム中に存在することは、 該生産菌のゲノム DNAを用いたサザンブロ ッ ト · ハイブリ ダイゼ一ションによ り確認することができる。  The presence of the nucleotide sequence of the nucleic acid probe in the genome of the ML-236B producing bacterium can be confirmed by Southern blot hybridization using the genomic DNA of the producing bacterium.
サザンブロ ッ ト . ハイブリ ダィゼ一シヨ ンは、 マニアテイスらの方法 （Maniat 1 s, T. , et a.l. , Molecular cloning, a laboratory manual, 2nd ed. , Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989)記載） ίこよ り行なう こと力 できる。  The Southern blot hybridization method was performed according to the method of Maniaités et al. (Maniat 1s, T., et al, Molecular cloning, a laboratory manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)). Described) ί You can do it.
上述の通り作製された標識核酸プローブを用い、 ゲノム DN Αライブラリ一か ら目的クローンをスク リ一二ングすることができる。 該スク リ一ニング法として は、 通常遺伝子クローニングに使用される方法であれば特に限定されないが、 好 適 iこ fまコロニー ' ノヽィフ'、リ タ、、ィゼーシヨ ン法 (Maniatis, T. , et al. , Molecular cloning, a laboratory manual, 2nd ed. , Co丄 d Spring Harbor Laboratory,し old Spring Har.bor, N. Y. (1989)記載） を使用することができる。  Using the labeled nucleic acid probe prepared as described above, the target clone can be screened from the genomic DNA library. The screening method is not particularly limited as long as it is a method usually used for gene cloning, but is preferably a suitable method such as colony 'Niffif', Rita, Isesion method (Maniatis, T. et al. , et al., Molecular cloning, a laboratory manual, 2nd ed., Cod Spring Harbor Laboratory, old Spring Har.bor, NY (1989)) can be used.
コロニー 'ノ、イブリ ダイゼーショ ンに用いるコロニーの培養は、 各宿主細胞に 適した条件下で行なう ことができ、 好適な宿主細胞である大腸菌の形質転換体の 培養は、 L B寒天培地 （ 1 % (w/v) ト リプトン、 0. 5 % (w/v)ィ一ス トエキス ト ラク ト、 0. 5 % (w/v)塩化ナト リ ウム、 1 . 5% (w/v)ァガ口一ス） 上で、 3 0 乃至 3 7 C、 1 8時間乃至 2 日間保温することによ り行なうことができる。  The culture of colonies used for colonization and hybridization can be performed under conditions suitable for each host cell, and the culture of a transformant of Escherichia coli, which is a suitable host cell, is performed using LB agar medium (1% ( (w / v) tryptone, 0.5% (w / v) distract extract, 0.5% (w / v) sodium chloride, 1.5% (w / v) agaguchi 1) The above can be carried out by keeping the temperature at 30 to 37 C for 18 hours to 2 days.
コロニー ' ハイプリ ダイゼーショ ンによ り得られる陽性クローンからの組換え DNAベクタ一の調製は、 該陽性クローンの培養物からプラスミ ドを抽出及び精 製することによ りなされる。  Preparation of a recombinant DNA vector from a positive clone obtained by colony'hybridization is performed by extracting and purifying plasmid from a culture of the positive clone.
本発明において得られた陽性クローンである形質転換大腸菌 E. c o l i p M L 4 8 S ANK 7 1 1 9 9株は、 平成 1 1年 （ 1 9 9 9年） 7月 7 日付け で通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所 （日本国茨城県つくば巿東 1 一 1 — 3 ) に国際寄託され、 受託番号 F E RM B P— 6 7 8 0を付された。 E . c o l i p M L 4 8 S ANK 7 1 1 9 9株が保持する組換え D N Aべクタ一 は p M L 4 8 と命名された。 陽性クローンの保有する組換え DN Aべクターが所望の ML - 2 3 6 B生合成 関連 DNAを含んでいることは、 該組換え DNAべクターの挿入塩基配列の決定、 サザンプロ ッ ト · ハイプリ ダイゼーショ ン又は機能発現により確認できる。 The transformed Escherichia coli E. colip ML48 S ANK 711 199 strain obtained as a positive clone obtained in the present invention was produced by the Ministry of International Trade and Industry on July 7, 1999. It was deposited internationally with the Institute of Biotechnology, Industrial Technology Research Institute (Tsukuba East, Ibaraki Prefecture, Japan, Japan, Japan, Japan, Japan, Japan), and was assigned the accession number FE RM BP—680. The recombinant DNA vector contained in the E. colip ML48 SANK711 9199 strain was named pML48. The fact that the recombinant DNA vector possessed by the positive clone contains the desired ML-236B biosynthesis-related DNA can be determined by determining the inserted nucleotide sequence of the recombinant DNA vector, Southern blot hybridisation. Can be confirmed by the expression or function expression.
D N Aの塩基配列は、 マキサム—ギルバー トの化学修飾法 （Maxiam, A. M. M. and Gilbert, W. , Methods in Enzymology, 65, 499 (1980)記載) 又はジデォキシヌ ク レオチド鎖終結法 （Messing, J. and Vieira, J. , Gene, 19, 269 (1982)記載） 等 によ り決定できる。 なお、 塩基配列決定に供するプラスミ ド DNAと しては、 よ り純度の高い標品が好ましい。  The nucleotide sequence of DNA can be determined by the chemical modification method of Maxam-Gilbert (described in Maxiam, AMM and Gilbert, W., Methods in Enzymology, 65, 499 (1980)) or the dideoxynucleotide chain termination method (Messing, J. and Vieira). , J., Gene, 19, 269 (1982)). In addition, as the plasmid DNA to be subjected to the nucleotide sequence determination, a sample with higher purity is preferable.
p ML 4 8の挿入塩基配列は配列表の配列番号 1に示される。 配列表の配列番 号 2に示される塩基配列は、 配列番号 2に示される塩基配列に対して完全に相補 的である。 通常ゲノム D N Aの塩基配列は同種内において遺伝的多型 （ポリモル フイ ズム ： p o l' y m o r p h y s m) を有している。 また、 DNAクローニン グの過程及び塩基配列決定の過程において、 ヌク レオチドの置換等が一定の確率 で生じ得る。 従って、 本発明は、 配列表の配列番号 1又は 2のヌク レオチド番号 1乃至 3 4 2 0 3に示される塩基配列を有する D N Aにハイブリ ダイズする ML - 2 3 6 B生合成関連 D N A、 及び配列表の配列番号 1又は 2のヌク レオチド番 号 1乃至 3 4 2 0 3に示される塩基配列を有する D N Aにス ト リ ンジェントな条 件下でハイプリ ダイズする ML— 2 3 6 B生合成関連 DN Aをも包合する。 これ ら D N Aとしては、 配列表の配列番号 1又は 2のヌク レオチ 番号 1乃至 3 4 2 0 3に示される塩基配列に 1つ以上のヌク レオチドの置換、 欠失及びノ又は付加 が生じたもの、 並びにべニシリ ゥム · シ ト リナム S ANK 1 3 3 8 0株以外の ML - 2 3 6 B生産菌に由来するものであり、 ML— 2 3 6 B生産菌内に導入さ れることによ り該菌の ML— 2 3 6 B生産能を改善する機能を有するものをも包 合する。 なお、 本発明において、 ハイブリ ダィズとは、 2本の一本鎖核酸同士が 互いに相補的な領域又は相補性の高い領域において二本鎖を形成することをいい、 ス ト リ ンジェントな条件とは、 ハイブリ ダイゼ一ション液の組成が 6 X S S C The inserted base sequence of pML48 is shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. The nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing is completely complementary to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2. Usually, the nucleotide sequence of the genome DNA has a genetic polymorphism (polymorphism: pol'ymorphysm) within the same species. In the process of DNA cloning and the process of nucleotide sequence determination, nucleotide substitution and the like may occur with a certain probability. Therefore, the present invention provides an ML-236B biosynthesis-related DNA which hybridizes to a DNA having a nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 1 to 342 of SEQ ID NO: 1 or 2 in the sequence listing, and ML-236B biosynthesis-related DN that hybridizes under stringent conditions to DNA having the nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 1 to 342 of SEQ ID NO: 1 or 2 in the sequence listing A is also included. These DNAs are those in which one or more nucleotide substitutions, deletions, and deletions or additions have occurred in the nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 1 to 342 of SEQ ID NO: 1 or 2 in the sequence listing. , And Benidium citrinum S ANK 133 0 strain other than ML-236B-producing bacteria, which are introduced into ML-236B-producing bacteria. Furthermore, those having a function of improving the ML-236B production ability of the bacterium are also included. In the present invention, the term “hybridization” means that two single-stranded nucleic acids form a double-stranded region in a region complementary to each other or in a region having high complementarity. The composition of the hybridization solution is 6 XSSC
( 1 X S S Cの組成は、 1 5 0 mMN a C l 、 1 5 mMクェン酸三ナト リ ウ ム。 ） であり且つハイブリ ダィゼーシヨ ンを行なう際の保温温度が 5 5 °Cの場合 をレヽう。 (The composition of 1 XSSC is 150 mM NaCl, 15 mM trisodium citrate.) When the incubation temperature at the time of hybridization is 55 ° C. Review
ML— 2 3 6 B生合成関連 D N Aの解析法は次の 1 ) 乃至 3 ) に従う。  The analysis method for ML-236B biosynthesis-related DNA follows 1) to 3) below.
1 ) 遺伝子解析ソフ トによる解析  1) Analysis using gene analysis software
ゲノム DN A配列中の遺伝子領域の推定は、 既存の遺伝子解析プログラム （G e n e F i n d i n gプログラム （以下、 「 G RA I L」 という。 ） 、 及び配 列の相同性検索プログラム （B LA S TN及び B LA S T X) により行う ことが できる。  The gene region in the genome DNA sequence can be estimated by using existing gene analysis programs (GeneFinding program (hereinafter referred to as "GRAIL")) and sequence homology search programs (BLASTN and BLASTN). LA STX).
G RA I Lはゲノム配列の 「遺伝子配列らしさ」 を評価する 7つのパラメ一タ に分割し、 それらの結果をニューラルネッ ト法を用いて統合することによ り、 ゲ ノム DN A上の構造遺伝子を検索するプログラム （Uberbacher, E. &. Mural, R. J. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA. , 88, 11261 (1991) fBi ) であり、 A p o C o m G RA I L T o o l k i t (A P O C OM社製） が好適に使用される。  GRAIL divides the genomic sequence into seven parameters that evaluate the “likeness of the gene sequence,” and integrates the results using a neural net method to generate structural genes on the genome DNA. (Uberbacher, E. & Mural, RJ, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 88, 11261 (1991) fBi), and ApoCom G RA ILT oolkit (APOC OM) ) Is preferably used.
B L A S Tは核酸配列及びァミノ酸配列の相同性検索を行なうアルゴリズム (Altechul, S. F. , Madden, T.し， et al. , ucl. Acids Res. , 25, 3389 (1997)記載） を用いたプログラムである。  BLAST is a program using an algorithm for homology search of nucleic acid sequence and amino acid sequence (described in Altechul, SF, Madden, T., et al., Ucl. Acids Res., 25, 3389 (1997)). .
ゲノム DN A配列を適当な長さに分割し、 B L A S TNを用いて遺伝子データ ベースに対し相同性検索することにより、 被検 DNA配列上の構造遺伝子の位置 及び方向を推定することができる。 また、 分割されたゲノム DN A配列を 6つの 翻訳フ レーム （センス配列及びアンチセンス配列に各々 3つずつ） に従ってアミ ノ酸配列に翻訳し、 該ァミ ノ酸配列のぺプチド . データベースに対する相同性検 索を B LA S TXを用いて行なうことによ り、 被掉 DNA配列上の構造遺伝子の 位置及び方向の推定を行なうこともできる。 さらに、 真核生物においては、 ゲノ ム D N A配列中に含まれる構造遺伝子のコード領域がィントロン配列によ り分断 されている場合があり、 このよ うなギヤップを有する構造遺伝子の解析にはギヤ ップ含有配列用の B L A S Tがより有効であり、 G a p p e d— B LA S T (B LA S T 2 : W I S CON S I N GC G p a c k a g e v e r . 1 0. 0に搭載） が好適に使用される。  By dividing the genome DNA sequence into appropriate lengths and performing homology search on the genetic database using BLASTN, the position and direction of the structural gene on the test DNA sequence can be estimated. In addition, the divided genomic DNA sequence is translated into an amino acid sequence according to six translation frames (three in each of a sense sequence and an antisense sequence), and the amino acid sequence is homologous to the peptide database. By performing the sex search using the BLAST TX, the position and direction of the structural gene on the DNA sequence to be removed can also be estimated. Furthermore, in eukaryotes, the coding region of a structural gene contained in a genomic DNA sequence may be interrupted by an intron sequence, and the analysis of a structural gene having such a gap is a gap. BLAST for contained sequences is more effective, and Gapped—BLAST (BLAST2: mounted on WIS CON SIN GC G packagever. 10.0) is preferably used.
2 ) ノーザンプロッ ト ' ハイブリ ダイゼ一ション法による解析 ノーザンプロ ッ ト · ハイブリ ダィゼーシヨ ン法により、 1 ) 記載の解析法によ り推定される構造遺伝子の発現を調べることができる。 2) Analysis by Northern Plot 'Hybridization Method By the Northern plot hybridization method, the expression of a structural gene estimated by the analysis method described in 1) can be examined.
ノ一ザンブロ ッ トに供する M L - 2 3 6 B生産菌の全 R NAは、 該菌の培養物 より得ることができる。 好適な ML— 2 3 6 B生産菌であるぺニシリ ゥム · シト リナムの培養は、 該菌のスラントから MG B 3 — 8培地に該菌を接種し、 2 2乃 至 2 8 ° (：、 1乃至 4 日間、 振盪しつつ保温することによ り行う こと できる。  The total RNA of the ML-236B producing bacterium to be used for the Northern blot can be obtained from a culture of the bacterium. For cultivation of a suitable ML-236B producing bacterium, Penicillium citrinum, the strain is inoculated from a slant of the bacterium into a MGB3-8 medium, and the bacterium is cultured at a temperature of 22 to 28 ° (: For 1 to 4 days by keeping the temperature while shaking.
M L— 2 3 6 B生産菌からの RNAの抽出は、 通常全 R N Aを調製するのに使 用される方法であれば特に限定されないが、 例えば、 グァニジン ' チオシァネー ト ' ホッ トフエノール法、 グァニジン · チオシァネ一 ト一グァニジン · 塩酸法等 が挙げられる。 また、 よ り純度の高い全 R N Aを調製するための市販キッ トと し ては、 例えば、 R N e a s y P l a n t M i n i K i t (キアゲン社製） 等が挙げられる。 さらに、 mR NAは、 全 RN Aをオリ ゴ （d T) カラムに添加 し、 該カラムに吸着した画分を回収することによ り得ることができる。  Extraction of RNA from ML-236B-producing bacteria is not particularly limited as long as it is a method generally used for preparing total RNA. For example, guanidine 'thiosinate' hot phenol method, guanidine-thiosine Monoguanidine · hydrochloric acid method. Examples of commercially available kits for preparing higher-purity total RNAs include, for example, RNeasyPlantMiniKit (manufactured by QIAGEN). Furthermore, mRNA can be obtained by adding total RNA to an oligo (dT) column and collecting the fraction adsorbed on the column.
R N Aのメ ンブレンへの トランスファ一、 プローブの調製、 ハイブリ ダィゼー シヨ ン及びシグナルの検出は、 上述のサザンブロ ッ ト ' ハイブリ ダィゼーシヨ ン と同様に行なうことができる。  Transfer of the RNA to the membrane, preparation of the probe, hybridization, and detection of the signal can be performed in the same manner as in the Southern blot 'hybridization described above.
3 ) 5 ' —末端及び 3 ' —末端の解析 3) Analysis of 5'-end and 3'-end
各構造遺伝子の 5 ' —末端及び 3 ' —末端の解析は、 R A C E ( r a p i d a m p l i f i c a t i o n o f c D N A e n d s ) '法により行なうこと ができる。 RA C Eは、 mRNAを铸型と し、 塩基配列が決定されている領域か ら塩基配列が決定されていない 5 ' —末端又は 3 ' —末端領域までを含む c D N Aを、 RT— P C Rの応用によ り取得する方法である （Frohtnan. M. A.， et al. , P roc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. , 85, 8998 (1988) fB¾) 。  Analysis of the 5'-end and 3'-end of each structural gene can be performed by the RACE (rapidammpliificantionanofcDNAEnds) method. RACE uses mRNA as a type III and converts cDNA containing the region from the base sequence to the 5'-end or 3'-end region where the base sequence has not been determined by RT-PCR. (Frohtnan. MA, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 8998 (1988) fB¾).
5 ' R A C Eは以下の方法に従う。 m R NAを踌型と し、 塩基配列中の公知の 部分に基いて設計されたアンチセンス側のオリ ゴ D NA ( 1 ) をプライマーと し た逆転写酵素反応によ り c D N A第一鎖を合成した後、 ターミナルデォキシヌク レオチヂルトランスフェラーゼにより該 c D NA第一鎖の 3 ' —末端にホモポリ メ リ ックな （h o m o p o l y m e r i c ： 単一塩基からなる） ヌク レオチド鎖 を付加させる。 該 c D NA第一鎖を铸型と し且つ該ホモポリ メ リ ックな塩基配列 に相補的な塩基配列を含むセンス側のオリ ゴ D NA、 及び、 アンチセンス側に存 在し且つオリ ゴ DNA ( 1 ) よ り 3 ' —側に存在するオリ ゴ DNA ( 2) をプラ イマ一と した P C Rによって、 5 ' —末端領域の二本鎖 c D N Aを増幅させる方 法である (Frohman, M. A. , Methods in Enzymol. , 218， 340 (1993)記載） 。 5 ' R AC E用のキッ トが市販されており、 このよ うなキッ トと して、 例えば、 5 ' R A C L S y s t e m i o r R a p i d Am p l i i i c a t i o n o f c D N A e n d s , V e r s i o n 2. 0 (G I B C O社製） 等が好適 に使用される。 5 'RACE follows the method below. The first strand of cDNA is formed by reverse transcriptase reaction using oligo-DNA (1) on the antisense side, which is designed based on a known portion of the base sequence, with mRNA as type III. After synthesizing, a homopolymeric (homopolymeric: consisting of a single base) nucleotide chain at the 3'-end of the first strand of the cDNA is obtained by terminal deoxynucleotidyl transferase. Is added. The oligo DNA present on the sense side, which has the first strand of cDNA as a type II and contains a nucleotide sequence complementary to the homopolymeric nucleotide sequence, and an oligo present on the antisense side. This method amplifies the double-stranded cDNA in the 5'-terminal region by PCR using the oligo DNA (2) present on the 3 'side of the DNA (1) as the primer (Frohman, MA , Methods in Enzymol., 218, 340 (1993)). Kits for 5 'RACE are commercially available. As such a kit, for example, 5' RACLS ystemior Rapid Am pliiicationofc DNA ends, Version 2.0 (manufactured by GIBCO) and the like are preferable. Used for
3 ' RAC Eは、 mRNAの 3 ' —末端に存在するポリ A領域を利用する方法 である。 すなわち、 mRNAを铸型として、 オリ ゴ d (T) アダプタ一をプライ マーとした逆転写酵素反応によ り c DN A第一鎖を合成した後、 該 c DNA第一 鎖を铸型として、 塩基配列中の公知の部分に基いて設計されたセンス側のオリ ゴ DNA (3) 、 及び、 アンチセンス側のオリ ゴ d (T) アダプタ一をプライマ一 とした P'C Rによって、 3 ' —末端領域の二本鎖 c D N Aを増幅させる方法であ る。 3 ' RA C E用のキッ トが市販されており、 このようなキッ トと して、 例え は、 R e a d y— T o— G o Ί — p r i m e d F i r s t — S t r a n d K i t ( P h r a m a c i a社製） が好適に使用される。  3 ′ RACE is a method that utilizes the poly A region present at the 3′-end of mRNA. That is, after the cDNA is synthesized as a type I cDNA, the first strand of the cDNA is synthesized by a reverse transcriptase reaction using the oligo d (T) adapter as a primer, and then the first strand of the cDNA is expressed as a type II. The oligo DNA (3) on the sense side designed based on the known portion of the nucleotide sequence and the P'CR with the oligo d (T) adapter on the antisense primer as the primer 3 ' —This method amplifies double-stranded cDNA in the terminal region. Kits for 3 'RACE are commercially available. Examples of such kits include: Ready—To—Go—Primed First—Strand Kit (Pharmacia) Is preferably used.
R A C Eにおける塩基配列中の公知の部分に基いたプライマーの設計には、 上 記 1 ) 及び 2 ) の解析結果が好適に利用できる。  The analysis results of the above 1) and 2) can be suitably used for designing a primer based on a known portion of the base sequence in RACE.
以上、 1 ) 乃至 3 ) に記載した解析法によ り、 ゲノム D N A配列上の構造遺伝 子の方向、 並びに、 構造遺伝子中の転写開始点の位置、 翻訳開始コ ドンの位置、 翻訳終止コ ドン及びその位置を推定することができる。 これらの情報に基づいて、 各構造遺伝子及びその c DN Aを取得することが可能である。  As described above, according to the analysis methods described in 1) to 3), the direction of the structural gene on the genomic DNA sequence, the position of the transcription start point, the position of the translation start codon, and the translation stop codon in the structural gene And its position can be estimated. Based on this information, each structural gene and its cDNA can be obtained.
本発明において得られた組換え D N Aべクター p ML 4 8挿入配列上には、 6つの構造遺伝子の存在が推定され、 それぞれを m l c A、 m l c B、 m l c C、 m l c D、 m l c E及び m 1 c Rと命名した。 このうち、 m l c A、 m l c B、 m l c E及び m l c Rは配列表の配列番号 2に示される塩基配列上にコード領域 を有し、 m l c C及び m l c Dは配列表の配列番号 1に示される塩基配列上にコ 一 ド領域を有しているものと推定された。 On the recombinant DNA vector pML48 insertion sequence obtained in the present invention, the presence of six structural genes was presumed, and mlcA, mlcB, mlcC, mlcD, mlcE and m1 c Named R. Among them, mlc A, mlc B, mlc E and mlc R are coding regions on the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing. It was presumed that mlc C and mlc D had a coding region on the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
c DNAの取得法と しては、 上述の情報に基づいて設計され得るプライマ一を 用いた R T— P C Rによるク ローニング、 かかる情報に基いて得られる D N Aプ ローブを用いた c D N Aライブラ リーからのクローニング等が挙げられる。 これらの方法で取得できる c D N Aを機能発現させるためには、 完全長の c D NAを得る必要がある。 また、 RT— P C Rにより機能発現し得る c D N Aを取 得するためには、 該 RT— P C R産物が本来の位置に翻訳開始コ ドンを含み且つ 該翻訳開始コ ドンよ り開始される翻訳フ レーム中には本来の位置以外に翻訳終止 コ ドンを含まないよ うにプライマーを設計することが必須である。  Methods for obtaining cDNA include cloning by RT-PCR using a primer that can be designed based on the above-mentioned information, and cDNA cloning using a DNA probe obtained based on such information. Cloning and the like. In order to express the function of the cDNA obtained by these methods, it is necessary to obtain a full-length cDNA. In addition, in order to obtain cDNA capable of functional expression by RT-PCR, the RT-PCR product contains a translation initiation codon at its original position and is contained in a translation frame initiated by the translation initiation codon. It is essential to design a primer so that it does not contain a translation termination codon other than its original position.
P C R用プライマー X I (Xは A、 C、 E、 G、 I及び Kのいずれかよ り選択 され、. A 1は （ 1 3 ) 、 C 1は （ 2 1 ) 、 E 1は （ 2 9 ) 、 G 1は （ 3 7 ) 、 I 1は （4 5 ) 、 K 1は （ 5 3 ) に記載されている。 ） 又は P C R用プライマ一 Υ 1 (Υは Β, D， F、 H、 J又は Lのいずれかより選択され、 B 1は （ 1 7 ) 、 D 1 は （ 2 5 ) 、 F 1 は （3 3 ) 、 H Iは （4 1 ) 、 J 1 は （4 9) 、 L 1は PCR primers XI (X is selected from any of A, C, E, G, I and K. A1 is (13), C1 is (21), E1 is (29), G1 is described in (37), I1 is described in (45), K1 is described in (53).) Or PCR primer 1 (Υ is Υ, D, F, H, J or L is selected from B, B1 is (17), D1 is (25), F1 is (33), HI is (41), J1 is (49), L1 is
( 5 7 ) に記載されている。 ） は配列表の配列番号 1又は配列番号 2に示される 塩基配列中の少なく とも 1 0個の塩基からなる塩基配列を有する。 (57). ) Has a base sequence consisting of at least 10 bases in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 in the sequence listing.
P C R用プライマーの有する塩基配列は、 錡型鎖と選択的にァニ一リ ングし且 つ P C R又は RT— P C Rのプライマーと して機能し得る限りにおいては、 該踌 型鎖の一部と完全に相補的でなくてもよい。 ·  As long as the base sequence of the primer for PCR can selectively anneal to the type I strand and can function as a primer for PCR or RT-PCR, it can be completely integrated with a part of the type I strand. Need not be complementary to ·
P C R用プライマ一 X 2乃至 X 4 (Xは A、 C、 E、 G、 I及び Kのいずれか より選択され、 Α 2は （ 1 4) 、 A 3は （ 1 5) 、 Α 4は （ 1 6 ) 、 C 2は （ 2 2 ) 、 C 3は （ 2 3 ) 、 C 4は （ 2 4) 、 Ε 2は （3 0 ) 、 Ε 3は （ 3 1 ) 、 Ε 4 ( 3 2 ) 、 G 2は （ 3 8 ) 、 G 3は （ 3 9) 、 G 4は （4 0 ) 、 I 2は （4 6 ) 、 1 3は （4 7 ) 、 1 4は （4 8 ) 、 K 2は （ 5 4 ) 、 K 3は （ 5 5). 、 K 4は （ 5 6 ) に記載されている。 ） は P C R用プライマー X I (X I及び X 2乃 至 X 4の Xは同じアルファべッ トのグループを表わす ； A 1には A 2乃至 A 4、 C 1 には C 2乃至 C 4、 E lには E 2乃至 E 4、 G 1には G 2乃至 G 4、 I 1 に は I 2乃至 I 4、 K 1 には K 2乃至 K 4 、 それぞれ対応する。 ） の塩基配列と 7 0 o/o以上の相同性を有し、 好適には 8 0 %以上の相同性を有し、 よ り好適には 9 0 %以上の相同性を有し、 少なく とも 1 0個の塩基からなる配列を含む。 PCR primers X2 to X4 (X is selected from any of A, C, E, G, I and K, Α2 is (14), A3 is (15), Α4 is ( 1 6), C 2 is (2 2), C 3 is (2 3), C 4 is (24), Ε 2 is (30), Ε 3 is (3 1), Ε 4 (3 2) , G2 is (38), G3 is (39), G4 is (40), I2 is (46), 13 is (47), 14 is (48), K 2 is described in (54), K3 is described in (55)., K4 is described in (56).) X of PCR primers XI (XI and X2 to X4 is the same alpha-base). A1 represents A2 to A4, C1 represents C2 to C4, El represents E2 to E4, G1 represents G2 to G4, and I1 represents a group of bits. Corresponds to I2 to I4, and K1 corresponds to K2 to K4, respectively. ) Has a homology of 70 o / o or more, preferably has a homology of 80% or more, more preferably has a homology of 90% or more, and at least Includes a sequence consisting of 10 bases.
P C R用プライマー Y 2乃至 Y 4 (Yは B， D， F、 H、 J又は Lのいずれか よ り選択され、 B 2は （ 1 8 ) 、 B 3は （ 1 9) 、 B 4は （ 2 0 ) 、 D 2は （ 2 6 ) 、 D 3は （ 2 7 ) 、 D 4は （ 2 8 ) 、 F 2は （ 3 4 ) 、 F 3は （ 3 5) 、 F 4は （ 3 6 ) 、 H 2は （4 2 ) 、 H 3は （4 3 ) 、 H 4は （4 4 ) 、 J 2は （ 5 0 ) 、 J 3は （ 5 1 ) 、 J 4は （ 5 2) 、 L 2は （ 5 8 ) 、 L 3は （ 5 9) 、 L 4は （6 0 ) に記載されている。 ） は P C R用プライマー Y l (Y 1及び Y 2乃 至 Y 4の Yは同じアルファべッ トのグループを表わす ； B 1には B 2乃至 B 4、 D 1 には D 2乃至 D 4、 F 1には F 2乃至 F 4、 H Iには H 2乃至 H 4、 J 1 に は J 2乃至 J 4、 L 1 には L 2乃至 L 4が、 それぞれ対応する。 ） の塩基配列と 7 0 %以上の相同性を有し、 好適には 8 0 %以上の相同性を有し、 よ り好適には 9 0 %以上の相同性を有し、 少なく とも 1 0個の塩基からなる配列を含む。  PCR primers Y2 to Y4 (Y is selected from any of B, D, F, H, J or L, B2 is (18), B3 is (19), B4 is ( 20), D2 is (26), D3 is (27), D4 is (28), F2 is (34), F3 is (35), F4 is (36) ), H 2 is (4 2), H 3 is (4 3), H 4 is (4 4), J 2 is (50), J 3 is (5 1), J 4 is (5 2), L2 is described in (58), L3 is described in (59), L4 is described in (60).) Y1 of PCR primer Yl (Y1 and Y2 to Y4 is the same) Represents a group of alphabets; B1 is B2 to B4, D1 is D2 to D4, F1 is F2 to F4, HI is H2 to H4, J1 Correspond to J2 to J4, and L1 corresponds to L2 to L4, respectively.) Has a homology of 70% or more, preferably 80% or more. More preferably 90% or more homology, Ku also comprises an array of 1 0 bases.
P C R用プライマ一 X 1乃至 X 4 (Xは A、 C、 E、 G、 I及び Kのいずれか よ り選択される。 ） のいずれか一つ及び P C R用プライマー Υ 1乃至 Υ 4 (Υは Β, D, F、 H、 J又は Lのいずれかよ り選択される。 ） のいずれか一つをプラ イマ一として P C R又は RT— P C Rを行なうことができる。  One of PCR primers X1 to X4 (X is selected from any one of A, C, E, G, I and K) and PCR primers Υ1 to Υ4 (Υ又 は, D, F, H, J, or L) PCR or RT-PCR can be performed using any one of the primers as a primer.
上述の通り、 本発明において得られた組換え DN Aベクタ一 pML 4 8挿入 配列上には、 6つの構造遺伝子 （m l c A、 m l c B、 m l c C、 m l c D、 m 1 c E及び m 1 c R) の存在が推定された。 これらの 6つの構造遺伝子の c DN Aは、 逆転写反応並びに該 P C R用プライマー X 1乃至 X 4のいずれか一つ及び P C R用プライマー Y 1乃至 Y 4のいずれか一つによる P C Rを組み合せた R T 一 P C Rによ り取得することができる。 また、 各構造遺伝子は、 P C R用プライ マー X 1乃至 X 4のいずれか一つ及び P C R用プライマ一 Y 1乃至 Y 4のいずれ か一つをプライマーと し、 ML— 2 3 6 B生産菌のゲノム DN Aを铸型と した P C Rにより取得することができる。  As described above, the six structural genes (mlc A, mlc B, mlc C, mlc D, m1cE and m1c) were placed on the pML48 insert sequence of the recombinant DNA vector obtained in the present invention. R) was estimated. The cDNA of these six structural genes was obtained by combining RT with a reverse transcription reaction and PCR using any one of the PCR primers X1 to X4 and any one of the PCR primers Y1 to Y4. I) It can be obtained by PCR. Further, each of the structural genes uses any one of the primers X1 to X4 for PCR and any one of the primers Y1 to Y4 for PCR as primers to generate the ML-236B-producing bacteria. Genomic DNA can be obtained by PCR using type III.
完全長であり且つ適当な宿主細胞において発現し得る c DN Aを取得するため の P C R用プライマーとしては、 次の①において述べる、 P C R用プライマ一 X 1乃至 X 4のいずれか一つ及び P C R用プライマー Y 1乃至 Y 4のいずれか一つ の組み合わせが好適に使用される。 To obtain cDNA that is full-length and can be expressed in a suitable host cell As the primer for PCR, a combination of any one of primers X1 to X4 for PCR and any one of primers Y1 to Y4 for PCR, which will be described in the following (2), is preferably used.
① m 1 c Aの c DN Aの取得には、 P C R用プライマー A 1乃至 A 4のいずれか 一つ、 及び P C R用プライマー B 1乃至 B 4のいずれか一つの組み合わせが好適 に使用される。  (1) For obtaining the cDNA of m1cA, a combination of any one of the primers A1 to A4 for PCR and any one of the primers B1 to B4 for PCR is suitably used.
m.l c Bの c DN Aの取得には、 P C R用プライマ一 C 1乃至 C 4のいずれか 一つ、 及ぴ P C R用プライマ一 D 1乃至 D 4のいずれか一つの組み合わせが好適 に使用される。  For obtaining the cDNA of mlc B, any one of PCR primers C1 to C4 and any one of PCR primers D1 to D4 are preferably used. .
m l c Cの c DN Aの取得には、 P C R用プライマー E 1乃至 E 4のいずれか 一つ、 及び P C R用プライマー F 1乃至 F 4のいずれか一つの組み合わせが好適 に使用される。  For obtaining the cDNA of mlcC, a combination of any one of the primers E1 to E4 for PCR and any one of the primers F1 to F4 for PCR is suitably used.
m l c Dの c D N Aの取得には、 P C R用プライマー G 1乃至 G 4のいずれか 一つ、 及ぴ P C R用プライマー H I乃至 H 4のいずれか一つの組み合わせが好適 に使用される。  For obtaining the cDNA of mlcD, a combination of any one of the primers G1 to G4 for PCR and any one of the primers HI to H4 for PCR is suitably used.
m l c Eの c DN Aの取得には、 P C R用プライマー I 1乃至 1 4のいずれか 一つ、 及び P C R用プライマー J 1乃至 J 4のいずれか一つの組み合わせが好適 に使用される。  For obtaining the cDNA of mlcE, a combination of any one of primers I1 to 14 for PCR and any one of primers J1 to J4 for PCR is preferably used.
m l c Rの c D N Aの取得には、 P C R用プライマー K 1乃至 K 4のいずれか 一つ、 及び P C R用プライマー L 1乃至 L 4のいずれか一つの組み合わせが好適 に使用される。  For the acquisition of cDNA of mlCR, a combination of any one of primers K1 to K4 for PCR and any one of primers L1 to L4 for PCR is suitably used.
さらに、 P C R用プライマー X I乃至 X 4には以下の②の要件が伴う。  Further, the primers XI to X4 for PCR have the following requirement (1).
② P C R用プライマー X 1乃至 X 4は、 該 P C R用プライマー X 1乃至 X 4のい ずれか一つ及び P C R用プライマー Y 1乃至 Y 4のいずれか一つをプライマーと した P C R産物が本来の位置に翻訳開始コ ドン a t gを含み且つ該翻訳開始コ ド ンよ り開始される翻訳フレーム中には本来の位置以外に翻訳終止コ ドンを含まな いよ うに設計される （なお、 配列表の配列番号 1のヌク レオチド番号 1乃至 3 4 2 0 3に示される塩基配列及び配列表の配列番号 2のヌク レオチド番号 1乃至 3 4 2 0 3に示される塩基配列における、 本発明において推定された各構造遺伝子 の翻訳開始コ ドンの位置は、 表 4に記載されている） 。 (2) PCR primers X1 to X4 are located in the original positions of the PCR products using any one of the PCR primers X1 to X4 and any one of the PCR primers Y1 to Y4 as primers. The translation frame is designed so as to contain a translation initiation codon atg and to include no translation termination codon other than the original position in the translation frame started from the translation initiation codon (see SEQ ID NO: Nucleotide number 1 to 3 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 The position of the translation initiation codon of each structural gene estimated in the present invention in the nucleotide sequence shown in 4203 is described in Table 4).
P C R用プライマ一 X Iは c DNAの翻訳開始コ ドン a t g中の a又はそれよ り 5 ' —側の塩基を 5 ' —末端とする。  Primer XI for PCR has a 5′-terminal at the a or 5′-side base thereof in the translation initiation codon atg of cDNA.
P C R用プライマ一 X 2乃至 X 4は配列表の配列番号 1のヌク レオチド番号 1 乃至 3 4 2 0 3に示される塩基配列上又は配列表の配列番号 2のヌク レオチド番 号 1乃至 3 4 2 0 3に示される塩基配列上の特定の領域と選択的にァニーリ ング する （配列表の配列番号 2の全塩基配列は、 配列表の配列番号 1の全塩基配列に 対して完全に相補的である。 ） 。  The primers for PCR X2 to X4 are on the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 1 to 324203 or the nucleotide numbers 1 to 34 in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing. Selectively anneals to a specific region on the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 03 (The entire nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing is completely complementary to the entire nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. is there. ) .
P C R用プライマー X 2乃至 X 4が翻訳開始コ ドン a t gよ り 3 ' —側の塩基 配列を含む場合、 翻訳開始コ ドン a t gよ り 3 ' —側の塩基配列上に開始コ ドン a t gから始まる翻訳フ レーム中に終始コ ドンとなるよ うな塩基配列 （ t a a、 t a g又は t g a ) は含まれない。 なお、 開始コ ドン a t gから始まる翻訳フ レ ームとは、 翻訳開始コ ドン a t gより 3 ' —側の塩基配列を翻訳開始コ ドン a t gから 3塩基単位に分割したときに生じる 3塩基からなる配列をいう。  If the PCR primers X2 to X4 contain a nucleotide sequence 3 'to the translation initiation codon atg, translation starting from the initiation codon atg on the nucleotide sequence 3' to the translation initiation codon atg The base sequence (taa, tag, or tga) that is a codon in the frame is not included. The translation frame starting from the start codon atg is a sequence consisting of three bases generated when the base sequence 3'-side from the translation start codon atg is divided into three base units from the translation start codon atg. Say.
P C R用プライマ一 X 2乃至 X 4力；、 翻訳開始コ ドンの a、 & 1又は & 1 8 ( 「塩基又は塩基配列 m」 という。 ） にその位置で対応する塩基又は塩基配列 ( 「塩基又は塩基配列 m' 」 という。 ） を含む場合、 塩基又は塩基配列 mが aの とき、 塩基又は塩基配列 m' は aであり、 且つ、 塩基又は塩基配列 m' の aは、 該 P C R用プライマー X 2乃至 X 4の 3 ' —末端に位置する。 塩基又は塩基配列 mが a tのとき、 塩基又は塩基配列 m' は a tであり、 且つ、 塩基又は塩基配列 m' の a tは、 該 P C R用プライマ一 X 2乃至 X 4の 3 ' —末端に位置する。 塩 基又は塩基配列 mが a t gのとき、 塩基又は塩基配列 m' は a t gであり、 且つ、 塩基又は塩基配列 m' の a t g中の aを 1番目と して 3 ' —方向に数えて 3 X n + 1 (nは 1以上の整数） 番目のヌク レオチドを 5 ' —末端とする ト リヌク レオ チドが該 P C R用プライマ一 X 2乃至 X 4に存在する場合、 該トリヌク レオチド の塩基配列が t a a、 t a g及び t g aのいずれかであることはない。 PCR primers X2 to X4; a base or base sequence (“base or base sequence”) corresponding to the translation initiation codon a, & 1 or & 18 (referred to as “base or base sequence m”) at that position. When the base or the base sequence m is a, the base or the base sequence m ′ is a, and a of the base or the base sequence m ′ is the PCR primer X Located at the 3'-end of 2 to X4. When the base or base sequence m is at, the base or base sequence m 'is at, and the at of base or base sequence m' is located at the 3'-end of the PCR primers X2 to X4. I do. When the base or base sequence m is atg, the base or base sequence m 'is atg, and a in the atg of the base or base sequence m' is the first and 3 X is counted in the 3'-direction. When the n + 1 (n is an integer of 1 or more) nucleotide at the 5′-terminal is present in the PCR primers X2 to X4, the nucleotide sequence of the trinucleotide is taa. , Tag or tga.
P C R用プライマ一 X 2乃至 X 4の 3 ' —末端が、 翻訳開始コ ドン a t g中の a を 1番目と して 3 ' —方向に数えて 3 X n + l (nは 1以上の整数） 番目のヌ ク レオチドであるとき、 該 P C R用プライマ一 X 2乃至 X 4を一方のプライマー と し、 ML— 2 3 6 B生産菌の R N A若しくは m R N Aを铸型とする RT— P C R産物又はゲノム DNA若しく は c DN Aを铸型とする P C R産物において、 3 X n + 1番目のヌク レオチド及びその 3 ' —側に隣接するジヌク レオチドからな る ト リヌク レオチドの塩基配列が t a a、 t a g及び t g aのいずれかであるこ とはない。 The 3'-end of the PCR primers X2 to X4 is When a is the first nucleotide in the 3 X n + l (n is an integer of 1 or more) counting in the 3′-direction with a being the first, the PCR primers X2 to X4 are used as one of the primers. In the case of an RT-PCR product that uses RNA or mRNA of a ML—236B-producing bacterium as type III, or a PCR product that uses genomic DNA or cDNA as type III, the 3Xn + 1st The nucleotide sequence of a trinucleotide consisting of a nucleotide and a dinucleotide adjacent to the 3′-side is not taa, tag, or tga.
P C R用プライマー X 2乃至 X 4のいずれか一つの 3 ' . —末端が、 翻訳開始コ ドン a t g中の aを 1番目と して 3 ' —方向に数えて 3 X n + 2 (nは 1以上の 整数） 番目のヌク レオチ ドであるとき、 該 P C R用プライマー X 2乃至 X 4を一 方のプライマーとし、 ML— 2 3 6 B生産菌の RNA若しくは mRNAを铸型と する R T— P C R産物又はゲノム DNA若しくは c D N Aを踌型とする P C R産 物において、 3 X n + 2番目のヌク レオチド及ぴその 3 ' —側並びに 5 ' —側に 隣接する 2つのモノヌク レオチドからなる ト リヌク レオチドの塩基配列が t a a , t a g及び t g aのいずれかであることはなレ、。  3 ′ of any one of PCR primers X 2 to X 4. —Terminal is 3 X n + 2 (n is 1 RT-PCR product that uses the PCR primers X2 to X4 as one primer and the RNA or mRNA of the ML-236B-producing bacterium as the 铸 -type nucleotide. Or, in a PCR product having genomic DNA or cDNA as a type III, a trinucleotide consisting of a 3Xn + 2nd nucleotide and two mononucleotides adjacent to its 3′- and 5′-sides The base sequence may not be any of taa, tag and tga.
P C R用プライマー X 2乃至 X 4の 3 ' —末端が、 翻訳開始コ ドン a t g中の aを 1番目と して 3 ' —方向に数えて 3 X n + 3 (nは 1以上の整数） 番目のヌ ク レオチ ドであるとき、 3 X n + l乃至 3 X n + 3番目のヌク レオチドからなる ト リ ヌク レオチドの塩基配列が t a a、 t a g及び t g aのいずれかであること はない。  The 3'-end of the PCR primers X2 to X4 is 3Xn + 3 (n is an integer of 1 or more) in the 3'-direction, with a in the translation initiation codon atg as the first. The nucleotide sequence of the trinucleotide consisting of the 3 × n + 1 to 3 × n + 3 nucleotides is not any of taa, tag and tga.
以上が②の要件である。  The above is the requirement of ①.
また、 P C R用プライマー Y 1乃至 Y 4には以下の③の要件が伴う。  In addition, the primers Y1 to Y4 for PCR have the following requirement (3).
③ P C R用プライマー Y 1乃至 Y 4は、 P C R用プライマー X 1乃至 X 4のいず れか一つ及び該 Y 1乃至 Y 4のいずれか一つをプライマーとする P C Rによ り、 各構造遺伝子 （m l c A、 m l c B、 m l c C、 m l c D、 m l c E及び m 1 c R) にコードされるぺプチドの N末端から C末端までをコ一ドした c DNAを増 幅できるように設計される。 ③ The PCR primers Y1 to Y4 are prepared by PCR using any one of the PCR primers X1 to X4 and any one of the primers Y1 to Y4 as primers. (Mlc A, mlc B, mlc C, mlc D, mlc E and m1cR) are designed to amplify cDNA encoding the N-terminal to C-terminal of the peptide encoded by it. .
P C R用プライマ一 Y 1は、 c DNA上の翻訳終止領域附近の塩基配列に対し て相補的な塩基配列を有する P C R用プライマーであれば特に限定されないが、 好適には翻訳終止コ ドンの 3 ' —末端の塩基に対して相補的な塩基又はそれよ り 5 ' 一側の塩基を 5 ' —末端とする塩基配列を有し、 よ り好適には翻訳終止コ ド ンに対して相補的な 3塩基の配列を有する （なお、 本発明において推定された各 構造遺伝子の翻訳終止コ ドン、 該翻訳終止コ ドンの相補配列、 各構造遺伝子にコ 一ドされるぺプチドの C末端のアミ ノ酸残基、 該ァミ ノ酸残基をコー ドした塩基 配列、 並びに、 配列表の配列番号 1のヌク レオチド番号 1乃至 3 4 2 0 3に示さ れる塩基配列及び配列表の配列番号 2のヌク レオチド番号 1乃至 3 4 2 0 3に示 される塩基配列におけるそれらの位置は、 表 8乃至 1 0に記載されている） 。 The PCR primer Y1 is used for the base sequence near the translation termination region on the cDNA. The primer is not particularly limited as long as it is a PCR primer having a complementary base sequence, but is preferably a base complementary to the 3′-terminal base of the translation termination codon or a base 5 ′ to one side thereof. Has a 5′-terminal nucleotide sequence, and more preferably has a 3 nucleotide sequence complementary to the translation termination codon (the translation termination of each structural gene estimated in the present invention). A codon, a sequence complementary to the translation termination codon, a C-terminal amino acid residue of a peptide encoded by each structural gene, a base sequence encoding the amino acid residue, and The positions of the nucleotide sequences represented by the nucleotide numbers 1 to 324 of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing and those represented by the nucleotide sequences represented by the nucleotide numbers 1 to 324 of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing are as follows. , Tables 8-10).
P C R用プライマー Y 2乃至 Y 4は、 配列表の配列番号 1のヌク レオチド番号 1乃至 3 4 2 0 3に示される塩基配列上又は配列表の配列番号 2のヌク レオチド 番号 1乃至 3 4 2 0 3に示される塩基配列上の特定の領域と選択的にァニ一リ ン グする。 '  The primers for PCR Y 2 to Y 4 are the nucleotide numbers 1 to 3 4 0 on the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 2 in the sequence listing. Selectively anneals to a specific region on the base sequence shown in 3. '
以上が③の要件である。  The above is the requirement of (3).
さらに、 P C R用プライマー X 2乃至 X 4及び P C R用プライマー Y 2乃至 Y 4は、 上述の定義及び②及び③記載の要件を満たす限りにおいて、 それぞれの 5 ' —末端に適宜塩基配列を付加させることが可能である。 そのような塩基配列 としては、 該ブライマーが P C Rに使用可能であれば特に限定されないが、 例え ば、 P C R産物についてその後のクローニング操作を行なうのに便利な塩基配列 等が挙げられ、 このよ うな塩基配列と して、 制限酵素認識配列及ぴ該制限酵素認 識配列を含む塩基配列が挙げられる。  Furthermore, as long as the primers X2 to X4 for PCR and the primers Y2 to Y4 for PCR satisfy the definition described above and the requirements described in (1) and (3) above, a nucleotide sequence should be appropriately added to their 5'-ends. Is possible. Such a base sequence is not particularly limited as long as the primer can be used for PCR, and examples thereof include a base sequence that is convenient for performing a subsequent cloning operation on the PCR product. Examples of the sequence include a restriction enzyme recognition sequence and a base sequence containing the restriction enzyme recognition sequence.
また、 P C R用プライマ一 X 1乃至 X 4及び P C R用プライマー Y 1乃至 Y 4 の設計は、 前述の P C R用プライマーの設計に関する記述に従って行なう。 陽性クローンの保有する組換え DN Aベクターの機能発現は、 該組換え DN A べクターで細胞を形質転換し、 該形質転換細胞の ML— 2 3 6 B生産能を測定す ることにより行なうことができる。 機能発現を行なう細胞と しては、 上述の ML - 2 3 6 B生産菌又は ML— 2 3 6 B非生産菌を用いることができる。 ML— 2 3 6 B非生産菌としては、 該 DNAベクターで形質転換される細胞であれば特に 限定されないが、 例えば、 上述の ML— 2 3 6 B生産菌の非生産変異株等が挙げ られる。 該変異株に形質転換することによ り ML— 2 3 6 Bの生産が回復すれば, 該組換え D N Aベクタ一が所望の機能を有すると推定することができる。 The design of the primers X1 to X4 for PCR and the primers Y1 to Y4 for PCR are performed in accordance with the above description on the design of the primer for PCR. Functional expression of the recombinant DNA vector possessed by the positive clone should be performed by transforming cells with the recombinant DNA vector and measuring the ML-236B-producing ability of the transformed cells. Can be. As the cells that express the function, the above-mentioned ML-236B-producing bacteria or ML-236B non-producing bacteria can be used. As the ML-236B non-producing bacterium, a cell transformed with the DNA vector is particularly preferable. Without limitation, for example, non-producing mutants of the above-mentioned ML-236B-producing bacteria and the like can be mentioned. When the production of ML-236B is restored by transforming the mutant strain, it can be estimated that the recombinant DNA vector has a desired function.
機能発現のための形質転換法は、 宿主細胞に依存して適宜選択される。 好適な M L - 2 3 6 B生産菌でるぺニシリ ゥム ' シト リナムの形質転換は、 ぺニシリ ゥ ム · シト リナムの胞子からプロ トプラス トを調製し、 該プロ トプラス トに組換え D N Aベクターを導入することによ り行なうことができる （Nara,F. , et al. , Cu rr. Genet.23, 28 (1993)記載） 。  A transformation method for expressing the function is appropriately selected depending on the host cell. Transformation of a suitable ML-236B producing bacterium, P. citrinum, is performed by preparing a protoplast from the spores of P. citrinum and adding a recombinant DNA vector to the protoplast. It can be performed by introduction (described in Nara, F., et al., Curr. Genet. 23, 28 (1993)).
プロ トプラス トの調製は以下の方法による。  Protoplasts are prepared as follows.
ぺニシリ ウム ' シト リナムを培養したスラントから P G A寒天培地のプレ一 ト へ該菌を接種し、 2 2乃至 2 8 °( 、 1 0乃至 1 4 日間保温し、 該プレー トから胞 子を回収し、 該胞子 1 X 1 07乃至 1 X 1 09個を 5 0乃至 1 0 0 m l の Y P L - 2 0培地 （組成 ； 0. 1 % /v)ィース トエキス トラク ト （D i f c o社製） 、 0. 5 % (w/v)ポリペプトン （日本製薬 （株） 製） 、 2 0 o/o (w/v)ラク ト一ス、 p H 5 - 0 ) に接種し、 2 2乃至 2 8で、 1 8時間乃至 2 日間保温する。 該培養物 から発芽胞子を回収し、 細胞壁分解酵素で処理し、 プロ トプラス トを得る。 細胞 壁分解酵素と しては、 ぺニシリ ウム · シト リナムの細胞壁を分解するものであり 且つ該菌に有害な作用を及ぼさないものであれば特に限定されないが、 例えば、 ザィモリアーゼ、 キチナ一ゼ等が挙げられる。 The bacteria are inoculated on a PGA agar plate from the slant in which Penicillium 'citrinum has been cultured, incubated at 22 to 28 ° (for 10 to 14 days), and spores are collected from the plate. and, spores 1 X 1 0 7 to 1 X 1 0 9 pieces of 5 0 to 1 0 0 ml of YPL - 2 0 medium (composition; 0. 1% / v) Isu Toekisu tractor preparative (D Ifco Co.) , 0.5% (w / v) polypeptone (manufactured by Nippon Pharmaceutical Co., Ltd.), 20 o / o (w / v) lactose, pH 5-0), and 22 to 28 Incubate for 18 hours to 2 days. Germinated spores are collected from the culture and treated with a cell wall degrading enzyme to obtain protoplasts. The cell wall degrading enzyme is not particularly limited as long as it degrades the cell wall of Penicillium citrinum and does not exert a harmful effect on the bacterium. Examples thereof include zymoliase and chitinase. Is mentioned.
形質転換された ML— 2 3 6 B生産菌の培養は、 各宿主細胞に適した条件下で 行なうことができるが、 好適な ML— 2 3 6 B生産菌であるべニシリ ゥム · シト リナムの形質転換体の場合は、 M L— 2 3 6 Bを生産させる前に、 形質転換され た該菌のプロ トプラス トを適当な条件下で培養することにより予め細胞壁を再生 させておく。  Culture of the transformed ML-236B-producing bacteria can be carried out under conditions suitable for each host cell, but the preferred ML-236B-producing bacteria, Benicillium citrinum In the case of the transformant, the cell wall is regenerated by culturing the transformed protoplasts under appropriate conditions before producing ML-236B.
該細胞壁の再生は、 形質転換したぺニシリ ウム ， シト リナムのプロ トプラス ト を封入した V G S中層寒天培地 （組成 ； V o g e 1 最小培地、 2 % (w/v)ダルコ ース、 1 Mグルシトール、 2 % (w/v)寒天） を VG S下層寒天培地 （組成 ； V o g e 1最小培地、 2 % (w/v)グルコース、 1 Mグルシトール、 2. 7 % (w/v)寒 天） 及び VG S上層寒天培地 （組成 ； V o g e 1最小培地、 2 % (w/v)ダルコ一 ス、 1 Mグルシトール、 1. 5 %(w/v)寒天） で挟み、 2 2乃至 2 8°( 、 7乃至 1 5 日間保温することによ り行なうことができる。 得られた菌株は P G A培地上 で、 2 2乃至 2 8°Cで保温しつつ継代培養する。 該菌株を P G A培地で作製した スラントに白金耳を用いて接種し、 2 2乃至 2 8°< 、 1 0乃至 1 4 日間保温し、 0乃至 4。Cで保存する。 The cell wall was regenerated by transforming VGS medium agar medium containing the transformed penicillium and citrinum protoplasts (composition: Voge 1 minimal medium, 2% (w / v) dalcose, 1 M glucitol, 2% (w / v) agar) VGS lower layer agar medium (composition: Voge 1 minimal medium, 2% (w / v) glucose, 1M glucitol, 2.7% (w / v) agar ) And VGS upper layer agar medium (composition: Voge 1 minimal medium, 2% (w / v) Darcos, 1M glucitol, 1.5% (w / v) agar), 22 to 2 The strain can be subcultured on a PGA medium while keeping the temperature at 22 to 28 ° C. The strain can be subcultured on a PGA medium at a temperature of 22 to 28 ° C. The slant prepared in the medium is inoculated with a platinum loop, kept at 22 to 28 ° <for 10 to 14 days, and stored at 0 to 4.C.
上述の通り細胞壁を再生させたぺニシリ ウム · シト リナムの形質転換体を培養 したスラントから、 MB G 3— 8培地へ該形質転換体を接種し、 2 2乃至 2 8°( 、 7乃至 1 2 日間、 振盪しつつ保温することによ り、 ML— 2 3 6 Bを効率よく生 産することができる。 なお、 宿主細胞のぺニシリ ウム · シト リナムについても、 全く同様の液体培養によ り ML— 2 3 6 Bを生産させることができる。  From a slant in which a transformant of Penicillium citrinum in which the cell wall was regenerated as described above was cultured, the transformant was inoculated into MBG3-8 medium, and 22 to 28 ° (, 7 to 1). By maintaining the temperature for 2 days while shaking, ML-236B can be produced efficiently.The host cells, Penicillium and Citrineum, can be produced by the same liquid culture. ML—236 B can be produced.
ML— 2 3 6 B生産菌の培養物からの ML— 2 3 6 Bの精製は、 通常天然物の 精製に使用される諸技法を組み合わせることによ りなされる。 該諸技法としては、 特に限定されないが、 例えば、 遠心分離、 濾過による固液分離、 アルカ リ又は酸 処理、 有機溶媒による抽出、 転溶、 吸着及び分配等の各種クロマ トグラフィー、 結晶化等が挙げられる。 ML— 2 3 6 Bは、 ヒ ドロキシ酸体とラク トン体の両方 の形をと り、 相互に変換し、 更に、 ヒ ドロキシ酸体は安定な塩を形成する。 この ような物理化学的特質を利用して、 ML— 2 3 6 Bのヒ ドロキシ酸体 （以下、 「遊離型ヒ ドロキシ酸」 という。 ） 、 ML— 2 3 6 Bのヒ ドロキシ酸塩 （以下、 「ヒ ドロキシ酸塩」 とレヽう。 ） 、 又は ML— 2 3 6 Bのラク トン体 （以下、 「ラ ク トン」 という。 ） を得ることができる。  Purification of ML-236B from cultures of ML-236B-producing bacteria is accomplished by combining techniques commonly used for the purification of natural products. Examples of the various techniques include, but are not limited to, centrifugation, solid-liquid separation by filtration, alkali or acid treatment, extraction with an organic solvent, phase transfer, adsorption and distribution, and various types of chromatography, crystallization, and the like. No. ML-236B takes the form of both the hydroxy and lactone forms, which are converted to each other, and the hydroxy form forms stable salts. Utilizing such physicochemical properties, ML-236B hydroxy acid form (hereinafter referred to as "free hydroxy acid"), ML-236B hydroxy acid salt (hereinafter referred to as "free hydroxy acid") , Or “hydroxylate”), or a lactone form of ML-236B (hereinafter referred to as “lactone”).
該培養物を、 加熱下又は常温下でアルカ リ加水分解することにより開環し、 ヒ ドロ.キシ酸塩に変換し、 該反応溶液を酸性にした後濾過し、 濾液を水と混和しな い有機溶媒で抽出することによ り、 目的化合物を遊離型ヒ ドロキシ酸として得る ことができる。 水と混和しない有機溶媒と しては、 特に限定されるものではない 力；、 例えば、 へキサン、 ヘプタン等の脂肪族炭化水素類、 ベンゼン、 トルエン等 の芳香族炭化水素類、 メチレンクロ リ ド、 クロ口ホルム等のハロゲン化炭化水素 類、 ジェチルエーテル等のエーテル類、 蟻酸ェチル、 酢酸ェチル等のエステノレ類、 それら 2種以上の混合溶媒等が挙げられる。 The culture is opened by heating or at room temperature to hydrolyze and hydrolyze to convert to a hydroxylate, the reaction solution is acidified and filtered, and the filtrate is not mixed with water. By extracting with an organic solvent, the target compound can be obtained as free hydroxy acid. The organic solvent that is immiscible with water is not particularly limited; for example, aliphatic hydrocarbons such as hexane and heptane, aromatic hydrocarbons such as benzene and toluene, methylene chloride, and the like. Halogenated hydrocarbons such as black form, ethers such as getyl ether, ethenolees such as ethyl formate and ethyl acetate, Examples thereof include a mixed solvent of two or more thereof.
また、 この遊離型ヒ ドロキシ酸を、 水酸化ナト リ ウム等のアルカリ金属塩類の 水溶液に転溶することによ り、 目的化合物をヒ ドロキシ酸塩として得ることがで きる。  The target compound can be obtained as a hydroxy acid salt by dissolving the free hydroxy acid in an aqueous solution of an alkali metal salt such as sodium hydroxide.
さらに、 この遊離型ヒ ドロキシ酸を、 有機溶媒中で加熱して脱水するか、 又は 他の方法によ り閉環することによ り、 目的化合物をラク トンとして得ることがで きる。  Further, the target compound can be obtained as a lactone by dehydrating the free hydroxy acid by heating in an organic solvent or by closing the ring by another method.
このよ うにして得ることができる遊離型ヒ ドロキシ酸、 ヒ ドロキシ酸塩及びラ ク トンは、 カラムクロマ トグラフィー等により精製、 単離することが可能である カラムクロマ トグラフィーの担体と しては、 特に限定されるものではないが、 例 えば、 セフアデックス LH— 2 0 (P h a r m a c i a社製） 、 ダイヤイオン The free hydroxy acid, hydroxy acid salt and lactone thus obtained can be purified and isolated by column chromatography or the like. Although not particularly limited, for example, Sephadex LH-20 (manufactured by Pharmacia), Diaion
H P— 2 0 (三菱化学 （株） 製） 、 シリカゲル、 逆相系担体等が挙げられ、 好 適には C 1 8系の担体である。 Examples thereof include HP-20 (manufactured by Mitsubishi Chemical Corporation), silica gel, and a reversed-phase carrier, and a C18-based carrier is preferred.
ML - 2 3 6 Bの定量法としては、 通常有機化合物の定量に用いられる方法で あれば特に限定されないが、 例えば、 逆相高性能クロマ トグラフィー （ r e v e r s e p h a s e h i g h p e r f o r m a n c e l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y : 以下、 「逆相 H P L C」 とレ、う。 ） 法等が挙げられ る。 逆相 H P L C法による定量は、 ML— 2 3 6 B生産菌の培養物をアルカリ加 水分解し、 可溶性画分を C 1 8カラムを用いた逆相 H P L Cに供し、 紫外吸収を 測定し、 該吸収を定量化することにより行なうことがきる。 C 1 8カラムと して は、 通常の逆相 H P L Cに使用される C 1 8力ラムであれば特に限定されないが、 例えば、 S S C— O D S— 2 6 2 (直径 6 mm、 長さ 1 0 0 mm ： センシユー科 学 （株） 製） 等が挙げられる。 移動相と しては、 通常逆相 H P L Cに使用される 溶媒であれば特に限定されないが、 例えば、 7 5 % (v/v)メタノール一 0. 1 % (v/v) ト リェチルァミ ン一 0. 1 % (v/v)酢酸等が挙げられる。 移動相に流速 2 m 1 /分の 7 5 % (v/v)メタノール一 0. 1 % (v/v) ト リェチルァミン一 0 · 1 % (V /v)酢酸を用いて S S C -OD S - 2 6 2カラムに ML— 2 3 6 Bを室温で添加 すると、 4. 0分後に溶出される。 ML— 2 3 6 Bの検出は、 H P L C用 UV検 出器を用いて行なうことができ、 UV検出器の吸収波長は、 2 2 0乃至 2 8 0 η mであり、 好適には 2 2 0乃至 2 6 0 n m、 より好適には 2 3 6 n mである。 機能発現が確認された遺伝子を有する所望の組換え D N Aべクタ一は、 ML— 2 3 6 Bの生産性の改善に有用である。 The method for quantifying ML-236B is not particularly limited as long as it is a method usually used for the quantification of organic compounds. For example, reverse-phase high-performance chromatography (hereinafter referred to as “reverse-phase HPLC”) ) And the law. For quantification by the reversed-phase HPLC method, cultures of ML-236B-producing bacteria were hydrolyzed with alkali, and the soluble fraction was subjected to reversed-phase HPLC using a C18 column to measure ultraviolet absorption. This can be done by quantifying the absorption. The C18 column is not particularly limited as long as it is a C18 column used for ordinary reversed-phase HPLC. For example, SSC—ODS—262 (diameter 6 mm, length 100 mm: manufactured by Sensyu Science Co., Ltd.). The mobile phase is not particularly limited as long as it is a solvent usually used for reverse phase HPLC.For example, 75% (v / v) methanol-0.1% (v / v) triethylamine-0.1 1% (v / v) acetic acid and the like. SSC -OD S-using 75% (v / v) methanol 0.1% (v / v) triethylamine 0.1% (V / v) acetic acid as the mobile phase at a flow rate of 2 m1 / min When ML-236B is added to the 262 column at room temperature, it elutes after 4.0 minutes. ML-236B detection was performed by UV detection for HPLC. The absorption wavelength of the UV detector is 220 to 280 ηm, preferably 220 to 260 nm, more preferably 236 nm. It is. A desired recombinant DNA vector having a gene whose functional expression has been confirmed is useful for improving the productivity of ML-236B.
なお、 本明細書においては、 アデニンを 「 a」 、 グァニンを 「 g」 、 チミンを 「 も」 、 シトシンを 「 c」 とそれぞれ記載する。 配列表の各配列番号に示される 塩基配列は、 「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書等の作成のためのガイ ド ライン （特許庁刊行、 平成 1 0年 6月） 」 に従って記載した。  In this specification, adenine is described as "a", guanine is described as "g", thymine is described as "mo", and cytosine is described as "c". The nucleotide sequence shown in each SEQ ID NO in the sequence listing is described in accordance with “Guidelines for Preparation of Specifications and the like Containing Base Sequence or Amino Acid Sequence (published by the Patent Office, June 2010)”.
「図面の簡単な説明」 "Brief description of the drawings"
図 1 ： 大腸菌及び糸状菌に導入させることができ且つ長い DN Aを挿入する ことができる DNAベクタ一 p S AK c o s 1の構築図。  Figure 1: Construction diagram of pSAK cos1, a DNA vector that can be introduced into E. coli and filamentous fungi and can insert a long DNA.
図 2 ： p ML 4 8挿入配列の構造遺伝子解析。  Figure 2: Structural gene analysis of the pML48 insertion sequence.
図 3 ： p M L 4 8挿入配列のノーザンブロ ッ ト · ノ、イブリ ダイゼ一ション。  Figure 3: Northern blot, hybridization of the pML48 insertion sequence.
「発明を実施するための最良の形態」 "Best mode for carrying out the invention"
以下に実施例及び試験例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、 本発明は これらに限定されない。 実施例 p S AK c o s 1ベクターの作製  Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples and Test Examples, but the present invention is not limited thereto. Example p Preparation of SAK cos1 vector
1 ) 大腸菌由来のハイ グロマイシン Bホスフォ トランスフエラーゼ遺伝子をもつ プラスミ ド p S AK 3 3 3 (特開平 3 - 2 6 2 4 8 6号公報記載） を制限酵素 B amH r (宝酒造 （株） 製） で消化し、 T 4 DNAポリ メラーゼ （宝酒造 （株） 製） で末端を平滑化した。  1) Plasmid pSAK333 (described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 3-226486) having a hygromycin B phosphotransferase gene derived from Escherichia coli was replaced with a restriction enzyme BamHr (Takara Shuzo Co., Ltd.). ) And blunt-ended with T4 DNA polymerase (Takara Shuzo Co., Ltd.).
2 ) DNA l i g a t i o n k i t V e r . 2 (宝酒造 （株） 製） を用い て上記 DN A断片を自己環状化し、 大腸菌のコンビ一テント ' セル J M 1 0 9株 2) The DNA fragment was self-cyclized using DNAligonikitVer.2 (Takara Shuzo Co., Ltd.), and the E. coli combination tent 'cell JM109 strain
(宝酒造 （株） 製） を形質転換した。 形質転換大腸菌から B a mH I部位を欠失 したプラスミ ドを保有する株を選抜し、 この株が保有するプラスミ ドを p S AK 3 6 0 と命名した。 (Manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.). A strain carrying a plasmid lacking the BamHI site was selected from the transformed Escherichia coli, and the plasmid carried by this strain was transformed into pSAK. It was named 360.
3 ) p S AK 3 6 0を制限酵素 P v u I I で消化した後、 アル力リ フォスファタ ーゼ処理を行い、 5 ' 末端の脱リ ン酸化を行なった。 コス ミ ドベクター pWE l 5 (S T RATAG E N E社製） からコス （ c o s ) 部位を含む [ S a 1 I — S c a. I ] 断片 （約 3 k b ) を取得し、 T 4 DNAポリ メラ一ゼにより末端を平 滑化した後、 p S A K 3 6 0の P V u I I 部位に連結し、 J M 1 0 9株を形質転 換した。 該形質転換大腸菌から [S a l I — S e a l ] 断片 （約 3 k b ) を P v u I I部位に挿入したプラスミ ドを保有する株を選抜し、 この株が保有するブラ スミ ドを p S A K c o s 1 と命名した。 p S AK c o s l は、 pWE 1 5由来の B a mH I 、 E c o R I及び N o t I の各制限酵素認識部位を 1つずつ有する。 また、 p S AK c o s lは選択マ一カーと して、 アンピシリ ン耐性遺伝子及びハ イダロマイシン耐性遺伝子を有している。 以下の実施例において、 大腸菌を宿主 とする場合、 p S AK c o s 1又は外来 DNAを挿入した p S AK c o s 1によ る形質転換体の選択は、 4 0 g/m l のアンピシリ ンを培地に添加して行なつ た。 ぺニシリ ウム ' シト リナム S ANK 1 3 3 8 0を宿主とする場合、 p S A K c o 1又は外来 D N Aを挿入した p S AK c o s lによる形質転換体の選択は. S O O /z g Zm l のハイグロマシシン B ( h y g r o m y c i n B ) を培地に 添加して行なつた。  3) pSAK365 was digested with the restriction enzyme PvuII, and then subjected to an alkaline phosphatase treatment, followed by dephosphorylation of the 5 'end. A [Sa1I—Sca.I] fragment (about 3 kb) containing a cosm (cos) site was obtained from the cosmid vector pWEl5 (manufactured by STRATAG ENE), and T4 DNA polymerase was obtained. After blunting the ends, the ligation was carried out at the PVuII site of pSAK365, and the JM109 strain was transformed. From the transformed Escherichia coli, a strain containing a plasmid in which a [Sal I — Seal] fragment (about 3 kb) was inserted into the PvuII site was selected, and the plasmid carried by this strain was replaced with p SAK cos 1 It was named. pSAKcosl has one restriction site for each of BamHI, EcoRI and NotI derived from pWE15. Also, pSAK cosl has an ampicillin resistance gene and a hidalomycin resistance gene as selection markers. In the following examples, when Escherichia coli is used as a host, selection of transformants using pSAK cos 1 or pSAK cos 1 into which foreign DNA has been inserted is performed by using 40 g / ml ampicillin in the medium. The addition was performed. When Penicillium 'Citrineum S ANK 133 0 80 is used as a host, selection of transformants by p SAK co1 or p SAK cosl into which foreign DNA has been inserted is performed. SOO / zg Zml hygromachicin B (hygromycin B) was added to the medium.
p S AK c o s 1の構築手順を図 1に記載した。 実施例 2. ぺニシリ ウム ' シト リナム— S A N K 1 3 3 8 0株のゲノム DNAの  The construction procedure of pSAK cos1 is described in FIG. Example 2. Penicillium 'citrineum-SNK13 330 strain genomic DNA
1 ) ぺニシリ ウム ' シト リナム S ANK 1 3 3 8 0株の培養 1) Culture of Penicillium 'Citulinum S ANK 133
ぺニシリ ウム . シト リナム S ANK 1 3 3 8 0株の種菌の培養は P G A寒天 培地を用いたスラントにて行なった。 すなわち、 ぺニシリ ウム ' シト リナム S The seed strain of Penicillium. Citrinum S ANK 13380 strain was cultured in a slant using a PGA agar medium. That is, Penicillium 'Citulinum S
AN K 1 3 3 8 0株を白金耳により接種し、 2 6 °Cにて 1 4 S間保温した。 この スラントは 4 °Cで保存した。 The ANK 13380 strain was inoculated with a platinum loop and kept at 26 ° C for 14S. This slant was stored at 4 ° C.
本培養は、 液体通気培養にて行なった。 上述のスラント 5 mm角の菌体を 5 0 m l の MB G 3— 8培地を入れた 5 0 0 m l 容の三角フラスコに接種し、 2 6 °C, 2 1 0 r p mの条件下で 5 日間振盪培養した。 The main culture was performed by liquid aeration culture. The above slant 5 mm square cells A 500 ml Erlenmeyer flask containing ml of MBG3-8 medium was inoculated, and cultured under shaking at 26 ° C and 210 rpm for 5 days.
2 ) ぺニシリ ウム ' シ ト リナム S ANK 1 3 3 8 0株の培養物からのゲノム D N Aの調製  2) Preparation of genomic DNA from cultures of Penicillium 'citrinum S ANK 13380 strain
1 ) の培養物を、 室温、 1 0 0 0 XGの条件下で 1 0分間遠心分離し、 菌体を 回収した。 湿重量 3 gの菌体を、 ドライアイスで冷却した乳鉢上で粉末になるま で破砕した。 菌体破砕物を 2 0 m 1 の 6 2. 5 mM E D T A · 2 N a (和光純 薬 （株） 製） — 5 % (w/v) S D S— 5 0 mM T r i s (和光純薬 （株） 製） 一 塩酸 （和光純薬 （株） 製） 緩衝液 （p H 8. 0 ) で満たした遠心管に入れ、 穏ゃ かに混合した後、 0 °Cにて 1時間静置した。 1 0 mM T r i s -塩酸— 0 · 1 mM Ε D Τ A · 2 Ν a ( ρ Η 8. 0 : 以下 「Τ Ε」 とレ、う。 ） で飽和した 1 0 m 1 のフエノールを添加し、 5 0 °Cにて 1時間穏やかに攪拌した。 室温、 1 0 0 0 0 XGの条件下で 1 0分間遠心分離した後、 1 5 m l の上層 （水相） を別の遠 心管にと り、 0. 5倍容の T E飽和フエノール及び 0. 5倍容のクロ口ホルム溶 液を加え、 2分間穏やかに攪拌した後、 室温、 1 0 0 0 0 XGの条件下で 1 0分 間遠心分離した （以下、 「フエノール ' ク ロ口ホルム抽出」 という。 ） 。 1 0 m 1 の上層 （水相） に 1 0 m 1 の 8 M 酢酸アンモニゥム （ p H 7. 5 ) 及び 2 5 m 1 の 2 プロパノール （和光純薬 （株） 製） を添加し、 8 0 °Cにて 1 5分間 冷却した後、 4°C、 1 0 0 0 0 XGの条件下で 1 0分間遠心分離した。 沈澱を 5 m l の T Eに溶解させた後、 2 0 μ 1 の 1 0 m g/m l リ ボヌク レア一ゼ A (S i g m a社製） 及び 2 5 0単位のリボヌク レアーゼ T l (G I B CO社製） を添 カロし、 3 7 °Cにて 2 0分間保温した。 これに 2 0 m 1 の 2 プロパノールを添加 し、 穏やかに混合した後、 糸状のゲノム DNAをパスツールピペッ トの先端に卷 きつけ、 1 m 1 の T E'に溶解させた。 この DNA溶液に 0. 1倍容の 3M 酢酸 ナト リ ウム （p H 6. 5 ) 及び 2. 5倍容のエタノールを加え、 8 0°Cにて 1 5分冷却した後、 4°C、 1 0 0 0 0 XGの条件下で 5分間遠心分離した （以下、 「エタノール沈澱」 という。 ） 。 得られた沈澱を 2 0 0 / 1 の T Eに溶解し、 ゲ ノム DN A画分とした。 実施例 3. ぺニシリ ウム ' シト リナム S ANK 1 3 3 8 0株のゲノム DNAラ イブラリ一の作製 The culture obtained in 1) was centrifuged at room temperature under a condition of 10000 XG for 10 minutes to collect the cells. Cells having a wet weight of 3 g were crushed in a mortar cooled with dry ice until they became powder. 20 ml of 62.5 mM EDTA · 2Na (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) — 5% (w / v) SDS—50 mM Tris (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) The mixture was placed in a centrifuge tube filled with a monohydrochloric acid (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) buffer (pH 8.0), mixed gently, and allowed to stand at 0 ° C. for 1 hour. 10 mM Tris-HCl-0.1 mM DΕAΕ2 2a (ρΗ8.0: hereafter referred to as ΤΤ), add 10 ml of phenol saturated with The mixture was gently stirred at 50 ° C for 1 hour. After centrifugation for 10 minutes at room temperature and 10000 XG, transfer 15 ml of the upper layer (aqueous phase) to another centrifuge tube, and add 0.5 volume of TE-saturated phenol and 0. Add a 5-fold volume of clonal form solution, gently stir for 2 minutes, and centrifuge for 10 minutes at room temperature at 1000 XG (hereinafter “Phenol” clonal form). Extraction.) To the upper layer (aqueous phase) of 10 ml, add 10 ml of 8 M ammonium acetate (pH 7.5) and 25 ml of 2 propanol (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), and add 80 ml. After cooling at 15 ° C. for 15 minutes, the mixture was centrifuged at 4 ° C. under the conditions of 1000 XG for 10 minutes. After dissolving the precipitate in 5 ml of TE, 20 μl of 10 mg / ml ribonuclease A (Sigma) and 250 units of ribonuclease Tl (GIB CO) Then, the mixture was kept at 37 ° C for 20 minutes. Twenty ml of 2-propanol was added thereto, and the mixture was gently mixed. Then, the filamentous genomic DNA was wrapped around the tip of a Pasteur pipette and dissolved in 1 ml of TE '. To this DNA solution was added 0.1 volumes of 3M sodium acetate (pH 6.5) and 2.5 volumes of ethanol, cooled at 80 ° C for 15 minutes, and then cooled to 4 ° C. Centrifugation was performed for 5 minutes under the condition of 1000 XG (hereinafter referred to as "ethanol precipitation"). The resulting precipitate was dissolved in 200/1 TE to obtain a genomic DNA fraction. Example 3. Preparation of genomic DNA library of Penicillium 'Citrinaum S ANK 13380 strain
1 ) ゲノム D N A断片の調製  1) Preparation of genomic DNA fragment
実施例 2において得られたぺニシリ ウム ' シト リナム S ANK 1 3 3 8 0株 のゲノム DNA ( 5 0 μ g ) を含む 1 0 0 μ 1 の水溶液に、 0. 2 5単位の S a u 3 A I (宝酒造 （株） 製） を添加した後、 1.0、 3 0、 6 0、 9 0及び 1 2 0 秒経過後に 2 0 μ 1ずつサンプリ ングし、 各サンプルに 2 0 μ 1ずつの 0 · 5 Μ 0.25 units of S au 3 was added to an aqueous solution of 100 μl containing genomic DNA (50 μg) of Penicillium ′ citrinum S ANK 133 0 obtained in Example 2. After addition of AI (Takara Shuzo Co., Ltd.), samples were sampled by 20 μl after 1.0, 30, 60, 90 and 120 seconds, and each sample was subjected to 0 μl of 20 μl. 5 Μ
E DTA ( ρ Η 8. 0 ) を加えて制限酵素反応を停止した。 ァガロースゲル電 気泳動により、 得られた部分消化 DN Α断片を分離し、 3 0 k b以上の大きさを もつ DNA断片を含むァガロースゲルを回収した。 The restriction enzyme reaction was stopped by adding EDTA (ρΗ8.0). The obtained partially digested DNA fragment was separated by agarose gel electrophoresis, and an agarose gel containing a DNA fragment having a size of 30 kb or more was recovered.
回収したゲルを細かく砕き、 ウルトラフリー C 3遠心式ろ過ユニッ ト （日本ミ リポア （株） 製） に入れた。 — 8 0°Cにて 1 5分間冷却し、 ゲルを凍結した後、 3 7°Cにて 1 0分間保温してゲルを融解した。 5 0 0 0 XG、 5分間遠心分離し DNA抽出液を得た。 この DNA抽出液について、 フエノール · クロ口ホルム抽 出及びエタノ一ル沈澱を行ない、 得られた沈澱を少量の T Eに溶解した。  The collected gel was finely crushed and placed in an Ultrafree C3 centrifugal filtration unit (manufactured by Nippon Miripore Co., Ltd.). — After cooling at 80 ° C for 15 minutes and freezing the gel, it was kept at 37 ° C for 10 minutes to melt the gel. Centrifugation was performed at 5,000 XG for 5 minutes to obtain a DNA extract. The DNA extract was subjected to phenol / chloroform extraction and ethanol precipitation, and the resulting precipitate was dissolved in a small amount of TE.
2 ) D NAベクター p S AK c o s lの前処理  2) Pretreatment of DNA vector p S AK cos l
p S A K c o s 1 を制限酵素 B a mH I (宝酒造 （株） 社製） によ り消化した 後、 6 5°Cにて 3 0分間アルカ リ フォスファターゼ （宝酒造 （株） 製） 反応を行 つた。 反応終了液について、 フエノール ' クロ口ホルム抽出及びエタノール沈澱 を行ない、 得られた沈澱を少量の T Eに溶解した。 .  After digesting pSAKos1 with the restriction enzyme BamHI (Takara Shuzo Co., Ltd.), an alkaline phosphatase (Takara Shuzo Co., Ltd.) reaction was carried out at 65 ° C. for 30 minutes. The reaction-terminated liquid was subjected to phenol-chloroform extraction with ethanol and ethanol precipitation, and the resulting precipitate was dissolved in a small amount of TE. .
3 ) ライゲーシヨ ン及び i n v i t r oパッケージング  3) Ligation and invitro packaging
上記 1 ) 記載のゲノム D N A断片 （ 2 / g ) 及び上記 2 ) 記載の前処理済み p S AK c o s l ( l g) を混合し、 D NA l i g a t i o n k i t V e r . 2 (宝酒造 （株） 製） を用い、 1 6 °Cにて 1 6時間ライゲ一シヨ ン反応を行 なった。 反応終了液について、 フエノール ' クロ口ホルム抽出及びエタノール沈 澱を行ない、 得られた沈澱を 5 μ 1 の Τ Εに溶解させた。 ライゲーシヨ ン生成物 溶液を、 G I GA P AK I I G o l d (S T RATAG E N E社製） キソ トを用いた i n v i t r oパッケージングに供し、 組換え DNAベクターを含 む形質転換大腸菌を得た。 形質転換大腸菌のコロニーを形成させたプレー トに 3 m 1 の L B培地を注ぎ、 セルスク レ一パ一を用いてプレー ト上のコロニーを回収 した （回収液 1 という） 。 さらに 3 m 1 の L B培地でプレー トを洗浄、 回収したThe genomic DNA fragment (2 / g) described in 1) above and the pretreated pSAK cosl (lg) described in 2) above were mixed, and DNA ligationkit Ver. 2 (Takara Shuzo Co., Ltd.) was used. A Reigesion reaction was performed at 16 ° C for 16 hours. The reaction-terminated liquid was subjected to phenol / chloroform extraction and ethanol precipitation, and the resulting precipitate was dissolved in 5 μl of water. Transfer the ligation product solution to GIGA PAK IIG old (ST RATAG ENE) The resulting mixture was subjected to in vitro packaging using the recombinant DNA vector to obtain transformed E. coli containing the recombinant DNA vector. 3 ml of LB medium was poured into the plate on which the transformed E. coli colonies had been formed, and the colonies on the plate were collected using a cell scraper (referred to as “recovery solution 1”). The plate was further washed and recovered with 3 ml of LB medium.
(回収液 2という。 ) 。 回収液 1及び 2の混合液にグリセリ ンを終濃度 1 8 %と なるよ う加えたものを大腸菌菌体液と称し、 ぺニシリ ウム ' シト リナム S AN K 1 3 3 8 0株のゲノム DNAライブラ リ一として、 一 8 0°Cにて保存した。 実施例 4. ぺニシリ ウム ' シト リナム S ANK 1 3 3 8 0株のゲノム DNAを 鎵型と した P C Rによる P K S遺伝子断片の増幅 (This is referred to as recovery liquid 2.) A mixture of recovered solutions 1 and 2 with glycerin added to a final concentration of 18% is called Escherichia coli germ fluid, and the genomic DNA library of Penicillium 'Citulinum SANK 13380 strain is used. For storage, it was stored at 180 ° C. Example 4. Amplification of PKS gene fragment by PCR using genomic DNA of Penicillium 'citrinum S ANK13380 as type III
1 ) P C R用プライマーの設計及び合成  1) Design and synthesis of primers for PCR
ァスペルギルス . フラヴァス （Aspergillus flavus) の P K S遺伝子のアミ ノ酸配列 (Brown, D. W. , et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 1418 (1996)記載） に基づき、 配列表の配列番号 3及び 4に示されるミ ックス ' プライマーを設計し た。  Based on the amino acid sequence of the PKS gene of Aspergillus flavus (described in Brown, DW, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 1418 (1996)). The mix 'primers shown in 3 and 4 were designed.
歹1 J表の ai歹1 J番^" 3 ： gayacngcntgyasttc歹1 ai of J Table歹1 J number ^ "3: gayacngcntgyasttc
ϋ歹 IJ表の酉 S歹リ番号 4 ： tcnccnknrcwgtgncc  ϋ system IJ table rooster S system number 4: tcnccnknrcwgtgncc
なお、 配列表の配列番号 3及び 4に示される塩基配列において、 nはイノシン の塩基 （ヒポキサンチン） を、 yは t又は c を、 sは g又は cを、 kは g又は t を、 rは g又は aを、 wは a又は tを、 それぞれ表わす。  In the base sequences shown in SEQ ID NOs: 3 and 4 in the sequence listing, n represents the base of inosine (hypoxanthine), y represents t or c, s represents g or c, k represents g or t, and r represents Represents g or a, w represents a or t, respectively.
2 ) P C Rによる D N A断片の増幅  2) Amplification of DNA fragment by PCR
上記 2) 記載の P C R用プライマ一 （各 1 0 0 p m o 1 ) 、 実施例 2で得られ たぺニシリ ウム ' シト リナム S ANK 1 3 3 8 0株のゲノム DNA ( 5 0 0 η g ) 、 0. 2 mM d AT P、 0. 2 mM d CT P、 0. 2 mM d GT P、 0. 2 mM d TT P、 5 0 mM 塩化カ リ ウム、 2 mM 塩化マグネシウム及 び 1 . 2 5単位の E X . T a q DNAポリメラ一ゼ （宝酒造 （株） 製） を含む 5 0 μ 1 の反応液を、 9 4°( にて 1分間、 5 8 °Cにて 2分間、 7 0°Cにて 3分間、 の連続する 3工程からなるサイクル反応に供した。 このサイクルを 3 0回繰り返 すことによ り D N A断片を増幅した。 P C Rは、 T a K a R a P C R T h e r m a 1 C y c l e r MP T P 3 0 0 0 (宝酒造 （株） 製） を使用して行 なった。 The primers for PCR (100 pmo 1 each) described in 2) above, the genomic DNA (500 η g) of the Penicillium 'citrineum S ANK 13380 strain obtained in Example 2, 0.2 mM d ATP, 0.2 mM d CTP, 0.2 mM d GTP, 0.2 mM d TTP, 50 mM potassium chloride, 2 mM magnesium chloride and 1.25 50 μl of the reaction solution containing the unit of EX.Taq DNA polymerase (Takara Shuzo Co., Ltd.) was added at 94 ° C (1 minute, 58 ° C for 2 minutes, 70 ° C). For 3 minutes at, and subjected to a cycle reaction consisting of three consecutive steps. Thus, the DNA fragment was amplified. PCR was carried out using TaKaRa PCRT herma 1 Cycler MP TP3000 (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.).
増幅された DN A断片を、 ァガロースゲル電気泳動に供した後、 約 1. 0乃至 2. 0 k bの大きさをもつ DNA断片を含むァガロースゲルを回収した。 ゲルか ら D NAを回収し、 フエノール ' クロ口ホルム抽出及びェタノール沈澱を行ない. 得られた沈澱を少量の T Eに溶解した。  After the amplified DNA fragment was subjected to agarose gel electrophoresis, an agarose gel containing a DNA fragment having a size of about 1.0 to 2.0 kb was recovered. The DNA was recovered from the gel and subjected to phenol / chloroform extraction and ethanol precipitation. The resulting precipitate was dissolved in a small amount of TE.
3 ) ライゲーシヨ ン及び形質転換 3) Ligation and transformation
2 ) で得られた DN A断片、 及び、 TAクローニング ' システム p C R 2. 1 ( I n V i t r o g e n社製） を用いて、 このキッ トに含まれるプラスミ ド p C R 2. 1にライゲ一シヨンし、 形質転換株を得た。  Using the DNA fragment obtained in 2) and the TA cloning system pCR2.1 (manufactured by Invitrogen), ligation was performed on plasmid pCR2.1 contained in this kit. Then, a transformant was obtained.
得られたク ローンを数個選び、 マニアテイスら （Maniatis, T. , et al. , Molecu lar cloning, a laboratory manual, 2nd ed. , Cold Spring Harbor Laboratory,し old Spring Harbor, N. Y. (1989)記載） の方法に従って培養した。 すなわち、 2 m l の L B培地を含む 2 4 m l 容の試験管に各ュロニ一を接種し、 3 7 °Cにて 1 8時間、 振盪培養した。  Several clones obtained were selected, and Maniatis et al. (Described in Maniatis, T., et al., Molecular cloning, a laboratory manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, old Spring Harbor, NY (1989)) The culture was performed according to the method described above. That is, a 24 ml test tube containing 2 ml of LB medium was inoculated with each uroni, and cultured with shaking at 37 ° C. for 18 hours.
この培養物からの組換え DNAベクタ一の調製は、 アルカリ法 （Maniatis, T.， et a丄. , Molecular cloning, a laboratory manual, 2nd ed. , Co丄 d Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989)記載） に従った。 すなわち、 1. 5 m l の培養液を、 室温、 1 0 0 0 0 XGの条件下で 2分間遠心分離し、 沈澱よ り菌体を回収した。 菌体に 1 0 0 μ 1 の 5 0 mM グルコース一 2 5 mM T r i s -塩酸— 1 0 mM E DTA ( p H 8. 0 ) を加えて懸濁し、 2 0 0 μ 1 の 0. 2規定水酸化ナト リ ウム一 1 % (w/v) S D Sを加えて穏やかに攪拌し、 溶 菌させた。 これに 1 5 0 μ 1 の 3 M 酢酸力 リ ウム一 1 1. 5 % (w/v)氷酢酸を 加えてタンパク質を変成させ、 室温、 1 0 0 0 0 XGの条件下で.1 0分間遠心分 離し、 上清を回収した。 上清について、 フエノール ' クロ口ホルム抽出及びエタ ノール沈澱を行ない、 得られた沈澱を 4 0 μ g/m 1 のリボヌク レアーゼ A ( S i g m a社製） を含有する 5 0 μ 1 の Τ Εに溶解させた。 各組換え D N Aべクターを制限酵素消化して電気泳動に供し、 電気泳動パター ンの異なる組換え D N Aべクタ一中の挿入塩基配列を、 D N Aシークェンサ一 (モデル 3 7 7 ： パーキンエルマ一 · ジャパン社製） を用いて決定した。 Preparation of a recombinant DNA vector from this culture was performed using the alkaline method (Maniatis, T., et a 丄., Molecular cloning, a laboratory manual, 2nd ed., Co 丄 d Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)). That is, 1.5 ml of the culture solution was centrifuged at room temperature under a condition of 10000 XG for 2 minutes, and the cells were collected by precipitation. Add 100 μl of 50 mM glucose-25 mM Tris-HCl—10 mM EDTA (pH 8.0) to the cells, suspend them, and add 200 μl of 0.2 μL Sodium hydroxide 1% (w / v) SDS was added and gently stirred to lyse. To this was added 150 μl of 3M acetic acid in 11.5% (w / v) glacial acetic acid to denature the protein, and the mixture was incubated at room temperature and under the conditions of 1000 XG. After centrifugation for 1 minute, the supernatant was recovered. The supernatant was subjected to phenol / chloroform extraction and ethanol precipitation, and the resulting precipitate was added to 50 μl of す る containing 40 μg / m 1 of ribonuclease A (Sigma). Dissolved. Each recombinant DNA vector was digested with restriction enzymes and subjected to electrophoresis, and the inserted base sequence in the recombinant DNA vector having a different electrophoresis pattern was analyzed using a DNA sequencer (Model 377: PerkinElmer Japan). (Manufactured by the company).
その結果、 P K S遺伝子断片を含む組換え D N Aベクターを保有する株の存在 が確認された。 実施例 5 . ぺニシリ ウム ' シ ト リナム S A N K 1 3 3 8 0株のゲノ ミ ック ' サ ザンブロ ッ トハイブリ ダィゼ一シヨン  As a result, the presence of a strain carrying the recombinant DNA vector containing the PKS gene fragment was confirmed. Example 5: Penicillium 'Citrimum S ANK 13 380 Strain Genomic' Southern Blot Hybridization
1 ) 電気泳動及びメ ンブレンへの トランスファー  1) Electrophoresis and transfer to membrane
実施例 2において得られたのぺニシリ ウム ' シト リナム S A N K 1 3 3 8 0 株のゲノム D N A ( 1 0 μ g ) を、 制限酵素 E c o R I、 S a i l , H i n d i The genomic DNA (10 μg) of the Penicillium ′ citrinum S ANK 13 380 strain obtained in Example 2 was ligated with the restriction enzymes EcoRI, Sail, and Hindi.
I I又は S a c I (いずれも宝造 （株） 製） を用いて消化し、 ァガロースゲル電 気泳動に供した。 ァガロースゲルの調製には、 A g a r o s e L 0 3 「T A K A R A」 （宝酒造 （株） 製） を用いた。 泳動後、 ゲルを 0 . 2 5規定塩酸 （和光 純薬 （株） 製） に浸し、 室温にて 1 ひ分間穏やかに振盪した。 このゲルを 0 . 4 規定水酸化ナ ト リ ウム （和光純薬 （株） 製） 中に移し、 室温にて 3 0分間穏やか に振盪した。 マニアテイスらのアルカ リ トランスファ一法 （Maniatis, T. , et a 1. , Molecular cloning, a laboratory manual, 2nd ed. , Cold Spring Harbor Lab oratory, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989)記載） によ り、 ゲル中の D N Aをナイ ロン · メ ンブレン H y b o n d ™- N+ (アマシャム社製） に トランスファ—し、 固定した。 メ ンブレンを 2 X S S C ( 1 X S S Cの組成は、 1 5 0 mM N a CDigestion was performed using I I or Sac I (both manufactured by Takara Co., Ltd.) and subjected to agarose gel electrophoresis. Agarose gel was prepared using Agarose L03 "TAKARA" (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.). After the electrophoresis, the gel was immersed in 0.25N hydrochloric acid (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and gently shaken at room temperature for 1 minute. This gel was transferred into 0.4 N sodium hydroxide (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and gently shaken at room temperature for 30 minutes. According to Maniatis et al.'S alkaline transfer method (described in Maniatis, T., et al., Molecular cloning, a laboratory manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)). The DNA in the gel was transferred to Nylon Membrane Hybond ™ -N + (Amersham) and fixed. The membrane was mixed with 2XSSC (1XSSC had a composition of 150 mM NaC
1、 1 5 mM クェン酸三ナト リ ウム） で洗浄した後風乾した。 After washing with 1,15 mM trisodium citrate), it was air-dried.
2 ) ハイブリ ダィゼーシヨ ン及びシグナルの検出  2) Detection of hybridization and signal
1 ) で得られたメンブレンに対し、 実施例 4で得られた P K S遺伝子断片をプ ローブとして用いたハイブリ ダィゼーショ ンを行なった。  Hybridization using the PKS gene fragment obtained in Example 4 as a probe was performed on the membrane obtained in 1).
プローブには、 実施例 4において得られた P K S遺伝子断片 D N A ( 1 M g ) を D I G D N A L a b e l l i n g K i t (ベーリ ンガー · マンハイム社 製） で標識し、 使用直前に 1 0分間煮沸後急冷したものを用いた。 ハイブリ ダイゼーショ ン液 （D I Gィージーハイブ ： ベーリ ンガー · マンハイ ム社製） に 1 ) 記載のメンブレンを浸し、 2 0 r p mで振盪しつつ、 4 2 °Cにて 2時間プレハイプリ ダイゼ一ショ ンを行なった後、 上述の標識プロ一ブをハイブ リ ダィゼ一シヨ ン液に添加し、 マルチシェーカー ' オーブン H B (T A I T E C 社製） を用い、 2 0 r p mで振盪しつつ 4 2。Cにて 1 8時間ハイブリ ダィゼーシ ヨ ンを行なった。 ハイブリ ダィゼーシヨ ンを行なったメ ンブレンについて、 2 X S S Cを用いた室温、 2 0分間の洗浄を 3回、 0. 1 X S S Cを用いた 5 5 °C、 3 0分間の洗浄を 2回、 それぞれ行なった。 For the probe, the PKS gene fragment DNA (1 mg) obtained in Example 4 was labeled with DIGDNA Labeling Kit (manufactured by Boehringer Mannheim), boiled for 10 minutes immediately before use, and quenched. Was. After immersing the membrane described in 1) in a hybridization solution (DIG Easy Hive: manufactured by Boehringer Mannheim), and performing prehybridization at 42 ° C for 2 hours while shaking at 20 rpm, The above labeled probe was added to the hybridization solution, and the mixture was shaken at 20 rpm using a Multi Shaker 'Oven HB (TAITEC) 42. Hybridization was performed at C for 18 hours. The membrane subjected to hybridization was washed three times with 2 XSSC at room temperature for 20 minutes, and twice with 0.1 XSSC at 55 ° C for 30 minutes. .
'洗净したメ ンブランを D I G L u m i n e s c e n t D e t e c t i o n 'Clean the washed membrane D IG L u m i n e s c e n t D e t e c t i o n
K i t f o r N u c l e i c A c i d s (ベー リ ンガー · マンノヽィム社 製） で処理し、 X線フィルム （ノレミ フイルム ： ベーリ ンガー ' マンハイム社製） に露光した。 感光は富士メディカルフイルムプロセサー F PM 8 0 0 A (F u j i F i 1 m社製） を用いて行なった。 The sample was processed with KitforNucleicAcids (manufactured by Boehringer Mannheim) and exposed to an X-ray film (Noremi Film: manufactured by Behringer Mannheim). Exposure was performed using Fuji Medical Film Processor F PM800A (FujiFi1m).
その結果、 実施例 4において得られた P K S遺伝子断片はぺニシリ ゥム · シト リナムのゲノム上に存在することが確認された。 実施例 6. P K S遺伝子断片をプローブと したぺニシリ ウム ' シト リナム S A NK 1 3 3 8 0株のゲノム D NAライブラ リーのスク リーニング  As a result, it was confirmed that the PKS gene fragment obtained in Example 4 was present on the genome of Penicillium citrinum. Example 6. Screening of genomic DNA library of Penicillium 'Citrinaum S ANK 133 80 strain using PKS gene fragment as probe
P K S遺伝子を含むゲノム D N Aのクローニングは、 コ口二一ハイブリダイゼ —ショ ン法により行なった。  The cloning of the genomic DNA containing the PKS gene was performed by the Koguchi 21 hybridization method.
1 ) メ ンブレンの調製 1) Preparation of membrane
ぺニシリ ウム ' シト リナム S A NK 1 3 3 8 0株のゲノム D NAライブラ リ 一と して保存した大腸菌菌体液 （実施例 3記載） を、 L B寒天培地のプレー トに. プレー ト 1枚あたり 5 0 0 0乃至 1 0 0 0 0個のコロニ一が生育するよ う希釈し て撒いた。 このプレー トを 2 6 °Cにて 1 8時間保温した後、 4 °Cにて 1時間冷却 した。 H y b o n d TM— N+ (アマシャム社製） をプレー トにのせ、 1分間接 触させた。 コロニーを付着させたメンブレンをプレー トから注意深く離し、 コロ ュ一接触面を上にして、 2 0 0 m l の 1 . 5 M 塩化ナト リ ウム— 0. 5規定 水酸化ナト リ ウムに 7分、 2 0 0 m l の 1 · 5Μ 塩化ナト リ ウム一 0. 5Μ T r i s -塩酸— I mM E DTA ( p H 7. 5) に 3分ずつ 2回浸した後、 4 0 0 m l の 2 X S S Cで洗浄した。 洗浄したメンブレンを 3 0分風乾した。 Escherichia coli bacterial fluid (described in Example 3) stored as a genomic DNA library of Penicillium 'Citulinum SA NK13380 strain was added to a plate of LB agar medium. 5,000 to 10,000 colonies were diluted and scattered so as to grow. The plate was kept at 26 ° C for 18 hours and then cooled at 4 ° C for 1 hour. Hybond ™ — N + (Amersham) was placed on the plate and indirectly contacted for 1 minute. Carefully separate the membrane with the colonies from the plate and place 200 ml of 1.5 M sodium chloride—0.5N with the column contact side up. After immersing twice in sodium hydroxide for 7 minutes and in 200 ml of 1.5 · sodium chloride 0.5 0 Tris-HCl-ImM EDTA (pH 7.5) for 3 minutes each Washed with 400 ml of 2 XSSC. The washed membrane was air dried for 30 minutes.
2 ) ハイブリ ダイゼーショ ン 2) Hybridization
プローブには、 実施例 4において得られた P K S遺伝子断片 DNA ( 1 μ g ) を D I G DNA L a b e l i n g K i t (ベ一リ ンガ一 · マンハイム社 製） で標識し、 使用直前に 1 0分間煮沸後急冷したものを用いた。  For the probe, the PKS gene fragment DNA (1 μg) obtained in Example 4 was labeled with DIG DNA Labeling Kit (manufactured by Behringer Mannheim), and after boiling for 10 minutes immediately before use The quenched one was used.
ハイブリ ダイゼーション液 （D I Gィージーハイブ ： ベ一リ ンガー · マンハイ ム社製） に 1 ) 記載のメンブレンを浸し、 2 0 r p mで振盪しつつ、 4 2°Cにて 2時間プレハイプリ ダイゼ一ショ ンを行なった後、 上述の標識プローブをハイブ リ ダィゼーシヨ ン液に加え、 マルチシェ一カー ' オーブン H B (丁 A I T E C社 製） を用い、 2 0 r p mで振盪しつつ 4 2 °Cにて 1 8時間ハイブリ ダィゼーショ ンを行なった。 ハイブリダィゼーシヨ ンを行なったメンブレンについて、 2 X S S Cを用いた室温、 2 0分間の洗浄を 3回、 0. 1 X S S Cを用いた 6 8 ° (：、 3 0分間の洗浄を 2回、 それぞれ行なった。  The membrane described in 1) is immersed in a hybridization solution (DIG Easy Hive: manufactured by Behringer Mannheim), and prehybridization is performed at 42 ° C for 2 hours while shaking at 20 rpm. After that, the above-mentioned labeled probe is added to the hybridization solution, and hybridization is performed at 42 ° C for 18 hours while shaking at 20 rpm using a multi-shaker Oven HB (manufactured by AITEC). Was performed. The membrane subjected to hybridization was washed three times with 2 XSSC at room temperature for 20 minutes, and washed with 0.1 XSSC at 68 ° (: twice for 30 minutes. Each was done.
洗净したメ ンブランを D I G L u m i n e s c e n t D e t e c t i o n Wash the washed membrane DIG L u m i n e s c e n t D e t e c t i o n
K i t f o r N u c l e i c A c i d s (ベーリ ンガー ' マンノヽィム社 製） で処理し、 X線フィルム （ノレミ フイルム ： ベ一リ ンガー ' マンハイム社製） に露光した。 感光は富士メディカルフイルムプロセサー F PM8 0 0 A ： F u j i F i 1 m社製） を用いて行なった。 The sample was processed with KitforNucleiccAcids (manufactured by Boehringer Mannheim) and exposed to an X-ray film (Noremi film: manufactured by Behringer Mannheim). Exposure was performed using Fuji Medical Film Processor F PM800A (FujiFi1m).
以上、 1 ) 及び 2 ) 記載の操作をスク リ ーニングという。  The operations described in 1) and 2) above are called screening.
一回目のスク リ一二ングで陽性シグナルが検出されたク ローンのコロニ一周辺 をかきとって L B培地に懸濁した後、 適宜希釈してプレー トに撒いて培養し、 同 様に二回目のスク リーニングを行ない、 陽性クローンを純化した。  A clone in which a positive signal was detected in the first screening was scraped around the colony, suspended in LB medium, diluted appropriately, and spread on a plate, followed by culture in the same manner. Was screened to purify the positive clones.
なお、 本実施例で得られた陽性クローン、 すなわち形質転換大腸菌 E. c o 1 i p M L 4 8 S ANK 7 1 1 9 9は、 平成 1 1年 （ 1 9 9 9年） 7月 7 日 付けで通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所 （日本国茨城県つくば巿東 町 1丁目 1番 3号） に国際寄託され、 受託番号 F E RM B P— 6 7 8 0を付さ れた。 実施例 7. 組換え D N Aベクタ一 p ML 4 8の挿入配列の解析 （ 1 ) In addition, the positive clone obtained in this example, that is, the transformed E. coli E.co1 ip ML48S ANK 711 199 was prepared on July 7, 1999. Deposited internationally at the Institute of Biotechnology and Industrial Technology, the Institute of Biotechnology, Ministry of International Trade and Industry (1-3, Tsukuba-Higashi-cho, Ibaraki, Japan), and given the accession number FE RM BP—6780 Was. Example 7 Analysis of Insertion Sequence of Recombinant DNA Vector pML48 (1)
実施例 6で得られた E. c o 1 i p M L 4 8 S A N K 7 1 1 9 9株の培養 及び該培養物からの組換え D N Aベクターの調製は、 実施例 4記載の方法に準じ て行なった。  The cultivation of the E.co1ipML48SANK71199 strain obtained in Example 6 and the preparation of a recombinant DNA vector from the culture were performed according to the method described in Example 4.
得られた組換え D N Aべクターを pML 4 8 と命名した。 p M L 4 8挿入配列 を各種制限酵素消化し、 p UC 1 1 9 (宝酒造 （株） 製） に組込むことにより、 サブクローニングした。 得られたサブクローンをプローブとして、 実施例 5記載 の方法に準じてサザンプロ ッ ト · ハイブリ ダィゼーシヨ ンを行なった。 すなわち、 pML 4 8の各種制限酵素消化物を電気泳動に供し、 D N Aをメンブレンへトラ ンスファーしたものに対して、 ハイブリ ダイゼ一ショ ンを行なつた。  The obtained recombinant DNA vector was designated as pML48. The pML48 insertion sequence was subcloned by digesting with various restriction enzymes and incorporating it into pUC119 (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.). Using the obtained subclone as a probe, Southern plot hybridization was carried out according to the method described in Example 5. That is, the various restriction enzyme digests of pML48 were subjected to electrophoresis, and the DNA was transferred to the membrane, and hybridization was performed.
その結果、 p ML 4 8挿入配列の制限酵素地図が作成された。  As a result, a restriction map of the pML48 insertion sequence was created.
また、 上述の各サブクローンの挿入配列の塩基配列を、 DN Aシークェンサ一 モデル 3 7 7 (パーキンエルマ一 · ジャパン社製） を用いて決定し、 pML 4 8 の全塩基配列を決定した。  In addition, the nucleotide sequence of the inserted sequence of each of the above-mentioned subclones was determined using a DNA Sequencer-1 model 377 (manufactured by Perkin-Elma Japan KK), and the entire nucleotide sequence of pML48 was determined.
p M L 4 8の挿入配列は全 3 4 2 0 3塩基であった。  The inserted sequence of pML48 was a total of 342 003 bases.
P ML 4 8の挿入配列の塩基配列は、 配列表の配列番号 1及び 2に記載されて いる。 配列表の配列番号 1及び 2に示される塩基配列は、 互いに、 完全に相補的 である。  The base sequence of the inserted sequence of PML48 is described in SEQ ID NOs: 1 and 2 in the sequence listing. The nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 1 and 2 in the sequence listing are completely complementary to each other.
該挿入配列上の構造遺伝子の存在について、 遺伝子検索プログラム G R A I L (A p o C o m G RA I L T o o l k i t : A P O C OM社製） 及ぴ相同性 検索プログラム B L A S T (G a p p e d — B LA S T (B LA S T 2 ) ： W I S CON S I N G C G p a c k a g e v e r . 1 0. 0に搭載） を用いて 解析した。  Regarding the presence of the structural gene on the inserted sequence, the gene search program GRAIL (ApoCom GRA ILT oolkit: manufactured by APOC OM) and the homology search program BLAST (Gapped—BLAST (BLAST2)) : WIS CON SINGCG packagever. 10.0).
その結果、 p ML 4 8の挿入塩基配列中には、 6種類の異なる構造遺伝子の存 力；推定され、 それぞれを m l c A、 m l c B、 m l c C、 m l c D、 m l c E 及び m l c Rと命名した。 また、 m l c A、 m l c B、 m l c E及び m l c Rは 配列表の配列番号 2記載の塩基配列中に、 m 1 c C及び m 1 c Dは配列表の配列 番号 1に示される塩基配列中に、 それぞれコ一ド領域を有していることが推定さ れた。 さらに、 該挿入配列における各推定構造遺伝子の相対的位置及び大きさが 推定された。 As a result, the presence of six different structural genes in the inserted nucleotide sequence of pML48 was presumed, and they were named mlc A, mlc B, mlc C, mlc D, mlc E and mlc R, respectively. . Also, mlc A, mlc B, mlc E and mlc R are In the nucleotide sequence described in SEQ ID No. 2 in the sequence listing, it is presumed that m1cC and m1cD each have a code region in the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO. 1 in the sequence listing. It was done. Further, the relative position and size of each putative structural gene in the inserted sequence were estimated.
本実施例の結果を図 2に記載した。 実施例 8. 組換え DN Aベクタ一 p ML 4 8の挿入配列の解析 （ 2)  The result of this example is shown in FIG. Example 8 Analysis of Insertion Sequence of Recombinant DNA Vector pML48 (2)
ノーザンブロッ ト · ハイブリ ダイゼーショ ン法及び RAC Eにより、 実施例 7 において存在が示唆された構造遺伝子の発現解析、 及び 5 ' —末端並びに 3 ' - 末端領域の解析を行なった。  By the Northern blot hybridization method and RACE, the expression analysis of the structural gene suggested to be present in Example 7 and the analysis of the 5′-terminal and 3′-terminal regions were performed.
1 ) ぺニシリ ウム ' シト リナム S ANK 1 3 3 8 0の全 RNAの調製  1) Preparation of total RNA of Penicillium 'Citulinum S ANK 133
ぺニシリ ウム . シト リナム S ANK 1 3 3 8 0株を培養したスラント （実施 例 2記載） よ り 5 mm角の菌体を 1 0 m l の MG B 3— 8培地を入れた 1 0 0 m 1 容の三角フラスコに接種し、 2 6 °Cにて 3 日間、 振盪培養した。  Penicillium citrineum S ANK 1 330 The strain of 5 mm square from the slant (described in Example 2) was cultured in 100 ml of 100 ml of MGB3-8 medium. The mixture was inoculated into a 1-volume Erlenmeyer flask and cultured with shaking at 26 ° C for 3 days.
培養物からの全 RN Aの調製は、 ヅァニジン · イソチオシァネ一 ト法を利用し た RN e a s y P l a n t M i n i K i t (キアゲン社製） を用いて行つ た。 すなわち、 培養物を、 室温、 5 0 0 0 X Gの条件下で 1 0分間遠心分離して 菌体を回収し、 湿重量 2 gの菌体を液体窒素によ り凍結した後、 乳鉢上で粉末に なるまで破砕した。 この破砕物をグァニジン · ィソチオシァネ一 トを含む 4 m 1 の菌体溶解バッファ一 （このキッ トに含まれる。 ） に懸濁した。 懸濁液をこのキ ッ トに含まれる Q I A s h r e d d e r スピン力ラム 1 0本に 4 5 0 μ 1ずつ分 注し、 室温、 1 0 0 0 XG、 1 0分間遠心分離した後、 溶出液をそれぞれ回収し た。 各溶出液に 2 2 5 ずつのエタノールを加えた後、 このキッ トに含まれる R NAミニスピンカラムに添加した。 このカラムをこのキッ トに含まれる洗浄用緩 衝液で洗浄した後、 5 0 μ 1ずつのリボヌク レア一ゼ · フリ一蒸留水で吸着物を 溶出させ、 溶出液を全 RNA画分と した。  Preparation of total RNA from the culture was carried out using RNeasyPlAntMiniKit (manufactured by Qiagen) utilizing the panidine-isothiocane method. That is, the culture was centrifuged at room temperature under the condition of 5,000 XG for 10 minutes to collect the cells, and the cells with a wet weight of 2 g were frozen with liquid nitrogen and then placed in a mortar. Crushed to a powder. This crushed product was suspended in 4 ml of a cell lysis buffer (included in this kit) containing guanidine / isothiothionate. Dispense 450 μl of the suspension into 10 QIA shredder spinning rams contained in this kit, centrifuge at room temperature at 1000 XG for 10 minutes, and elute each eluate. Collected. After adding 225 ethanol to each eluate, the solution was added to the RNA mini spin column included in this kit. After the column was washed with a washing buffer contained in the kit, the adsorbate was eluted with 50 μl of ribonuclease-free distilled water, and the eluate was used as the total RNA fraction.
2 ) ノーザンブロ ッ ト · ハイブリ ダィゼーシヨン  2) Northern blot hybridization
2 0 μ gのぺニシリ ゥム · シト リナム S ANK 1 3 3 8 0の全 RNAを含む 2. 2 5 1 の水溶液に、 1 μ 1 の 1 0 XMO P S (組成 ； 2 0 0 mM 3—モ ルフォリ ノプロパンスルホン酸、 5 0 mM 酢酸ナト リ ウム、 1 0 mM E DT A ' 2 N a、 p H 7. 0 : 1 2 1 °Cにて 2 0分間オー トク レーブ滅菌してから使 用した。 ： 同仁化学研究所 （株） 製） 、 1. 7 5 μ 1 のホルムアルデヒ ド及び 5 μ 1 のホルムアミ ドを添加して混合し、 RN Αサンプルと した。 この RNAサン プルを、 6 5。Cにて 1 0分間保温した後、 氷水中で急冷し、 ァガロースゲル電気 泳動に供した。 電気泳動のゲルは、 1 0 m 1 の 1 0 XMO P S及ぴ 1 gの A g a r o s e L 0 3 「TAKA RA」 （宝酒造 （株） 製） を 7 2 m l のピロ力ノレ ボニック ' ァシッ ド · ジェチルエステル （ S i g m a社製） 処理水に混合し、 加 熱してァガ口一スを溶解させた後冷却させ、 1 8 m l のホルムアルデヒ ドを添加 することによ り作製した。 サンプルバッファ一は、 1 XMO P S ( 1 0 XMO P Sを水で 1 0倍希釈したもの。 ） を使用した。 ゲル中の RN Aを、 1 0 X S S C 中で H y b o n d TM— N + (アマシャム社） へ トランスファーした。 Contains 20 μg of penicillium citrinum S ANK 133 0 total RNA 2. Add 1 μl of 10 XMOPS (composition: 200 mM 3-morpholinopropanesulfonic acid, 50 mM sodium acetate, 10 mM EDTA A2N) a, pH 7.0: Autoclave sterilization for 20 minutes at 121 ° C before use: Dojin Chemical Laboratory Co., Ltd.), 1.75 μl formaldehyde and 5 μl of formamide was added and mixed to obtain an RNII sample. This RNA sample was used for 65. After keeping the mixture at C for 10 minutes, it was rapidly cooled in ice water and subjected to agarose gel electrophoresis. The electrophoresis gel was prepared by combining 10 ml of 10 XMOPS and 1 g of Agarose L03 “TAKA RA” (Takara Shuzo Co., Ltd.) with 72 ml of Pyro-Kyoroné Bonic's acid gel. It was prepared by mixing chill ester (manufactured by Sigma) with treated water, heating to dissolve the agarose, cooling, and adding 18 ml of formaldehyde. As a sample buffer, 1 XMO PS (10 X MO PS diluted 10-fold with water) was used. The RNA in the gel was transferred to Hybond ™ —N + (Amersham) in 10 XSSC.
プローブには、 pML 4 8挿入配列を下記表 1記載の制限酵素 1及び 2で消化 することによ り得られる DNA断片 （a、 b、 c、 d及び e) を用いた。 表 1 · _ノーザンブロ ッ ト _· ハイブリ ダイゼーションのプローブ  DNA fragments (a, b, c, d and e) obtained by digesting the pML48 insertion sequence with restriction enzymes 1 and 2 shown in Table 1 below were used as probes. Table 1-Northern blots-Probes for hybridization
プ口 制限 制限酵素認識部位の 制限 制限酵素認識部位の —ブ _酵素 ヌク レオチド番号 * 酵素 2 ヌク レオチ ド番号 * a. EcoRI 6319— 6324 EcoRI 15799〜15804 Restriction of restriction enzyme recognition site Restriction of restriction enzyme recognition site — _ enzyme Nucleotide number * Enzyme 2 Nucleotide number * a. EcoRI 6319— 6324 EcoRI 15799 to 15804
b BamHI 16793— 16798 Pstl 18164〜18169 b BamHI 16793— 16798 Pstl 18164-18169
c Kpnl 26025~26030 BamHI 27413^27418 c Kpnl 26025 ~ 26030 BamHI 27413 ^ 27418
d Sail 28691— 28696 Sail 2955卜 29556 d Sail 28691— 28696 Sail 2955 U 29556
e HinclIII 33050〜33055 Sacl 34039—34044 e HinclIII 33050-33055 Sacl 34039—34044
*各ヌク レオチ ド番号は、 配列表の配列番号 1に基く プローブの標識、 ハイブリ ダィゼーシヨ ン及びシグナルの検出は、 実施例 5の サザンプロッ ト . ハイブリ ダイゼーショ ンに従って行なった。 本実施例の結果を図 3に記載した。 * Each nucleotide number is based on SEQ ID No. 1 in the sequence listing. Probe labeling, hybridization and signal detection were performed according to the Southern blot hybridization of Example 5. FIG. 3 shows the results of this example.
各シグナルは各プローブの塩基配列と相同な転写産物の存在を示す。  Each signal indicates the presence of a transcript homologous to the nucleotide sequence of each probe.
本実施例で p ML 4 8挿入配列上に存在が推定された 6つの構造遺伝子のうち, m l c B、 m l c D、 m l c E及び m 1 c Rはぺニシリ ゥム ' シト リナム S A Of the six structural genes estimated to be present on the pML48 insertion sequence in this example, mlcB, mlcD, mlcE and m1cR were:
N K 1 3 3 8 0株内で転写されていることが確認され、 m l c A及び m l c Cに ついても該細胞内で転写されていることが示唆された。 Transcription was confirmed in the NK13380 strain, suggesting that mlcA and mlcC were also transcribed in the cells.
各シグナルの位置は、 転写産物の相対的なサイズを示すものではない。  The location of each signal does not indicate the relative size of the transcript.
3 ) 5 ' RA C Eによる 5 ' —末端配列の決定  3) Determination of 5'-terminal sequence by 5 'RACE
各構造遺伝子の 5 ' —末端領域を含む c D N Aの取得は、 5 ' RA C E S y s t e m f o r R a p i d Am p l i f i c a t i o n o f c D N A E n d s , V e r s i o n 2. 0 (G I B C〇社製） を用いて行なった。 実施例 7及び本実施例の 2 ) の結果よ り推定された p ML 4 8の挿入配列上の 各構造遺伝子において、 コー ド領域であり且つ該遺伝子の 5 ' —末端近傍に位置 すると考えられる塩基配列に基いて設計されたアンチセンス側のオリ ゴ D N Aを Acquisition of cDNA including the 5'-terminal region of each structural gene was performed using 5 'RACEsystemforRapidAmPlificaitionanofc DNAEnds, Verios2.0 (manufactured by GIBC). In each structural gene on the inserted sequence of pML48 estimated from the results of Example 7 and 2) of this example, it is considered to be a code region and located near the 5′-terminal of the gene. Antisense oligo DNA designed based on the base sequence
2種類作製した。 Two types were produced.
表 2に、 各構造遺伝子の、 よ り 3 ' —側に位置する塩基配列に基いて設計され たアンチセンス側のオリ ゴ D N A ( 1 ) の塩基配列を、 表 3に、 より 5 ' —側に 位置する塩基配列に基いて設計されたアンチセンス側のオリ ゴ D N A ( 2 ) の塩 基配列を、 それぞれ記載した。 表 2. 5 ' R A C Eによる 5 ' —末端配列解析に用いるオリ ゴ D N A ( 1 ) 遺伝子 配列表の配列番号 ： 塩基配列 _  Table 2 shows the nucleotide sequence of the oligosense DNA (1) on the antisense side designed based on the nucleotide sequence located on the 3'-side of each structural gene. The nucleotide sequence of oligo-DNA (2) on the antisense side designed based on the nucleotide sequence located at (1) is described. Table 2. Oligo DNA (1) gene used for 5'-terminal sequence analysis by 5 'R ACE SEQ ID NO in the Sequence Listing: Base sequence _
mlcA 歹1 j番 5 ： gcatgttcaatttgctctc mlcA歹1 j No. 5: gcatgttcaatttgctctc
mlcB 酉 3歹1 j番号 6 ： ctggatcagacttttctgc mlcB Rooster 3歹1 j number 6: ctggatcagacttttctgc
mlcC C歹1 J番号 7 ： gtcgcagtagcatgggcc mlcC C歹1 J number 7: gtcgcagtagcatgggcc
mlcD ϋ歹リ番号 8 ： gtcagagtgatgctcttctc mlcD system number 8: gtcagagtgatgctcttctc
mlcE 酉己歹 IJ番^" 9 ： gttgagaggattgtgagggc mlcE Tori self IJ number ^ "9: gttgagaggattgtgagggc
mlcR 配歹 IJ番号 1 0 ： ttgcttgtgttg^attgtc ― 表 3. 5 ' RAC Eによる 5 ' —末端配列解析に用いるオリ ゴ DNA ( 2) 遺伝子 配列表の配列番号 ： 塩基配列 mlcR distribution IJ number 10: ttgcttgtgttg ^ attgtc ― Table 3. Oligo DNA used for analysis of 5'-terminal sequence by 5 'RAC E (2) Gene Sequence number in gene sequence list: Nucleotide sequence
tnlc.A 列番号 1 1 ： catggtactctcgcccgttc tnlc.A Column No. 11: catggtactctcgcccgttc
mlcB 目 C列番号 1 2 ： ctccccagtacgtaagctc mlcB Eye C column number 1 2: ctccccagtacgtaagctc
mlcC 目 C歹1 J番 1 3 ： ccataatgagtgtgactgttc mlcC eyes C歹1 J No. 1 3: ccataatgagtgtgactgttc
mlcD 目 列番号 1 4 ： gaacatctgcatccccgtc mlcD Column number 14: gaacatctgcatccccgtc
mlcE Sti歹リ番号 1 5 ： ggaaggcaaagaaagtgtac mlcE Sti system number 15: ggaaggcaaagaaagtgtac
mlcR 目 C列番号 1 り ： agattcattgctgttggcatc オリ ゴ DNA ( 1 ) をプライマ一とし、 ぺニシリ ウム . シト リナム S ANK 1 3 3 8 0株の全 RNAを铸型とした逆転写反応により c DNA第一鎖を合成し た。 すなわち、 l μ gの全RNA、 2. 5 p m o l のオリ ゴ DNA ( 1 ) 、 1 μ 1 の S U P E R S C R I P T TM I I r e v e r s e t r a n s c r i p t a s e (このキッ トに含まれる。 ） を含む 2 4 // 1 の反応液を、 1 6 °Cにて 1時間保温した後、 生成物をこのキッ トに含まれる G LA S SMAXスピンカー ト リ ッジに添加して c DN A第一鎖を精製した。 mlcR: C column number 1: agattcattgctgttggcatc oligo DNA (1) was used as the primer, and penicillium. The chain was synthesized. That is, the 24 // 1 reaction mixture containing l μg of total RNA, 2.5 pmol of oligo DNA (1), and 1 μl of SUPERSCRIPT ™ II reversetranscriptase (included in this kit) was After incubating at 16 ° C for 1 hour, the product was added to the GLAS SMAX spin cartridge contained in this kit to purify the cDNA first strand.
c DNA第一鎖の 3 ' —末端に、 このキッ トに含まれる t e r m i n a l d e o x y r i b o n u c 1 e o t i d y 1 t r a n s i e r a s e iこよ りホリ C鎖を付加させた。  At the 3'-end of the first strand of the cDNA, the tertiary chain C was added to the terminaldeleoxyrivibonuc1eottidy1transsieraisasei contained in this kit.
3 ' —末端にポリ C鎖の付加した c D N A第一鎖、 4 0 p m o 1 のオリ ゴ D N A ( 2 ) 及び4 0 p m o l のA b r i g e d A n c h o r P r i m e r (こ のキッ トに含まれる） を含む 5 0 μ 1 の反応液を、 9 4 °Cにて 2分間保温し、 続 レヽて、 9 4 Cにて 3 0秒、 5 5 °Cにて 3 0秒、 及び、 7 2 °Cにて 2分間を 1サイ クルとする反応を 3 5回行なった後、 7 2 °Cにて 5分間、 4 °Cにて 1 8時間保温 した。 得られた産物をァガロースゲル電気泳動に供した後、 ゲルから DNAを回 収し、 フヱノール ' クロ口ホルム抽出及びエタノール沈澱によ り産物を精製し、 実施例 4記載の方法に準じて p C R 2. 1 を用いてクローニングした。 以上の操作を 5 ' RAC Eという。 3 '— Contains the first strand of cDNA with a poly C chain added at the end, 40 pmo 1 of oligo DNA (2) and 40 pmol of Bridged Anchor Primer (included in this kit) Incubate 50 μl of the reaction solution at 94 ° C for 2 minutes, then continue at 94 ° C for 30 seconds, 55 ° C for 30 seconds, and 72 ° C. The reaction was performed 35 times for 2 minutes in a cycle of 2 minutes, and then incubated at 72 ° C for 5 minutes and at 4 ° C for 18 hours. After subjecting the obtained product to agarose gel electrophoresis, DNA was recovered from the gel, and the product was purified by extraction with phenol-chloroform and ethanol precipitation, and pCR2 was purified according to the method described in Example 4. 1. Cloned using The above operation is called 5 'RAC E.
5 ' 一末端を含む c DN A断片の塩基配列を決定し、 転写開始点及ぴ翻訳開始 コ ドンの位置を推定した。  The nucleotide sequence of the cDNA fragment containing the 5 'end was determined, and the positions of the transcription start point and the translation start codon were estimated.
5 ' R A C Eによ り得られた各構造遺伝子に対応する 5 ' —末端 c DNA断片 の塩基配列を記載した配列表の配列番号を表 4に表示した。 また、 表 5に、 各構 造遺伝子の転写開始点及び翻訳開始の存在する配列番号、 転写開始点の位置及ぴ 翻訳開始点の位置を記載した。 表 4. 各 5 ' —末端 c DN A断片の塩基配列を示した配列表の配列番号 退 子 配列表の配列番号  Table 4 shows the sequence numbers of the sequence listings describing the base sequence of the 5'-terminal cDNA fragment corresponding to each structural gene obtained by 5 'RACE. In addition, Table 5 shows the transcription start point of each structural gene, the sequence number where translation starts, the position of transcription start point, and the position of translation start point. Table 4. SEQ ID No. in the sequence listing showing the nucleotide sequence of each 5'-terminal cDNA fragment
mlcA 配列番号 1 7 mlcA SEQ ID NO: 1 7
mlcB 配列番号 1 8 mlcB SEQ ID NO: 18
mlcC 配列番号 1 9 mlcC SEQ ID NO: 1 9
mlcD 配列番号 2 0 mlcD SEQ ID NO: 20
mlcE 配列番号 2 1 mlcE SEQ ID NO: 2 1
mlcR 配列番号 2 2 表 5. 各遺伝子の転写開始点及び翻訳開始コ ドンの位置 mlcR SEQ ID NO: 2 2 Table 5. Transcription start and translation start codon positions for each gene
遺伝子 翻訳開始コ ドンの 配列番号 1又は 2におけるヌクレオチド 番号―存在する配列番号 * 転写開始点 翻訳開始コ ドン Gene Nucleotide number in SEQ ID NO: 1 or 2 of translation initiation codon-existing SEQ ID NO * Transcription start translation initiation codon
mlcA 配列番号 2 2 2 9 1 3 2 3 0 4 5 2 3 0 4 7 mlcB 配列番号 2 1 1 6 8 9 1 1 7 4 8 1 1 7 5 0 mlcC 配列番号 1 1 1 6 4 1 1 1 7 9 6 1 1 7 9 8 mlcD 配列番号 1 2 4 0 6 6 2 4 3 2 1 2 4 3 2 3 mlcE 配列番号 2 3 3 9 9 3 5 4 5 3 5 4 7 mlcR 配列番号 2 3 6 5 4 0 0 4 0 2 mlcA SEQ ID NO: 2 2 2 9 1 3 2 3 0 4 5 2 3 0 4 7 mlcB SEQ ID NO: 2 1 1 6 8 9 1 1 7 4 8 1 1 7 5 0 mlcC SEQ ID NO: 1 1 1 6 4 1 1 1 7 9 6 1 1 7 9 8 mlcD SEQ ID NO: 1 2 4 0 6 6 2 4 3 2 1 2 4 3 2 3 mlcE SEQ ID NO: 2 3 3 9 9 3 5 4 5 3 5 4 7 mlcR SEQ ID NO: 2 3 6 5 4 0 0 4 0 2
*配列表の配列番号 1及び 2に示される塩基配列は、 互いに、 完全に相捕的であ る。 * The nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 1 and 2 in the Sequence Listing are completely complementary to each other. You.
4 ) 3 ' RA C Eによる 3 ' —末端配列の決定 4) Determination of 3'-terminal sequence by 3 'RACE
各構造遺伝子の 3 ' —末端領域を含む c D NAの取得は、 R e a d y T o G o : T— P r i m e d F i r s t - S t r a n d k i t (ファノレマシア社 製） を用いて行なった。  Acquisition of cDNA containing the 3'-terminal region of each structural gene was carried out by using ReadyToGo: T-PrimedFirstst-Strandkit (manufactured by FANORE Masia).
実施例 7及び本実施例の 2 ) の結果よ り推定された p M L 4 8の挿入塩基配列 上の各構造遺伝子において、 コード領域であり、 構造遺伝子の 3 ' —末端近傍に 位置すると考えられるセンス側のオリ ゴ D N A ( 3 ) を 1種類ずつを作製した。 表 6に各構造遺伝子について作製したオリ ゴ D N A ( 3 ) の塩基配列を表示し た。 表 6. J3 ' R A C Eによる 3 ' ——末端配列解析に用いるオリ ゴ D N A ( 3 ) lB.12S-f- 配列表の配列番号 ： 塩基配列  In each structural gene on the inserted base sequence of pML48 estimated from the results of Example 7 and 2) of this example, it is considered to be a coding region and located near the 3′-terminal of the structural gene. One oligo DNA (3) on the sense side was prepared. Table 6 shows the nucleotide sequence of oligo DNA (3) prepared for each structural gene. Table 6. Oligo DNA (3) lB.12S-f- sequence list used for 3 '--- terminal sequence analysis by J3' RACE SEQ ID NO: nucleotide sequence
mlcA 目 ti列番号 2 3 ： atcataccatcttcaacaac mlcA eyes ti column number 23: atcataccatcttcaacaac
mlcB Θ己列番号 2 4 ： gctagaataggttacaagcc mlcB Self column number 2 4: gctagaataggttacaagcc
ml cC 目己列 ¾·号 2 5 ： acattgccaggcacccagac ml cC 目 自 列 ¾ · 号 2 5 ： acattgccaggcacccagac
mlcD 目 ci列番号 2 6 ： caacgcccaagctgccaatc mlcD eyes ci column number 26: caacgcccaagctgccaatc
mlcE 目 ci列番号 2 7 ： gtctttXcctactatctacc mlcE eyes ci column number 2 7: gtctttXcctactatctacc
mlcR 列番号 2 8 ： ctttcccagct¾ctactatc オリ ゴ D NA ( 3 ) をプライマ一と し、 ぺニシリ ウム . シ ト リナム S ANK 1 3 3 8 0株の全RNA ( 1 μ g ) を錡型と した逆転写反応によ り c D N A第一 鎖を合成した。 mlcR Column No. 28: reverse transcription using ctttcccagct¾ctactatc oligo DNA (3) as primer and total RNA (1 μg) of Penicillium. citrinum S ANK 13380 strain as type 1 The first strand of cDNA was synthesized by the reaction.
c D NA第一鎖、 4 0 p m o l のォリ ゴDNA ( 3 ) 及びN o t I — d (T) 1 8プライマ一 （このキッ トに含まれる。 ） を含む Ι Ο Ο μ 1 の反応液を、 9 4 °Cにて 2分間保温し、 続いて、 9 4 °Cにて 3 0秒、 5 5 °Cにて 3 0秒、 及び、 7 2 °Cにて 2分間を 1サイクルとする反応を 3 5回行なった後、 7 2 °Cにて 5分 間、 4°Cにて 1 8時間保温した。 得られた産物をァガロースゲル電気泳動に供し た後、 ゲルから DNAを回収し、 フエノール ' クロ口ホルム抽出及びエタノール 沈澱によ り産物を精製し、 実施例 4記載の方法に準じて p C R 2. 1 を用いてク 口一二 c DNA containing first strand, 40 pmol of oligo DNA (3) and NotI-d (T) 18 primer (included in this kit) Ι Ο μ1 reaction solution Was kept at 94 ° C for 2 minutes, followed by one cycle of 30 ° C at 94 ° C, 30 seconds at 55 ° C, and 2 minutes at 72 ° C. After performing the reaction 3 to 5 times, 5 minutes at 72 ° C During this time, the temperature was kept at 4 ° C for 18 hours. After subjecting the obtained product to agarose gel electrophoresis, DNA was recovered from the gel, and the product was purified by phenol-chloroform extraction and ethanol precipitation, and pCR2 was purified according to the method described in Example 4. 1
以上の操作を 3 ' RAC Eとレヽう。  Repeat the above operation for 3 'RAC E.
得られた c DNAの 3 ' —側断片の塩基配列を決定し、 翻訳終止コ ドンの位置 を推定した。  The nucleotide sequence of the 3′-side fragment of the obtained cDNA was determined, and the position of the translation termination codon was estimated.
3 ' R AC Eによ り得られた各構造遺伝子に対応する 3 ' —末端 c DNA断片 の塩基配列を記載した配列表の配列番号を表 7にまとめた。 また、 表 8に、 各構 造遺伝子の翻訳終止コ ドン及ぴ該コ ドンの位置を配列表の配列番号 1又は 2に基 いて記載した。 表 7. 各 3 ' —末端 c D N A断片の塩基配列を示した配列表の配列番号 退ィ 子 配列表の配列番号  Table 7 summarizes the sequence numbers of the sequence listings describing the base sequence of the 3′-terminal cDNA fragment corresponding to each structural gene obtained by 3 ′ RACE. Also, in Table 8, the translation termination codon of each structural gene and the position of the codon are described based on SEQ ID NO: 1 or 2 in the sequence listing. Table 7. Sequence number in the sequence listing showing the nucleotide sequence of each 3'-terminal c DNA fragment
mlcA 配列番号 2 9 mlcA SEQ ID NO: 29
ralcB 配列番号 3 0 ralcB SEQ ID NO: 30
mlcC 配列番号 3 1 mlcC SEQ ID NO: 3 1
mlcD 配列番号 3 2 mlcD SEQ ID NO: 32
mlcE 配列番号 3 3 mlcE SEQ ID NO: 33
mlcR 配列番号 3 4 表 8. 各構造遺伝子の翻訳終止コ ドン及び該翻訳終止コ ドンの位置 mlcR SEQ ID NO: 3 4 Table 8. Translation stop codon of each structural gene and the position of the translation stop codon
遺伝子 翻訳終止 翻訳終止コ ドンの 配列番号 1又は 2における コ ドン 存在する配列番号 * 翻訳終止コ ドンのヌク レオ チド番号 Gene Translation termination Codon in translation termination codon SEQ ID NO: 1 or 2 Sequence number present * Nucleotide number of translation termination codon
mlcA tag 配列番号 2 3 2 7 2 3 3 2 7 2 5 mlcB taa 配列番号 2 1 9 8 4 0 1 9 8 4 2 ml cC taa 配列番号 1 1 3 4 7 9 1 3 4 8 1 ml cD tga 配列番号 1 2 7 8 9 0〜 2 7 8 9 2 mlcE tga. 配列番号 2 5 7 3 0〜 5 7 3 2 mlcR tag 配列番号 2 1 9 1 5〜 1 9 1 7mlcA tag SEQ ID NO: 2 3 2 7 2 3 3 2 7 2 5 mlcB taa SEQ ID NO: 2 1 9 8 4 0 1 9 8 4 2 ml cC taa SEQ ID NO: 1 1 3 4 7 9 1 3 4 8 1 ml cD tga SEQ ID NO: 1 2 7 8 9 0 to 2 7 8 9 2 mlcE tga.SEQ ID NO: 2 5 7 3 0 to 5 7 3 2 mlcR tag SEQ ID NO: 2 1 9 1 5 to 1 9 1 7
*配列表の配列番号 1及び 2に示される塩基配列は、 互いに、 完全に相補的であ る。 さ らに、 各構造遺伝子がコー ドすると推定されるポリペプチ ドの C末端のアミ ノ酸残基、 そのアミノ酸残基をコ一 ドする ト リヌク レオチドの塩基配列及びその ト リヌク レオチ ドの位置を表 9に記載した。 ' 表 9. 各構造遺伝子の ドするポリべプチドの C末端ァミ ノ酸 * The base sequences shown in SEQ ID NOS: 1 and 2 in the sequence listing are completely complementary to each other. In addition, the amino acid residue at the C-terminus of the polypeptide which is predicted to be encoded by each structural gene, the nucleotide sequence of the nucleotide encoding the amino acid residue, and the position of the nucleotide are described. It is described in Table 9. '' Table 9. C-terminal amino acids of polypeptides of each structural gene
遺 C末端 該アミ ノ酸をコー 該ト リヌク レ 配列番号 1又は 2にお 伝 ァミ ノ ドする ト リヌク レ ォチドの存在 ける該ト リヌク レオチ 子 —酸残基 ォチドの塩基配列 する配列番号 *—ドのヌク レオチド番号 mlcA ァフニン gcc 配列番号 2 32720〜32722 ralcB セリン agt 配列番号 2 19837〜19839 nilcC システィン tgc 配列番号 1 13476- 13478 mlcD アルキ、'ニン cgc 配列番号 1 27887〜27889 mlcE ァラニン get 配列番号 2 5727〜5729 Residue C-terminal The amino acid is transferred to the trinucleotide SEQ ID NO: 1 or 2. The trinucleotide in the presence of the trinucleotide is present. -Nucleotide number of mlcA afunin gcc SEQ ID NO: 2 32720-32722 ralcB serine agt SEQ ID NO: 2 19837-19839 nilcC cysteine tgc SEQ ID NO: 1 13476-13478 mlcD Alky, 'nin cgc SEQ ID NO: 1 27887-27889 mlcE alanin get SEQ ID NO: 2 5727〜5729
mlcR ァラニン get 配列番号 2 1912〜1914 mlcR alanine get SEQ ID NO: 2 1912-1914
*配列表の配列番号 1及び 2に示される塩基配列は、 互いに、 完全に相捕的であ る。 また、 表 8記載の翻訳終止コ ドンに対する相補配列、 該相補配列の存在する配 列番号、 及び、 該相補配列の位置を表 1 0にまとめた。 表 1 0. 各構造遺伝子の翻訳終始コ ドンに対する相補配列  * The nucleotide sequences shown in SEQ ID NOS: 1 and 2 in the sequence listing are completely complementary to each other. In addition, Table 10 summarizes the complementary sequence to the translation termination codon described in Table 8, the sequence number where the complementary sequence exists, and the position of the complementary sequence. Table 10. Complementary sequences to the translation stop codon of each structural gene
遺伝子 翻訳終始コ ドン 該相補配列の存在 配列番号 1又は 2におけ .対する相補配 する配列番号 * る該相補配列のヌク レオ 列 チド番号 Gene translation stop codon Presence of the complementary sequence SEQ ID NO: 1 or 2 Complementary sequence number * Nucleotide sequence number of the complementary sequence
mlcA cta 配列番号 1 1 4 7 9〜 1 4 8 1 mlcB tta 配列番号 1 1 4 3 6 2〜 1 4 3 6 4 mlcC tta 配列番号 2 2 0 7 2 3〜 2 0 7 2 5 mlcD tea 配列番号 2 6 3 1 2〜 6 3 1 4 inlcE tea 配列番号 1 2 8 4 7 2〜 2 8 4 7 4 mlcR cta 配列番号 1 3 2 2 8 7 ~ 3 2 2 8 9mlcA cta SEQ ID NO: 1 1 4 7 9 to 1 4 8 1 mlcB tta SEQ ID NO: 1 1 4 3 6 2 to 1 4 3 6 4 mlcC tta SEQ ID NO: 2 2 0 7 2 3 to 2 0 7 2 5 mlcD tea SEQ ID NO: 2 6 3 1 2 to 6 3 1 4 inlcE tea SEQ ID NO: 1 2 8 4 7 2 to 2 8 4 7 4 mlcR cta SEQ ID NO: 1 3 2 2 8 7 to 3 2 2 8 9
*配列表の配列番号 1及び 2に示される塩基配列は、 互いに、 完全に相捕的で ある。 以上の通り、 各構造遺伝子の存在、 その方向及びその位置が明らかとなった。 これらの情報に基いて、 各構造遺伝子の転写産物及ぴ翻訳産物を取得することが 可能である。 実施例 9. 組換え DN Aベタタ一 pML 4 8を用いたぺニシリ ゥム · シト リナム の形質転換 * The nucleotide sequences shown in SEQ ID NOS: 1 and 2 in the sequence listing are completely complementary to each other. As described above, the existence, direction, and position of each structural gene were clarified. Based on this information, it is possible to obtain transcription products and translation products of each structural gene. Example 9. Transformation of Penicillium citrinum with recombinant DNA beta pML48
ぺニシリ ウム ' シト リナムの形質転換は、 ナラらの方法 （Nara,F. ,et al. , C urr. Genet.23, 28 (1993)記載） に従った。  Transformation of Penicillium 'citrinum was performed according to the method of Nara et al. (Described in Nara, F., et al., Curr. Genet. 23, 28 (1993)).
1 ) プロ トプラス トの調製  1) Preparation of protoplast
ぺニシリ ウム . シト リナム S ANK 1 3 3 8 0株を培養したスラントよ り、 白金耳を用いて P G A寒天培地に接種し、 2 6°Cにて 1 4 日間保温した。 該培養 物よ りぺニシリ ウム ' シト リナム S A N K 1 3 3 8 0株の胞子を回収し、 I X 1 08個の胞子を 8 0 m l の Y P L— 2 0培地に接種し、 2 6 °Cにて 1 日間保温 した。 胞子の発芽を顕微鏡観察により確認した後、 発芽胞子を、 室温、 5 0 0 0 XGの条件下で 1 0分間遠心分離して胞子を沈澱と して回収した。 胞子を滅菌水 で 3回洗浄した後、 プロ トプラス ト化を行なった。 すなわち、 2 0 0 m gのザィ モリァ一ゼ 2 0 T (生化学工業 （株） 製） 及び 1 0 0 m gのキチナーゼ （S i g m a社製） を 1 0 m l の 0. 5 5M 塩化マグネシウムに溶解し、 室温、 5 0 0 0 X Gの条件下で 1 0分間遠心分離して得られた上清を酵素液と し、 2 0 m 1 の 酵素液及び湿重量 0. 5 gの発芽胞子を 1 0 0 m 1容三角フラスコに入れ、 3 0°Cにて 6 0分間穏やかに振盪し、 発芽胞子がプロ トプラス ト化したことを顕微 鏡観察によ り確認した後、 反応液を 3 G— 2ガラスフィルタ一 （HA R I O社 製） で濾過した。 該濾液を、 室温、 1 0 0 0 XGの条件下で 1 0分間遠心分離し、 プロ トプラス トを沈澱として回収した。 A PGA agar medium was inoculated with a platinum loop from a slant obtained by cultivating Penicillium citrinum S ANK 133 0 8 strain, and incubated at 26 ° C for 14 days. Spores of 1 3 3 8 0 shares the culture by repeller Nishiri um 'citrate Rinamu SANK were collected and IX 1 0 8 spores were inoculated into YPL- 2 0 medium 8 0 ml, the 2 6 ° C For one day. After confirming the germination of the spores by microscopic observation, the germinated spores were centrifuged at room temperature under the condition of 500.times.XG for 10 minutes, and the spores were collected as a precipitate. The spores were washed three times with sterile water, and then protoplasted. That is, 200 mg of Zymoryase 20 T (manufactured by Seikagaku Corporation) and 100 mg of chitinase (Sig was dissolved in 10 ml of 0.5M magnesium chloride, and centrifuged at room temperature under the condition of 500 XG for 10 minutes. m 1 Enzyme solution and 0.5 g wet weight of germinated spores were placed in a 100-ml Erlenmeyer flask and gently shaken at 30 ° C for 60 minutes to form protoplasts. After confirmation by microscopic observation, the reaction solution was filtered through a 3G-2 glass filter (manufactured by HARIO). The filtrate was centrifuged at room temperature under a condition of 1000 XG for 10 minutes, and the protoplast was collected as a precipitate.
2 ) 形質転換  2) Transformation
1 ) で得られたプロ トプラス トを 3 0 m 1 の 0. 5 5M 塩化マグネシウム溶 液で 2回、 3 0 m l の 0. 5 5M 塩化マグネシウム一 5 0 mM 塩化カルシゥ ム一 1 0 mM 3—モルフォ リ ノプロパンスルホン酸 （ρ Η 6 · 3 : 以下、 「Μ CM溶液」 とレ、う。 ） で 1回それぞれ洗浄し、 1 0 0 /1 1 の 4 % (w/v)ポリェチ レングリ コール 8 0 0 0 - 1 0 mM 3—モルフォ リ ノプロパンスルホン酸一 0. 0 0 2 5 % (w/v)へパリ ン （S i g m a社製） 一 5 0 mM 塩ィ匕マグネシゥム The protoplast obtained in 1) was washed twice with 30 ml of 0.5 M magnesium chloride solution, and 30 ml of 0.5 M magnesium chloride- 50 mM calcium chloride 10 mM 3-methylene chloride solution. Wash once with morpholinopropanesulfonic acid (ρ Η 6.3: hereafter referred to as “Μ CM solution”), and add 100% of 4/1 (w / v) polyethylene glycol 800-10 mM 3-morpholinopropanesulfonic acid-0.025% (w / v) heparin (manufactured by Sigma)-50 mM Shiridani Magnesium
(p H 6. 3 ： 以下、 「形質転換用溶液」 という。 ） に懸濁した。 約 5 X 1 07 個のプロ トプラス トを含む 9 6 β 1 の形質転換溶液及ぴ 1 2 0 /x gの pML 4 8 DNAを含む 1 0 μ 1 の T Eを混合し、 氷上で 3 0分間静置した。 これに 1. 2 m 1 の 2 0 % (w/v)ポリエチレングリ コール— 5 0 mM 塩化マグネシゥム一 1 0 mM 3—モルフォ リ ノプロパンスルホン酸 （p H 6. 3 ) を加えて穏、や力 こ ピペッティングし、 室温、 2 0分間静置した。 これに 1 0 m 1 の MCM溶液を加 えて穏やかに混合し、 室温、 1 0 0 0 XGの条件下で 1 0分間遠心分離した。 沈 澱よ り形質転換プロ トプラス トを回収した。 (pH 6.3: hereinafter, referred to as “transformation solution”). About 5 X 1 0 7 single mixing 1 0 mu 1 of TE containing pro Topurasu transformation of 9 6 beta 1 including bets solution及Pi 1 2 0 / xg pML 4 8 DNA in ice for 3 0 minutes It was left still. To this was added 1.2 ml of 20% (w / v) polyethylene glycol-50 mM magnesium chloride-10 mM 3-morpholinopropanesulfonic acid (pH 6.3), and the mixture was moderately diluted. This was pipetted and allowed to stand at room temperature for 20 minutes. To this, 10 ml of an MCM solution was added, mixed gently, and centrifuged at room temperature under a condition of 1000 XG for 10 minutes. Transformation protoplasts were recovered from the precipitate.
3 ) 形質転換プロ トプラス トにおける細胞壁の再生  3) Regeneration of cell wall in transformation protoplasts
2 ) で得られた形質転換プロ トプラス トを 5 m 1 の液状の VG S中層寒天培地 に懸濁し、 固化した 1 0 m 1 の V G S下層寒天培地プレー トに重層した。 該プレ ー トを、 2 6 °Cにて 1 日間培養した後、 プレー ト 1枚につき 5 m gのハイグロマ イシン B (H y g r o m y c i n B ： S i g m a社製） を含む 1 0 m l の液状 の V G S上層寒天培地を重層した （ハイグロマイシン Bの終濃度は 2 0 0 μ g Z m l ) 。 2 6 °Cにて 1 4 日間保温して得られた菌株を、 S O O /i gZm l のハイ グロマイシン Bを含有する P G A寒天培地上で継代培養した後、 P G A寒天培地 で作製したスラントに植え継ぎ、 2 6 °Cにて 1 4 日間保温した。 The transformation protoplast obtained in 2) was suspended in 5 ml of a liquid VGS medium agar medium, and layered on a solidified 10 ml VGS lower agar medium plate. After culturing the plate at 26 ° C for 1 day, 10 ml of liquid VGS upper agar containing 5 mg of hygromycin B (Sigma) per plate was used. The medium was overlaid (final concentration of hygromycin B was 200 μg Z ml). The strain obtained by incubation at 26 ° C for 14 days was subcultured on PGA agar medium containing SOO / igZml of hygromycin B, and then inoculated on the slant prepared on PGA agar medium. And incubated at 26 ° C for 14 days.
これを形質転換株という。  This is called a transformant.
該スラントは 4 Cで保存した。 試験例 1. 形質転換株及び親株の有する ML— 2 3 6 B生産能の比較  The slant was stored at 4C. Test Example 1. Comparison of ML-236B production ability of transformed strain and parent strain
実施例 9において得られた形質転換株及び親株ぺニシリ ウム ' シト リナム S ANK 1 3 3 8 0株を培養し、 該培養物中の ML— 2 3 6 B量を測定した。  The transformed strain obtained in Example 9 and the parent strain Penicillium 'citrinum S ANK 13380 strain were cultured, and the amount of ML-236B in the culture was measured.
形質転換株を培養したスラント （実施例 9記載） 又はぺニシリ ウム ' シト リナ ム S ANK 1 3 3 8 0株を培養したスラント （実施例 2記載） より 5 mm角の 菌体を、 1 O m 1 の MB G 3— 8培地を入れた 1 0 O m 1容の三角フラスコに接 種し、 2 6 °Cにて 2 日間、 振盪培養した後、 3. 5 m 1 の 5 0 % (w/v)ダリセリ ン溶液を添加し、 さらに 2 6°Cにて 1 0 日間、 振盪培養した。  A 5 mm square cell from the slant (described in Example 9) in which the transformed strain was cultured (described in Example 9) or the slant (in Example 2) in which the penicillium 'citrine S ANK 13380 strain was cultured was added to 1O. After inoculating a 10 O m1 Erlenmeyer flask containing m1 MBG3-8 medium and culturing with shaking at 26 ° C for 2 days, 50% of 3.5 m1 ( (w / v) Dalyceline solution was added, and the cells were further cultured with shaking at 26 ° C for 10 days.
該培養物 1 0 m 1 に 5 0 m 1 の 0. 2規定水酸化ナト リ ウムを加え、 2 6 °Cに て 1時間、 振盪しつつ保温した後、 室温、 3 0 0 0 XGの条件下で 2分間遠心分 離し、 1 m l の上淸を回収し、 9 m 1 の 5 0 %メタノールと混合して H P L Cに 供した。  50 ml of 0.2 N sodium hydroxide was added to 10 ml of the culture and incubated at 26 ° C for 1 hour with shaking. The mixture was centrifuged under the same conditions for 2 minutes, and 1 ml of the supernatant was collected, mixed with 9 ml of 50% methanol, and subjected to HPLC.
H P L Cのカラムには、 S S C— OD S— 2 6 2 (直径 6 mm、 長さ 1 0 0 m m : センシユー科学 （株） 製） を用い、 移動相には 7 5 % (v/v)メタノール— 0. 1 % (v/v) ト リェチルァミ ン— 0. 1 % (v/v)酢酸を用レ、、 室温にて 2 m l /分の 流速で溶出した。 これら条件下において、 ML— 2 3 6 Bはカラム添加後 4. 0 分に溶出された。 検出は UV検出器の吸収波長を 2 3 6 n mに設定して行なった c 形質転換株のうち ML 2 3 6 B生産能の改善された株が 5つ得られ、 これらの 生産能は親株よ り平均 1 2 %高かった。 The HPLC column used was SSC-ODS-262 (diameter 6 mm, length 100 mm: manufactured by Sensyu Kagaku Co., Ltd.), and the mobile phase was 75% (v / v) methanol 0.1% (v / v) triethylamine—eluted with 0.1% (v / v) acetic acid at room temperature at a flow rate of 2 ml / min. Under these conditions, ML-236B was eluted 4.0 minutes after column loading. Detection was carried out by setting the absorption wavelength of the UV detector to 236 nm, and among the c- transformed strains, 5 strains with improved ML236B-producing ability were obtained. On average 12% higher.
この 5株の ML— 2 3 6 B生産能は、 モノスポア処理等の継代を行なった後も 安定に維持された。 「産業上の利用の可能性」 The ML-236B production ability of these five strains was maintained stably even after passage such as monospore treatment. "Possibility of industrial use"
本発明において ML - 2 3 6 B生産菌ょ り得られた DN Aは、. 該生産菌内に導 入されることによ り該生産菌の ML— 2 3 6 B生産能を改善する。  In the present invention, the DNA obtained from the ML-236B-producing bacterium improves the ML-236B-producing ability of the producing bacterium by being introduced into the producing bacterium.
また、 該 D N A上に 6つの構造遺伝子の存在、 その方向及びその位置が明らか となった。 本発明によ り、 それぞれの構造遺伝子に対応する c DNAを取得する ことが可能になる。  In addition, the presence, direction, and position of six structural genes on the DNA were revealed. According to the present invention, it is possible to obtain cDNA corresponding to each structural gene.

Claims

請求の範囲 The scope of the claims
1. 配列表の配列番号 1のヌク レオチド番号 1乃至 3 4 2 0 3で示される塩基配 列を含むことからなり、 ML— 2 3 6 B生産菌内に導入されることにより該菌の ML - 2 3 6 B生産能を改善することを特徴とする DN A。 1. It comprises a nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 1 to 34203 of SEQ ID NO: 1 in the sequence list, and is introduced into a ML-236B-producing bacterium to produce the ML of the bacterium. -DN A characterized by improving productivity.
2. 形質転換大腸菌 E . c o 1 i p M L 4 8 S ANK 7 1 1 9 9株 （F E RM B P— 6 7 8 0 ) よ り得ることができる、 請求項 1記載の D N A。  2. The DNA according to claim 1, wherein the DNA can be obtained from a transformed E. coli E.co1ipML48SANK71119 strain (FERMBP-6790).
3. 請求項 1又は 2記載の D N Aとハイブリ ダィズじ、 ML— 2 3 6 B生産菌内 に導入されることによ り該菌の ML— 2 3 6 B生産能を改善することを特徴とす る D N A。  3. A DNA hybridized with the DNA of claim 1 or 2, which is introduced into an ML-236B-producing bacterium to improve the ML-236B-producing ability of the bacterium. DNA.
4. 請求項 1又は 2記載の DNAとス ト リ ンジェントな条件下でハイブリ ダイズ し、 ML— 2 3 6 B生産菌内に導入されることによ り該菌の ML— 2 3 6 B生産 能を改善することを特徴とする DNA。  4. Hybridizing with the DNA of claim 1 or 2 under stringent conditions and introducing into the ML-236B-producing bacterium to produce ML-236B of the bacterium DNA characterized by improved performance.
5. 請求項 1乃至 4のいずれか一つに記載の DN Aを含む組換え DN Aべクター c 5. A recombinant DNA vector c containing the DNA according to any one of claims 1 to 4.
6. 形質転換大腸菌 E. c o 1 i p M L 4 8 S ANK 7 1 1 9 9株 （F E RM B P— 6 7 8 0 ) に保持される、 請求項 5記載の組換え D N Aベクター。6. The recombinant DNA vector according to claim 5, which is maintained in the transformed Escherichia coli E.co1ipML48SANK71119 (strain FERMBP-6790).
7. 請求項 5又は 6記載の組換え DN Aベクターで形質転換された宿主細胞。7. A host cell transformed with the recombinant DNA vector according to claim 5 or 6.
8. ML - 2 3 6 B生産菌であることを特徴とする請求項 7記載の宿主細胞。8. The host cell according to claim 7, which is a ML-236B-producing bacterium.
9. ぺニシリ ウム ' シト リナム （Penicillium citrinum) であることを特徴と する、 請求項 8記載の宿主細胞。 9. The host cell according to claim 8, wherein the host cell is Penicillium citrinum.
1 0. 請求項 8又は 9記載の宿主細胞を培養し、 次いで該培養物から ML— 2 3 10. Culturing the host cell according to claim 8 or 9;
6. Bを回収することを特徴とする、 ML— 2 3 6 Bの製造法。 6. A method for producing ML-236B, wherein B is recovered.
1 1. 大腸菌であることを特徴とする、 請求項 7記載の宿主細胞。  1 1. The host cell according to claim 7, which is Escherichia coli.
1 2. 形質転換大腸菌 E. c o l i p ML 4 8 S ANK 7 1 1 9 9 (F E RM B P— 6 7 8 0 ) である、 請求項 1 1記載の宿主細胞。  1 2. The host cell according to claim 11, wherein the host cell is a transformed E. coli E.colipML 48 S ANK 711 999 (FERMBP—6790).
1 3. 配列表の配列番号 2において、 ヌク レオチド番号 2 3 0 4 5のアデニン又 はそれよ り 5 ' —側の塩基を 5 ' —末端とする、 少なく とも 1 0個の塩基からな る配列を有する P C R用プライマ一 A l。 1 3. At least 10 bases with the adenine at nucleotide number 2304 5 or the 5'-terminal base 5 'to the 5'-end in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing A primer for PCR having a sequence.
1 4. 請求項 1 3記載の P C R用プライマー A 1の塩基配列と 7 0 %以上の相同 性を有し、 少なく とも 1 0個の塩基からなる配列を含む P C R用プライマ一 A 2 (但し、 該 P C R用プライマ一 A 2は、 配列表の配列番号 2のヌク レオチド番 号 2 3 0 4 5乃至 2 3 0 4 7によ り コー ドされるメチォニン残基を N末端とする ポリペプチドをコードする c D NAを増幅させるための P C Rに用いられ得る） 1 4.PCR primer A2 having at least 70% homology with the nucleotide sequence of the PCR primer A1 according to claim 13 and containing a sequence consisting of at least 10 bases (provided that The primer A2 for PCR encodes a polypeptide having a methionine residue encoded by nucleotide numbers 23045 to 23047 of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing as an N-terminal. Can be used for PCR to amplify cDNA)
1 5. 請求項 1 3記載の P C R用プライマー A 1の塩基配列と 8 0 %以上の相同 性を有し、 少なく とも 1 0個の塩基からなる配列を含む P C R用プライマー A 3 (但し、 該 P C R用プライマー A 3は、 配列表の配列番号 2のヌク レオチ ド番 号 2 3 0 4 5乃至 2 3 0 4 7によ りコ一 ドされるメチォニン残基を N末端とする ポリぺプチドをコ一ドする c D N Aを増幅させるための P C Rに用いられ得る） 1 5.PCR primer A 3 (having a homology of 80% or more with the nucleotide sequence of the primer A 1 for PCR according to claim 13 and containing a sequence consisting of at least 10 bases, The primer A3 for PCR is a polypeptide having a methionine residue encoded by a nucleotide number 23045 to 23047 of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing as an N-terminal. Can be used for PCR to amplify the coding cDNA)
1 6. 請求項 1 3記載の P C R用プライマー A 1の塩基配列と 9 0 %以上の相同 性を有し、 少なく とも 1 0個の塩基からなる配列を含む P C R用プライマ一 A 4 (但し、 該 P C R用プライマ一 A 4は、 配列表の配列番号 2のヌク レオチ ド番 号 2 3 0 4 5乃至 2 3 0 4 7により コー ドされるメチォ二ン残基を N末端とする ポリペプチドをコードする c D N Aを増幅させるための P C Rに用いられ得る） 1 6.PCR primer A4 having at least 90% homology with the nucleotide sequence of the PCR primer A1 according to claim 13 and containing a sequence consisting of at least 10 bases (provided that The PCR primer A4 is a polypeptide having a N-terminal methionine residue encoded by a nucleotide number 23045 to 23047 of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing. Can be used for PCR to amplify the encoding cDNA)
1 7. 配列表の配列番号 1において、 ヌク レオチ ド番号 1 4 7 9のシ トシン又は それより 5 ' —側の塩基を 5 ' —末端とする、 少なく とも 1 0個の塩基からなる 配列を有する P C R用プライマー B 1。 1 7. In SEQ ID NO: 1 of the Sequence Listing, a sequence consisting of at least 10 bases, with the 5'-terminal of the cytosine of nucleotide number 1479 or the 5'-side thereof being 5'-terminal. Having PCR primer B1.
1 8. 請求項 1 7記載の P C R用プライマー B 1の塩基配列と 7 0 %以上の相同 性を有する、 少なく とも 1 0個の塩基からなる配列を含む P C R用プライマー B 2  1 8. PCR primer B 2 having a sequence consisting of at least 10 bases and having a homology of 70% or more with the nucleotide sequence of primer B 1 for PCR according to claim 17
(但し、 該 P C R用プライマー B 2は、 配列表の配列番号 2のヌク レオチド番 号 3 2 7 2 0乃至 3 2 7 2 2によ り コー ドされるァラニン残基を C末端とするポ リぺプチドをコ一ドする c D N Aを増幅させるための P C Rに用いられ得る） 。  (However, the PCR primer B2 is a primer having a C-terminal alanine residue coded by the nucleotide numbers 32720 to 32272 of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing. It can be used for PCR to amplify cDNA encoding a peptide).
1 9. 請求項 1 7記載の P C R用プライマー B 1の塩基配列と 8 0 %以上の相同 性を有する、 少なく とも 1 0個の塩基からなる配列を含む P C R用プライマ一 B 3 1 9. More than 80% homology with the nucleotide sequence of the PCR primer B1 according to claim 17 PCR primer containing a sequence consisting of at least 10 bases
(但し、 該 P C R用プライマ一 B 3は、 配列表の配列番号 2のヌク レオチ ド番 号 3 2 7 2 0乃至 3 2 7 2 2によ り コー ドされるァラニン残基を C末端とするポ リぺプチ ドをコ一ドする c DN Aを増幅させるための P C Rに用いられ得る） 。  (However, the primer B3 for PCR has a C-terminal alanine residue coded by the nucleotide numbers 32720 to 32272 of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing. It can be used in PCR to amplify cDNA encoding a polypeptide).
2 0. 請求項 1 7記載の P C R用プライマ一 B 1の塩基配列と 9 0 %以上の相同 性を有する、 少なく とも 1 0個の塩基からなる配列を含む P C R用プライマー B 4 20. A PCR primer B4 having a sequence consisting of at least 10 bases and having a homology of 90% or more with the nucleotide sequence of the primer for PCR B1 according to claim 17
(但し、 該 P C R用プライマ一 B 4は、 配列表の配列番号 2のヌク レオチ ド番 号 3 2 7 2 0乃至 3 2 7 2 2により コードされるァラニン残基を C末端とするポ リぺプチドをコードする c DNAを増幅させるための P C Rに用いられ得る） 。  (However, the primer B4 for PCR is a primer having a C-terminal alanine residue encoded by the nucleotide number 32720 to 3272 of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing. Can be used for PCR to amplify the cDNA encoding the peptide).
2 1 . 配列表の配列番号 2において、 ヌク レオチ ド番号 1 1 7 4 8のアデニン又 はそれよ り 5 ' —側の塩基を 5 ' —末端とする、 少なく とも 1 0個の塩基からな る配列を有する P C R用プライマー C 1。 21. In SEQ ID NO: 2 in the sequence listing, a nucleotide consisting of at least 10 bases, with the adenine at the nucleotide number 11748 or the 5'-terminal base 5 'to the 5'-terminal, PCR primer C1 having the following sequence:
2 2. 請求項 2 1記載の P C R用プライマー C 1の塩基配列と 7 0 %以上の相同 性を有し、 少なく とも 1 0個の塩基からなる配列を含む P C R用プライマ一 C 2 (但し、 該 P C R用プライマー C 2が、 配列表の配列番号 2のヌク レオチ ド番 号 1 1 7 4 8乃至 1 1 7 5 0により コー ドされるメチォニン残基を N末端とする ポリぺプチドをコ一ドする c DN Aを増幅させるための P C Rに用いられ得る）  2 2.A PCR primer C2 having at least 70% homology with the nucleotide sequence of the PCR primer C1 according to claim 21 and containing a sequence consisting of at least 10 bases (provided that The primer C2 for PCR comprises a polypeptide having a methionine residue encoded by the nucleotide number 11748 to 117500 of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing as an N-terminal. Can be used for PCR to amplify cDNA
2 3. 請求項 2 1記載の P C R用プライマー C 1の塩基配列と 8 0 %以上の相同 性を有し、 少なく とも 1 0個の塩基からなる配列を含む P C R用プライマ一 C 3 (但し、 該 P C R用プライマー C 3が、 配列表の配列番号 2のヌク レオチ ド番 号 1 1 7 4 8乃至 1 1 7 5 0によ り コ一 ドされるメチォニン残基を N末端とする ポリぺプチドをコー ドする c DNAを増幅させるための P C Rに用いられ得る） 2 3.A PCR primer C3 having at least 80% homology with the nucleotide sequence of the PCR primer C1 according to claim 21 and containing a sequence consisting of at least 10 bases (provided that The primer C3 for PCR is a polypeptide having a methionine residue encoded by nucleotide numbers 1 1 7 4 8 to 1 1 7 0 of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing as an N-terminal. Can be used for PCR to amplify cDNA)
2 4. 請求項 2 1記載の P C R用プライマ一 C 1の塩基配列と 9 0 %以上の相同 性を有し、 少なく とも 1 0個の塩基'からなる配列を含む P C R用プライマー C 4 (但し、 該 P C R用プライマ一 C 4が、 配列表の配列番号 2のヌク レオチ ド番 号 1 1 7 4 8乃至 1 1 7 5 0によ り コー ドされるメチォニン残基を N末端とする ポリぺプチ ドをコ一ドする c D N Aを増幅させるための P C Rに用いられ得る） 2 4. A PCR primer C4 having at least 90% homology with the nucleotide sequence of the PCR primer C1 according to claim 21 and comprising a sequence consisting of at least 10 bases' (However, the PCR primer C4 has a N-terminal methionine residue encoded by the nucleotide numbers 1 1 7 4 8 to 1 1 7 0 of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing. It can be used for PCR to amplify cDNA that encodes the polypeptide)
2 5. 配列表の配列番号 1において、 ヌク レオチド番号 1 4 3 6 2のチミン又は それより 5 ' —側の塩基を 5 ' —末端とする、 少なく とも 1 0個の塩基からなる 配列を有する P C R用プライマー D l。 2 5. In the sequence listing, SEQ ID NO: 1, having a sequence consisting of at least 10 bases, with the thymine of nucleotide number 14432 as the 5'-terminal at the 5'-side thereof at the 5'-terminal PCR primer Dl.
2 6. 請求項 2 5記載の P C R用プライマ一 D 1の塩基配列と 7 0 %以上の相同 性を有し、 少なく とも 1 0個の塩基からなる配列を含む P C R用プライマー D 2 26. A primer D2 for PCR having at least 70% homology with the nucleotide sequence of the primer D1 for PCR according to claim 25, and comprising a sequence consisting of at least 10 bases.
(但し、 該 P C R用プライマー D 2は、 配列表の配列番号 2のヌク レオチ ド番 号 1 9 8 3 7乃至 1 9 8 3 9により コードされるセリ ン残基を C末端とするポリ ペプチドをコードする c DNAを増幅させるための P C Rに用いられ得る） 。 (However, the PCR primer D2 is a polypeptide having a C-terminal serine residue encoded by nucleotide numbers 198 337 to 198 39 of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing. It can be used for PCR to amplify the encoding cDNA).
2 7. 請求項 2 5記載の P C R用プライマー D 1の塩基配列と 8 0 %以上の相同 性を有し、 少なく とも 1 0個の塩基からなる配列を含む P C R用プライマー D 32 7. A primer D 3 for PCR that has at least 80% homology with the nucleotide sequence of the primer D 1 for PCR according to claim 25 and contains a sequence consisting of at least 10 bases
(但し、 該 P C R用プライマ一 D 3は、 配列表の配列番号 2のヌク レオチド番 号 1 9 8 3 7乃至 1 9 8 3 9によ り コー ドされるセリ ン残基を C末端とするポリ ペプチドをコードする c DNAを増幅させるための P C Rに用いられ得る） 。 (However, the primer D3 for PCR has a C-terminus at the serine residue coded by the nucleotide numbers 198 37 to 198 39 of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing. It can be used for PCR to amplify cDNA encoding a polypeptide).
2 8. 請求項 2 5記載の P C R用プライマー D 1の塩基配列と 9 0 %以上の相同 性を有し、 少なく とも 1 0個の塩基からなる配列を含む P C R用プライマー D 42 8. A primer D4 for PCR having at least 90% homology with the nucleotide sequence of the primer D1 for PCR according to claim 25 and comprising a sequence consisting of at least 10 bases
(但し、 該 P C R用プライマー D 4は、 配列表の配列番号 2のヌク レオチド番 号 1 9 8 3 7乃至 1 9 8 3 9によ り コー ドされるセリ ン残基を C末端とするポリ ペプチドをコードする c DNAを増幅させるための P C Rに用いられ得る） 。(However, the PCR primer D4 is a primer having a C-terminal serine residue coded by nucleotide numbers 198 337 to 198 39 of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing. Can be used for PCR to amplify cDNA encoding the peptide)).
2 9. 配列表の配列番号 1において、 ヌク レオチド番号 1 1 7 9 6のアデニン又 はそれよ り 5 ' —側の塩基を 5 ' —末端とする、 少なく とも 1 0個の塩基からな る配列を有する P C R用プライマー E 1。 2 9. In SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, the nucleotide consists of at least 10 bases, with the adenine at nucleotide number 1 197 6 or the 5'-terminal base 5'-terminal to the 5'-terminal. PCR primer E1 having a sequence.
3 0. 請求項 2 9記載の P C R用プライマー E 1の塩基配列と 7 0 %以上の相同 性を有し、 少なく とも 1 0個の塩基からなる配列を含む P C R用プライマー E 2 30. A primer E2 for PCR having at least 70% homology with the nucleotide sequence of the primer E1 for PCR according to claim 29, and comprising a sequence consisting of at least 10 bases.
(但し、 該 P C R用プライマ一 E 2が、 配列表の配列番号 1のヌク レオチ ド番 号 1 1 7 9 6乃至 1 1 7 9 8によ り コードされるメチォニン残基を N末端とする ポリペプチドをコードする c DN Aを増幅させるための P C Rに用いられ得る） (However, the primer E2 for PCR corresponds to the nucleotide number of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. No. 11 796 to 11 798 can be used for PCR to amplify cDNA encoding a polypeptide having a methionine residue encoded at the N-terminus)
3 1. 請求項 2 9記載の P C R用プライマー E 'lの塩基配列と 8 0 %以上の相同 性を有し、 少なく とも 1 0個の塩基からなる配列を含む P C R用プライマー E 3 (但し、 該 P C R用プライマー E 3力 配列表の配列番号 1のヌク レオチド番 号 1 1 7 9 6乃至 1 1 7 9 8により コー ドされるメチォニン残基を N末端とする ポリペプチ ドをコードする c D NAを増幅させるための P C Rに用いられ得る） 3 1.A PCR primer E 3 having at least 80% homology with the nucleotide sequence of the PCR primer E′l according to claim 29 and containing a sequence consisting of at least 10 bases (provided that The PCR primer E3 force cDNA encoding a polypeptide having a methionine residue encoded by the nucleotide number 1 197 6 to 1 197 8 of SEQ ID NO: 1 in the sequence list at the N-terminus c D NA Can be used for PCR to amplify
3 2. 請求項 2 9記載の P C R用プライマー E 1の塩基配列と 9 0 %以上の相同 性を有し、 少なく とも 1 0個の塩基からなる配列を含む P C R用プライマー E 4 (但し、 該 P C R用プライマー E 4が、 配列表の配列番号 1のヌク レオチド番 号 1 1 7 9 6乃至 1 1 7 9 8によ り コー ドされるメチォニン残基を N末端とする ポリぺプチドをコードする c DNAを増幅させるための P C Rに用いられ得る） 3 2.A PCR primer E4 having at least 90% homology with the nucleotide sequence of the PCR primer E1 according to claim 29 and containing a sequence consisting of at least 10 bases, provided that PCR primer E4 encodes a polypeptide having a methionine residue encoded by nucleotide numbers 11796 to 11798 of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing as an N-terminus c Can be used for PCR to amplify DNA)
3 3. 配列表の配列番号 2において、 ヌク レオチド番号 2 0 7 2 3のチミン又は それよ り 5 ' —側の塩基を 5 ' —末端とする、 少なく とも 1 0個の塩基からなる 配列を有する P C R用プライマー F 1。 3 3. In SEQ ID NO: 2 in the sequence listing, a sequence consisting of at least 10 bases, with the thymine of nucleotide number 20723 or the 5'-terminal base 5'-terminal to the 5'-terminal. Having PCR primer F1.
3 4. 請求項 3 3記載の P C R用プライマ一 F 1の塩基配列と 7 0 %以上の相同 性を有し、 少なく とも 1 0個の塩基からなる配列を含む P C R用プライマー F 2 (但し、 該 P C R用プライマー F 2が、 配列表の配列番号 1のヌク レオチド番 号 1 3 4 7 6乃至 1 3 4 7 8により コー ドされるシスティン残基を C末端とする 'ポリぺプチドをコードする c DNAを増幅させるための P C Rに用いられ得る）  3 4.A PCR primer F2 having a homology of 70% or more with the nucleotide sequence of the primer F1 for PCR according to claim 33 and containing a sequence consisting of at least 10 bases (provided that The PCR primer F2 encodes a 'polypeptide having a cysteine residue encoded by nucleotide numbers 1347 to 13478 of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing as a C-terminal. c Can be used for PCR to amplify DNA)
3 5. 請求項 3 3記載の P C R用プライマー F 1の塩基配列と 8 0 %以上の相同 性を有し、 少なく とも 1 0個の塩基からなる配列を含む P C R用プライマ一 F 3 (但し、 該 P C R用プライマー F 3力；、 配列表の配列番号 1のヌク レオチド番 号 1 3 4 7 6乃至 1 3 4 7 8によ りコー ドされるシスティン残基を C末端とする ポリペプチドをコードする c D N Aを増幅させるための P C Rに用いられ得る） 3 5.A PCR primer F3 having at least 80% homology with the base sequence of the PCR primer F1 according to claim 33 and containing a sequence consisting of at least 10 bases (provided that The primer F3 for PCR; the cysteine residue encoded by the nucleotide numbers 1347 to 13478 of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing is used as the C-terminus. Can be used for PCR to amplify cDNA encoding polypeptide)
3 6. 請求項 3 3記載の P C R用プライマー F 1の塩基配列と 9 0 %以上の相同 性を有し、 少なく とも 1 0個の塩基からなる配列を含む P C R用プライマー F 4 (但し、 該 P C R用プライマー F 4力；、 配列表の配列番号 1のヌク レオチ ド番 号 1 3 4 7 6乃至 1 3 4 7 8によ り コー ドされるシスティン残基を C末端とする ポリペプチ ドをコードする c D N Aを増幅させるための P C Rに用いられ得る） 3 6.A PCR primer F4 having at least 90% homology with the nucleotide sequence of the PCR primer F1 according to claim 33 and containing a sequence consisting of at least 10 bases (provided that the PCR primer F4: Encodes a polypeptide having a cysteine residue encoded by nucleotide numbers 1347 to 13478 of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing as the C-terminus Can be used for PCR to amplify cDNA)
3 7 . 配列表の配列番号 1において、 ヌク レオチ ド番号 2 4 3 2 1のアデニン又 はそれより 5 ' —側の塩基を 5 ' —末端とする、 少なく とも 1 0個の塩基からな る配列を有する P C R用プライマー G l 。 37. In SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, the nucleotide consists of at least 10 bases, with the adenine at nucleotide number 2432 1 or the 5'-side base 5'-terminal to the 5'-terminal. PCR primer Gl having a sequence.
3 8. 請求項 3 7記載の P C R用プライマー G 1の塩基配列と 7 0 %以上の相同 性を有し、 少なく とも 1 0個の塩基からなる配列を含む P C R用プライマー G 2 (但し、 該 P C R用プライマ一 G 2が、 配列表の配列番号 1のヌク レオチド番 号 2 4 3 2 1乃至 2 4 3 2 3でユードされるメチォニン残基を N末端とするポリ ぺプチドをコ一ドする c D N Aを増幅させるための P C Rに用いられ得る） 。 3 8.A PCR primer G2 having at least 70% homology with the nucleotide sequence of the PCR primer G1 according to claim 37 and containing a sequence consisting of at least 10 bases, provided that The primer G2 for PCR encodes a polypeptide having a methionine residue at the N-terminus, which is used at nucleotide number 2432 21 to 2432 in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. c can be used for PCR to amplify DNA).
3 9. 請求項 3 7記載の P C R用プライマ一 G 1の塩基配列と 8 0 %以上の相同 性を有し、 少なく とも 1 0個の塩基からなる配列を含む P C R用プライマー G 33 9. Primer G3 for PCR having at least 80% homology with the nucleotide sequence of primer G1 for PCR according to claim 37 and containing a sequence consisting of at least 10 bases
(但し、 該 P C R用プライマ一 G 3力；、 配列表の配列番号 1のヌク レオチド番 号 2 4 3 2 1乃至 2 4 3 2 3でコードされるメチォニン残基を N末端とするポリ ペプチドをコードする c D N Aを増幅させるための P C Rに用いられ得る） 。(However, the primer G3 for PCR; a polypeptide having an N-terminal methionine residue encoded by the nucleotide number 2432 21 to 24324 of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing) It can be used for PCR to amplify the encoding cDNA).
4 0. 請求項 3 7記載の P C R用プライマ一 G 1の塩基配列と 9 0 %以上の相同 性を有し、 少なく とも 1 0個の塩基からなる配列を含む P C R用プライマ一 G 440. A primer G4 for PCR having at least 90% homology with the nucleotide sequence of primer G1 for PCR according to claim 37, and comprising a sequence consisting of at least 10 bases.
(但し、 該 P C R用プライマー G 4が、 配列表の配列番号 1のヌク レオチド番 号 2 4 3 2 1乃至 2 4 3 2 3でコ一ドされるメチォニン残基を N末端とするポリ ぺプチドをコードする c D N Aを増幅させるための P C Rに用いられ得る） 。 (However, the primer G4 for PCR is a polypeptide having a methionine residue encoded by the nucleotide number 2432 21 to 243223 of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing as an N-terminal. Can be used for PCR to amplify the cDNA encoding
4 1 . 配列表の配列番号 2において、 ヌク レオチド番号 6 3 1 2のチミン又はそ れよ り 5 ' —側の塩基を 5 ' 一末端とする、 少なく とも 1 0個の塩基からなる配 列を含む P C R用プライマー H 1。 41. In SEQ ID NO: 2 in the sequence listing, a thymine having nucleotide number 6312 or a nucleotide consisting of at least 10 bases with the 5'-terminal base 5 'to the 5'-terminal thereof as one terminal. PCR primer H1 containing the column.
4 2. 請求項 4 1記載の P C R用プライマー H Iの塩基配列と 7 0 %以上の相同 性を有し、 少なく とも 1 0個の塩基からなる配列を含む P C R用プライマ一 H 2 4 2. A primer H2 for PCR having a homology of 70% or more with the nucleotide sequence of the primer HI for PCR according to claim 41 and comprising a sequence consisting of at least 10 bases.
(但し、 該 P C R用プライマー H 2は、 配列表の配列番号 1のヌク レオチド番 号 2 7 8 8 7乃至 2 7 8 8 9でコ一 ドされるアルギニン残基を C末端とするポリ ぺプチドをコ一ドする c DNAを増幅させるための P C Rに用いられ得る） 。 (However, the PCR primer H2 is a polypeptide having a C-terminal arginine residue encoded by the nucleotide numbers 278787 to 27889 of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. Can be used for PCR to amplify cDNA)).
4 3. 請求項 4 1記載の P C R用プライマー H 1の塩基配列と 8 0 %以上の相同 性を有し、 少なく とも 1 0個の塩基からなる配列を含む P C R用プライマ一 H 34 3. A primer H3 for PCR having at least 80% homology with the nucleotide sequence of the primer H1 for PCR according to claim 41 and containing a sequence consisting of at least 10 bases
(但し、 該 P C R用プライマ一 H 3は、 配列表の配列番号 1のヌク レオチド番 号 2 7 8 8 7乃至 2 7 8 8 9でコー ドされるアルギニン残基を C末端とするポリ ペプチドをコー ドする c DNAを増幅させるための P C Rに用いられ得る） 。 (However, the primer H3 for PCR is a polypeptide having a C-terminal arginine residue encoded by nucleotide numbers 278787 to 27889 of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. It can be used for PCR to amplify the coding cDNA).
4 4. 請求項 4 1記載の P C R用プライマ一 H 1の塩基配列と 9 0 %以上の相同 性を有し、 少なく とも 1 0個の塩基からなる配列を含む P C R用プライマー H 44 4. A primer H4 for PCR having at least 90% homology with the nucleotide sequence of the primer H1 for PCR according to claim 41 and comprising a sequence consisting of at least 10 bases
(但し、 該 P C R用プライマ一 H 4は、 配列表の配列番号 1のヌク レオチド番 号 2 7 8 8 7乃至 2 7 8 8 9でコー ドされるアルギニン残基を C末端とするポリ ぺプチドをコ一ドする c DN Aを増幅させるための P C Rに用いられ得る） 。 (However, the primer H4 for PCR is a polypeptide having a C-terminal arginine residue encoded by nucleotide numbers 278787 to 27889 of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. Can be used for PCR to amplify cDNA)).
4 5. 配列表の配列番号 2において、 ヌク レオチド番号 3 5 4 5のアデニン又は それよ り 5 ' —側の塩基を 5 ' —末端とする、 少なく とも 1 0個の塩基からなる 配列を含む P C R用プライマー I 1。 4 5. Includes a sequence consisting of at least 10 bases, with the adenine at nucleotide number 35 45 or the 5'-side base at the 5'-end in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing PCR primer I1.
4 6. 請求項 4 5記載の P C R用プライマー I 1の塩基配列と 7 0 %以上の相同 性を有し、 少なく とも 1 0個の塩基からなる配列を含む P C R用プライマー I 2 46. A primer I 2 for PCR that has a homology of 70% or more with the nucleotide sequence of the primer I 1 for PCR according to claim 45 and contains a sequence consisting of at least 10 bases.
(但し、 該 P C R用プライマー I 2が、 配列表の配列番号 2のヌク レオチド番 号 3 5 4 5乃至 3 5 4 7でコー ドされるメチォニン残基を N末端とするポリぺプ チ ドをコー ドする c D NAを増幅させるための P C Rに用いられ得る） 。 (However, the primer I2 for PCR uses a polypeptide having a methionine residue encoded by nucleotide numbers 3545 to 3547 of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing as an N-terminal. It can be used for PCR to amplify the coding DNA).
4 7. 請求項 4 5記載の P C R用プライマー I 1の塩基配列と 8 0 %以上の相同 性を有し、 少なく とも 1 0個の塩基からなる配列を含む P C R用プライマー I 34 7. A primer I 3 for PCR that has a homology of 80% or more with the nucleotide sequence of the primer I 1 for PCR according to claim 45 and contains a sequence consisting of at least 10 bases
(伹し、 該 P C R用プライマー I 3力 配列表の配列番号 2のヌク レオチド番 号 3 5 4 5乃至 3 5 4 7でコー ドされるメチォニン残基を N末端とするポリぺプ チ ドをコ一 ドする c D N Aを増幅させるための P C Rに用いられ得る） 。 (Primer for PCR I 3) Polypeptide having N-terminal methionine residue encoded by nucleotide numbers 3545 to 3547 of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing Ji de co one sul c DNA can be used in PCR for amplifying a).
4 8. 請求項 4 5記載の P C R用プライマ一 I 1の塩基配列と 9 0 %以上の相同 性を有し、 少なく とも 1 0個の塩基からなる配列を含む P C R用プライマー I 4 (但し、 該 P C R用プライマー I 4力；、 配列表の配列番号 2のヌク レオチド番 号 3 5 4 5乃至 3 5 4 7でコー ドされるメチォニン残基を N末端とするポリぺプ チ ドをコー ドする c D NAを増幅させるための P C Rに用いられ得る） 。  4 8.PCR primer I 4 having a homology of 90% or more with the nucleotide sequence of the primer I 1 for PCR according to claim 45, and containing a sequence consisting of at least 10 bases (provided that The primer I4 for PCR; a polypeptide having the methionine residue encoded by the nucleotide number 3545 to 3547 of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing as an N-terminus; Can be used for PCR to amplify cDNA.)
4 9. 配列表の配列番号 1において、 ヌク レオチド番号 2 8 4 7 2のチミン又は それより 5 ' —側の塩基を 5 ' —末端とする、 少なく とも 1 0個の塩基からなる 配列を含む P C R用プライマー J 1。  4 9. In the sequence listing, SEQ ID NO: 1, including a sequence consisting of at least 10 bases, with the thymine of nucleotide number 2 8 4 7 2 or the 5'-side base 5'-terminal to the 5'-terminal PCR primer J1.
5 0. 請求項 4 9記載の P C R用プライマ一 J 1の塩基配列と 7 0 %以上の相同 性を有し、 少なく とも 1 0個の塩基からなる配列を含む P C R用プライマ一 J 2 50. A primer J2 for PCR having at least 70% homology with the nucleotide sequence of the primer J1 for PCR according to claim 49, and comprising a sequence consisting of at least 10 bases.
(但し、 該 P C R用プライマ一 J 2は、 配列表の配列番号 2のヌク レオチ ド番 号 5 7 2 7乃至 5 7 2 9によ り コードされるァラニン残基を C末端とするポリぺ プチドをコー ドする c D N Aを増幅させるための P C Rに用いられ得る） 。 (However, the PCR primer J2 is a polypeptide having a C-terminal alanine residue encoded by the nucleotide number 5727 to 5729 of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing. Can be used for PCR to amplify cDNA).
5 1. 請求項 4 9記載の P C R用プライマー J 1の塩基配列と 8 0 %以上の相同 性を有し、 少なく とも 1 0個の塩基からなる配列を含む P C R用プライマー J 35 1. PCR primer J 3 having a homology of 80% or more with the nucleotide sequence of primer J 1 for PCR according to claim 49, and containing a sequence consisting of at least 10 bases
(但し、 該 P C R用プライマー J 3は、 配列表の配列番号 2のヌク レオチド番 号 5 7 2 7乃至 5 7 2 9によ り コードされるァラニン残基を C末端とするポリぺ プチドをコ一ドする c DNAを増幅させるための P C Rに用いられ得る） 。 (However, the PCR primer J3 is a polynucleotide having a C-terminal alanine residue encoded by the nucleotide number 5727 to 57229 of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing. Can be used for PCR to amplify the cDNA to be loaded).
5 2. 請求項 4 9記載の P C R用プライマ一 J 1の塩基配列と 9 0 %以上の相同 性を有し、 少なく とも 1 0個の塩基からなる配列を含む P C R用プライマ一 J 45 2. A PCR primer J4 having a homology of 90% or more with the nucleotide sequence of the PCR primer J1 according to claim 49, and comprising a sequence consisting of at least 10 bases.
(但し、 該 P C R用プライマー J 4は、 配列表の配列番号 2のヌク レオチド番 号 5 7 2 7乃至 5 7 2 9によ り コー ドされるァラニン残基を C末端とするポリぺ プチドをコー ドする c DN Aを増幅させるための P C Rに用いられ得る） 。 (However, the PCR primer J4 is a polypeptide having a C-terminal alanine residue encoded by the nucleotide numbers 5727 to 57229 of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing. It can be used for PCR to amplify the coding cDNA).
5 3. 配列表の配列番号 2において、 ヌク レオチド番号 4 0 0のアデニン又はそ れょ り 5 ' —側の塩基を 5 ' —末端とする、 少なく とも 1 0個の塩基からなる配 列を含む P C R用プライマー K 1。 5 3. In SEQ ID No. 2 in the sequence listing, a sequence consisting of at least 10 bases, with adenine at nucleotide number 400 or the 5'-terminal base 5'-terminal to the 5'-terminal. Including PCR primer K1.
5 4. 請求項 5 3記載の P C R用プライマー K 1の塩基配列と 7 0 %以上の相同 性を有し、 少なく とも 1 0個の塩基からなる配列を含む P C R用プライマー K 2 (但し、 該 P C R用プライマ一 K 2力；、 配列表の配列番号 2のヌク レオチド番 号 4 0 0乃至 4 0 2により コー ドされるメチォニン残基を N末端とするポリぺプ チドをコー ドする c DNAを増幅させるための P C Rに用いられ得る） 。 5 4. More than 70% homology with the nucleotide sequence of the PCR primer K1 according to claim 53 PCR primer K2 having a sequence of at least 10 bases (provided that the primer number for PCR is 1 K2; the nucleotide number of 400 to It can be used for PCR to amplify a cDNA encoding a polypeptide having a methionine residue encoded by 402 at the N-terminus).
5 5. 請求項 5 3記載の P C R用プライマー K 1の塩基配列と 8 0 %以上の相同 性を有し、 少なく とも 1 0個の塩基からなる配列を含む P C R用プライマー K 3 (但し、 該 P C R用プライマー K 3力；、 配列表の配列番号 2のヌク レオチド番 号 4 0 0乃至 4 0 2により コー ドされるメチォニン残基を N末端とするポリぺプ チドをコードする c DNAを増幅させるための P C Rに用いられ得る） 。 5 5. A PCR primer K3 having at least 80% homology with the nucleotide sequence of the PCR primer K1 according to claim 53 and containing a sequence consisting of at least 10 bases, provided that PCR primer K3; amplifies cDNA encoding a polypeptide having a methionine residue at the N-terminus encoded by nucleotide numbers 400 to 402 of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing Can be used for PCR).
5 6. 請求項 5 3記載の P C R用プライマー K 1の塩基配列と 9 0 %以上の相同 性を有し、 少なく とも 1 0個の塩基からなる配列を含む P C R用プライマー K 4 (但し、 該 P C R用プライマー K 4力 配列表の配列番号 2のヌク レオチド番 号 4 0 0乃至 4 0 2により コー ドされるメチォニン残基を N末端とするポリぺプ チドをコードする c DNAを増幅させるための P C Rに用いられ得る） 。 5 6.A PCR primer K4 having at least 90% homology with the nucleotide sequence of the PCR primer K1 according to claim 53 and containing a sequence consisting of at least 10 bases, provided that PCR primer K4 force To amplify cDNA encoding a polypeptide having a methionine residue at the N-terminus encoded by nucleotide numbers 400 to 402 of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing Can be used for PCR).
5 7. 配列表の配列番号 1において、 ヌク レオチド番号 3 2 2 8 7のシトシン又 はそれよ り 5 ' —側の塩基を 5 ' —末端とする、 少なく とも 1 0個の塩基からな る配列を含む P C R用プライマ一 L l。 5 7. In SEQ ID NO: 1 of the sequence listing, at least 10 bases, with the 5'-end of the cytosine or 5'-side of the nucleotide number 32 22 7 as the 5'-terminal Primer for PCR containing sequence.
5 8. 請求項 5 7記載の P C R用プライマー L 1の塩基配列と 7 0 %以上の相同 性を有し、 少なく とも 1 0個の塩基からなる配列を含む P C R用プライマー L 2 (但し、 該 P C R用プライマー L 2は、 配列表の配列番号 2のヌク レオチド番 号 1 9 1 2乃至 1 9 1 4によ り コ一ドされるァラニン残基を C末端とするポリべ プチ ドをコー ドする c DNAを増幅させるための P C Rに用いられ得る） 。 58.A PCR primer L2 having at least 70% homology with the nucleotide sequence of the PCR primer L1 according to claim 57 and containing a sequence consisting of at least 10 bases, provided that The PCR primer L2 encodes a polypeptide having a C-terminal alanine residue encoded by nucleotide numbers 1912 to 1914 of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing. Can be used for PCR to amplify cDNA).
5 9. 請求項 5 7記載の P C R用プライマ一 L 1の塩基配列と 8 0 %以上の相同 性を有し、 少なく とも 1 0個の塩基からなる配列を含む P C R用プライマ一 L 35 9. The primer for PCR primer L3 having a homology of 80% or more with the nucleotide sequence of the primer for PCR primer L1 according to claim 57 and comprising a sequence consisting of at least 10 bases
(但し、 該 P C R用プライマー L 3は、 配列表の配列番号 2のヌク レオチド番 号 1 9 1 2乃至 1 9 1 4により コードされるァラニン残基を C末端とするポリべ プチ ドをコー ドする c DN Aを増幅させるための P C Rに用いられ得る） 。(However, the PCR primer L3 is a polypeptide having a C-terminal alanine residue encoded by the nucleotide number 1912 to 1914 of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing. Can be used for PCR to amplify cDNA.)
6 0. 請求項 5 7記載の P C R用プライマー L 1の塩基配列と 9 0 %以上の相同 性を有し、 少なく とも 1 0個の塩基からなる配列を含む P C R用プライマ一 L 4 (但し、 該 P C R用プライマー L 4は、 配列表の配列番号 2のヌク レオチド番 号 1 9 1 2乃至 1 9 1 4によ り コ一ドされるァラニン残基を C末端とするポリぺ プチ ドをコー ドする c DNAを増幅させるための P C Rに用いられ得る） 。 60. 90% or more homology with the nucleotide sequence of the PCR primer L1 according to claim 57 PCR primer L4 containing a sequence consisting of at least 10 bases (provided that the PCR primer L4 has a nucleotide number of 1912 to SEQ ID NO: 2 in the sequence listing). It can be used for PCR to amplify cDNA encoding a polypeptide having the alanine residue encoded by 1914 as the C-terminus).
PCT/JP2000/005420 1999-08-11 2000-08-11 Ml-236b biosynthesis-associated dna WO2001012814A1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AU64758/00A AU6475800A (en) 1999-08-11 2000-08-11 Ml-236b biosynthesis-associated dna

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP11/227696 1999-08-11
JP22769699 1999-08-11

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2001012814A1 true WO2001012814A1 (en) 2001-02-22

Family

ID=16864926

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2000/005420 WO2001012814A1 (en) 1999-08-11 2000-08-11 Ml-236b biosynthesis-associated dna

Country Status (2)

Country Link
AU (1) AU6475800A (en)
WO (1) WO2001012814A1 (en)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1149919A2 (en) * 2000-04-18 2001-10-31 Sankyo Company Limited Genes related to biosynthesis of ML-236B

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995012661A1 (en) * 1993-11-02 1995-05-11 Merck & Co., Inc. Dna encoding triol polyketide synthase

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995012661A1 (en) * 1993-11-02 1995-05-11 Merck & Co., Inc. Dna encoding triol polyketide synthase

Non-Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BECK J. ET AL.: "The multifunctional 6-methylsalicylic acid synthase gene of penicillium patulum", EUR. J. BIOCHEM., vol. 192, no. 2, 1990, pages 487 - 498, XP002934751 *
BROWN D.W. ET AL.: "Twenty-five coregulated transcripts define a sterigmatocytin gene cluster in aspergillus nidulans", PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 93, 1996, pages 1418 - 1422, XP002934749 *
FUJII I. ET AL.: "Structures and functional analysis of fungal polyketide synthase genes", ACTINOMYCETOL., vol. 12, no. 1, 1998, pages 1 - 14, XP002934750 *
FUJII I.: "Polyketide kousei busshitsu seigousei idenshi no cloning", RESEARCH REPORT OF MOCHIDA KINEN ZAIDAN, vol. 5, 1989, pages 256 - 257, XP002934748 *
HENDRICKSON L. ET AL.: "Lovastatin biosynthesis in aspergillus terreus: Characterization of blocked mutants, enzyme activities and a multifunctional polyketide synthesis gene", CHEM. BIOL., vol. 6, no. 7, June 1999 (1999-06-01), pages 429 - 439, XP002934746 *
KENNEDY J. ET AL.: "Modulation of polyketide synthase activity by accessory proteins during lovastatin biosynthesis", SCIENCE, vol. 284, May 1999 (1999-05-01), pages 1368 - 1372, XP002934745 *
SERIZAWA N.: "Development of two-step fermentation-based production of pravastatin, a HMG-CoA reductase", J. SYNTH. ORGAN. CHEM., vol. 55, no. 4, 1997, pages 334 - 338, XP002934747 *
TSUJITA Y. ET AL.: "Discovery and development of hypolipidemic drug, pravastatin sodium", TISS. CULT. RES. COMMUN., vol. 12, no. 4, 1993, pages 279 - 289, XP002934752 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1149919A2 (en) * 2000-04-18 2001-10-31 Sankyo Company Limited Genes related to biosynthesis of ML-236B
EP1149919A3 (en) * 2000-04-18 2002-02-06 Sankyo Company Limited Genes related to biosynthesis of ML-236B
US7056710B2 (en) 2000-04-18 2006-06-06 Sankyo Company, Limited Methods for producing ML-236B, a pravastatin precursor, using a host cell transformed with mlcR, a transcription factor

Also Published As

Publication number Publication date
AU6475800A (en) 2001-03-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101690802B1 (en) Pyripyropene a biosynthetic gene
JP2011515086A (en) NRPS-PKS genes and their manipulation and utility
WO2006126723A1 (en) Genetically modified microorganism and process for production of macrolide compound using the microorganism
US20090011476A1 (en) Gene cluster and method for the biosynthesis of terrequinone a
US20070111293A1 (en) Genes from a gene cluster
JP4668176B2 (en) Triterpene hydroxylase
MX2012013099A (en) Spnk strains.
WO2001012814A1 (en) Ml-236b biosynthesis-associated dna
EP1381685B1 (en) Genes and proteins for the biosynthesis of polyketides
JP3972068B2 (en) Structural genes on gene clusters
CN111378675A (en) Biosynthesis gene of eremophilane sesquiterpene in catharanthus roseus and application
CN105985967B (en) Biological synthesis gene cluster of oosporins and application thereof
KR100808307B1 (en) Novelr-2-hydroxy-3-phenylpropionated-phenyllactate dehydrogenase and gene encoding the same
EP1826267B1 (en) Novel halogenase
JP5954539B2 (en) Method for producing 1-benzyl-4-hydroxy-3-piperidinecarboxylic acid alkyl ester
JP2001112487A (en) Ml-236 biosynthesis-related dna
JP2003116567A (en) Gene cluster
JP2004173537A (en) Biosynthesis gene for kanamycin
CN116656641A (en) Caffeic acid O-methyltransferase mutant and application thereof
EA013412B1 (en) Gene sms 27
JP2003033188A (en) Method for producing avermectin derivative
Temporini et al. The cfp genes (cfp-1 and cfp-2) of Neurospora crassa: a tale of a bunch of filaments, one enzyme, and two genes
JP2007000104A (en) Polyketide synthase gene derived from dinoflagellate

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AU BR CA CN CZ HU ID IL IN KR MX NO NZ PL RU TR US ZA

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AT BE CH CY DE DK ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE

DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
122 Ep: pct application non-entry in european phase