JP2004173537A

JP2004173537A - Biosynthesis gene for kanamycin

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Publication number: JP2004173537A
Application number: JP2002341504A
Authority: JP
Inventors: Koji Yanai; 耕二矢内; Naomi Sumida; 奈緒美隅田; Kaoru Okakura; 薫岡倉; Shigeru Hoshiko; 繁星子; Takeshi Murakami; 健村上
Original assignee: Meiji Seika Kaisha Ltd
Current assignee: Meiji Seika Kaisha Ltd
Priority date: 2002-11-25
Filing date: 2002-11-25
Publication date: 2004-06-24

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To isolate a DNA fragment containing biosynthesis genes for kanamycin, analyze its base sequence and specify each biosynthesis gene. <P>SOLUTION: A genome DNA library is prepared from a genome DNA of Streptomyces kanamyceticus and the DNA fragment containing genes involving biosynthesis of the kanamycin is found from the genome DNA library. Analysis of functions concerning biosynthesis pathway of the kanamycin is carried out by decoding these genes. <P>COPYRIGHT: (C)2004,JPO

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、カナマイシン生合成遺伝子に関する。
【０００２】
【従来の技術】
カナマイシン（Ａ：Ｃ_１８Ｈ_３６Ｎ_４Ｏ_１１、分子量４８４．５０、Ｂ：Ｃ_１８Ｈ_３７Ｎ_５Ｏ_１０、分子量４８３．５２、第１図）は、ストレプトミセス・カナマイセティカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｋａｎａｍｙｃｅｔｉｃｕｓ）が生産するアミノグリコシド系抗生物質である。広範囲な抗菌力を示すが、多くの感染菌が速やかに耐性化する欠点を有しているため、近年は臨床適応が結核症を中心に限られたものとなっている。カナマイシンに対する耐性菌は、各種アセチルトランスフェラーゼ、ホスホトランスフェラーゼ及びヌクレオチジルトランスフェラーゼによってカナマイシン分子の特定のアミノ基やヒドロキシル基を修飾することによってカナマイシンを不活性化する。この耐性機構に関する研究から、ジベカシン、アミカシン及びアルベカシンといったカナマイシン誘導体が合成され、耐性菌のみならず、緑膿菌やＭＲＳＡ（メチシリン耐性黄色ブドウ球菌）に有効な化学療法剤として使用されている。
【０００３】
近年、二次代謝産物の生産性向上や新規活性物質の創出を目的として遺伝子組換えの手法が取り入れられてきており、ポリケチド生合成遺伝子を中心に多くの二次代謝産物生合成に関わる遺伝子が単離されている。アミノグリコシド系抗生物質生合成に関わる遺伝子としては、ストレプトマイシン生合成遺伝子［オオヌキ（Ｏｈｎｕｋｉ，Ｔ．）著，「ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）」，（米国），１９８５年，第１６４巻，ｐ．８５−９４（非特許文献１）］、アストロマイシン生合成遺伝子［ダイリ（Ｄａｉｒｉ，Ｔ．）ら著，「モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティクス（ＭｏｌｅｃｕｌａｒａｎｄＧｅｎｅｒａｌＧｅｎｅｔｉｃｓ），（独国），１９９２年，第２３２巻，ｐ．２６２−２７０（非特許文献２）」、ブチロシン生合成遺伝子［オオタ（Ｏｔａ，Ｙ．）ら著，「ジャーナル・オブ・アンチバイオティックス（ＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ）」，２０００年，第５３巻，ｐ．１１５８−１１６７（非特許文献３）］などが挙げられる。
【０００４】
一方、カナマイシン生合成に関わる遺伝子については、カナマイシン耐性に関わるアセチルトランスフェラーゼや１６ＳｒＲＮＡメチルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡの単離が報告されている［ナカノ（Ｎａｋａｎｏ，Ｍ．）ら著，「ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）」，（米国），１９８４年，第１５７巻，ｐ．７９−８３（非特許文献４）］、［ジョーアンドグー（Ｊｏｅ，Ｙ．Ａ．ａｎｄＧｏｏ，Ｙ．Ｍ．）著，「アーカイブズ・オブ・ファーマカル・リサーチ（ＡｒｃｈｉｖｅｓｏｆＰｈａｒｍａｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈ）」，（韓国），１９９８年，第２１巻，ｐ．４７０−４７４（非特許文献５）］ものの、塩基配列に関しては１６ＳｒＲＮＡメチルトランスフェラーゼ遺伝子（ｋｍｒ）が明らかにされているのみであり、その他の生合成遺伝子に関しては全く不明である。生合成遺伝子を単離できれば、組換えＤＮＡ技術を利用することによって効率的なカナマイシン生産菌の育種が可能となるだけでなく、コンビナトリアルバイオシンセシス技術により有機化学合成では困難であった新規なカナマイシン誘導体を生合成させることができる可能性がある。
【０００５】
【非特許文献１】
オオヌキ（Ｏｈｎｕｋｉ，Ｔ．）著，「ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）」，（米国），１９８５年，第１６４巻，ｐ．８５−９４
【非特許文献２】
ダイリ（Ｄａｉｒｉ，Ｔ．）ら著，「モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティクス（ＭｏｌｅｃｕｌａｒａｎｄＧｅｎｅｒａｌＧｅｎｅｔｉｃｓ），（独国），１９９２年，第２３２巻，ｐ．２６２−２７０
【非特許文献３】
オオタ（Ｏｔａ，Ｙ．）ら著，「ジャーナル・オブ・アンチバイオティックス（ＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ）」，２０００年，第５３巻，ｐ．１１５８−１１６７
【非特許文献４】
ナカノ（Ｎａｋａｎｏ，Ｍ．）ら著，「ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）」，（米国），１９８４年，第１５７巻，ｐ．７９−８３
【非特許文献５】
ジョーアンドグー（Ｊｏｅ，Ｙ．Ａ．ａｎｄＧｏｏ，Ｙ．Ｍ．）著，「アーカイブズ・オブ・ファーマカル・リサーチ（ＡｒｃｈｉｖｅｓｏｆＰｈａｒｍａｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈ）」，（韓国），１９９８年，第２１巻，ｐ．４７０−４７４
【非特許文献６】
カイザー（Ｋｉｅｓｅｒ，Ｔ．）ら著，「プラクティカル・ストレプトマイセス・ジェネティックス（ＰｒａｃｔｉｃａｌＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓＧｅｎｅｔｉｃｓ）」，「ザ・ジョーン・イネス・ファンデーション（ＴｈｅＪｏｈｎＩｎｎｅｓＦｏｕｎｄａｔｉｏｎ）」，（英国），ノルウィック（Ｎｏｒｗｉｃｋ），２０００年，ｐ．１６１−１７１
【非特許文献７】
池田と大村著，蛋白質核酸酵素，１９９８年，第４３巻，ｐ．１２６５−１２７７
【非特許文献８】
カレラスアンドサンティ（Ｃａｒｒｅｒａｓ，Ｃ．Ｗ．ａｎｄＳａｎｔｉ，Ｄ．Ｖ．）著，「カレント・オピニオン・イン・バイオテクノロジー（ＣｕｒｒｅｎｔＯｐｉｎｉｏｎｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」，（英国），１９９８年，第９巻，ｐ．４０３−４１１
【非特許文献９】
ハッチンソン（Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ，Ｃ．Ｒ．）著，「カレント・オピニオン・イン・マイクロバイオロジー（ＣｕｒｒｅｎｔＯｐｉｎｉｏｎｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）」，（英国），１９９８年，第１巻，ｐ．３１９−３２９
【非特許文献１０】
カッツアンドマクダニエル（Ｋａｔｚ，Ｌ．ａｎｄＭｃＤａｎｉｅｌ，Ｒ．）著，「メディシナル・リサーチ・レビューズ（ＭｅｄｉｃｉｎａｌＲｅｓｅａｒｃｈＲｅｖｉｅｗｓ）」，（米国），１９９９年，第１９巻，ｐ．５４３−５５８
【非特許文献１１】
ハッチンソン（Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ，Ｃ．Ｒ．）著，「バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」，（米国），１９９４年，第１２巻，ｐ．３７５−３８０
【非特許文献１２】
サンブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．）ら著，「モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｇ）：ア・ラボラトリー・マニュアル（ａｌａｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎｕａｌ）」，（米国），第２版，コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ），１９８９年
【非特許文献１３】
カイザー（Ｋｉｅｓｅｒ，Ｔ．）ら著，「プラクティカル・ストレプトマイセス・ジェネティックス（ＰｒａｃｔｉｃａｌＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓＧｅｎｅｔｉｃｓ）」，ザ・ジョーン・イネス・ファンデーション（ＴｈｅＪｏｈｎＩｎｎｅｓＦｏｕｎｄａｔｉｏｎ），（英国），ノルウィック（Ｎｏｒｗｉｃｋ），２０００年，ｐ．１６９−１７０
【非特許文献１４】
ビッブ（Ｂｉｂｂ，Ｍ．Ｊ．）ら著，「ジーン（Ｇｅｎｅ）」，（和蘭），１９８４年，第３０巻，ｐ．１５７−１６６
【非特許文献１５】
アルシュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．）ら著，「ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（ＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ）」，（英国），１９９０年，第２１５巻，ｐ．４０３−４１０）
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、カナマイシン生合成遺伝子を含むＤＮＡを単離し、その塩基配列を解析することによって生合成遺伝子を特定することを課題とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を行った結果、カナマイシン生合成遺伝子を含むＤＮＡ断片を単離することに成功するとともに、その塩基配列を解析することによって各生合成遺伝子を特定することに成功した。すなわち本発明は、以下の通りである。
【０００８】
（１）カナマイシンの生合成に関与するポリペプチド少なくとも１種をコードするヌクレオチド配列を含んでなる単離されたポリヌクレオチド。
（２）ポリペプチドが、配列番号２〜１９、および２１〜２５から選択されるアミノ酸配列と実質的に同等なアミノ酸配列を含む上記（１）に記載のポリヌクレオチド。
（３）ポリペプチドが、配列番号２〜１９、および２１〜２５から選択されるアミノ酸配列を含む上記（２）に記載のポリヌクレオチド。
（４）配列番号１の塩基３−５３３、５９９−１７４７、１７６７−２３５４、２３８０−２５９２、３３２２−４４３１、４５２６−５５５７、５６５６−６８９７、６９０３−８０８１、８０８９−９６１５、９７３４−１１０１７、１１０５９−１２２３１、１２２２８−１３３４９、１３３４６−１３５０１、１３４９８−１４７５４、１４７５１−１５５００、１５４９７−１６７５６、１６９１５−１７７７２、１７７９８−１８８５６、１９８９８−２１１４２、２１２０１−２２２０８、２２２４３−２２６４１、２２６６５−２３３３６、および２３５８９−２５３７０から選択されるヌクレオチド配列と厳密な条件下でハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列からなる上記（１）に記載のポリヌクレオチド。
（５）配列番号１の塩基３−５３３、５９９−１７４７、１７６７−２３５４、２３８０−２５９２、３３２２−４４３１、４５２６−５５５７、５６５６−６８９７、６９０３−８０８１、８０８９−９６１５、９７３４−１１０１７、１１０５９−１２２３１、１２２２８−１３３４９、１３３４６−１３５０１、１３４９８−１４７５４、１４７５１−１５５００、１５４９７−１６７５６、１６９１５−１７７７２、１７７９８−１８８５６、１９８９８−２１１４２、２１２０１−２２２０８、２２２４３−２２６４１、２２６６５−２３３３６、および２３５８９−２５３７０から選択されるヌクレオチド配列からなる上記（４）に記載のポリヌクレオチド。
（６）上記（１）〜（５）の何れか一項に記載のポリヌクレオチドを含んでなる組換えベクター。
（７）上記（６）に記載の組換えベクターを含んでなる宿主。
【０００９】
【発明の実施の形態】
カナマイシン生合成遺伝子
本発明のカナマイシン生合成遺伝子がコードするポリペプチドは、配列番号２〜１９、および２１〜２５から選択されるアミノ酸配列及び該アミノ酸配列と実質的に同等なアミノ酸配列からなる。これらのポリペプチドの機能は後述する第２表に記載される通りである。
【００１０】
本発明において「実質的に同等なアミノ酸配列」とは、１つ若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、付加及び挿入による改変を有するが、ポリペプチドの活性に影響を受けないアミノ酸配列を意味する。改変されるアミノ酸残基の数は、好ましくは１〜４０個、より好ましくは１〜数個、さらに好ましくは１〜８個、最も好ましくは１〜４個である。
【００１１】
本発明でいう「活性に影響を与えない改変」の例としては、保存的置換が挙げられる。「保存的置換」とは、ポリペプチドの活性を実質的に変化しないように１若しくは複数個のアミノ酸残基を、別の化学的に類似したアミノ酸残基で置き換えることを意味する。例えば、ある疎水性アミノ酸残基を別の疎水性アミノ酸残基によって置換する場合、ある極性アミノ酸残基を同じ電荷を有する別の極性アミノ酸残基によって置換する場合などが挙げられる。このような置換を行うことができる機能的に類似したアミノ酸は、アミノ酸毎に当該技術分野において公知である。具体例を挙げると、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニン等が挙げられる。極性（中性）アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、システイン等が挙げられる。陽電荷をもつ（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、リジン等が挙げられる。また、負電荷をもつ（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸等が挙げられる。
【００１２】
本発明のカナマイシン生合成遺伝子は、配列番号１の塩基３−５３３、５９９−１７４７、１７６７−２３５４、２３８０−２５９２、３３２２−４４３１、４５２６−５５５７、５６５６−６８９７、６９０３−８０８１、８０８９−９６１５、９７３４−１１０１７、１１０５９−１２２３１、１２２２８−１３３４９、１３３４６−１３５０１、１３４９８−１４７５４、１４７５１−１５５００、１５４９７−１６７５６、１６９１５−１７７７２、１７７９８−１８８５６、１９８９８−２１１４２、２１２０１−２２２０８、２２２４３−２２６４１、２２６６５−２３３３６、および２３５８９−２５３７０から選択されるヌクレオチド配列及び該ヌクレオチド配列と厳密な条件下でハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドであることができる。本発明において「厳密な条件」とは、ハイブリダイゼーション後のメンブレンの洗浄操作を、高温度低塩濃度溶液中で行うことを意味し、例えば、２×ＳＳＣ濃度（１×ＳＳＣ：１５ｍＭクエン酸３ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム）、０．５％ＳＤＳ溶液中で、６０℃、２０分間の洗浄条件を意味する。
【００１３】
カナマイシン生合成遺伝子の取得
本発明のカナマイシン生合成遺伝子は、例えば、以下の方法によりストレプトミセス・カナマイセティカス（ＮＢＲＣ１３４１４）またはその変異株から単離することができる。また、本発明に開示するようにヌクレオチド配列が明らかとなっているため、人工的に化学合成することも可能である。
【００１４】
ストレプトミセス・カナマイセティカスの菌体から、［カイザー（Ｋｉｅｓｅｒ，Ｔ．）ら著，「プラクティカル・ストレプトマイセス・ジェネティックス（ＰｒａｃｔｉｃａｌＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓＧｅｎｅｔｉｃｓ）」，「ザ・ジョーン・イネス・ファンデーション（ＴｈｅＪｏｈｎＩｎｎｅｓＦｏｕｎｄａｔｉｏｎ）」，（英国），ノルウィック（Ｎｏｒｗｉｃｋ），２０００年，ｐ．１６１−１７１（非特許文献６）］に記載の慣行法によりゲノムＤＮＡを抽出する。このゲノムＤＮＡを適当な制限酵素にて消化後、適当なベクターと連結することにより、ストレプトミセス・カナマイセティカスのゲノムＤＮＡライブラリーを作製する。ベクターとしては、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、コスミドベクター、ＢＡＣベクター等、多様なものが使用できる。
【００１５】
次に、本明細書において開示したカナマイシン生合成遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて適当なプローブを作成し、ゲノムＤＮＡライブラリーからハイブリダイゼーションによって所望のカナマイシン生合成遺伝子を含むＤＮＡ断片を単離することができる。また、本明細書において開示したカナマイシン生合成遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて所望の遺伝子を増幅させるためのプライマーを作成し、ストレプトミセス・カナマイセティカスのゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを実施し、増幅したＤＮＡ断片を適当なベクターと連結することにより所望の遺伝子を単離することができる。更に、本発明によるカナマイシン生合成遺伝子は、プラスミドｐＫＭ９及びプラスミドｐＫＭ９５に含まれていることから、これらをＰＣＲの鋳型ＤＮＡとして利用することが可能である。また、これらプラスミドから適当な制限酵素にて所望のＤＮＡ断片を調製することができる。
【００１６】
微生物の寄託
ｐＫＭ９で形質転換された大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）は、平成１４（２００２）年１１月２２日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に寄託された。受託番号は、ＦＥＲＭＰ−１９１１７である。
ｐＫＭ９５で形質転換された大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）は、平成１４（２００２）年１１月２２日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に寄託された。受託番号は、ＦＥＲＭＰ−１９１１８である。
【００１７】
形質転換体
遺伝子組換えにより二次代謝産物の生産性を向上させる方法として、律速反応となっている生合成反応を触媒するポリペプチドをコードする遺伝子の発現増強、生合成遺伝子の発現を制御する遺伝子の発現増強や遺伝子破壊、不必要な二次代謝系の遮断等が挙げられる。よって、生合成遺伝子が特定されれば、適当なベクターに連結し、生産菌に導入することにより、二次代謝産物の生産性を向上させることができる。
【００１８】
一方、遺伝子組換えにより新規活性物質を創出するには、ポリケチド合成酵素のドメイン改変［池田と大村著，蛋白質核酸酵素，１９９８年，第４３巻，ｐ．１２６５−１２７７（非特許文献７）］、［カレラスアンドサンティ（Ｃａｒｒｅｒａｓ，Ｃ．Ｗ．ａｎｄＳａｎｔｉ，Ｄ．Ｖ．）著，「カレント・オピニオン・イン・バイオテクノロジー（ＣｕｒｒｅｎｔＯｐｉｎｉｏｎｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」，（英国），１９９８年，第９巻，ｐ．４０３−４１１（非特許文献８）］、［ハッチンソン（Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ，Ｃ．Ｒ．）著，「カレント・オピニオン・イン・マイクロバイオロジー（ＣｕｒｒｅｎｔＯｐｉｎｉｏｎｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）」，（英国），１９９８年，第１巻，ｐ．３１９−３２９（非特許文献９）］、［カッツアンドマクダニエル（Ｋａｔｚ，Ｌ．ａｎｄＭｃＤａｎｉｅｌ，Ｒ．）著，「メディシナル・リサーチ・レビューズ（ＭｅｄｉｃｉｎａｌＲｅｓｅａｒｃｈＲｅｖｉｅｗｓ）」，（米国），１９９９年，第１９巻，ｐ．５４３−５５８（非特許文献１０）］、生合成遺伝子の破壊、他の生物からの修飾酵素遺伝子の導入［ハッチンソン（Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ，Ｃ．Ｒ．）著，「バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」，（米国），１９９４年，第１２巻，ｐ．３７５−３８０（非特許文献１１）］等が行われている。よって、生合成遺伝子が特定されれば、適当なベクターに連結し、二次代謝産物の生産菌に導入することにより新規活性物質を創出することが可能となる。
【００１９】
従って、本発明によるカナマイシン生合成遺伝子を適当なベクターに連結してストレプトミセス・カナマイセティカス等の宿主に導入し、その発現を増強または抑制すること、または一部の生合成遺伝子について相同組換えを利用して遺伝子破壊を行いその機能を欠損させることにより、カナマイシンの生産性を向上させることができる。また、本発明によるカナマイシン生合成遺伝子を適当なベクターに連結し、カナマイシン以外の二次代謝産物を生産する宿主に導入して発現させること、あるいは生合成遺伝子の一部を遺伝子破壊してカナマイシン非生産株となった菌株を適当な物質を添加した培地で培養することによって新規活性物質を生産させることができる。
【００２０】
相同組換えを利用した遺伝子破壊は慣用の方法に従って実施することができ、遺伝子破壊に用いられるベクターの作成やベクターの宿主への導入は当業者に自明であろう。
【００２１】
遺伝子導入用の組換えベクターは、本発明により提供されるポリヌクレオチドを、例えば、［サンブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．）ら著，「モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｇ）：ア・ラボラトリー・マニュアル（ａｌａｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎｕａｌ）」，（米国），第２版，コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ），１９８９年（非特許文献１２）］に記載の遺伝子組換え技術の慣行法に従って目的に応じて適当な形態に修飾し、ベクターに連結することによって作製することができる。本発明において使用されるベクターは、使用する宿主細胞を勘案しながら、ウイルス、プラスミド、コスミドベクター等から適宜選択することができる。例えば、宿主細胞が大腸菌の場合はλファージ系のバクテリオファージ、ｐＢＲ、ｐＵＣ系のプラスミド、枯草菌の場合はｐＵＢ系のプラスミド、酵母の場合はＹＥｐ、ＹＲｐ、ＹＣｐ、ＹＩｐ系のプラスミドベクターが挙げられる。
【００２２】
また、使用されるプラスミドの内少なくとも１つは、形質転換体を選抜するための選択マーカーを含むのが好ましく、選択マーカーとしては薬剤耐性遺伝子、栄養要求性を相補する遺伝子を使用することができる。その好ましい具体例としては、使用する宿主が細菌の場合は、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子などであり、酵母の場合はトリプトファン生合成遺伝子（ＴＲＰ１）、ウラシル生合成遺伝子（ＵＲＡ３）、ロイシン生合成遺伝子（ＬＥＵ２）などであり、カビの場合はハイグロマイシン耐性遺伝子、ビアラホス耐性遺伝子、ブレオマイシン耐性遺伝子、オーレオバシジン耐性遺伝子などであり、植物の場合にはカナマイシン耐性遺伝子、ビアラホス耐性遺伝子などが挙げられる。
【００２３】
さらに、本発明において利用される発現ベクターとしてのＤＮＡ分子は、各遺伝子の発現に必要なＤＮＡ配列、例えばプロモーター、転写開始信号、リボソーム結合部位、翻訳停止シグナル、転写終結信号などの転写調節信号、翻訳調節信号を有しているのが好ましい。プロモーターとしては、大腸菌においてはラクトースオペロン、トリプトファンオペロンなどのプロモーター、酵母ではアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子、酸性フォスファターゼ遺伝子、ガラクトース資化性遺伝子、グリセロアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子などのプロモーター、カビではα−アミラーゼ遺伝子、グルコアミラーゼ遺伝子、セロビオハイドロラーゼ遺伝子、グリセロアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、ａｂｐ１遺伝子などのプロモーター、植物ではＣａＭＶ３５ＳＲＮＡプロモーター、ＣａＭＶ１９ＳＲＮＡプロモーター、ノパリン合成酵素遺伝子プロモーターが好ましく用いることができるものとして挙げられる。
【００２４】
生合成遺伝子を導入する宿主は、用いるベクターの種類に応じて、放線菌、大腸菌、枯草菌、酵母、糸状菌、植物細胞等の中から適宜選択されて良い。
【００２５】
組換えベクターの宿主への導入方法としては、接合伝達、ファージによる形質導入、更にカルシウムイオン法、リチウムイオン法、エレクトロポレーション法、ＰＥＧ法、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法といった形質転換の方法の中から、供試する宿主細胞に応じて用いれば良い。
【００２６】
本発明において複数の遺伝子を宿主細胞に導入する場合には、各遺伝子は同一または別々のＤＮＡ分子に含まれていても良い。さらに、宿主細胞が細菌である場合には、各遺伝子をポリシストロン性ｍＲＮＡとして発現させるように設計し、１つのＤＮＡ分子とすることも可能である。
【００２７】
得られた組換え体を慣行の方法により、培養し、新たに獲得した性質を調べることができる。培地としては、慣用の成分、例えば炭素源としてはグルコース、シュクロース、水飴、デキストリン、澱粉、グリセロール、糖蜜、動・植物油等が使用できる。また、窒素源としては大豆粉、小麦胚芽、コーン・スティープ・リカー、綿実粕、肉エキス、ポリペプトン、マルトエキス、イーストエキス、硫酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、尿素等が使用できる。その他必要に応じ、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、コバルト、塩素、リン酸（リン酸水素２カリウム等）、硫酸（硫酸マグネシウム等）及びその他のイオンを生成することのできる無機塩類を添加することも有効である。また、必要に応じてチアミン（チアミン塩酸塩等）等の各種ビタミン、グルタミン酸（グルタミン酸ナトリウム等）、アスパラギン（ＤＬ−アスパラギン等）等のアミノ酸、ヌクレオチド等の微量栄養素、抗生物質等の選抜薬剤を添加することもできる。さらに、菌の発育を助け、カナマイシン又カナマイシン以外のアミノグリコシド系化合物の生産を促進するような有機物及び無機物を適当に添加することができる。
【００２８】
培地のｐＨは、例えばｐＨ５．５〜ｐＨ８程度である。培養法としては、好気的条件での固体培養法、振とう培養法、通気撹拌培養法又は深部好気培養法により行うことができるが、特に深部好気培養法が最も適している。培養に適当な温度は、１５℃〜４０℃であるが、多くの場合２２℃〜３０℃付近で生育する。カナマイシン又はカナマイシン以外のアミノグリコシド系化合物の生産は、培地及び培養条件、又は使用した宿主により異なるが、いずれの培養法においても通常２日〜１０日間でその蓄積が最高に達する。培養中のカナマイシン又はカナマイシン以外のアミノグリコシド系化合物の量が最高になった時に培養を停止し、培養物から目的物質を単離、精製する。
【００２９】
培養物からカナマイシン又はカナマイシン以外のアミノグリコシド系化合物を採取するためには、その性状を利用した通常の分離手段、例えば溶剤抽出法、イオン交換樹脂法、吸着又は分配カラムクロマトグラフィー法、ゲル濾過法、透析法、沈殿法、結晶化法等を単独で、又は適宜組み合わせて抽出精製することができる。
【００３０】
カナマイシン又はカナマイシン以外のアミノグリコシド系化合物をさらに精製するには、シリカゲル、アルミナ等の吸着剤、セファデックスＬＨ−２０（ファルマシア社製）、又はトヨパールＨＷ−４０（東ソー社製）等を用いるクロマトグラフィーを行うと良い。
【００３１】
【実施例】
以下に本発明の実施例を示すが、これは単なる一例であって本発明を限定するものではなく、ここに例示しなかった多くの変法あるいは修飾手段のすべてを包括するものである。
【００３２】
実施例１：ゲノムＤＮＡライブラリーの作成
５０ｍｌ分の液体培地（２％可溶性デンプン、１％ポリペプトン、０．３％肉エキス、０．０５％ＫＨ_２ＰＯ_４、ｐＨ７．０）を２５０ｍｌ容の三角フラスコに作製した。この培地に、ストレプトマイセス・カナマイセティカスを植菌し、２８℃、２４時間培養した。培養終了後、遠心により菌体を集め、これらの菌体より［カイザー（Ｋｉｅｓｅｒ，Ｔ．）ら著，「プラクティカル・ストレプトマイセス・ジェネティックス（ＰｒａｃｔｉｃａｌＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓＧｅｎｅｔｉｃｓ）」，ザ・ジョーン・イネス・ファンデーション（ＴｈｅＪｏｈｎＩｎｎｅｓＦｏｕｎｄａｔｉｏｎ），（英国），ノルウィック（Ｎｏｒｗｉｃｋ），２０００年，ｐ．１６９−１７０（非特許文献１３）］に記載の方法で染色体ＤＮＡを調製した。
【００３３】
単離したゲノムＤＮＡを制限酵素Ｓａｕ３ＡＩで部分消化した後、アルカリフォスファターゼ処理を行い、ＤＮＡ末端を脱リン酸化した。このＤＮＡ断片を、予め制限酵素ＸｂａＩで消化しアルカリフォスファターゼ処理によって脱リン酸化した後、更に制限酵素ＢａｍＨＩで消化したコスミドベクターＳｕｐｅｒＣｏｓＩ（ストラタジーン社製）に連結し、組換えコスミドベクターを作製した。この組換えコスミドベクターについて、ストラタジーン社製のＧｉｇａｐａｃｋＩＩＩパッケージングエキストラクトを用いてインビトロパッケージし、大腸菌ＸＬＩ−ＢｌｕｅＭＲＡに感染させることによりゲノムＤＮＡライブラリーを作製した。
【００３４】
実施例２：ゲノムＤＮＡライブラリーのスクリーニング
実施例１で作製したゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングするためのプローブとして、カナマイシン耐性遺伝子（ｋｍｒ）を使用することとし、以下に示すようにＰＣＲによって調製した。
【００３５】
実施例１に示したゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列表の配列番号２６及び２７に記載のオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、ＤＮＡポリメラーゼとしてＫＯＤＤａｓｈ（東洋紡績製）を使用し、ＰＥＲＫＩＮＥＬＭＥＲＧｅｎｅＡｍｐＰＣＲＳｙｓｔｅｍ９７００を用いて行った。反応液は、ゲノムＤＮＡを１μｌ（１μｇ相当量）、酵素に添付の１０倍濃度反応用緩衝液を５μｌ、２ｍＭｄＮＴＰ溶液を５μｌ、１００ｐｍｏｌ／μｌの濃度に調整した上記プライマーを各１μｌずつ、ジメチルスルホキシド（特級、和光純薬製）を５μｌ、ＫＯＤＤａｓｈを１μｌ、滅菌水を３１μｌ加えて５０μｌとした。反応は、９４℃、５分間の前処理後、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で３０秒間のインキュベーションを２５サイクル行った。反応終了後、反応液の一部をアガロースゲル電気泳動に供した結果、約０．８ｋｂｐのＤＮＡ断片が特異的に増幅されている事が確認された。そこで、残りの反応液をフェノール・クロロホルム・イソアミルアルコール（２５・２４・１）で抽出し、エタノール沈殿を行った。沈殿物を滅菌水に再溶解し、アガロースゲル電気泳動を行い、約０．８ｋｂｐのバンドを定法に従って切り出してＤＮＡ断片を回収した。
【００３６】
上記ＤＮＡ断片をプローブにし、ＥＣＬダイレクトＤＮＡ／ＲＮＡラベリング・検出システム（アマシャムファルマシアバイオテク社製）を使用してコロニーハイブリダイゼーションを行い、約１０００個のコロニーをスクリーニングした。その結果、１個の陽性クローンが得られ、本クローンよりプラスミドｐＫＭ９（ＦＥＲＭＰ−１９１１７）を単離した。
【００３７】
実施例３：プラスミドｐＫＭ９５の単離
実施例２で単離したプラスミドｐＫＭ９（ＦＥＲＭＰ−１９１１７）の塩基配列を解析する中で、プラスミドｐＫＭ９（ＦＥＲＭＰ−１９１１７）にはカナマイシン生合成遺伝子が充分含まれていないことが判明したため、クロモソームウォーキングにより別のプラスミドの単離を実施した。
【００３８】
プラスミドｐＫＭ９（ＦＥＲＭＰ−１９１１７）を制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＳｐｈＩで消化し、挿入断片の末端に位置する約１．６ｋｂｐのＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動により調製した。これをプローブとして、実施例１で調製したゲノムＤＮＡの制限酵素ＳｐｈＩ消化物に対してサザン解析を実施した結果、約１０ｋｂｐの位置にハイブリダイズすることが明らかとなった。
【００３９】
次に、ゲノムＤＮＡの制限酵素ＳｐｈＩ消化物をアガロースゲル電気泳動により分画した後、約１０ｋｂｐの大きさのＤＮＡ断片をゲルから回収し、このＤＮＡ断片を予め制限酵素ＳｐｈＩで消化しておいたプラスミドｐＵＣ１１９と連結してサブゲノムＤＮＡライブラリーを作製した。これを上記プローブでスクリーニングし、陽性クローンからプラスミドｐＫＭ９５（ＦＥＲＭＰ−１９１１８）を単離した。
【００４０】
実施例４：プラスミドｐＫＭ９及びｐＫＭ９５の塩基配列の解析
プラスミドｐＫＭ９（ＦＥＲＭＰ−１９１１７）についてはショットガン法、プラスミドｐＫＭ９５（ＦＥＲＭＰ−１９１１８）についてはトランスポゾン法を用い、マルチキャピラリーＤＮＡシーケンサＲＩＳＡ３８４（島津製作所製）を使用してシーケンシングを実施した。得られた結果から、解析が不充分な領域については、解析済みの塩基配列を元に新たなプライマーを設計してシーケンシングを行った。その結果、配列番号１に示す塩基配列が得られた。各プラスミドの位置を第２図に示した。
【００４１】
塩基配列中のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の予測はＦｒａｍｅＰｌｏｔ−２．３［ビッブ（Ｂｉｂｂ，Ｍ．Ｊ．）ら著，「ジーン（Ｇｅｎｅ）」，（和蘭），１９８４年，第３０巻，ｐ．１５７−１６６］（非特許文献１４）］により行い、各ＯＲＦの機能はＢＬＡＳＴ［アルシュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．）ら著，「ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（ＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ）」，（英国），１９９０年，第２１５巻，ｐ．４０３−４１０）（非特許文献１５）］により公共のデータベースを検索し予測した。各ＯＲＦに位置を第１表及び第２図に示した。
【００４２】
【表１】

【００４３】
また、各ＯＲＦの予測される機能を第２表に示した。
【００４４】
【表２】

【００４５】

【００４６】
機能から特定されたカナマイシンの生合成に関わるＯＲＦの有する機能について以下に説明する。ＯＲＦ６、ＯＲＦ８、ＯＲＦ９、ＯＲＦ１０、ＯＲＦ１２、ＯＲＦ１６、ＯＲＦ１８及びＯＲＦ２４は、１位、３位、２’位、６’位及び３”位（第１図）の５ヶ所のアミノ基形成に関わる遺伝子である。このうちＯＲＦ６、ＯＲＦ９、ＯＲＦ１２、ＯＲＦ１８及びＯＲＦ２４は、各糖の水酸基（−ＯＨ）をケト基（＝Ｏ）に変換する酸化還元酵素をコードする遺伝子であり、またＯＲＦ８、ＯＲＦ１０及びＯＲＦ１６はケト基にアミノ基を転移するアミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子である。ＯＲＦ１１はグルコース６リン酸から２−デオキシ−シロ−イノソースの反応を触媒する酵素をコードする遺伝子であり、２−デオキシストレプタミン生合成に関わる遺伝子である。ＯＲＦ１４及び２０は２ヵ所のグリコシド結合形成に関わるグリコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子である。ＯＲＦ１、ＯＲＦ２、ＯＲＦ７及びＯＲＦ１９は、カナマイシンに対する自己耐性に関わる遺伝子であり、ＯＲＦ１は６’位のアミノ基をアセチル化してカナマイシンを不活化するアセチルトランスフェラーゼをコードし、ＯＲＦ２及びＯＲＦ７はカナマイシンを菌体外に排出するトランスポーターをコードし、更にＯＲＦ１９はカナマイシンの標的部位であるｒＲＮＡを修飾するメチルトランスフェラーゼをコードする。ＯＲＦ５は、カナマイシン生合成遺伝子の発現を制御する転写因子をコードする遺伝子である。
【００４７】
【発明の効果】
本発明のカナマイシン生合成遺伝子は、遺伝子組換え技術を利用するカナマイシンの生産性向上及び新規活性物質の創製に有用である。
【００４８】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】第１図は、カナマイシンの化学構造を示す。
【図２】第２図は、決定した塩基配列、決定されたＯＲＦ、プラスミドｐＫＭ９及びプラスミドｐＫＭ９５の位置関係を示す。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a kanamycin biosynthesis gene.
[0002]
[Prior art]
Kanamycin (A: C₁₈H₃₆N₄O₁₁, Molecular weight 484.50, B: C₁₈H₃₇N₅O₁₀, Molecular weight 483.52, FIG. 1) was obtained from Streptomyces kanamyceticas (Streptomyces  kanamyceticus) Is an aminoglycoside antibiotic. Although it shows a wide range of antibacterial activity, it has a drawback that many infectious bacteria quickly become resistant, and thus, in recent years, clinical indications have been limited mainly to tuberculosis. Bacteria resistant to kanamycin inactivate kanamycin by modifying specific amino and hydroxyl groups of the kanamycin molecule with various acetyltransferases, phosphotransferases and nucleotidyltransferases. From studies on this resistance mechanism, kanamycin derivatives such as dibekacin, amikacin and arbekacin have been synthesized and used as chemotherapeutic agents effective not only for resistant bacteria but also for Pseudomonas aeruginosa and MRSA (methicillin-resistant Staphylococcus aureus).
[0003]
In recent years, genetic recombination techniques have been adopted for the purpose of improving the productivity of secondary metabolites and creating new active substances, and many genes involved in secondary metabolite biosynthesis, mainly polyketide biosynthesis genes, have been developed. Has been isolated. Examples of genes involved in aminoglycoside antibiotic biosynthesis include streptomycin biosynthesis genes [Ohnuki, T., "Journal of Bacteriology", (USA), 1985, vol. 164. , P. 85-94 (Non-patent Document 1)], an astromycin biosynthesis gene [Dairi, T., et al., "Molecular and General Genetics, (Germany), 1992." 232: 270-270 (Non-patent Document 2), butyrosine biosynthesis gene [Ota, Y., et al., "Journal of Antibiotics", 2000. 53, p. 1158-1167 (Non-Patent Document 3)].
[0004]
On the other hand, for genes related to kanamycin biosynthesis, isolation of DNAs encoding acetyltransferase and 16S rRNA methyltransferase related to kanamycin resistance has been reported [Nakano, M., et al., Journal of Bacterio. Journal of Bacteriology ", (USA), 1984, vol. 157, p. 79-83 (Non-patent Document 4)], [Joes, YA and Goo, YM], "Archives of Pharmaceutical Research", ( Korea), 1998, Vol. 21, p. 470-474 (Non-Patent Document 5)], but the nucleotide sequence of the 16S rRNA methyltransferase gene (kmr) Is only disclosed, and other biosynthetic genes are completely unknown. If a biosynthetic gene can be isolated, not only can efficient breeding of kanamycin-producing bacteria be achieved by utilizing recombinant DNA technology, but also a novel kanamycin derivative that has been difficult in organic chemical synthesis by combinatorial biosynthesis technology May be biosynthesized.
[0005]
[Non-patent document 1]
Ohnuki, T., "Journal of Bacteriology", (USA), 1985, vol. 164, p. 85-94
[Non-patent document 2]
Dairi, T. et al., "Molecular and General Genetics, (Germany), 1992, Vol. 232, p. 262-270.
[Non-Patent Document 3]
Ota, Y. et al., "Journal of Antibiotics", 2000, vol. 53, p. 1158-1167
[Non-patent document 4]
Nakano, M. et al., "Journal of Bacteriology", (USA), 1984, vol. 157, p. 79-83
[Non-Patent Document 5]
Joe, YA and Goo, YM, "Archives of Pharmaceutical Research", (Korea), 1998, Vol. 21, p. 470-474
[Non-Patent Document 6]
Kieser, T., et al., "Practical Streptomyces Genetics", "The John Innes Foundation", Norwick (UK), Norwick (UK). ), 2000, p. 161-171
[Non-Patent Document 7]
Ikeda and Omura, Protein Nucleic Acid Enzyme, 1998, Vol. 43, p. 1265-1277
[Non-Patent Document 8]
Carreras, CW and Santi, DV, "Current Opinion in Biotechnology", UK, 1998, Vol. 9, p. 403-411
[Non-Patent Document 9]
Hutchinson, CR, "Current Opinion in Microbiology", (UK), 1998, Volume 1, p. 319-329
[Non-Patent Document 10]
Katz, L. and McDaniel, R., "Medical Research Reviews", (USA), 1999, Vol. 19, p. 543-558
[Non-Patent Document 11]
Hutchinson, CR, "Bio / Technology", (USA), 1994, Volume 12, p. 375-380
[Non-Patent Document 12]
Sambrook, J. et al., "Molecular cloning: a laboratory manual", (USA), 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory (Cold Spring Harbor). Laboratory), 1989
[Non-patent document 13]
Kieser, T., et al., "Practical Streptomyces Genetics", The John Innes Foundation, (Norwick, N.W.), The John Innes Foundation. 2000, p. 169-170
[Non-patent document 14]
Bibb, MJ, et al., "Gene", (Japanese orchid), 1984, Vol. 30, p. 157-166
[Non-Patent Document 15]
Altschul, SF, et al., Journal of Molecular Biology, (UK), 1990, Vol. 215, p. 403-410)
[0006]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to isolate a DNA containing a kanamycin biosynthesis gene and analyze the nucleotide sequence to identify the biosynthesis gene.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have conducted intensive studies to solve the above problems, and as a result, succeeded in isolating a DNA fragment containing a kanamycin biosynthetic gene, and analyzing each base sequence by analyzing its base sequence. Successfully identified. That is, the present invention is as follows.
[0008]
(1) An isolated polynucleotide comprising a nucleotide sequence encoding at least one polypeptide involved in kanamycin biosynthesis.
(2) The polynucleotide according to the above (1), wherein the polypeptide comprises an amino acid sequence substantially equivalent to an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 2 to 19 and 21 to 25.
(3) The polynucleotide according to the above (2), wherein the polypeptide comprises an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 2 to 19 and 21 to 25.
(4) bases 3-533, 599-1747, 1767-2354, 2380-2592, 3322-4431, 4526-5557, 5656-6897, 6903-881, 8089-9615, 9734-111017, 11059- of SEQ ID NO: 1 12231, 12228-13349, 13346-13501, 13498-14754, 14751-15500, 15497-16756, 16915-17772, 17798-18856, 19898-21142, 2121-22208, 22243-222641, 22665-23336, and 23589-25370 The polynucleotide according to the above (1), comprising a nucleotide sequence capable of hybridizing under stringent conditions with a nucleotide sequence selected from the group consisting of:
(5) bases 3-533, 599-1747, 1767-2354, 2380-2592, 3322-4431, 4526-5557, 5656-6897, 6903-8081, 8089-9615, 9934-11017, 11059- of SEQ ID NO: 1 12231, 12228-13349, 13346-13501, 13498-14754, 14751-15500, 15497-16756, 16915-17772, 17798-18856, 19898-21142, 2121-22208, 22243-222641, 22665-23336, and 23589-25370 The polynucleotide according to the above (4), which comprises a nucleotide sequence selected from the group consisting of:
(6) A recombinant vector comprising the polynucleotide according to any one of (1) to (5).
(7) A host comprising the recombinant vector according to (6).
[0009]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Kanamycin biosynthesis gene
The polypeptide encoded by the kanamycin biosynthesis gene of the present invention comprises an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 2 to 19 and 21 to 25 and an amino acid sequence substantially equivalent to the amino acid sequence. The functions of these polypeptides are as described in Table 2 below.
[0010]
In the present invention, “substantially equivalent amino acid sequence” means an amino acid sequence which has a modification by substitution, deletion, addition and insertion of one or more amino acids but is not affected by the activity of the polypeptide. I do. The number of amino acid residues to be modified is preferably 1 to 40, more preferably 1 to several, still more preferably 1 to 8, and most preferably 1 to 4.
[0011]
Examples of the “modification that does not affect the activity” in the present invention include conservative substitution. "Conservative substitution" refers to the replacement of one or more amino acid residues with another, chemically similar amino acid residue without substantially altering the activity of the polypeptide. For example, a case where a certain hydrophobic amino acid residue is replaced with another hydrophobic amino acid residue, a case where a certain polar amino acid residue is replaced with another polar amino acid residue having the same charge, and the like can be mentioned. Functionally similar amino acids that can make such substitutions are known in the art for each amino acid. As specific examples, non-polar (hydrophobic) amino acids include alanine, valine, isoleucine, leucine, proline, tryptophan, phenylalanine, methionine and the like. Examples of polar (neutral) amino acids include glycine, serine, threonine, tyrosine, glutamine, asparagine, and cysteine. Examples of (basic) amino acids having a positive charge include arginine, histidine, lysine and the like. Examples of negatively charged (acidic) amino acids include aspartic acid and glutamic acid.
[0012]
The kanamycin biosynthesis gene of the present invention comprises bases 3-533, 599-1747, 1767-2354, 2380-2592, 3322-4431, 4526-5557, 5656-6897, 6903-8081, 8089-9615 of SEQ ID NO: 1. 973-411017, 11059-12231, 12228-13349, 13346-13501, 13498-14754, 14751-15500, 15497-16756, 16915-17772, 17798-18856, 19898-21142, 21201-22208, 22243-222641, 22665 23336 and 23589-25370 and a nucleotide sequence hybridizable therewith under stringent conditions It can be a polynucleotide made. In the present invention, “strict conditions” means that the membrane is washed after hybridization in a high-temperature, low-salt concentration solution, for example, at a 2 × SSC concentration (1 × SSC: 15 mM citric acid 3). Sodium, 150 mM sodium chloride) in a 0.5% SDS solution at 60 ° C. for 20 minutes.
[0013]
Acquisition of kanamycin biosynthesis gene
The kanamycin biosynthesis gene of the present invention can be isolated from, for example, Streptomyces kanamyceticas (NBRC13414) or a mutant thereof by the following method. Further, since the nucleotide sequence is known as disclosed in the present invention, it is also possible to artificially synthesize it chemically.
[0014]
From the cells of Streptomyces kanamyceticas, see [Kieser, T., et al., "Practical Streptomyces Genetics", "The Joan Ines Foundation". John Innes Foundation, "(UK), Norwick, 2000, p. 161-171 (Non-patent Document 6)], and genomic DNA is extracted by the conventional method. This genomic DNA is digested with an appropriate restriction enzyme and then ligated to an appropriate vector to prepare a genomic DNA library of Streptomyces kanamyceticas. As the vector, various vectors such as a plasmid vector, a phage vector, a cosmid vector, and a BAC vector can be used.
[0015]
Next, an appropriate probe is prepared based on the nucleotide sequence of the kanamycin biosynthesis gene disclosed herein, and a DNA fragment containing the desired kanamycin biosynthesis gene is isolated from the genomic DNA library by hybridization. it can. Further, a primer for amplifying a desired gene is prepared based on the nucleotide sequence of the kanamycin biosynthesis gene disclosed in the present specification, PCR is performed using genomic DNA of Streptomyces kanamyceticas as a template, and amplification is performed. The desired gene can be isolated by ligating the obtained DNA fragment to an appropriate vector. Furthermore, since the kanamycin biosynthesis gene according to the present invention is contained in plasmids pKM9 and pKM95, they can be used as template DNA for PCR. Also, a desired DNA fragment can be prepared from these plasmids by using an appropriate restriction enzyme.
[0016]
Microbial deposit
E. coli transformed with pKM9 (Escherichia  coli) Was deposited with the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST) on November 22, 2002 at the Patent Organism Depositary Center (1-1-1, Higashi 1-1, Tsukuba, Ibaraki, Japan 305-8566 Japan) . The accession number is FERM P-19117.
E. coli transformed with pKM95 (Escherichia  coli) Was deposited with the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST) on November 22, 2002 at the Patent Organism Depositary Center (1-1-1, Higashi 1-1, Tsukuba, Ibaraki, Japan 305-8566 Japan) . The accession number is FERM P-19118.
[0017]
Transformant
Methods for improving the productivity of secondary metabolites by genetic recombination include enhancing the expression of genes encoding polypeptides that catalyze the rate-limiting biosynthetic reaction, and expressing genes that regulate the expression of biosynthetic genes Examples include enhancement, gene disruption, and blocking of unnecessary secondary metabolic systems. Therefore, once the biosynthetic gene is specified, it can be linked to an appropriate vector and introduced into a production bacterium, thereby improving the productivity of secondary metabolites.
[0018]
On the other hand, to create a new active substance by genetic recombination, it is necessary to modify the domain of polyketide synthase [Ikeda and Omura, Protein Nucleic Acid Enzyme, 1998, Vol. 43, p. 1265-1277 (Non-Patent Document 7)], [Carreras, CW and Santi, DV], "Current Opinion in Biotechnology", ( (UK), 1998, Vol. 9, p. 403-411 (Non-Patent Document 8)], [Hutchinson, CR], "Current Opinion in Microbiology", (UK), 1998, 1st. Vol., P. 319-329 (Non-Patent Document 9)], [Katz, L. and McDaniel, R.], "Medical Research Reviews", (USA), 1999, Volume 19, p. 543-558 (Non-Patent Document 10)], disruption of biosynthetic genes, introduction of modified enzyme genes from other organisms [Hutchinson, CR, "Bio / Technology", (USA), 1994, Vol. 12, p. 375-380 (Non-Patent Document 11)] and the like. Therefore, if the biosynthetic gene is specified, it will be possible to create a novel active substance by ligating the biosynthetic gene to an appropriate vector and introducing it into a secondary metabolite producing bacterium.
[0019]
Therefore, the kanamycin biosynthesis gene according to the present invention may be ligated to an appropriate vector and introduced into a host such as Streptomyces kanamyceticus to enhance or suppress its expression, or a homologous set of some biosynthesis genes may be used. Kanamycin productivity can be improved by disrupting the gene using recombination and losing its function. Further, the kanamycin biosynthesis gene according to the present invention may be ligated to an appropriate vector and introduced into a host that produces secondary metabolites other than kanamycin for expression. A novel active substance can be produced by culturing the producing strain in a medium to which an appropriate substance has been added.
[0020]
Gene disruption using homologous recombination can be performed according to a conventional method, and preparation of a vector used for gene disruption and introduction of the vector into a host will be obvious to those skilled in the art.
[0021]
The recombinant vector for gene introduction can be prepared by using the polynucleotide provided by the present invention, for example, in [Sambrook, J., et al., "Molecular cloning": a laboratory manual (a laboratory). manual), (USA), 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989 (Non-Patent Document 12)] according to the purpose. It can be prepared by modifying it to an appropriate form and ligating it to a vector. The vector used in the present invention can be appropriately selected from viruses, plasmids, cosmid vectors, and the like, while taking into consideration the host cells used. For example, when the host cell is Escherichia coli, bacteriophage of λ phage system, pBR, pUC plasmid, plasmid of Bacillus subtilis, pUB plasmid, and yeast, YEp, YRp, YCp, YIp plasmid vector are exemplified. Can be
[0022]
In addition, at least one of the plasmids used preferably contains a selection marker for selecting a transformant. As the selection marker, a drug resistance gene or a gene complementary to auxotrophy can be used. . Preferable specific examples thereof include an ampicillin resistance gene, a kanamycin resistance gene, a tetracycline resistance gene when the host used is a bacterium, and a tryptophan biosynthesis gene (TRP1), Uracil biosynthesis gene (URA3), Leucine biosynthesis gene (LEU2), And in the case of mold, a hygromycin resistance gene, a bialaphos resistance gene, a bleomycin resistance gene, an aureobasidin resistance gene and the like, and in the case of a plant, a kanamycin resistance gene, a bialaphos resistance gene and the like.
[0023]
Furthermore, a DNA molecule as an expression vector used in the present invention is a DNA sequence necessary for expression of each gene, for example, a transcription control signal such as a promoter, a transcription initiation signal, a ribosome binding site, a translation termination signal, a transcription termination signal, It preferably has a translation control signal. As a promoter, a lactose operon in Escherichia coli, a promoter such as a tryptophan operon, a yeast such as an alcohol dehydrogenase gene, an acid phosphatase gene, a galactose assimilation gene, a glyceraldehyde triphosphate dehydrogenase gene, etc. Promoters such as glucoamylase gene, cellobiohydrolase gene, glyceraldehyde triphosphate dehydrogenase gene and abp1 gene, and CaMV 35SRNA promoter, CaMV 19SRNA promoter and nopaline synthase gene promoter in plants are preferably used.
[0024]
The host into which the biosynthetic gene is introduced may be appropriately selected from actinomycetes, Escherichia coli, Bacillus subtilis, yeast, filamentous fungi, plant cells, and the like, depending on the type of vector used.
[0025]
Methods for introducing a recombinant vector into a host include conjugative transfer, transduction with phage, and transformation methods such as calcium ion method, lithium ion method, electroporation method, PEG method, Agrobacterium method, and particle gun method. May be used depending on the host cell to be tested.
[0026]
When a plurality of genes are introduced into a host cell in the present invention, each gene may be contained in the same or separate DNA molecules. Further, when the host cell is a bacterium, each gene can be designed to be expressed as polycistronic mRNA, and can be used as one DNA molecule.
[0027]
The obtained recombinant is cultured by a conventional method, and the newly obtained properties can be examined. As the medium, conventional components such as glucose, sucrose, starch syrup, dextrin, starch, glycerol, molasses, animal and vegetable oils, etc. can be used as the carbon source. As the nitrogen source, soybean flour, wheat germ, corn steep liquor, cottonseed meal, meat extract, polypeptone, malt extract, yeast extract, ammonium sulfate, sodium nitrate, urea and the like can be used. In addition, if necessary, add sodium, potassium, calcium, magnesium, cobalt, chlorine, phosphoric acid (dipotassium hydrogen phosphate, etc.), sulfuric acid (magnesium sulfate, etc.) and other inorganic salts capable of generating ions. Is also effective. In addition, if necessary, various vitamins such as thiamine (thiamine hydrochloride), amino acids such as glutamic acid (sodium glutamate), amino acids such as asparagine (DL-asparagine), micronutrients such as nucleotides, and selection drugs such as antibiotics are added. You can also. Further, organic substances and inorganic substances which promote the growth of bacteria and promote the production of kanamycin and aminoglycoside compounds other than kanamycin can be appropriately added.
[0028]
The pH of the medium is, for example, about pH 5.5 to pH 8. The culture method can be a solid culture method under aerobic conditions, a shaking culture method, an aeration stirring culture method, or a deep aerobic culture method. In particular, a deep aerobic culture method is most suitable. Suitable temperatures for cultivation are between 15 ° C and 40 ° C, but often grow around 22 ° C to 30 ° C. The production of kanamycin or an aminoglycoside compound other than kanamycin varies depending on the medium and the culture conditions or the host used, but in any culture method, its accumulation usually reaches its maximum in 2 to 10 days. When the amount of kanamycin or an aminoglycoside compound other than kanamycin in the culture reaches the maximum, the culture is stopped, and the target substance is isolated and purified from the culture.
[0029]
In order to collect kanamycin or an aminoglycoside compound other than kanamycin from a culture, ordinary separation means utilizing its properties, such as a solvent extraction method, an ion exchange resin method, an adsorption or partition column chromatography method, a gel filtration method, Extraction and purification can be performed by a dialysis method, a precipitation method, a crystallization method, or the like alone or in an appropriate combination.
[0030]
In order to further purify kanamycin or an aminoglycoside compound other than kanamycin, chromatography using silica gel, an adsorbent such as alumina, Sephadex LH-20 (manufactured by Pharmacia), or Toyopearl HW-40 (manufactured by Tosoh Corporation) is used. Good to do.
[0031]
【Example】
Examples of the present invention will be described below, but these are merely examples, and do not limit the present invention. The present invention encompasses all of various modifications or modification means not illustrated here.
[0032]
Example 1: Preparation of genomic DNA library
50 ml liquid medium (2% soluble starch, 1% polypeptone, 0.3% meat extract, 0.05% KH₂PO₄, PH 7.0) in a 250 ml Erlenmeyer flask. This medium was inoculated with Streptomyces kanamyceticus and cultured at 28 ° C. for 24 hours. After completion of the culture, the cells were collected by centrifugation, and the cells were collected from the cells [Kieser, T., et al., "Practical Streptomyces Genetics", The Joan Ines. Foundation (The John Innes Foundation), (UK), Norwick, 2000, p. 169-170 (Non-Patent Document 13)] to prepare chromosomal DNA.
[0033]
Restriction enzyme for isolated genomic DNASauAfter partial digestion with 3AI, alkaline phosphatase treatment was performed to dephosphorylate the DNA termini. This DNA fragment was previously digested with a restriction enzyme.XbaAfter digestion with I and dephosphorylation by alkaline phosphatase treatment,BamThe cosmid vector was ligated to cosmid vector SuperCosI (Stratagene) digested with HI to prepare a recombinant cosmid vector. The recombinant cosmid vector was packaged in vitro using Gigapack III packaging extract manufactured by Stratagene, and infected with Escherichia coli XLI-Blue MRA to prepare a genomic DNA library.
[0034]
Example 2: Screening of genomic DNA library
As a probe for screening the genomic DNA library prepared in Example 1, a kanamycin resistance gene (kmr) Was used and was prepared by PCR as shown below.
[0035]
PCR was performed using the genomic DNA shown in Example 1 as a template and the oligonucleotides shown in SEQ ID NOs: 26 and 27 in the sequence listing as primers. PCR was performed using KOD Dash (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) as a DNA polymerase and PERKINELMER GeneAmp PCR System 9700. The reaction solution was 1 μl of genomic DNA (equivalent to 1 μg), 5 μl of a 10-fold concentration reaction buffer attached to the enzyme, 5 μl of 2 mM dNTP solution, and 1 μl of each of the above primers adjusted to a concentration of 100 pmol / μl in dimethyl 5 μl of sulfoxide (special grade, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 1 μl of KOD Dash, and 31 μl of sterilized water were added to make 50 μl. The reaction was pretreated at 94 ° C. for 5 minutes, followed by 25 cycles of incubation at 94 ° C. for 30 seconds, 55 ° C. for 30 seconds, and 72 ° C. for 30 seconds. After completion of the reaction, a part of the reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis. As a result, it was confirmed that a DNA fragment of about 0.8 kbp was specifically amplified. Therefore, the remaining reaction solution was extracted with phenol / chloroform / isoamyl alcohol (25 / 24.1), and ethanol precipitation was performed. The precipitate was redissolved in sterile water, subjected to agarose gel electrophoresis, and a band of about 0.8 kbp was cut out according to a standard method to recover a DNA fragment.
[0036]
Using the above DNA fragment as a probe, colony hybridization was performed using an ECL direct DNA / RNA labeling / detection system (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech) to screen about 1000 colonies. As a result, one positive clone was obtained, and plasmid pKM9 (FERM P-19117) was isolated from this clone.
[0037]
Example 3: Isolation of plasmid pKM95
Analysis of the nucleotide sequence of plasmid pKM9 (FERM P-19117) isolated in Example 2 revealed that plasmid pKM9 (FERM P-19117) did not contain a sufficient amount of the kanamycin biosynthesis gene. Isolation of another plasmid was performed by walking.
[0038]
Plasmid pKM9 (FERM P-19117)EcoRI andSphAfter digestion with I, an approximately 1.6 kbp DNA fragment located at the end of the inserted fragment was prepared by agarose gel electrophoresis. Using this as a probe, the restriction enzyme of the genomic DNA prepared in Example 1SphAs a result of Southern analysis performed on the digested product of I, it was found that it hybridized at about 10 kbp.
[0039]
Next, genomic DNA restriction enzymesSphAfter fractionating the digested product by agarose gel electrophoresis, a DNA fragment of about 10 kbp was recovered from the gel, and this DNA fragment wasSphA subgenomic DNA library was prepared by ligating the plasmid pUC119 digested with I. This was screened with the above probe, and plasmid pKM95 (FERM P-19118) was isolated from a positive clone.
[0040]
Example 4: Analysis of base sequence of plasmids pKM9 and pKM95
Sequencing was performed using the multi-capillary DNA sequencer RISA384 (manufactured by Shimadzu Corporation) using the shotgun method for plasmid pKM9 (FERM P-19117) and the transposon method for plasmid pKM95 (FERM P-19118). From the obtained results, in the region where the analysis was insufficient, new primers were designed based on the analyzed base sequence and sequencing was performed. As a result, the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 was obtained. The position of each plasmid is shown in FIG.
[0041]
The prediction of an open reading frame (ORF) in a nucleotide sequence is described in FramePlot-2.3 [Bibb, MJ. Et al., “Gene”, (Japanese orchid), 1984, Vol. 30, p. 157-166] (Non-patent Document 14)], and the function of each ORF is described in BLAST [Altschul, SF] et al., “Journal of Molecular Biology”, (UK), 1990, Vol. 215, p. 403-410) (Non-Patent Document 15)], and a public database was searched and predicted. The location of each ORF is shown in Table 1 and FIG.
[0042]
[Table 1]

[0043]
Table 2 shows the expected functions of each ORF.
[0044]
[Table 2]

[0045]

[0046]
The functions of the ORF related to the biosynthesis of kanamycin identified from the functions will be described below. ORF6, ORF8, ORF9, ORF10, ORF12, ORF16, ORF18 and ORF24 are genes involved in the formation of five amino groups at the first, third, 2 ′, 6 ′ and 3 ″ positions (FIG. 1). Of these, ORF6, ORF9, ORF12, ORF18 and ORF24 are genes encoding an oxidoreductase that converts the hydroxyl group (-OH) of each sugar into a keto group (= O), and ORF8, ORF10 and ORF16 are ORF11 is a gene encoding an aminotransferase that transfers an amino group to a keto group, and ORF11 is a gene encoding an enzyme that catalyzes the reaction of glucose 6-phosphate to 2-deoxy-siro-inosose.

ORFs

14 and 20 are involved in the formation of two glycosidic bonds. ORF1, ORF2, ORF7 and ORF19 are genes related to self-resistance to kanamycin, and ORF1 encodes an acetyltransferase that inactivates kanamycin by acetylating the amino group at the 6′-position. ORF2 and ORF7 encode a transporter that excretes kanamycin outside the cells, ORF19 encodes a methyltransferase that modifies rRNA that is a target site of kanamycin, and ORF5 controls expression of a kanamycin biosynthesis gene. Is a gene that encodes a transcription factor.
[0047]
【The invention's effect】
INDUSTRIAL APPLICABILITY The kanamycin biosynthesis gene of the present invention is useful for improving the productivity of kanamycin using a gene recombination technique and for creating a novel active substance.
[0048]
[Sequence list]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows the chemical structure of kanamycin.
FIG. 2 shows the determined nucleotide sequence, the determined ORF, the positional relationship between plasmid pKM9 and plasmid pKM95.

Claims

An isolated polynucleotide comprising a nucleotide sequence encoding at least one polypeptide involved in kanamycin biosynthesis.

The polynucleotide according to claim 1, wherein the polypeptide comprises an amino acid sequence substantially equivalent to an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 2 to 19 and 21 to 25.

The polynucleotide according to claim 2, wherein the polypeptide comprises an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 2 to 19 and 21 to 25.

Bases 3-533, 599-1747, 1767-2354, 2380-2592, 3322-4431, 4526-5557, 5656-6897, 6903-8081, 8089-9615, 9734-11017, 11059-12231, 12228 of SEQ ID NO: 1 -13349; 13346-13501; The polynucleotide according to claim 1, comprising a nucleotide sequence capable of hybridizing under stringent conditions with the nucleotide sequence.

Bases 3-533, 599-1747, 1767-2354, 2380-2592, 3322-4431, 4526-5557, 5656-6897, 6903-8081, 8089-9615, 9734-11017, 11059-12231, 12228 of SEQ ID NO: 1 -13349; 13346-13501; The polynucleotide according to claim 4, which comprises a nucleotide sequence.

A recombinant vector comprising the polynucleotide according to claim 1.

A host comprising the recombinant vector according to claim 6.