WO2001008806A1 - Equipement pour l'extraction automatique d'acides nucleiques - Google Patents

Equipement pour l'extraction automatique d'acides nucleiques Download PDF

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WO2001008806A1
WO2001008806A1 PCT/FR2000/002225 FR0002225W WO0108806A1 WO 2001008806 A1 WO2001008806 A1 WO 2001008806A1 FR 0002225 W FR0002225 W FR 0002225W WO 0108806 A1 WO0108806 A1 WO 0108806A1
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equipment
tubes
automatic extraction
biological components
components according
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Inventor
Michel Gazeau
Philippe Lare
Original Assignee
Genomic S.A.
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Links

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B04—CENTRIFUGAL APPARATUS OR MACHINES FOR CARRYING-OUT PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES
    • B04B—CENTRIFUGES
    • B04B5/00—Other centrifuges
    • B04B5/04—Radial chamber apparatus for separating predominantly liquid mixtures, e.g. butyrometers
    • B04B5/0407—Radial chamber apparatus for separating predominantly liquid mixtures, e.g. butyrometers for liquids contained in receptacles
    • B04B5/0414—Radial chamber apparatus for separating predominantly liquid mixtures, e.g. butyrometers for liquids contained in receptacles comprising test tubes
    • B04B5/0421—Radial chamber apparatus for separating predominantly liquid mixtures, e.g. butyrometers for liquids contained in receptacles comprising test tubes pivotably mounted

Definitions

  • the present invention relates to the field of biological analysis, and more particularly the field of equipment for the automatic extraction of biological components from separate biological samples.
  • European patent EP740964 relates to another centrifuge equipment where a blocking means prevents the containers from returning to their equilibrium position.
  • US patent US5178602 relates to centrifuge equipment where the containers are held in the position acquired under the effect of centrifugal force.
  • Patent 09921658 relates to centrifuge equipment where mechanical means oppose tilting under the effect of centrifugal force.
  • the object of the present invention is to provide equipment making it possible to automate an analysis protocol and to carry out simultaneously, without manual intervention, a plurality of extraction from several distinct samples, and to communicate to the tubes a constrained movement. periodic tilting to cause agitation of its contents.
  • An additional aim is to propose an equipment making it possible to carry out a periodic tilting, for the agitation of the tubes, with a variable amplitude.
  • the invention relates in its most general sense to equipment comprising means for causing complete or periodic tilting of the tubes independently of the centrifugal force.
  • the equipment includes means for modifying the angular position of the tubes in the radial plane of the rotor independently of the centrifugal force, and constraining the angular position of these tubes.
  • This characteristic makes it possible to carry out transfers of reagents into the tubes without it being necessary to remove them from the rotor of the centrifuge and to animate the tubes with a periodic movement.
  • the equipment according to the invention comprises at least one movable stop in a radial direction to cause the tilting of the tube placed on the axis of movement of said movable stop.
  • the stop is formed by an inclined plate movable along a radial axis inclined relative to a horizontal axis.
  • the tubes are movable in rotation by approximately 180 ° between a vertical position and an inverted position.
  • the rotor is closed by a cover crossed by nozzles for depositing reagents in at least one tube.
  • the equipment according to the invention comprises an annular receptacle for receiving the liquids spilled by the tubes during their tilting.
  • it comprises a member for actuating the plugs closing the tubes with a view to their plugging or unclogging.
  • the equipment has thermoregulation means.
  • FIG. 1 represents a schematic sectional view of the equipment
  • Figure 2 shows an overview of an alternative embodiment
  • FIG. 3 represents a detailed view of a tube suspended from the rotor, and of its guide mechanism.
  • the equipment according to the invention comprises a centrifuge rotor, supporting pendulum tubes (1).
  • these tubes tilt under the effect of centrifugal force.
  • the tubes can also be inclined independently of the centrifugal force, under the effect of a movable stop (2) driven by a jack or an electric motor and a worm .
  • This movable stop is inclined at an angle of about 60 ° relative to a horizontal plane. It moves along a radial axis (3) inclined at an angle of about 30 ° relative to the vertical. This stop comes into contact with the bottom (4) of the tube (1), and causes its tilting, until a complete overturning.
  • the displacement axis (3) cuts the median axis (5) of the tube offset from the pivot point (6) in order to cause the tube (1) to overturn completely.
  • the movable stop can take the form of a crown rising and falling under the action of an electric motor or a jack.
  • the stop can take the form of a crown which can move vertically as well as horizontally.
  • a collector (7) allows the collection of samples.
  • the tubes or nacelles supporting the tubes may have at their lower end a guide pin which can be positioned in a slot provided on a crown movable in height between a spaced-apart position where the tubes can tilt freely, and a working position in which the pin of each tube is positioned in the slot to ensure oscillation of the tube during rotation of the rotor, and a third position for the complete tilting of the tubes for emptying, in which the crown is in the high position.
  • This ring may have movement movements in horizontal planes to exert on the tubes a tilting of variable amplitude.
  • the slot has a width corresponding substantially to the section of the stud. It forms an annular path, oscillating on either side of a circular line with a pitch corresponding to the spacing of two consecutive tubes or nacelles.
  • the pitch of the oscillations is different from the pitch of the suspended tubes so as to create a tilting of variable amplitude.
  • the equipment can also include a camera intended to acquire an image of a tube for the automatic measurement of the height of levels, of the position of a meniscus or of a zone of separation of two phases, or of verification the presence of a tube at a rotor position.
  • the equipment includes a computer for programming the different stages.
  • an extraction protocol will be described in the following: 50 ml capacity tubes are filled with a maximum of 15 ml of blood;
  • the tubes are then tilted to empty the supernatant
  • a centrifugation is then carried out for 10 minutes at 2000 G at 4 ° C;
  • the tube is then rinsed with the above reagent;
  • the supernatant is resuspended with the same reagent
  • a new centrifugation is carried out for 10 minutes at 400 g or less at 4 ° C; Then heated to 50 ° C until the temperature is balanced;
  • a solution of Proteinase K is added to a final mg / l, preheated to 50 ° C;
  • Precipitation is carried out with ethanol (2 volumes) or with isopropanol (0.6 volumes);
  • Figure 2 shows an overview of an alternative embodiment and Figure 3 shows a detailed view of a tube suspended from the rotor, and its guide mechanism.
  • Figure 2 shows an alternative embodiment where the pendulum tubes (1) are suspended from the arm (10) of a rotor (11).
  • the articulation between the tube (1) and the arm (10) is for example constituted by a pivot (12) oriented in a tangential direction.
  • the tubes (1) can thus tilt in a radial plane relative to the rotor (11).
  • Each tube (1) is provided at its lower part with a stud (13) extending in a direction substantially parallel to the median axis (14) of the tube.
  • This stud (13) forms a guide member able to cooperate with a groove (15) formed in a plate (16). This plate can be fixed in rotation.
  • the axis of rotation (17) of the plate (16) can be offset relative to the axis of rotation (18) of the rotor (11), in order to create an additional relative component.
  • the groove (14) has a width corresponding substantially to the section of the stud, in order to ensure constrained guidance of the stud.
  • the groove (14) may be circular, the plate (16) then being off-center with respect to the axis (18) of the rotor
  • the pins (13) come to engage in the groove (15) of the plate (16).
  • the relative displacement between the rotor (11) and the plate (16) causes a periodic movement of the stud (15) relative to the reference linked to the rotor, and therefore a periodic tilting of the tube in the radial plane. .
  • This constrained angular displacement is independent of the centrifugal force, and produces agitation of the contents of the tube.
  • the periodicity of these rockers ents can be adjusted by the relative speed of rotation of the plate (16) and the rotor (11).
  • the amplitude of these tiltings is defined by the shape of the groove, and by the offset of the plate relative to the axis of the rotor.
  • the plate (16) is movable in translation along the axis (18) of the rotor (11), which also ensures a tilting of all the tubes.

Landscapes

  • Centrifugal Separators (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Sampling And Sample Adjustment (AREA)

Abstract

La présente invention concerne un équipement pour l'extraction automatique de composants biologiques à partir de plusieurs échantillons distincts, comportant un rotor (11) supportant des tubes pendulaires (1), caractérisé en ce qu'il comporte des moyens (13, 15, 16) pour provoquer le basculement des tubes indépendamment de la force centrifuge.

Description

EQUIPEMENT POUR L'EXTRACTION AUTOMATIQUE D'ACIDES NUCLEIQUES .
La présente invention concerne le domaine de l'analyse biologique,, et plus particulièrement le domaine des équipements pour l'extraction automatique de composants biologiques à partir d'échantillons biologiques distincts.
Il est connu de réaliser des équipements comportant un rotor supportant des tubes pendulaires .
De tels équipements de centrifugation permettent de réaliser une des étapes de l'analyse.
Il nécessite de nombreuses manipulations pour l'apport de réactifs, pour le prélèvement ou le lavage, et pour la récupération des échantillons.
On connaît également le brevet US5045047 concernant un équipement de centrifugation pour la séparation du surnageant et du culot d'un échantillon biologique.
Le basculement des tubes est imposé par la force centrifuge, un mécanisme empêchant le retour en position verticale . Le brevet européen EP740964 concerne un autre équipement de centrifugation où un moyen de blocage empêche les récipients de revenir à leur position d'équilibre.
Le brevet américain US5178602 concerne un équipement de centrifugation où les récipients sont maintenus dans la position acquise sous l'effet de la force centrifuge.
Le brevet 09921658 concerne un équipement de centrifugation où un moyen mécanique s'oppose au basculement sous l'effet de la force centrifuge.
D'autres brevets tels que EP838265, EP106398 décrivent des solutions de centrifugation.
L'objet de la présente invention est de proposer un équipement permettant d'automatiser un protocole d'analyse et de réaliser simultanément, sans intervention manuelle, une pluralité d'extraction à partir de plusieurs échantillons distincts, et de communiquer aux tubes un mouvement contraint de basculement périodique pour provoquer une agitation de son contenu. Un but additionnel est de proposer un équipement permettant de réaliser un basculement périodique, pour l'agitation des tubes, avec une amplitude variable. A cet effet, l'invention concerne dans son acception la plus générale un équipement comportant des moyens pour provoquer des basculements complets ou périodiques des tubes indépendamment de la force centrifuge.
L'équipement comporte des moyens pour modifier la position angulaire des tubes dans le plan radial du rotor indépendamment de la force centrifuge, et contraindre la position angulaire de ces tubes.
Cette caractéristique permet de procéder aux transferts de réactifs dans les tubes sans qu'il soit nécessaire de les retirer du rotor de la centrifugeuse et d'animer les tubes avec un mouvement périodique.
Avantageusement, l'équipement selon l'invention comporte au moins une butée mobile selon une direction radiale pour provoquer le basculement du tube placé sur l'axe de déplacement de ladite butée mobile.
Selon une variante de réalisation, la butée est formée par une plaquette inclinée mobile selon un axe radial incliné par rapport à un axe horizontal .
Avantageusement, les tubes sont mobiles en rotation de 180° environ entre une position verticale et une position renversée .
Selon un mode de réalisation particulier, le rotor est fermé par un couvercle traversé par des buses pour déposer des réactifs dans un tube au moins. Selon un mode de réalisation spécifique, l'équipement selon l'invention comporte un réceptacle annulaire pour recevoir les liquides déversés par les tubes lors de leur basculement. Selon une autre variante, il comporte un organe pour 1 ' actionnement des bouchons fermant les tubes en vue de leur bouchage ou débouchage.
De préférence, l'équipement présente des moyens de thermorégulation.
L'invention sera mieux comprise à la lecture de la description qui suit, se référant aux dessins annexés correspondant à un exemple non limitatif de réalisation, où : la figure 1 représente une vue schématique en coupe de 1 ' équipement ; la figure 2 représente une vue d'ensemble d'une variante de réalisation ; la figure 3 représente une vue de détail d'un tube suspendu au rotor, et de son mécanisme de guidage.
L'équipement selon l'invention comporte un rotor de centrifugation, supportant des tubes (1) pendulaires. De façon connue, ces tubes s'inclinent sous l'effet de la force centrifuge. Toutefois, contrairement aux dispositifs de l'art antérieur, les tubes peuvent également être inclinés indépendamment de la force centrifuge, sous l'effet d'une butée mobile (2) entraînée par un vérin ou un moteur électrique et d'une vis sans fin. Cette butée mobile est inclinée d'un angle d'environ 60° par rapport à un plan horizontal. Elle se déplace selon un axe radial (3) incliné d'un angle d'environ 30° par rapport à la vertical. Cette butée vient en contact avec le fond (4) du tube (1) , et provoque son basculement, jusqu'à un renversement complet. L'axe de déplacement (3) coupe l'axe médian (5) du tube en décalage par rapport au point de pivotement (6) afin de provoquer le renversement complet du tube (1) .
La butée mobile peut prendre la forme d'une couronne montant et descendant sous l'action d'un moteur électrique ou d'un vérin. La butée peut prendre la forme d'une couronne mobile verticalement ainsi qu'horizontalement.
Un collecteur (7) permet le recueil des échantillons . Les tubes ou les nacelles supportant les tubes peuvent présenter à leur extrémité inférieure un téton de guidage pouvant se positionner dans une fente prévue sur une couronne mobile en hauteur entre une position écartée où les tubes peuvent basculer librement, et une position de travail dans laquelle le téton de chaque tube est positionné dans la fente pour assurer une oscillation du tube pendant la rotation du rotor, et une troisième position pour le basculement complet des tubes en vue de leur vidage, dans laquelle la couronne est en position haute. Cette couronne peut présenter des mouvements de déplacement dans des plans horizontaux pour exercer sur les tubes un basculement d'amplitude variable.
La fente présente une largeur correspondant sensiblement à la section du téton. Elle forme un chemin annulaire, oscillant de part et d'autre d'une ligne circulaire avec un pas correspondant à 1 ' ecartement de deux tubes ou nacelles consécutifs. Le pas des oscillations est différent du pas des tubes suspendus de façon à créer un basculement d'amplitude variable. Lorsque le téton est positionné dans la fente ondulée, la rotation du rotor, ainsi que la translation éventuelle du disque mobile portant la fente provoque le basculement des tubes de part et d'autre d'une position verticale.
L'équipement peut également comporter une caméra destinée à acquérir une image d'un tube en vue de la mesure automatique de la hauteur de niveaux, de la position d'un ménisque ou d'une zone de séparation de deux phases, ou de vérification de la présence d'un tube à une position du rotor.
L'équipement comporte un calculateur pour la programmation des différentes étapes. A titre d'exemple, un protocole d'extraction sera décrit dans ce qui suit : On remplit des tubes de 50 ml de contenance avec 15 ml de sang au maximum ;
On ajoute du PBS pour atteindre un volume de 40 ml et on mélange ; On procède à une centrifugation pendant 5 minutes à
2000 g en portant la température à 4°C ;
On procède ensuite au basculement des tubes pour vider le surnageant ;
On peut éventuellement répéter les étapes précédentes à partir de l'étape d'ajout de PBS ;
On remplit ensuite à hauteur de 35 ml avec un réactif composé de 9,54g de NH4CL, 0,237 g de NH4HC03 et Qsp 100ml d'eau ;
On laisse incuber pendant 20 minutes à température ambiante ;
On procède ensuite à une centrifugation pendant 10 minutes à 2000 G à 4°C ;
On vide à nouveau le surnageant ;
On procède ensuite au rinçage du tube avec le réactif susvisé ;
On remet le surnageant en suspension avec le même réactif ;
On procède à une nouvelle centrifugation pendant 10 minutes à 400 g ou moins à 4°C ; On chauffe ensuite à 50°C jusqu'à équilibrage de la température ;
On ajoute une solution de Protéinase K à lmg/1 final, préchauffé à 50°C ;
On incube à 50°C pendant 3 ou 4 heures en agitant de temps en temps ;
On précipite à l'éthanol (2 volumes) ou à 1' isopropanol (0,6 volume) ;
On centrifuge à 7000 ou 8000 tours par minutes pendant 15 minutes à 4°C ; On lave à l'éthanol à 70% ; On égoutte et on sèche le culot.
Ces étapes sont toutes réalisées dans l'équipement selon l'invention, sans retirer les tubes du rotor.
La figure 2 représente une vue d'ensemble d'une variante de réalisation et la figure 3 représente une vue de détail d'un tube suspendu au rotor, et de son mécanisme de guidage .
La figure 2 représente une variante de réalisation où les tubes pendulaires (1) sont suspendus au bras (10) d'un rotor (11). L'articulation entre le tube (1) et le bras (10) est par exemple constitué par un pivot (12) orienté selon une direction tangentielle . Les tubes (1) peuvent ainsi basculer dans un plan radial par rapport au rotor (11) .
Chaque tube (1) est muni à sa partie inférieure d'un téton (13) s ' étendant selon une direction sensiblement parallèle à l'axe médian (14) du tube. Ce téton (13) forme un organe de guidage apte à coopérer avec une rainure (15) formée dans un plateau (16). Ce plateau peut être fixe en rotation.
Il peut également être animé d'un mouvement de translation circulaire, résultant d'une rotation excentrée par exemple ou par un guidage par un ensemble de cames . Il peut également être animé d'un mouvement de rotation dans le même sens que le rotor, ou dans un sens opposé. L'axe de rotation (17) du plateau (16) peut être décalé par rapport à l'axe de rotation (18) du rotor (11), afin de créer une composante relative supplémentaire. La rainure (14) présente une largeur correspondant sensiblement à la section du téton, afin d'assurer un guidage contraint du téton.
La rainure (14) peut être circulaire, le plateau (16) étant alors décentré par rapport à l'axe (18) du rotor
(11) . Elle peut également présenter la forme d'une courbe fermée dont le rayon varie périodiquement, par exemple de façon sensiblement sinusoïdale.
Lorsque les tubes (1) sont mis en place sur le rotor, les tétons (13) viennent s'engager dans la rainure (15) du plateau (16) . Lorsque le rotor entre en rotation, le déplacement relatif entre le rotor (11) et le plateau (16) provoque un mouvement périodique du téton (15) par rapport au repère lié au rotor, et donc un basculement périodique du tube dans le plan radial. Ce déplacement angulaire contraint est indépendant de la force centrifuge, et produit une agitation du contenu du tube. La périodicité de ces bascule ents peut être réglé par la vitesse de rotation relative du plateau (16) et du rotor (11). L'amplitude de ces basculements est définie par la forme de la rainure, et par le décalage du plateau par rapport à l'axe du rotor. Le plateau (16) est mobile en translation selon l'axe (18) du rotor (11), ce qui permet d'assurer en outre un basculement de l'ensemble des tubes.

Claims

REVENDICATIONS
1 - Equipement pour 1 ' extraction automatique de composants biologiques [notamment d'acides nucléiques] à partir de plusieurs échantillons distincts, comportant un rotor supportant des tubes pendulaires (1) , caractérisé en ce qu'il comporte des moyens pour modifier la position angulaire des tubes dans le plan radial du rotor indépendamment de la force centrifuge.
2 - Equipement pour l'extraction automatique de composants biologiques selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il comporte au moins une butée mobile pour provoquer le basculement du tube placé sur l'axe de déplacement de ladite butée mobile.
3 - Equipement pour l'extraction automatique de composants biologiques selon la revendication 2 caractérisé en ce que la butée est formé par une plaquette inclinée mobile selon un axe radial incliné par rapport à un axe horizontal.
4 - Equipement pour l'extraction automatique de composants biologiques selon la revendication 2 caractérisé en ce que la butée est formée par une couronne mobile venant en contact avec les tubes ou nacelles.
5 - Equipement pour l'extraction automatique de composants biologiques selon la revendication 1 caractérisé en ce que les tubes ou nacelles supportant les tubes présentent à leur surface inférieure un téton pouvant se positionner dans une fente prévue sur un plateau mobile, afin de provoquer un basculement oscillant des tubes.
6 - Equipement pour l'extraction automatique de composants biologiques selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que les tubes ou nacelles supportant les tubes sont mobiles en rotation de 180° environ entre une position verticale et une position renversée .
7 - Equipement pour l'extraction automatique de composants biologiques selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que le rotor est fermé par un couvercle traversé par des buses pour déposer des réactifs dans un tube au moins.
8 - Equipement pour l'extraction automatique de composants biologiques selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce qu'il comporte un réceptacle annulaire pour recevoir les liquides déversés par les tubes lors de leur basculement.
9 - Equipement pour 1 ' extraction automatique de composants biologiques selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce qu'il comporte un organe pour 1 ' actionnement des bouchons fermant les tubes en vue de leur bouchage ou débouchage .
10 - Equipement pour l'extraction automatique de composants biologiques selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce qu'il présente des moyens de thermorégulation.
11 - Equipement pour l'extraction automatique de composants biologiques selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce qu'il comporte une caméra pour l'acquisition d'une image d'un tube. 12 - Equipement pour l'extraction automatique de composants biologiques selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que chaque tube (1) ou nacelle supportant un tube est muni à sa partie inférieure d'un téton (13) formant un organe de guidage apte à coopérer avec une rainure (15) formée dans un plateau (16).
13 - Equipement pour l'extraction automatique de composants biologiques selon la revendication 12, caractérisé en ce que le centre de déplacement (17) du plateau (16) est décalé par rapport à l'axe de rotation (18) du rotor (11).
14 - Equipement pour l'extraction automatique de composants biologiques selon la revendication 12 ou 13, caractérisé en ce que la rainure (14) présente la forme d'une courbe fermée dont le rayon varie périodiquement, par exemple de façon sensiblement sinusoïdale.
15 - Equipement pour l'extraction automatique de composants biologiques selon la revendication 12, 13 ou 14, caractérisé en ce que le plateau (16) est mobile en translation selon l'axe (18) du rotor (11).
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