WO2000073791A1 - Remedies for kidney diseases and method for screening the same - Google Patents

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Hiromi Hase
Akiko Honda
Takeshi Sugaya
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Definitions

  • the present invention relates to a method for screening and identifying a therapeutic agent for renal disease.
  • it relates to a screening method and an identification method focusing on the expression of a fatty acid binding protein, and to a cell line established from kidney (proximal tubule) cells.
  • Kidney diseases such as nephritis have complex and diverse pathologies, but when they become chronic, glomerulosclerosis and interstitial iteration occur, and may lead to a serious course of renal failure . Therefore, accurate treatment at an early stage is desired, but at present there are very few effective therapeutic agents.
  • Steroids one of the few therapeutic drugs, have clear effects, but have the problem of very strong side effects, and there has been a strong demand for new and superior therapeutic drugs.
  • FABP fatty acid binding protein
  • FABP includes liver type (L-FABP), intestinal type (I-FABP), myocardial type (H-FABP), brain type (B-FABP), skin type (CF AB P / EF AB P), fat At least seven molecular species are known, including cell type (aP2) and peripheral nerve cell type (myelin P2). These all have fatty acid binding ability and are considered to be families evolved from common ancestral genes.
  • L-FABP liver type
  • I-FABP intestinal type
  • H-FABP myocardial type
  • B-FABP brain type
  • CF AB P / EF AB P skin type
  • CF AB P / EF AB P fat
  • FABP includes liver type (L-FABP), intestinal type (I-FABP), myocardial type (H-FABP), brain type (B-FABP), skin type (CF AB P / EF AB P), fat At least seven molecular species are known, including cell type (aP2) and peripheral nerve cell type (myelin P2).
  • H-FABP myocardial type
  • H—FAB P is mainly distributed in the distal tubule.
  • K—FAB P is synthesized by the liver after ⁇ 2 ⁇ -glopurin synthesized in the liver is excreted from the blood into the urine via the kidneys and then partially reabsorbed into tubular cells and processed inside the cells. Is considered to be converted to renal-type FAB ⁇ following the treatment of cysteine (Kimura et al., FEBS Letters, Vol. 246, pp. 101-104, 1989).
  • the present invention is a method for screening or identifying a therapeutic or prophylactic agent for renal disease, characterized by assaying the effect of a test substance on the expression of fatty acid binding protein (FABP) in animal cells. Further, it is a therapeutic or prophylactic agent for renal disease selected or identified by such a method. Also, kidney cells Or a drug having an action to enhance the expression of FAB P in a tissue or tissue (such as a compound having an agonistic effect of peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR)) as an active ingredient, It is a prophylactic drug. Further, the present invention is a novel mouse proximal tubular epithelial cell line useful for the screening method or the identification method.
  • FABP fatty acid binding protein
  • kidney tissues and cells are exposed to various stresses such as severe proteinuria and ischemia.
  • the therapeutic or prophylactic agent for renal disease selected or identified by the method of the present invention that is, a drug that enhances the expression of FABP, protects kidney cells or tissues. Its mode of action is based on the fact that FABP in kidney tissues and cells (particularly tubular cells) protects against stress such as severe proteinuria and ischemia.
  • severe proteinuria has recently been regarded as a risk factor in itself, not just an indicator of kidney damage (Kees-Folts et al., Kidney International, Vol. 45, pp. 1697-1709, 1994; Eddy Et al., Journal of the American Society of Nephrology, Vol. 5, pp.
  • albumin which is the main component of proteinuria
  • Fatty acid bound to urine protein is likely to be reabsorbed from the brush border membrane of proximal tubular epithelial cells, bind to intracellular FABP, and be transported to mitochondria and peroxisomes].
  • fatty acids do not undergo normal j3 oxidation, and as a result, the production of lipid factors (nephrotoxic factors) that activate macrophages is induced, and so on. It will progress the conversion of stroma to ml by immunological mechanisms.
  • by increasing the expression of FABP in proximal tubular epithelial cells normalization of fatty acid metabolism and suppression of the production of renal impaired lipidic factors improve the disease state. It is thought to get.
  • FIG. 1 is an electron micrograph showing the morphology of mouse proximal tubular epithelial cell line No. 13 (37-13).
  • Figure 2 shows the hormonal response of mouse proximal tubular epithelial cell lines (Nos. 10, 13, 14, 15, 16, and 19) (induction of intracellular cAMP production when stimulated with PTH and AVP). It is a figure showing the result of measurement.
  • FIG. 3 shows the results of measuring the BSA uptake ability of mouse proximal tubular epithelial cell lines (Nos. 13 and 16).
  • FIG. 4 is a diagram showing the results of measuring the L_FABP expression enhancing effect of a test substance by a reporter assay using a mouse proximal tubular epithelial cell line.
  • FIG. 5 shows the effect of L-FABP expression suppression on cell injury in a hypoxia-reoxygenation model (in vitro renal ischemia-reperfusion model).
  • L-FAPP antisense was used for transient transfection of L-FAPP antisense RNA expression vector from porcine proximal tubule-derived LLC-PK1 cells. The same cells that were transiently transfused are represented.
  • Figure 6 shows the effect of forced expression of L-FABP on cell injury in a hypoxia-reoxygenation model (in vitro renal ischemia-reperfusion model).
  • FIG. 5 shows the effect of L-FABP expression suppression on cell injury in a hypoxia-reoxygenation model (in vitro renal ischemia-reperfusion model).
  • FIG. 7 shows the results of examining the effects of a drug (MCC-555) on proteinuria and NAG excretion in a kidney disease model (adreamycin-induced glomerulosclerosis model) mouse.
  • FIG. 8 shows the effect of a drug (MCC-555) on blood biochemical parameters (blood cholesterol and albumin levels) in a kidney disease model (adreamycin-induced glomerulosclerosis model) mouse.
  • FIG. 9 shows the effect of the drug (MCC-555) on proteinuria and NAG excretion in a renal disease model (adreamycin-induced glomerulosclerosis model) using transgenic mice transfected with the human L-FAB P gene.
  • FIG. 4 is a diagram showing the result of examining the above.
  • the diseases targeted by the present invention include diabetic nephropathy, glomerulonephritis, nephrotic syndrome, focal glomerulosclerosis, immune complex nephropathy (IgA nephropathy) , Membranous nephropathy), renal diseases such as lupus nephritis, drug-induced nephropathy and renal failure.
  • the present invention is applied not only to human diseases, but also to mammals such as monkeys, dogs, cats, pigs, pigs, sheep, sheep, goats, rabbits, rats, and mice. In mammals such as humans (other than rodents), kidney cells or tissues express LFABP and H—FABP.
  • L-FABP is distributed in the proximal tubule
  • H-FABP is mainly distributed in the distal tubule.
  • FABP in kidney cells or tissues, especially on FABP in proximal tubular cells (ie, L-FABP in humans, etc.). it is conceivable that.
  • the screening method and the identification method of the therapeutic agent for renal disease according to the present invention can be carried out in the following modes. That is, by culturing animal cells (such as mammalian cells or tissues) in the presence of the test substance, and comparing the expression level of FABP in the cells with that in the absence of the test substance, the test substance The effect of enhancing the expression of FABP may be determined. Alternatively, the test substance may be administered to an animal individual, and the FABP expression-enhancing effect of the test substance may be assayed by comparing the expression of FABP in kidney tissues and cells with that of the non-administration.
  • animal cells such as mammalian cells or tissues
  • the test substance is determined to have a potentiating effect according to the degree, and the effect as a therapeutic drug for renal disease can be expected .
  • a test substance having a strong FABP expression enhancing action as a candidate, a therapeutic agent for renal disease can be suitably screened.
  • the mechanism of action as a therapeutic agent for renal disease is clarified, and excellent characterization as a therapeutic agent It can be performed.
  • Examples of a method for detecting the expression of FABP include a method for measuring the expression of a gene by a reporter assay using a reporter protein as an index. Gene expression can also be detected at the mRNA level. Alternatively, the expression of FABP in the cell extract can be directly detected at the protein level.
  • a DNA construct consisting of a transcriptional regulatory region of the FABP gene and a reporter gene linked downstream thereof is prepared, and the DNA construct is prepared in an appropriate animal cell. To be introduced. The cells are After culturing in the presence and absence of personally, the expression level may be quantified and measured by measuring the activity of the reporter protein in the cell extract.
  • Genbank / EMBL accession number M10050 Rat chromosomal gene (Sweetser et al., Journal of Biological Chemistry, Vol. 261, Vol. 5553-5561, 1986) Sequence information such as Genbank / EMBL accession number M13501) is known.
  • primers and probes are designed based on the above sequence information, and the PCR method, colony hybridization method, plaque hybridization method, etc. are used. It can be obtained from an appropriate DNA library in appropriate combination.
  • the reporter structure and the reporter plasmid containing it are prepared by a conventional gene recombination technique using the transcription regulatory region located in the 5 'upstream region of the chromosomal gene of FABP and an appropriate reporter gene. can do.
  • the reporter gene is not particularly limited, but it is preferable to use a gene of an enzyme which is stable and whose activity can be easily measured quantitatively.
  • reporter genes include the galactosidase gene (1 ac Z), the chloramphenic acid acetyltransferase gene (CAT) derived from a bacterial transposon, and the luciferase gene (Luc) derived from firefly. .
  • RNA is extracted from cells or tissues, and PCR (Polymerase chain reaction method) (rpCR Protocols J Innis MA, Gel fad DH, Sninsky JJ and White TJ eds., Academic Press, Sandiego, 1990), RNase protection assay method (Nucleic Acid Research Vol. 12, pp. 7035-7056, 1984), or Northern blot analysis
  • PCR Polymerase chain reaction method
  • RNase protection assay method Nucleic Acid Research Vol. 12, pp. 7035-7056, 1984
  • Northern blot analysis The mRNA transcribed from the FABP gene may be detected and quantified using a method or the like.
  • an anti-FABP antibody n etc. can be used immunochemical methods using (EL I SA method, immunohistochemical staining method).
  • Antibodies can be prepared by a conventional method using purified FABP as an immunizing antigen.
  • EL I SA method immunohistochemical staining method.
  • Antibodies can be prepared by a conventional method using purified FABP as an immunizing antigen.
  • FABP adenosine-derived protein
  • cDNA may be isolated based on the known gene sequence information and prepared and used by gene recombination technology.
  • the cell be an animal cell (such as a mammalian cell).
  • an animal cell such as a mammalian cell.
  • cells derived from animal kidney are preferred, tubular cells are more preferred, and proximal tubular epithelial cells are particularly preferred.
  • primary cultured cells or immortalized cells may be used.
  • Use of immortalized cells (cell lines) is advantageous in that culturing and handling are easy.
  • kidney-derived cells As cells derived from human kidney, cells falling in urine (particularly, proximal tubular epithelial cells) can be separated from human urine samples and used.
  • the use of human kidney-derived cells is advantageous in that the effects in humans can be more reliably predicted.
  • Known cell lines derived from tubules include, for example, MDCK (ATCC CRL 6253), a cell line derived from canine tubule (distal tubule), and porcine tubule (proximal tubule). Derived cell line, such as LLC-PK1 (ATCC CRL1392).
  • the inventors of the present invention such as the mouse cell line mPro X 37-13, used a mouse near the mouse in Example 2 to be described later.
  • Immortalized cell lines established from renal tubular cells. These cell lines have the following properties (1), (2) and (3). (1) It has an epithelial cell morphology.
  • LLC-PK1 is considered to be derived from the proximal tubule and is an epithelial cell, but has a hormone-responsive characteristic of proximal tubule cells in vivo (3 ) (See Example 2 below).
  • the cell lines established by the present inventors are cell lines that clearly maintain the characteristics of proximal tubular epithelial cells, including hormone responsiveness. The system becomes closer to the physiological environment in the living body. The use of such cells is advantageous for effective screening and identification of renal disease drugs.
  • the therapeutic and preventive effects can be further confirmed in a known disease state model (in vivo or in vitro) of renal disease.
  • Examples of such an in vitro disease state model include a model for producing renal impaired lipids (inflammatory lipids) using tubular cells (Kees-Folts et al., Kidney International, Vol. 45, pp. 1697-1709, 1994). And the like.
  • In vivo disease models include an accelerated anti-GBM nephritis model (Nagai et al., Jpn. J. Pharmacol., Vol. 32, pp. 1171-1124, 1982) and an S S-induced diabetic nephropathy model. (Sharma et al., Diabetes., Vol. 45, pp.
  • Drugs having FABP expression enhancing activity include, for example, peroxisome proiiferator-activated receptor (PPAR) agonists, carnitine palmitoyltransferase
  • PPAR peroxisome proiiferator-activated receptor
  • CPT cystethione-transferase
  • a peroxisome proliferator response element is found upstream of the FABP gene. This confirms that the PPARagonist has an activity of enhancing FABP expression.
  • P PAR agonists examples include known P PAR agonists (Lehmann et al., Journal of Biological Chemistry, Vol. 270, Vol. 12953-12956, 1995; Willson et al., Journal of Medicinal Chemistry, Vol. 39, Vol. 665-668. P. 1996) and the methods described in the literature (WO 99/1 0532; WO 96/33724; WO 9
  • MCC-555 chemical name: 5- [6- (2-fluorobenzyloxy) naphthalen-2-ylmethylJtniazoliame-2, 4-dione; EP 604 983) is an agonist of PPAR (PP ARy). It can be used particularly preferably.
  • CPT inhibitors examples include known CPT inhibitors (Current
  • 4-THA chemical name: 2-hydroxy-3-propyl- 4-[6- (tetrazol-5-y ⁇ ) hexyloxy] acetophenone; Biochem J. Vol. 252, pp. 409-414, 1988
  • 4-THA chemical name: 2-hydroxy-3-propyl- 4-[6- (tetrazol-5-y ⁇ ) hexyloxy] acetophenone; Biochem J. Vol. 252, pp. 409-414, 1988
  • PPARagonist II CPT inhibitors are known as therapeutic agents for diabetes. It has also been reported that diabetic-induced kidney disease symptoms are improved in a diabetic condition model (Buckingham et al., Diabetes, Vol. 47, pp. 1326-1334, 1998). This is based on the improvement of the underlying disease, diabetes. There is no information or suggestion to apply PPAR agonists or CPT inhibitors to renal diseases not caused by diabetes. On the other hand, the therapeutic or prophylactic agent of the present invention is suitably applied to renal diseases other than renal diseases caused by diabetes (eg, diabetic nephropathy).
  • a test substance when a test substance, a drug having a FABP expression enhancing action, a PPAR agonist, an inhibitor of CPT, or the like is administered to an animal individual or a human, any of oral, intravenous, intramuscular, subcutaneous, etc.
  • a form may be used. It can be formulated as necessary together with an inert carrier according to the dosage form and used.
  • the dose varies depending on the method of administration, the age and weight of the individual, the degree of the disease, etc., but is usually 1-3 mg / kg per day for oral administration and 0 mg / kg for parenteral administration. Set in the range of 01 to 5 OmgZkg.
  • the medicament (therapeutic agent or prophylactic agent) of the present invention exerts an in vivo drug effect based on the FABP expression enhancing action (or PPAR agonist action or CPT inhibitory action).
  • the medicament of the present invention does not include a drug which does not have an action of enhancing FABP expression (or a PPAR agonist action or an inhibitory action of CPT) having sufficient strength to exert a drug effect in vivo. Also, it does not include drugs that exert a drug effect in vivo based on other major actions other than the FABP expression enhancing action (or PPAR agonist action or CPT inhibitory action).
  • the pharmaceuticals of the present invention do not include those which cannot be used for the treatment or prevention of diseases due to toxicity or unfavorable characteristics in pharmacokinetics.
  • the DNA fragment (approximately 420 base pairs) obtained by PCR contained the entire translation region of human L-FAB Pc DNA. This fragment was ligated to the appropriate plasmid.
  • Fragment containing human FABP cDNA obtained in (1) above (about 420 base pairs, BamH
  • the human L-FAPP chromosomal gene was cloned from the human chromosomal DNA library (Clontech, Cat # HL1006d L0T # 19412) by the plaque hybridization method. One Jung. The resulting clone contained an approximately 20 kb insert. Partial nucleotide sequencing revealed that this fragment contained the entire translation region of human L-FABP.
  • a fragment (about 5360 bp, Sail-K ⁇ I fragment) containing the 5 ′ upstream region was cut out of this inserted fragment, and incorporated into Vector Plasmid for use in the following experiments.
  • the nucleotide sequence of the fragment containing the 5 'upstream region (SalI-KpnI fragment) is shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing below.
  • the L-FAPP gene fragment (about 5360 base pairs, Sa1I-KpnI fragment) obtained in the previous section (2) was used as type III, and the NspV recognition site (5 ' A region from the 4670th base of SEQ ID NO: 1 to about 100 bases downstream (immediately before the start codon) was amplified to obtain a fragment (about 100 bp).
  • the resulting plasmid was digested with NspV and KpnI. Digestion deleted the portion downstream from the NspV recognition site.
  • the fragment obtained by the above PCR was ligated with this to obtain plasmid pUC18-925.
  • This plasmid is then digested with Sa1I and KpnI and the resulting fragment (About 4760 base pairs) was inserted into a vector plasmid pGV-B (manufactured by Toyo Ink) to obtain a plasmid for reporter assembly.
  • the inserted fragment contains the nucleotide sequence corresponding to the 1st to 4760th positions (immediately before the start codon) of SEQ ID NO: 1, and a Kpnl recognition sequence (6 base pairs) is added to its 3 'end.
  • the resulting L-FAB ⁇ reporter plasmid is composed of a reporter in which the luciferase gene (excluding the promoter region) is linked downstream of the 5 'upstream region containing the transcriptional regulatory region of the human L-FAB ⁇ gene. Having.
  • Nephrons were isolated from mouse kidneys by microdissection as follows. The mouse was anesthetized with pentobarbital and then laparotomy was performed, and 20 ml of a cold Hanks' buffered solution (HBS) containing 0.1% BSA was perfused from the abdominal aorta. Then, 10 ml of cold HBS containing 0.1% BSA and 0.1% collagenase type 1 were perfused. 5% of these perfusate
  • HBS Hanks' buffered solution
  • kidney was excised and sliced with a thickness of 0.5 to: 1.0 mm using a surgical blade (Surgical Brade). This was immersed in 10 ml of 0.1% collagenase solution (in HBS), treated with the enzyme at 37 ° C for 10 minutes, and then washed twice with HBS. A single segment (nephron) was isolated while observing this sliced piece with a stereoscopic microscope in an ice-cooled state.
  • a single segment was prepared using K1 medium (50:50 DMEM / Ham's F-12, 15 mM Hepes, 13.4 mM sodium bicarbonate 5 ⁇ g / m1 insulin, 5 ⁇ g / After washing twice with m 1 transferrin ⁇ 5 ng / m 1 selenous acid, 0.05 // M hydrocortisone, 10 ng / m 1 epidermal growth factor), the cells were seeded on a 96-well plate and cultured in the same medium. The next day, the addition of feeder cells (Feeder layer) (2.
  • Tubular epithelial cells were cultured in the same manner as in (2) above.
  • the plasmid containing the SV40 Large T antigen gene and the neomycin resistance gene (a commercially available plasmid containing the neomycin resistance gene p GEM3 S Ra neo inserted the SV40 Large T antigen gene into the plasmid) C) transfection.
  • Transfection was performed by culturing cells at 37 ° C. for 1 to 3 hours in a medium to which a mixture of plasmid and transphenatam (Air Brown; cationic ribosome) was added.
  • the cells were cultured for 2 to 3 days, treated with trypsin-EDTA to detach the cells, and subcultured into a 48-well plate. At that time, a new supporting cell was added to the feeder (about 1 X 1 C ⁇ cellsZwell). One or two days after the passage, the plasmid was transfused again. Thereafter, the above operation was repeated while expanding the culture scale to obtain immortalized cells.
  • the obtained immortalized cells were cultured in a K1 medium containing 10% fetal calf serum in a culture vessel coated with 0.1% gelatin without using feeder cells. went.
  • Example 1 The immortalized cells obtained in (3) above were cultured overnight. Then, the Example 1 was made adjusted by a human L one FABP reporter plus Mi de (18 mu g), a plasmid containing a Haiguromaishi down resistance gene (p PUR, Clontech, Inc., Cat # 6 1 ⁇ 6-1) (1.8 / / g) and transfection was performed. Transfection was performed using transfection as in the previous section (3).
  • hygromycin 100 / zg / m1
  • the cells were cultured in a medium (Kl medium containing 10% fetal bovine serum). After passage once after 6 days of culture, the cells were further cultured for 10 days, and the resulting hygromycin-resistant colonies were collected under a microscope, inoculated into a 96-well plate, and cultured. Thus, several transformed cell lines (No. 10 to No. 19) into which the plasmid was introduced were obtained.
  • FIG. 1 shows an electron micrograph of the cell line No. 13. It is known that renal tubular epithelial cells show specific responsiveness to various hormones in each segment and induce intracellular cAMP production. For example, proximal tubule cells respond only to parathyroid hormone (PTH) and no response to vasopressin (AVP). On the other hand, collecting ducts and Hen 1e snares respond to AVP.
  • PTH parathyroid hormone
  • AVP vasopressin
  • LLC-PK1 ATCC CRL 1392
  • a known proximal tubular epithelial cell line was examined in the same manner as described above.
  • the ratio of cAMP production to hormonal stimulation was 1: 0.7: 7.4 in the control: PTH stimulation: AVP stimulation, and was found to respond to AVP without responding to PTH. . That is, unlike the cell line No. 13, LLC-PK1 did not have the characteristics of proximal tubule cells in terms of hormone responsiveness.
  • albumin uptake ability of cell lines No. 13 and No. 16 was examined in accordance with the method described in Reference Example 1 (5) below.
  • the proximal tubule is a segment responsible for the reabsorption of proteins contained in the filtrate filtered by the glomerulus, and the proximal tubule cells are known to have the ability to take up albumin and other substances that are present in large amounts in plasma. Have been.
  • both cell lines showed albumin uptake ability.
  • cell line No. 13 showed about 5 times higher albumin uptake capacity than the control, and this indicates that cell line No. 13 has proximal tubular cells also in terms of albumin uptake capacity. It was found that the characteristics as well were maintained.
  • cell line No. 13 is a mouse proximal tubular epithelial cell line and a cell line into which L-FABP reporter plasmid has been introduced.
  • Southern blot analysis was performed as follows.
  • a 4.3 Kb fragment was obtained by cutting the chromosomal DNA with the restriction enzyme Ap a-Kpn I. Should occur.
  • Chromosomal DNA was prepared from cells of cell line No. 13, treated with restriction enzymes Apa and Kp ⁇ I, and then subjected to agarose gel electrophoresis. After transferring the DNA from the gel after the electrophoresis to a nylon membrane (Hyband N + membrane, Amershaml earth), the membrane was washed with 2 XSSC and dried. After pre-hybridization treatment of the membrane, the membrane is hybridized in a hybridization buffer containing probe at 65 ° C.
  • cell line No. 13 has a DNA structure derived from the L-FABP reporter plasmid (a structure comprising the human L-FABP gene transcription regulatory region and the luciferase gene) inserted into its chromosome. It was considered.
  • mProx 37- 13 This cell line No. 13 (hereinafter referred to as mProx 37- 13) was deposited as described above under the cell line name "mouse cell line mPro X 37- 13" (Receiving Deposit number: FE RM BP—7038, Date of change to international deposit: February 21, 2000).
  • the proximal tubular epithelial cell line mPro X37-13 (also referred to as cell line No13) containing the L-FABP reporter-DNA construct obtained in Example 2 was used.
  • the L-FABP expression enhancing effect of the test substance was measured by the reporter assay as described below.
  • the cell line mProx 37-13 was dispensed into a 96-well flat bottom plate at 5 ⁇ 10 4 cells / 100 ⁇ l well and cultured.
  • the medium was 100% fetal serum serum, penicillin (100 units / m1) and streptomycin (100 / ZZm Dulbecco's MEM (high glucose; DMEM) (Gibco) supplemented with 1) was used.
  • the cells were washed once with a serum-free medium, and then a serum-free medium containing a test substance was added. As a control, no test substance was added. After further culturing, the luciferase activity was measured 2 to 10 hours later.
  • Luciferase activity was measured as follows. After washing the cells with phosphate buffered saline (PBS), add 20 ⁇ l of cell lysate (cultured cell lysate LC) 3-51, manufactured by Toyo Ink Co., Ltd., and leave at room temperature for 20 minutes. Stored overnight at 80 ° C. ⁇ After returning the plate stored at 80 ° C. to room temperature, 1 ⁇ l of a luminescent substrate solution (Pitka Gene Luminescence Kit, manufactured by Toyo Ink) was added to start the reaction. The luminescence was measured using a luminometer (MicroLumat LP98P, BERTHOLD
  • peroxisome proliferator-activated receptor As a test substance, peroxisome proliferator-activated receptor
  • MCC-555 (chemical name: 5- [6- (2-fluorobenzyloxy) naphthalen_2-yl-methyl] thiazolidine-2, 4-dione; EP 604 983) and etomoxinole (chemical name: ethyl 2- [6- ( 4-chlorophenoxy) hexyl] -oxiranecarboxylate; EP 465 90 and Current Pharmaceutical Design, Vol. 4, pp. 1-15, 1998) were synthesized according to the method described in the literature.
  • Example 4 Assay for enhancing L-FABP expression in proximal tubular epithelial cells
  • the pig tubule cell line LLC-PK1 or Example 2 described above was used.
  • the mice were transfected into immortalized tubular epithelial cells obtained in the same manner as in (3) to obtain stable transformed cells.
  • the chromosomal gene for human L-FABP was integrated on the chromosome without deletion.
  • the L-FABP expression enhancing effect of the test drug was examined at the mRNA and protein levels as follows. After culturing the cells to confluence, replace the medium with serum-free DMEM medium to a final concentration of 1 zM. The test drug was added to the medium so as to be cultured at 37 ° C. In the control, no test drug was added.
  • the measurement at the mRNA level was performed as follows. After the culture, the cells were collected and total RNA was prepared. RT-PCR using the obtained total RNA as type II
  • ABP mRNA was detected.
  • mRNA of GAPDH (Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) was detected using the same RT-PCR as a control. After the obtained PCR product was subjected to agarose gel electrophoresis, each band was detected by staining with ethidium bromide, and the expression level was determined by densitometry or visual observation. As a result, when MCC-555 was added as a test drug, the induction of L-FAB P mRNA was observed from 15 minutes to 24 hours after the culture.
  • the measurement at the protein level was performed as follows. The cells after culturing were collected and disrupted by ultrasonic waves, and then a cell extract was prepared. The amount of L-FABP in the extract was measured by the western blotting method using an anti-human L-FABP antibody or the ELISA 'method. As a result, the addition of MCC-555 as a test drug was found to enhance the expression of L-FABP protein. Similarly, when etomoxil was added as a test drug, an effect of enhancing the expression of L-FABP protein was also observed.
  • Example 5 Assay of L-FABP expression enhancing action in human urinary falling cells
  • Tubular epithelial cells (hereinafter referred to as urinary falling cells) falling from the kidney tissue into the urine were separated from the human urine sample as described below and used for culture.
  • urine samples were collected by boys with nephritis (0 to 3 years old) or by the clean-catch method. Then, this urine sample was centrifuged at room temperature (1000 rpm, 10 minutes), the supernatant was discarded, and the pellet was reduced to 10%.
  • V Z V Dulbecco's medium containing fetal serum
  • the plate was washed twice with modified Eagle's medium) and once with the culture medium.
  • Culture media include Dulbecco's Ignore medium and Ham's F-12 medium (Ham, sF-1). 2 medium) in 1: 1 mixture, fetal calf serum (10% vZv), insulin (5 ⁇ g / m 1), transferrin (5 ⁇ g / m 1), sodium selenite (sodium selenite) (5 ng / m 1), dexamethasone (1 0- 8 M), was added nicotinamidine de (5 mM), penicillin (1 00 1 UZm 1) and streptomycin (l OO / zg / ml) Was used.
  • the pellet was suspended in a culture medium, diluted appropriately, and then cultured in a 3.5 cm-diameter dish (Falcon) coated with type 4 collagen. Cultivation was performed at 5% CO 2 at 37 ° C.
  • the medium is replaced with Dulbecco's Eagle's medium (containing no serum) containing the test drug to a final concentration of ⁇ .
  • the cells were cultured at 37 ° C.
  • MCC-555 PPARagonist
  • 4-THA 4-hydroxy-3-propyl-4- [6- (tetrazol-5-yl) hexyloxy] -acetophenone
  • CPT inhibitor 4-THA (2-hydroxy-3-propyl-4- [6- (tetrazol-5-yl) hexyloxy] -acetophenone)
  • RNA DNA sequence complementary metal-oxide-semiconductor
  • RT-PCR Reverse transcriptase-Polymerase chain reaction
  • mRNA of rBAT related to b0 , + system amino acid transporter; Purroy et al., Genomics ⁇ Vol. 37, Vol. 249-252, 1996) was used as a control.
  • RT Detected by PCR.
  • porcine L-FAB Pc DNA was cloned by RT-PCR, and pRCZ
  • p L FAB P — p RCZCMV was transfected with lipofectamine (manufactured by GIBCO).
  • lipofectamine manufactured by GIBCO
  • pRC / CMV lipofectamine
  • the degree of cytotoxicity was measured using LDH (lactic dehydrogenase) leaked into the medium as an index. That is, after the exposure to hypoxia, the medium was collected, and the LDH activity in the medium was measured using a measurement kit “LDH-Cytotoxicity Test II” (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).
  • L-FABP antisense RNA expression ie, L-FABP expression
  • L-FABP expression increased cytotoxicity during hypoxia / reoxygenation, resulting in renal vascular damage to proximal tubular cells.
  • L-FABP was thought to play a role in protecting cells.
  • Example 6 the effect of forced expression of L-FABP on cell injury was examined using a hypoxia / reoxygenation model using proximal tubular cells (in vitro renal ischemia / reperfusion model).
  • Example 1 A mouse containing the human L-FABP chromosomal gene (full length) isolated in Example 1 (2) was linearized and then obtained in the same manner as in Example 2 (3). Transfection into proximal tubular cells (clone 24) yielded stable transformed cells (clone 24-19). In this cell, the chromosomal gene of human L-FABP was integrated on the chromosome without deletion.
  • Clone 24-19 obtained above and clone 24 as a control cell were each exposed to hypoxia for 24 hours in an anaerobic chamber (COY). Further, the cells were returned to the normal atmosphere and reoxygenated for 24 hours, and then the degree of cytotoxicity was measured. The degree of cytotoxicity was measured using LDH (lactic dehydrogenas) leaked into the medium as an index.
  • COY an anaerobic chamber
  • Adriamycin-induced glomerulosclerosis mice were used as a kidney disease model.
  • the effect of the PPAR agonist MCC-555 on the drug was confirmed as follows.
  • Adriamycin (AD) -induced glomerulosclerosis mice exhibit nephrotic symptoms, develop focal glomerulosclerosis at 3 weeks, and irreversibly lead to chronic renal failure (Chen et al. Nron hron, Vol. 78, pp. 440-452, 1998). Further, as shown in Examples 3, 4 and 5, MCC-555 is a compound that has been confirmed to have an L-FABP gene expression enhancing effect.
  • mice used 7-week-old female BALBZc (purchased from Nippon Charls River).
  • adriamycin manufactured by Sigma
  • the normal group received only the same volume of physiological saline intravenously.
  • mice were orally administered either MCC-555 or vehicle alone for 14 days (from day 0 to day 13) from the start of the experiment.
  • the first dose was administered one hour before the administration of adriamycin, and the volume of each solution was 10 m1 kg.
  • FIG. 7 shows the result of the blood biochemical test on the 14th day.
  • FIG. 8 shows the result of the blood biochemical test on the 14th day.
  • the control group symptoms of hypercholesterolemia and hypoalbuminemia, which are the main symptoms of nephrosis, were observed. In contrast, these symptoms were improved in the drug-administered group.
  • MCC-555 suppresses NAG excretion, which is an indicator of proximal tubule injury, in renal disease model mice (adreamycin-induced glomerulosclerosis model), as well as the main symptoms of nephrosis. Proteinuria and blood biochemical parameters. Furthermore, examination of the renal histology confirmed that MCC-555 also suppressed histological changes in the kidney of the model mouse.
  • hFABP-Tg mice Transgenic mice into which human L-FABP gene was introduced were prepared.
  • a renal disease model according to Example 8 was prepared as described below, and the action of MCC-555 was confirmed.
  • h F ABP-T g mice were prepared using BCF 1 male mice 13 weeks or older for infertile and natural mating, and ICR female mice 10 weeks or older for embryo transfer and foster care.
  • BDF 1 male mice 13 weeks or older were used for mating, and BCF 1 female mice 8 weeks or older were used for egg collection.
  • the transgenic mice (B6C3F1 strain) obtained in this way were returned to BALB / c mice and crossed.
  • a renal disease model (adriamycin-induced glomerulosclerosis model) was prepared and the action of the drug (MCC-555) was confirmed.
  • Preparation of the disease model and confirmation of the action of the drug were conducted in accordance with Example 8 described above.
  • the dose of adriamycin (AD) administered on the day of the experiment was 15 mg / kg (15 ml 1 Zkg dissolved in physiological saline at a concentration of 1 mg Zm 1). .
  • Reference Example 1 Isolation of primary tubular epithelial cells by density gradient centrifugation and primary culture
  • kidney cortical cells were isolated from mouse kidney as follows.
  • HBS Hank's buffered solution
  • This cell suspension was overlaid on 30 ⁇ 1 ⁇ 2—50% protein (Perco 11) overlay solution, and then centrifuged (3500 rpm, 4 ° C., 30 minutes). After centrifugation, the cells in each layer (four layers of fractions 1 to 4 from the top) separated in the Percoll density gradient were carefully collected.
  • Alkaline phosphatase is known to be located in the proximal tubule in the kidney. Therefore, a part of the cells in each layer collected in the above (1) was collected and subjected to alkaline phosphatase staining as follows. That is, the cell suspension was centrifuged, fixed on a preparation, stained using an alkaline phosphatase substrate kit (Funacocine :), and then encapsulated with glycerol. As a result, in fraction 1 of the uppermost layer, The alkaline phosphatase positive rate was the highest, and therefore, the content of proximal tubular cells was considered to be the highest.
  • the cells of fraction 1 in (1) above were treated with collagenase as follows, and then subjected to primary culture. That is, the collected cells were washed once with HBS, and 1 ml of a collagenase solution (collagenase type 4, 2 mg ml, in HBS) was added thereto, followed by enzyme treatment at 37 ° C for 5 minutes. After further washing twice with HBS, the cells were cultured. It is generally known that the primary culture of epithelial cells is contaminated with fibroblasts, and it is necessary to suppress the proliferation of blast cells and selectively grow only epithelial cells.
  • a collagenase solution collagenase type 4, 2 mg ml, in HBS
  • MEM / D-Va1 medium a medium in which L-valine was replaced with D-valine in MEM medium; Gibco
  • MEM / D-Va1 medium a medium in which L-valine was replaced with D-valine in MEM medium; Gibco
  • a serum-free K1 medium 50:50
  • a hormone and a growth factor for specifically growing epithelial cells, and free of factors involved in fibroblast proliferation.
  • cells are 10 ° /. ⁇ ⁇ In MEM / D—Va1 medium containing fetal serum: After culturing for ⁇ 2 days and confirming cell adhesion and proliferation, the medium was replaced with serum-free K1 medium, and culturing was continued for about another week. Cells were seeded in plates Koten grayed in advance 0.1% gelatin and cultured in co 2 incubator within one.
  • an anti-albumin antibody (Egret polyclonal antibody, manufactured by Sigma) was used as the primary antibody, and a biotin-labeled anti-albumin antibody was used as the secondary antibody.
  • the primary antibody is adsorbed to a 96-well immunoplate, the above cell extract ( ⁇ ⁇ 1 ⁇ well) is added and reacted at room temperature for 2 hours. Then, a secondary antibody diluent is added, and Allowed to react for hours. After washing the wells, color development was detected using a detection kit (Vector Laboratories, Vectorstin ABC-PO kit) containing streptavidin and biotin-labeled sabiperoxidase.
  • a detection kit Vector Laboratories, Vectorstin ABC-PO kit
  • Proximal tubular cells are known to induce intracellular cAMP production in response to parathyroid hormone (PTH) but not to vasopressin (AVP).
  • PTH parathyroid hormone
  • AVP vasopressin
  • the cell surface was washed twice with a medium (MEMZD-Va1 medium). Thereto, the PTH (10 “7 M) or A VP (1 U / m 1 ), I BMX; was added Caro with (3-isobutyl-1-Mechirukisa Nchin c AMP phosphodiesterase inhibitors) (10_ 4 M) Medium As a control, a medium to which only IBMX was added was added.
  • cAMP in the cells and culture medium was extracted with 65% ethanol, and the amount of cAMP was determined by ELISA (using the cAMP EIA system kit from Amersham). It was measured.
  • the amount of intracellular cAMP was found to be about 1.6 times that of the control, confirming that the primary culture contained proximal tubular cells. .
  • the cAMP level was about 4.6 times that of the control, indicating that some cells not derived from proximal tubular cells were also contaminated.
  • hypoxia inducible factor HIr binding-site
  • a novel therapeutic and / or prophylactic agent for renal disease can be screened accurately and efficiently.
  • the therapeutic agent and Z or the prophylactic agent identified or characterized by the method of the present invention are excellent therapeutic agents for renal diseases having a clear mechanism of action.
  • Z or prophylactic are excellent therapeutic agents for renal diseases having a clear mechanism of action.
  • the novel cell line of the present invention maintains the physiological characteristics of proximal tubular epithelial cells well, and is useful for research and development of therapeutic agents for renal diseases and the like.

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Description

明 細 書 腎疾患治療薬およびそのスクリーニング方法 技術分野
本発明は、 腎疾患治療薬のスクリーニング方法おょぴ同定方法に関する。 特に, 脂肪酸結合蛋白質の発現に着目したスクリーニング方法および同定方法に関する また、 腎臓 （近位尿細管） の細胞から樹立した細胞株に関する。
背景技術
腎炎などの腎臓疾患は、 複雑で多様な病態を呈するが、 いずれも慢性化すると、 糸球体硬化や間質の it化などが起こり、 さらには腎不全にいたる重篤な経過を たどることがある。 このため早い段階での的確な治療が望まれるが、 現状では有 効な治療薬は極めて少ない。 また、 数少ない治療薬の一つであるステロイド系薬 物は、 明確な効果が認められる反面、 副作用が非常に強いという問題があり、 新 しい優れた治療薬が強く求められていた。
一方、 脂肪酸結合蛋白質 （FABP： fatty acid binding protein) は、 サイ トゾルに存在し、 脂肪酸と結合する能力を有する分子量約 1 5キロダルトン前後 の蛋白質群である。 脂肪酸を細胞内に転送したり蓄積することによって代謝酵素 系の調節に関与していると考えられているが、 これまで、 FABPと腎疾患との 関連性については何ら知られてはいなかった。
FABPとしては、 肝型 (L-FABP) 、 腸型 （I— FABP) 、 心筋型 (H-FAB P) 、 脳型 （B— FABP) 、 皮膚型 (C-F AB P/E-F AB P) 、 脂肪細胞型 （aP2) 、 末梢神経細胞型 （ミエリン P2) 等少なくとも 7つの 分子種が知られている。 これらはいずれも脂肪酸結合能を有し、 共通の祖先遣伝 子から進化したファミリーであると考えられている。 各型の FABPは特異的な 組識分布を示し、 命名は、 初めにどの から見出されたかを意味するが、 その ,にしカゝ存在しないことを必ずしも意味するものではない。
ヒ トの腎鹏且織中では、 肝型 （L一 FABP) と心筋型 （H— FABP) の少 なくとも二種類の FABPが発現しており、 これらのうち L一 FABPは近位尿 細管に分布し、 H— FAB Pは主として遠位尿細管に分布している （Maatmanら、 Biochemical Journal, 第 288卷、 第 285- 290頁、 1992年； Maatmanら、
Biochemical Journal、 第 273卷、 第 759- 766頁、 1991年） 。
ゲッ歯類の腎臓においては、 FAB Pの発現'分布がヒトとは異なる。 L— F ABPは近位尿細管ではほとんど発現しておらず、 ごく少量遠位尿細管に分布し ている （Maatmanら、 Biochemical Journal, 第 288卷、 第 285- 290頁、 1992年） 。 ゲッ歯類の腎臓における主要な FAB Pは、 H— FABPと腎型 FAB P (K— FABP) である。 H— FAB Pは主に遠位尿細管に分布している。 K— FAB Pは、 肝臓で合成された α2υ—グロプリンが血中から腎臓を経由して尿中に排 出された後、 その一部が尿細管細胞内に再吸収され、 細胞内でプロセッシングを 受けて腎型 FAB Ρに変換されると考えられている （Kimuraら、 FEBS Letters, 第 246卷、 第 101- 104頁、 1989年) 。
発明の開示
本発明の目的は、 新規な作用機序を有する腎疾患治療薬もしくは予防薬、 その スクリーニング方法または同定方法を提供することにある。 また、 前記スタリ一 ニング方法または同定方法等に有用な新規細胞株を提供することにある。
前記の通り、 FAB Pと腎疾患との関連性については何ら知られてはいなかつ たが、 発明者らは、 独自に、 腎炎モデルマウスで、 マクロファージ浸潤や尿細管 間質 mm化に先行して、 尿中あるいは腎 l 且織で FABPが減少することを見出 した。 また、 ヒトでも、 予後不良を示す腎疾患患者で腎組織の L— FABPが减 少していることを見出し、 これら知見に基づいて、 FABPに着目した腎疾患の 診断方法を確立した （特開平 1 1一 242026号、 W099Z27363)。 また、 発明者らは、 さらに研究を進め、 FABPの発現増強が腎炎などの腎疾患 治療につながること、 すなわち、 FABPの発現を増強する薬物は腎疾患治療薬 となり得ることを見出し、 本発明を完成するにいたった。
すなわち、 本発明は、 動物細胞における脂肪酸結合蛋白質 （FABP) の発現 に対する被験物質の増強作用を検定することを特徴とする、 腎疾患治療薬もしく は予防薬のスクリーニング方法または同定方法である。 また、 かかる方法により 選択または同定された腎疾患治療薬もしくは予防薬である。 また、 腎臓の細胞ま たは組織において FAB Pの発現を増強する作用を有する薬物 （ペ^^オキシソ一 ムプロリフエレータ活性化受容体 （PPAR) のァゴニスト作用を有する化合物 など） を有効成分とする腎疾患治療薬もしくは予防薬である。 さらに、 前記スク リ一ユング方法または同定方法のために有用な新規なマウス近位尿細管上皮細胞 株である。
腎疾患において、 腎臓の組織や細胞は、 高度蛋白尿ゃ虚血など種々のストレス にさらされている。 本発明の方法で選択または同定される腎疾患治療薬もしくは 予防薬、 すなわち FABPの発現を増強する薬物は、 腎臓の細胞または組織を保 護する。 その作用機作は、 腎臓の組織や細胞 （特に尿細管細胞） における FAB Pが、 高度蛋白尿ゃ虚血などのストレスに対して保護的に働くことに基づく。 例えば、 高度蛋白尿は、 最近では、 単なる腎障害の指標ではなくそれ自体危険 因子の一つとされている （Kees- Foltsら、 Kidney International, 第 45卷、 第 1697— 1709頁、 1994年； Eddyら、 Journal of American Society of Nephrology, 第 5卷、 第 1273— 1287頁、 1994年） 。 蛋白尿の主成分であるアルブミンには通常 数分子の遊離脂肪酸が結合していることが知られている。 尿蛋白と結合した脂肪 酸は、 近位尿細管上皮細胞の刷子縁膜から再吸収され、 細胞内の FABPと結合 し、 ミ トコンドリアやペルォキシソ一ムに輸送され] 3酸化されると考えられる。 し力 し、 FABPの存在量が十分でない場合には、 脂肪酸が正常な j3酸化を受け ず、 その結果、 マクロファージを活性化する脂質性因子 （腎障害性因子） の産生 等が誘導されて、 免疫学的機序による間質の ml化等を進展させるであろう。 こ れに対して、 近位尿細管上皮細胞内での FABPの発現を増強させることにより、 脂肪酸代謝を正常化し、 腎障害性を有する脂質性因子の産生を抑制することで、 病態を改善し得ると考えられる。
図面の簡単な説明
図 1はマウス近位尿細管上皮細胞株 No. 13 (37—13) の形態を示す電 子顕微鏡写真である。
図 2はマウス近位尿細管上皮細胞株 （No. 10、 13、 14、 15、 16お よび 1 9) のホルモン応答能 （PTHおよび AVPで刺激した場合の細胞内 c A MP産生誘導） を測定した結果を示した図である。 図 3はマウス近位尿細管上皮細胞株 (No. 1 3および 1 6) の BSA取込み 能を測定した結果を示した図である。
図 4はマウス近位尿細管上皮細胞株を用いるレポ一タ一ァッセィにより被験物 質の L _ F A B P発現増強作用を測定した結果を示した図である。
図 5は低酸素 ·再酸素化モデル （ィンビトロ腎虚血再灌流モデル） における細 胞傷害に対する L— FAB P発現抑制の影響を示した図である。 図 5中、 L— F AB Pアンチセンスは、 L— F AB Pアンチセンス RNA発現ベクターを一過性 にトランスフエクトしたブタ近位尿細管由来 LLC— PK1細胞を、 コントロー ルは、 ベクターのみを一過性にトランスフエタトした同細胞を、 各々表す。 図 6は低酸素 ·再酸素化モデル （ィンビトロ腎虚血再灌流モデル） における細 胞傷害に対する L一 FABP強制発現の影響を示した図である。 図 6中、 「2 4 J は、 マウス近位尿細管細胞 （クローン 24) (対照細胞） 、 「24— 1 9」 は、 マウス近位尿細管細胞 （クローン 24) にヒ ト L— FAB P遺伝子を導入し て強制発現させた細胞 （クローン 24— 1 9) を、 各々表す。
図 7は腎疾患モデル （アドレアマイシン誘発糸球体硬化症モデル） マウスにお ける蛋白尿と NAG排出量に対する薬物 （MCC— 555) の作用を調べた結果 を示した図である。
図 8は腎疾患モデル （アドレアマイシン誘発糸球体硬化症モデル） マウスにお ける血液生化学的パラメータ （血中コレステロール量および血中アルブミン量） に対する薬物 （MCC— 555) の作用を調べた結果を示した図である。
図 9はヒト型 L— FAB P遺伝子を導入したトランスジエニックマウスを用い た腎疾患モデル （アドレアマイシン誘発糸球体硬化症モデ レ） における蛋白尿と NAG排出量に対する薬物 (MCC- 555) の作用を調べた結果を示した図で ある。
発明を実施するための最良の形態
本発明 （スクリーニング方法、 同定方法および治療薬） の対象とする疾患とし ては、 糖尿病性腎症、 糸球体腎炎、 ネフローゼ症候群、 巣状糸球体硬化症、 免疫 複合体腎症 （I gA腎症、 膜性腎症など） 、 ループス腎炎、 薬剤性腎障害および 腎不全などの腎疾患が挙げられる。 また、 本発明は、 ヒトの疾患に適用されるほか、 サル、 ィヌ、 ネコ、 ブタ、 ゥ シ、 ヒッジ、 ャギ、 ゥサギ、 ラット、 マウスなどの哺乳動物にも適用される。 ヒ トなどの哺乳動物 （ゲッ歯類以外） において、 腎臓の細胞または組織には、 L-F AB Pおよび H— F AB Pが発現している。 これらのうち L一 F A B Pは 近位尿細管に分布し、 H— FABPは主として遠位尿細管に分布している。 腎疾 患治療薬を創製するためには、 腎臓の細胞または組織における FABP、 特に、 近位尿細管細胞における F AB P (すなわち、 ヒ トなどにおいては L— FAB P) に着目することが重要と考えられる。
本発明による腎疾患治療薬のスクリーニング方法および同定方法は、 以下のよ うな形態で実施できる。 すなわち、 動物細胞 （哺乳動物の細胞または組織など） を被験物質の存在下に培養し、 細胞内での FABPの発現量を、 被験物質非存在 下で培養した場合と比較することにより、 被験物質の FABP発現増強作用を検 定すればよい。 あるいは、 動物個体に被験物質を投与し、 腎臓の組織や細胞など における FAB Pの発現を非投与の場合と比較することにより、 被験物質の FA B P発現増強作用を検定してもよい。
被験物質の存在下 （または投与例） での FABP発現量が高かった場合に、 被 験物質は、 その度合いに応じた増強作用を有すると判定され、 腎疾患治療薬とし ての効果が期待できる。 F AB P発現増強作用の強い被験物質を選別し候補とす ることにより、 腎疾患治療薬を好適にスクリーニングすることができる。
また、 候補薬の FABP発現増強作用を検定し、 FABP発現増強作用を有す る薬物として同定することで、 腎疾患治療薬としての作用機序が明確にされ、 治 療薬としての優れた特徴付けを行うことができる。
F AB Pの発現を検出する方法としては、 遺伝子の発現をレポーターアツセィ 法によりレポーター蛋白質を指標として測定する方法が挙げられる。 また、 遺伝 子発現を mRN Aレベルで検出することもできる。 あるいはまた、 細胞抽出液中 の F A B Pの発現を蛋白質レベルで直接検出することもできる。
遺伝子発現をレポーターアツセィ法で測定する場合、 具体的には、 例えば、 F ABP遺伝子の転写調節領域とその下流に連結されたレポータ一遺伝子からなる DNA構成を調製し、 これを適当な動物細胞に導入する。 この細胞を、 被験物質 „ の存在下および非存在下に培養した後、 細胞抽出液中のレポーター蛋白質の活性 などを測定することにより、 発現量を定量し比較すればよい。
F AB Pのアミノ酸配列や遺伝子配列は、 多くの種においてすでに報告されて レ、る （Veerkamp and Maatman, Prog. Lipid Res.、 第 34卷、 第 17— 52頁、 1995 年） 。 例えば、 L— FABPについては、 ヒ トの cDNA (Loweら、 Journal of
Biological Chemistry, 第 260卷、 第 3413— 3417頁、 1985年； Genbank/EMBL登録 番号 M10050) 、 ラッ卜の染色体遺伝子 （Sweetserら、 Journal of Biological Chemistry, 第 261卷、 第 5553— 5561頁、 1986年； Genbank/EMBL登録番号 M13501) などの配列情報が既知である。
従って、 F AB Pの c DNAや染色体遺伝子は、 前記のような配列情報をもと にプライマーやプローブを設計し、 PCR法、 コロニ一ハイブリダィゼ一シヨン 法、 プラークハイブリダィゼ一シヨン法等を適宜組合せて、 適当な DNAライブ ラリーから取得できる。
レポ一ター構成およびこれを含むレポ一タープラスミ ドは、 FABPの染色体 遺伝子中の 5'上流域に存在する転写調節領域と、 適当なレポ一ター遺伝子を用 いて、 通常の遺伝子組換え技術により調製することができる。
レポ一タ一遺伝子は特に限定されないが、 安定でかつ活性の定量的測定が容易 な酵素の遺伝子などを用いることが好ましい。 このようなレポ一ター遺伝子とし ては、 ガラクトシダ一ゼ遺伝子 （ 1 a c Z) 、 バクテリアトランスポゾン由 来のクロラムフエニコ一ルァセチルトランスフェラーゼ遺伝子 （CAT) 、 ホタ ル由来のルシフェラーゼ遺伝子 （Lu c) 等が挙げられる。
遺伝子発現を mRN Aレベルで検出する場合は、 例えば細胞や組織から、 RN A (mRN A) を抽出して、 PCR法 (Polymerase chain reaction method) ( rpCR ProtocolsJ Innis MA, Gel fad DH， Sninsky JJ and White TJ eds.， Academic Press, Sandiego, 1990年） 、 RN A分解酵素プロテクションアツセィ 法 (RNase protection assay method) (Nucleic Acid Research 第 12卷、 第 7035— 7056頁、 1984年） 、 あるいはノーザンブロット解析法などを利用して、 F AB P遺伝子から転写された mRN Aを検出定量すればよい。
FAB Pの発現を蛋白質レベルで検出する場合には、 例えば抗 F AB P抗体な n どを用いる免疫化学的方法 （EL I SA法、 免疫組織染色法など） を用いること ができる。 抗体は、 免疫抗原として精製 FABPを用い、 常法により調製できる。 FABPの各分子種については、 すでにその臓器分布、 分子量、 一次構造などが 報告されている （藤井ら、 動脈硬化、 第 24卷、 353-361頁、 1996年； Veerkamp and Maatraan, 第 34卷、 17- 52頁、 1995年； Drickamerら、 J. Biol. Chem.、 第 256卷、
3634- 3636頁、 1981年； Untermanら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA、 第 78卷、 3478- 3482頁） 。 精製 FABPは、 これら情報をもとに調製できる。 あるいは、 前記既 知遺伝子配列情報に基づいて、 c DNAを単離し、 遺伝子組換え技術により調製 して用いてもよレ、。
本発明の方法をインビト口にて、 培養細胞を用いて実施する場合、 細胞は、 動 物細胞 （哺乳動物の細胞等） を用いることが望ましい。 中でも、 動物の腎臓由来 の細胞が好ましく、 尿細管細胞がより好ましく、 とりわけ近位尿細管上皮細胞が とりわけ好ましい。 細胞は、 初代培養細胞、 不死化細胞 （株化細胞） のいずれを 用いてもよい。 不死化細胞 （株化細胞） を用いた場合には、 培養や取り扱いが容 易となる点で有利である。
ヒ トの腎臓由来の細胞としては、 ヒ トの尿サンプルから尿中落下細胞 （特に近 位尿細管上皮細胞） を分離して用いることができる。 ヒ トの腎臓由来の細胞を用 いた場合には、 ヒトでの作用をより確かに予測できる点で有利である。
尿細管由来の既知細胞株としては、 具体的には例えば、 ィヌの尿細管 （遠位尿 細管） 由来細胞株である MDCK (ATCC CRL 6253) 、 ブタの尿細 管 （近位尿細管） 由来細胞株である LLC— PK1 (ATCC CRL 139 2) などが挙げられる。
また、 これらの他、 茨城県つくば市東 1丁目 1番 3号、 工業技術院生命工学ェ 業技術研究所に、 受託番号： FERM P- 1 6985で寄託され （受託日 ： 1 998年 9月 9 Θ) 、 その後、 ブタぺスト条約に基づく国際寄託へ移管された
(受託番号： FERM BP— 7038、 国際寄託への変更日 ： 2000年 2月 21日） マウス細胞株 m P r o X 37— 13など、 本発明者らが後記実施例 2に おいてマウスの近位尿細管細胞から樹立した不死化細胞株が挙げられる。 これら 細胞株は、 下記 （1) 、 (2) および （3) の性質を有する。 ( 1 ) 上皮細胞の形態を有する。
( 2 ) アルブミン取り込み能を有する。
( 3 ) 上皮小体ホルモンによる刺激に応答して細胞内 c AM P産生が誘導される 力 バソプレツシンによる刺激には応答しなレ、。
前記の既知尿細管由来細胞株のうち、 L L C一 P K 1は近位尿細管由来とされ ており上皮細胞であるが、 生体内の近位尿細管細胞に特徴的なホルモン応答性で ある （3 ) の性質を失っている （後記実施例 2参照） 。 これに対し、 本発明者ら の樹立した細胞株は、 ホルモン応答性も含めて近位尿細管上皮細胞の特徴を明確 に維持している株化細胞であるので、 これら細胞株を使用すれば、 生体内の生理 的環境により近い系となる。 このような細胞を、 使用することは、 効果的な腎疾 患治療薬のスクリ一ユング方法および同定方法のために有利である。
本発明の方法により、 F A B Pの発現を増強する作用が認められた被験物質に ついては、 さらに腎疾患の既知病態モデル （in vivoまたは in vitro) において 治療効果および予防効果を確認すればよレ、。
このようなインビトロの病態モデルとしては、 尿細管細胞を用いる腎障害性リ ピド （炎症性リピド） の産生モデル （Kees- Foltsら、 Kidney International, 第 45卷、 第 1697— 1709頁、 1994年） などが挙げられる。 また、 インビボの病態モデ ルとしては、 加速型抗 G B M腎炎モデル （Nagaiら、 Jpn. J. Pharmacol. , 第 32 巻、 第 1117- 1124頁、 1982年） 、 S Τ Ζ誘発糖尿病性腎症モデル （Sharmaら、 Diabetes.、 第 45卷、 第 522- 530頁、 1996年） 、 ピューロマイシン誘発巣状糸球体 硬化症モデル （Hiranoら、 Nephron、 第 60卷、 第 443- 447頁、 1992年） 、 アドリア マイシン誘発糸球体硬化症モデル （Chenら、 N印 hron、 第 78卷、 第 440 - 452頁、 1998年） 、 シクロスポリン腎症モデル （Gil lumら、 Transplant, 第 46卷、 第 285 - 292頁、 1988年) などが挙げられる。
F A B P発現増強作用を有する薬物としては、 例えば、 ペルォキシソ一ムプロ リフェレ一タ活性 ^ [匕 体 (peroxisome proiiferator-activated receptor； P P A R) のァゴニスト、 カルニチンパルミ トイルトランスフェラーゼ
(carnitine palmitoyltransferase； C P T) の阻害剤などを見出している。 F A B P遣伝子の上流域にペルォキシソ一ムプロリフェレ一タ応答配列が見られる „ ことは、 P PARァゴニストが FAB P発現増強作用を有することを裏付ける。
P PARのァゴニストとしては、 既知の P PARァゴニスト （Lehmannら、 Journal of Biological Chemistry, 第 270卷、 第 12953-12956頁、 1995年； Willsonら、 Journal of Medicinal Chemistry, 第 39卷、 第 665- 668頁、 1996年） の他、 文献記載の方法 （WO 99/1 0532 ； WO 96/33724 ； WO 9
6/ 22884 ； Mizukamiり、 Biochemical Biophysical Research
Communications, 第 240卷、 第 61 - 64頁、 1997年； Kreyら、 Molecular
Endocrinology, 第 11卷、 第 779 - 791頁、 1997年； Buckleら、 Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 第 6卷、 第 2121 - 2126頁、 1996年； Tontonozら、 Genes and Development, 第 8卷、 第 1224 - 1234頁、 1994年） により、 PPAR ァゴニス ト作用が新たに確認された化合物も使用できる。 これらのうち、 PPA R (P P ARy) のァゴニストとして、 MCC— 555 (化学名： 5 - [6— (2— f luorobenzyloxy)naphthalen-2-ylmethylJ tniazoliame-2, 4-dione； E P 604 983) がとりわけ好適に使用できる。
C P Tの阻害剤としては例えば、 既知の C P T阻害剤 （Current
Pharmaceutical Design, 第 4卷、 第 1-15頁、 1998年） の他、 文献記載の方法
(Saeedら、 Arch. Biochem. Biophys.、 第 305卷、 第 307- 312頁、 1993年；
Kanamuraら、 Life Science, 第 37卷、 第 217 - 223頁、 1985年； Shinagawaら、 J. Med. Chem.、 第 30卷、 第 1458 - 1463頁、 1987年） により、 CP TP且害作用が新た に確認された化合物も使用できる。 これらのうち、 CPT (CPT I) の阻害 剤として、 ェトモキシール (Etoraoxir) (化学名： ethyl 2- [6- (4-chloro- phenoxy)hexyl」—oxiranecarboxylate； £ P 46 o 90および Current
Pharmaceutical Design, 第 4卷、 第 1-15頁、 1998年） 、 4—THA (化学名： 2- hydroxy - 3 - propyl— 4 - [6-(tetrazol - 5 - y丄) hexyloxy]acetophenone； Biochem. J. 第 252卷、 第 409— 414頁、 1988年） が好適に使用できる。
P PARァゴニストゃ CP T阻害剤は、 糖尿病の治療薬として知られている。 また、 糖尿病病態モデルにおいて、 糖尿病に起因する腎疾患の症状が改善される ことが報告されている （Buckinghamら、 Diabetes, 第 47卷、 第 1326 - 1334頁、 1998年） 。 し力 し、 これは、 原疾患である糖尿病が改善されることに基づくもの と推察され、 糖尿病に起因しない腎疾患に、 P PARのァゴニストや CPT阻害 剤などを適応することについては何ら知られておらず示唆もない。 一方、 本発明 の治療薬または予防薬は、 糖尿病に起因する腎疾患 （例えば、 糖尿病性腎症） を 除く腎疾患にも好適に適応されるものである。
本発明において、 被験物質、 FAB P発現増強作用を有する薬物、 PPARの ァゴニスト、 CPTの阻害剤などを動物個体あるいはヒトに投与する場合には、 経口、 静脈內、 筋肉内、 皮下などいずれの投与形態を用いてもよい。 投与形態に 応じた不活性な担体と共に、 必要に応じては製剤化して用いることもできる。 投 与量は、 投与方法や個体の年齢、 体重、 疾患の程度などによって異なるが、 通常、 1日当たり、 経口投与の場合は、 1〜3◦ Omg/k g、 非経口投与の場合には、 0. 01〜5 OmgZk gの範囲で設定される。
本発明の医薬 （治療薬または予防薬） は、 FABP発現増強作用 （または PP ARのァゴニスト作用、 または CPTの阻害作用） に基づいて生体内での薬効を 発揮するものである。 本発明の医薬としては、 生体内での薬効を発揮するために 十分な強さの FAB P発現増強作用 （または P PARのァゴニスト作用、 または CPTの阻害作用） を有しない薬物は含まれない。 また、 FABP発現増強作用 (または P PARのァゴニスト作用、 または CPTの阻害作用） 以外の他の主作 用に基づいて生体内での薬効を発揮する薬物は含まれない。 また、 本発明の医薬 としては、 毒性あるいは薬物動態の面での好ましからざる性格等のために、 疾病 の治療または予防に使用できないものは含まれなレ、。
以下、 実施例をもって本発明をさらに詳しく説明するが、 これらの実施例は本 発明を制限するものではない。
なお、 下記実施例において、 各操作は特に明示がない限り、 「モレキュラー クローニング （Molecular Cloning) 」 （Sambrook, J., Fritsch, E. F.および Maniatis, T. 著、 Cold Spring Harbor Laboratory Pressより 1 989年に発 刊） に記載の方法により行う力、 または、 市販の試薬やキットを用いる場合には 市販品の指示書に従って使用した。
実施例 1 L— FABPレポ一タ一プラスミ ドの作製
(1) ヒ ト F AB Pの c DNAの単離 U ヒ ト L— F AB Pの c DNAを、 ヒ ト肝臓由来の cDNAライブラリー （クロンテ ック社製、 Cat#HL1115b L0T#562l) から PCR (polymerase chain reaction) 法にて単離した。 プライマ一は、 既知配列情報 （Loweら、 Journal of
Biological Chemistry, 第 260卷、 第 3413- 3417頁、 1985年； Genbank/EMBL登録番 号 M10050) を元に設計し、 PCRで得られる断片の両末端には B a mH I認識部 位が付加されるようにした。 PCRにょり得られたDNA断片 （約 420塩基対） は、 ヒ ト L— F AB P c DNAの全翻訳領域を含んでいた。 この断片を適当なプ ラスミ ドに連結した。
(2) ヒ ト F A B Pの染色体遺伝子の単離
前項 （1) で得たヒ ト F AB P c DNAを含む断片 （約 420塩基対、 B a mH
I断片） をプローブとして用い、 ヒ ト染色体 DNAライブラリー （クロンテック 社製、 Cat#HL1006d L0T#19412) から、 プラークハイブリダィゼーシヨン法によ りヒ ト L— F AB Pの染色体遺伝子をクロ一ユングした。 得られたクローンは、 約 20 k bの挿入断片を含んでいた。 部分的に塩基配列を決定したところ、 この 断片中にヒ ト L— FABPの全翻訳領域が含まれていることがわかった。
この挿入断片のうち、 5'上流域を含む断片 （約 5360 b p、 S a i l— K ρ η I断片） を切り出し、 ベクタ一プラスミ ドに組み込んで以下の実験に用いた。 5' 上流域を含む断片 （S a l I -Kp n I断片） の塩基配列を、 後記配列表の 配列番号 1に示した。
(3) L— F AB Pレポ一タープラスミ ドの作製
前項 （2) で得た L— F AB P遺伝子断片 （約 5360塩基対、 S a 1 I— Kp n I断片） を铸型とし、 PCR法により、 N s pV認識部位 （5'上流域中；配列 番号 1の 4670番目の塩基） から約 100塩基ほど下流 （開始コドンの直前） までの領域を増幅し、 断片 （約 100 b p) を得た。 また、 これとは別に、 先の S a i l -Kp n I断片をプラスミ ド pUC 18の S a 1 I— Kp n I切断部位 に組み込んだ後、 得られたプラスミ ドを Ns pVおよび Kp n Iで消化して、 N s pV認識部位から下流の部分を欠失させた。 先の PCRで得た断片をこれと連 結し、 プラスミ ド pUC 1 8— 9 25を得た。
次いでこのプラスミ ドを、 S a 1 Iおよび Kp n Iで消化し、 得られる断片 (約 4760塩基対） を、 ベクタープラスミド pGV— B (東洋インキ社製） に 挿入し、 レポ一ターアツセィ用のプラスミドを得た。 挿入断片は、 配列番号 1の 第 1〜4760番目 （開始コドン直前） までに相当する塩基配列を含み、 その 3 '末端に Kp n l認識配列 （6塩基対） が付加されている。
得られた L—FAB Ρレポータープラスミドは、 ヒ ト L— FAB Ρ遺伝子の転 写調節領域を含む 5 '上流域の下流にルシフエラーゼ遺伝子 （プロモータ一領域 を含まない） が連結されたレポ一ター構成を有する。
実施例 2 尿細管細胞の初代培養 ·不死化および L— F ΑΒ Ρレポ一ター構成の 導入
(1) ネフロンの単離
顕微解剖法により、 以下のようにして、 マウスの腎臓からネフロンを単離した。 マウスをペントバルビタールにて麻酔後開腹し、 0. 1%BSAを含む冷ハンク ス緩衝液 (Hank' s buffered solution： HB S) 20 m 1を、 腹部大動脈より灌 流した。 次いで、 0. 1 %B S Aおよび 0. 1 %コラゲナ一ゼ （collagenase typel) を含む冷 HBS 1 0m lを灌流した。 これら灌流液は、 あらかじめ 5%
C02— 95%02混合ガスにより飽和させたものを用いた。 次に腎臓を摘出し、 外科手術刃 （Surgical Brade) で厚さ 0. 5〜： I.0 mmのスライス片を作製した。 これを 0. 1 %コラゲナーゼ溶液 （HB S中） 10m lに浸し、 37°C、 10分 間酵素処理を行った後、 HBSで 2回洗浄した。 このスライス片を、 氷冷した状 態で実体顕微鏡にて観察しながら単一セグメント （ネフロン） を単離した。
(2) 尿細管上皮細胞の初代培養
前項 （1) で得られた単一セグメント （ネフロン） を用い、 以下のようにして 尿細管細胞の初代培養を行った。 単一セグメントを、 10 %ゥシ胎児血清を含む K 1培地 （50 ： 50 DMEM/H am's F— 12、 15 mM H e p e s、 13.4 mM sodium bi carbonate 5 μ g/ m 1 insulin、 5 μ g/ m 1 transferrin^ 5 n g /m 1 selenous acid、 0.05 // M hydrocortisone, 1 0 n g/m 1 epidermal growth factor) で 2回洗浄した後、 96穴プレートに 播種し、 同培地中一晚培養した。 翌日、 支持細胞 （Feeder layer) を添加 （2. 5〜5 X 103 cellS/well) し、 単一セグメントと共培養した。 支持細胞とし ては、 マウス腎間葉系由来細胞 （密度勾配遠心法によりマウス腎臓から単離した 後不死化して得た細胞株） またはマウス N I H3T 3細胞を X線照射して増殖能 を欠如させたものを用いた。 培地としては、 10%ゥシ胎児血? fr^有 K1培地に、 支持細胞の培養上清を等量加え、 さらに HGF (Hepatocyte Growth Factor) (25 n g/m 1 ) を添加したものを用いた。 また、 プレートは、 予め 0. 1% ゼラチンにてコーティング処理したものを使用した。 4〜6日間培養後、 セグメ ントから上皮細胞 （尿細管上皮細胞） の遊走が顕微鏡下で確認できた。
(3) 尿細管上皮細胞の不死ィ匕
前項 （2) と同様にして尿細管上皮細胞の培養を行った。
上皮細胞の遊走が確認された後、 SV40 Large T抗原遺伝子およびネオマイシン 耐性遺伝子を含むプラスミ ド （ネオマイシン耐性遺伝子を含む市販プラスミ ド p GEM3 S Ra n e oに SV40 Large T抗原遺伝子を挿入して作製したプラスミ ド） をトランスフエクシヨンした。 トランスフエクシヨンは、 プラスミ ドと トラ ンスフエタタム （エアブラウン社製； カチオン性リボソーム） の混合液を添加し た培地中で、 細胞を 1〜3時間 37°Cで培養することにより行った。
トランスフエクシヨン後、 2〜 3日間培養した後、 トリプシン一 EDTAにて 処理して細胞を剥離し、 48穴プレートに継代した。 その際、 新たに支持細胞を 添カ卩 （約 1 X 1 C^cellsZwell) した。 継代 1〜2日後に、 再度、 同プラスミ ドをトランスフエクシヨンした。 以後培養スケ一ルを拡大しながら上記操作を反 復して行い、 不死化細胞を取得した。 得られた不死化細胞の培養は、 以後、 支持 細胞を用いず、 0. 1%ゼラチンにてコ一ティング処理した培養器を用い、 1 0 %ゥシ胎児血清を含む K 1培地中にて行った。
(4) L— F AB Pレポータープラスミ ドの導入
前項 （3) で得られた不死化細胞を一晩培養した。 次いで、 前記実施例 1で調 製したヒ ト L一 FABPレポータープラスミ ド （18 μ g) を、 ハイグロマイシ ン耐性遺伝子を含むプラスミド （p PUR、 Clontech社製、 カタログ #61δ6-1) (1.8 // g) とともに用い、 トランスフエクシヨンを行った。 トランスフエク シヨンは、 前項 (3) と同様に、 トランスフエクタムを用いて行った。
トランスフエクシヨン後、 ハイグロマイシン （100 /z g/m 1 ) を添加した 培地 （10%ゥシ胎児血清含有 Kl培地） にて培養した。 6日培養後に一回継代 した後、 さらに 10日間培養し、 生じたハイグロマイシン耐性コロニーを顕微鏡 下で採取して、 これらを 96穴プレートに接種し、 培養した。 かくして、 プラス ミドが導入された数種の形質転換細胞株 （No. 10~No. 1 9) を得た。
これら細胞株は、 以後、 10%ゥシ胎児血清を含む高グルコース含有ダルべッ コ一 f—グル培地 （以下、 DMEM培地） （Gibco社製） 中にて培養を行った。 (5) 細胞株の形態学的および生理学的解析
前項 （4) で得られた細胞株について、 近位尿細管上皮細胞としての形態学的 特徴および生理学的特徴 （ホルモンに対する応答能、 BS A取込み能の解析） を 有しているかどう力、解析した。
細胞株について形態学的な観察を行ったところ、 位相差顕微鏡による観察では、 いずれも上皮細胞に特徴的な敷石構造を取っていることが確認できた。 また、 細 胞株 No. 13について、 電子顕微鏡で観察したところ、 尖端 （apical) 側に微 絨毛が存在すること、 上皮細胞に特徴的な密着結合 （tight junction) が形成さ れていること、 側底 （basolateral) 側にァクチンが発現し、 へモデスモソ一ム
(hemodesmosome) が形成されていること、 および、 部分的にではあるが極性を 有していることが確認された。 これらの観察像力 ら、 取得した細胞株は、 上皮細 胞であると考えられた。 図 1には、 細胞株 N o. 13の電子顕微鏡写真を示す。 尿細管の上皮細胞は、 各種ホルモンに対し、 各々の分節で特異的な応答性を示 し、 細胞内の c AMP産生を誘導することが知られている。 例えば、 近位尿細管 細胞は、 上皮小体ホルモン （PTH) に対してのみ応答し、 バソプレツシン （A VP) に対しては応答を示さない。 一方、 集合管および He n 1 e係蹄などでは、 AVPに対して応答を示す。
そこで、 各細胞株 （細胞株 No. 10、 1 3、 14、 1 5、 16および 1 9) について、 後記参考例 1 (6) 記載の方法に準じ、 PTHおよび AVPに対する 応答を調べた。 その結果、 図 2に示したように、 細胞株 No. 10を除き全ての 各細胞株が PTH刺激に対して応答を示し、 特に細胞株 No. 13は非常に高い 応答能を維持していた。 一方、 AVPに対しては全ての細胞株が応答を示さなか つた。 これらの結果から、 No. 10を除く各細胞株は、 ホルモン応答能に関し て近位尿細管細胞としての特徴を有しており、 特に No. 13はその特徴がよく 維持されていると考えられた。
また、 既知の近位尿細管上皮細胞株である LLC— PK1 (ATCC CRL 1392) について、 前記と同様にホルモン応答能を調べた。 その結果、 ホルモ ン刺激に対する c AMP産生量の比は、 コントロール： PTH刺激時： AVP刺 激時で、 1 ： 0.7 ： 7.4であり、 PTHには応答せず、 AVPに応答すること がわかった。 すなわち、 LLC— PK1は、 細胞株 No. 1 3とは異なり、 ホル モン応答能に関して近位尿細管細胞としての特徴を有していなかつた。
次に、 細胞株 No. 13および No. 16について、 後記参考例 1 (5) 記載の 方法に準じ、 アルブミン取り込み能を調べた。 近位尿細管は、 糸球体で濾過され た濾液中に含まれる蛋白の再吸収を担う分節であり、 近位尿細管細胞は、 血漿中 に多量存在するアルブミン等の取り込み能を有することが知られている。 測定の 結果、 図 3に示したように、 両細胞株にはアルブミン取り込み能が認められた。 特に細胞株 No. 13は、 コントロールに比して約 5倍の高いアルブミン取込み 能を示し、 このこと力 ら、 細胞株 No. 1 3は、 アルブミン等の取り込み能の点 でも近位尿細管細胞としての特徴をよく維持していることがわかった。
(6) L— FABP遺伝子挿入領域の確認
細胞株 No. 13は、 前記の通り、 マウス近位尿細管上皮細胞株であるととも に、 L— FAB Pレポータープラスミ ドが導入された細胞株である。 その染色体 上にレポーター構成が挿入されていることを確認するために、 以下のようにサザ ンブロット解析を行った。
レポータープラスミ ドに由来するヒ ト L— FABP遺伝子の転写調節領域が欠 失を受けずに揷入されていた場合、 染色体 DNAを制限酵素 Ap a— Kp n Iで 切断することにより 4.3 Kbの断片を生じるはずである。 細胞株 No. 13の細 胞から染色体 DN Aを調製し、 これを制限酵素 A p aおよび Kp η Iで処理した 後、 ァガロースゲル電気泳動に供した。 泳動後のゲルから、 ナイロン膜 （Hyband N+ membrane, Amershaml土製） に DNAをトランスファーした後、 膜を 2 X S S Cで洗浄し乾燥させた。 メンブレンを、 プレハイブリダィゼ一シヨン処理後、 プ ローブを含むハイブリダイゼーション用緩衝液中にて、 65 でー晚ハイブリダ ィゼ一シヨンを行い、 次いで 2 X S S C (0. 1 %S DS含有） で洗浄 （6 5°C、 3 0分間） 後、 オートラジオグラフィ一に供した。 プローブとしては、 ヒト L— FAB P遺伝子の 5'上流配列を含む断片 （1. 2 Kb) を R I標識して用いた。 その結果、 4. 3 K bの断片が検出され、 L— FAB P遺伝子転写調節領域が 欠失なく挿入されていることが確認された。 このことから、 細胞株 No. 1 3は、 その染色体上に、 L— FAB Pレポータープラスミドに由来する DNA構成 （ヒ ト L一 F A B P遺伝子転写調節領域およびルシフエラーゼ遺伝子からなる構成） が挿入されていると考えられた。
この細胞株 N o. 1 3 (以下、 mP r o x 3 7— 1 3と称する） は、 細胞株の 名称 「マウス細胞株 mP r o X 3 7— 1 3」 として、 前記の通り寄託された （受 託番号： F E RM B P— 70 3 8、 国際寄託への変更日 ： 200 0年 2月 2 1 曰） 。
実施例 3 近位尿細管上皮細胞における L— FAB P発現増強作用の検定
前記実施例 2で得られた、 L— F AB Pレポ一タ一DN A構成を含む近位尿細 管上皮細胞株 mP r o X 3 7— 1 3 (細胞株 N o 1 3とも称する） を用い、 以 下のように、 レポ一タ一アツセィ法により被験物質の L— FAB P発現増強作用 を測定した。
まず、 細胞株 mP r o x 3 7— 1 3を、 9 6穴平底プレートに 5 X 1 04細胞 /1 00 μ 1 Ζゥエルとなるよう分注し、 培養した。 培養には、 0. 1 %ゼラチ ンでコ一ティング処理したプレートを用い、 培地は 1 0%ゥシ胎児血清、 ぺニシ リン （1 0 0単位 /m 1 ) およびストレプトマイシン （1 00 /Z Zm 1 ) を添 加した高グルコース含有ダルベッコ MEM培地 （Dulbecco' s MEM, high glucose； DMEM) (Gibco社製） を用いた。 4 8時間培養後、 無血清培地で 1 回洗浄を行った後、 被験物質を含む無血清培地を加えた。 コントロールは、 被験 物質無添加とした。 さらに培養を行った後、 2〜1 0時間後のルシフェラーゼ活 性を測定した。
ルシフェラーゼ活性は、 以下のように測定した。 細胞をリン酸緩衝生理食塩水 (P B S) で洗浄後、 20 μ Iの細胞溶解液 （培養細胞溶解液 L C )3— 5 1、 東 洋インキ社製） を加え、 室温にて 20分間放置後、 一 80°Cに一晩保存した。 ― 80°Cに保存したプレートを室温に戻した後、 Ι Ο Ο μ 1の発光基質液 （ピツカ ジーン発光キット、 東洋インキ社製） を加え、 反応を開始した。 発光量は、 ルミ ノメータ （MicroLumat LP98P、 BERTHOLD|±0) を用いて測定した。 反応開始から 1 0秒間の相対光度 （RLU) 値を積算し、 ルシフェラ一ゼ活性とした。 また、 この活性値から、 ルシフェラーゼ誘導率 （L u c誘導率） を下記の式に従って算 出した。
L u c誘導率 =被験値ノコントロール値
被験物質として、 ペルォキシソームプロリフユレータ活性化受容体
(.peroxisome prol if erator-acti vated receptor； P P A ) (D ゴニス卜 (作 動薬） である MCC— 55 5、 およびカルニチンパルミ トイルトランスフェラー ゼ （carnitine palmitoyltransferase； CPT) の阻害剤であるエトモキシ一ノレ (Etoraoxir) を添加したところ、 ルシフェラ一ゼ活性誘導が認められた。 このこ とから、 これら化合物は、 近位尿細管細胞において L一 FAB P遺伝子発現を増 強する作用を有するものと同定される。 測定結果を、 図 4に示した。
MCC- 55 5 (化学名： 5- [6- (2- fluorobenzyloxy)naphthalen_2-yl - methyl] thiazolidine-2, 4-dione； EP 604 983) およびェトモキシーノレ (ィヒ学名： ethyl 2-[6-(4-chlorophenoxy)hexyl]-oxiranecarboxylate； E P 4 6 5 90および Current Pharmaceutical Design, 第 4卷、 第 1-15頁、 1998年） は文献記載の方法に準じて合成したものを用レヽた。
実施例 4 近位尿細管上皮細胞における L一 FABP発現増強作用の検定
(mRNAレベルおよび蛋白質レベルでの測定）
前記実施例 1の （2) 項にて単離したヒト L— FAB P染色体遺伝子 （全長） を含むプラスミドを線状化した後、 ブタ尿細管細胞株 LLC一 PK 1、 または前 記実施例 2の （3) と同様にして得たマウスの不死化尿細管上皮細胞にトランス フエクシヨンし、 安定な形質転換細胞を得た。 これら細胞は、 ヒ ト L— FABP の染色体遺伝子が欠失を受けることなく染色体上に組込まれていた。
これら細胞を用い、 以下のようにして被験薬物の L— F A B P発現増強作用を mRNAレベルおよび蛋白質レベルで調べた。 細胞を、 コンフルェントになるま で培養した後、 血清を含まない DMEM培地に培地交換し、 最終濃度 1 zMに なるよう被験薬物を培地中に添加し、 37°Cで培養した。 また、 対照例は、 被験 薬物無添加とした。
mRN Aレベルでの測定は以下のように行った。 培養後、 細胞を回収しトータ ル RN Aを調製した。 得られたトータル RNAを铸型とする RT— PCR
(Reverse transcriptase - Pol merase chain reaction) により、 ヒ 卜 L—ト
AB Pの mRNAを検出した。 また、 測定値の標準化のために、 コントロールと して GAPDH (Glyceraldehyde 3- phosphate dehydrogenase) の mRN Aを同 様の RT— PC Rにて検出した。 得られた PC R産物をァガロースゲル電気泳動 後、 ェチジゥムブロマイドで染色して各バンドを検出し、 デンシトメ トリ一また は目視により発現量を判定した。 その結果、 被験薬物として MCC— 555を添 加した場合、 培養後 1 5分から 24時間まで L— FAB PmRNAの誘導作用が 認められた。
蛋白質レベルでの測定は、 以下のように行った。 培養後の細胞を回収し、 超音 波破砕した後、 細胞抽出液を調製した。 抗ヒ ト L— FABP抗体を用いるウェス タンプロティング法または E L I SA'法により、 抽出液中の L— FAB P量を測 定した。 その結果、 被験薬物として MCC— 555を添加することにより、 L— FABP蛋白質の発現増強作用が認められた。 また被験薬物としてェトモキシー ルを添加した場合にも同様に L一 F A B P蛋白質の発現増強作用が認められた。 実施例 5 ヒ ト尿中落下細胞における L— FABP発現増強作用の検定
(mRNAレベルでの測定）
(1) ヒ ト尿中落下細胞の単離
腎組織から尿中に落下している尿細管上皮細胞 （以下、 尿中落下細胞とよぶ） を以下のようにしてヒ ト尿サンプルから分離し、 培養に供した。
まず、 男児の腎炎患者 （0から 3才） か 、 クリーンキャッチ法 （clean - catch method) により、 尿サンブルを採取した。 ついで、 この尿サンプルを室温 で遠心分離 （1000 r pm、 10分） し、 上清を捨て、 ペレツトを、 10%
( V Z V ) ゥシ胎児血清含有のダルべッコ—ィ一グル培地 （Dulbecco' s
modified Eagle' s medium) にて 2回、 培養用培地で 1回洗浄した。 培養用培地 としては、 ダルベッコ一ィーグノレ培地とハムズ F— 12培地 （Ham， s F— 1 2 medium) を 1 ： 1で混合したものに、 ゥシ胎児血清 （1 0%vZv) 、 イン シュリン （5 μ g/m 1 ) 、 トランスフェリン （5 μ g/m 1 ) 、 亜セレン酸ナ トリウム （sodium selenite) (5 n g/m 1 ) 、 デキサメタゾン （1 0— 8M) 、 ニコチンアミ ド （5mM) 、 ペニシリン （1 00 1 UZm 1 ) およびストレプト マイシン （l O O /z g/m l ) を添加したものを用いた。
ペレットを培養用培地に懸濁し、 適宜希釈した後、 タイプ 4コラーゲンでコー ティングを施した 3. 5 c m径ディッシュ （Falcon社製） 中で培養を行った。 培 養は 5 % C O 2、 3 7 °Cの条件で行つた。
培養した細胞が、 尿細管上皮細胞であることは、 培養器上でコンフルェントに るとドーム形成が観察されたこと、 およびアルカリホスファターゼ染色で陽 性を示すことにより確認した。
(2) L— FAB P発現増強作用の検定
前記 （1) で培養したヒ ト尿中落下細胞 （ヒ ト尿細管上皮細胞） を用い、 以下 のように、 前記実施例 4と同様にして、 被験薬物の L— FAB P発現増強作用を mRNAレベルで調べた。
まず、 細胞を、 コンフルェントになるまで培養した後、 最終濃度 Ι μΜにな るよう被験薬物を添加したダルベッコ一イーグル培地 （血清不含） に培地交換し、
3 7 °Cで培養した。 被験薬物としては、 MCC— 5 55 (P PARァゴニスト） および 4— THA (2-hydroxy-3-propyl-4-[6-(tetrazol-5-yl)hexyloxy]- acetophenone) (CPT阻害薬） を用いた。 また、 対照例については、 被験薬物 を無添加とした。
培養後の細胞を回収しトータル RNAを調製した。 得られたト一タル RNAを として RT— PCR (Reverse transcriptase - Polymerase chain reaction) を行った。 P C R産物をァガロースゲル電気泳動後、 ェチジゥムブ口 マイ ドで染色して各バンドを検出し、 デンシトメ トリーまたは目視により発現量 を判定した。 また、 測定値の標準化のために、 コントロールとして r BAT (related to b0,+ system amino acid transporter； Purroyら、 Genomics ^ 第 3 7卷、 第 249— 25 2頁、 1 996年） の mRNAを RT— P C Rにて検出し た。 その結果、 下表 1に示した通り、 ヒ ト尿中落下細胞 （ヒト尿細管上皮細胞） に おける L— F AB PmRNAの発現量は、 MCC— 5 5 5および 4— THAの添 加によって増加した。 この結果から、 これら化合物は、 ヒ卜においても、 近位尿 細管細胞の L— F A B Pの発現増強作用を有するものと同定された。
Figure imgf000022_0001
実施例 6 細胞傷害に対する L—F AB P発現抑制の影響
ブタ近位尿細管由来 L L C— PK 1細胞を用いた低酸素 ·再酸素化モデル （ィ ンビトロ腎虚血再灌流モデル） により、 細胞傷害に対する L— F A B P発現抑制 の影響を、 以下のようにして調べた。
まず、 ブタ L— FAB P c DNAを RT— PCRでクロ一ニングし、 p RCZ
CMVにサブクロ一ニングしてアンチセンス RNA発現用べクタ一 p L F AB P
― RCZCMVを得た。
ついで、 6穴プレートに L LC— PK 1細胞をまき （1 X I 05 ウエル） 、
24時間培養後、 リポフエクトァミン （G I B CO社製） を用いて p L FAB P — p RCZCMVをトランスフエタトした。 またコントロールとしては、 ベクタ 一 (p RC/CMV) のみをトランスフエタトした。 これら細胞を 24時間培養 後、 嫌気性チャンバ一 （COY社） 内に移し低酸素暴露を 24時間行った。 さら に、 これら細胞を通常の大気中に戻して 24時間再酸素化した後、 細胞傷害度を 測定した。
細胞傷害度は、 培地中に漏出した LDH (lactic dehydrogenase；乳酸脱水素 酵素） を指標にして測定した。 すなわち、 低酸素暴露後、 培地を回収し、 測定キ ット 「LDH—細胞毒性テストヮコ一」 （和光純薬製） を用いて培地中の LDH 活性を測定した。
その結果、 図 5に示した通り、 低酸素 '再酸素化した後に漏出した LDH活性 は、 L— FAB Pアンチセンス RNAを一過性に発現させた細胞の場合、 ベクタ —のみをトランスフエクトしたコントロールと比較して大きい値を示し、 細胞が より大きい傷害を受けていることが示された。
このように、 L— F AB Pアンチセンス RNAの発現、 すなわち L— FABP の発現抑制により、 低酸素 ·再酸素化時の細胞傷害が増大したことから、 近位尿 細管細胞に傷害を与える腎虚血再灌流などの状態において、 L— FAB Pは細胞 を保護する機能を果たすものと考えられた。
実施例 7 細胞傷害に対する L— FABP強制発現の影響
前記実施例 6に準じ、 近位尿細管細胞を用いた低酸素 ·再酸素化モデル （イン ビトロ腎虚血再灌流モデル） を用い、 細胞傷害に対する L一 FABP強制発現の 影響を調べた。
前記実施例 1の （2) 項にて単離したヒト L— FABP染色体遺伝子 （全長） を含むプラスミ ドを線状化した後、 実施例 2の （3) 項と同様にして取得したマ ウス近位尿細管細胞 （クローン 24) にトランスフユクシヨンし、 安定な形質転 換細胞 （クローン 24— 1 9) を得た。 この細胞は、 ヒ ト L— FABPの染色体 遺伝子が欠失を受けることなく染色体上に組込まれていた。
上記で得たクローン 24—19および対照細胞としてクローン 24を、 各々嫌 気性チャンバ一 （COY社） 内で低酸素暴露を 24時間行った。 さらに、 これら 細胞を通常の大気中に戻して 24時間再酸素化した後、 細胞傷害度を測定した。 細胞傷害度は、 培地中に漏出した LDH (lactic dehydrogenas) を指標にして 測定した。
その結果、 図 6に示した通り、 ヒ ト L— FABP遺伝子を導入して強制発現さ せた細胞 （クローン 24— 19) では、 低酸素 ·再酸素化後に漏出した LDH活 性が、 対照細胞 （クロ一ン 24) と比較して低値を示し、 低酸素 ·再酸素化に対 してより抵抗性が強いことが示された。 このように、 L— FABPの強制発現に より、 低酸素 ·再酸素化時の細胞傷害に対する抵抗性が増大したことから、 近位 尿細管細胞に傷害を与える腎虚血再灌流などの状態にぉレ、て、 L— F A B Pは細 胞を保護する機能を果たすものと考えられた。
実施例 8 腎疾患モデルマウスに対する薬物の作用
腎疾患モデルとして、 アドリアマイシン誘発糸球体硬化症マウスを用い、 これ に対する PPAR作動薬 MCC— 555の効果を以下のように確認した。
アドリアマイシン （AD) 誘発糸球体硬化症マウスは、 ネフローゼ症状を呈し ながら、 3週間目には巣状糸球体硬化症になり、 不可逆的に慢性腎不全に到る病 態モデルである （Chenら、 N印 hron、 第 78卷、 第 440- 452頁、 1998年） 。 また、 M CC— 555は、 実施例 3、 4および 5にも示した通り、 L— FABP遺伝子発 現増強作用が確認されている化合物である。
マウスは、 7週齢の雌性 BALBZc (日本チヤ一ルスリバ一より購入） を用 いた。 実験開始日 （0日目） に、 アドリアマイシン （S i gma社製） を、 10 mg/k g (生理食塩液に lmg/m 1の濃度で溶解したものを 1 Om i Zk g) 静脈内投与した。 正常群には同容量の生理食塩液のみを静脈内投与した。 こ れらマウスに、 MCC— 555または担体のみを、 実験開始日から 14日間 （0 日目から 13日目まで） 経口投与した。 初回投与はアドリアマイシン投与の 1時 間前に行い、 投与液量はいずれも 10 m 1 k gとした。
薬物投与群 （n = 6) は、 アドリアマイシン投与マウスに MCC— 555 (0. 1 %Twe e n 80含有精製水に懸濁したもの） を 10 m g k gの用量で投与 した。 対照群 （n = 6) は、 アドリアマイシン投与マウスに担体 （0. l%Tw e e n 80含有精製水） のみを投与した。 また、 正常群 (n = 3) も担体のみを 投与した。
マウスは個別に代謝ケージに入れ、 自由摂食 ·摂水下で 24時間採尿した。 採尿は、 3〜4、 6〜7、 9〜： 10および 1 3〜： I 4日目の計 4回行った。 採取 した尿については、 尿量を測定後、 自動分析器 （Su p e r Z-818、 ニッテ ク） で尿中蛋白質、 NAG (N-acetyl- β -D-glucosarainidase) およびクレアチ ニン （creatinine： CRE) 濃度を測定した。 実験最終日 （14日目） の採尿後、 エーテル麻酔下に腹部大動脈より採血し、 血清を分離して、 自動分析器 (TBA — 80 F R、 東芝） でコレステロールおよびアルブミン濃度を測定した。 また腎 を摘出して中性緩衝ホルマリン液で固定した。
実験の結果、 図 7に示したように、 尿中蛋白質および近位尿細管障害の指標で ある NAG排泄量は、 対照群では AD投与後 7〜14日目に上昇した。 これに対 して薬物投与群では、 尿中蛋白質および NAG排泄量の上昇が有意に抑制された。 また、 14日目の血液生化学的検査の結果を図 8に示した。 図 8に示されたよ うに、 対照群では、 ネフローゼの主症状である高コレステロール血症、 低アルブ ミン血症の症状が認められた。 これに対して、 薬物投与群ではこれら症状が改善 されていた。
上記のように、 MCC— 555は、 腎疾患モデルマウス （アドレアマイシン誘 発糸球体硬化症モデル） に対して、 近位尿細管障害の指標となる NAG排泄を抑 制するとともに、 ネフローゼの主症状である蛋白尿や血液生化学的パラメ一タを 改善した。 さらに、 腎組織像を調べたところ、 MCC—555は、 同モデルマウ スの腎臓における組織学的変化も抑制していることが確認された。
実施例 9 ヒ ト型 L— FAB P遺伝子導入トランスジエニックマウスを用いた 腎疾患モデルに対する薬物の作用
ヒ ト型 L— FAB P遺伝子を導入したトランスジエニックマウス （hFABP —Tgマウス） を作製した。 この h F AB P— T gマウスを用いて、 以下のよう に、 実施例 8に準じた腎疾患モデルを作成し、 MCC— 555の作用を確認した。 h F AB P— T gマウスの作製においては、 13週齢以上の BCF 1系雄マウ スを不妊交配用および自然交配用に、 10週齢以上の I CR系雌マウスを胚移植 用および里親用に、 1 3週齢以上の BDF 1系雄マウスを交配用に、 8週齢以上 の BCF 1系雌マウスを採卵用に、 それぞれ使用した。 これにより得られたトラ ンスジエニックマウス （B 6C3 F 1系） について BALB/cマウスともどし 交配を行った。
得られた雌性トランスジエニックマウスを用いて、 腎疾患モデル （アドリアマ イシン誘発糸球体硬化症モデル） の作製と薬物 （MCC—555) の作用確認を 行った。 疾患モデルの作製と薬物の作用確認は、 前記実施例 8に準じた。 但、 実 験開始日 （0日目） に投与するアドリアマイシン （AD) の投与量は、 1 5mg /k g (生理食塩液に 1 mgZm 1の濃度で溶解したものを 1 5m 1 Zk g) と した。
薬物投与群 (n = 5) は、 アドリアマイシン投与マウスに MCC— 555 (1 Omg/k g) を投与し、 対照群 （実験開始時 n = 5) はアドリアマイシン投与 マウスに担体のみを投与した。 正常群 (n = 3) はアドリアマイシン非投与マウ スに担体のみを投与した。 採尿を、 6〜7日目 （Da y 7) 、 10〜 1 1日目
(Da y l l) 、 13〜： 14日目 （Da y l 4) の計 3回行い、 尿量測定後、 自 動分析器で尿中蛋白質、 NAGおよびクレアチニン濃度を測定した。
その結果、 図 9に示したように、 対照群では AD投与後、 尿中蛋白質および N AG排泄量が上昇したのに対して、 薬物 （MCC—555) 投与群ではこれらの 上昇が顕著に抑制された。 また、 対照群では、 実験期間中 3例が死亡したが、 薬 物 （MCC—555) 投与群では死亡例は認められなかった。
参考例 1 密度勾配遠心法による近位尿細管上皮細胞の単離および初代培養
(1) 近位尿細管細胞の分離
ヒ 4一 (Vinay) らの文献 (American Journal of Physiolog 第 241¾：、
F403-F411, 1981年） 記載の密度勾配遠心法に準じ、 以下のようにして、 マウス の腎臓から、 腎臓皮質部細胞を単離した。
マウス 2匹を断頭脱血後、 腎臓を摘出し、 これを冷ハンクス緩衝液 （Hank's buffered solution： HB S) で洗浄した後、 皮膜を摘除した。 次に、 皮膜から 皮質部のみを切り出し、 1〜2 cm角に細切した。 細切組織を HBSで軽く洗浄 後、 コラゲナーゼ溶液 (collagenase type4, 400 μ g/m 1 , HBS中） 5 m lを加えて 37°C、 30分間酵素処理を行った。 次いで、 5分間攪拌後、 ナイ ロンメッシュ （100 //m) で濾過して組織塊を除去し、 HBSで洗浄した。 こ れに HBS (lm l ) を加え、 軽くピペッティングして細胞懸濁液を調製した。 この細胞懸濁液を、 30<½— 50%パ一コール (P e r c o 1 1 ) 重層液に重 層した後、 遠心した （3500 r pm、 4°C、 30分間） 。 遠心後、 パーコール 密度勾配中に分離された各層 （上から画分 1〜4の 4層） の細胞を注意深く回収 した。
(2) 分離した細胞のアルカリフォスファターゼ染色
アルカリフォスファタ一ゼは、 腎臓では近位尿細管に局在することが知られて いる。 そこで、 上記 (1) で回収した各層の細胞の一部を採取し、 以下のように アルカリフォスファターゼ染色を行った。 すなわち、 細胞懸濁液を遠心した後、 プレパラートに固定し、 アルカリフォスファタ一ゼ基質キット （フナコシネ: を用いて染色後、 グリセロール封入した。 その結果、 最上層の画分 1において、 アルカリフォスファターゼ陽性率が最も高く、 従って、 近位尿細管細胞の含有率 も最も高いと考えられた。
(3) 近位尿細管上皮細胞の初代培養
上記 （1) の画分 1の細胞について、 以下のようにコラゲナ一ゼ処理した後、 初代培養を行った。 すなわち、 回収した細胞を、 HBSで 1回洗浄し、 コラゲナ ーゼ溶液 (collagenase type4, 2 mg m 1 , HB S中) 1 m 1を加えて 3 7°C、 5分間酵素処理を行った。 さらに HB Sで 2回洗浄した後、 培養に供した。 上皮細胞の初代培養の際には、 線維芽細胞が混入することが一般的に知られて おり、 芽細胞の増殖を抑制して上皮細胞だけを選択的に増殖させることが必 要となる。 このため、 培養に際しては、 （ i ) 線維芽細胞の増殖を選択的に阻害 する MEM/D— Va 1培地 （MEM培地の L—バリンを D—バリンに置換した 培地； G i b c o社製） にゥシ胎児血清を添加した培地、 および、 （ i i ) 上皮 細胞を特異的に増殖させるホルモンおよび成長因子を含み、 線維芽細胞の増殖に 関与する因子を含まない無血清 K 1培地 （50 ： 50 DMEM/Ham's F — 1 2、 1 5 mM H e p e s、 1 3. 4 mM sodium bi carbonate Λ 5 μ g /
1 insulin、 5 // gZm 1 transferrin^ 5 n g /m 1 selenous acid、 0. 0 5 μΜ hydrocortisone^ 1 0 n g /m 1 epidermal growth factor) を、 以下 のように組合せて用いた。
まず、 細胞を、 1 0°/。ゥシ胎児血清含有 MEM/D— V a 1培地にて：！〜 2日 培養し、 細胞の接着と増殖を確認した後、 培地を無血清 K1培地に交換して、 さ らに約一週間培養を継続した。 細胞は、 あらかじめ 0. 1 %ゼラチンでコーテン グしたプレートに播種し、 co2インキュベータ一内で培養した。
(4) 細胞の形態学的解析
前項 （3) の培養細胞を、 位相差顕微鏡にて観察したところ、 敷石状の細胞増 殖が認められた。 また、 細胞がコンフルェントになる頃に、 ドーム形成が認めら れた。 これら所見は、 溶質溶媒の経上皮輸送が行われていることを示唆している。 これらのこと力 ら、 得られた培養細胞は、 尿細管上皮細胞であることが形態学的 に確認された。
(5) アルブミン取込み能 近位尿細管細胞は、 アルブミン等の取り込み能を有することが知られている。 そこで、 前項 （3) の培養細胞について、 アルブミンの取り込み能を、 以下のよ うに調べた。 細胞を、 10 c mディッシュでコンフルェントになるまで培養した 後、 培地を MEMZD— Va 1培地に交換し、 ー晚培養した。 ついで、 ゥシ血清 アルブミン （bovine serum albumin： BSA) を、 終濃度が 50 m g / 1 Om l になるよう培地に添加し、 37。C、 90分間培養を行った。 コントロールとして は、 同様の細胞を用い、 水上でインキュベーションを行った。 培養後、 細胞をリ ン酸緩衝食塩水 (phosphate buffered saline： PBS) (p H 7.4) で洗浄し た後、 回収した。 この細胞を、 プロテア一ゼ阻害剤 (protease inhibitor) を含 む PBS (pH9.6) 200 1に懸濁した後、 超音波破砕した。 破 に P
B S (p H6.4) を加えて p Hを中性領域に戻した後、 遠心 （1 2000 r p m、 1 5分間） して上清を、 細胞抽出液として回収した。 得られた細胞抽出液に ついて、 83八の存在を£し I S A法にて測定した。
EL I SAには、 一次抗体として、 抗アルブミン抗体 （ゥサギポリクロ一ナル 抗体、 S i gma社製） を用い、 二次抗体としては、 ピオチン標識した抗アルブ ミン抗体を用いた。 一次抗体を 96穴ィムノプレートに吸着させた後、 前記細胞 抽出液 （Ι Ο Ο μ 1 Ζ穴） を加えて室温で 2時間反応させ、 次いで、 二次抗体希 釈液を添加し、 室温で 2時間反応させた。 ゥエルを洗浄した後、 ストレプトアビ ジンおよびビォチン標識ヮサビペルォキシダーゼを含む検出キット （ベクターラ ボラトリー社製、 ベクタスティン ABC— POキット） を用いて発色検出を行つ た。
その結果、 アルブミン添加条件下 37 °Cで培養することにより、 コントロール の 2.3倍量の B S A取り込みが認められた。 このことから、 細胞は、 近位尿細 管細胞としての生理的機能を有することが確認された。
(6) ホルモンに対する応答能
近位尿細管細胞は、 上皮小体ホルモン （PTH) に応答して細胞内 c AMP産 生が誘導されるが、 バソプレツシン （AVP) には応答しないことが知られてい る。 前項 （3) の培養細胞について、 以下のとおりこれらホルモンに対する応答 能を調べた。 „
27 細胞を、 24穴プレートでコンフルェントになるまで培養した後、 細胞表面を 培地 （MEMZD— Va 1培地） で 2回洗浄した。 これに、 PTH (10"7 M) または A VP (1 U/m 1 ) を、 I BMX ( 3—イソブチル 1—メチルキサ ンチン； c AMPホスホジエステラーゼ阻害剤） （10_4M) とともに添カロし た培地を加えた。 コントロールとしては、 I BMXのみを添加した培地を加えた。
37°Cで 10分間反応させた後、 細胞および培養液中の c AMPを 65%ェタノ —ルで抽出し、 c AMP量を E L I S A法 （Amersham社製の c AMP E I Aシ ステムキットを使用） により測定した。
その結果、 PTH刺激を行った場合、 コントロールに対して約 1.6倍の細胞 内 c AMP量が認められ、 このことから、 この初代培養には近位尿細管細胞が含 まれることが確認された。 一方、 A VP刺激時においても、 コントロールの 約 4.6倍の c AMP量が認められたことから、 近位尿細管細胞に由来しない細 胞もいくらか混入しているものと考えられた。
配列表フリーテキスト
配列番号 1のフリーテキスト
<223> G AT Aシグナル （GATA— signal)
く 223〉 ペルォキシソ一ムプロリフエレータ応答配列 （peroxisome
proliferator responsive element (PP REノノ
く 223〉 へパティックヌクレアファクタ一 （HNF) 結合サイ ト （hepatic nuclear factor (HN binding-site;
く 223〉 ヒポキシァ誘導因子 （HI F) 結合サイト （hypoxia inducible factor (HIr binding-site)
産業上の利用の可能性
本発明の方法によれば、 新規な腎疾患治療薬および/または予防薬を的確に効 率よくスクリーニングすることができる。 また、 本発明の方法により同定され特 徴付けされた治療薬および Zまたは予防薬 （あるいは本発明の治療薬および Zま たは予防薬） は、 作用機序の明確な優れた腎疾患治療薬および Zまたは予防薬と なる。 また、 本発明の新規細胞株は、 近位尿細管上皮細胞としての生理的特徴を よく維持しており、 腎疾患治療薬などの研究開発などに有用である。

Claims

求 の 範 囲
1 . 動物細胞における脂肪酸結合蛋白質の発現に対する被験物質の増強作用を 検定することを特徴とする、 腎疾患治療薬もしくは予防薬のスクリ一二ング方法 または同定方法。
2. 脂肪酸結合蛋白質が肝型脂肪酸結合蛋白質である請求項 1記載の方法。
3 . 動物細胞が腎臓の細胞または組織である請求項 1または 2記載の方法。
4 . 動物細胞が近位尿細管細胞である請求項 1または 2記載の方法。
5 . 脂肪酸結合蛋白質遺伝子の転写調節領域とその下流に連結されたレポータ —遺伝子からなる D N A構成が導入された細胞を用いるレポ一ターアツセィによ り、 被験物質の作用を検定する工程を含む、 請求項 1記載の方法。
6 . ( 1 ) 動物細胞を被験物質の存在下および非存在下で培養する工程；およ び （2 ) 動物細胞中の脂肪酸結合蛋白質の発現量を決定するとともに、 被験物質 存在下での発現量と、 被験物質非存在下での発現量を相互に比較する工程；を含 む請求項 1記載の方法。
7 . 請求項 1〜6いずれか 1項記載の方法により、 選択または同定された腎疾 患治療薬もしくは予防薬。
8 . 脂肪酸結合蛋白質の発現を増強する作用を有する薬物を有効成分とする腎 疾患治療薬もしくは予防薬。
9 . 脂肪酸結合蛋白質の発現を増強する作用を有する薬物が、 腎臓の細胞また は組織における脂肪酸結合蛋白質の発現を増強する作用を有する薬物である請求 項 8記載の治療薬もしくは予防薬。
1 0 . 脂肪酸結合蛋白質が肝型脂肪酸結合蛋白質である請求項 8記載の治療薬 もしくは予防薬。
1 1 . 腎疾患が、 糖尿病性腎症、 糸球体腎炎、 ネフローゼ症候群、 巣状糸球体 硬化症、 免疫複合体腎症、 ループス腎炎、 薬剤性腎障害おょぴ腎不全から選択さ れるものである、 請求項 7〜1 0のいずれか 1項記載の治療薬もしくは予防薬。
1 2 . ペ^^オキシソームプロリフエ I タ活性化受容体 （P P A R) のァゴニ スト作用を有する化合物、 またはカルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ (CPT) の阻害作用を有する化合物からなる、 脂肪酸結合蛋白質の発現増強薬。
13. ペルォキシソームプロリフエレ一タ活性化受容体 （PPAR) のァゴニ スト作用を有する化合物を有効成分とする、 腎疾患治療薬もしくは予防薬。
14. カルニチンパルミ トイルトランスフェラーゼ （CPT) の阻害作用を有 する化合物を有効成分とする、 腎疾患治療薬もしくは予防薬。
1 5. 腎疾患が、 糖尿病に起因する腎疾患ではない請求項 7、 8、 9、 10、 1 3または 14記載の治療薬もしくは予防薬。
1 6. 腎疾患が、 糸球体腎炎、 ネフローゼ症候群、 巣状糸球体硬化症、 免疫複 合体腎症、 ループス腎炎、 薬剤性腎障害および腎不全から選択されるものである 請求項 7、 8、 9、 10、 1 3または 14記載の治療薬もしくは予防薬。
1 7. 腎疾患が、 ネフローゼ症候群、 巣状糸球体硬化症および薬剤性腎障害か ら選択されるものである請求項 7、 8、 9、 10、 13または 14記載の治療薬 もしくは予防薬。
18. マウスの近位尿細管の細胞から樹立された不死化細胞株であって下記の (1) 、 (2) および （3) の性質を有する細胞株。
(1) 上皮細胞の形態を有する。
(2) アルブミン取り込み能を有する。
(3) 上皮小体ホルモンによる刺激に応答して細胞内 c AMP産生が誘導される 、 バソプレツシンによる刺激には応答しない。
1 9. ヒト肝型脂肪酸結合蛋白質遺伝子の転写調節領域とその下流に連結され たレポーター遺伝子からなる DNA構成が導入されている、 請求項 18記載の細 胞株。
20. マウス細胞株 mP r o X 37— 13 (FERM BP— 7038) 。
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