WO2000060094A1 - Lactocoques modifies exprimant une catalase et leurs utilisations - Google Patents

Lactocoques modifies exprimant une catalase et leurs utilisations Download PDF

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WO2000060094A1
WO2000060094A1 PCT/FR2000/000885 FR0000885W WO0060094A1 WO 2000060094 A1 WO2000060094 A1 WO 2000060094A1 FR 0000885 W FR0000885 W FR 0000885W WO 0060094 A1 WO0060094 A1 WO 0060094A1
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catalase
strain
cells
bacteria
gene
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PCT/FR2000/000885
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Anne Bravard
Patrick Duwat
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Institut National De La Recherche Agronomique (Inra)
Commissariat A L'energie Atomique (Cea)
DUWAT, Charlotte
DUWAT, Coralie
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0065—Oxidoreductases (1.) acting on hydrogen peroxide as acceptor (1.11)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
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    • A23L29/065—Microorganisms
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2400/00—Lactic or propionic acid bacteria
    • A23V2400/11—Lactobacillus
    • A23V2400/157—Lactis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to modified probiotic bacteria expressing antioxidant molecules.
  • Free radicals derived from oxygen are continuously produced by normal cellular metabolism, and in particular during the reduction of molecular oxygen to H 2 0 by the respiratory chain.
  • the term “free radicals derived from oxygen” is used to denote a set of chemical species including in particular the superoxide anion 0 2 ⁇ , the hydroxyl radicals OH, the oxygen smgulet î0 2 *, the peroxyl radicals ROO, as well as hydrogen peroxide, H 2 0 2 .
  • These species are extremely reactive and capable of damaging cellular constituents such as ADM, proteins, and me ⁇ uoranary pnospholipi ⁇ es [FRIDOVICH, Science, 201, 875-880, (1978); PRYOR, Photochem.
  • Oxygenated radicals are therefore potentially toxic and mutagenic, and they are involved in particular in the development of inflammatory reactions and carcmogenesis. However, they also participate in the proper functioning of the cell: they are for example involved in the control of cell proliferation [REMACLE et al., Mutation Res., 316, 103-122, (1995)], as well as in resistance infectious agents.
  • the cells have antioxidant enzymes (superoxide dismutase, catalase, glutathione peroxidase, etc.), and radical-scavenging molecules (glutathione, vitamin E, etc.). ) [RICE-EVANS and BURDON, New Comprehensive Biochemistry, 28, (1994)]. These natural mechanisms of However, protection is insufficient in the event of oxidative stress resulting from the overproduction of oxygenated free radicals, in particular during exposure to ionizing radiation or to certain chemical substances. Several studies carried out on animal models have thus shown modifications of the antioxidant metabolism in different organs after exposure to ionizing radiation [PELTOLA et al., J.
  • Probiotic organisms are defined as: "living organisms which after ingestion in certain quantities have beneficial health effects going beyond the inherent nutritive properties of oase” [F.A.O. , (1992)].
  • Probiotic bacteria are non-pathogenic bacteria that can have a beneficial impact on the health of their host. They are generally lactic acid bacteria of the genera Lactobacillus, Bif dobacterium, Streptococcus and Lactococcus, commonly used in the dairy industry. These bacteria are able to survive in the digestive tract where they remain metabolically active without supplanting the intestinal microflora [SALMINEN et al., Antonie van Leeuwenhoek, 70, 347-358, (1996)].
  • milk fermented with lactobacilli or lactococci would: a) increase the survival of mice after irradiation; b) to reduce the diarrhea of patients occurring following radiation treatment [SALMINEN et al., Clinic. Radiol., 39, 435-437, (1988);
  • probiotic bacteria mainly lactobacilli
  • the lactic acid bacteria used as probiotics have only very weak detoxification capacities for oxygen radicals. In fact, most of them do not have all of the enzymatic equipment necessary to neutralize these radicals [CODON, FEMS Microbiol. Rev. , 46, 269-280, (1987)].
  • the inventors have investigated whether it is possible to express active antioxidant enzymes in these probiotic bacteria without interfering with their natural metabolism.
  • Lactococcus lactis has no natural catalase activity, and therefore does not a priori provide the environment necessary for the expression of this activity; in particular, does not manufacture the heme constituting the prosthetic group of catalases.
  • the inventors have however managed to express the heterologous catalase in active form, by adding heme to the culture medium of L. lactis; they indeed found that heme was imported into the bacterium and normally integrated into the synthesized catalase, and that the expression of this active catalase did not harm the growth and survival of L. lactis.
  • the inventors have found that the expression of the heterologous catalase protects against oxidative stress not only the host bacteria, but also the other bacteria present in the same culture.
  • the present invention relates to a lactococcus strain, in particular a strain of Lactococcus lactis, transformed by a gene coding for a heterologous catalase.
  • said gene codes for a prokaryotic catalase.
  • said gene is the ka t ⁇ gene from 3. subtilis.
  • the present invention also relates to a process for the production of a catalase by a strain of lactococcus according to the invention, characterized in that it comprises the cultivation of said strain in the presence of hè e.
  • the present invention also relates to the use of a lactococcal strain according to the invention for obtaining a medicament intended to protect cells against oxidative stress.
  • Said cells are in particular cells of the intestinal wall, in particular of the intestinal epithelium. It can also be bacteria of the intestinal flora; the administration of a lactococcal strain in accordance with the invention makes it possible to protect, in the event of oxidative stress, the bacterial species sensitive to stress, and thus to maintain the balance of the intestinal flora.
  • said medicament makes it possible to protect said cells against oxidative stress induced by radiation, and is therefore particularly suitable for the treatment of gastrointestinal affections consecutive to radiotherapy. It can however also be used in any other pathology gastrointestinal in which there is an excessive production of oxygenated free radicals, and in particular all inflammatory pathologies.
  • the present invention makes it possible to route in a simple manner, and at low cost, the molecules of therapeutic interest directly in the vicinity of cells sensitive or exposed to oxidative stress without affecting the organism as a whole.
  • the present invention further relates to a method for protecting m vi tro of cells against oxidative stress, characterized in that it comprises bringing the cells to be protected and at least one strain of lactococcus in accordance with the invention, under the conditions defined above, for the production of catalase by said strain.
  • said cells are probiotic bacteria, in particular lactic acid bacteria.
  • the process according to the invention can thus be implemented for the preparation of a fermented food associating at least one strain of lactococcus according to the invention with other probiotic bacteria.
  • the present invention also encompasses any fermented food comprising at least one strain of lactococcus according to the invention, possibly associated with other probiotic bacteria.
  • Fermented foods according to the invention act on two levels: on the one hand, by the presence of the lactococci according to the invention, they have a direct detoxification effect of free radicals which makes it possible to protect the intestinal epithelium and microflora; on the other hand, by the probiotic action of the lactococci in accordance with the invention, as well as of the other bacteria which are possibly associated therewith, these foods act as a protector of the intestinal epithelium and a barrier against pathogens.
  • the present invention will be better understood with the aid of the additional description which follows, which refers to non-limiting examples describing the production and use of a bacterial strain according to the invention.
  • EXAMPLE 1 OBTAINING A STRAIN OF L. LACTIS EXPRESSING THE kATB GENE FROM B. SOBTIL
  • the ka tB gene from Ba cill us subtilis codes for a catalase (SWISS-PROT access number: P42234), the synthesis of which is induced in Bacill us subtilis during thermal or saline stress, the addition of ethanol or glucose deprivation.
  • the ka tB gene was amplified by PCR from the chromosome of strain 168 ⁇ e B. subtilis [ANAGNOSTOPOULOS and SPITZIZEN, J.
  • This fragment was then cloned, under the control of the promoter of the ⁇ -galactosidase gene at the Xbal-Xhol sites of pBSKS + (STRATAGENE) in the strain E. coli TG1.
  • the plasmid obtained was then transferred to the strain MG1655 katE katG from E. coli [DUKAN and TOUATI, J. Bacteriol., 178, 6145-6150, (1996)] devoid of catalase activity.
  • the catalase activity was sought according to the protocol described by AERI, [Methods in Enzymology, 105, 121-127, (1984)]. No catalase activity was observed under these conditions.
  • the p23 promoter [VAN DER VOSS ⁇ N et al., Appl. About. Microbiol., 53, 2452-2457, (1987)] by L. lactis was then cloned into the NotI-Xbal sites of the plasmid pBSKSkatB.
  • a transformed catalase activity is determined in the transformed strain, determined according to the protocol indicated above.
  • NotI-Xhol fragment containing the p23 promoter and the ka tB gene was then transferred to the plasmid pILNewl3 [RENAULT et al., Gene, 183, 175-182,
  • the plasmid pILN13p23KatB was introduced into strain 168 of B. subtilis, and a low copy number derivative of this plasmid was made by deleting a Kpnl fragment.
  • the resulting plasmid, called pILN5p23KatB, was then introduced into the strain MG1363 from L. lactis [GASSON, J.
  • E. coli and pVS41 [VON WRIGHT and 3AARELA, Plasmid, 31, 106-110, (1994)] (high copy number plasmid replicating by a so-called rolling circle mechanism in E. coli and L. lactis) containing the promoter p23 and the ka tB gene has also been introduced into several strains of E. coli and L. lactis where catalase activity could be observed under the conditions previously described.
  • EXAMPLE 2 JN VITRO ANTI-OXIDANT EFFECTS OF A STRAIN OF L. LACTIS EXPRESSING THE kATB GENE FROM B. SUBTIL
  • the bacteria are seeded from a frozen stock culture in 5 ml of M17 medium supplemented with 1% glucose (M17glu) and then incubated at 30 ° C for 18 hours. The culture is then diluted 1/1000 in M17glu medium, supplemented with hemin at a concentration of 50 mg / ml, then incubated at 30 ° C for 24 hours. Before the test, the bacteria are centrifuged and resuspended in M17, at a concentration of 10 3 cells / ml.
  • the bacteria are seeded from a frozen stock culture in 5 ml of M17glu medium and then incubated at 30 ° C for 18 hours. The culture is then diluted 1/1000 in M17glu medium, then incubated at 30 ° C until the time of the test.
  • the bacteria are seeded from a frozen stock culture in 5 ml of LB medium and then incubated at 30 ° C for 18 hours. The culture is then diluted 1/1000 in LB medium, then incubated at 37 ° C with shaking until the time of the test.
  • Lactobacillus fer entum The bacteria are seeded from a frozen stock culture, in 5 ml of MRS medium and then incubated at 37 ° C for 18 hours in an anaerobiosis jar. The culture is then diluted 1/1000 in MRS medium, then incubated at 37 ° C until the time of the test. Induction of stress
  • an oxidative stress is induced by adding 10 mM H 2 O 2 to the culture medium, and incubation for 30 minutes at 30 ° C for and 37 ° C for Eschericnia coli and Lactoba cill us fermen tum.
  • the percentage of surviving bacteria is estimated by spreading on samples of successive dilutions the samples taken from the cultures before and at the end of the treatment, and counting the colonies.
  • the catalase producing strain makes it possible to protect an L strain.
  • the non-catalase-producing side the survival of 10 3 less catalase lactococci is 10 "4 ; it increases by 50 times in the presence of 10 7 catalase plus lactococci, and it is 100% in the presence of 10 8 catalase plus lactococci.
  • the catalase producing strain makes it possible to protect a strain of Escheri chia col i which does not produce catalase: the survival of 10 8 E. col i is 10 "3 ; it increases by 50 times in the presence of 10 7 lactococci catalase plus, and it is 100% in the presence of 10 8 lactococci catalase plus. On the other hand, survival is not improved in the presence of lactococci catalase minus (results not shown).
  • the catalase-producing strain makes it possible to protect a strain of Lactobacillus fermentum which does not produce catalase: the survival of 10 8 L. fermen tum is 5 x 10 " ⁇ ; it increases by 200 times in the presence of 10 7 catalase plus lactococci, and it is 3 x 10 " 2 in the presence of 10 8 catalase plus lactococci. On the other hand, survival is not improved in the presence of less catalase lactococci (results not shown).
  • the introduction to the catalase gene increases the resistance of L. the cti s to oxidative stress.
  • the protective effect of the catalase expressed by the ka tB gene introduced into Lactococcus lactis was tested on human colonic cells in culture exposed to stress induced by an oxidizing product (H 2 0 2 ).
  • Human cells cells of the human colonic epithnial line HT29 Experimental protocol: the cells are seeded in a 96-well plate (2000 cells per well). At least 8 different wells are produced for each experimental condition. After 3 days of culture, the culture medium is removed and replaced with culture medium for eukaryotic cells containing the bacteria to be tested (5 ⁇ 10 8 per ml of culture), previously cultivated as indicated in 1) above.
  • CAT- or producing catalase (CAT-) on the survival of HT29 cells after incubation with 0, 100, 200 or 400 ⁇ M of H 2 0 2 .
  • control Statistically significant differences by compared to cells incubated without bacteria (control) are indicated:
  • the unmodified bacteria also have a protective effect.
  • L. unmodified ctis can provide some protection against oxidative stress, but protection is much more effective in the presence of L. the ctis producing the catalase.
  • HT29 cells are seeded at 2000 cells per well in a 96-well plate. At least 8 different wells are made for each experimental condition. After 3 days of culture, the plates are irradiated at 2 Gy using a source of cobalt 60. The bacteria at two different concentrations (10 7 and 10 3 / 0.2 ml) are added, ie 1 hour before l irradiation, either 24 or 48 hours after and left in contact with the cells for 3 hours. The effect of the irradiation on cell growth is estimated after 5 days of culture by the MTT technique.
  • L. lactis protects HT29 cells against the effects of ionizing radiation. This protective effect is reinforced with L. lactis producing catalase.
  • Animals male C 3 H / He mice aged 9 weeks at the time of irradiation Food: the day before irradiation, the animals are fed standard ground kibbles to which are added the cultures of bacteria or the culture medium for the controls (1 ml / g of kibble). Food is renewed every day for the duration of the experiment, the animals are divided into 6 groups of 5 individuals: 5 irradiated ingesting culture medium without bacteria and 5 non-irradiated controls fed in the same way; 5 irradiated ingesting L. unmodified lactis and 5 non-irradiated controls fed in the same way, 5 irradiated ingesting L. lactis producing catalase and 5 non-irradiated controls fed in the same way.
  • Irradiation after anesthesia, the animals are exposed to abdominal irradiation of 10 Gy using a source of cobalt 60.
  • the feeding protocol is the same as that followed for abdominal irradiation.
  • the animals, placed in the plexiglass tubes, are irradiated every morning for 5 days at a dose of 3Gy using a source of Cobalt 60.
  • Weight monitoring the animals are weighed each day at the same time throughout the duration of experience.

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Abstract

L'invention est relative à des souches de lactocoques, notamment de L. lactis, transformées par un gène codant pour une catalase hétérologue. Les souches sont notamment utilisables pour protéger des cellules procaryotes ou eucaryotes contre un stress oxydant.

Description

LACTOCOQUES MODIFIES EXPRIMANT UNE CATALASE ET LEURS UTILISATIONS La présente invention est relative a des bactéries probiotiques modifiées exprimant des molécules anti-oxydantes.
Des radicaux libres dérives de l'oxygène sont continuellement produits par le métabolisme cellulaire normal, et notamment lors de la réduction de l'oxygène moléculaire en H20 par la chaîne respiratoire. On désigne sous le terme de : " radicaux libres dérives de l'oxygène " un ensemble d'espèces chimiques regroupant notamment l'anion superoxyde 02~ , les radicaux hydroxyle OH , l'oxygène smgulet î02 * , les radicaux peroxyles ROO , ainsi que l'eau oxygénée, H202. Ces espèces sont extrêmement réactives et capables d'endommager des constituants cellulaires tels que 'ADM, les protéines, et les pnospholipiαes meπuoranaires [FRIDOVICH, Science, 201, 875-880, (1978) ; PRYOR, Photochem. Photobiol., 28, 787-801, (1978) ; CERUTTI, Science, 227, 375-381, (1985) ; BOREK, Br. J. Cancer, 55, 74-86, (1987)]. Les radicaux oxygénés sont donc potentiellement toxiques et mutagenes, et ils interviennent notamment dans le développement des réactions inflammatoires et la carcmogenèse . Cependant, ils participent également au bon fonctionnement de la cellule : ils sont par exemple impliques dans le contrôle de la prolifération cellulaire [REMACLE et al., Mutation Res., 316, 103-122, (1995)], ainsi que dans la résistance aux agents infectieux. Pour contrôler le niveau des radicaux libres oxygénés produits en conditions physiologiques, les cellules disposent d'enzymes antioxydantes (superoxyde dismutase, catalase, glutathion peroxydase, etc...), et de molécules piegeuses de radicaux (glutathion, vitamine E,...) [RICE-EVANS et BURDON , New Comprehensive Biochemistry, 28, (1994)]. Ces mécanismes naturels de protection sont toutefois insuffisants en cas de stress oxydant résultant de la surproduction de radicaux libres oxygénés, notamment lors de l'exposition à des radiations ionisantes ou à certaines substances chimiques. Plusieurs études réalisées sur des modèles animaux, ont ainsi montré des modifications du métabolisme antioxydant dans différents organes après exposition à des radiations ionisantes [PELTOLA et al., J. Androl., 14, 267-274, (1993) ; HARDMEIER et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 7572-7576, (1997)]. Dans la muqueuse intestinale, une étude ancienne met en évidence une baisse importante de l'activité antioxydante (BARBER et WILBUR, Radiation Res., 10, 167-175, (1959)] ; plus récemment, une baisse de vitamine 312 (molécule antioxydante) a été décrite [DANNIELSSON et al., Gut, 32, 1180-1187, (1991)]. Chez l'homme, le traitement par radiothérapie des tumeurs abdominales induit une toxicité intestinale qui entraine l'interruption du traitement chez 20% des patients [BLAIR et al., J. Surg. Res., 65, 165-168, (1996)]. Au niveau de l'épithéliu intestinal, cette toxicité se traduit par une réduction du nombre et de la taille des villosités et par l'apparition de zones nécrosées [FRIBERG, Thesis, (Jniversity of Lund, Sweden, (1980) ; HAUER-JENSEN, Acta Oncol., 29, 401-415, (1990) ; POTTEN, Nature, 269, 518-529, (1977) ; POTTEN, Int. J. Radiât. Biol., 58, 925-973, (1990)].
Cet effet direct sur la muqueuse gastrointestinale est en outre aggravé par une translocation de la microflore intestinale [DANNIELSSON et al., Gut, 32, 1180-1187, (1991)], résultant de la destruction d'une grande partie de celle-ci, composée de bactéries anaerobies présentant une très grande sensibilité aux stress oxydants [WELLS, Antonie van Leeuwenhoe , 58, 87- 93, (1990) ; BENNO et MITSUOKA, J. Vet. Med. Sci., 54, 1039-1041, (1992)], et du développement de bactéries pathogènes se traduisant par l'apparition d'infections. Des études ont mis en évidence l'efficacité des antioxydants contre les effets mutagènes et toxiques des radiations ionisantes. Certains dérivés sulfhydryle s'avèrent très efficaces m vi tro ; malheureusement leur forte toxicité m vivo limite leur utilisation chez l'homme [DELANEY et al., Cancer, 74, 2379-2384, (1994) ; PRASAD, Handbook of Radiobiology, 2nd édition, 61-84, (1995)]. L'effet protecteur d'autres molécules antioxydantes (telle que la vitamine E) a été observé après irradiation ex vi vo du tractus digestif [MAISIN et LAMBIET-COLLIER, Int. J. Radiât. Biol., 13, 35-43, (1967)] ; FΞLEMOVICIUS et al., Ann . Surg. 222, 504-508, (1995)]. De plus, une tude récente de BLAIR et al., (1996) suggère un effet protecteur m vivo L-2-oxo-4- tniazolidme, précurseur au glutathion, qui permettrait de limiter le syndrome gastro-intestinal en diminuant, entre autres, la translocation bactérienne.
Pour protéger l'épithélium intestinal et réduire la translocation de la microflore intestinale, il a également été proposé d'utiliser des bactéries probiotiques.
Les organismes probiotiques sont définis comme des : "organismes vivants qui après ingestion en certaines quantités exercent des effets bénéfiques pour la santé allant au-delà des vertus nutritives inhérentes de oase" [F.A.O. , (1992) ] .
Les bactéries probiotiques sont des bactéries non-pathogènes pouvant influer de manière bénéfique sur la santé de leur hôte. Il s'agit généralement de bactéries lactiques des genres Lactobacillus , Bif dobacterium , Streptococcus et Lactococcus , couramment utilisés dans l'industrie laitière. Ces bactéries sont capable de survivre dans le tractus digestif où elles restent métaboliquement actives sans supplanter la microflore intestinale [SALMINEN et al., Antonie van Leeuwenhoek, 70, 347-358, (1996)]. Leur durée de transit dans le tractus digestif est variable et va d'une journée pour Lactococcus lactis , à neuf jours pour La ctoba cillus plan tarum [WELLS et al., Antonie van Leeuwenhoek, 70, 317-330, (1996)]. Au cours αes dernières années, de nombreuses études, parfois contradictoires, sur les effets de l'ingestion d'aliments fonctionnels (tel que les yaourts) ou de bactéries ont été publiées. Certaines d'entre elles décrivent un effet positif de l'ajout de probiotiques dans l'alimentation vis-a-vis des conséquences d'un stress oxydant, induit par exemple par une radiothérapie. Ainsi, des laits fermentes par des lactobacilles ou des lactocoques permettraient : a) d'augmenter la survie de souris après irradiation ; b) de diminuer les diarrhées de patients survenant à la suite de traitement par rayonnements [SALMINEN et al., Clinic. Radiol., 39, 435-437, (1988) ;
HENRIKSSON et al., Supp. Care Cancer, 3, 81-83, (1995)], et c) de favoriser la réimplantation de la microflore autochtone [CUZZOLIN et al., J Chemother, 4, 176-179 (1992)].
L'ingestion de bactéries probiotiques (principalement des lactobacilles) aurait également un effet contre le développement des pathogènes ; ainsi, elle limiterait les infections par Salmonella typhimuri um
[ALM, Prg. Fd. Nutr. Sci., 7, 13-17, (1983)] ; HUDAULT et al., Appl. Environ. Microbiol., 63, 513-518, (1997)], Listeπa monocytogenes [SATO, Infect Immun., 44, 445-451,
(1984)], Escheπchia coli [UNDERDAHL, Prog. Fd. Nutr.
Sci., 7, 5-12, (1983)] et protégerait des souris immunodépnmées contre le développement de candidioses
[WAGNER et al., Infect Immun. 65, 4165-4172, (1997)]. La mobilité intestinale semble également être augmentée par l'ingestion de lait fermenté avec des bifidobactéries [SEKI et al., Nutr. Food, 4, 379-387, (1978)].
'Cependant, les bactéries lactiques utilisées en tant que probiotiques ne possèdent que de très faibles capacités de détoxication des radicaux oxygénés. En effet, la plupart d'entre elles ne possède pas l'ensemble de l'équipement enzymatique nécessaire à la neutralisation de ces radicaux [CODON, FEMS Microbiol. Rev. , 46, 269-280, (1987) ] . Les Inventeurs ont recherché s'il était possible d'exprimer chez ces bactéries probiotiques des enzymes antioxydantes actives, sans pour autant interférer avec leur métabolisme naturel.
Dans ce but, ils ont entrepris le clonage chez Lactococcus lactis d'un gène codant pour une catalase
(EC 1.11.1.6). Lactococcus lactis ne possède aucune activité catalase naturelle, et ne fournit donc pas a priori l'environnement nécessaire à l'expression de cette activité ; notamment, ne fabrique pas l'hème constituant le groupe prosthétique des catalases. Les Inventeurs sont toutefois parvenus à exprimer la catalase hétérologue sous forme active, en ajoutant de l'hème au milieu de culture de L . lactis ; ils ont en effet constaté que l'hème était importée dans la bactérie et normalement intégrée dans la catalase synthétisée, et que l'expression de cette catalase active ne nuisait pas à la croissance et à la survie de L . lactis .
En outre, les Inventeurs ont constaté que l'expression de la catalase hétérologue protégeait contre un stress oxydant non seulement les bactéries-hôte, mais également les autres bactéries présentes dans la même culture .
De plus, ils ont également constaté que les lactocoques transformés exprimant la catalase hétérologue protégeaient in vi tro des cellules d'épithélium intestinal en culture contre les effets d' un stress oxydant induit notamment par un rayonnement ionisant, et possédaient également in vivo des effets protecteurs sur des souris irradiées, en présence ou en absence de bactéries pathogènes. La présente invention a pour objet une souche de lactocoque, en particulier une souche de Lactococcus lactis , transformée par un gène codant pour une catalase hétérologue .
Selon un mode de réalisation préféré de la présente invention, ledit gène code pour une catalase procaryote. Selon une disposition préférée de ce mode de réalisation, ledit gène est le gène ka tΞ de 3. subtilis .
La présente invention a également pour objet un procédé de production d'une catalase par une souche de lactocoque conforme à l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend la mise en culture de ladite souche en présence d'hè e.
La présente invention a aussi pour objet l'utilisation d'une souche de lactocoque conforme à l'invention pour l'obtention d'un médicament destiné à protéger des cellules contre un stress oxydant.
Lesdites cellules sont notamment des cellules de la paroi intestinale, en particulier de l'épithélium intestinal. Il peut également s'agir des bactéries de la flore intestinale ; l'administration d'une souche de lactocoque conforme à l'invention permet de protéger, en cas de stress oxydant, les espèces bactériennes sensibles au stress, et ainsi de maintenir l'équilibre de la flore intestinale . Selon un mode de mise en œuvre préféré de la présente invention, ledit médicament permet de protéger lesdites cellules contre un stress oxydant induit par un rayonnement, et est donc particulièrement approprié pour le traitement des affections gastrointestinales consécutives à une radiothérapie. Il peut toutefois également être utilisé dans toute autre pathologie gastro-intestinale dans laquelle intervient une production excessive de radicaux libres oxygénés, et notamment toutes les pathologies inflammatoires . La présente invention permet d'acheminer de façon simple, et a faible coût, les molécules d'intérêt tnerapeutique directement au voisinage des cellules sensibles ou exposées aux stress oxydants sans affecter l'organisme dans sa totalité.
La présente invention a en outre pour objet un procédé pour protéger m vi tro des cellules contre un stress oxydant, caractérisé en ce qu'il comprend la mise en présence des cellules à protéger et d'au moins une souche de lactocoque conforme a l'invention, dans les conditions définies ci-dessus, de production de catalase par ladite souche.
Selon un mode de mise en œuvre préféré de ce procédé, lesdites cellules sont des bactéries probiotiques, notamment des bactéries lactiques. Le procédé conforme à l'invention peut ainsi être m s en œuvre pour la préparation d'un aliment fermenté associant au moins une souche de lactocoque conforme à l'invention à d'autres bactéries probiotiques.
La présente invention englooe également tout aliment fermenté comprenant au moins une souche de lactocoque conforme a l'invention, éventuellement associée à d'autres bactéries probiotiques.
Des aliments fermentes conformes à l'invention agissent à deux niveaux : d'une part, de par la présence des lactocoques conformes à l'invention, ils ont un effet direct de détoxication des radicaux libres ce qui permet de protéger l'epithélium intestinal et la microflore ; d'autre part, de par l'action probiotique des lactocoques conformes à l'invention, ainsi que des autres bactéries qui y sont éventuellement associées, ces aliments agissent en tant que protecteur de l'epithélium intestinal et de barrière contre les pathogènes. La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples non-limitatifs décrivant l'obtention et l'utilisation d'une souche bactérienne conforme à l'invention.
EXEMPLE 1 : OBTENTION D'UNE SOUCHE DE L . LACTIS EXPRIMANT LE GÈNE katB DE B . SOBTILIS
Le gène ka tB de Ba cill us subtilis code une catalase (Numéro d'accès SWISS-PROT : P42234) dont la synthèse est induite chez Bacill us subtilis lors d'un stress thermique ou salin, de l'addition d'éthanol ou de la privation en glucose. Le gène ka tB a été amplifié par PCR à partir du chromosome de la souche 168 αe B . subtilis [ANAGNOSTOPOULOS et SPITZIZEN, J. Bacteriol., 81, 741-746, (1961) ] en utilisant des amorces permettant d'obtenir la séquence codante du gène avec le s te de fixation des πoosomes et son terminateur, et modifiées pour contenir des sites de restriction : amorce sens : 5' -AATGTGCTCTAGAATGTTTCGTTTTAAA-3' , contenant un site Xbal ; amorce anti-sens : 5' -TTTTCCTCGAGTTCGTAAGCTTCAGTGAGC-3 ' , contenant un site Xhol.
L'amplification [5 mn 96°C, (15 s. à 96°C,
15 s. à 50°C, 2mm 50 s. à 72°C) 30foιs] a été faite avec 5 unités de Vent Polymérase [NEW ENGLAND BIOLABS] en présence de 4 mM de MgS04. Un fragment de la taille attendue (2180 pb) a été obtenu.
Ce fragment a ensuite été clone, sous contrôle du promoteur du gène de la β-galactosidase aux sites Xbal-Xhol de pBSKS+ (STRATAGENE) dans la souche E . coli TG1.
Le plasmide obtenu, dénommé pBSKSkatB a ensuite été transféré dans la souche MG1655 katE katG de E . coli [DUKAN et TOUATI, J. Bacteriol., 178, 6145-6150, (1996)] dépourvue d'activité catalase. Après avoir vérifié la présence du plasmide pBSKSkatB dans les bactéries transformées, l'activité catalase a été recherchée selon le protocole décrit par AERI, [Methods in Enzymology, 105, 121-127, (1984)]. Aucune activité catalase n'a été observée dans ces conditions.
Le promoteur p23 [VAN DER VOSSΞN et al., Appl. Environ. Microbiol., 53, 2452-2457, (1987)] de L . lactis a ensuite été clone dans les sites Notl-Xbal du plasmide pBSKSkatB. Le plasmide obtenu, dénommé pBSKSp23katB, comprenant le gène ka tB sous contrôle du promoteur p23, a été introduit dans la souche MG1655 katE katG de E . coli . On observe dans la souche transformée une activité catalase, déterminée selon le protocole indiqué ci- dessus.
Le fragment Notl-Xhol contenant le promoteur p23 et le gène ka tB a ensuite été transféré sur le plasmide pILNewl3 [RENAULT et al., Gène, 183, 175-182,
(1996)]. Le plasmide résultant est dénommé pILN13p23Kat3. Plusieurs essais effectués sur différentes souches de
L . lactis n'ayant pas permis d'introduire directement ce plasmide chez cette bactérie, le plasmide pILN13p23KatB a été introduit dans la souche 168 de B . subtilis, et un dérivé à bas nombre de copies de ce plasmide a été fabriqué par délétion d'un fragment Kpnl. Le plasmide résultant, dénommé pILN5p23KatB a ensuite été introduit dans la souche MG1363 de L . lactis [GASSON, J.
Bacteriol., 154, 1-9, (1983)].
Après avoir vérifié la présence du plasmide pILN5p23KatB dans les bactéries transformées, l'activité catalase a été recherchée selon le protocole indiqué ci- dessus. Aucune activité catalase n'a été observée.
De l'hème (sous forme d'hé ine) a été ajoutée au milieu de culture à une concentration de 0,5 mg par litre de milieu. D'ans ces conditions de culture, aucune activité catalase n'a été observée lors de la phase de croissance exponentielle. En revanche, une forte activité catalase apparaît au cours de la phase stationnaire. Le fragment Notl-Xhol contenant le promoteur p23 et le gène ka tB a également été clone sur les plasmides pG+host4, pG+host9, pGK12 [KOK et al., Appl . Environ. Microbiol. 48, 726-731, (1984)] (plasmides à haut nombre de copies se répliquant par un mécanisme dit de cercle roulant dans E . coli et de nombreuses bactéries à Gram-positif, notamment B . subtilis et L . la ctis) et introduit dans plusieurs souches de E. coli et de L . lactis où une activité catalase a pu être observée dans les conditions précédemment décrites. Un cointégrat pBSKS-- (plasmide réplicatif de
E . coli ) et pVS41 [VON WRIGHT et 3AARELA, Plasmid, 31, 106-110, (1994)] (plasmide à haut nombre de copies se répliquant par un mécanisme dit de cercle roulant dans E . coli et L . lactis) contenant le promoteur p23 et le gène ka tB a également été introduit dans plusieurs souches de E . coli et L . lactis où une activité catalase a pu être observée dans les conditions précédemment décrites . EXEMPLE 2 : EFFETS ANTI-OXYDANTS JN VITRO D'UNE SOUCHE DE L . LACTIS EXPRIMANT LE GÈNE katB DE B . SUBTILIS
1) Effet sur la survie de souches bactériennes après un stress oxydant
L'effet protecteur de la catalase exprimée par le gène ka tB introduit dans Lactococcus lactis a été testé sur la bactérie hôte, ainsi que sur d'autres bactéries ( Lactococcus lactis , Escherichia coli
La ctobacillus fermentum) soumises à un stress oxydant. Matériels et méthodes
Cul tures bactériennes
Les cultures ont été effectuées dans les conditions suivantes : - souche de Lactococcus lactis productrice de catalase :
Les bactéries sont ensemencées à partir d'une culture stock congelée, dans 5 ml de milieu M17 supplémenté avec 1% de glucose (M17glu) puis incubées à 30°C pendant 18 heures. La culture est ensuite diluée au 1/1000 en milieu M17glu, supplémenté avec de l'hémine à la concentration de 50 mg/ml, puis incubée à 30°C pendant 24 heures. Préalablement au test, les bactéries sont centrifugées et resuspendues en M17, à la concentration de 103 cellules/ml.
- souches non productrices de catalase : ^Lactococcus lactis :
Les bactéries sont ensemencées à partir d'une culture stock congelée, dans 5 ml de milieu M17glu puis incubées à 30°C pendant 18 heures. La culture est ensuite diluée au 1/1000 en milieu M17glu, puis incubée à 30°C jusqu'au moment du test.
*Escherichia coli :
Les bactéries sont ensemencées à partir d'une culture stock congelée, dans 5 ml de milieu LB puis incubées à 30°C pendant 18 heures. La culture est ensuite diluée au 1/1000 en milieu LB, puis incubée à 37°C avec agitation jusqu'au moment du test.
*Lactobacillus fer entum : Les bactéries sont ensemencées à partir d'une culture stock congelée, dans 5 ml de milieu MRS puis incubées à 37°C pendant 18 heures dans une jarre d' anaerobiose. La culture est ensuite diluée au 1/1000 en milieu MRS, puis incubée à 37°C jusqu'au moment du test. Induction du s tress
Lorsque la culture a atteint une D050o de 0,1, un stress oxydant est induit par addition de 10 mM de H202 au milieu de culture, et incubation pendant 30 minutes à 30°C pour et 37°C pour Eschericnia coli et Lactoba cill us fermen tum . Le pourcentage de bactéries survivantes est estimé par étalement sur boîte de dilutions successives des prélèvements effectues dans les cultures avant et à l'issue du traitement, et comptage des colonies. Des expérimentations sont effectuées en présence de Lactococcus lactis transformé producteur de catalase, ou de Lactococcus lactis non transforme ; dans les 2 cas l'ajout des lactocoques est effectue, a raison de 10' ou 108 cellules/ml, juste avant l'addition du peroxyde d'hydrogène.
Résultats
Les résultats obtenus sont illustres par la figure 1 :
A - Survie des cellules de lactocoques sauvages (CAT-) ou productrices de catalase (CAT+) ;
B - Survie de lactocoques sauvages (CAT-) incubés avec 10 ou 108 lactocoques producteurs de catalase (CAT+) ;
C - Survie des cellules d' Escnerichia coli (E . coli) incubés avec 107 ou 108 lactocoques producteurs de catalase (CAT+) .
D - Survie des cellules de Lactoba cill us fermentum { L . fermentum) incubes avec 107 ou 108 lactocoques producteurs de catalase (CAT+) . Ces résultats montrent que :
1) La survie de la soucne de Lactococcus lactis productrice de catalase est augmentée d'environ 1000 fois (survie de la souche sans catalase ≈10"4, avec catalase =5 x 10"1) .
2) La souche productrice de catalase permet de protéger une souche de L . la ctis non productrice de catalase : la survie de 103 lactocoques catalase moins est de 10"4 ; elle augmente de 50 fois en présence de 107 lactocoques catalase plus, et elle est de 100% en présence de 108 lactocoques catalase plus.
3) La souche productrice de catalase permet de protéger une souche d' Escheri chia col i non productrice de catalase : la survie de 108 E . col i est de 10"3 ; elle augmente de 50 fois en présence de 107 lactocoques catalase plus, et elle est de 100% en présence de 108 lactocoques catalase plus. Par contre la survie n'est pas améliorée en présence de lactocoques catalase moins (résultats non représentés) .
4) La souche productrice de catalase permet de protéger une souche de Lactobacillus fermentum non productrice de catalase : la survie de 108 L . fermen tum est de 5 x 10"δ ; elle augmente de 200 fois en présence de 107 lactocoques catalase plus, et elle est de 3 x 10"2 en présence de 108 lactocoques catalase plus. Par contre la survie n'est pas améliorée en présence de lactocoques catalase moins (résultats non représentés) . Conclusions:
L'introduction au gène catalase augmente la résistance de L . la cti s à un stress oxydant.
La présence de L . la cti s produisant la catalase augmente la résistance à un stress oxydant de souches bactériennes n'exprimant pas de catalase. 2) Effet sur la survie de cellules coliques humaines après un stress oxydant.
L'effet protecteur de la catalase exprimée par le gène ka tB introduit dans Lactococcus lactis a été testé sur des cellules coliques humaines en culture exposées à un stress induit par un produit oxydant (H202) .
Matériels et méthodes :
Cellules humaines : cellules de la lignée épitnéliale colique humaine HT29 Protocole expérimental : les cellules sont ensemencées en plaque 96 puits (2000 cellules par puits). Au moins 8 puits différents sont réalisés pour chaque condition expérimentale. Après 3 jours de culture, le milieu de culture est éliminé et remplace par du milieu de culture de cellules eucaryotes contenant les bactéries à tester (5 x 108 par ml de culture), préalablement cultivées comme indiqué en 1) ci-dessus.
Après 1 heure de contact cellules-bactéries, on ajoute du peroxyde d'hydrogène à différentes concentrations (0, 100, 200 et 400 μM) . Après 2 heures d'incubation, le milieu contenant les bactéries est éliminé et remplace par du milieu de culture normal. La mesure de la prolifération cellulaire est effectuée 24 heures après, par deux techniques couramment utilisées pour les tests de toxicité : 1) test au rouge neutre, 2) test au MTT (sel de tetrazolium) . L'analyse statistique des résultats est réalisée par un test t.
Résultats :
Les résultats obtenus sont illustres par la figure 2 qui montre l'effet de L . lactis non modifié
(CAT-) ou produisant la catalase (CAT-) sur la survie de cellules HT29 après incubation avec 0, 100, 200 ou 400 μM d'H202. Les différences statistiquement significatives par rapport aux cellules incubées sans bactéries (témoin) sont indiquées :
* = p<0,05 ; ** = p<0,01 et *** = p<0,001. A : test au rouge neutre ; B : test au MTT .
Ces résultats montrent que :
1) La présence de bactéries ne modifie pas la prolifération des cellules HT29, en l'absence de peroxyde d' hydrogène, 2) que les différentes concentrations en H202 testées ont un effet toxique sur les cellules HT29,
3) que les bactéries modifiées pour surproduire la catalase protègent efficacement les cellules HT29 contre les différentes concentrations d' H202 utilisées,
4) qu'à la concentration de 200 μM, les bactéries non modifiées ont également un effet protecteur.
Conclusion : La présence de L . la ctis n'altère pas la croissance des cellules HT29.
La présence de L . la ctis non modifiés peut apporter une certaine protection contre un stress oxydant mais la protection est beaucoup plus efficace en présence de L . la ctis produisant la catalase.
3) Effet sur la survie de cellules coliques humaines après un stress oxydant induit par irradiation
L'effet protecteur de la catalase exprimée par le gène ka tB introduit dans La ctococcus lactis a été testé sur des cellules coliques humaines en culture exposées à un stress induit par des radiations ionisantes . Matériels et méthodes
Les cellules HT29 sont ensemencées à 2000 cellules par puits en plaque 96 puits. Au moins 8 puits différents sont réalises pour chaque condition expérimentale. Après 3 jours de culture, les plaques sont irradiées à 2 Gy à l'aide d'une source de cobalt 60. Les bactéries à deux concentrations différentes (107 et 103 / 0,2 ml) sont ajoutées soit 1 heure avant l'irradiation, soit 24 ou 48 heures après et laissées en contact des cellules pendant 3 heures. L'effet de l'irradiation sur la croissance cellulaire est estimé après 5 jours de culture par la technique du MTT .
Les résultats obtenus sont illustres par la figure 3 qui montre l'effet de L . lactis non modifie ou L . lactis produisant la catalase (L. lactis CAT) sur la prolifération de cellules HT29 après une irradiation de
2 Gy. Les bactéries ont été rajoutées soit 1 heure avant l'irradiation (( | ) ; soit 24 heures après (^) ; soit
48 heures après (|)- Les valeurs (n=8) sont exprimées en % de survie par rapport au témoin correspondant non irradié. Les différences statistiquement significatives (test t) par rapport aux cellules incubées sans bactéries sont indiquées :
* = p<0,05 ; ** = ρ<0,01 et *** = P<0,001 Ces résultats confirment que la présence des lactocoques, modifiés ou non, n'altère pas la croissance des cellules HT29. On n'observe pas d'effet protecteur des bactéries lorsque celles ci sont rajoutées au moment de l'irradiation ; par contre un effet protecteur est obtenu lorsqu'elles sont rajoutées 24 heures ou 48 heures après l'irradiation. L'effet protecteur le plus marqué est obtenu en présence de 108 L . la ctis produisant la catalase . Conclusion
La présence de L . lactis protège les cellules HT29 contre les effets des radiations ionisantes. Cet effet protecteur est renforcé avec L . lactis proαuisant la catalase.
EXEMPLE 3 : EFFETS ANTI-OXYDANTS IN VIVO D'UNE SOUCHE DE L . LACTIS EXPRIMANT LE GÈNE katB DE B . SUBTILIS
L'effet de l'ingestion de L . lactis exprimant la catalase sur la toxicité intestinale radiomduite a été testé comme suit :
1) Irradiation abdominale en 1 fois
Matériels et méthodes :
Animaux: souris mâles C3H/He âgées de 9 semaines au moment de l'irradiation Alimentation: la veille de l'irradiation, les animaux sont nourris de croquettes standard broyées auxquelles sont ajoutées les cultures de bactéries ou le milieu de culture pour les témoins (1 ml /g de croquettes). Les aliments sont renouvelés chaque our pendant toute la durée de l'expérience, les animaux sont divises en 6 groupes de 5 individus: 5 irradies ingérant du milieu de culture sans bactérie et 5 témoins non irradies nourris de la même façon; 5 irradiés ingérant L . lactis non modifié et 5 témoins non irradiés nourris de la même façon, 5 irradiés ingérant L . lactis produisant la catalase et 5 témoins non irradiés nourris de la même façon.
Irradiation: après anesthésie, les animaux sont exposés à une irradiation abdominale de 10 Gy à l'aide d'une source de cobalt 60.
Suivi pondéral: les animaux sont pesés chaque jour à la même heure pendant toute la durée de 1' expérience. Résultats
Les résultats obtenus sont illustrés par la figure 4, qui montre l'effet de L . la ctis non modifié
(—•—) et de L . lactis produisant la catalase (--O--), par rapport au milieu de culture sans bactérie
(— —) sur la perte pondérale des souris C3H/He après une irradiation abdominale de 10 Gy. Les différences statistiquement significatives (test t) par rapport au témoin (milieu sans bactérie) sont indiquées : * ≈ p<0,05 et ** =*• p<0,01.
Ces résultats montrent qu'une alimentation supplémentée en L . lactis diminue αe façon significative la perte pondérale entraînée par l'irradiation. Pour les animaux ingérant L . la ctis produisant la catalase, la perte de poids est interrompue plus tôt et la reprise semble s'amorcer plus rapidement que pour ceux ingérant L . lactis non modifié.
2) Irradiation fractionnée
Matériels et méthodes: Le protocole d'alimentation est le même que celui suivi pour l'irradiation abdominale.
Les animaux, places dans αes tubes plexiglas, sont irradiés tous les matins pendant 5 jours à une dose de 3Gy à l'aide d'une source de Cobalt 60. Suivi pondéral: les animaux sont pesés chaque jour à la même heure pendant toute la durée de l' expérience.
Résultats :
Les résultats obtenus sont illustrés par la figure 5, qui montre l'effet de L . lactis non modifié (—•—) et de L . lactis produisant la catalase (--O--) par rapport au milieu de culture sans bactérie (— M—) sur la perte pondérale des souris C3H/He après une irradiation totale de 5 X 3 Gy. La différence entre L . lactis modifié et milieu de culture est significative (test t) à p<0,05.
Ces résultats montrent qu'une alimentation supplémentée en L . lactis diminue la perte pondérale après irradiation. La différence par rapport au témoin est statistiquement significative dans le cas de L . la ctis produisant la catalase (p<0,05, test t) .

Claims

REVENDICATIONS
1) Souche de lactocoque, notamment de L . la cti s , transformée par un gène codant pour une catalase hétérologue.
2) Souche selon la revendication 1 caractérisé en ce que ledit gène est un gène procaryote.
3) Souche selon une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que ledit gène est le gène ka tB de B . subtilis .
4) Procédé de production d'une catalase par une souche de lactocoque selon une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il comprend la mise en culture de ladite souche en présence d'hème. 5) Utilisation d'une souche de lactocoque selon une quelconque des revendications 1 à 3 pour l'obtention d'un médicament destiné a protéger des cellules contre un stress oxydant.
6) Utilisation selon la revendication 5, caractérisée en ce que lesdites cellules sont des bactéries de la flore intestinale.
7) Utilisation selon la revendication 5, caractérisée en ce que lesdites cellules sont des cellules de la paroi intestinale. 8) Utilisation selon la revendication 5, caractérisée en ce que ledit stress oxydant est induit par un rayonnement.
9) Procédé pour protéger m vi tro des cellules contre un stress oxydant, caractérisé en ce qu'il comprend la mise en présence des cellules à protéger et d'au moins une souche de lactocoque selon une quelconque des revendications 1 à 3, dans les conditions de production de catalase par ladite souche de lactocoque.
10) Procédé selon la revendication 9, caractérisée en ce que lesdites cellules sont des bactéries probiotiques. 11) Aliment fermenté comprenant au moins une souche de lactocoque selon une quelconque des revendications 1 à 3, éventuellement associée à d'autres bactéries probiotiques.
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