WO2000049143A1

WO2000049143A1 - Procede d'analyse d'une frequence d'expression genique

Info

Publication number: WO2000049143A1
Application number: PCT/JP2000/000902
Authority: WO
Inventors: Takami Maekawa; Akira Mitsui; Masayo Date; Hisao Fukuda; Yoshiyuki Takahara
Original assignee: Ajinomoto Co., Inc.
Priority date: 1999-02-17
Filing date: 2000-02-17
Publication date: 2000-08-24
Also published as: EP1156107A1; JP3924976B2; US6806049B1; ATE275196T1; DE60013410T2; EP1156107A4; DE60013410D1; EP1156107B1; DK1156107T3; JP2000232888A

Description

明細書

― 遺伝子の発現頻度の解析方法技術分野

本発明は、遺伝子の発現頻度の解析方法に関し、詳しくは、遺伝子発現の動的変化を捉えるために、細胞において蛋白質をコードする全遺伝子より発現している mRNAの種類と量を、微量生体サンプルを用いて解析することが可能な方法に関する。背景技術

ゲノム上に存在する蛋白質をコードする遺伝子の総数は、ヒトで約 10万種と予想されている。既に全ゲノム構造が明らかとなった酵母では、蛋白質をコードする遺伝子の総数は約 5000種と推定されている。

近年、公共の遺伝子データバンクが欧米、日本を中心に設立され、世界中の膨犬な量の遺伝子情報がデータバンクに登録されており、さらに日々新たな情報がデータバンクに集まって来る。世界規模で行なわれているヒトゲノムプロジェクト（human genome project) は、 2005年を目標にヒトゲノムの全遺伝子の配列を明らかにしつつあり、その遺伝子情報もデータバンクに登録されつつある。ある遺伝子配列についてデータバンクに問い合わせると、その配列と同一又は類似の配列を持つ遺伝子が既に登録されているか否か、さらには登録されていれば、その配列に関する情報、例えば、遺伝子名、機能、関連する文献等を知ることができる。このような検索をホモロジ一検索といい、ホモロジ一検索を行うソフトゥエアは何種類かあるが、多数の検索を行なう場合は検索時間の短い BLASTが通常用いられている。

通常、細胞の遺伝子は全ての遺伝子が mRNAに読みとられ、 mRNAから蛋白質が生産されている訳ではなく、ヒトでは 1細胞の発現している遺伝子は約 15000種と推定されている。このように、細胞中では何種類ものゲノム遺伝子が発現しており、それに応じた種類のメッセンジャー RNA (以下、「mRNA」という）が生成しているが、発現している遺伝子の種類及び量（以下、「遺伝子発現頻度情報」ともいう）は、細胞の種類、状態により変動する。例えば、血液幹細胞からリンパ球前駆細胞、プレ B細胞、 B細胞、活性化 B細胞と分化するに従い、各細胞で共通に発現する遺伝子もあるが、全く違う遺伝子発現を示す。

上記のような遺伝子発現頻度情報を測定することを、遺伝子発現プロファイル解析という。細胞の生命活動を担っているのは主として蛋白質であり、 mRNAから翻訳される蛋白質の種類と量を解析することは、遺伝子発現解析として重要であるが、現状では全蛋白質のプロファイルを得ることは技術的に困難である。一方、 mRNAについては、全種類の mRNAを測定することが可能となっている。

遺伝子発現プロファイル解析法として最初に報告されたのは、 Body Map法（Ge ne， 174, 151 -158 ( 1996 ) ) である。 Body Map法の概略は以下の通りである。ベクタ一上のポリ T配列と mRNAの 3'末端にあるポリ Aテールを結合させ、ベクタ一ポリ T配列をプライマ一として cDNAを合成する。更に、制限酵素 Mbolで cDNAを切断する。 Mbolサイトは cDNA上で平均 300塩基対に一つあるため、ベクター上の cDN Aは平均 300塩基対に分断される。このとき、最もポリ Aテールよりの cDNAは、ベクタ一に結合したまま残る。この cDNA断片を持つベクタ一を閉環させ、それを大腸菌に導入して cDNAライブラリーを作製する。ライブラリーから約 1000クロ一ンを任意に選択して、それそれについて平均 300塩基対の塩基配列を決定する。それらの配列の中から同じ配列を含むクローン毎にまとめて、それそれの配列の種類と出現頻度を算出して遺伝子発現プロファイルを得る。各 cDNA配列はデータバンクでのホモロジ一検索（BLAST検索）を行い、既知の遺伝子と同一の配列を有するクローンにはその遺伝子の名称を与える。配列がデ一夕バンクに登録されていない場合は、その配列に該当する遺伝子は存在しないものとする。

BLAST検索によりホモロジ一検索を行なうためには、最低 11塩基対の情報が必要である。 10塩基からなる配列の種類は約百万種であり、人で存在すると予想される遺伝子の種類 10万種を遙かに越える。すなわち、 11塩基対の情報があれば、その配列を持つ遺伝子は特定することができ、遺伝子発現プロファイル解析が可能である。したがって、多量のシークェンスを必要とする Body Mapによる遺伝子発現プロファイル解析を効率化するために、 Body Mapにおける約 300塩基対の cDN A断片を、更に 11塩基対以上の短い断片（「タグ（tag) 」と呼ばれる）とし、更にこの断片同士を多数連結してベクターに挿入することにより、連結タグのライブラリ^:作成し、 Body Mapと同様に約 1000クローンを任意に選択して、連結タグの DNA配列を決定すれば、 Body Mapと同じ手数でより多くの遺伝子発現情報を得ることが期待できる。タグは遺伝子配列を代表し、タグの出現頻度はその遺伝子の発現頻度を現す。通常、 1回のシークェンスで判読出来る DNA配列の長さは約 6 00塩基対であるから、 1回のシークェンスで最大 50個程度の夕グの MA配列を判読出来る。すなわち、 Body Map法に比べて最大約 50倍の効率で、遺伝子発現プロフアイル解析を行うことが可能になる。

上記の考えに基づいた遺伝子発現プロファイル解析法として、 Serial analysi s of gene expression (SAGE) 法がある（米国特許第 5, 695, 937号、第 5，866，330 号、欧州特許公開第 0761 822号）。 SAGEは、ピオチンが 3'末端に結合したポリ T をプライマーとして cDNAを作製し、 Body Mapと同様に Mbol等の制限酵素（「アン力リング酵素（anchoring enzyme )」と呼ばれる）で cDNAを切断した後、ビォチンが結合した 3，末端を含む cDNA断片をアビジンビーズに吸着させ、ビーズを二分して、それそれのビーズに吸着した cDNA断片（約 13bp) に 2種のリンカ一（A又は B ) の一方ずつを結合させる。各リンカ一には BsmF Iのような Class I I制限酵素 ( 「タグ化酵素（tagging enzyme )」と呼ばれる）のサイトを含ませておく。タグ化酵素で cDNA断片をビーズから切り出し、切断部位を平滑化し、 Aリンカ一に接続するタグと Bリンカ一に接続するタグを連結させる。これは、ダイタグ（dita g) と称される。 Aリンカ一と Bリンカ一を認識するプライマ一を用いて PCRによりダイタグを増幅する。増幅されたダイタグ同士を多数連結させてベクターに組み込み、シークェンスする。 1シークェンスで最大 50程度のタグシークェンスを得ることができる。このタグシークェンス情報を集計して、遺伝子発現頻度を導き出す。

また、遺伝子の発現頻度を解析する他の方法として、遺伝子チップ法及び遺伝子マイクロアレイ法がある。いずれも、遺伝子断片を適当な板の上（通常はスライドガラス）に、極めて高密度に（約 10個/ nrai²以上）並べて張り付けたものが用いられる。このチップと蛍光ラベルした mRNAをハイブリダィズさせて、 mRNAの種類と量を測定する。

上記のように、遺伝子の発現頻度を解析する方法がいくつか開発され、それなりの成果は得られている。現状では、全ての真核生物の全ての遺伝子の発現頻度を測定するには SAGE法が最も有効な手段であるが、実際にこの手法を実施しょうとすると多くの問題に遭遇して、殆どの研究機関で SAGE法を再現することができなかった。すなわち、 SAGE法は、手技が難しく、特別に訓練した者しか実施できない。また、測定には mRNAが l〃g程度必要であり、小量の検体しか入手できない場合、例えば臨床生検材料では測定を行うことや、組織の微細な部分の遺伝子発現の違いを測定することは、事実上不可能である。さらに、原理的に測定ミスが多い。

SAGE法では、正確にタグの配列を読み取ることは極めて重要である。なぜなら、タグは短く（約 13bp) 、一力所でも読み間違いがあると同一物であるにも関わらず別物と判断したり、また、異なるタグを同一物とみなしてしまうことが起こる。ところが、 SAGE法にはこの間違いが生じる可能性が高い。なぜなら、 SAGE法では 2つのタグをつなげてダイ夕グを形成するが、このときにタグと夕グの境界が不明瞭になるからである。夕グは BsmFIや Foklなどの制限酵素で切り取られる短い遺伝子断片である。しかし、これらの酵素は切断部位が必ずしも安定しておらず、切り出されたタグの長さはまちまちである。このように長さの異なる夕グが混在している状態でタグとタグをつなげてダイタグにすると、夕グと夕グの連結部位確なタグの配列が得られなくなる。このように、 SAGE法には原理的に不可避な欠点がある。また、 SAGE法にはアビジン及びビォチンビーズを用いて DNAを回収する操作があるが、アビジン及びピオチンビーズを用いてコン夕ミネ一シヨンを生じることなく DNAを回収することは実際には非常に難しく、プロトコ一ル通りの操作では正確なデ一夕を得ることは非常に困難である。また、 SAGE法ではデ一夕を得るためには多量の mRNAを必要とし、臨床サンプルなどのサンプル量に限りがあるものの場合、十分な mRNAは得られず、 SAGE法は実施困難であった。

また、遺伝子チップ法及び遺伝子マイクロアレイ法では、 Body Map法や SAGE法と違って、構造の解っている遺伝子しか測定することができない。したがって、現状では、全ての生物の全ての遺伝子の発現頻度を測定することはできない。現状では、全ての真核生物の全ての遺伝子の発現頻度を測定するには SAGE法が最も有効な手段であるが、実際にこの手法を実施しょうとすると多くの問題に遭遇して、殆どの研究機関で SAGE法を再現することができなかった。 SAGE法の問題点を上げると、（ 1 ) 手技が難しく、特別に訓練した者しか実施出来ない。（2 ) 測定に mRNA量が l〃g程度必要であり、小量の検体しか入手できない場合、例えば臨床生検材料は測定できない。同様に、組織の微細な部分の遺伝子発現の違いを測定することができない。（ 3 ) ダイタグを測定するために、原理的に測定ミスが多い。発明の開示

本発明は、上記現状に鑑みなされたものであり、通常の研究者が容易に実施することができ、また、ごく微量の検体から正確な遺伝子発現頻度解析を行なうことができる方法を提供することを課題とする。

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、ポリ T配列を有するベクタ一プライマ一を用いて m Aから cDNAを合成し、同べクタ一上で cD NA配列をタグ化し、得られたタグを、タグの末端が識別できるような配列を介在させて連結することによりコンカテマ一を形成させ、このコンカテマ一の塩基配列を解析することによって、効率よく、しかも高精度で遺伝子の発現頻度を解析することができることを見出し、「 AGE (Micro-analysis of Gene Expression) 」と名付けた本発明の方法を完成するに至った。

すなわち本発明は、以下のものを提供する。

( 1 ) 以下のステップを含む遺伝子の発現頻度を解析する方法；

( a ) 直鎖状のプラスミドベクターの一方の 3，末端に一本鎖のポリ T配列と、その内側に第一の制限酵素認識配列とを有し、他方の末端近傍に第二の制限酵素認識配列と、さらにその内側にタイプ 11 S制限酵素認識配列とを有するベクタープライマーと、遺伝子の発現頻度を解析しょうとする細胞に由来する mR N Aとをァニールさせて c D N A合成を行い、 c D N Aが結合したベクタープライマ一を生成するステップと、 (b) 前記 cDNAが結合したベクタープライマ一を、ベクタ一プライマ一を切断せず、かつ、前記第二の制限酵素の切断末端と同じ形の末端を生じさせる第三の II艮酵素と、前記第二の制限酵素とを用いて消化して cDNAの上流侧を切除し、ベクタープライマ一を閉環するステップと、

(c) 閉環したベクタ一プライマーを、前記第一の制限酵素及び前記タイプ II S制限酵素で消化して、 c D N Aの一部からなる夕グを残して c D N Aの下流側を切除し、ベクタ一プライマーを再び閉環するステップと、

(d) 前記ベクタープライマーを鎵型とし、ベクタ一プライマー中のタグの両側のそれそれの領域に相当する塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマ —としてポリメラ一ゼ 'チェイン ' リアクション（PCR) を行い、タグを増幅するステップと、

(e)前記増幅産物を連結してタグのコンカテマ一を形成するステップと、 (f ) 前記コンカテマ一の塩基配列を決定し、その塩基配列中に出現するタグの種類及びその頻度を調べるステップ。

(2)前記ステップ（e) において、連結反応を、一方の末端がタグの末端と同じ形を有するアダプタ一存在下で行い、それによりコンカテマ一の両端にァダプ夕一を配置させ、アダプターの配列に相当する配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーに用いて P CRを行うことによりコンカテマ一を増幅することを特徴とする（1) の方法。

(3)前記ステップ（e) の後に、前記コンカテマ一の塩基配列の決定を、塩基配列決定用のクローニングベクターにクロ一ニングして行うことを特徴とする

(1)又は（2) の方法。

(4)前記第三の制限酵素の認識配列が 4塩基である（1) 〜（3) のいずれかの方法。

(5)ベクタープライマ一は、第二の制限酵素認識配列の切断点と同じ位置又はその内側に切断点を有し、かつ、タイプ IIS制限酵素による切断によってべクタ一プライマ一から切除されない第四の制限酵素認識配列を有し、

前記（d) のステップで用いるプライマーのうち、タグの下流側のプライマーは、第四の制限酵素切断末端と同じ形の末端を生じさせる第五の制限酵素の認識配列を有し、増幅されたプライマーを第四の制限酵素及び第五の制限酵素で消化した後にコンカテマ一を形成させる（ 1) ~ (4) のいずれか一項に記載の方法。 ( 6 )—前記ベクターブラィマ一は、第一の制限酵素認識配列のさらに内側に第五の制限酵素認識配列と一塩基異なる塩基配列を有し、前記夕グの下流側のブラィマーを用いた P C Rにより前記一塩基異なる塩基配列が第五の制限酵素認識配列に変換される（5) の方法。

( 7 ) 前記第三の制限酵素、第四の制限酵素及び第五の制限酵素が同一である前記（ 6 ) の方法。

(8) ベクタ一プライマーが、マルチクローニング部位を有するプラスミドを同マルチクローニング部位の二箇所で切断して得られる直鎖状プラスミドと、この直鎖状プラスミドの一方の末端と同じ形の末端を有し、一本鎖のポリ T配列を有する部分二本鎖 DNAとが連結されたものである（ 1) 〜（7) のいずれかの方法。図面の簡単な説明

図 1は、ベクタ一プライマ一を作るためのプラスミド DNAの構造の一例（MAGE/ PUC19) を示す。

図 2は、ベクタ一プライマーの構造の一例とその構築過程を示す。

図 3は、本発明の方法のステップ（a) 及び（b) を模式的に表す。

図 4は、本発明の方法のステップ（c) 及び（d) を模式的に表す。

図 5は、本発明の方法のステップ（e) と、ステップ（e) により得られる増幅産物をシークェンス用クロ一ニングベクタ一に挿入するステツプを模式的に表す。発明を実施するための最良の形態

本発明の方法は、上記（a) 〜（f ) のステップを含む。以下、各ステップ毎に説明する。

< 1 >ステップ（ a )

最初のステップでは、直鎖状のプラスミドベクタ一の一方の 3 ' 末端に一本鎖のポリ T配列と、その内側に第一の制限酵素認識配列とを有し、他方の末端近傍に第二の制限酵素認識配列と、さらにその内側にタイプ I I S制限酵素認識配列とを有るベクタ一プライマ一（以下、「逆転写用ベクタープライマ一」ともいう）を用いる。ここで、タイプ I I S制限酵素とは、制限酵素により認識される配列から離れた特定の部位を開裂する制限酵素をいう。

ベクタ一プライマ一の構造の一例を、図 2 Dに示す。このべクタ一プライマーは、例えば、マルチクローニング部位を有するプラスミドを同マルチクロ一ニング部位の二箇所で切断して得られる直鎖状プラスミドと、この直鎖状プラスミドの一方の末端と同じ形の末端を有し、一本鎖のポリ T配列を有する部分二本鎖 D N Aとを連結することにより、調製することができる。図 1に、マルチクロー二ング部位を有するプラスミドの例として、 MAGE/pUC19の構造を示す。このプライマ一は、基本構造として公知のクローニングベクターである PUC19を含み、そのマルチクローニングサイ卜の EcoRlと Hindi 11制限酵素部位の間に、種々の制限酵素認識部位を含む配列（Z fragmentと呼ぶ。配列を配列番号 1に示す。）が挿入されたものである。

尚、以下の具体例では、 MAGE/pUC19は、 Damメチレ一シヨン系を有するェシェリヒア · コリ宿主、例えば JM109株等を用いて調製したものを使用する例について説明するが、本発明に必須ではない。また、基本構造となるベクターは、 pUCl 9に限られるものでなく、それ以外のベクタ一、例えば pUC18、 pBR322, pHSG299、 pHSG298、 pHSG399、 pHSG398、 RSFlOlOv pMW119、 pMW118、 pM 219、 pMW218等、種々のベクターを用いることができる。尚、用いるベクタ一の宿主は、形質転換、宿主からのベクターの回収等、通常の遺伝子組換え技術を適用することができるものであれば特に制限されるものではないが、通常、ェシエリヒア ·コリが用いられる。

以下、マルチクロ一ニング部位を有するプラスミドとして MAGE/pUC19を用いた例について説明するが、本発明はこれに限られるものではない。

まず、 MAGE/pUC19ベクタ一（図 2 A ) を、制限酵素 BstXI及び Pst lで処理し、切り取られた小断片を除去する（図 2 B ) 。次に BstXIによる切断末端に、一本鎖のポリ T配列を有する部分二本鎖 D N A (図 2 Cに示すポリ Tアダプタ一）をライゲ一シヨンする。これにより、 MAGE/pUC19ベクターの一端から一本鎖のポリ Tが飛び出した形のベクタ一プライマー（又は、逆転写用べクタ一プライマー）が形成される（図 2D) 。このべクタ一プライマ一では、第一の制限酵素は Pmel であり、第二の制限酵素は Bglllであり、タイプ IIS制限酵素は Bsglである。第二の制限酵素 Bglllの認識配列には bol認識配列が重複して含まれており、 B gill末端を Mbol末端と連結すると、 Mbolで切断することができる。また、この例では、ベクタープライマーの第一の制限酵素（Pmel) 認識配列のさらに内側に、第四の制限酵素（Mbol) 認識配列と一塩基異なる塩基配列を含むように設計されている（図 3 Eの AMboI) 。この AMboI及びべクタ一プライマ一の第一の制限酵素認識配列は、ポリ Τアダプターに由来する。

第一の制限酵素及び第二の制限酵素は、ベクタープライマーを一箇所で切断するものであれば特に限定されない。また、タイプ IIS制限酵素及びその存在位置は、ベクタープライマ一から第四の制限酵素部位を切除せず、かつ、 cDNAの上流側の一部をベクタープライマーに残したまま切断するものであれば特に制限されない。具体的には、例えば上記 Bsglの他に、 BsmFI等が挙げられる。

また、ポリ T配列の長さは、 mRNAのポリ A配列とァニールできる程度の長さであればよく、通常 10〜50塩基程度である。

上記のようなベクタ一プライマーと、遺伝子の発現頻度を解析しょうとする細胞に由来する mRNAとをァニールさせる。その状態で逆転写反応を行うと、ポリ Tがプライマ一となって cDNA合成が始まる（図 3 E) 。そして、合成された一鎖目の cDNAを錡型として二鎖目を合成し、二本鎖 cDNAが合成できる（図 3 F) 。多数の mRNA分子から多数の cDNAが結合したベクタープライマー分子（ cDNA- M AGE/pUC19) ができるが、図 3 Fはその典型例のひとつを示したものである。 mRNAは、遺伝子の発現頻度を解析しょうとする細胞から抽出する。発現頻度を解析しょうとする細胞は、動物や植物の組織の細胞、酵母等の微生物の細胞等、細胞中の mRNAの 3 ' 末端にポリ A構造を有するものであれば特に制限なく使用することができる。また、原核生物の mRNAは 3 ' 末端にポリ A (poly(A)) 構造を持たないために、そのままではべクタ一プライマ一のポリ Tにァニールさせることはできないが、 mRNAに酵素的にポリ A構造を付加することにより、真核生物の mRNAと同様にして本発明の方法を実施することができる。

mRNAの調製、及び c D N A合成、オリゴヌクレオチドの合成、制限酵素反応、ライ一シヨン反応、ポリメラ一ゼ ·チェイン · リアクション（P C R ) 、形質転換等の操作は、通常の c D N Aクロ一ニングに用いられる mRNAの調製法（例えば Sambrook, J. , Fritsch, E. F.， and Maniatis, T. , "Molecular Cloning A L aboratory Manual , Second Edition" , Cold Spring Harbor Laboratory Press, ( 1989 )等参照）と同様にして行うことができる。

< 2 >ステップ（ b )

次に、前記のようにして得られる c D N Aが結合したベクタ一プライマ一を、ベクタープライマーを切断せず、かつ、前記第二の制限酵素の切断末端と同じ形の末端を生じさせる第三の制限酵素と、前記第二の制限酵素とを用いて消化して c D N Aの上流側を切除し、ベクタープライマーを閉環させる。閉環されたべク夕一プライマ一は、それを適当な宿主に導入し、得られる形質転換体を培養してプラスミドを回収することにより、増幅させることができる。尚、以降の工程で得られる閉環状のベクタープライマーも同様であるが、回収されたベクターブライマ一を切断しょうとする制限酵素部位が、 Damメチレーシヨンにより切断されない場合には、修飾系を有しない宿主を用いる。

前記第三の制限酵素としては 4塩基認識の酵素が好ましい。 6塩基認識の酵素であると、 cDNA配列中に制限酵素部位が存在しない場合がある。また、ベクタ一プライマ一に残される cDNAの配列が長いと、後の操作で得られるタグが m Aのポリ A配列から遠くなる。そのような場合、データべ一ス中の遺伝子の発現情報

(EST :expressed sequence tag) は、通常 mRNAの 3 ' 末端側の一部であるため、タグ配列を検索してもヒットしない場合がある。本発明に好適な 4塩基認識の制限酵素としては、 MboI、 Tai l等が挙げられる。

以下、第三の制限酵素として、 Mbolを用いた例を説明する。まず、 c D N Aが結合したベクタープライマ一（cMA- MAGE/pUC19) を制限酵素 Bgl I I及び Mbolで消化する（図 3 G ) 。このとき、 MAGE/pUC19は Damメチレ一シヨンを受けているので、 Mbolでは切断されず、逆転写により新たに合成された cDNA中の Mbolサイトだけが切断される。図 3 Gは、仮に cDNAが 3箇所の Mbolサイトを含む例を示している。 cDNAに注目すると、ポリ Aテールから上流に向かって最初の bolサイトまでの下流側部分が MAGE/pUC19ベクタープライマ一につながったまま残り、他の部分、すなねち cDNAの上流側は Mbol切断により分離除去される。また、 MAGE/pUC19 は、 Bglllにより一箇所のみが切断される。 Mbol及び Bglllで切断された末端は同じ形をしており、ライゲーシヨン反応で互いをつなぐことができる。そこで、これらの末端を介して、 cDNA- MAGE/pUC19をセルフライゲ一シヨン反応により閉環する（図 3H) 。

< 3〉ステップ（c)

ステップ（b) で閉環したベクタープライマ一を、前記第一の制限酵素及び前記タイプ 11 S制限酵素で消化して、 cDNAの一部からなるタグを残して cDN Aの下流側を切除し、ベクタ一プライマ一を再び閉環する。

具体的には、閉環された cDNA-MAGE/pUC 19を制限酵素 Bsg I及び Pme Iで消化する (図 41) 。これらの制限酵素の切断により、 cDNAの前記 3' 末端側部分のうちポリ Aテールから最も遠い約 13塩基のみがべクタ一プライマーに残る。この cDNAの約 1 3塩基からなる配列を、タグ（図 4 J中の「tag」で示される）と呼ぶ。

上記の Bsglによる切断点は、 5' 側が 2 bp突出しているので、例えば T4 DNA ポリメラ一ゼ処理により平滑化する。また、 Pmelによる他方の切断末端は、平滑末端であるので、これらの末端をライゲ一シヨンすることができる（図 4 J) 。そこで、ベクタ一プライマーをセルフライゲーシヨン反応で閉環すると、夕グ以外の部分の cDNAが切り取られ、 MAGE/pUC19に短いタグがつながった構造のベクタ —プライマーが得られる（図 4 J、K) 。

< 4〉ステップ（d)

次に、ステップ（c) で閉環されたベクタープライマ一を銪型とし、ベクタープライマー中のタグの両側のそれそれの領域に相当する塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマ一として P CRを行い、タグを増幅する。

具体的には、タグを含むベクタープライマーを銹型とし、タグの両側のベクタ —部分の配列に相当するプライマー（例えば配列番号 2及び 3 ) を用いて PCR反応を行う（図 4 K) 。その結果、中央にタグを含む DNAフラグメント（この場合はプライマ一の配列及び夕グを含めて llObp) が増幅される（図 4 L ) 。

< 5 >ステップ（ e )

前 ¾·® Ρ C R増幅産物を連結してタグのコンカテマ一を形成させる。その際、前記（d ) のステップで用いるプライマーのうち、タグの下流側のプライマ一に、第四の制限酵素切断末端と同じ形の末端を生じさせる第五の制限酵素の認識配列を含ませておき、増幅されたプライマーを第四の制限酵素及び第五の制限酵素で消化すると、効率よくコンカテマ一を形成させることができる。第五の制限酵素の種類は特に制限されないが、第四の制限酵素と同じ制限酵素を用いると、操作が簡便となる。また、第四の制限酵素として、第三の制限酵素と同じ制限酵素を用いてもよい。さらに、第三、第四及び第五の制限酵素が同じであってもよい。ただし、第五の制限酵素と第四の制限酵素に同じものを用いる場合は、ステップ ( b ) で cDNAの全配列がベクタープライマーから切除されてしまうので、それを防ぐために、ベクタープライマーの第一の制限酵素認識配列のさらに内側に、第五の制限酵素認識配列と一塩基異なる塩基配列を含ませておき、夕グの下流側に第五の制限酵素認識配列を有するプライマーを用いて P C Rを行うことにより、一塩基異なる塩基配列を第五の制限酵素認識配列に変換するようにする必要がある。また、第三の制限酵素と第四の制限酵素が同じである場合には、ベクタープラィマ一の第四の制限酵素認識部位は、メチレ一シヨンにより切断されないようにしておく必要がある。その場合には、第四の制限酵素で消化する前に、ステツプ（c ) で閉環されたべクタ一プライマ一を修飾系を持たない宿主に導入して脱修飾する。

タグの連結反応を、一方の末端がタグの末端と同じ形を有するアダプター存在下で行い、それによりコンカテマ一の両端にアダプタ一を配置させると、ァダプ夕一の配列に相当する配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーに用いて P C Rを行うことにより、コンカテマ一を増幅することができる。アダプタ一は、タグの量に比べて少量用いるか、一方の末端がタグの末端と異なる形を有するァダブ夕一を用いると、多数のタグからなるコンカテマ一の末端にアダプタ一を配置させることができる。このようにすることで、ごく微量のコンカテマ一でもクローニングすることができ、結果としてごく微量のサンプル mRNAを用いた解析が可能となる。

タグとアダプターの比率は、通常モル比でタグ：アダプタ一 = 1 ： 1〜 1 ： 0 . 0 1、4子ましくは 1 ： 0 . 2〜； 1 : 0 . 0 5である。この範囲でアダプタ一を用いると、タグが 2〜5 0程度連結したコンカテマ一が得られる。

得られるコンカテマ一は、塩基配列決定用のクロ一ニングベクタ一に挿入すると、シークェンス操作が容易になる。

MAGE/pUC19を用いる場合には、ステップ（d ) の増幅産物を制限酵素 Mbolで消化することにより、タグを含む小断片が得られる（図 5 M ) 。ここで得られた夕グ断片は、既知の DNA配列、すなわち GATCと AAACGに挟まれており、どの部分が夕グかを明確に識別することができる。このタグ配列は両端に Mbolサイ卜が露出しているので、ライゲーシヨン反応により夕グ同士を連結し、コンカテマ一を形成させることができる（図 5 M ) 。

< 6 >ステップ（f )

上記のようにして得られるコンカテマ一の塩基配列を決定すると、その中には多数の cDNA分子に由来するタグが含まれているので、その塩基配列中に出現するタグの種類及びその頻度を調べることにより、 cDNAが由来する遺伝子の発現頻度を解析することができる。タグの種類は、既知の mMAの部分配列（EST) の情報に関するデ一夕ベースを検索することにより調べることができる。

尚、タグのコンカテマ一を増幅することにより、同一配列を持つフラグメントが複数個生じることになる。しかし、クロ一ニング後のシークェンス解析において、先にシークェンスしたものと同一物とみなされるシークェンスは出現した場合は、それを解析から除くことにより、遺伝子発現頻度解析に PCRが及ぼす悪影響を排除することができる。

また、第四と第五の制限酵,素として同じ酵素を用いた場合は、コンカテマ一中のタグの向きは不定であるので、配列解析においては一方の鎖だけでなく逆鎖の配列も考慮する。

以上説明したように、本発明の方法では、 SAGE法のようにダイタグを作らず、個々のタグを既知の DNA断片で挟むことにより、タグが他のタグと連続しないようにすることができる。その結果、タグの境界が曖昧になるという問題点が解決される。また、 PCRを複数回行い、試料を増幅することができるので、微量の mRNAからでも解析が可能となる。さらに、ベクタ一プライマーを用いることにより、ベクタ一に融合した形の cDNA合成を行うことで、アビジンやピオチンビーズを用いずに解析することができる。実施例

マウス C57BL/6肝臓 lgから、 Invitrogen社製 FastTrack 2.0キットを用いて mRN A 35〃gを抽出した。

得られた mRNA 0.97〃gを用いて、以下の様にして MAGE/pUC19を用いて逆転写 cD NA合成後、遺伝子発現頻度解析を行った。

MAGE/pUC19ベクタ一（図 2A) を、制限酵素 BstXI及び Pstlで処理し、切り取られた小断片を除去した（図 2 B) 。次に BstXIによる切断末端に、一本鎖のポリ T配列を有する部分二本鎖 DNA (図 2 Cに示すポリ Tアダプター）をライゲ —シヨンした（図 2D) 。このベクタープライマ一では、第一の制限酵素は Pmel であり、第二の制限酵素は Bglllであり、タイプ IIS制限酵素は Bsglである（図 3E) 。

上記ベクタープライマー 0.2〃gと、上記のマウス肝臓由来の mRNA 0.97〃gとをァニールさせ、 cDNA合成を行い、続いて合成された一鎖目の cDNAを錶型として二鎖目を合成した（図 3 F) 。そして、得られた cDNAの 40分の 1に当たる量（mRNA 0.025〃g相当）を材料に遺伝子発現頻度解析を行った。

尚、別の実験では、 4.5mgの微量臨床サンプルから抽出した、 0.05 ^の微量11111 NAを実験材料にして、逆転写 cDNA合成後、以下と同様にして遺伝子発現頻度解析を実施することに成功している。

次に、前記のようにして得られる cDNAが結合したベクタ一プライマ一を、第二の制限酵素 Bglll及び第三の制限酵素である Mbolで消化した（図 3G) 。次に、 c DNA- AGE/pUC 19の Mbo I末端及び Bgl 11末端をセルフライゲ一シヨン反応により連結して閉環させた（図 3 H) 。

前記の閉環したベクタ一プライマ一を Bsgl及び Pmelで消化し、 T4 MAポリメラ —ゼ処理により平滑化した後、ベクタープライマーを再び閉環させた（図 41〜 K ) 。この閉環されたべクタ一プライマーを銪型とし、ベクタ一プライマ一中のタグの両側のそれそれの領域に相当する塩基配列を有するオリゴヌクレオチド

(配番号 2及び 3 ) をプライマ一として、酵素 AmpliTaq Gold (PE Biosystems 社）を用いて P C Rを行い、タグを増幅した（図 4 L ) 。 P C R反応は、変性

(95°C、 0.3分）、アニーリング及びポリメラ一ゼによる伸長反応（72°C、 1.5分）からなる反応を 65サイクル行うことにより行った。その結果、中央にタグを含む llObpの DNAフラグメントが増幅された。

前記の P C R増幅産物を Mbolで消化してタグを切り出し、タグ：アダプタ一が 8 ： 1となるように、配列番号 4、 5に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをァニールさせたアダプタ一を加えて連結反応を行い、夕グのコンカテマ一を形成させた（図 5 M) 。このコンカテマ一を、配列番号 6に示す塩基配列を有するプライマーを用いた P C Rにより増幅した。 P C R反応は、変性（95° 0.3 分）、アニーリング（40°C、 3分）、ポリメラ一ゼによる伸長反応（72°C、 1分）からなる反応を 5サイクル行い、引き続き変性（95°C、 0.3分）、アニーリング及び伸長反応（72°C、 1分）からなる反応を 60サイクル行った。増幅産物を制限酵素 Notlで消化し、シークェンス用クロ一ニングベクタ一 pKF3の Notl部位に挿入して、塩基配列を決定した。

得られたシークェンスデ一夕（11000個）から、同一の配列を有する夕グをグループィ匕し、出現頻度順に並べた。頻度上位 1 0番までを表 1に示す。この結果から、マウス肝臓組織中で最も発現頻度が高い遺伝子はゥリナリ · プロテイン I /I I遺伝子であることがわかる。以下、発現頻度の高い順に、アルブミン遺伝子、ゥリナリ · プロテイン I I I遺伝子、アルギニノコハク酸合成酵素遺伝子と並んでいる。このように、本発明の方法は、 mRNAサンプルが微量であっても、ベクタープライマーを用いることにより cDNAの回収効率が高く、またタグ配列の不明瞭さを除くことが可能であるので、遺伝子発現頻度を高精度で解析することができる。表 1 タ（配列番号）頻度順位夕グの数遺伝子名

TGCATTCCATC ( ) 1 2196 ゥリナリ · プロティン I/I I

CCTGGTGGAAA ( 8) 2 1261 アルブミン

TGCTCTCCACC ( 9 ) 3 485 ゥリナリ ·プロティン I I I

GGGAAGTACGC ( 10 ) 4 383 アルギニノコハク酸合成酵素

ACCTCGGATGA ( 11 ) 5 . 345 フィブリノ一ゲン Aひ

TTCCAGGCCCG ( 12) 6 333 ァポリポプロティン E

ACCAGTGTCGC ( 13 ) 7 310 マウス EST

TGCATGCCCTG ( 14) 8 307 フヱリチン軽鎖

CACTACAGCAC ( 15 ) 9 300 マウス EST

CTGCCAAGTTC ( 16 ) 10 226 レチノ一ル結合夕ンパク質

産業上の利用の可能性

本発明により、遺伝子の発現頻度を、簡便に、確実に、かつ精度よく解析することができる。

本発明の遺伝子発現解析法は、生命科学の研究にとって有用であるが、特に、健康人と病気の人における特定臓器、又は細胞における遺伝子発現の差異を解析する事により、病気の治療法開発や診断法開発に有用である。例えば、健康人の肝臓と肝炎の肝臓の発現遺伝子の違いを本法により解析することにより、肝炎で特異的に発現が増加したり減少したりする遺伝子を見つけることができる。これら遺伝子の肝臓での役割を調べることにより、肝炎治療を目的として、この遺伝子の働きを阻害したり、促進させたりする薬剤を開発することができる。又、遺伝子そのもの、遺伝子構造から設計したアンチセンスオリゴヌクレオチド、あるいは遺伝子を発現させて得た蛋白質等を、肝炎治療に用いることができる。

また、発症のメカニズムが解っていない病気に対しても、本発明の方法を用いれば、治療法を開発できる可能性がある。さらに、本発明の方法により疾患特異的に発現が変動する遺伝子を発見することができれば、治療ばかりでなく、疾患の診断法を開発することも可能となる。さらに、医療における利用ばかりでなく、全ての真核生物を対象に有用遺伝子を発見する手段ともなる。例えば、ビール生産に適した酵母を変異により育種した場^ 親株と変異株の遺伝子発現の変化を本発明の方法で解析し、変異により発現が変化した遺伝子を同定することができる。このようにして得たビール生産にとつて有利な遺伝子を総合的に操作することにより、よりよいビール生産酵母を創製することができる。

また、例えば、大腸菌やコリネパクテリゥムのようなアミノ酸生産菌の解析を行うことにより、より優れたアミノ酸生産菌を創製することができる。

Claims

請求の範囲

1. 以下のステップを含む遺伝子の発現頻度を解析する方法；

(a) "ii鎖状のプラスミドベクタ一の一方の 3' 末端に一本鎖のポリ T配列と、その内側に第一の制限酵素認識配列とを有し、他方の末端近傍に第二の制限酵素認識配列と、さらにその内側にタイプ 11 S制限酵素認識配列とを有するベクタープライマ一と、遺伝子の発現頻度を解析しょうとする細胞に由来する mRNAとをァニールさせて c DNA合成を行い、 c DNAが結合したベクタ一プライマ一を生成するステップと、

(b)前記 cDNAが結合したベクタ一プライマ一を、ベクタープライマーを切断せず、かつ、前記第二の制限酵素の切断末端と同じ形の末端を生じさせる第三の制限酵素と、前記第二の制限酵素とを用いて消化して cDNAの上流側を切除し、ベクタ一プライマ一を閉環するステップと、

(c) 閉環したベクタ一プライマーを、前記第一の制限酵素及び前記タイプ IIS 制限酵素で消化して、 c D N Aの一部からなる夕グを残して c D N Aの下流側を切除し、ベクタ一プライマ一を再び閉環するステップと、

(d ) 前記ベクタープライマーを铸型とし、ベクタ一プライマ一中のタグの両側のそれぞれの領域に相当する塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとしてポリメラ一ゼ ·チェイン · リアクション（PCR) を行い、タグを増幅するステップと、

(e)前記増幅産物を連結してタグのコンカテマ一を形成するステップと、

(f ) 前記コンカテマ一の塩基配列を決定し、その塩基配列中に出現するタグの種類及びその頻度を調べるステップ。

2. 前記ステップ（e) において、連結反応を、一方の末端がタグの末端と同じ形を有するアダプタ一存在下で行い、それによりコンカテマ一の両端にァダブ夕一を配置させ、ァダブ夕一の配列に相当する配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーに用い、コンカテマ一を錶型として P CRを行うことによりコン力テマ一を増幅することを特徴とする請求項 1記載の方法。

3. 前記ステップ（e) の後に、前記コンカテマ一の塩基配列の決定を、塩基配列決定用のクロ一ニングベクタ一にクロ一ニングして行うことを特徴とする請求項 1又は 2記載の方法。

4 . 前記第三の制限酵素の認識配列が 4塩基である請求項 1〜 3のいずれか一 (こ記載の方法。

5 . ベクタープライマ一は、第二の制限酵素.認識配列の切断点と同じ位置又はその内側に切断点を有し、かつ、タイプ I I S制限酵素による切断によってべクタ一プライマ一から切除されない第四の制限酵素認識配列を有し、

前記（d ) のステップで用いるプライマーのうち、タグの下流側のプライマ一は、第四の制限酵素切断末端と同じ形の末端を生じさせる第五の制限酵素の認識配列を有し、増幅されたプライマーを第四の制限酵素及び第五の制限酵素で消化した後にコンカテマ一を形成させる請求項 1〜 4のいずれか一項に記載の方法。

6 . 前記べクタ一プライマーは、第一の制限酵素認識配列のさらに内側に第五の制限酵素認識配列と一塩基異なる塩基配列を有し、前記夕グの下流側のプライマーを用いた P C Rにより前記一塩基異なる塩基配列が第五の制限酵素認識配列に変換される請求項 5記載の方法。

7 . 前記第三の制限酵素、第四の制限酵素及び第五の制限酵素が同一である請求項 6記載の方法。

8 . ベクタープライマ一が、マルチクロ一ニング部位を有するプラスミドを同マルチクローニング部位の二箇所で切断して得られる直鎖状プラスミドと、この直鎖状プラスミドの一方の末端と同じ形の末端を有し、一本鎖のポリ T配列を有する部分二本鎖 D N Aとが連結されたものである請求項 1〜7のいずれか一項に記載の方法。