WO2000047753A1 - Adn plasmidique cyclique provenant d'actinomycetes - Google Patents

Adn plasmidique cyclique provenant d'actinomycetes Download PDF

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WO2000047753A1
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seq
streptomyces
actinomycetes
derived
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PCT/JP2000/000708
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Inventor
Satoshi Inouye
Hiroshi Takagi
Shigeru Nakamori
Original Assignee
Chisso Corporation
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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/76—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Actinomyces; for Streptomyces

Definitions

  • the present invention relates to an actinomycete-derived plasmin DNA having f-polylysine-producing ability.
  • Actinomycetes have the ability to produce secondary metabolites such as antibiotics and various bioactive substances, and understanding their genetic background is very important in the development of industrial production. It provides a rationale for traditional strain improvement and provides a more rational strategy. Specifically, by artificially manipulating genes involved in the metabolic pathway of antibiotics, the structure of the final product can be actively modified, or the gene expression of enzymes involved in the production can be positively modified. By changing the control of the production, improvement of production can be expected.
  • actinomycetes are often genetically unstable, and it is possible to carry out conservation analysis by transferring the gene controlling the trait to a stable system by recombination. Therefore, development of plasmid vector, which is essential for a gene recombination system using actinomycetes as a host, is desired.
  • the actinomycete plasmid vector system has been developed mainly for specific strains.
  • the major characteristic of actinomycetes is that their characteristics vary greatly depending on the species, and therefore, unlike the currently widely used Escherichia coli, a standard host-vector system However, it is not enough, and it is necessary to develop a host-vector system suitable for each species to be studied.
  • f-polylysine which has rapidly spread as an antimicrobial food additive, is a polymer of lysine produced by specific actinomycetes. It is a derivative and its price is more than 10 times higher than sorbic acid and glycine, which are known as other general preservatives.
  • no research and development has been conducted on plasmid vectors using actinomycetes producing £ -polylysine as a host. Disclosure of the invention
  • the present inventors aimed at further improving the productivity of an actinomycete strain Streptomyces genus having the ability to produce E-polylysine, which is currently industrially used for production, to improve the productivity.
  • the object of the present invention is to provide a plasmid for producing a polylysine shown in the following (1) to (5), and a transformation shown in the following (6). It is to provide the body.
  • the present invention has the following configurations (1) to (6).
  • Cyclic plasmid derived from actinomycetes belonging to the genus Streptomyces, having a molecular weight of about 37 Kbp and having a restriction enzyme recognition site shown in Fig. 1. p N 0 3 3.
  • Streptomyces albus Streptomycesa 1 bu 1 us
  • FIG. 1 shows a restriction map of the plasmid pN033 of the present invention.
  • the black part is the determined part of SEQ ID NO: 1.
  • the plasmid pN033 of the present invention is a cyclic plasmid obtained from a bacterium that produces £ -polylysin belonging to the genus Streptomyces.
  • the plasmid of the present invention is, for example, Streptomycesa 1bu 1 us IF 0 1 4.14 having the ability to produce ⁇ -polylysine. 7 Strength It is a replicable cyclic plasmid having a total length of about 37 kb and having the restriction enzymes shown in Tables 1, 2 and 1. ⁇ table 1 ⁇
  • the plasmid ⁇ 033 of the present invention has cleavage sites by various restriction enzymes, and this fact has been confirmed by modifying this plasmid.
  • the target gene or the like for example, ⁇ -polylysine-producing enzyme system, is incorporated into this plasmid or its induction plasmid, and this is introduced into an appropriate bacterium to host the host. Can also be transformed.
  • the partial base sequence of the plasmid ⁇ ⁇ 033 of the present invention is determined and the known sequence is determined.
  • the present inventors have designed a DNA fragment derived from the plasmid ⁇ 033. After subcloning to an appropriate plasmid, its nucleotide sequence was determined and determined as shown in SEQ ID NO: 1.
  • the plasmid pN033 partial nucleotide sequence is a nucleotide sequence that has not been known at all up to now, and the plasmid pNO33 derived from Streptomyces is a novel nucleotide sequence. It became clear that it was plasmid DNA.
  • SEQ ID NO: 2 is a translatable region corresponding to positions 1576 to 1803 of SEQ ID NO: 1, and is a protein-like polypeptide composed of 76 amino acid residues.
  • SEQ ID NO: 3 is a translatable region corresponding to No. 641 to No. 1576 of SEQ ID NO: 1, and is a polypeptide-like substance composed of 312 amino acid residues.
  • a useful gene of interest for example, a gene for an enzyme that produces £ 1 poridine
  • a useful gene of interest is incorporated into the plasmid pNO33 of the present invention and transformed into a suitable host.
  • a strain having a high f-polylysine-producing ability can be obtained.
  • a homologous search was similarly performed on the genomic center database using SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3, and as a result, The gene ORF—D (75 amino acid residues), which is present in the chromosome of Celiac varieties (. Streptomycescoelicolor) and is involved in the regulation of the production of the antibiotic actinorhodin, is about 36 % Homology was found.
  • the plasmid pN033 of the present invention may be present as a regulatory gene involved in secondary metabolites such as antibiotics, and can be used industrially. .
  • Tris (hydroxy) amide (hereinafter referred to as "tris") is 25 mM and ethylenediamine.
  • Tris Tris (hydroxy) amide
  • EDTA sodium sodium acetate
  • the cells were lysed (0.3 M sucrose, Tris).
  • the suspension thus obtained was left at 4 ° C. for 5 minutes, and then 2% by weight of sodium raurylsulfate and sodium hydroxide were added to the suspension. um was added 0. 3 1 0 an aqueous solution containing a concentration of N ml, after mixing, was allowed to stand for 5 minutes at 4 D C on further.
  • the suspension was mixed with 15 ml of a 5 M aqueous solution of ammonium acetate, allowed to stand at 4 ° C for 10 minutes, and then centrifuged at 1200 g for 10 minutes. After the separation,
  • nucleic acid fraction To the water-soluble fraction was added 0.1 volumes of a 3 M sodium acetate aqueous solution and 2 volumes of ethanol, and the water-soluble fraction was added at ⁇ 20 ° C. to 30 ° C. After standing for 1 min, the precipitated white precipitate (nucleic acid fraction) was collected by centrifugation at 1200 g for 20 minutes, and the collected nucleic acid fraction was added to 1 ml of TE buffer. It was dissolved to obtain a nucleic acid fraction solution.
  • ribonuclease manufactured by Sigma, trade name: Product name: RIBONUCLEASE A
  • aqueous solution containing 20% (W / V) of polyethylene glycol and 5 M of sodium chloride was added, and the mixture was allowed to stand at 4 ° C for 1 hour. During the standing, a white precipitate was deposited in the mixture.
  • the white precipitate was recovered by centrifugation at 1200 g for 20 minutes.
  • the collected white precipitate was dissolved in lm 1 of TE buffer to obtain a plasmid pN033 of the present invention.
  • the white precipitate solution was subjected to 0.7% agarose gel electrophoresis (100 volts, 20 minutes), and the gel was stained with a bromide reagent. It was confirmed.
  • Example 1 Detailed restriction enzyme mapping of the plasmid pN033 obtained in Example 1 was performed using various commercially available restriction enzymes (manufactured by Nippon Gene and Takara Shuzo). The DNA fragment obtained by digesting 0, 33 with single, double, or triple digestion is subjected to 0.7% agarose gel electrophoresis or Biofield's Norsfield. The sample was subjected to electrophoresis, and the molecular weight was determined from the mobility.
  • plasmid pN033 DNA was digested with a restriction enzyme, EcoRI, and the fragment was replicated in E. coli.
  • a restriction enzyme EcoRI
  • pBluescript SK + pBluescript SK +
  • the inserted fragment was confirmed by plasmid separation based on the plasmid isolation method described in Example 1, digestion with EcoRI, and then by 0.7% agarose gel electrophoresis.
  • the nucleotide sequence of the inserted fragment was determined by a fluorescence seek sensor (ABI 373) of Applied Biosystems using a dye terminator-cycle sequencing method.
  • SEQ ID NO: 1 Based on SEQ ID NO: 1, a translatable region was searched by using DNASIS Ver. 3.6 gene analysis software manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd., and two amino acid sequences (SEQ ID NO: 2) were searched. , And SEQ ID NO: 3) were clarified.
  • SEQ ID NOs: 1, 2, and 3 Based on SEQ ID NOs: 1, 2, and 3, whether there is homology to all genetic databases constructed worldwide Force, via the Internet, on the GenomeNet homepage (http://www.ncbi.n1m.nih.gov/) where the analysis software is available. The foot was searched using FASTA and BLAST. SEQ ID NO: 1 is used for all entry gene sequences, and SEQ ID NOs: 2 and 3 are translated from entry amino acid sequences and entry gene sequences. Performed on the amino acid sequence. As a result, a gene sequence having significant homology to SEQ ID NO: 1 could not be detected.
  • SEQ ID NOs: 2 and 3 are present on the chromosome of Streptomyces coelico 1 or Streptomyces sp. Approximately 36% homology was found with the involved gene ORF-D. This suggests that a gene for a secondary metabolite such as an antibiotic is present on the plasmid of the present invention, indicating that it can be used industrially. Industrial availability
  • the plasmid of the present invention has cleavage sites with various restriction enzymes, many useful vectors which modify this plasmid and can be used for Streptomyces bacteria can be used. Can develop In addition, a useful gene can be incorporated into this plasmid and introduced into a Streptomyces bacterium to transform a host to produce a useful substance.

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Description

明 細 書
放線菌由来の環状プラ ス ミ ド D N A 技術分野
本発明は、 f 一ポ リ リ ジン生産能を有する放線菌由来のブラ ス ミ ド D N Aに関する。 背景技術
放線菌は、 抗生物質や様々 な生理活性物質に代表される よ う な二次代謝産物を生産する能力を持ち、 その遺伝子的背景の解 明は、 工業生産の開発において非常に重要である。 それは、 従 来行われてきた菌株改良に理論的根拠を与え、 よ り 合理的な戦 略を提供するからである。 具体的には、 抗生物質の代謝経路に 関与する遺伝子を人為的に操作する こ と によ り 、 最終産物の構 造を積極的に改変 した り 、 またその生産に関与する酵素の遺伝 子発現の制御を変更する こ と によ り 、 生産の向上も望める。
一般的に、 放線菌はしばしば遺伝学的に不安定なこ と があ り 、 形質を支配する遺伝子を組換え操作によ り 安定な系に移して保 存解析も可能である。 こ のこ と から、 放線菌を宿主に した遺伝 子組換え系で必須である プラス ミ ドベク ターの開発が望まれて いる。 しか し、 放線菌のプラ ス ミ ドベク ター系は、 主に特定の 菌株でのみでの開発が行われている。 一方、 放線菌の大き な特 徴は、 菌種によ り その性質が非常に こ と なる こ と から、 現在汎 用 されている大腸菌の場合と異なって、 スタ ンダー ドの宿主一 ベク ター系では不十分であ り 、 個々 の研究対象の菌種に合っ た 宿主一べク ター系の開発が必要である。
現在ま でに、 抗菌食品添加剤と して、 急速に波及 している f —ポ リ リ ジンは、 特定の放線菌が産生 している リ ジンのポ リ マ 一誘導体であ り 、 他の一般的保存剤 と知 られている ソルビン酸 やグ リ シン等に比べ、 その価格は 1 0倍以上高価である。 f — ポ リ リ ジ ンの生産性を上げるため古典的変異剤処理によ り 、 高 生産性菌株の分離を試みて来たが、 E —ポ ！ リ ジンの生産価格 を飛躍的に押 し下げる までには至っていない。 そこで、 遺伝子 組換え手法の導入によ る生産性向上が必須である と 考えられ、 そのためには、 f —ポ リ リ ジンの生産菌での使用可能なベク タ 一系の開発が急務である。 しか し、 今 日 まで、 £ —ポ リ リ ジン を生産する放線菌を宿主 と したプラス ミ ドベク タ一に関する研 究開発は全く 行われていない。 発明の開示
そこで、 本発明者ら は、 現在工業的に製造に使用 している E 一ポ リ リ ジンの生産能を有する放線菌株ス ト レブ トマイセス属 での さ ら なる生産性向上のために、 該菌株での宿主一プラス ミ ドベク タ ー系に使用可能な新規プラ ス ミ ドの単離およびその利 用を可能とすべく 鋭意研究を行った。
その結果、 E — ポ リ リ ジンの生産能を有する放線菌ス ト レプ トマイセス アルブラスの細胞内で複製可能なプラス ミ ドを見 い出 し、 本発明に至った。
以上の記述から明 らかなよ う に、 本発明の 目的は、 下記 （ 1 ) 〜 （ 5 ) に示される ポ リ リ ジン製造用のプラス ミ ド、 および下 記 （ 6 ) に示される形質転換体を提供する こ と である。
すなわち、 本発明は下記 （ 1 ) 〜 （ 6 ) の構成を有する。
( 1 ) ス ト レプ トマイ セ ス属に属する放線菌由来の環状プラス ミ ドであっ て、 分子量が約 3 7 K b p であ り 、 図 1 に示される 制限酵素認識部位を有するプラ ス ミ ド p N 0 3 3。
( 2 ) ス 卜 レプ ト マイ セ ス属に属する放線菌由 来の環状プラ ス ミ ドであって、 分子量が約 3 7 K b p であ り 、 配列番号 1 で示 される塩基配列を含む前記第 1 項記載のプラス ミ ド p N O 3 3 。
( 3 ) ス ト レブ トマイ セス属に属する放線菌由来の環状プラス ミ ドであって、 分子量が約 3 7 K b p であ り 、 配列番号 2 また は配列番号 3 で示される ァ ミ ノ 酸配列を有する タ ンパク質また は該タ ンパク 質と実質的に同等の機能を有する タ ンパク質をコ ー ドする前記第 1 項または第 2項記載のプラス ミ ド p N 0 3 3 。
( 4 ) ス ト レブ ト マイ セス属に属する放線菌が、 ε —ポリ リ ジ ン生産能を有する前記第 1 項〜第 3 項の何れか 1 項記載のブラ ス ミ ド ρ Ν 0 3 3 。
( 5 ) ス ト レブ トマイ セス属に属 し Ε —ポ リ リ ジン生産能を有 する放線菌が 、 ス ト レプ ト マイ セ ス アルブラ ス （ S t r e p t o m y c e s a 1 b u 1 u s ) I F 〇 1 4 1 4 7 である前 記第 4項記載のプラス ミ ド p N ◦ 3 3 。
( 6 ) 環状プラ ス ミ ド p N 0 3 3 由来の全部あるいは一部塩基 配列断片を用いて構築 したプラス ミ ド。 図面の簡単な開示
図 1 は、 本発明のプラス ミ ド p N 0 3 3 の制限酵素地図を示す。 黒色部分は、 配列番号 1 の決定部分である。 発明を実施するための最良の形態
以下、 さ ら に詳細に本発明を説明する。 本発明のプラ ス ミ ド p N 0 3 3 は、 ス ト レプ トマイ セス属に属する £ —ポ リ リ ジン の生産菌から得られる環状プラス ミ ドである。
具体的には、 本発明のプラ ス ミ ドは、 例えば ∑ —ポ リ リ ジン の生産能を有する ス ト レプ ト マイ セ ス ァノレブラ ス （ S t r e p t o m y c e s a 1 b u 1 u s ) I F 0 1 4. 1 4 7 力 ら得 る こ と ができ 、 全長約 3 7 k b よ り な り 、 且つ表 1 、 表 2及び 図 1 に示す制限酵素をもつ複製可能な環状プラス ミ ドである。 【表 1 】
Figure imgf000006_0001
Aはアデニン、 C はシ ト シン、 Gはグァニン、 Tはチ ミ ンを示 す。 図 1 において、 決定された制限酵素の位置は、 制限酵素 Hindi II の位置を起点と して、 時計周 り の距離は表 2 の とお り である。 【表 2 】
Figure imgf000007_0001
明 らかに、 本発明のプラ ス ミ ド ρ Ν 0 3 3 は各種の制限酵素 によ る切断部位を有 してお り 、 こ の事実は、 本プラ ス ミ ドを修 飾して多く の有用なべク ターを開発する こ と を示 している。 ま た、 こ のプラス ミ ドあるいはその誘導プラ ス ミ ドに 目 的 とする 遺伝子等、 た と えば ε —ポ リ リ ジンの生産酵素系を組み込み、 これを適当な細菌に導入 してその宿主を形質転換する こ と も可 能である。
さ ら に、 本発明によ り 得られたプラ ス ミ ドに新規性があるか ど う か判断する には、 本発明のプラ ス ミ ド ρ Ν 0 3 3 部分塩基 配列を決定し、 既知のス ト レプ トマイ セス属由来のプラ ス ミ ド と比較する こ と によ り 、 容易に異なる こ と が判断でき る。 そ こ で、 本発明者ら は、 プラ ス ミ ド ρ Ν 0 3 3 由来の D N A断片を 適当なプラ ス ミ ドにサブク ローニ ング後、 その塩基配列を決定 し、 配列番号 1 に示すよ う に決定した。 得られた塩基配列 （配 列番号 1 ) を用いて、 東京大学医科学研究所ヒ ト ゲノ ム解析セ ンターおよび米国 N a t i o n a l C e n t e r f o r B i o t e c h n o l o g y I n f o r m a t i o n ( N C B I ) のデーターベース保有のすべでの塩基配列に対してホモ ロ ジー検索を行った結果、 塩基配列が同一の も のは検出でき な かった。 また、 細菌由来の塩基配列の相同性が 4 0 %以上でか つプラ ス ミ ド配列由来の塩基配列も全く 検出でき なかった。 す なわち、 プラ ス ミ ド p N 0 3 3 部分塩基配列は、 現在まで全く 知 られていない塩基配列であ り 、 ス ト レプ ト マイ セス属由来プ ラス ミ ド p N O 3 3 は新規のプラ ス ミ ド D N Aである こ と が明 らかと なつた。
さ ら に、 決定 した配列番号 1 内に、 機能遺伝子 と しての翻訳 可能領域が存在するかど う か調べた と こ ろ、 翻訳可能領域が存 在し、 その内容は、 配列番号 2 、 および配列番号 3 に示される よ う なア ミ ノ 酸配列である こ と が明 らかと なった。
配列番号 2 は、 配列番号 1 の 1 5 7 6 番から 1 8 0 3 番に相 当する翻訳可能領域で、 7 6 ア ミ ノ 酸残基よ り 構成される タ ン パク質様ポ リ ペチ ドである。 配列番号 3 は、 配列番号 1 の 6 4 1 番から 1 5 7 6 番に相当する翻訳可能領域で、 3 1 2 ァ ミ ノ 酸残基よ り 構成されるポ リ ペチ ド様物質である。
この こ と 力 ら 、 本プラ ス ミ ド p N 0 3 3 には、 他の翻訳可能 遺伝子を組み込むこ と が可能である こ と は明 らかである。
すなわち、 目 的 と する有用遺伝子、 た と えば £ 一ポ リ リ ジ ン の生産酵素系遺伝子を、 本発明のプラ ス ミ ド p N O 3 3 組み込 み、 これを適当 な宿主に形質転換する こ と によ り 、 f —ポ リ リ ジン生産能力の高い菌株を得る こ と ができ る。 一方、 その配列番号 2 および配列番号 3 を用いて同様にゲノ ムセ ン タ ーのデータ一ベース にホモ ロ ジ一検索を行った結果、 特に配列番号 2 に関 して、 ス ト レプ ト マイセス属セ リ カ ラー種 (. S t r e p t o m y c e s c o e l i c o l o r ) の染色 体に存在 し、 抗生物質ァ クチノ ホヂン （ A c t i n o r h o d i n ) の産生調節に関与する遺伝子 O R F — D ( 7 5 ア ミ ノ酸 残基） と約 3 6 %の相同性が見い出 された。 こ の こ と は、 本発 明プラ ス ミ ド p N 0 3 3 は、 抗生物質等の二次代謝産物に関与 する調節する遺伝子 と して存在する可能性があ り 、 産業上利用 でき る。
(実施例）
次に本発明の実施例を示すが、 本発明はこれ らの実施例に何 ら限定される も のではない。
実施例 1
ス ト レ フ。 ト マイ セ ス ァノレブ ラ ス （ S t r e p t o m y c e s a 1 b u 1 u s ) I F 〇 1 4 1 4 7 力 ら の プラ ス ミ ド p N 0 3 3 の単離。
ス ト レ フ。 ト マイ セ ス ァノレブ ラ ス （ S t r e p t o m y c e s a 1 b u 1 u s ) I F 〇 1 4 1 4 7 の一白金耳の灰色胞子 を、 5 0 0 m l 容量の坂 口 フ ラ ス コ にいれた 5 0 m l の液体培 地ノくク ト ト リ プ ト ン 1 0 g 、 ィ 一ス ト ェ ク ス ト ラ ク ト 5 g 、 食 塩 5 g を 1 L の水道水に溶解後、 p Hを 7 . 3 に調整した培地） に接種 し、 振盪速度 1 4 0 r p m、 温度 3 0 °Cで 1 6 時間培養 した。
1 6 時間経過後、 該培養液を 5 0 0 0 g で 5 分間遠心分離す る こ と によ り 、 培養液から菌体を分離 · 集菌 し、 得られた菌体 を T E緩衝液 （ ト リ ス （ ヒ ド ロ キ シ） ァ ミ ノ メ タ ン （以下 「 ト リ ス 」 と 表記す る。 ） を 2 5 m M、 お よ びエチ レ ンジァ ミ ン四 酢酸ニナ ト リ ウム （ E D T A ) を 2 5 mMの濃度で含有する水 溶液、 p H 8 . 0 ) で洗浄後、 該菌体を溶菌液 （シ ョ 糖を 0 . 3 M、 ト リ ス を 2 5 mM、 E D T Aを 2 5 mM、 およびリ ゾチ ームを 2 m g Z m 1 の濃度で含有する水溶液） 2 0 m 1 に懸濁 させた。
こ のよ う に して得 られた懸濁液を 4 °Cで 5 分間放置した後、 該懸濁液に、 ラ ウ リ ル硫酸ナ ト リ ゥムを 2 重量％および水酸化 ナ ト リ ウムを 0 . 3 Nの濃度で含有する水溶液を 1 0 m l 添加 し、 混合後、 さ らに 4 DCで 5 分放置した。
該懸濁液に 5 M酢酸ア ンモニ ゥム水溶液を 1 5 m 1 混合 し、 4 °Cで 1 0 分放置 した後、 該懸濁液を 1 2 0 0 0 g で 1 0 分間 遠心分離し、 分離後その上清を 3 5
m 1 分取した。
この上清に等量の T E緩衝液飽和のフ ノ ールを加えた後、 撹拌機 （ロ ーテ一ター RT- 50 タイ テ ッ ク社製） を用いて 5 分 間混合した。 こ の混合液を 1 2 0 0 0 g で 1 0分間遠心分離し、 水溶性画分を 3 5 m 1 分取した （水溶性画分①） 。
こ の水溶性画分①に等量のク ロ 口 ホルムを添加後、 撹拌機 （口 ーテーター RT- 50 タイ テ ッ ク社製） 5 分間混合 し、 こ の混合 液を 1 2 0 0 0 g で 1 0 分間遠心分離 し、 水溶性画分を 3 5 m 1 分取した （水溶性画分②） 。
該水溶性面分②に、 0 . 1 倍容の 3 M酢酸ナ ト リ ウム水溶液 と 2 倍容のエタ ノ ールを添加 し、 該水溶性画分②を— 2 0 °Cで 3 0 分放置後、 析出 した 白色沈殿物 （核酸画分） を 1 2 0 0 0 g で 2 0 分間遠心分離する こ と によ り 回収 し、 回収 した核酸画 分を 1 m 1 の T E緩衝液に溶解 し核酸画分溶解液を得た。
リ ボ核酸除去のため、 該核酸画分溶解液に、 最終濃度が 5 0 u g Z m 1 と なる よ う に、 リ ボ核酸分解酵素 （シグマ社製、 商 品名 ： RIBONUCLEASE A) を力 [!え、 3 7 °Cで 3 0 分反応させた。 3 0 分経過後、 ポ リ エチ レングリ コールを 2 0 % ( W/V) 、 食塩 を 5 Mの濃度で含有する水溶液を 0 . 6 倍容加え、 4 °Cで 1 時 間放置した。 放置中、 該混合液に白色沈殿物が析出 した。
該白色沈殿物を 1 2 0 0 0 g で 2 0 分間遠心分離する こ と に よ り 回収 した。 回収された白色沈殿物を lm 1 の T E緩衝液に溶 解し、 本発明のプラス ミ ド p N 0 3 3 を得た。
該白色沈殿溶解液を 0 . 7 %ァガロースゲル電気泳動 （ 1 0 0 ボル ト 、 2 0 分） に供 し、 ゲルを臭化工チジュ ゥムで染色す る こ と によ り 、 高分子核酸の存在を確認した。
さ ら に、 こ の高分子核酸画分を制限酵素 H i n d lll (日 本 ジー ン社製） で消化後、 バイ オラ ッ ド社製のパルスフ ィ 一ル ド 電気泳動装置 （泳動条件は、 バイ オラ ッ ド社製によ り 提供され ている条件、 2 0 0 ボル ト、 1 6 時間） に供し、 酵母染色体を 分子量マーカー と して約 3 7 k b p のプラス ミ ド p N 0 3 3 由 来の D N A断片を確認した。
実施例 2
プラス ミ ド p N 0 3 3 の詳細な制限酵素地図の作製。
実施例 1 で取得した したプラ ス ミ ド p N 0 3 3 の詳細な制限 酵素地図作製は、 市販の各種制限酵素 （ 日本ジー ン社製、 およ び宝酒造社製） によ って p N 0 3 3 を単一消化、 二重消化、 あ るいは三重消化 して得られた D N A断片を 0 . 7 %の ァガロ ー スゲル電気泳動あるいはバイ オラ ッ ド社製のノ ルス フ ィ 一ル ド 電気泳動に供し、 その移動度から分子量を求めた。
酵素の反応条件は、 供給者によ って決め られた条件に従った。 また、 分子量は、 ラムダファージ D N Aを制限酵素 H i n d II I で消化 して得られた分子量マーカ一 （ 日本ジー ン社製） および 酵母染色体を分子量マーカ一 （バイ オラ ッ ド社製） の標準移動 度を も と に決定した。 これらの結果から、 前記載の図 1 である プラ ス ミ ド p N 0 3 3 の詳細な制限酵素地図を決定した。 結果 を図 1 に示す。
実施例 3
プラス ミ ド p N 0 3 3 の塩基配列 （配列番号 1 ) 、 ア ミ ノ酸 配列 （配列番号 2 、 および配列番号 3 ) の決定。
実施例 1 で取得したプラス ミ ド p N 0 3 3 の塩基配列を決定 するため、 プラス ミ ド p N 0 3 3 D N Aを制限酵素， E c o R I で消化後、 その断片を大腸菌で複製可能な公知プラス ミ ドべ ク タ一 p G r e e n l 9 .( I n o u y e り、 G e n e v o l . 1 8 9、 p p l 5 9 — 1 6 2 : 1 9 9 7 ) あるいは p B l u e s c r i p t S K + (ス ト ラ ッテジー ン社製） の E c o R I に、 常法によ り サブク ローン化を行った。
挿入断片の確認は、 実施例 1 記載のプラス ミ ド単離法に基づ きプラス ミ ド分離し、 E c o R I で消化後、 0 . 7 %のァガロ ースゲル電気泳動法によ り 確認 した。 挿入断片の塩基配列 （配 列番号 1 ) は、 ダイ ター ミ ネータ一サイ クルシーク ェンシング 法を用い、 アプライ ド バイ オシステム社の蛍光シークセンサ 一 ( A B I 3 7 3 ) にて決定した。
配列番号 1 に基づき 、 宝酒造社製の D N A S I S V e r . 3 . 6 遺伝子解析ソ フ ト ウェア を使用する こ と によ り 、 翻訳可 能領域を検索 し、 2 つのア ミ ノ 酸配列 （配列番号 2 、 および配 列番号 3 ) を明 らかに した。
実施例 4
配列番号 1、 2、 3 に関する遺伝子データーベース相同性の 検索。
配列番号 1、 2、 3 に基づき 、 世界規模で構築されている全 ての遺伝子データ一ベース に対 して、 その相同性があるかど う 力 、 イ ンターネ ッ ト経由でゲノ ムネ ッ ト ホームページ （ h t t p ： / / w w . g e n o m e , a d . j p あるレヽ iま h t t p : / / w w w . n c b i . n 1 m . n i h . g o v / ) で、 解析ソ フ ト は F A S T A、 および B L A S T を用いて検索を行 つた。 配列番号 1 は、 全てのエン ト リ ー遺伝子配列に対して行 い、 配列番号 2 、 3 は、 エ ン ト リ ーア ミ ノ 酸配列およびェ ン ト リ ー遺伝子配列 よ り 翻訳されるア ミ ノ 酸配列に対して行った。 その結果、 配列番号 1 と 著し く 相同性のある遺伝子配列は検出 できなかった。
一方、 配列番号 2 、 3 についても、 顕著な相同性は見い出 さ れなかっ た。 しカゝし、 配列番号 2 に関 しては、 ス ト レプ トマイ セス属セ リ カ ラー種 ( S t r e p t o m y c e s c o e l i c o 1 o r ) の染色体に存在 し、 抗生物質ァ ク チノ ホヂン （ A c t i n o r h o d i n ) の生産に関与する遺伝子 O R F — D と約 3 6 %の相同性が見い出 された。 こ の こ と は、 本発明ブラ ス ミ ド上に、 抗生物質等の二次代謝産物遺伝子が存在する こ と を示唆し、 産業上利用でき る こ と を示 している。 産業状の利用可能性
本発明のプラ ス ミ ドは種々 の制限酵素によ る開裂部位を有 し てお り 、 本プラ ス ミ ドを修飾 し、 ス ト レプ トマイ セス属細菌に 使用可能な、 多く の有用なべク ターを開発する こ と ができ る。 また、 このプラ ス ミ ドに有用遺伝子を組込み、 ス ト レプ トマイ セス属細菌に導入 して宿主を形質転換させ、 有用物質の生産が 可能と なる。

Claims

δ冃 求 の 範 囲
1 . ス ト レプ トマイ セス属に属する放線菌由来の環状プラス ミ ドであって、 分子量が約 3 7 K b ρ であ り 、 図 1 に示される制 限酵素認識部位を有するプラス ミ ド p N O 3 3。
2 . ス ト レプ ト マイ セス属に属する放線菌由来の環状プラス ミ ドであって、 分子量が約 3 7 K b p であ り 、 配列番号 1 で示さ れる塩基配列を含む請求項 1 記載のプラス ミ ド p N 0 3 3。
3 . ス ト レプ トマイセス属に属する放線菌由来の環状プラス ミ ドであっ て、 分子量が約 3 7 K b p であ り 、 配列番号 2 または 配列番号 3 で示されるァ ミ ノ 酸配列を有する タ ンパク質または 該タ ンパク質と 実質的に同等の機能を有するタ ンパク質をコー ドする請求項 1 または 2記載のプラス ミ ド p N 0 3 3。
4 . ス ト レプ トマイ セス属に属する放線菌が、 f —ポ リ リ ジン 生産能を有する請求項 1 〜 3 の何れか 1 項記載のプラ ス ミ ド p N 0 3 3。
5 . ス ト レプ トマイ セス属に属 し ε —ポ リ リ ジン生産能を有す る放線菌が、 ス ト レプ ト マイ セ ス ァノレブラ ス （ S t r e p t o m y c e s a 1 b u 1 u s ) I F 0 1 4 1 4 7 である請求 項 4記載のプラス ミ ド p N 0 3 3。
6 . 環状プラス ミ ド p N O 3 3 由来の全部あるいは一部塩基配 列断片を用いて構築したプラス ミ ド。
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