WO2000035953A1 - Nouvelle proteine recepteur couplee a une proteine g et son adn - Google Patents

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WO2000035953A1
WO2000035953A1 PCT/JP1999/006904 JP9906904W WO0035953A1 WO 2000035953 A1 WO2000035953 A1 WO 2000035953A1 JP 9906904 W JP9906904 W JP 9906904W WO 0035953 A1 WO0035953 A1 WO 0035953A1
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receptor protein
present
salt
coupled receptor
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PCT/JP1999/006904
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Takuya Watanabe
Kuniko Kikuchi
Yasushi Shintani
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Takeda Chemical Industries, Ltd.
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
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    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/72—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for hormones
    • C07K14/723—G protein coupled receptor, e.g. TSHR-thyrotropin-receptor, LH/hCG receptor, FSH receptor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
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    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
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    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy

Definitions

  • the present invention relates to a novel G protein-coupled receptor protein derived from mouse spleen or human lung, a salt thereof, and DNA encoding the same.
  • G protein-coupled receptor protein seven-transmembrane receptor protein (7TMR).
  • G protein-coupled receptor protein is present on the surface of each functional cell in living cells and organs, and is used as a target for molecules that regulate the functions of those cells and organs, such as hormones, neurotransmitters, and bioactive substances. Plays an important role.
  • the receptor transmits a signal into the cell through binding to a physiologically active substance, and this signal causes various reactions such as suppression of activation and activation of the cell.
  • physiological functions are regulated under the control of many hormones, hormone-like substances, neurotransmitters or bioactive substances.
  • physiologically active substances are present in various parts of the body, and regulate their physiological functions through the corresponding receptor proteins.
  • hormones, neurotransmitters and other physiologically active substances have not been reported on the structure of their receptor protein.
  • receptor proteins do not know whether subtypes exist.
  • Clarifying the relationship between substances that regulate complex functions in living organisms and their specific receptor proteins is a very important tool for drug development.
  • the functions of the receptor gene expressed in the body must be elucidated. Expression in an appropriate expression system was necessary.
  • the G protein-coupled receptor is used to search for new physiologically active substances (ie, ligands) using its signal transduction as an index, and to provide an agonist to the receptor. Or an evening ghost).
  • new physiologically active substances ie, ligands
  • an agonist or an antagonist of the receptor can be identified. It is also possible to produce.
  • These ligands, agonists, and antagonists for the receptor can be expected to be used as preventive and therapeutic agents for diseases associated with dysfunction of G protein-coupled receptors.
  • a decrease or enhancement of the function of the receptor in vivo due to a gene mutation of the G protein-coupled receptor has caused some disease.
  • introduction of the receptor gene into a living body (or a specific organ) or introduction of an antisense nucleic acid to the receptor gene Can also be applied to gene therapy.
  • the nucleotide sequence of the receptor is indispensable information for examining the presence or absence of a deletion or mutation on the gene, and the receptor gene is a disease associated with dysfunction of the receptor. It can also be applied to prophylactic / therapeutic drugs and diagnostic drugs.
  • the present invention provides a novel G protein-coupled receptor protein useful as described above. That is, a novel G protein-coupled receptor protein, its partial peptide or a salt thereof, and a polynucleotide containing the G protein-coupled receptor protein or its partial peptide (DNA, RNA and derivatives thereof) Nucleotides (DNA, RNA and derivatives thereof), a recombinant vector containing the polynucleotide, a transformant carrying the recombinant vector, a method for producing the G protein-coupled receptor protein or a salt thereof, Antibody to G protein-coupled receptor protein, its partial peptide or salt thereof, compound that changes the expression level of G protein-coupled receptor protein, determination of ligand for G protein-coupled receptor protein Methods and compounds that alter the binding of a ligand to the G protein-coupled receptor protein (en) A method for screening a ligand, obtained by using the screening method, the screening method or the screening kit, and the G protein-coupled receptor protein
  • the present inventors have conducted intensive studies and as a result, based on EST information generated by the degenerated PCR method, have been able to simply encode cDNA encoding a novel G protein-coupled receptor-1 protein derived from mouse kidney and human lung. And succeeded in analyzing the entire nucleotide sequence. Then, when this base sequence was translated into an amino acid sequence, the first to seventh transmembrane regions were confirmed on the hydrophobicity plot, and the protein encoded by these cDNAs was a seven-transmembrane G protein-coupled receptor. It was confirmed that it was a protein. The present inventors have further studied based on these findings, and as a result, have completed the present invention.
  • a G protein-coupled receptor protein or a salt thereof which comprises an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1;
  • a ligand for a G protein-coupled receptor Yuichi protein or a salt thereof is a ligand for a G protein-coupled receptor Yuichi protein or a salt thereof
  • (21) a polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to the polynucleotide according to (4) and a part thereof,
  • the protein is: (1) an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or one or more in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (preferably about 1 to 30, more preferably 1 to 9) Degree, more preferably 1 to 5) amino acid sequence, (2) 1 or 2 or more (preferably about 1 to 30, more preferably 1 to 30) amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 An amino acid sequence to which about 10 or more, more preferably 1 to 5) amino acids have been added; 3 one or more (preferably 1 to 30) amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 Or more preferably about 1 to 10, more preferably 1 to 5) amino acids in which the amino acid sequence is substituted with another amino acid, or (1) a protein comprising an amino acid sequence obtained by combining them. ) Role-type receptor Yuichi protein or its
  • the ligand is, for example, angiotensin, bombesin, canapinoid, cholecystokinin, glutamine, serotonin, melatonin, neuropeptide Y, opioid, purine, vasoprescin, oxitocin, PACAP, secretin, glucagon, calcitonin, adrenomedullin, adrenomedullin, Somatos quintin, GHRH, CRF, ACTH, GRP, PTH, VIP (Vasoactive Intestinal polypeptide), Somatos quintin, dopamine, motilin, amylin, bradykinin, CGRP (calcitonin gene relayed peptide), leukotrien, Pancreatastin, prostaglandin, thromboxane, adenosine, adrenaline, ⁇ and i3-chemokine (eg, IL-8, GROa, GRO] 3, GRO RI
  • a compound that activates the G protein-coupled receptor protein described in (1) or a salt thereof is contacted with a cell containing the G protein-coupled receptor protein described in (1).
  • a G protein-coupled receptor described in (1) above, a compound that activates the protein or a salt thereof, and a test compound described in (1) above is measured and compared with the ligand described in (1) above.
  • the compound that activates the G protein-coupled receptor protein described in (1) is angiotensin, bombesin, canapinoid, cholecystokinin, glumin, serotonin, melatonin, neuropeptide Y, Opioids, purines, nosopretcin, oxitosine, PACAP, secretin, glucagon, calcitonin, adrenomedullin, somatos, GHRH, CRF, ACTH, GRP, PTH, VIP (basoactive intestinal polypeptide), somatos Tin, dopamine, motilin, amylin, bradykinin, CGRP (leucine nin gene relayed peptide), leukotriene, pancreas, tin, prostaglandin, thromboxane, adenosine, adrenaline, and / 3-chemokine (chemokine) ) (For example IL-8, GROa, GRO) 3, GR ⁇
  • FIG. 1 shows the nucleotide sequence of the DNA encoding the novel spleen-derived mouse protein GAL7TO24 derived from the mouse spleen of the present invention obtained in Example 1 and the amino acid sequence deduced therefrom ( (Continued in Figure 2.)
  • FIG. 2 shows the nucleotide sequence of the DNA encoding the novel spleen G protein-coupled receptor protein mAL7T024 derived from the mouse spleen of the present invention obtained in Example 1 and the amino acid sequence deduced therefrom (FIG. Continue to Figure 3).
  • FIG. 3 shows the nucleotide sequence of the DNA encoding the novel G protein-coupled receptor protein mAL7T024 derived from the mouse spleen of the present invention obtained in Example 1 and the amino acid sequence deduced therefrom. Continuation of 2).
  • FIG. 4 shows the hydrophobic plot of the mouse spleen-derived novel G protein-coupled receptor protein mAL7TO24 of the present invention prepared based on the amino acid sequences shown in FIGS.
  • FIG. 5 shows the nucleotide sequence of the DNA encoding the novel human lung-derived G protein-coupled receptor protein hAL7T024 obtained in Example 2 and the amino acid sequence deduced therefrom (see FIG. 6). Continue) .
  • FIG. 6 shows the nucleotide sequence of the DNA encoding the novel human L-derived G protein-coupled receptor protein hAL7TO24 obtained in Example 2 and the amino acid sequence deduced therefrom (FIG. 5). Continue to Figure 6).
  • FIG. 7 shows the nucleotide sequence of a DNA encoding the novel human lung-derived G protein-coupled receptor of the present invention obtained in Example 2—protein hAL7T024, and deduced therefrom. The amino acid sequence is shown (continuation of FIG. 6).
  • FIG. 8 shows a hydrophobic plot of the human lung-derived novel G protein-coupled receptor protein hAL7T024, which was created based on the amino acid sequences shown in FIGS. 5 to 7. .
  • the G protein-coupled receptor protein of the present invention (hereinafter sometimes abbreviated as receptor protein) is an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 [amino acid sequence in FIGS. 1 to 3] Is a protein having the same or substantially the same amino acid sequence.
  • the receptor protein of the present invention may be, for example, a human mammal (eg, a guinea pig, a rat, a mouse, a mouse, a heron, a bush, a sheep, a horse, a monkey, etc.), and all cells (eg, spleen cells, nerve cells, Glial cells, kidney / 3 cells, bone marrow cells, mesangial cells, Langerhans cells, epidermal cells, epithelial cells, endothelial cells, fibroblasts, fibroblasts, muscle cells, fat cells, immune cells (eg, macrophages, T Cells, B cells, natural killer cells, mast cells, neutrophils, basophils, eosinophils, monocytes), megakaryocytes, synovial cells, chondrocytes, bone cells, osteoblasts, osteoclasts, mammary gland Cells, hepatocytes or stromal cells, or their precursors, stem cells or cancer cells),
  • amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 examples include, for example, about 50% or more, preferably about 70% or more, more preferably the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. About 80% or more, more preferably about 90% or more, Most preferably, an amino acid sequence having about 95% or more homology is exemplified. Specific examples include a receptor protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 [amino acid sequence in FIGS. 5 to 7].
  • Examples of the protein having an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 of the present invention include, for example, a protein having an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 Proteins having substantially the same activity as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 are preferred.
  • Substantially the same activity includes, for example, ligand binding activity, signal transduction activity and the like. Substantially the same means that their activities are the same in nature. Therefore, the activities such as ligand binding activity and signal transduction activity are equivalent (eg, about 0.01 to 100 times, preferably about 0.5 to 20 times, more preferably about 0.5 to 20 times). However, the quantitative factors such as the degree of activity and the molecular weight of the protein may be different.
  • the measurement of the activity such as the ligand binding activity and the signal transduction can be carried out according to a method known per se.
  • the activity can be measured according to the ligand determination method described later and the screening method. it can.
  • the receptor protein of the present invention includes: (1) one or two or more amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (preferably, about 1 to 30; more preferably, 1 to 10; Amino acid sequence in which about 1 to 5 amino acids have been deleted, and 1 or 2 or more amino acids (preferably about 1 to 30 amino acids, more preferably about 1 to 30 amino acids) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • amino acid sequence to which about 1 to 10 amino acids have been added more preferably about 1 to 5 amino acids; 3 one or more (preferably about 1 to 30) amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (More preferably about 1 to 10, more preferably 1 to 5) amino acids in which amino acids are substituted with other amino acids, or proteins containing an amino acid sequence obtained by combining them. .
  • the receptor protein of the present invention includes: (1) one or two or more amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 (preferably, about 1 to 30; more preferably, about 1 to 10; More preferably, 1 to 5 amino acids are deleted. (2) one or more (preferably about 1 to 30, more preferably about 1 to 10, and more preferably 1 to 5) amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5; Added amino acid sequence, 3 one or more amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 (preferably about 1 to 30, more preferably about 1 to 10, more preferably 1 to 5) A) an amino acid sequence in which the amino acid is replaced with another amino acid, or a protein containing an amino acid sequence obtained by combining them.
  • the left end is the N-terminus (amino terminus) and the right end is the C-terminus (carboxyl terminus) according to the convention of peptide labeling.
  • the receptor protein of the present invention including the receptor protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, usually has a carboxyl group (1-COOH) or carboxylate (1-COO-) at the C-terminus.
  • the C-terminal may be an amide (1-C ⁇ NH 2 ) or an ester (—COOR).
  • R in the ester e.g., methyl, Echiru, n- propyl, alkyl groups such as isopropyl, n- butyl, Shikuropen chill, C 3 _ 8 cycloalkyl group such as cyclohexyl, for example, phenyl, such as ⁇ - naphthyl C 6 - 1 2 Ariru group, e.g., benzyl, phenylene Lou such phenethyl ( ⁇ - 2 alkyl or ⁇ - naphthylmethyl etc. ⁇ - naphthyl -C ⁇ ⁇ C 7 such as an alkyl group - 14 Aralkyl group strength Piva mouth yloxymethyl ester, which is widely used as an oral ester, is used.
  • phenyl such as ⁇ - naphthyl C 6 - 1 2
  • Ariru group e.g., benzyl, phenylene Lou such phenethyl ( ⁇
  • the receptor protein of the present invention has a lipoxyl group (or carboxylate) other than at the C-terminus
  • a protein in which the carboxyl group is amidated or esterified is also included in the receptor protein of the present invention.
  • the ester in this case, for example, the above-mentioned C-terminal ester and the like are used.
  • the Resebu evening one protein of the present invention is the protein mentioned above, Amino group protecting groups main Chionin residues of N-terminal (e.g., formyl group, C 2 such Asechiru - such as 6 Arukanoiru group - 6 Ashiru Group), N-terminal cleavage of the darminyl mill group generated by cleavage in vivo, pyroglutamine oxidation, substituents on the side chains of amino acids in the molecule (eg, 1 OH, 1 SH) , Amino group, imidazole Group, indole group, Guanijino group, etc.) a suitable protecting group (e.g., formyl group, C 2 such Asechiru - 6 Arukanoiru such as C E _ 6 Ashiru groups such as groups) are protected by shall, a sugar chain Complex proteins such as so-called glycoproteins that are bound are also included.
  • Amino group protecting groups main Chionin residues of N-terminal
  • receptor protein of the present invention include, for example, a mouse receptor protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a human protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 Recept Yuichi protein is used.
  • the partial peptide of the receptor protein of the present invention may be any peptide as long as it is the partial peptide of the receptor protein of the present invention described above.
  • a partial peptide may be any peptide as long as it is the partial peptide of the receptor protein of the present invention described above.
  • the receptor protein molecules of the present invention those which are exposed outside the cell membrane and have receptor binding activity are used.
  • the partial peptide of the receptor protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 includes an extracellular region (hydrophilic) in the hydrophobicity plot analysis shown in FIG. Is a peptide containing a portion that was analyzed to be Further, as a partial peptide of the receptor protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5, the extracellular region (hydrophilic region) in the hydrophobicity plot analysis shown in FIG. Is a peptide containing a portion analyzed to be Further, a peptide partially containing a hydrophobic (Hydrophobic) site can also be used. A peptide containing individual domains may be used, but a peptide containing a plurality of domains at the same time may be used.
  • the number of amino acids of the partial peptide of the present invention is at least 20 or more, preferably 50 or more, more preferably 100 or more amino acids of the constituent amino acid sequence of the receptor protein of the present invention. Are preferred.
  • Substantially identical amino acid sequences refer to those amino acid sequences having a homology of about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, and still more preferably about 95% or more. 1 shows an amino acid sequence having
  • substantially the same activity has the same meaning as described above.
  • substantially the same Can be measured in the same manner as described above.
  • the partial peptide of the present invention has one or more (preferably about 1 to 10, more preferably 1 to 5) amino acids in the above amino acid sequence, or One or more (preferably about 1 to 20, more preferably about 1 to 10, and more preferably 1 to 5) amino acids are added to the sequence, or 1 or 2 More than one (preferably about 1 to 10, more preferably 1 to 5) amino acids may be substituted with another amino acid.
  • the C-terminus is usually a carboxyl group (one COOH) or other that forces the carboxylate (one COO-), C-terminal amide (- CONH 2 ) Or ester (—COOR).
  • the partial peptide of the present invention has an N-terminal methionine residue in which the amino group of the methionine residue is protected with a protecting group, and the N-terminal side is cleaved in vivo.
  • G1n is pyroglutamine-oxidized, and the substituent on the side chain of the amino acid in the molecule is protected with an appropriate protecting group, or a complex peptide such as a so-called glycopeptide to which a sugar chain is bound, etc. Is also included.
  • the C-terminus is usually a carboxyl group (one COOH) or a carboxylate (one COO—). 2 ) or ester (one COOR).
  • the salt of the receptor protein or its partial peptide of the present invention is preferably a physiologically acceptable acid addition salt.
  • Such salts include, for example, salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid) or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, Salts with succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, etc. are used.
  • inorganic acids eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid
  • organic acids eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid
  • the receptor protein of the present invention or a salt thereof can also be produced from the above-mentioned human or mammalian cells or tissues by a known method for purifying a receptor protein. It can also be produced by culturing a transformant containing DNA encoding the receptor protein of the present invention described below. Also, it can be produced by a protein synthesis method described later or according to it.
  • the human or mammalian tissues or cells are homogenized and then extracted with an acid or the like, and the extract is subjected to reverse phase chromatography, ion exchange chromatography, etc. Purification and isolation can be performed by combining the above chromatography.
  • a commercially available resin for protein synthesis can be generally used.
  • resins include, for example, chloromethyl resin, hydroxymethyl resin, benzhydrylamine resin, aminomethyl resin, 4-benzyloxybenzyl alcohol resin, 4-methylbenzhydrylamine resin, PAM Resin, 4-hydroxymethylmethylphenylacetamidomethyl resin, polyacrylamide resin, 4- (2 ', 4'-dimethoxyphenylhydroxymethyl) phenoxy resin, 4- (2', 4'- Dimethoxyphenyl-Fmocaminoethyl) phenoxy resin.
  • an amino acid in which the ⁇ -amino group and the side chain functional group are appropriately protected is condensed on the resin according to the sequence of the target protein according to various known condensation methods.
  • the protein is cleaved from the resin, and at the same time, various protecting groups are removed.
  • an intramolecular disulfide bond formation reaction is carried out in a highly diluted solution to obtain a target protein or an amide thereof.
  • various activating reagents that can be used for protein synthesis can be used, and carbodiimides are particularly preferable.
  • DCC dicyclobutadiene carboxylate
  • N N'-diisopropylcarpoimide
  • These activations involve adding the protected amino acid directly to the resin along with a racemization inhibitor additive (eg, H ⁇ Bt, HOOBt), or using a symmetrical acid anhydride or HOBt ester or HOOt.
  • the protected amino acid can be added as a Bt ester to the resin after activation.
  • Solvents used for activation of protected amino acids and condensation with resins include proteins It can be appropriately selected from solvents known to be usable for the condensation reaction. For example,
  • Acid amides such as N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide, N-methylvinylidone; halogenated hydrocarbons such as methylene chloride and chloroform; alcohols such as trifluorophenol; dimethyl Sulfoxides such as sulfoxide, ethers such as pyridine, dioxane and tetrahydrofuran, nitriles such as acetonitrile and propionitol, esters such as methyl acetate and ethyl acetate, or an appropriate mixture thereof are used.
  • the reaction temperature is appropriately selected from the range known to be usable for the protein bond formation reaction, and is usually appropriately selected from the range of about 120 ° (: to 50 ° C.
  • the acid derivative is usually used in an excess of 1.5 to 4 times. If the condensation is insufficient as a result of the test using the ninhydrin reaction, the condensation reaction should be repeated without removing the protecting group. When sufficient condensation cannot be obtained even by repeating the reaction, the unreacted amino acid can be acetylated using acetic anhydride or acetylimidazole.
  • Examples of the protecting group for the amino group of the starting material include Z, B oc, succinyl-pentyloxycarbonyl, isopolnyloxycarbonyl, 4-methoxybenzyloxycarbonyl, C 11 Z, Br—Z Adamantyloxycarbonyl, trifluoroacetyl, phthaloyl, formyl, 2-ditrophenylsulfenyl, diphenylphosphinothioyl, Fmoc and the like.
  • the lipoxyl group can be, for example, alkyl esterified (for example, methyl, ethyl, propyl, butyl, tert-butyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, cyclooctyl, 2-adamantyl, etc.) Or cyclic alkyl esterification), aralkyl esterification (eg, benzyl ester, 412-methyl benzyl ester, 4-methoxybenzyl ester, 4-methyl benzyl ester, benzhydryl esterification) It can be protected by phenacyl esterification, benzyloxycarbonyl hydrazide, evening char-butoxycarbonyl hydrazide, trityl hydrazide, or the like.
  • alkyl esterified for example, methyl, ethyl, propyl, butyl, tert-butyl, cyclopenty
  • the hydroxyl group of serine can be protected, for example, by esterification or etherification.
  • Suitable groups for this esterification include, for example, lower groups such as an acetyl group.
  • Examples thereof include groups derived from carbonic acid such as an aroyl group such as a lower alkanol group and a benzoyl group, a benzyloxycarbonyl group, and an ethoxycarbonyl group.
  • Examples of a group suitable for etherification include a benzyl group, a tetrahydroviranyl group, and a t-butyl group.
  • the protecting group of the phenolic hydroxyl group of tyrosine for example, B z and C 1 2 -B zl, 2- nitrobenzyl, B r- Z, such as evening over tert-butyl is used.
  • Examples of the protecting group for histidine imidazole include Tos, 4-methoxy-2,3,6-trimethylbenzenesulfonyl, DNP, benzyloxymethyl, Bum, Boc, Trt, and Fmoc. .
  • Examples of the activated carboxyl groups of the raw materials include, for example, corresponding acid anhydrides, azides, and active esters [alcohols (eg, phenol, 2,4,5-trichlorophenol, 2,4- Dinitrophenol, cyanomethyl alcohol, paranitrophenol, HONB, N-hydroxysuccinimide, N-hydroxyphenylimide, HOB tester) and the like.
  • active esters eg, phenol, 2,4,5-trichlorophenol, 2,4- Dinitrophenol, cyanomethyl alcohol, paranitrophenol, HONB, N-hydroxysuccinimide, N-hydroxyphenylimide, HOB tester
  • the activated amino group of the raw material for example, a corresponding phosphoric amide is used.
  • Methods for removing (eliminating) protecting groups include, for example, catalytic reduction in a stream of hydrogen in the presence of a catalyst such as Pd-black or Pd-carbon, or hydrogen fluoride anhydride, methanesulfonic acid, or trifluoromethane.
  • the elimination reaction by the above-mentioned acid treatment is generally performed at a temperature of about 120 to 40 ° C.
  • a force-thione scavenger such as 1,4-butanedithiol, 1,2-ethanedithiol and the like.
  • the 2,4-dinitrophenyl group used as an imidazole protecting group of histidine is removed by thiophenol treatment, and the formyl group used as an indole protecting group of tributofan is 1,2-ethanedithiol, 4 Removal by acid treatment in the presence of 1-butanedithiol In addition to protection, it is also removed by alkaline treatment with dilute sodium hydroxide solution, dilute ammonia and the like.
  • the protection of the functional group which should not be involved in the reaction of the raw materials, the protecting group, the elimination of the protective group, the activation of the functional group involved in the reaction, and the like can be appropriately selected from known groups or known means.
  • a peptide (protein) chain is added to the amino group side with a desired chain length.
  • a protein in which only the protecting group for the N-terminal amino group of the peptide chain was removed and a protein in which only the protecting group for the C-terminal carboxyl group was removed were produced.
  • Condensate in a mixed solvent Details of the condensation reaction are the same as described above.
  • all the protecting groups are removed by the above-mentioned method to obtain a desired crude protein.
  • the crude protein is purified using various known purification means, and the main fraction is freeze-dried to obtain an amide of the desired protein.
  • ester of a protein for example, after condensing the high carboxyl group of the carboxy terminal amino acid with a desired alcohol to form an amino acid ester, the ester of the desired protein is prepared in the same manner as the amide of the protein You can get
  • the partial peptide of the receptor protein of the present invention or a salt thereof can be produced according to a peptide synthesis method known per se, or by cleaving the receptor protein of the present invention with an appropriate peptide. it can.
  • a method for synthesizing a peptide for example, any of a solid phase synthesis method and a liquid phase synthesis method may be used. That is, a partial peptide or amino acid capable of constituting the receptor protein of the present invention is condensed with the remaining portion, and when the product has a protecting group, the protecting group is eliminated to produce the desired peptide.
  • Examples of the known condensation method and elimination of the protecting group include the methods described in the following 1 to 5.
  • the partial peptide of the present invention can be purified and isolated by a combination of ordinary purification methods such as solvent extraction, distillation, column chromatography, liquid chromatography, and recrystallization.
  • the partial peptide obtained by the above method is a free form, it can be converted to an appropriate salt by a known method, and when it is obtained as a salt, it can be converted to a free form by a known method. be able to.
  • any polynucleotide containing the above-described nucleotide sequence (DNA or RNA, preferably DNA) encoding the receptor protein of the present invention can be used.
  • the polynucleotide is DNA such as DNA or mRNA encoding the receptor protein of the present invention, and may be double-stranded or single-stranded. In the case of double-stranded, it may be double-stranded DNA, double-stranded RNA or DNA: RNA hybrid. In the case of a single strand, it may be a sense strand (ie, a coding strand) or an antisense strand (ie, a non-coding strand).
  • the polynucleotide encoding the receptor protein of the present invention for example, by the method described in the well-known experimental medicine special edition “New PCR and its application” 15 (7), 1997 or a method analogous thereto.
  • the mRNA of the receptor protein of the present invention can be quantified.
  • the DNA encoding the receptor protein of the present invention may be any of genomic DNA, genomic DNA library, cDNA derived from the above-described cells and tissues, cDNA library derived from the above-described cells and tissues, and synthetic DNA.
  • the vector used for the library may be any of bacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like.
  • reverse transcriptase polymerase was directly used by using a total RNA or mRNA fraction prepared from the cells and tissues described above. Amplification can also be performed by chain reaction (hereinafter abbreviated as RT-PCR).
  • DNA encoding the receptor protein of the present invention for example, DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 6, or SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 6 Has a nucleotide sequence that hybridizes under high stringent conditions to the nucleotide sequence represented by, and has substantially the same activity as the receptor protein of the present invention (eg, ligand binding activity, signal information transduction action, etc.) Any DNA may be used as long as it encodes a receptor protein.
  • Examples of the DNA which can hybridize with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 6 include, for example, about 70% or more, preferably about 8% with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 6.
  • DNA containing a nucleotide sequence having a homology of 0% or more, more preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more is used.
  • Hybridization can be performed by a method known per se or a method analogous thereto, for example, a method described in Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). It can be performed according to the method. When a commercially available library is used, it can be performed according to the method described in the attached instruction manual. More preferably, it can be performed according to high stringent conditions.
  • the high stringent conditions include, for example, a sodium concentration of about 19 to 40 mM, preferably about 19 to 20 mM, a temperature of about 50 to 70 ° C., and preferably about 60 to 70 ° C.
  • the condition of 65 is shown. Particularly, the case where the sodium concentration is about 19 mM and the temperature is about 65 is most preferable.
  • DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 and the like are used.
  • DNA encoding the receptor protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 6 and the like are used.
  • nucleotide sequence of DNA encoding the receptor protein of the present invention or the D
  • polynucleotide comprising a part of the nucleotide sequence complementary to NA is used not only to include DNA encoding the following partial peptide of the present invention but also to include RNA.
  • a G protein-coupled receptor protein in which an antisense 'polynucleotide (nucleic acid) capable of inhibiting replication or expression of a G protein-coupled receptor protein gene has been cloned or determined has been determined.
  • an antisense 'polynucleotide nucleic acid
  • Such a polynucleotide can hybridize with RNA of a G protein-coupled receptor protein gene and can inhibit the synthesis or function of the RNA, or can inhibit the G protein-coupled receptor protein. It can regulate and control the expression of G protein-coupled receptor protein gene through interaction with protein-related RNA.
  • a polynucleotide complementary to a selected sequence of protein-related RNA and a polynucleotide capable of specifically hybridizing with G-protein-coupled receptor protein-related RNA can be used in vivo and in vitro. It is useful for controlling and controlling the expression of the G protein-coupled receptor protein gene, and is also useful for treating or diagnosing diseases and the like.
  • the term "corresponding" means having homology or being complementary to a specific nucleotide, nucleotide sequence or nucleotide sequence including a gene.
  • nucleotide a nucleotide sequence or a nucleic acid and a peptide (protein) means that the amino acid of the peptide (protein) specified by the sequence derived from the nucleotide (nucleic acid) sequence or its complement is usually used. pointing.
  • the 'end untranslated region, the 3' end palindrome region, and the 3 'end hairpin loop may be selected as preferred regions of interest, but any region within the G protein-coupled receptor protein gene may be selected. sell.
  • Antisense polynucleotides are polydeoxyribonucleotides containing 2-dexoxy-D-reports. And other types of polynucleotides that are N-glycosides of purines or pyrimidine bases, or other polymers with non-nucleotide backbones (eg, commercially available protein nucleic acids and synthetics).
  • a sequence-specific nucleic acid polymer) or other polymer containing a special bond provided that the polymer has a nucleotide configuration that allows base pairing or base attachment as found in DNA or RNA. And the like). They can be double-stranded DNA, single-stranded DNA, double-stranded RNA, single-stranded RNA, and even DNA: RNA hybrids, and can be unmodified polynucleotides (or unmodified oligonucleotides).
  • Modified with an intramolecular nucleotide for example, having an uncharged bond (eg, methylphosphonate, phosphotriester, phosphoramidite, phorbamate, etc.), charged bond or sulfur-containing bond (eg, phosphorothioate) ,
  • an intramolecular nucleotide for example, having an uncharged bond (eg, methylphosphonate, phosphotriester, phosphoramidite, phorbamate, etc.), charged bond or sulfur-containing bond (eg, phosphorothioate)
  • proteins nucleases, nucleases and inhibitors, toxin, Substances having side-chain groups such as body, signal peptide, poly-L-lysine, etc., sugars (eg, monosaccharides), those having interactive compounds (eg, acridine, psoralen, etc.), chelates Those containing compounds (eg, metals, radioactive metals, boron, oxidizing metal
  • nucleoside may include not only those containing purine and pyrimidine bases but also those having other modified heterocyclic bases. Such modifications may include methylated purines and pyrimidines, acylated purines and pyrimidines, or other heterocycles. Modified nucleotides and modified nucleotides may also be modified at the sugar moiety, e.g., where one or more hydroxyl groups have been replaced with halogens, aliphatic groups, etc., or with functional groups such as ethers, amines, etc. It may be converted.
  • the antisense polynucleotide (nucleic acid) of the present invention is RNA, DNA, Or modified nucleic acids (RNA, DNA).
  • modified nucleic acids include, but are not limited to, sulfur derivatives of nucleic acids, thiophosphate derivatives, and degradation-resistant ones such as polynucleoside amides and oligonucleoside amides.
  • the antisense nucleic acid of the present invention can be preferably designed according to the following policy. That is, to make the antisense nucleic acid more stable in the cell, to make the antisense nucleic acid more cell permeable, to have a greater affinity for the target sense strand, and to be more toxic if it is toxic. Make sense nucleic acid less toxic.
  • the antisense nucleic acids of the present invention may contain altered or modified sugars, bases, or bonds, may be provided in special forms such as ribosomes or microspheres, may be applied by gene therapy, It could be given in additional form.
  • additional forms include polycations, such as polylysine, which act to neutralize the charge on the phosphate backbone, and lipids, which enhance interaction with cell membranes or increase the uptake of nucleic acids ( For example, phospholipids, cholesterol, etc.) can be used.
  • Preferred lipids for addition include cholesterol and its derivatives (eg, cholesteryl chromate formate, cholic acid, etc.).
  • nucleic acids can be attached via a base, sugar, or intramolecular nucleoside bond.
  • Other groups include capping groups specifically located at the 3 'or 5' end of nucleic acids to prevent degradation by nucleases such as exonuclease and RNase.
  • capping group include, but are not limited to, hydroxyl-protecting groups known in the art, such as glycols such as polyethylene glycol and tetraethylene glycol.
  • the inhibitory activity of the antisense nucleic acid is determined by the transformant of the present invention, It can be examined using an external gene expression system or an in vivo or in vitro translation system of the G protein-coupled receptor protein.
  • the nucleic acid can be applied to cells by various methods known per se.
  • the DNA encoding the partial peptide of the present invention may be any DNA containing the above-described nucleotide sequence encoding the partial peptide of the present invention.
  • Genomic DNA, genomic DNA library Any of the above-described cell / tissue-derived cDNA, the above-described cell / tissue-derived cDNA library, and synthetic DNA may be used.
  • the vector used for the library may be any of bacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like. Alternatively, it can be directly amplified by a reverse transcriptase polymerase chain reaction (hereinafter abbreviated as RT-PCR method) using an mRNA fraction prepared from the cells and tissues described above.
  • RT-PCR method reverse transcriptase polymerase chain reaction
  • the DNA encoding the partial peptide of the present invention includes, for example, (1) DNA having a partial base sequence of DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 6, or (2) having a nucleotide sequence that hybridizes under high stringent conditions to the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 6, and having substantially the same activity as the receptor protein of the present invention (for example, a DNA having a partial nucleotide sequence of a DNA encoding a receptor protein having ligand binding activity, signal transduction action, etc.) is used.
  • Examples of the DNA capable of hybridizing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 6 include, for example, the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 6 and about 70 or more, preferably about 80% or more, Preferably, DNA containing a nucleotide sequence having a homology of about 90% or more, most preferably about 95% or more is used.
  • a portion of the receptor protein of the present invention is used.
  • a DNA amplified by the PCR method using a synthetic DNA primer having a nucleotide sequence, or incorporated into an appropriate vector, is used as a DNA encoding a partial or entire region of the receptor protein of the present invention.
  • Selection can be performed by hybridization with fragments or those labeled with synthetic DNA. The hybridization can be carried out, for example, according to the method described in Molecular Cloning 2nd (J. Sarabrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). When a commercially available library is used, it can be carried out according to the method described in the attached instruction manual.
  • the cloned DNA encoding the receptor protein can be used as it is or, if desired, digested with a restriction enzyme or added with a linker, if desired.
  • the DNA may have ATG as a translation initiation codon at the 5 'end and TAA, TGA or TAG as a translation termination codon at the 3' end. These translation initiation codon and translation termination codon can also be added using an appropriate synthetic DNA adapter.
  • the expression vector for the receptor protein of the present invention includes, for example, (a) cutting out a DNA fragment of interest from DNA encoding the receptor protein of the present invention, and (mouth) placing the DNA fragment in an appropriate expression vector. Can be produced by ligating downstream of the promoter.
  • the vector examples include a plasmid derived from Escherichia coli (eg, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13), a plasmid derived from Bacillus subtilis (eg, pUB110, pTP5, pC194), a plasmid derived from yeast (eg, pSH19, pSH15), bacteriophage such as phage ⁇ , animal viruses such as retrovirus, vaccinia virus, baculovirus, etc., pAl-11, pXT1, pRc / CMV, pRcZRSV, pc DNA IZNeo or the like is used.
  • Escherichia coli eg, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13
  • Bacillus subtilis eg, pUB110, pTP5, pC194
  • yeast eg, pSH19, pSH15
  • the promoter used in the present invention may be any promoter as long as it is suitable for the host used for gene expression.
  • SRa Promoter when animal cells are used as hosts, SRa Promoter, SV40 Promoter, LTR Mouth motor, CMV promoter, HSV-TK promoter and the like.
  • CMV promoter, SR promoter and the like are preferably used.
  • the host is Escherichia, trp promoter, lac promoter, recA promoter, ⁇ PL promoter, 1 pp promoter, etc., and if the host is Bacillus, SPOL
  • yeast such as Promote overnight, SP02 Promoter, and pen P promoter, PH5 Promoter, PGK promoter, GAP Promoter, ADH promoter, etc. are preferred.
  • a polyhedrin promoter, P10 promoter—Yuichi, etc. are preferred.
  • the expression vector may contain, in addition to the above elements, an enhancer, a splicing signal, a polyA addition signal, a selection marker, and an SV40 replication origin (hereinafter sometimes abbreviated as SV40 ori), if desired.
  • SV40 ori an SV40 replication origin
  • the selection marker include dihydrofolate reductase (hereinafter sometimes abbreviated as dhfr) gene [Mesotorekise Ichito (MTX) resistance], ⁇ ampicillin resistant gene (hereinafter sometimes abbreviated as Amp r), Neomycin resistance gene (hereinafter sometimes abbreviated as Neo, G418 resistance) and the like.
  • dh fr gene is used as a selection marker using CH ⁇ (dh fr ⁇ ) cells
  • the target gene can be selected using a thymidine-free medium.
  • a signal sequence suitable for the host is added to the N-terminal side of the receptor protein of the present invention. If the host is a bacterium belonging to the genus Escherichia, Ph 0 A signal sequence, ⁇ mpA signal sequence, etc., if the host is a bacterium belonging to the genus Bacillus, ⁇ -amylase signal sequence, subtilisin signal sequence, etc. If the host is an yeast, MFo; signal sequence, SUC2, signal sequence, etc. If the host is an animal cell, insulin signal sequence, ⁇ -inuichiferon 'signal sequence, antibody molecule, signal An array etc. can be used respectively.
  • a transformant can be produced using the thus constructed vector containing DN ⁇ encoding the receptor protein of the present invention.
  • Examples of the host include Escherichia, Bacillus, yeast, insect cells, Insects and animal cells are used.
  • Escherichia examples include Escherichia coli (Escherichia col 0 K12 ⁇ DH 1 [Processing's ⁇ the 'National Academy ⁇ ob ⁇ Sciences' ob ⁇ the Pro Natl. Acad. Sci. USA), 60, 160 (1968)], JM103 [Nucleic Acids Research, (Nucleic Acids Research), 9, 309 (1981)], J ⁇ 221 [Journale Journal of Molecular Biology], Volume 120, 517 (1978)], HB 101 [Job 'B' Molecular Biology, Volume 41, 459 (1969) )], C 600 [Genetics
  • Bacillus spp. include, for example, Bacillus subtilis M1114 [Gene, 24, 255 (1983)], 207-21 [Journal of Biochemistry, 95 , 87 (198 4)].
  • yeast examples include, for example, Saccharomyces cerevisiae AH22, AH22R-, NA87-11A, DKD-5D, 20B-12, Schizosaccharomyces pombe NCYC 1913, NCYC 2036, Pichia pastoris (Pichia pastoris) is used.
  • insect cells for example, when the virus is Ac NPV, the cell line derived from the larvae of the night roth moth (Spodoptera frugiperda cell; Sf cell), MG1 cell derived from the midgut of Trichoplusia ni, and HighFive derived from the egg of Trichoplusiani TM cells, cells derived from Mamestra brassicae, cells derived from Estigmena acrea, and the like are used. If the virus is BmNPV, a silkworm-derived cell line (Bombyx mori N; BmN cell) is used. Examples of the Sf cell include Sf9 cell (ATCC CRL1711) and Sf21 cell (Vaughn, LL. Et al., In Vivo, Vol. 13, 213-217 (1977)). Are used.
  • insects for example, silkworm larvae are used [Maeda et al., Nature, 315, 592 (1985)].
  • animal cells include monkey cell COS-7, Vero, Chinese Hamus Yuichi cell CHO (hereinafter abbreviated as CHO cell), dh ⁇ r gene-deficient Chinese hamster cell CHO (hereinafter CHO (dh ⁇ r— ) Cells), mouse L cells, mouse AtT-20, mouse myeloid cells, rat GH3, human FL cells, etc. are used.
  • Transformation of Escherichia spp. can be performed, for example, using Proc. Natl. Acad. Sci. USA (Proc. Natl. Acad. Sci. USA). , 69, 2110 (1972) and Gene, 17, 107 (1982).
  • Transformation of Bacillus spp. Can be performed, for example, according to the method described in Molecular & General Genetics, 168, 11 (1799).
  • Transformation of insect cells or insects can be performed, for example, according to the method described in Bio / Technology, Vol. 6, 47-55 (1988).
  • a liquid medium is suitable as a medium used for the cultivation, and a carbon source necessary for the growth of the transformant is contained therein.
  • Nitrogen sources inorganic substances and others.
  • carbon sources include glucose, dextrin, soluble starch, and sucrose.
  • nitrogen sources include For example, inorganic or organic substances such as ammonium salts, nitrates, corn chip liquor, peptone, potato zein, meat extract, soybean meal, potato extract, and inorganic substances such as calcium chloride and sodium dihydrogen phosphate , Magnesium chloride and the like.
  • yeast, vitamins, growth promoting factors, etc. may be added.
  • the pH of the medium is preferably about 5-8.
  • a culture medium for culturing a bacterium belonging to the genus Escherichia
  • an M9 medium containing glucose and casamino acids Miller, Journal of Epsperimen, Penn. Molecular, Shettics) Experiments in Molecular Genetics), 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972.
  • a drug such as, for example, 3 / 3-indolyl acrylic acid can be added to make the promotion work efficiently.
  • culturing is usually performed at about 15 to 43 ° C for about 3 to 24 hours, and if necessary, aeration and stirring may be added.
  • the cultivation is usually carried out at about 30 to 40 ° C for about 6 to 24 hours, and if necessary, aeration and stirring may be added.
  • Burkholder's minimal medium Bostian, KL et al., "Procedures * of the National Academy of Cultures” Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4505 (1980)] or an SD medium containing 0.5% casamino acid [Bitter, GA et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, Vol. 5330 (1984)], "Processings of the National Academy of Sciences of the USA”.
  • the pH of the medium is preferably adjusted to about 5 to 8. Culture is usually performed at about 20 ° C to 35 ° C for about 24 to 72 hours, and aeration and stirring are added as necessary.
  • Grace's Insect Medium (Grace, TCC, Nature, 195, 788 (1962)) to which an additive such as immobilized 10% pepsin serum or the like is appropriately added is used.
  • the pH of the medium is preferably adjusted to about 6.2 to 6.4.
  • Culture is usually performed at about 27 ° C for about 3 to 5 days, and aeration and agitation are added as necessary.
  • examples of the medium include a MEM medium containing about 5 to 20% fetal bovine serum [Science, 122, 501 (1952)], DMEM Medium [Virology, 8, 396 (1959)], RPMI 1640 medium [Journal of the American Medical 'The Journal of the American Medical Association] 199, 519 (1967) )], And 199 medium [Proceeding of the Society for the Biological Medicine], 7.3, 1 (1950)].
  • H is preferably about 6-8.
  • Cultivation is usually carried out at about 30 ° C to 40 ° C for about 15 to 60 hours, and aeration and agitation are added as necessary.
  • the G protein-coupled receptor protein of the present invention can be produced on the cell membrane of the transformant.
  • Isolation and purification of the receptor protein of the present invention from the above culture can be performed, for example, by the following method.
  • the receptor protein of the present invention When extracting the receptor protein of the present invention from cultured cells or cells, after culturing, cells or cells are collected by a known method, suspended in an appropriate buffer, and subjected to ultrasonication, lysozyme and / or freeze-thawing. After disrupting the cells or cells by such methods as mentioned above, a method of obtaining a crude extract of the receptor protein by centrifugation or filtration is appropriately used.
  • the buffer may contain a protein denaturant such as urea or guanidine hydrochloride, or a surfactant such as Triton X-100 TM.
  • Purification of the receptor protein contained in the culture supernatant or extract obtained in this manner can be carried out by appropriately combining known separation and purification methods.
  • These known separation and purification methods mainly include methods using solubility such as salting out and solvent precipitation, dialysis, ultrafiltration, gel filtration, and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, mainly molecular weight.
  • Method using charge difference such as ion exchange chromatography, method using specific affinity such as affinity chromatography, reverse phase high performance liquid chromatography, etc.
  • a method utilizing the difference in the hydrophobicity of the polymer, a method utilizing the difference in the isoelectric point such as isoelectric focusing, and the like are used.
  • the receptor protein thus obtained When the receptor protein thus obtained is obtained in a free form, it can be converted to a salt by a method known per se or a method analogous thereto. It can be converted into a free form or another salt by an analogous method.
  • the recombinant protein produced by the recombinant can be arbitrarily modified or the polypeptide can be partially removed by applying an appropriate protein modifying enzyme before or after purification.
  • the protein modifying enzyme include trypsin, chymotrypsin, arginyl endopeptidase, protein kinase, glycosidase and the like.
  • the activity of the receptor protein or the salt thereof of the present invention thus produced can be measured by a binding experiment with a labeled ligand, an enzyme immunoassay using a specific antibody, or the like.
  • Antibodies against the receptor protein of the present invention, its partial peptide or their salts include polyclonal antibodies and monoclonal antibodies as long as they can recognize the receptor protein of the present invention, their partial peptide or their salts. Any of antibodies may be used.
  • An antibody against the receptor protein of the present invention, its partial peptide, or a salt thereof uses the receptor protein, etc. of the present invention as an antigen, and is used as an antigen. It can be produced according to a known antibody or antiserum production method.
  • the receptor protein or the like of the present invention is administered to a mammal at a site capable of producing an antibody by administration itself or together with a carrier or a diluent.
  • Complete Freund's adjuvant / incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance antibody production upon administration. Administration is usually performed once every 2 to 6 weeks, for a total of about 2 to 10 times. Examples of mammals that can be used include monkeys, egrets, dogs, and guinea pigs. A mouse, a rat, a sheep, a goat, and a mouse and a rat are preferably used.
  • a warm-blooded animal immunized with the antigen for example, a mouse with an antibody titer is selected from the mouse, and the spleen or lymph node is collected 2 to 5 days after the final immunization.
  • a monoclonal antibody-producing hybridoma can be prepared.
  • the measurement of the antibody titer in the antiserum can be performed, for example, by reacting the below-described labeled receptor protein or the like with the antiserum, and then measuring the activity of the labeling agent bound to the antibody.
  • the fusion operation can be performed according to a known method, for example, the method of Kohler and Milstein [Nature, 256, 495 (1975)].
  • the fusion promoter include polyethylene glycol (PEG) and Sendai virus.
  • PEG polyethylene glycol
  • myeloma cells include NS-1, P3U1, SP 2/0 and the like, with P3U1 being preferred.
  • the preferred ratio between the number of antibody-producing cells (spleen cells) and the number of myeloma cells used is about 1: 1 to 20: 1, and the concentration of PEG (preferably PEG1000 to PEG6000) is about 10 to 80%.
  • the hybridoma culture supernatant is added to a solid phase (eg, microplate) on which an antigen such as receptor protein is adsorbed directly or together with a carrier.
  • a solid phase eg, microplate
  • an anti-immunoglobulin antibody anti-mouse immunoglobulin antibody is used if the cell used for cell fusion is a mouse
  • protein A labeled with a radioactive substance or enzyme and the monoclonal antibody bound to the solid phase Antibody detection method
  • Add the hybridoma culture supernatant to a solid phase to which anti-immunoglobulin antibody or protein A has been adsorbed add Receptacle protein, etc. labeled with radioactive substances, enzymes, etc.
  • a method for detecting the bound monoclonal antibody is exemplified.
  • the selection of monoclonal antibodies can be carried out according to a method known per se or a method analogous thereto.
  • HAT hyperxanthine, aminopterin, thymidine
  • any medium can be used as long as it can grow a hybridoma.
  • RPMI 1640 medium containing 1 to 20%, preferably 10 to 20% fetal bovine serum, GIT medium containing 1 to 10% fetal bovine serum (Wako Pure Chemical Industries, Ltd. )
  • a serum-free medium for hybridoma culture SFM-101, Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.
  • the culture temperature is usually 20 to 40 ° C, preferably about 37 ° C.
  • the culture time is generally 5 days to 3 weeks, preferably 1 week to 2 weeks. Cultivation can usually be performed under 5% CO2.
  • the antibody titer of the hybridoma culture supernatant can be measured in the same manner as the measurement of the antibody titer in the antiserum described above.
  • Monoclonal antibodies can be separated and purified in the same manner as normal polyclonal antibodies. [Examples: salting out, alcohol precipitation, isoelectric focusing, electrophoresis, ion exchangers (ex. , DEAE), ultracentrifugation, gel filtration, antigen-binding solid phase or specific antibody obtained by collecting only the antibody with an active adsorbent such as protein A or protein G, and dissociating the bond to obtain the antibody. Purification method].
  • the polyclonal antibody of the present invention can be produced according to a method known per se or a method analogous thereto. For example, a complex of an immunizing antigen (an antigen such as a receptor protein) and a carrier protein is formed, and a mammal is immunized in the same manner as in the method for producing a monoclonal antibody described above.
  • the antibody can be produced by collecting the antibody-containing substance corresponding to the above and isolating and purifying the antibody.
  • the type of carrier protein and the mixing ratio of the carrier and the hapten depend on the efficiency of the antibody against the hapten immunized by cross-linking the carrier.
  • any kind of crosslinking may be used in any ratio.
  • serum albumin, thyroglobulin, keyhole, lindet, hemocyanin, etc. are converted into hapten 1 by weight.
  • a method of coupling at a rate of about 0.1 to 20, preferably about 1 to 5 is used.
  • various condensing agents can be used for force coupling between the hapten and the carrier.
  • an active ester reagent containing a daltaraldehyde, a carbodiimide, a maleimide active ester, a thiol group or a dithioviridyl group is used.
  • the condensation product is administered to a mammal at a site capable of producing an antibody itself or together with a carrier and a diluent.
  • Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance the antibody-producing ability upon administration.
  • the administration can usually be made once every about 2 to 6 weeks, for a total of about 3 to 10 times.
  • the polyclonal antibody can be collected from the blood, ascites, etc., preferably from the blood of the mammal immunized by the above method.
  • the measurement of the polyclonal antibody titer in the antiserum can be performed in the same manner as the measurement of the antibody titer in the serum described above. Separation and purification of the polyclonal antibody can be carried out according to the same immunoglobulin separation and purification method as the above-described separation and purification of the monoclonal antibody.
  • the receptor protein of the present invention, its partial peptide or a salt thereof, and the DNA encoding them can be obtained by (1) determination of a ligand (agonist) for the receptor protein of the present invention, (2) the present invention. Prevention and / or treatment of diseases associated with dysfunction of G protein-coupled receptor protein, (3) Diagnostic agent, (4) Quantification of ligand for G protein-coupled receptor protein of the present invention (5) screening for compounds (eg, agonists and antonists) that alter the binding between the G protein-coupled receptor protein of the present invention and a ligand; (6) G protein-coupling receptor Yuichi protein of the present invention A prophylactic and / or therapeutic agent for various diseases, comprising a compound that changes the binding property between a protein and a ligand (agonist, angiogonist); (7) a receptor protein of the present invention; (8) Neutralization of the receptor peptide of the present invention, an antibody against the partial peptide or a salt thereof, (9) Encoding the G protein-coupled receptor protein of
  • the binding of a ligand to a G protein-coupled receptor specific to humans and mammals can be improved.
  • Compound that changes eg, Angst, etc.
  • a receptor protein of the present invention, a partial peptide or a salt thereof (hereinafter, may be abbreviated as a receptor protein of the present invention, etc.), a DNA encoding the receptor protein of the present invention or a partial peptide thereof (
  • the use of the antibody of the present invention (which may be abbreviated as the DNA of the present invention) and the antibody against the receptor protein of the present invention (hereinafter sometimes abbreviated as the antibody of the present invention) will be specifically described below.
  • the receptor protein of the present invention or a salt thereof or the partial peptide or a salt thereof of the present invention can be used to search for or determine a ligand (agonist) for the receptor protein of the present invention or a salt thereof. It is useful as a reagent.
  • the present invention provides a method for determining a ligand for the receptor protein of the present invention, which comprises contacting the receptor protein of the present invention or a salt thereof or a partial peptide of the present invention or a salt thereof with a test compound.
  • a method for determining a ligand for the receptor protein of the present invention which comprises contacting the receptor protein of the present invention or a salt thereof or a partial peptide of the present invention or a salt thereof with a test compound.
  • Test compounds include known ligands (e.g., angiotensin, bombesin, canapinoid, cholecystokinin, glutamine, serotonin, melatonin, neuropeptide Y, opioid, purine, vasopressin, oxitocin, ⁇ ACAP, secretin, glucagon, calcium Tonin, adrenomedullin, somatosuvin, GHRH, CRF, ACTH, GRP, PTH, VIP (vasoactive intestinal polypeptide), somatosuvin, dopamine, motilin, amylin, bradykinin, CGRP ( Calcitonin gene-related peptide), leukotriene, pancreastatin, prostaglandin, tropoxane, adenosine, adrenaline, ⁇ and / 3-chemokine (eg, IL-8, GRO, GROi3, GRO , NAP-2, ENA-78, PF4, IP10,
  • the ligand determination method of the present invention uses the receptor protein of the present invention, a partial peptide thereof or a salt thereof, or constructs an expression system for a recombinant receptor protein, and uses the expression system.
  • the receptor-unbound Atsushi system which binds to the receptor-unprotein of the present invention, it stimulates cell stimulating activity (eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ release, intracellular c AM).
  • Compounds that have the activity of promoting or inhibiting P production, intracellular c GMP production, inositol phosphate production, fluctuations in cell membrane potential, phosphorylation of intracellular proteins, activation of c-fos, reduction of pH, etc.) (Eg, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, etc.) or salts thereof.
  • the receptor protein of the present invention or a partial peptide thereof is brought into contact with a test compound, for example, the amount of the test compound bound to the receptor protein or the partial peptide, It is characterized by measuring irritation activity.
  • the present invention relates to (1) a labeled test compound when the labeled test compound is brought into contact with the receptor protein of the present invention or a salt thereof or the partial peptide of the present invention or a salt thereof.
  • a method for determining a ligand for the receptor protein or a salt thereof of the present invention which comprises measuring the amount of binding to the protein or a salt thereof, or the partial peptide or a salt thereof;
  • the labeled test compound is transformed into a receptor protein expressed on the cell membrane by culturing a transformant containing the DNA encoding the receptor protein of the present invention.
  • a method for determining a ligand to the receptor protein of the present invention which comprises measuring the amount of the labeled test compound bound to the receptor protein or a salt thereof when contacted;
  • the 4 test compound definitive when contacted with a cell containing the receptions evening one protein of the present invention, cell stimulating activity via receptions evening one protein (e.g., Arakidon acid release, acetylcholine release, intracellular C a 2 + Activity or inhibition that promotes release, intracellular cAMP production, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, fluctuations in cell membrane potential, phosphorylation of intracellular proteins, activation of c-fos, decrease in pH, etc. , A method for determining a ligand for the receptor protein or a salt thereof of the present invention, and
  • a transformant containing DNA encoding the receptor protein of the present invention e.g., Arakidon acid release, acetylcholine release, intracellular C a 2 + release, intracellular c AM P production, intracellular c GM P, production of inositol phosphate, changes in cell membrane potential, phosphorylation of intracellular proteins, c- and a method for determining a ligand to the receptor protein or a salt thereof of the present invention, which comprises measuring an activity of promoting or suppressing fos activation or pH reduction.
  • the receptor protein used in the ligand determination method may be any receptor protein containing the above-described receptor protein of the present invention or the partial peptide of the present invention.
  • Receptor Yuichi protein is suitable.
  • the above-mentioned expression method is used, but it is preferable to carry out the expression by expressing the DNA encoding the receptor protein in mammalian cells or insect cells.
  • cDNA is used as the DNA fragment encoding the protein portion of interest, but is not necessarily limited to this.
  • a gene fragment or a synthetic DNA may be used.
  • the receptor protein of the present invention In order to introduce the encoding DNA fragment into host animal cells and express them efficiently, the DNA fragment should be prepared from nuclear polyhedrosis virus (NPV) belonging to baculovirus using insects as a host.
  • NPV nuclear polyhedrosis virus
  • a polyhedrin promoter an SV40-derived promoter, a retrovirus promoter, a metallotionin promoter, a human heat shock promoter, a cytomegalovirus promoter, and the SR ⁇ promoter.
  • Examination of the amount and quality of the expressed receptor can be performed by a method known per se. For example, the method is performed according to the method described in the literature [Nambi, P. et al., The Journal of Biological Chemistry (J. Biol. Chem.), 267, pp. 19555-19559, 1992]. be able to.
  • the receptor protein of the present invention includes the receptor protein or the partial peptide thereof or a salt thereof purified according to a method known per se.
  • a cell containing the receptor protein or a cell membrane fraction thereof may be used.
  • the cell When a cell containing the receptor protein of the present invention is used in the ligand determination method of the present invention, the cell may be immobilized with daltaraldehyde, formalin, or the like.
  • the immobilization method can be performed according to a method known per se.
  • the cell containing the receptor protein of the present invention refers to a host cell that expresses the receptor protein of the present invention.
  • Escherichia coli, Bacillus subtilis, yeast, insect cells, animal cells, and the like are used as the host cell.
  • Escherichia coli, Bacillus subtilis, yeast, insect cells, animal cells, and the like are used as the host cell.
  • the cell membrane fraction refers to a fraction abundant in cell membrane obtained by disrupting cells and then obtained by a method known per se.
  • the cells can be disrupted by crushing the cells with a Potter-E1Vehj em-type homogenizer, crushing with a Ring Ring Bender or a polytron (Kinematica), crushing with an ultrasonic wave, or applying pressure with a French press. Crushing by ejecting cells from a thin nozzle can be mentioned.
  • centrifugal fractionation methods such as differential centrifugation and density gradient centrifugation are mainly used.
  • the cell lysate is centrifuged at a low speed (500 rpm to 3000 rpm) for a short time (typically, about 1 minute to 10 minutes), and the supernatant is further concentrated. Centrifuge at high speed (15000-30000 rpm) for 30 minutes to 2 hours, and use the resulting precipitate as the membrane fraction.
  • the membrane fraction is rich in the expressed receptor protein and membrane components such as cell-derived phospholipids and membrane proteins.
  • the amount of the receptor protein in the cell containing the receptor protein or in the membrane fraction thereof is preferably 10 3 to 10 8 molecules per cell, and more preferably 10 5 to 10 7 molecules per cell.
  • an appropriate receptor protein fraction and a labeled test compound are used.
  • receptor protein fraction a natural receptor protein fraction or a recombinant receptor protein fraction having an activity equivalent thereto is desirable.
  • equivalent activity means equivalent ligand binding activity, signal transduction action, and the like.
  • a cell or a membrane fraction of the cell containing the receptor protein of the present invention is suitable for the determination method.
  • the buffer may be any buffer that does not inhibit the binding between the ligand and the receptor protein, such as a phosphate buffer having a pH of 4 to 10 (preferably pH 6 to 8) or a buffer of Tris-HCl.
  • detergents such as CHAPS, Tween-80 TM (Kaoichi Atlas), digitonin, dexcholate, etc. Buffer various proteins such as serum albumin and gelatin.
  • protease inhibitors such as PMS F, Leptin, E-64 (manufactured by Peptide Research Laboratories), and Peptide Resin may be added to suppress receptor degradation and ligand degradation by proteases. it can.
  • a certain amount 5000 c pm ⁇ 500000 c pm
  • [3 H] [125 I]
  • [14 C] tests labeled with a [35 S] Coexist with compounds.
  • the reaction is carried out at about 0 ° C to 50 ° C, preferably about 4 ° C to 37 ° C, for about 20 minutes to 24 hours, preferably about 30 minutes to 3 hours.
  • the reaction solution is filtered through a glass fiber filter or the like, washed with an appropriate amount of the same buffer, and the radioactivity remaining on the glass fiber filter is measured with a liquid scintillation counter or an a counter.
  • a test compound having a count (B-NSB) exceeding 0 cpm obtained by subtracting the non-specific binding amount (N SB) from the total binding amount (B) is used as a ligand for the receptor protein of the present invention or its salt (agogoni). Strike).
  • cell stimulating activity via the receptor protein for example, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2 + Release, intracellular cAMP production, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, activation of c-fos, pH reduction, etc. Or its inhibitory activity
  • cell stimulating activity via the receptor protein for example, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2 + Release, intracellular cAMP production, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, activation of c-fos, pH reduction, etc. Or its inhibitory activity
  • cell stimulating activity via the receptor protein for example, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2 + Release, intracellular cAMP production, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation
  • the assay Prior to ligand determination, replace the cells with fresh medium or an appropriate buffer that is not toxic to cells, add test compounds, etc., incubate for a certain period of time, and extract cells or collect supernatant. Then, the produced product is quantified according to each method. If the production of a substance (for example, arachidonic acid) as an indicator of cell stimulating activity is difficult due to the presence of a degrading enzyme contained in cells, the assay may be performed by adding an inhibitor against the degrading enzyme. Good. In addition, activities such as cAMP production suppression can be detected as a production suppression effect on cells whose basic production amount has been increased with forskolin or the like.
  • a substance for example, arachidonic acid
  • activities such as cAMP production suppression can be detected as a production suppression effect on cells whose basic production amount has been increased with forskolin or the like.
  • a kit for determining a ligand binding to the receptor protein of the present invention or a salt thereof comprises the receptor protein of the present invention or a salt thereof, the partial peptide of the present invention or a salt thereof, and the receptor protein of the present invention. It contains cells or the membrane fraction of cells containing the receptor protein of the present invention.
  • Examples of the ligand determination kit of the present invention include the following.
  • CHO cells expressing the receptor protein of the present invention were subcultured on a 12-well plate at 5 ⁇ 10 5 holes and cultured at 37 ° C., 5% C 2 , and 95% air for 2 days.
  • test compounds that are poorly soluble in water should be dissolved in dimethylformamide, DMSO, methanol, etc. 4Unlabeled test compound
  • the same as the labeled compound is prepared at a concentration 100 to 1000 times higher.
  • Examples of the ligand capable of binding to the receptor protein or a salt thereof of the present invention include substances specifically present in the brain, pituitary gland, england, etc., and specifically, angiotensin, Bombesin, canapinoid, cholecystokinin, glutamine, serotonin, melatonin, neuropeptide Y, opioid, purin, vasopressin, oxotosine, PACAP, secretin, glucagon, lucitonin, adrenomedullin, somatostin, GHRH, CRF ACT H, GRP, PTH, VIP (Vasoactive Intestinal Polypeptide), Somatosintin, Dopamine, Motilin, Amylin, Bradykinin, CGRP (Calcitonin Gene Receptor Peptide), Leukotriene, Punk Reastatin, Prosta Grunge , Tropoxane, adenosine, adrenaline, ⁇
  • the ligand for the receptor protein of the present invention is identified, then depending on the action of the ligand, (1) encode the receptor protein of the present invention or (2) encode the receptor protein of the present invention.
  • the DNA can be used as a medicament such as an agent for preventing and / or treating a disease associated with dysfunction of the receptor protein of the present invention.
  • the receptor protein of the present invention when there is a patient who cannot expect the physiological action of ligand due to a decrease in the receptor protein of the present invention in the living body (the deficiency of the receptor protein), (1) the receptor protein of the present invention By administering to the patient to supplement the amount of the receptor protein, or (2) administering to the patient the DNA encoding the receptor protein of the present invention and expressing it; After inserting and expressing DNA encoding the receptor protein of the present invention in such cells, the amount of the receptor protein in the patient's body is increased by transplanting the cells into the patient, etc. Can be sufficiently exerted. Therefore, the DNA encoding the receptor protein of the present invention is useful as a drug for preventing and / or treating a disease associated with dysfunction of the safe and low-toxic receptor-1 protein of the present invention.
  • the receptor protein of the present invention has about 50% homology at the amino acid sequence level to EDG-2 receptor, which is a G protein-coupled receptor protein.
  • the receptor protein of the present invention may be used for central diseases (eg, Alzheimer's disease, dementia, eating disorders, etc.), inflammatory diseases (eg, allergies, asthma, rheumatism, etc.), cardiovascular diseases (eg, hypertension, cardiac hypertrophy, narrowing).
  • central diseases eg, Alzheimer's disease, dementia, eating disorders, etc.
  • inflammatory diseases eg, allergies, asthma, rheumatism, etc.
  • cardiovascular diseases eg, hypertension, cardiac hypertrophy, narrowing.
  • Prophylaxis and / or cancer eg non-small cell lung cancer, ovarian cancer, prostate cancer, stomach cancer, bladder cancer, breast cancer, cervical cancer, colon cancer, rectal cancer, etc.
  • the receptor protein of the present invention When used as the above-mentioned prophylactic / therapeutic agent, it can be formulated according to a conventional method.
  • DNA of the present invention when a DNA encoding the receptor protein of the present invention (hereinafter sometimes abbreviated as DNA of the present invention) is used as the above-mentioned prophylactic / therapeutic agent, the DNA of the present invention may
  • the NA can be used alone or in a suitable vector such as a retrovirus vector, an adenovirus vector, an adenovirus associated virus vector or the like, followed by a conventional method.
  • the DNA of the present invention can be administered as it is or together with an auxiliary for promoting uptake by a gene gun or a catheter such as a hydrogel catheter.
  • the receptor protein of the present invention or (2) DNA encoding the receptor protein may be orally administered as sugar-coated tablets, capsules, elixirs, microcapsules, etc., if necessary. Alternatively, it can be used parenterally in the form of an injection such as a sterile solution with water or other pharmaceutically acceptable liquid, or a suspension.
  • a known carrier, flavoring agent, excipient, vehicle, preservative, stabilizer, and binder which can physiologically recognize the DNA encoding the receptor protein of the present invention or (2) the DNA encoding the receptor protein. It can be manufactured by mixing in the unit dosage form generally required for the manufacture of pharmaceutical preparations.
  • Additives that can be incorporated into tablets, capsules, etc. include, for example, binders such as gelatin, corn starch, tragacanth, gum arabic, excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, alginic acid And bulking agents such as magnesium stearate, sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin, and flavoring agents such as peppermint, cocoa oil or cellulose.
  • binders such as gelatin, corn starch, tragacanth, gum arabic
  • excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, alginic acid And bulking agents such as magnesium stearate, sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin, and flavoring agents such as peppermint, cocoa oil or cellulose.
  • sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin
  • flavoring agents such as peppermint, cocoa oil or cellulose.
  • the unit dosage form is a capsule
  • Sterile compositions for injection can be formulated according to standard pharmaceutical manufacturing methods, such as dissolving or suspending the active substance in vehicles such as water for injection, and naturally occurring vegetable oils such as sesame oil and coconut oil. it can.
  • aqueous liquid for injection include physiological saline, isotonic solution containing glucose and other adjuvants (eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.) and the like.
  • Agents such as alcohols (eg, ethanol), polyalcohols (eg, propylene glycol, polyethylene daricol), non-ionic surfactants (eg, polysorbate 80 (TM), HCO-50) Is also good.
  • the oily liquid include sesame oil and soybean oil. It may be used in combination with solubilizers such as benzyl benzoate and benzyl alcohol.
  • the prophylactic / therapeutic agents include, for example, buffers (eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer), soothing agents (eg, benzalkonium chloride, procaine hydrochloride, etc.), stabilizers (eg, human They may be combined with serum albumin, polyethylene glycol, etc.), preservatives (eg, benzyl alcohol, phenol, etc.), antioxidants and the like.
  • buffers eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer
  • soothing agents eg, benzalkonium chloride, procaine hydrochloride, etc.
  • stabilizers eg, human They may be combined with serum albumin, polyethylene glycol, etc.
  • preservatives eg, benzyl alcohol, phenol, etc.
  • antioxidants eg, benzyl alcohol, phenol, etc.
  • the preparations obtained in this way are safe and low toxic, so they can be used, for example, in humans and mammals (eg, rats, mice, egrets, higgs, bushes, cats, cats, dogs, dogs, etc.). Can be administered.
  • mammals eg, rats, mice, egrets, higgs, bushes, cats, cats, dogs, dogs, etc.
  • the dose of the receptor protein of the present invention varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, and the like.
  • oral administration in general, for example, in an arteriosclerosis patient (as 6 Okg), About 0.1 mg to l'00 mg per day, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg.
  • parenteral administration the single dose varies depending on the administration target, target organ, symptoms, administration method, etc. (as kg), it is convenient to administer about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 1 Omg per day by intravenous injection. .
  • the amount converted per 60 kg can be administered.
  • the dosage of the DNA of the present invention varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, and the like.
  • oral administration for example, in arteriosclerosis patients (as 60 kg), About 0.1 mg to 100 mg per day, preferably about 1.0 to 5 Omg, more preferably about 1.0 to 20 mg per day.
  • parenteral administration the single dose varies depending on the administration target, target organ, symptoms, administration method, and the like.
  • the dose equivalent to 6 O kg should be administered. Can be.
  • the DNA of the present invention can be used as a probe to produce the receptor of the present invention in humans or mammals (eg, rats, mice, rabbits, sheep, sheep, horses, cats, cats, dogs, monkeys, etc.).
  • Abnormality (genetic abnormality) of DNA or mRNA encoding one protein or a partial peptide thereof can be detected, for example, damage, mutation or decreased expression of the DNA or mRNA, or increase or expression of the DNA or mRNA It is useful as an agent for genetic diagnosis of excess or the like.
  • the above-described genetic diagnosis using the DNA of the present invention can be performed, for example, by the well-known Northern Eighth hybridization and PCR-SSCP method (Genomics, Vol. 5, pp. 874-879 (1989), Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, Vol. 86, pp. 2766-2770 (1989 )).
  • the quantification method of the present invention can be used, for example, in combination with a competition method. That is, the ligand concentration in the test sample can be measured by bringing the test sample into contact with the receptor protein of the present invention or the like. Specifically, for example, it can be used in accordance with the method described in (1) or (2) below or a method analogous thereto.
  • a method for screening a compound that changes the binding property between a G protein-coupled receptor protein of the present invention and a ligand eg, agonist, antagonist
  • the ligand and the present invention can be used.
  • Compounds that alter the binding to the receptor, Yuichi protein, etc. (Eg, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, etc.) or salts thereof can be screened efficiently.
  • Such compounds via the G protein-coupled receptions evening single cell stimulating activity (e.g., Arakidon acid release, acetylcholine release, intracellular C a 2 + release, intracellular c AM P product, cells C GMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuations, phosphorylation of intracellular proteins, activation of c-fos, activity to suppress or decrease pH etc.
  • evening single cell stimulating activity e.g., Arakidon acid release, acetylcholine release, intracellular C a 2 + release, intracellular c AM P product, cells C GMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuations, phosphorylation of intracellular proteins, activation of c-fos, activity to suppress or decrease pH etc.
  • Ligand and G of the present invention A compound that enhances the binding force to the protein-coupled receptor protein, or (2) a compound that decreases the binding force between the ligand and the G protein-coupled receptor protein of the present invention, etc. Include (The compound of the above (I) is preferably screened by a ligand decision method described above).
  • the present invention relates to (i) the case where the receptor protein of the present invention or its partial peptide or a salt thereof is brought into contact with a ligand; and (ii) the receptor protein of the present invention or its partial peptide or a salt thereof. , A ligand and a test compound, and comparing the ligand with a receptor protein of the present invention or a partial peptide thereof or a salt thereof, or a compound or a salt thereof, which is characterized by comparing the case of contacting the ligand with a test compound.
  • a screening method is provided.
  • the screening method of the present invention is characterized in that, in the cases (i) and (ii), for example, the amount of binding of a ligand to the receptor protein or the like, the cell stimulating activity, and the like are measured and compared.
  • the present invention provides
  • the receptor protein of the labeled ligand is brought into contact.
  • the labeled ligand is transferred to a cell containing the receptor protein of the present invention or the like or the cell. Labeled ligand in contact with the membrane fraction of the vesicles, and when the labeled ligand and the test compound are contacted with the cells containing the receptor protein of the present invention or the membrane fraction of the cells. A method of measuring the amount of binding to the cell or the membrane fraction and comparing the ligand and the receptor of the present invention, or a salt thereof, which changes the binding property of the protein or the like.
  • the labeled ligand is contacted with the receptor protein expressed on the cell membrane by culturing the transformant containing the DNA of the present invention, and the labeled ligand and test compound are used in the present invention.
  • the transformant containing the DNA of the present invention is brought into contact with the receptor protein of the present invention expressed on the cell membrane by culturing, the amount of the labeled ligand bound to the receptor protein or the like is measured and compared.
  • a compound that activates the receptor protein of the present invention eg, a ligand for the receptor protein of the present invention
  • a cell containing the receptor protein of the present invention A cell stimulating activity via receptor receptor when a compound activating the receptor receptor protein of the present invention and a test compound are brought into contact with cells containing the receptor protein of the present invention (for example, Arakidon acid release, Asechiru choline release, intracellular C a 2 + release, intracellular c AM P production, intracellular c GMP product, I Noshitorurin acid production, change in cell membrane potential, phosphorylation of intracellular proteins, c-one I os Activation and reduction of activity, etc.) are measured and compared with each other. Changes in binding between the ligand and the receptor protein of the present invention, etc. Object or screening method of a salt thereof, and
  • a compound that activates the receptor protein of the present invention (eg, a ligand for the receptor protein of the present invention) is expressed on the cell membrane by culturing the transformant containing the DN ⁇ of the present invention. And a compound that activates the receptor protein or the like of the present invention and a test compound were expressed on the cell membrane by culturing a transformant containing the DNA of the present invention.
  • cell stimulating activity via receptions evening one e.g., Arakidon acid release, acetylcholine release, intracellular C a 2 + Activity that promotes release, intracellular cAMP production, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, fluctuations in cell membrane potential, phosphorylation of intracellular proteins, activation of c-fos, reduction of pH, etc.
  • a method for screening for a compound or a salt thereof that alters the binding property between the ligand and the receptor protein or the like of the present invention which is characterized by measuring and comparing the activity.
  • a cell, a tissue or a cell membrane containing the G protein-coupled receptor protein is screened for screening of a G protein-coupled receptor agonist or an gonist.
  • a method of confirming whether or not the inhibition of the binding between the G protein-coupled receptor protein and the ligand using the protein was employed.
  • the cell, fibrous tissue or cell membrane fraction is used as it is, other receptor proteins are also mixed, so that it is difficult to actually screen for an agonist or an anthony gonist against the target receptor protein. there were.
  • the receptor protein of the present invention by using the receptor protein of the present invention, a compound that inhibits the binding between the ligand and the G protein-coupled receptor protein can be efficiently screened. Furthermore, it is possible to easily evaluate whether the screened compound is an agonist or an antagonist.
  • the receptor protein of the present invention used in the screening method of the present invention may be any as long as it contains the above-described receptor protein of the present invention.
  • a cell membrane fraction of a mammalian organ containing the above-mentioned receptor protein or the like is preferred.
  • a receptor protein expressed in large amounts using a recombinant or the like is suitable.
  • the method described above is used to produce the receptor protein of the present invention and the like, but it is preferably carried out by expressing the DNA of the present invention in mammalian cells and insect cells.
  • the DNA fragment encoding the target protein portion cDNA is used, but is not necessarily limited thereto.
  • a gene fragment or a synthetic DNA may be used.
  • the DNA fragment is used as an insect host.
  • Polyhedrin promoter of nuclear polyhedrosis virus (NPV) belonging to the baculovirus a promoter derived from SV40, a promoter of retrovirus, meta-oral thionein promoter, human It is preferable to incorporate it in downstream of a heat shock motor, cytomegalovirus promoter, SR ⁇ promoter and the like.
  • the amount and quality of the expressed receptor can be examined by a method known per se. For example, in accordance with the method described in the literature [Nambi, P. et al., The Journal of 'Biological' Chemistry (J. Biol. Chem.), 267, pp. 19555-19559, 1992]. Can be.
  • the protein containing the receptor protein of the present invention and the like may be the receptor protein and the like purified according to a method known per se, or the receptor protein and the like may be used.
  • cells containing the protein may be used, or a membrane fraction of cells containing the receptor protein or the like may be used.
  • the cell when a cell containing the receptor protein of the present invention or the like is used, the cell may be immobilized with daltaraldehyde, formalin, or the like.
  • the immobilization method can be performed according to a method known per se.
  • the cells containing the receptor protein or the like of the present invention refer to host cells expressing the receptor protein or the like, and the host cells are preferably Escherichia coli, Bacillus subtilis, yeast, insect cells, animal cells, and the like. .
  • the cell membrane fraction refers to a fraction abundant in cell membrane obtained by disrupting cells and then obtained by a method known per se.
  • Cells can be disrupted by crushing the cells with a Potter-E1 Vehjem homogenizer, crushing with a Perling blender or Polytron (Kinematica), crushing with ultrasonic waves, French press, etc. Crushing by ejecting cells from a narrow nozzle while applying pressure.
  • centrifugal fractionation methods such as differential centrifugation and density gradient centrifugation are mainly used.
  • the cell lysate is centrifuged at a low speed (500 rpm to 300 rpm) for a short time (typically about 1 to 10 minutes), and the supernatant is further centrifuged at a high speed (150 rpm to The mixture is centrifuged at 300 rpm for 30 minutes to 2 hours, and the resulting precipitate is used as a membrane fraction.
  • the membrane fraction contains a large amount of expressed receptor proteins and membrane components such as cell-derived phospholipids and membrane proteins. The amount of receptor protein in cells and membrane fractions containing the receptor protein and the like,
  • an appropriate receptor protein fraction and a labeled ligand are required. It is.
  • the receptor protein fraction is preferably a natural receptor protein fraction or a recombinant receptor protein fraction having the same activity as the protein fraction.
  • “equivalent activity” refers to equivalent ligand binding activity, signal transduction action and the like.
  • the labeled ligand a labeled ligand, a labeled ligand analog compound and the like are used.
  • ligands labeled with [ 3 H], [ 125 I], [ 14 C], [ 35 S] and the like are used.
  • a cell containing the receptor protein of the present invention or a membrane fraction of the cell is first used.
  • Prepare a receptor protein sample by suspending it in a buffer suitable for screening.
  • the buffer may be any buffer such as a phosphate buffer of pH 4 to 10 (preferably pH 6 to 8) or a buffer such as Tris-HCl buffer that does not inhibit the binding between the ligand and the receptor protein.
  • No. Surfactants such as CHAPS, Tween-80 TM (Kaoichi Atlas), digitonin, and dexcholate can also be added to the buffer to reduce non-specific binding.
  • a proteases inhibitor such as PMS F, Leptin, E-64 (manufactured by Peptide Research Institute), and Pepsin-tin should be added in order to suppress the degradation of receptor and ligand by proteases. You can also. To the receptions evening over a solution of 0. 01ml ⁇ 10ml, was added labeled ligand a certain amount (5000 c pm ⁇ 500000 cm), causes the coexistence of test compound at the same time 10- 4 M ⁇ 10- 1Q M. Prepare a reaction tube containing a large excess of unlabeled ligand to determine the amount of non-specific binding (NSB).
  • NBS non-specific binding
  • the reaction is from about 0 ° C to 50 ° C, preferably from about 4 ° C
  • the reaction is performed at 37 ° C for about 20 minutes to 24 hours, preferably for about 30 minutes to 3 hours.
  • the reaction solution is filtered through a glass fiber filter or the like, washed with an appropriate amount of the same buffer, and the radioactivity remaining on the glass fiber filter is measured using a liquid scintillation counter or an arc counter.
  • the specific binding amount (B—NSB) is For example, a test compound having a concentration of 50% or less can be selected as a candidate substance having competitive inhibitory ability.
  • the cell stimulating activity through the receptor protein for example, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca release, intracellular cAMP production, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, c-fos Activation, activity to promote or suppress pH reduction, etc.
  • the cell stimulating activity through the receptor protein for example, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca release, intracellular cAMP production, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, c-fos Activation, activity to promote or suppress pH reduction, etc.
  • the cell stimulating activity through the receptor protein for example, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca release, intracellular cAMP production, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular
  • cells containing the receptor protein of the present invention and the like are cultured on a multi-well plate or the like. Prior to screening, replace the cells with a fresh medium or an appropriate buffer that is not toxic to cells, add test compounds, etc., incubate for a certain period of time, and extract cells or collect supernatant. Then, the produced product is quantified according to each method. If the production of a substance (for example, arachidonic acid) as an indicator of the cell stimulating activity is difficult to be assayed by a degrading enzyme contained in cells, an inhibitor for the degrading enzyme is added to perform the assay. Is also good. In addition, activities such as inhibition of cAMP production can be detected as production inhibitory effects on cells whose basic production has been increased by forskolin or the like.
  • a substance for example, arachidonic acid
  • cells expressing an appropriate receptor protein are used.
  • Examples of cells expressing the receptor protein of the present invention include cell lines having the natural receptor protein of the present invention and the like, and cell lines expressing the above-mentioned recombinant receptor protein and the like. desirable.
  • Test compounds include, for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds, A synthetic compound, a fermentation product, a cell extract, a plant extract, an animal tissue extract, or the like is used. These compounds may be novel compounds or known compounds.
  • a screening kit for a compound or a salt thereof that alters the binding property between the ligand and the receptor protein of the present invention, etc. is a cell containing the receptor protein of the present invention, a cell containing the receptor protein of the present invention, or And those containing a membrane fraction of cells containing the receptor protein of the present invention.
  • Examples of the screening kit of the present invention include the following.
  • CHO cells expressing the receptor protein of the present invention were subcultured on a 12-well plate at 5 ⁇ 10 5 in 7 wells and cultured at 37 ° C., 5% CO 2 , and 95% air for 2 days.
  • test compound solution 10- 3 ⁇ 10- 1G M After 5 1 added test compound solution 10- 3 ⁇ 10- 1G M, the labeled ligand 5 Add 1 and react at room temperature for 1 hour. A supplementary 5 X 1 ligands of 10- 3 M in place of the test compound to determine the amount of non-specific binding.
  • B 0 Toriguchi
  • the compound or a salt thereof obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention changes the binding property between the ligand and the receptor protein of the present invention.
  • G-protein-coupled receptor Cell-stimulating activity eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ release, intracellular cAMP
  • Production intracellular c GMP generation, inositol phosphoric acid production, cell membrane potential fluctuations, intracellular protein phosphorylation, c-1: activation of fos, activity to promote or suppress pH reduction, etc.
  • a so-called agonist against the receptor protein of the present invention (mouth) a compound not having the cell stimulating activity (a so-called agonist against the receptor protein of the present invention).
  • Is a G protein compound enhance coupling force between coupled receptor protein, or (d) a compound that decreases the binding force between G protein-coupled receptions evening one protein ligand with the present invention the ligand of the present invention.
  • the compound examples include peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, and fermentation products. These compounds may be novel compounds or known compounds. Since the agonist against the receptor protein of the present invention has the same activity as the physiological activity of the ligand for the receptor protein of the present invention, it is safe and has low toxicity according to the ligand activity. Useful as a medicine.
  • the antagonist of the present invention for the receptor protein or the like of the present invention can suppress the physiological activity of the ligand for the receptor protein or the like of the present invention, it is a safe and low-toxic drug that suppresses the ligand activity.
  • the compound that enhances the binding force between the ligand and the G protein-coupled receptor protein of the present invention is a safe and low-toxic drug for enhancing the physiological activity of the ligand for the receptor protein of the present invention and the like.
  • a compound that decreases the binding force between the ligand and the G protein-coupled receptor protein of the present invention is a safe and low-toxic drug for reducing the physiological activity of the ligand for the receptor protein of the present invention and the like. Useful.
  • a compound or a salt thereof obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention is used as the above-mentioned pharmaceutical composition, it can be formulated according to a conventional method.
  • tablets, capsules, elixirs, microcapsules, sterile solutions, suspensions and the like can be prepared in the same manner as the above-mentioned drug containing DNA of the present invention.
  • the preparations obtained in this way are safe and have low toxicity, so they can be used, for example, in humans and mammals (eg, rats, mice, egrets, sheep, pigs, pigs, cats, dogs, dogs, etc.). Can be administered.
  • mammals eg, rats, mice, egrets, sheep, pigs, pigs, cats, dogs, dogs, etc.
  • the dose of the compound or a salt thereof varies depending on the administration subject, target organ, symptoms, administration method, and the like.
  • oral administration for example, in an arteriosclerosis patient (as 60 kg), About 0.:! To 10 O mg per day, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg.
  • parenteral administration the single dose varies depending on the administration target, target organ, symptoms, administration method, and the like.
  • about 0.01 to 3 Omg per day preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 1 Omg per day Is convenient.
  • the dose equivalent to 6 O kg should be administered. Can be.
  • a prophylactic and / or therapeutic agent for various diseases containing a compound (agonist, angonist) that changes the binding property between the G protein-coupled receptor protein and the ligand of the present invention.
  • the receptor protein of the present invention plays an important role in a living body such as a central function. Therefore, the compounds of the present invention that alter the binding between the receptor protein of the present invention and a ligand (agonist, angoniist) can prevent and / or prevent diseases associated with dysfunction of the receptor protein of the present invention. It can be used as a therapeutic agent.
  • a ligand agonist, angoniist
  • the compound when used as an agent for preventing and / or treating a disease associated with dysfunction of the receptor protein of the present invention, it can be formulated according to conventional means.
  • the compound can be used as a sugar-coated tablet, capsule, elixir, microcapsule or the like as needed, orally, or aseptic solution with water or another pharmaceutically acceptable liquid. It can be used parenterally or in the form of injections such as suspensions.
  • the compound is mixed with known physiologically acceptable carriers, flavoring agents, excipients, vehicles, preservatives, stabilizers, binders, and the like in the unit dosage form required for generally accepted pharmaceutical manufacturing methods. Can be manufactured. The amount of the active ingredient in these preparations is such that a suitable dosage in the specified range can be obtained.
  • Additives that can be incorporated into tablets, capsules, etc. include, for example, binders such as gelatin, corn starch, tragacanth, gum arabic, excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, alginic acid And swelling agents such as magnesium stearate, sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin, and flavoring agents such as peppermint, cocoa oil or cherry.
  • binders such as gelatin, corn starch, tragacanth, gum arabic
  • excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, alginic acid And swelling agents such as magnesium stearate, sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin, and flavoring agents such as peppermint, cocoa oil or cherry.
  • sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin
  • flavoring agents such as peppermint, cocoa oil or cherry.
  • the unit dosage form is a capsule
  • the above type of material
  • aqueous liquid for injection examples include physiological saline, isotonic solution containing glucose and other adjuvants (eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.) and the like.
  • Agents such as alcohol (eg, ethanol), polyalcohol (eg, propylene glycol, polyethylene daricol), nonionic surfactants (eg, polysorbate 80 (TM), HCO-50) .
  • alcohol eg, ethanol
  • polyalcohol eg, propylene glycol, polyethylene daricol
  • nonionic surfactants eg, polysorbate 80 (TM), HCO-50
  • oily liquid for example, sesame oil, soybean oil and the like are used, and may be used in combination with solubilizers such as benzyl benzoate and benzyl alcohol.
  • the prophylactic / therapeutic agents include, for example, buffers (eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer), soothing agents (eg, benzalkonium chloride, procaine hydrochloride, etc.), stabilizers (eg, human serum It may be combined with albumin, polyethylene glycol, etc.), preservatives (eg, benzyl alcohol, phenol, etc.), antioxidants and the like.
  • buffers eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer
  • soothing agents eg, benzalkonium chloride, procaine hydrochloride, etc.
  • stabilizers eg, human serum It may be combined with albumin, polyethylene glycol, etc.
  • preservatives eg, benzyl alcohol, phenol, etc.
  • antioxidants eg, benzyl alcohol, phenol, etc.
  • the preparations obtained in this way are safe and low toxic, so they can be used, for example, in humans and mammals (eg, rats, mice, egrets, higgs, bushes, cats, cats, dogs, dogs, etc.). Can be administered.
  • mammals eg, rats, mice, egrets, higgs, bushes, cats, cats, dogs, dogs, etc.
  • the dose of the compound or a salt thereof varies depending on the administration subject, target organ, condition, administration method, and the like.
  • oral administration for example, in an arteriosclerosis patient (as 60 kg), one dose is generally used. It is about 0.1 to 10 Omg per day, preferably about 1.0 to 5 Omg, more preferably about 1.0 to 2 Omg.
  • parenteral administration the single dose varies depending on the administration target, target organ, symptoms, administration method, and the like. (as kg), it is convenient to administer about 0.01 to 3 Omg per day, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 1 Omg by intravenous injection. is there. In the case of other animals, the dose can be administered in terms of 60 kg.
  • the present invention provides, for example,
  • the antibody of the present invention is competitively reacted with a test solution, a labeled receptor protein, and the like, and the ratio of the labeled receptor protein bound to the antibody is measured.
  • a method for quantifying the receptor protein or the like of the present invention in a test solution
  • one of the antibodies is an antibody that recognizes the N-terminal portion of the receptor protein of the present invention or the like, and the other antibody is an antibody that reacts with the C-terminal portion of the receptor protein of the present invention or the like.
  • the other antibody is an antibody that reacts with the C-terminal portion of the receptor protein of the present invention or the like.
  • the monoclonal antibody of the present invention In addition to measuring the receptor protein of the present invention using a monoclonal antibody against the receptor protein of the present invention (hereinafter sometimes referred to as the monoclonal antibody of the present invention), detection by tissue staining or the like is also possible. Can also.
  • the antibody molecule itself may be used, or F (ab ') 2 , Fab', or Fab fraction of the antibody molecule may be used.
  • the assay method using an antibody against the receptor protein or the like of the present invention is not particularly limited, and may be an antibody, an antigen or an antibody-antigen complex corresponding to the amount of the antigen in the test solution (for example, the amount of the receptor protein).
  • any measurement method may be used as long as the amount of the body is detected by chemical or physical means, and the amount is calculated from a standard curve prepared using a standard solution containing a known amount of antigen.
  • nephrometry, a competitive method, an immunometric method, and a sandwich method are suitably used, but in terms of sensitivity and specificity, it is particularly preferable to use a sandwich method described later.
  • a labeling agent used in a measuring method using a labeling substance for example, a radioisotope, an enzyme, a fluorescent substance, a luminescent substance and the like are used. Radioisotopes, if example embodiment, [1 2 5 I], [1 3 1 I], C 3 H], and [1 4 C] used.
  • the enzyme is preferably a stable enzyme having a large specific activity.
  • 3-galactosidase, / 3-dalcosidase, alkaline phosphatase, peroxidase, and malate dehydrogenase are used.
  • fluorescent substances include fluorescami And fluorescein isothiocyanate are used.
  • the luminescent substance for example, luminol, luminol derivative, luciferin, lucigenin and the like are used. Further, a biotin-avidin system can be used for binding the antibody or antigen to the labeling agent.
  • insolubilization of the antigen or antibody physical adsorption may be used, or a method using a chemical bond usually used for insolubilizing and immobilizing proteins or enzymes may be used.
  • the carrier for example, insoluble polysaccharides such as agarose, dextran, and cellulose; synthetic resins such as polystyrene, polyacrylamide, and silicon; and glass are used.
  • the test solution is reacted with the insolubilized monoclonal antibody of the present invention (primary reaction), and further reacted with the labeled monoclonal antibody of the present invention (secondary reaction).
  • primary reaction By measuring the activity of the agent, the amount of the receptor protein of the present invention in the test liquid can be determined.
  • the primary reaction and the secondary reaction may be performed in the reverse order, may be performed simultaneously, or may be performed at staggered times.
  • the labeling agent and the method of insolubilization can be in accordance with those described above.
  • the antibody used for the solid phase antibody or the labeling antibody is not necessarily one kind, and a mixture of two or more kinds of antibodies is used for the purpose of improving measurement sensitivity and the like. May be used.
  • the monoclonal antibody of the present invention used in the primary reaction and the secondary reaction is preferably an antibody having different binding sites to the receptor protein and the like. That is, the antibody used in the primary reaction and the secondary reaction is, for example, when the antibody used in the secondary reaction recognizes the C-terminal of the receptor protein, the antibody used in the primary reaction is preferably the C-terminal. For example, an antibody that recognizes other than the N-terminal part is used.
  • the monoclonal antibody of the present invention can be used in a measurement system other than the sandwich method, for example, a competition method, an immunometric method, or a nephrometry.
  • a competition method the antigen in the test solution and the labeled antigen are allowed to react competitively with the antibody, and then the unreacted labeled antigen (F) and the labeled antigen (B) bound to the antibody are separated.
  • F labeled antigen
  • B labeled antigen
  • a soluble antibody is used as the antibody
  • BZF separation is performed using polyethylene glycol
  • a liquid phase method using a second antibody against the antibody a solid phase antibody is used as the first antibody
  • An immobilization method using a soluble first antibody and an immobilized antibody as the second antibody is used.
  • the antigen in the test solution and the immobilized antigen are subjected to a competitive reaction with a certain amount of labeled antibody, and then the solid phase and the liquid phase are separated. After reacting the antigen with an excess amount of the labeled antibody, the immobilized antigen is added to bind the unreacted labeled antibody to the solid phase, and then the solid phase and the liquid phase are separated. Next, the amount of label in either phase is measured to determine the amount of antigen in the test solution.
  • the amount of insoluble sediment generated as a result of the antigen-antibody reaction in a gel or in a solution is measured. Even when the amount of antigen in the test solution is small and only a small amount of sediment is obtained, laser-nephrometry utilizing laser-scattering is preferably used.
  • the receptor protein of the present invention or a salt thereof can be quantified with high sensitivity.
  • the antibody of the present invention can be used for specifically detecting the receptor protein of the present invention present in a subject such as a body fluid or a tissue. Further, preparation of an antibody column used for purifying the receptor protein of the present invention and the like, detection of the receptor protein of the present invention in each fraction at the time of purification, and the receptor of the present invention in test cells It can be used for analyzing the behavior of Yuichi proteins.
  • the neutralizing activity of an antibody against the receptor protein of the present invention or a partial peptide thereof or a salt thereof against a receptor protein or the like means an activity of inactivating a signal transduction function involving the receptor protein. . Therefore, when the antibody has a neutralizing activity, signal transduction involving the receptor protein, for example, cell stimulating activity via the receptor protein (eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2 + Activity to promote release, intracellular cAMP production, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, activation of c-fos, decrease in pH, etc. Activity, etc.) can be inactivated. Therefore, it can be used for prevention and Z or treatment of diseases caused by overexpression of the receptor protein.
  • cell stimulating activity via the receptor protein eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2 + Activity to promote release, intracellular cAMP production,
  • transgenic animal expressing the receptor protein of the present invention or the like can be prepared.
  • animals include mammals (for example, rats, mice, egrets, sheep, bush, sea lions, cats, dogs, monkeys, etc.) (hereinafter sometimes abbreviated as animals).
  • mammals for example, rats, mice, egrets, sheep, bush, sea lions, cats, dogs, monkeys, etc.
  • animals hereinafter sometimes abbreviated as animals.
  • Mouse, rat, etc. are suitable It is.
  • the DNA of the present invention In transferring the DNA of the present invention to a target animal, it is generally advantageous to use the DNA as a gene construct linked downstream of a promoter capable of being expressed in animal cells.
  • a gene construct linked to the downstream of one of various promoters capable of expressing an animal-derived DNA of the present invention having high homology with animal cells in an animal cell may be used, for example.
  • a DNA-transferred animal that produces high levels of the receptor protein of the present invention can be produced.
  • a promoter derived from virus or a ubiquitous expression promoter such as meta-mouth thionein can be used, but preferably, an NGF gene promoter specifically expressed in the brain is used. Ze gene promoter is used.
  • Transfer of the DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in all germ cells and somatic cells of the target animal.
  • the presence of the receptor protein or the like of the present invention in the germ cells of the produced animal after DNA transfer means that all the offspring of the produced animal have the receptor protein of the present invention in all of the germ cells and somatic cells.
  • the progeny of this kind of animal that has inherited the gene has the receptor protein of the present invention in all of its germ cells and somatic cells.
  • the DNA-transferred animal of the present invention After confirming that the DNA-transferred animal of the present invention stably retains the gene by breeding, it can be reared in an ordinary breeding environment as the DNA-bearing animal. Furthermore, by crossing male and female animals having the target DNA, homozygous animals having the transgene on both homologous chromosomes are obtained, and by crossing the male and female animals, all the offspring will have the DNA Breeding to have Since the animal into which the DNA of the present invention has been transferred expresses the receptor protein of the present invention at a high level, it is useful as an animal for screening an agonist or an anthony gonist against the receptor protein of the present invention. is there.
  • the DNA-transferred animal of the present invention can also be used as a cell source for tissue culture.
  • the present invention can be performed. Analysis of receptor proteins, etc.
  • Can be Cells of a tissue having the receptor protein or the like of the present invention are cultured by standard tissue culture techniques, and the functions of cells from tissues that are generally difficult to culture such as those derived from the brain or peripheral tissues are used by these techniques. Can study.
  • the cells for example, it is possible to select a drug that enhances the function of various tissues.
  • the receptor protein of the present invention can be isolated and purified therefrom.
  • bases, amino acids, and the like are indicated by abbreviations based on the abbreviations by the IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature or commonly used abbreviations in the art, and examples thereof are described below. If there is an optical isomer of the amino acid, the L-form is indicated unless otherwise specified.
  • Th r Threonine
  • TC thiazolidine-4 (R) lipoxamide group. Also, substituents, protecting groups and reagents commonly used herein are provided.
  • FIG. 1 shows the amino acid sequence of a mouse spleen-derived novel G protein-coupled receptor protein, mAL 7 TO 24, of the present invention.
  • FIG. 1 shows the nucleotide sequence of cDNA encoding the novel spleen G protein-coupled receptor protein mAL7T024 derived from the mouse spleen of the present invention having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • FIG. 1 shows the nucleotide sequence of Primer 12 used to clone cDNA encoding the novel G protein-coupled receptor protein mAL7T024 derived from the mouse spleen of the present invention.
  • FIG. 1 shows the amino acid sequence of human lung-derived novel G protein-coupled receptor protein hAL7TO24 derived from human lung.
  • FIG. 1 shows the nucleotide sequence of cDNA encoding the novel human lung-derived G protein-coupled receptor protein hAL7T024 having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 of the present invention.
  • FIG. 1 shows the nucleotide sequence of Primer 13 used for cloning cDNA encoding human lung-derived novel G protein-coupled receptor protein hAL7TO24 of the present invention.
  • the nucleotide sequence of the primer 14 used for cloning the cDNA encoding the human lung-derived novel G protein-coupled receptor protein hAL7TO24 of the present invention is shown below. " The transformed Escherichia coli (Escherichia coli) TOP 10 F '/ pCR 3. l-mAL024 was transferred to the National Institute of Biotechnology and Industrial Technology (NI BH) from December 2, 1998 by the Ministry of Trade and Industry. It has been deposited with the Fermentation Research Institute (IFO) as Accession No. IFO 16222 as Accession No. FERM BP — 6591 since November 25, 1998. The invention is described in more detail below with reference to examples. However, these methods do not limit the scope of the present invention, and the method of genetic manipulation using Escherichia coli followed the method described in Molecular * cloning.
  • PCR reaction was performed using two primers, primer 1 (SEQ ID NO: 3) and primer 2 (SEQ ID NO: 4).
  • the composition of the reaction solution used in the reaction was 1/10 of the above cDNA as type III, 1/50 of Advantagec DNA Polymerase Mix (CLONTEC H), primer 1 (SEQ ID NO: : 3) and Primer 2 (SEQ ID NO: 4) were added to each of 0.2 xM, dNTPs 200 ⁇ , and the buffer attached to the enzyme to give a volume of 251.
  • the PCR reaction repeats 35 cycles of 294 ° C for 30 seconds, 294 ° C for 5 seconds, 6.8 ° C for 2 minutes 35 times, 3Finally 6.8 ° C for 7 minutes was performed.
  • the reaction product after the PCR reaction was subcloned into a plasmid vector pCR3.1 (Invitrogen) according to the prescription of a TA cloning kit (Invitrogen). This was introduced into E. coli TOP10F ', clones having cDNA were selected on LB agar medium containing ampicillin, and the sequences of the individual clones were analyzed.
  • the coding cDNA sequence (SEQ ID NO: 2) was obtained.
  • PCR reaction was performed using two primers, primer 13 (SEQ ID NO: 7) and primer 4 (SEQ ID NO: 8).
  • the composition of the reaction solution used in the reaction was one-fifth of the above-mentioned cDNA, which was used as a ⁇ type, and was prepared using the Advantagec DNA Polymerase Mix. (CLONTECH Co., Ltd.)
  • a 50-mer amount, primer 3 (SEQ ID NO: 7) and primer 4 (SEQ ID NO: 8) were added to each of 0.2 M, dNTPs 200 M, and the enzyme. Buffer 1 was added to make a liquid volume of 25/1.
  • the PCR reaction is as follows: 1 94 ° C 30 seconds, 2 94 ° C ⁇ 5 seconds, 68 ° C ⁇ 2 minutes cycle repeated 35 times, 3 last 68 ° C '7 minutes extension reaction was done.
  • the reaction product after the PCR reaction was subcloned into a plasmid vector pCR3.1 (InV itrogen) according to the prescription of a TA cloning kit (InV itrogen). This was introduced into Escherichia coli DH5, clones containing cDNA were selected on LB agar medium containing ampicillin, and the sequences of the individual clones were analyzed.
  • a transformant containing the cDNA sequence SEQ ID NO: 6
  • the G protein-coupled receptor protein of the present invention is: (1) ligand (agonist) 2) Acquisition of antibodies and antisera; 3) Construction of a recombinant receptor protein expression system ⁇ Implementation of drug design based on comparison with Reception Yuichi, ⁇ ⁇ Reagents for preparing probes and PCR primers for genetic diagnosis, ⁇ ⁇ Preparation of transgenic animals or 8 Gene prevention Can be used.

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Description

明 細 新規 G蛋白質共役型レセプター蛋白質およびその D N A 技術分野
本発明は、 マウス脾臓由来またはヒト肺由来の新規 G蛋白質共役型レセプ夕一 蛋白質またはその塩およびそれをコードする D N Aに関する。 背景技術
多くのホルモンや神経伝達物質などの生理活性物質は、 細胞膜に存在する特異 的なレセプ夕一蛋白質を通じて生体の機能を調節している。 これらのレセプ夕一 蛋白質のうち多くは共役している guanine nuc l eot i de-b ind ing prote in (以下、 G蛋白質と略称する場合がある） の活性化を通じて細胞内のシグナル伝達を行な い、 また 7個の膜貫通領域を有する共通した構造をもっていることから、 G蛋白 質共役型レセプ夕一蛋白質あるいは 7回膜貫通型レセプ夕一蛋白質 （7 TM R) と総称される。
G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質は生体の細胞や臓器の各機能細胞表面に存在 し、 それら細胞や臓器の機能を調節する分子、 例えばホルモン、 神経伝達物質お よび生理活性物質等の標的として生理的に重要な役割を担っている。 レセプ夕一 は生理活性物質との結合を介してシグナルを細胞内に伝達し、 このシグナルによ り細胞の賦活ゃ抑制といつた種々の反応が惹起される。
各種生体の細胞や臓器の内の複雑な機能を調節する物質と、 その特異的レセプ 夕一蛋白質、 特には G蛋白質共役型レセプター蛋白質との関係を明らかにするこ とは、 各種生体の細胞や臓器の機能を解明し、 それら機能と密接に関連した医薬 品開発に非常に重要な手段を提供することとなる。
例えば、 生体の種々の器官では、 多くのホルモン、 ホルモン様物質、 神経伝達 物質あるいは生理活性物質による調節のもとで生理的な機能の調節が行なわれて いる。 特に、 生理活性物質は生体内の様々な部位に存在し、 それぞれに対応する レセプ夕一蛋白質を通してその生理機能の調節を行っている。 生体内には未だ未 知のホルモンゃ神経伝達物質その他の生理活性物質も多く、 それらのレセプ夕一 蛋白質の構造に関しても、 これまで報告されていないものが多い。 さらに、 既知 のレセプター蛋白質にいてもサブタイプが存在するかどうかについても分かって いないものが多い。
生体における複雑な機能を調節する物質と、 その特異的レセプター蛋白質との 関係を明らかにすることは、 医薬品開発に非常に重要な手段である。 また、 レセ プ夕一蛋白質に対するァゴニスト、アン夕ゴニストを効率よくスクリ一ニングし、 医薬品を開発するためには、 生体内で発現しているレセプ夕一蛋白質の遺伝子の 機能を解明し、 それらを適当な発現系で発現させることが必要であった。
近年、 生体内で発現している遺伝子を解析する手段として、 C D N Aの配列を ランダムに解析する研究が活発に行なわれており、 このようにして得られた c D N Aの断片配列が Expressed Sequence Tag ( E S T) としてデータベースに登録 され、 公開されている。 しかし、 多くの E S Tは配列情報のみであり、 その機能 を推定することは困難である。
従来、 G蛋白質共役型レセプターと生理活性物質 （即ち、 リガンド） との結合 を阻害する物質や、 結合して生理活性物質 （即ち、 リガンド） と同様なシグナル 伝達を引き起こす物質は、 これらレセプ夕一の特異的なアン夕ゴニストまたはァ ゴニストとして、 生体機能を調節する医薬品として活用されてきた。 従って、 こ のように生体内での生理発現において重要であるばかりでなく、 医薬品開発の標 的ともなりうる G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質を新規に見出し、その遺伝子（例 えば c D N A) をクローニングすることは、 新規 G蛋白質共役型レセプター蛋白 質の特異的リガンドゃ、 ァゴニスト、 アン夕ゴニストを見出す際に、 非常に重要 な手段となる。
しかし、 G蛋白質共役型レセプ夕一はその全てが見出されているわけではなく、 現時点でもなお、 未知の G蛋白質共役型レセプ夕一、 また対応するリガンドが同 定されていない、 いわゆるォーファンレセプ夕一が多数存在しており、 新たな G 蛋白質共役型レセプタ一の探索および機能解明が切望されている。
G蛋白質共役型レセプ夕一は、 そのシグナル伝達作用を指標とする、 新たな生 理活性物質 （即ち、 リガンド） の探索、 また該レセプ夕一に対するァゴニストま たはアン夕ゴニスト） の探索に有用である。 一方、 生理的なリガンドが見出され なくても、 該レセプ夕一の不活化実験 （ノックアウト動物） から該レセプ夕一の 生理作用を解析することにより、 該レセプタ一に対するァゴニストまたはアン夕 ゴニストを作製することも可能である。 これら該レセプターに対するリガンド、 ァゴニストまたはアン夕ゴニストなどは、 G蛋白質共役型レセプ夕一の機能不全 に関連する疾患の予防 Z治療薬や診断薬として活用することが期待できる。 さらにまた、 G蛋白質共役型レセプ夕一の遺伝子変異に基づく、 生体での該レ セプ夕一の機能の低下または昂進が、 何らかの疾患の原因となっている場合も多 い。 この場合には、 該レセプ夕一に対するアン夕ゴニストやァゴニストの投与だ けでなく、 該レセプタ一遺伝子の生体内 （またはある特定の臓器） への導入や、 該レセプター遺伝子に対するアンチセンス核酸の導入による、 遺伝子治療に応用 することもできる。 この場合には該レセプターの塩基配列は遺伝子上の欠失や変 異の有無を調べるために必要不可欠な情報であり、 該レセプ夕一の遺伝子は、 該 レセプ夕一の機能不全に関与する疾患の予防/治療薬や診断薬に応用することも できる。
本発明は、 上記のように有用な新規 G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質を提供す るものである。 即ち、 新規 G蛋白質共役型レセプター蛋白質， その部分ペプチド またはそれらの塩、 該 G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質またはその部分ペプチド をコードするポリヌクレオチド （D NA、 R N Aおよびそれらの誘導体） を含有 するポリヌクレオチド （D NA、 R NAおよびそれらの誘導体） 、 該ポリヌクレ ォチドを含有する組換えベクター、 該組換えベクターを保持する形質転換体、 該 G蛋白質共役型レセプタ一蛋白質またはその塩の製造法、 該 G蛋白質共役型レセ プ夕一蛋白質、 その部分ペプチドまたはそれらの塩に対する抗体、 該 G蛋白質共 役型レセプ夕一蛋白質の発現量を変化させる化合物、 該 G蛋白質共役型レセプ夕 一に対するリガンドの決定方法、 リガンドと該 G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質 との結合性を変化させる化合物 （アンタゴニスト、 ァゴニスト） またはその塩の スクリーニング方法、 該スクリーニング用キット、 該スクリーニング方法もしく はスクリーニングキットを用いて得られるリガンドと該 G蛋白質共役型レセプ夕 一蛋白質との結合性を変化させる化合物 （アン夕ゴニスト、 ァゴニスト） または その塩、 およびリガンドと該 G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質との結合性を変化 させる化合物 （アン夕ゴニスト、 ァゴニス卜） もしくは該 G蛋白質共役型レセプ 夕一蛋白質の発現量を変化させる化合物またはその塩を含有してなる医薬などを 提供する。 発明の開示
本発明者らは、 鋭意研究を重ねた結果、 degenerated PCR法によって作成した E S T情報に基づいて、 マウス陴臓由来およびヒト肺由来の新規な G蛋白質共役型 レセプタ一蛋白質をコードする c DNAを単離し、 その全塩基配列を解析するこ とに成功した。 そして、 この塩基配列をアミノ酸配列に翻訳したところ、 第 1〜 第 7膜貫通領域が疎水性プロット上で確認され、 これらの cDNAにコードされ る蛋白質が 7回膜貫通型の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質であることを確認し た。 本発明者らは、 これらの知見に基づいて、 さらに研究を重ねた結果、 本発明 を完成するに至った。
すなわち、 本発明は、
(1) 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有することを特徴とする G蛋白質共役型レセプター蛋白質または その塩、
(2) 実質的に同一のアミノ酸配列が配列番号： 5で表されるアミノ酸配列であ る上記 （1) 記載の蛋白質、
(3) 上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質の部分ペプチドまたは その塩、
(4) 上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質をコードする塩基配列 を有するポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
(5) DNAである上記 （4) 記載のポリヌクレオチド、
(6) 配列番号： 2または配列番号： 6で表される塩基配列を有する上記 （4) 記載のポリヌクレオチド、
(7) 上記 （4) 記載のポリヌクレオチドを含有する組換えべクタ一、
(8) 上記 （7) 記載の組換えベクターで形質転換させた形質転換体、 (9) 上記 （8) 記載の形質転換体を培養し、 上記 （1) 記載の G蛋白質共役型 レセプ夕一蛋白質を生成せしめることを特徴とする上記 （1) 記載の G蛋白質共 役型レセプター蛋白質またはその塩の製造法、
(10) 上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質もしくは上記 （3) 記載の部分べプチドまたはその塩に対する抗体、
(1 1) 上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質のシグナル伝達を不 活性化する中和抗体である上記 （10) 記載の抗体、
(12) 上記 （10) 記載の抗体を含有してなる診断薬、
(13) 上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくは上記 （3) 記載の部分ペプチドまたはその塩を用いることにより得られる上記 （1) 記載の
G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質またはその塩に対するリガンド、
(14) 上記 （13) 記載のリガンドを含有してなる医薬、
(15) 上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質もしくは上記 （3) 記載の部分ペプチドまたはその塩を用いることを特徴とする上記 （1) 記載の G 蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質またはその塩に対するリガンドの決定方法、
(16) 上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質もしくは上記 （3) 記載の部分べプチドまたはその塩を用いることを特徴とするリガンドと上記（ 1 ) 記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化 合物またはその塩のスクリーニング方法、
(17) 上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質もしくは上記 （3) 記載の部分べプチドまたはその塩を含有することを特徴とするリガンドと上記
( 1 ) 記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質またはその塩との結合性を変化さ せる化合物またはその塩のスクリーニング用キット、
(18) 上記 （16) 記載のスクリーニング方法または上記 （17) 記載のスク リ一ニング用キットを用いて得られる、 リガンドと上記 （1) 記載の G蛋白質共 役型レセプ夕一蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩、
(19) 上記 （16) 記載のスクリーニング方法または上記 （17) 記載のスク リーニング用キットを用いて得られる、 リガンドと上記 （1) 記載の G蛋白質共 役型レセプ夕一蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩 を含有してなる医薬、
(20) 上記 （4) 記載のポリヌクレオチドとハイストリンジェン卜な条件下で
(21) 上記 （4) 記載のポリヌクレオチドと相補的な塩基配列およびその一部 を含有してなるポリヌクレオチド、
(22) 上記 （4) 記載のポリヌクレオチドまたはその一部を用いることを特徴 とする上記 （1) 記載のレセプター蛋白質の mRN Αの定量方法、
(23) 上記 （10) 記載の抗体を用いることを特徴とする上記 （1) 記載のレ セプター蛋白質の定量方法、
(24) 上記 （22) または上記 （23) 記載の定量方法を用いることを特徴と する上記（1)記載の G蛋白質共役型レセプ夕一の機能が関連する疾患の診断剤、 (25) 上記 （22) または上記 （23) 記載の定量方法を用いることを特徴と する上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプ夕一の発現を変化させる （増強また は抑制させる） 化合物またはその塩のスクリーニング方法、 および、
(26) 上記 （25) 記載のスクリーニング方法を用いて得られる上記 （1) 記 載の G蛋白質共役型レセプ夕一の発現を変化させる化合物またはその塩などに関 する。
さらには、
(27) 蛋白質が、 ①配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列、 配列番号： 1で 表わされるアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜30個程度、 より好ましくは 1〜9偭程度、 さらに好ましくは 1〜5個） のアミノ酸が欠失し たアミノ酸配列、 ②配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列に 1または 2個以上 (好ましくは、 1〜30個程度、 より好ましくは 1〜10個程度、 さらに好まし くは 1〜5個） のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、 ③配列番号： 1で表わされ るアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜30個程度、 より好ま しくは 1〜10個程度、 さらに好ましくは 1〜5個） のアミノ酸が他のアミノ酸 で置換されたアミノ酸配列、 または④それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有 する蛋白質である上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質またはその
^nt、 (28) 上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質もしくはその塩また は上記 （3) 記載の部分ペプチドもしくはその塩と、 試験化合物とを接触させる ことを特徴とする上記 （15) 記載のリガンドの決定方法、
(29) リガンドが例えばアンギオテンシン、 ボンべシン、 カナピノイド、 コレ シストキニン、 グルタミン、 セロトニン、 メラ卜ニン、 ニューロペプチド Y、 ォ ピオイド、 プリン、 バソプレツシン、 ォキシトシン、 PACAP、 セクレチン、 グルカゴン、 カルシトニン、 アドレノメジュリン、 ソマトス夕チン、 GHRH、 CRF、 ACTH、 GRP、 PTH、 V I P (バソアクティブ インテスティナ ル ポリペプチド） 、 ソマトス夕チン、 ドーパミン、 モチリン、 アミリン、 ブラ ジキニン、 CGRP (カルシトニンジーンリレーティッドペプチド） 、 ロイコト リエン、 パンクレアスタチン、 プロスタグランジン、 トロンボキサン、 アデノシ ン、 アドレナリン、 αおよび i3—ケモカイン （chemokine) (例えば、 I L— 8、 GROa、 GRO]3、 GRO r , NAP - 2、 ENA - 78、 PF4、 I P 10、 GCP - 2、 MCP— 1、 HC 14、 MCP— 3、 卜 309、 ΜΙ Ρ 1 α、 M I P— 1 ]3、 RANTESなど） 、 エンドセリン、 ェンテロガストリン、 ヒス夕 ミン、 ニューロテンシン、 TRH、 パンクレアティックポリぺプ夕イド、 ガラニ ンまたは LPAである上記 （27) 記載のリガンドの決定方法、
(30) ( i ) 上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質もしくはその 塩または上記 （3) 記載の部分ペプチドもしくはその塩と、 リガンドとを接触さ せた場合と、 （ii) 上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質もしくは その塩または上記 （3) 記載の部分ペプチドもしくはその塩と、 リガンドおよび 試験化合物とを接触させた場合との比較を行なうことを特徴とする上記 （16) 記載のスクリーニング方法、
(31) ( i) 標識したリガンドを上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプ夕一 蛋白質もしくはその塩または上記 （3) 記載の部分ペプチドもしくはその塩に接 触させた場合と、 （ii) 標識したリガンドおよび試験化合物を上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその塩または上記 （3) 記載の部分べ プチドまたはその塩に接触させた場合における、 標識したリガンドの上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくはその塩または上記 （3) 記載の 部分べプチドもしくはその塩に対する結合量を測定し、 比較することを特徴とす るリガンドと上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質またはその塩と の結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
(32) ( i) 標識したリガンドを上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプ夕一 蛋白質を含有する細胞に接触させた場合と、 （ii) 標識したリガンドおよび試験 化合物を上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質を含有する細胞に接 触させた場合における、 標識したリガンドの該細胞に対する結合量を測定し、 比 較することを特徴とするリガンドと上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプター 蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリ一ニン グ方法、
(33) ( i) 標識したリガンドを上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプ夕一 蛋白質を含有する細胞の膜画分に接触させた場合と、 （U) 標識したリガンドぉ よび試験化合物を上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質を含有する 細胞の膜画分に接触させた場合における、 標識したリガンドの該細胞の膜画分に 対する結合量を測定し、 比較することを特徴とするリガンドと上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物ま たはその塩のスクリーニング方法、
(34) ( i) 標識したリガンドを上記 （8) 記載の形質転換体を培養すること によって該形質転換体の細胞膜に発現した G蛋白質共役型レセプター蛋白質に接 触させた場合と、 （ii) 標識したリガンドおよび試験化合物を上記 （8) 記載の 形質転換体を培養することによって該形質転換体の細胞膜に発現した G蛋白質共 役型レセプター蛋白質に接触させた塲合における、 標識したリガンドの該 G蛋白 質共役型レセプター蛋白質に対する結合量を測定し、 比較することを特徴とする リガンドと上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩との 結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
(35) ( i) 上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質またはその塩 を活性化する化合物を上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質を含有 する細胞に接触させた場合と、 （ii) 上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプ夕 —蛋白質またはその塩を活性化する化合物および試験化合物を上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質を含有する細胞に接触させた場合における、 G 蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質を介した細胞刺激活性を測定し、 比較することを 特徴とするリガンドと上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質または その塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、 (36) 上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質またはその塩を活性 化する化合物を上記 （8) 記載の形質転換体を培養することによって該形質転換 体の細胞膜に発現した G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質に接触させた場合と、 上 記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質またはその塩を活性化する化合 物および試験化合物を上記 （8) 記載の形質転換体を培養することによって該形 質転換体の細胞膜に発現した G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質に接触させた場合 における、 G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質を介する細胞刺激活性を測定し、 比 較することを特徴とするリガンドと上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプター 蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリ一ニン グ方法、
(37) 上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質を活性化する化合物 が、 アンギオテンシン、 ボンべシン、 カナピノイド、 コレシストキニン、 グル夕 ミン、 セロ卜ニン、 メラトニン、 ニューロペプチド Y、 ォピオイド、 プリン、 ノ ソプレツシン、 ォキシトシン、 PACAP、 セクレチン、 グルカゴン、 カルシト ニン、 アドレノメジュリン、 ソマトス夕チン、 GHRH、 CRF、 ACTH、 G RP、 PTH、 V I P (バソアクティブ インテスティナル ポリペプチド） 、 ソマトス夕チン、 ド一パミン、 モチリン、 アミリン、 ブラジキニン、 CGRP (力 ルシトニンジーンリレーティッドペプチド） 、 ロイコ卜リエン、 パンクレアス夕 チン、 プロスタグランジン、 トロンボキサン、 アデノシン、 アドレナリン、 ひお よび /3—ケモカイン （chemokine) (例えば、 I L— 8、 GROa, GRO)3、 G R〇7、 NAP- 2, ENA - 78、 PF4、 I P 10、 GCP_2、 MCP - 1、 HC 14、 MCP- 3, 1—309、 ΜΙ Ρ 1 α、 M I P— 1 /3、 RANT ESなど） 、 エンドセリン、 ェンテロガストリン、 ヒスタミン、 ニューロテンシ ン、 TRH、 パンクレアティックポリぺプタイド、 ガラニンまたは LP Aである 上記 （34) または上記 （36) 記載のスクリーニング方法、 (38) 上記 （30) 〜 （37) 記載のスクリーニング方法で得られる、 リガン ドと上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質またはその塩との結合性 を変化させる化合物またはその塩、
(39) 上記 （30) 〜上記 （37) 記載のスクリーニング方法で得られる、 リ ガンドと上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質またはその塩との結 合性を変化させるの化合物またはその塩を含有することを特徴とする医薬、
(40) 上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質を含有する細胞を含 有することを特徴とする上記 （17) 記載のスクリーニング用キット、
(41) 上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質を含有する細胞の膜 画分を含有することを特徴とする上記 （17) 記載のスクリーニング用キット、
(42) 上記 （8) 記載の形質転換体を培養することによって該形質転換体の細 胞膜に発現した G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質を含有することを特徴とする上 記 （17) 記載のスクリーニング用キット、
(43) 上記 （40) 〜上記 （42) 記載のスクリーニング用キットを用いて得 られる、 リガンドと上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質またはそ の塩との結合性を変化させる化合物またはその塩、
(44) 上記 （40) 〜上記 （42) 記載のスクリーニング用キットを用いて得 られる、 リガンドと上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質またはそ の塩との結合性を変化させる化合物またはその塩を含有することを特徴とする医 薬、
(45) 上記 （10) 記載の抗体と、 上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプ夕 —蛋白質、 上記 （2) 記載の部分ペプチドまたはそれらの塩とを接触させること を特徴とする上記 （1) の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質、 上記 （3) 記載の 部分べプチドまたはそれらの塩の定量法、
(46) 上記 （10) 記載の抗体と、 被検波および標識化された上記 （1) 記載 の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質、 上記 （3) 記載の部分ペプチドまたはそれ らの塩とを競合的に反応させ、 該抗体に結合した標識化された上記 （1) 記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質もしくは上記 （3) 記載の部分ペプチドまたは その塩の割合を測定することを特徴とする被検液中の上記 （1) 記載の G蛋白質 共役型レセプ夕一蛋白質もしくは上記 （3) 記載の部分ペプチドまたはその塩の 定量法、 および
(47) 被検液と担体上に不溶化した上記 （10) 記載の抗体および標識化され た上記 （10) 記載の抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、 不溶化担 体上の標識剤の活性を測定することを特徴とする被検液中の上記 （1) 記載の G 蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質もしくは上記 （3) 記載の部分ペプチドまたはそ の塩の定量法などを提供する。 図面の簡単な説明
図 1は、 実施例 1で得られた本発明のマウス脾臓由来新規 G蛋白質共役型レセ プ夕一蛋白質 mAL 7 TO 24をコードする D N Aの塩基配列、 およびそれから 推定されるアミソ酸配列を示す （図 2に続く） 。
図 2は、 実施例 1で得られた本発明のマウス脾臓由来新規 G蛋白質共役型レセ プ夕一蛋白質 mAL 7T024をコードする DNAの塩基配列、 およびそれから 推定されるアミノ酸配列を示す （図 1の続き、 図 3に続く） 。
図 3は、 実施例 1で得られた本発明のマウス脾臓由来新規 G蛋白質共役型レセ プ夕ー蛋白質 mAL 7 T 024をコードする D N Aの塩基配列、 およびそれから 推定されるアミノ酸配列を示す （図 2の続き） 。
図 4は、 図 1〜図 3に示したアミノ酸配列をもとに作成した、 本発明のマウス 脾臓由来新規 G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質 mAL 7 TO 24の疎水性プロッ トを示す。
図 5は、 実施例 2で得られた本発明のヒ卜肺由来新規 G蛋白質共役型レセプ夕 一蛋白質 hAL 7T024をコードする DNAの塩基配列、 およびそれから推定 されるアミノ酸配列を示す （図 6に続く） 。
図 6は、 実施例 2で得られた本発明のヒト肺由来新規 G蛋白質共役型レセプ夕 —蛋白質 hAL 7 TO 24をコードする DNAの塩基配列、 およびそれから推定 されるアミノ酸配列を示す （図 5の続き、 図 6に続く） 。
図 7は、 実施例 2で得られた本発明のヒト肺由来新規 G蛋白質共役型レセプ夕 —蛋白質 hAL 7T 024をコードする DNAの塩基配列、 およびそれから推定 されるアミノ酸配列を示す （図 6の続き） 。
図 8は、 図 5〜図 7に示したアミノ酸配列をもとに作成した、 本発明のヒト肺 由来新規 G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質 h A L 7 T 0 2 4の疎水性プロッ卜を 示す。 発明を実施するための最良の形態
本発明の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質 （以下、 レセプ夕一蛋白質と略記す る場合がある） は、 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列 〔図 1〜図 3中のァ ミノ酸配列〕 と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するレセプ夕一 蛋白質である。
本発明のレセプ夕一蛋白質は、 例えば、 ヒトゃ哺乳動物 （例えば、 モルモット、 ラット、 マウス、 ゥサギ、 ブ夕、 ヒッジ、 ゥシ、 サルなど） のあらゆる細胞 （例 えば、 脾細胞、 神経細胞、 グリア細胞、 塍臓 /3細胞、 骨髄細胞、 メサンギゥム細 胞、 ランゲルハンス細胞、 表皮細胞、 上皮細胞、 内皮細胞、 繊維芽細胞、 繊維細 胞、 筋細胞、 脂肪細胞、 免疫細胞 （例、 マクロファージ、 T細胞、 B細胞、 ナチ ュラルキラー細胞、 肥満細胞、 好中球、 好塩基球、 好酸球、 単球） 、 巨核球、 滑 膜細胞、 軟骨細胞、 骨細胞、 骨芽細胞、 破骨細胞、 乳腺細胞、 肝細胞もしくは間 質細胞、 またはこれら細胞の前駆細胞、 幹細胞もしくはガン細胞など） や血球系 の細胞、 またはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、 例えば、 脳、 脳の各部位 (例、 嗅球、 扁頭核、 大脳基底球、 海馬、 視床、 視床下部、 視床下核、 大脳皮質、 延髄、 小脳、 後頭葉、 前頭葉、 側頭葉、 被殻、 尾状核、 脳染、 黒質） 、 脊髄、 下 垂体、 胃、 塍臓、 腎臓、 肝臓、 生殖腺、 甲状腺、 胆のう、 骨髄、 副腎、 皮膚、 筋 肉、 肺、 消化管 （例、 大腸、 小腸） 、 血管、 心臓、 胸腺、 脾臓、 顎下腺、 末梢血、 末梢血球、 前立腺、 睾丸、 精巣、 卵巣、 胎盤、 子宮、 骨、 関節、 骨格筋など （特 に、 脳や脳の各部位） に由来するタンパク質であってもよく、 また合成タンパク 質であってもよい。
配列番号： 1で表わされるァミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列として は、 例えば、 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と約 5 0 %以上、 好ましく は約 7 0 %以上、 より好ましくは約 8 0 %以上、 さらに好ましくは約 9 0 %以上、 最も好ましくは約 9 5 %以上の相同性を有するアミノ酸配列などがあげられる。 具体的には、 配列番号： 5で表されるアミノ酸配列 〔図 5〜図 7中のアミノ酸 配列〕 を含有するレセプ夕一蛋白質などがあげられる。
本発明の配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配 列を含有するタンパク質としては、 例えば、 配列番号： 1で表わされるアミノ酸 配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、 配列番号： 1で表わされるアミノ酸 配列と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ましい。
実質的に同質の活性としては、 例えば、 リガンド結合活性、 シグナル情報伝達 作用などがあげられる。 実質的に同質とは、 それらの活性が性質的に同質である ことを示す。 したがって、 リガンド結合活性やシグナル情報伝達作用などの活性 が同等 （例、 約 0 . 0 1〜1 0 0倍、 好ましくは約 0 . 5〜2 0倍、 より好まし くは約 0 . 5〜2倍） であることが好ましいが、 これらの活性の程度やタンパク 質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
リガンド結合活性やシグナル情報伝達作用などの活性の測定は、 自体公知の方 法に準じて行なうことができるが、 例えば、 後述するリガンドの決定方法ゃスク リ一ニング方法に従つて測定することができる。
また、 本発明のレセプ夕一蛋白質としては、 ①配列番号： 1で表わされるアミ ノ酸配列中の 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜3 0個程度、 より好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは 1〜5個） のアミノ酸が欠失したアミノ酸配 列、②配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列に 1または 2個以上（好ましくは、 1〜3 0個程度、 より好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは 1〜5個） のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、 ③配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列 中の 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜3 0個程度、 より好ましくは 1〜1 0 個程度、 さらに好ましくは 1〜5個） のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたァ ミノ酸配列、 または④それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有する蛋白質など もあげられる。
さらに、 本発明のレセプター蛋白質としては、 ①配列番号： 5で表わされるァ ミノ酸配列中の 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜3 0個程度、 より好ましく は 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは 1〜5個） のアミノ酸が欠失したアミノ酸 配列、 ②配列番号： 5で表わされるアミノ酸配列に 1または 2個以上 （好ましく は、 1〜3 0個程度、 より好ましくは 1〜 1 0個程度、 さらに好ましくは 1〜5 個） のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、 ③配列番号： 5で表わされるアミノ酸 配列中の 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜3 0個程度、 より好ましくは 1〜 1 0個程度、 さらに好ましくは 1〜 5個） のアミノ酸が他のアミノ酸で置換され たアミノ酸配列、 または④それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有する蛋白質 などがあげられる。
本明細書におけるレセプター蛋白質は、 ペプチド標記の慣例に従って左端が N 末端 （ァミノ末端） 、 右端が C末端 （カルボキシル末端） である。 配列番号： 1 で表わされるアミノ酸配列を含有するレセプ夕一蛋白質をはじめとする、 本発明 のレセプ夕一タンパク質は、 C末端が通常カルボキシル基 （一 C O OH) または カルポキシレート（一 C O O—) であるが、 C末端がアミド （一 C〇NH 2) また はエステル （― C O O R) であってもよい。
ここでエステルにおける Rとしては、 例えば、 メチル、 ェチル、 n—プロピル、 イソプロピルもしくは n—ブチルなどの アルキル基、 例えば、 シクロペン チル、 シクロへキシルなどの C 3 _ 8シクロアルキル基、 例えば、 フエニル、 α— ナフチルなどの C 6— 1 2ァリール基、 例えば、 ベンジル、 フエネチルなどのフエ二 ルー（^— 2アルキル基もしくは α—ナフチルメチルなどの α—ナフチル—C^ ^ アルキル基などの C 7— 1 4ァラルキル基のほ力 経口用エステルとして汎用される ピバ口ィルォキシメチルエステルなどが用いられる。
本発明のレセプ夕一蛋白質が C末端以外に力ルポキシル基 （またはカルボキシ レート） を有している場合、 カルボキシル基がアミド化またはエステル化されて いるものも本発明のレセプター蛋白質に含まれる。この場合のエステルとしては、 例えば上記した C末端のエステルなどが用いられる。
さらに、 本発明のレセブ夕一蛋白質には、 上記の蛋白質において、 N末端のメ チォニン残基のァミノ基が保護基 （例えば、 ホルミル基、 ァセチルなどの C 2— 6 アルカノィル基などの — 6ァシル基など） で保護されているもの、 N端側が生 体内で切断され生成したダル夕ミル基がピログルタミン酸化したもの、 分子内の アミノ酸の側鎖上の置換基 （例えば、 一 O H、 一 S H、 アミノ基、 イミダゾール 基、 インドール基、 グァニジノ基など） が適当な保護基 （例えば、 ホルミル基、 ァセチルなどの C 2— 6アルカノィル基などの Cェ _ 6ァシル基など）で保護されてい るもの、 あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖タンパク質などの複合タンパク質な ども含まれる。
本発明のレセプ夕一蛋白質の具体例としては、 例えば、 配列番号： 1で表わさ れるアミノ酸配列を含有するマウス由来のレセプ夕一蛋白質または配列番号： 5 で表されるアミノ酸配列を含有するヒト由来のレセプ夕一蛋白質などが用いられ る。
本発明のレセプ夕一蛋白質の部分ペプチド （以下、 部分ペプチドと略記する場 合がある） としては、 前記した本発明のレセプ夕一蛋白質の部分ペプチドであれ ば何れのものであってもよいが、例えば、本発明のレセプター蛋白質分子のうち、 細胞膜の外に露出している部位であって、 レセプ夕一結合活性を有するものなど が用いられる。
具体的には、 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列を有するレセプ夕一蛋白 質の部分ペプチドとしては、 〔図 4〕 で示される疎水性プロット解析において細 胞外領域 （親水性 （Hydroph i l i c) 部位） であると分析された部分を含むペプチド である。 さらに、 配列番号： 5で表されるアミノ酸配列を有するレセプ夕一蛋白 質の部分ペプチドとしては、 〔図 8〕 で示される疎水性プロット解析において細 胞外領域 （親水性 （Hydroph i l i c) 部位） であると分析された部分を含むペプチド である。 また、 疎水性 （Hydrophobi c) 部位を一部に含むペプチドも同様に用いる ことができる。 個々のドメインを個別に含むペプチドも用い得るが、 複数のドメ ィンを同時に含む部分のぺプチドでも良い。
本発明の部分ペプチドのアミノ酸の数は、 前記した本発明のレセプ夕一蛋白質 の構成アミノ酸配列のうち少なくとも 2 0個以上、 好ましくは 5 0個以上、 より 好ましくは 1 0 0個以上のアミノ酸配列を有するペプチドなどが好ましい。
実質的に同一のアミノ酸配列とは、 これらアミノ酸配列と約 7 0 %以上、 好ま しくは約 8 0 %以上、 より好ましくは約 9 0 %以上、 さらも好ましくは約 9 5 % 以上の相同性を有するアミノ酸配列を示す。
ここで、 「実質的に同質の活性」 とは、 前記と同意義を示す。 「実質的に同質 の活性」 の測定は前記と同様に行なうことができる。
また、 本発明の部分ペプチドは、 上記アミノ酸配列中の 1または 2個以上 （好 ましくは、 1〜10個程度、 さらに好ましくは 1〜5個） のアミノ酸が欠失し、 または、 そのアミノ酸配列に 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜20個程度、 より好ましくは 1〜10個程度、 さらに好ましくは 1〜5個） のアミノ酸が付加 し、 または、 そのアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜10個 程度、 より好ましくは 1〜5個） のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されていても よい。
また、 本発明の部分ペプチドは C末端が通常カルボキシル基 （一 COOH) ま たはカルボキシレート （一 COO— ) である力 前記した本発明のレセプター蛋白 質のごとく、 C末端がアミド （― CONH2) またはエステル （― COOR) であ つてもよい。
さらに、 本発明の部分ペプチドには、 前記した本発明のレセプ夕一蛋白質と同 様に、 N末端のメチォニン残基のァミノ基が保護基で保護されているもの、 N端 側が生体内で切断され生成した G 1 nがピログルタミン酸化したもの、 分子内の アミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、 あるいは糖鎖 が結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドなども含まれる。
また、 本発明の部分ペプチドは C末端が通常カルボキシル基 （一 COOH) ま たはカルポキシレート（一 COO—) であるが、 前記した本発明のタンパク質のご とく、 C末端がアミド （一 CONH2) またはエステル （一 COOR) であっても よい。
本発明のレセプ夕一蛋白質またはその部分ペプチドの塩としては、 とりわけ生 理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば無機酸（例 えば、 塩酸、 リン酸、 臭化水素酸、 硫酸） との塩、 あるいは有機酸 （例えば、 酢 酸、 ギ酸、 プロピオン酸、 フマル酸、 マレイン酸、 コハク酸、 酒石酸、 クェン酸、 リンゴ酸、 蓚酸、 安息香酸、 メタンスルホン酸、 ベンゼンスルホン酸） との塩な どが用いられる。
本発明のレセプター蛋白質またはその塩は、 前述したヒトゃ哺乳動物の細胞ま たは組織から自体公知のレセプター蛋白質の精製方法によって製造することもで きるし、 後述する本発明のレセプ夕一蛋白質をコードする D NAを含有する形質 転換体を培養することによつても製造することができる。 また、 後述のタンパク 質合成法またはこれに準じて製造することもできる。
ヒトゃ哺乳動物の組織または細胞から製造する場合、 ヒトゃ哺乳動物の組織ま たは細胞をホモジナイズした後、 酸などで抽出を行ない、 該抽出液を逆相クロマ トグラフィー、 イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み 合わせることにより精製単離することができる。
本発明のレセプ夕一蛋白質、 その部分ペプチドもしくはそれらの塩またはそれ らのアミド体の合成には、 通常市販のタンパク質合成用樹脂を用いることができ る。 そのような樹脂としては、 例えば、 クロロメチル樹脂、 ヒドロキシメチル樹 脂、 ベンズヒドリルァミン樹脂、 アミノメチル樹脂、 4一べンジルォキシベンジ ルアルコール樹脂、 4—メチルベンズヒドリルァミン樹脂、 P AM樹脂、 4—ヒ ドロキシメチルメチルフエニルァセトアミドメチル樹脂、 ポリアクリルアミド樹 脂、 4 - ( 2 ' , 4 '—ジメトキシフエ二ルーヒドロキシメチル） フエノキシ樹脂、 4一 ( 2 ' , 4 'ージメトキシフエニル一 F m o cアミノエチル） フエノキシ樹脂 などをあげることができる。 このような樹脂を用い、 α—ァミノ基と側鎖官能基 を適当に保護したアミノ酸を、 目的とするタンパク質の配列通りに、 自体公知の 各種縮合方法に従い、 樹脂上で縮合させる。 反応の最後に樹脂からタンパク質を 切り出すと同時に各種保護基を除去し、 さらに高希釈溶液中で分子内ジスルフィ ド結合形成反応を実施し、目的のタンパク質またはそれらのアミド体を取得する。 上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、 タンパク質合成に使用できる各種活 性化試薬を用いることができるが、 特に、 カルポジイミド類がよい。 カルポジィ ミド類としては、 D C C、 N, N' —ジイソプロピルカルポジイミド、 N—ェチル — N' _ ( 3—ジメチルァミノプロリル） カルポジイミドなどが用いられる。 これ らによる活性化にはラセミ化抑制添加剤 （例えば、 H〇B t、 HO O B t ) とと もに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するかまたは、 対称酸無水物または HO B t エステルあるいは HOO B tエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活性化を 行なった後に樹脂に添加することができる。
保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、 タンパク質 縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。 例えば、
N, N—ジメチルホルムアミド， N， N—ジメチルァセトアミド， N—メチルビ 口リドンなどの酸アミド類、 塩化メチレン， クロ口ホルムなどのハロゲン化炭化 水素類、 トリフルォロェ夕ノールなどのアルコール類、 ジメチルスルホキシドな どのスルホキシド類、 ピリジン， ジォキサン， テトラヒドロフランなどのエーテ ル類、 ァセトニトリル， プロピオ二卜リルなどの二トリル類、 酢酸メチル， 酢酸 ェチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。 反応 温度はタンパク質結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜 選択され、 通常約一 2 0 ° (：〜 5 0 °Cの範囲から適宜選択される。 活性化されたァ ミノ酸誘導体は通常 1 . 5〜 4倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテ ス卜の結果、 縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行うことなく縮合反応を繰 り返すことにより十分な縮合を行なうことができる。 反応を繰り返しても十分な 縮合が得られないときには、 無水酢酸またはァセチルイミダゾ一ルを用いて未反 応アミノ酸をァセチル化することができる。
原料のァミノ基の保護基としては、 例えば、 Z、 B o c、 夕一シャリ一ペンチ ルォキシカルポニル、 イソポルニルォキシカルポニル、 4ーメトキシベンジルォ キシカルポニル、 C 1 一 Z、 B r— Z、 ァダマンチルォキシカルボニル、 トリフ ルォロアセチル、 フタロイル、 ホルミル、 2—二トロフエニルスルフエニル、 ジ フエニルホスフィノチオイル、 F m o cなどが用いられる。
力ルポキシル基は、 例えば、 アルキルエステル化 （例えば、 メチル、 ェチル、 プロピル、 ブチル、 夕一シャリーブチル、 シクロペンチル、 シクロへキシル、 シ クロへプチル、 シクロォクチル、 2—ァダマンチルなどの直鎖状、 分枝状もしく は環状アルキルエステル化） 、 ァラルキルエステル化 （例えば、 ベンジルエステ ル、 4一二卜口べンジルエステル、 4—メ卜キシベンジルエステル、 4一クロ口 ベンジルエステル、 ベンズヒドリルエステル化） 、 フエナシルエステル化、 ベン ジルォキシカルボニルヒドラジド化、 夕一シャリーブトキシカルボニルヒドラジ ド化、 トリチルヒドラジド化などによつて保護することができる。
セリンの水酸基は、 例えば、 エステル化またはエーテル化によって保護するこ とができる。 このエステル化に適する基としては、 例えば、 ァセチル基などの低 級アルカノィル基、 ベンゾィル基などのァロイル基、 ベンジルォキシカルボニル 基、 エトキシカルボニル基などの炭酸から誘導される基などが用いられる。 また、 エーテル化に適する基としては、 例えば、 ベンジル基、 テトラヒドロビラニル基、 t一ブチル基などである。
チロシンのフエノール性水酸基の保護基としては、 例えば、 B z し C 12-B z l、 2—ニトロベンジル、 B r— Z、 夕ーシャリーブチルなどが用いられる。 ヒスチジンのイミダゾ一ルの保護基としては、 例えば、 To s、 4ーメトキシ —2， 3， 6—トリメチルベンゼンスルホニル、 DNP、 ベンジルォキシメチル、 Bum, Bo c、 T r t、 Fmo cなどが用いられる。
原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、 例えば、 対応する酸無水 物、 アジド、 活性エステル 〔アルコール （例えば、 ペン夕クロ口フエノール、 2， 4, 5—トリクロ口フエノール、 2， 4ージニトロフエノール、 シァノメチルァ ルコール、 パラニトロフエノール、 HONB、 N—ヒドロキシスクシミド、 N— ヒドロキシフ夕ルイミド、 HOB t) とのエステル〕 などが用いられる。 原料の ァミノ基の活性化されたものとしては、 例えば、 対応するリン酸アミドが用いら れる。
保護基の除去 （脱離） 方法としては、 例えば、 Pd—黒あるいは Pd—炭素な どの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、 また、 無水フッ化水素、 メタ ンスルホン酸、 トリフルォロメ夕ンスルホン酸、 トリフルォロ酢酸あるいはこれ らの混合液などによる酸処理や、 ジイソプロピルェチルァミン、 トリェチルアミ ン、 ピぺリジン、 ピぺラジンなどによる塩基処理、 また液体アンモニア中ナトリ ゥムによる還元なども用いられる。 上記酸処理による脱離反応は、 一般に約一 2 0で〜 40°Cの温度で行なわれるが、 酸処理においては、 例えば、 ァニソール、 フエノール、 チオアニソール、 メタクレゾール、 パラクレゾ一ル、 ジメチルスル フイ ド、 1, 4—ブタンジチオール、 1, 2 _エタンジチオールなどのような力 チオン捕捉剤の添加が有効である。 また、 ヒスチジンのイミダゾ一ル保護基とし て用いられる 2， 4—ジニトロフエニル基はチォフエノ一ル処理により除去され、 トリブトファンのインドール保護基として用いられるホルミル基は上記の 1 , 2 一エタンジチオール、 1， 4一ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱 保護以外に、 希水酸化ナトリウム溶液、 希アンモニアなどによるアルカリ処理に よっても除去される。
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護ならびに保護基、 およびその保護 基の脱離、 反応に関与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段から 適宜選択しうる。
タンパク質のアミド体を得る別の方法としては、 例えば、 まず、 カルボキシ末 端アミノ酸のひ—力ルポキシル基をアミド化して保護した後、 アミノ基側にぺプ チド （タンパク質） 鎖を所望の鎖長まで延ばした後、 該ペプチド鎖の N末端のひ ーァミノ基の保護基のみを除いたタンパク質と C末端のカルボキシル基の保護基 のみを除去したタンパク質とを製造し、 この両タンパク質を上記したような混合 溶媒中で縮合させる。 縮合反応の詳細については上記と同様である。 縮合により 得られた保護タンパク質を精製した後、上記方法によりすベての保護基を除去し、 所望の粗夕ンパク質を得ることができる。 この粗夕ンパク質は既知の各種精製手 段を駆使して精製し、 主要画分を凍結乾燥することで所望のタンパク質のアミド 体を得ることができる。
タンパク質のエステル体を得るには、 例えば、 カルボキシ末端アミノ酸のひ— カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、 タン パク質のアミド体と同様にして、 所望のタンパク質のエステル体を得ることがで さる。
本発明のレセプ夕一蛋白質の部分ペプチドまたはその塩は、 自体公知のぺプチ ドの合成法に従って、 あるいは本発明のレセプ夕一蛋白質を適当なぺプチダ一ゼ で切断することによって製造することができる。 ペプチドの合成法としては、 例 えば、 固相合成法、 液相合成法のいずれによっても良い。 すなわち、 本発明のレ セプター蛋白質を構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合 させ、 生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のぺプチ ドを製造することができる。 公知の縮合方法や保護基の脱離としては、 例えば、 以下の①〜⑤に記載された方法があげられる。
φ M. Bodanszkyおよび M. A. Ondet t i , ペプチド シンセシス （Pept i de Synthes i s) , I ntersc i ence Pub l i shers, New York (1966年) ② Schroeder および Luebke, ザペプチド（The Peptide), Academic Press, New York (1965年）
③泉屋信夫他、 ペプチド合成の基礎と実験、 丸善 (株） （1975年）
④矢島治明 および榊原俊平、 生化学実験講座 1、 タンパク質の化学 IV、 205、 (1977年）
⑤矢島治明監修、 続医薬品の開発 第 14巻 ペプチド合成広川書店
また、 反応後は通常の精製法、 たとえば、 溶媒抽出 ·蒸留 ·カラムクロマトグ ラフィ一 ·液体クロマトグラフィー ·再結晶などを組み合わせて本発明の部分べ プチドを精製単離することができる。 上記方法で得られる部分べプチドが遊離体 である場合は、 公知の方法によって適当な塩に変換することができるし、 逆に塩 で得られた場合は、 公知の方法によって遊離体に変換することができる。
本発明のレセプ夕一蛋白質をコードするポリヌクレオチドとしては、 前述した 本発明のレセプ夕一蛋白質をコードする塩基配列 （DNAまたはRNA、 好まし くは DNA) を含有するものであればいかなるものであってもよい。 該ポリヌク レオチドとしては、 本発明のレセプ夕一蛋白質をコードする DNA、 mRNA等 の RNAであり、 二本鎖であっても、 一本鎖であってもよい。 二本鎖の場合は、 二本鎖 DNA、 二本鎖 RNAまたは DNA： RNAのハイブリッドでもよい。 一 本鎖の場合は、 センス鎖 （即ち、 コード鎖） であっても、 アンチセンス鎖 （即ち、 非コード鎖） であってもよい。
本発明のレセプ夕一蛋白質をコードするポリヌクレオチドを用いて、 例えば、 公知の実験医学増刊 「新 PC Rとその応用」 1 5 (7) 、 1 997記載の方法ま たはそれに準じた方法により、 本発明のレセプ夕一蛋白質の mRNAを定量する ことができる。
本発明のレセプター蛋白質をコードする DNAとしては、 ゲノム DNA、 ゲノ ム DN Aライブラリ一、 前記した細胞'組織由来の cDNA、 前記した細胞'組 織由来の c DNAライブラリ一、 合成 DNAのいずれでもよい。 ライブラリ一に 使用するべクタ一は、 バクテリオファージ、 プラスミド、 コスミド、 ファージミ ドなどいずれであってもよい。 また、 前記した細胞 ·組織より total RNAまたは mRNA画分を調製したものを用いて直接 Reverse Transcriptase Polymerase Chain React ion (以下、 R T- P C R法と略称する） によって増幅することもでき る。
具体的には、本発明のレセプター蛋白質をコードする D NAとしては、例えば、 配列番号： 2または配列番号： 6で表わされる塩基配列を含有する D N A、 また は配列番号： 2または配列番号： 6で表わされる塩基配列とハイストリンジェン 卜な条件下でハイブリダィズする塩基配列を有し、 本発明のレセプター蛋白質と 実質的に同質の活性 （例、 リガンド結合活性、 シグナル情報伝達作用など） を有 するレセプター蛋白質をコ一ドする D N Aであれば何れのものでもよい。
配列番号： 2または配列番号： 6で表わされる塩基配列とハイブリダィズでき る D NAとしては、 例えば、 配列番号： 2または配列番号： 6で表わされる塩基 配列と約 7 0 %以上、 好ましくは約 8 0 %以上、 より好ましくは約 9 0 %以上、 最も好ましくは約 9 5 %以上の相同性を有する塩基配列を含有する D NAなどが 用いられる。
ハイブリダィゼーシヨンは、 自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、 例え ば、 モレキュラー ·クロ一ニング （Molecular Cloning) 2nd (J. Sambrook et al. , Cold Spr ing Harbor Lab. Press, 1989) に記載の方法などに従って行なうことが できる。 また、 市販のライブラリーを使用する場合、 添付の使用説明書に記載の 方法に従って行なうことができる。 より好ましくは、 ハイストリンジェン卜な条 件に従って行なうことができる。
該ハイストリンジェン卜な条件とは、 例えば、 ナトリウム濃度が約 1 9〜4 0 mM、 好ましくは約 1 9〜 2 0 mM、 温度が約 5 0〜 7 0 °C、 好ましくは約 6 0 〜6 5 の条件を示す。 特に、 ナトリウム濃度が約 1 9 mMで温度が約 6 5 の 場合が最も好ましい。
より具体的には、 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列を含有するレセプ夕 —蛋白質をコードする D NAとしては、 配列番号： 2で表わされる塩基配列を有 する D N Aなどが用いられる。 また、 配列番号： 5で表わされるアミノ酸配列を 含有するレセプ夕一蛋白質をコードする D NAとしては、 配列番号： 6で表わさ れる塩基配列を有する D N Aなどが用いられる。
本発明のレセプ夕一蛋白質をコードする D N Aの塩基配列の一部、 または該 D NAと相補的な塩基配列の一部を含有してなるポリヌクレオチドとは、 下記の本 発明の部分ペプチドをコードする D N Aを包含するだけではなく、 R NAをも包 含する意味で用いられる。
本発明に従えば、 G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質遺伝子の複製又は発現を阻 害することのできるアンチセンス 'ポリヌクレオチド （核酸） を、 クローン化し たあるいは決定された G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質をコードする D N Aの塩 基配列情報に基づき設計し、 合成しうる。 そうしたポリヌクレオチド （核酸） は、 G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質遺伝子の R N Aとハイブリダィズすることがで き、 該 R NAの合成又は機能を阻害することができるか、 あるいは G蛋白質共役 型レセプ夕一蛋白質関連 R N Aとの相互作用を介して G蛋白質共役型レセプ夕一 蛋白質遺伝子の発現を調節 ·制御することができる。 G蛋白質共役型レセプ夕一 蛋白質関連 R N Aの選択された配列に相補的なポリヌクレオチド、 及び G蛋白質 共役型レセプター蛋白質関連 R N Aと特異的にハイブリダィズすることができる ポリヌクレオチドは、 生体内及び生体外で G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質遺伝 子の発現を調節 '制御するのに有用であり、 また病気などの治療又は診断に有用 である。 用語 「対応する」 とは、 遺伝子を含めたヌクレオチド、 塩基配列又は核 酸の特定の配列に相同性を有するあるいは相補的であることを意味する。 ヌクレ ォチド、 塩基配列又は核酸とペプチド （蛋白質） との間で 「対応する」 とは、 ヌ クレオチド（核酸）の配列又はその相補体から誘導される指令にあるペプチド（蛋 白質） のアミノ酸を通常指している。 G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質遺伝子の 5 '端ヘアピンループ、 5 '端 6—ベースペア 'リピート、 5 '端非翻訳領域、 ポリ ペプチド翻訳開始コドン、 蛋白質コード領域、 〇R F翻訳開始コドン、 3 '端非翻 訳領域、 3 '端パリンドローム領域、 及び 3 '端ヘアピンループは好ましい対象領 域として選択しうるが、 G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質遺伝子内の如何なる領 域も対象として選択しうる。
目的核酸と、対象領域の少なくとも一部に相補的なポリヌクレオチドとの関係、 あるいは、 対象物とハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドとの関係 は 「アンチセンス」 であるということができる。 アンチセンス ·ポリヌクレオチ ドは、 2—デォキシ— D—リポースを含有しているポリデォキシリボヌクレオチ ド、 D—リポースを含有しているポリリポヌクレオチド、 プリン又はピリミジン 塩基の N—グリコシドであるその他のタイプのポリヌクレオチド、 あるいは非ヌ クレオチド骨格を有するその他のポリマー （例えば、 市販の蛋白質核酸及び合成 配列特異的な核酸ポリマー） 又は特殊な結合を含有するその他のポリマー（但し、 該ポリマーは D NAや R NA中に見出されるような塩基のペアリングや塩基の付 着を許容する配置をもつヌクレオチドを含有する） などがあげられる。それらは、 2本鎖 D NA、 1本鎖 D N A、 2本鎖 R NA、 1本鎖 R NA、 さらに D N A : R N Aハイブリッドであることができ、 さらに非修飾ポリヌクレオチド （又は非修 飾オリゴヌクレオチド） 、 さらには公知の修飾の付加されたもの、 例えば当該分 野で知られた標識のあるもの、 キャップの付いたもの、 メチル化されたもの、 1 個以上の天然のヌクレオチドを類縁物で置換したもの、 分子内ヌクレオチド修飾 のされたもの、 例えば非荷電結合 （例えば、 メチルホスホネ一ト、 ホスホトリエ ステル、 ホスホルアミデ一ト、 力ルバメートなど） を持つもの、 電荷を有する結 合又は硫黄含有結合 （例えば、 ホスホロチォェ一ト、 ホスホロジチォェ一トなど） を持つもの、 例えば蛋白質 （ヌクレア一ゼ、 ヌクレアーゼ ·インヒビ夕一、 トキ シン、 抗体、 シグナルペプチド、 ポリ一 L一リジンなど） や糖 （例えば、 モノサ ッカライドなど） などの側鎖基を有しているもの、 インターカレント化合物 （例 えば、 ァクリジン、 プソラレンなど） を持つもの、 キレート化合物 （例えば、 金 属、 放射活性をもつ金属、 ホウ素、 酸化性の金属など） を含有するもの、 アルキ ル化剤を含有するもの、 修飾された結合を持つもの （例えば、 αァノマー型の核 酸など） であってもよい。 ここで 「ヌクレオシド」 、 「ヌクレオチド」 及び 「核 酸」 とは、 プリン及びピリミジン塩基を含有するのみでなく、 修飾されたその他 の複素環型塩基をもつようなものを含んでいて良い。 こうした修飾物は、 メチル 化されたプリン及びピリミジン、 ァシル化されたプリン及びピリミジン、 あるい はその他の複素環を含むものであってよい。 修飾されたヌクレオチド及び修飾さ れたヌクレオチドはまた糖部分が修飾されていてよく、 例えば 1個以上の水酸基 がハロゲンとか、 脂肪族基などで置換されていたり、 あるいはエーテル、 ァミン などの官能基に変換されていてよい。
本発明のアンチセンス ·ポリヌクレオチド （核酸） は、 R NA、 D NA、 ある いは修飾された核酸 （R N A、 D N A) である。 修飾された核酸の具体例として は核酸の硫黄誘導体ゃチォホスフェート誘導体、 そしてポリヌクレオシドアミド やオリゴヌクレオシドアミドなどの分解抵抗性のものがあげられるが、 それに限 定されるものではない。 本発明のアンチセンス核酸は次のような方針で好ましく 設計されうる。すなわち、細胞内でのアンチセンス核酸をより安定なものにする、 アンチセンス核酸の細胞透過性をより高める、 目標とするセンス鎖に対する親和 性をより大きなものにする、 そしてもし毒性があるならアンチセンス核酸の毒性 をより小さなものにする。
こうして修飾は当該分野で数多く知られており。 例えば J. Kawakami e t al. , Pharm Tech Japan, Vo l. 8, pp. 247, 1992 ; Vo l. 8, pp. 395, 1992 ; S. T. Crooke e t al. ed. , Ant i sense Research and Appl i cat i ons, CRC Press, 1993 などに開 示がある。
本発明のアンチセンス核酸は、 変化せしめられたり、 修飾された糖、 塩基、 結 合を含有していて良く、 リボゾーム、 ミクロスフエアのような特殊な形態で供与 されたり、 遺伝子治療により適用されたり、 付加された形態で与えられることが できうる。 こうして付加形態で用いられるものとしては、 リン酸基骨格の電荷を 中和するように働くポリリジンのようなポリカチオン体、 細胞膜との相互作用を 高めたり、 核酸の取込みを増大せしめるような脂質 （例えば、 ホスホリッピド、 コレステロールなど） といった粗水性のものがあげられる。 付加するに好ましい 脂質としては、 コレステロールやその誘導体 （例えば、 コレステリルクロ口ホル メート、 コール酸など） があげられる。 こうしたものは、 核酸の 3 '端あるいは 5 '端に付着させることができ、 塩基、 糖、 分子内ヌクレオシド結合を介して付着さ せることができうる。 その他の基としては、 核酸の 3 '端あるいは 5 '端に特異的 に配置されたキャップ用の基で、 ェキソヌクレア一ゼ、 R N a s eなどのヌクレ ァ一ゼによる分解を阻止するためのものがあげられる。 こうしたキャップ用の基 としては、 ポリエチレングリコール、 テトラエチレングリコ一ルなどのグリコー ルをはじめとした当該分野で知られた水酸基の保護基があげられるが、 それに限 定されるものではない。
アンチセンス核酸の阻害活性は、 本発明の形質転換体、 本発明の生体内や生体 外の遺伝子発現系、 あるいは G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質の生体内や生体外 の翻訳系を用いて調べることができる。 該核酸それ自体公知の各種の方法で細胞 に適用できる。
本発明の部分ペプチドをコードする DNAとしては、 前述した本発明の部分べ プチドをコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよ レ^ また、 ゲノム DNA、 ゲノム DNAライブラリー、 前記した細胞 ·組織由来 の cDNA、 前記した細胞 ·組織由来の c DNAライブラリ一、 合成 DNAのい ずれでもよい。 ライブラリ一に使用するべクタ一は、 バクテリオファージ、 ブラ スミド、 コスミド、 ファージミドなどいずれであってもよい。 また、 前記した細 胞 ·組織より mRNA画分を調製したものを用いて直接 Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (以下、 RT- P C R法と略称する） によって増幅す ることもできる。
具体的には、本発明の部分ペプチドをコードする DN Aとしては、例えば、 （1) 配列番号： 2または配列番号： 6で表わされる塩基配列を有する DNAの部分塩 基配列を有する DNA、 または （2) 配列番号： 2または配列番号： 6で表わさ れる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイプリダイズする塩基配列を 有し、 本発明のレセプ夕一蛋白質ペプチドと実質的に同質の活性 （例、 リガンド 結合活性、 シグナル情報伝達作用など） を有するレセプ夕一蛋白質をコードする DN Aの部分塩基配列を有する DN Aなどが用いられる。
配列番号： 2または配列番号： 6で表わされる塩基配列ハイブリダィズできる DNAとしては、 例えば、 配列番号： 2または配列番号： 6で表わされる塩基配 列と約 70以上、 好ましくは約 80%以上、 より好ましくは約 90%以上、 最も 好ましくは約 95%以上の相同性を有する塩基配列を含有する DNAなどが用い られる。
本発明のレセプ夕一蛋白質またはその部分ペプチド （以下、 本発明のレセプタ 一蛋白質と略記することもある） を完全にコードする DNAのクローニングの手 段としては、 本発明のレセプ夕一蛋白質の部分塩基配列を有する合成 DNAブラ イマ一を用いて PC R法によって増幅するか、 または適当なベクタ一に組み込ん だ DN Aを本発明のレセプ夕一蛋白質の一部あるいは全領域をコードする DN A 断片もしくは合成 DN Aを用いて標識したものとのハイブリダィゼ一シヨンによ つて選別することができる。 ハイブリダィゼ一シヨンの方法は、 例えば、 モレキ ユラ—クロ一ニング (Molecular Cloning) 2nd (J. Sarabrook et al. , Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) に記載の方法などに従って行なうことができる。 また、 市販のライブラリーを使用する場合、 添付の使用説明書に記載の方法に従って行 なうことができる。
DNAの塩基配列の変換は、 公知のキット、 例えば、 Mu t anTM— G (宝酒 造 （株） ） 、 Mu t a n™-K (宝酒造 （株） ） などを用いて、 Gu p p e d d up 1 e
Figure imgf000029_0001
1法などの自体公知の方法あるいはそれらに準じる方 法に従って行なうことができる。
クローン化されたレセプ夕一蛋白質をコードする DN Aは目的によりそのまま、 または所望により制限酵素で消化したり、 リンカ一を付加したりして使用するこ とができる。該 D N Aはその 5 '末端側に翻訳開始コドンとしての ATGを有し、 また 3'末端側には翻訳終止コドンとしての TAA、 TG Aまたは TAGを有して いてもよい。 これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、 適当な合成 DNAァ ダプタ一を用いて付加することもできる。
本発明のレセプター蛋白質の発現ベクターは、 例えば、 （ィ） 本発明のレセプ 夕一蛋白質をコードする DNAから目的とする DNA断片を切り出し、 （口） 該 DN A断片を適当な発現べクタ一中のプロモーターの下流に連結することにより 製造することができる。
ベクタ一としては、 大腸菌由来のプラスミド （例、 pBR322， p BR 32 5， pUC 12, pUC 13) 、 枯草菌由来のプラスミド （例、 pUB 110, pTP 5, pC 194) 、 酵母由来プラスミド （例、 p SH 19, p SH 1 5) 、 λファージなどのバクテリオファージ、 レトロウイルス， ワクシニアウィルス， バキュロウィルスなどの動物ウィルスなどの他、 pAl— 1 1、 pXT l、 pR c/CMV, pRcZRSV、 p c DNA I ZN e oなどが用いられる。
本発明で用いられるプロモーターとしては、 遺伝子の発現に用いる宿主に対応 して適切なプロモ一夕一であればいかなるものでもよい。 例えば、 動物細胞を宿 主として用いる場合は、 SRaプロモ一夕一、 SV40プロモータ一、 LTRプ 口モーター、 CMVプロモータ一、 HSV-TKプロモーターなどがあげられる。 これらのうち、 CMVプロモーター、 S Rひプロモーターなどを用いるのが好 ましい。
宿主がェシエリヒア属菌である場合は、 t r pプロモー夕一、 l a cプロモ一 ター、 r e cAプロモ一夕一、 λ PLプロモーター、 1 p pプロモー夕一などが、 宿主がバチルス属菌である場合は、 SPOlプロモ一夕一、 SP02プロモー夕 ―、 p e n Pプロモーターなど、 宿主が酵母である場合は、 PH〇5プロモー夕 一、 PGKプロモーター、 GAPプロモ一夕一、 ADHプロモーターなどが好ま しい。 宿主が昆虫細胞である場合は、 ポリヘドリンプロモーター、 P 10プロモ —夕一などが好ましい。
発現ベクターには、 以上の要素の他に、 所望によりェンハンサ一、 スプライシ ングシグナル、 ポリ A付加シグナル、 選択マーカ一、 SV40複製オリジン （以 下、 S V40 o r iと略称する場合がある） などを含有しているものを用いるこ とができる。 選択マーカーとしては、 例えば、 ジヒドロ葉酸還元酵素 （以下、 d h f rと略称する場合がある） 遺伝子 〔メソトレキセ一ト （MTX) 耐性〕 、 ァ ンピシリン耐性遺伝子 （以下、 Amp rと略称する場合がある） 、 ネオマイシン耐 性遺伝子 （以下、 Ne oと略称する場合がある、 G418耐性） 等があげられる。 特に、 CH〇 （dh f r— ) 細胞を用いて dh f r遺伝子を選択マ一カーとして使 用する場合、 目的遺伝子をチミジンを含まない培地によっても選択できる。
また、 必要に応じて、 宿主に合ったシグナル配列を、 本発明のレセプター蛋白 質の N端末側に付加する。 宿主がェシエリヒア属菌である場合は、 Ph 0 A ·シ グナル配列、 〇mpA ·シグナル配列などが、 宿主がバチルス属菌である場合は、 α—アミラーゼ ·シグナル配列、 サブチリシン · シグナル配列などが、 宿主が酵 母である場合は、 MFo; ·シグナル配列、 SUC2 ·シグナル配列など、 宿主が 動物細胞である場合には、インシュリン ·シグナル配列、 α—イン夕一フエロン ' シグナル配列、 抗体分子 ·シグナル配列などがそれぞれ利用できる。
このようにして構築された本発明のレセプ夕一蛋白質をコードする DN Αを含 有するベクターを用いて、 形質転換体を製造することができる。
宿主としては、 例えば、 ェシエリヒア属菌、 バチルス属菌、 酵母、 昆虫細胞、 昆虫、 動物細胞などが用いられる。
ェシエリヒア属菌の具体例としては、 ェシエリヒア 'コリ （Escherichia col 0 K 12 · DH 1 〔プロシージングズ ·ォブ 'ザ'ナショナル ·アカデミー ·ォブ · サイェンシィズ 'ォブ ·ザ ·ュ一エスェ一 （Pro Natl. Acad. Sci. USA) ， 6 0巻， 160 (1968)〕 ， J M 103 〔ヌクイレック ·ァシッズ · リサーチ， (Nucleic Acids Research) , 9巻， 309 (1981)〕 ， J Α221 〔ジャー ナリレ ·ォブ ·モレキユラ—— · /ヾィォ口ジ—— (Journal of Molecular Biology) 〕 ， 120巻， 517 (1978)〕 ， HB 101 〔ジャーナル'ォブ 'モレキュラー · バイオロジー， 41卷， 459 (1969)〕 ， C 600 〔ジェネティックス
(Genetics) , 39卷， 440 ( 1954)〕 などが用いられる。
バチルス属菌としては、 例えば、 バチルス ·サチルス （Bacillus subtilis) M 1 114 〔ジーン， 24巻， 255 (1983)〕 ， 207 - 21 〔ジャーナル · ォブ 'バイオケミストリ一 （Journal of Biochemistry) , 95巻， 87 (198 4)〕 などが用いられる。
酵母としては、 例えば、 サッカロマイセス セレピシェ （Saccharomyces cerevisiae) AH 22， AH22R―， NA87 - 1 1 A, DKD— 5D, 20 B — 12、 シゾサッカロマイセス ボンべ （Schizosaccharomyces pombe) NCYC 1913, NCYC 2036, ピキア パストリス （Pichia pastoris) などが用 いられる。
昆虫細胞としては、 例えば、 ウィルスが Ac NPVの場合は、 夜盗蛾の幼虫由 来株化細胞 (Spodoptera frugiperda cell； S f細胞) 、 Trichoplusia ni の中 腸由来の MG1細胞、 Trichoplusiani の卵由来の HighFiveTM 細胞、 Mamestra brassicae 由来の細胞または Est igmena acrea 由来の細胞などが用いられる。 ゥ ィルスが BmNPVの場合は、 蚕由来株化細胞 （Bombyx mori N； BmN細胞） な どが用いられる。 該 S f細胞としては、 例えば、 S f 9細胞 （ATCC CRL1711) 、 S f 21細胞 （以上、 Vaughn, LL.ら、 イン ·ヴイボ （In Vivo) ， 13巻， 21 3 - 217 (1977) ) などが用いられる。
昆虫としては、 例えば、 カイコの幼虫などが用いられる 〔前田ら、 ネイチヤー (Nature) , 31 5巻， 592 (1985)〕 。 動物細胞としては、 例えば、 サル細胞 COS— 7、 Ve r o、 チャイニーズハ ムス夕一細胞 CHO (以下、 CHO細胞と略記） 、 dh ί r遺伝子欠損チヤィニ ーズハムスター細胞 CHO (以下、 CHO (dh ί r— ) 細胞と略記） 、 マウス L 細胞、 マウス A tT—20、 マウスミエ口一マ細胞、 ラット GH3、 ヒト FL細 胞などが用いられる。
ェシエリヒア属菌を形質転換するには、例えば、 プロシージングズ ·ォブ 'ザ · ナショナル 'アカデミー'ォブ 'サイェンジィズ 'ォブ ·ザ'ュ一エスェ一 （Proc. Natl. Acad. Sci. USA) , 69巻， 21 10 (1972)やジーン （Gene) ， 17 巻， 107 (1982)などに記載の方法に従って行なうことができる。
バチルス属菌を形質転換するには、 例えば、 モレキュラー .アンド ·ジエネラ ル ·ジェネティックス （Molecular & General Genetics) , 168巻， 1 1 1 (1 979)などに記載の方法に従って行なうことができる。
酵母を形質転換するには、例えば、 メッソズ 'イン ·Χンザィモロジ一（Methods inEnzymology) , 194巻， 182— 187 ( 1991 ) 、 プロシ一ジングズ' ォブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー *ォブ ·サイェンシィズ ·ォブ ·ザ ·ユーェ スエー （Pro Natl. Acad. Sci. USA) , 75卷， 1929 (1978) などに記 載の方法に従って行なうことができる。
昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、 例えば、 バイオ /テクノロジ一 (Bio/Technology) ， 6巻， 47— 55 (1988) ) などに記載の方法に従つ て行なうことができる。
動物細胞を形質転換するには、 例えば、 細胞工学別冊 8新細胞工学実験プロト コール. 263— 267 (1995) (秀潤社発行） 、 ヴイロロジ一 （Virology) ， 52巻， 456 (1973)に記載の方法に従って行なうことができる。
このようにして、 G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質をコードする DNAを含有 する発現べクタ一で形質転換された形質転換体が得られる。
宿主がェシエリヒア属菌、 バチルス属菌である形質転換体を培養する際、 培養 に使用される培地としては液体培地が適当であり、 その中には該形質転換体の生 育に必要な炭素源、 窒素源、 無機物その他が含有せしめられる。 炭素源としては、 例えば、 グルコース、 デキストリン、 可溶性澱粉、 ショ糖など、 窒素源としては、 例えば、 アンモニゥム塩類、 硝酸塩類、 コーンスチープ · リカ一、 ペプトン、 力 ゼイン、 肉エキス、 大豆粕、 バレイショ抽出液などの無機または有機物質、 無機 物としては、 例えば、 塩化カルシウム、 リン酸二水素ナトリウム、 塩化マグネシ ゥムなどがあげられる。 また、 酵母、 ビタミン類、 生長促進因子などを添加して もよい。 培地の pHは約 5〜 8が望ましい。
ェシエリヒア属菌を培養する際の培地としては、 例えば、 グルコース、 カザミ ノ酸を含む M 9培地〔ミラ一 （Miller) , ジャーナル ·ォブ ·ェクスペリメンッ · Λン ·モレキュラー ·シェ不ティックス (Journal of Experiments in Molecular Genetics) , 43 1 -433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972] が好ましい。 ここに必要によりプロモー夕一を効率よく働かせるために、例えば、 3 /3—インドリル アクリル酸のような薬剤を加えることができる。 宿主がェ シェリヒア属菌の場合、 培養は通常約 1 5〜 43 °Cで約 3〜 24時間行ない、 必 要により、 通気や撹拌を加えることもできる。
宿主がバチルス属菌の場合、 培養は通常約 30〜 40 °Cで約 6〜 24時間行な い、 必要により通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、 培地としては、 例えば、 バークホ 一ルダー （Burkholder) 最小培地 〔Bostian， K. L. ら、 「プロシージングズ *ォ ブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンシィズ ·ォブ ·ザ ·ュ一エス ェ一 （Proc. Natl. Acad. Sci. USA) , 77卷， 4505 (1980)〕 や 0. 5% カザミノ酸を含有する SD培地 〔Bitter, G. A. ら、 「プロシ一ジングズ ·ォブ- ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンシィズ ·ォブ ·ザ ·ュ一エスエー (Proc. Natl. Acad. Sci. USA) ， 8 1卷， 5330 (1984) 〕 があげられ る。培地の pHは約 5〜8に調整するのが好ましい。培養は通常約 20°C〜35°C で約 24〜72時間行ない、 必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、 培地としては、
Grace's Insect Medium (Grace, T. C.C. ,ネィチヤ一 (Nature) , 195, 788 (1962)) に非動化した 10%ゥシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。 培 地の pHは約 6. 2〜6. 4に調整するのが好ましい。 培養は通常約 27°Cで約 3〜 5日間行ない、 必要に応じて通気や撹拌を加える。 宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、 培地としては、 例えば、 約 5 〜20 %の胎児牛血清を含む MEM培地 〔サイエンス （Science) ， 122巻， 5 01 (1952)〕 ， DMEM培地 〔ヴイロロジー （Virology) , 8巻， 396 (1 959)〕 ， RPM I 1640培地 〔ジャーナル ·ォブ ·ザ ·ァメリカン 'メデ ィカル-アソシエーション (The Journal of the American Medical Association) 199巻， 519 (1967)〕 ， 199培地 〔プロシ一ジング ·ォブ ·ザ ·ソサ イエティ ·フォー'ザ 'バイオロジカル'メディスン （Proceedingof the Society for the Biological Medicine) , 7.3巻， 1 ( 1950)〕 などが用いられる。 Hは約 6〜8であるのが好ましい。 培養は通常約 30°C〜40°Cで約 15〜60 時間行ない、 必要に応じて通気や撹拌を加える。
以上のようにして、 形質転換体の細胞膜に本発明の G蛋白質共役型レセプ夕一 蛋白質を生成せしめることができる。
上記培養物から本発明のレセプター蛋白質を分離精製するには、 例えば、 下記 の方法により行なうことができる。
本発明のレセプター蛋白質を培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、 培養後、 公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、 これを適当な緩衝液に懸濁し、 超音波、 リゾチームおよび/または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破 壊したのち、 遠心分離やろ過によりレセプタ一蛋白質の粗抽出液を得る方法など が適宜用いられる。 緩衝液の中に尿素や塩酸グァニジンなどの蛋白質変性剤や、 トリトン X— 100™などの界面活性剤が含まれていてもよい。 培養液中にレセ プター蛋白質が分泌される場合には、 培養終了後、 それ自体公知の方法で菌体ぁ るいは細胞と上清とを分離し、 上清を集める。
このようにして得られた培養上清、 あるいは抽出液中に含まれるレセプ夕一蛋 白質の精製は、 自体公知の分離 ·精製法を適切に組み合わせて行なうことができ る。 これらの公知の分離、 精製法としては、 塩析ゃ溶媒沈澱法などの溶解度を利 用する方法、 透析法、 限外ろ過法、 ゲルろ過法、 および SDS—ポリアクリルァ ミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、 イオン交換クロ マトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、 ァフィ二ティ一クロマトグラフ ィーなどの特異的親和性を利用する方法、 逆相高速液体クロマトグラフィーなど の疎水性の差を利用する方法、 等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方 法などが用いられる。
かくして得られるレセプター蛋白質が遊離体で得られた場合には、 自体公知の 方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、 逆に塩で得ら れた場合には自体公知の方法あるいはそれに準じる方法により、 遊離体または他 の塩に変換することができる。
なお、 組換え体が産生するレセプ夕一蛋白質を、 精製前または精製後に適当な 蛋白修飾酵素を作用させることにより、 任意に修飾を加えたり、 ポリペプチドを 部分的に除去することもできる。 蛋白修飾酵素としては、 例えば、 トリプシン、 キモトリブシン、 アルギニルエンドべプチダ一ゼ、 プロテインキナーゼ、 グリコ シダーゼなどが用いられる。
かくして生成する本発明のレセプ夕一蛋白質またはその塩の活性は、 標識した リガンドとの結合実験および特異抗体を用いたェンザィムィムノアッセィなどに より測定することができる。
本発明のレセプ夕一蛋白質、 その部分ペプチドまたはそれらの塩に対する抗体 は、 本発明のレセプ夕一蛋白質、 その部分ペプチドまたはそれらの塩を認識し得 る抗体であれば、 ポリクロ一ナル抗体、 モノクローナル抗体の何れであってもよ い。
本発明のレセプ夕一蛋白質、 その部分ペプチドまたはそれらの塩 （以下、 本発 明のレセプ夕一蛋白質等と略記する） に対する抗体は、 本発明のレセプ夕一蛋白 質等を抗原として用い、 自体公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造する ことができる。
〔モノクローナル抗体の作製〕
( a ) モノクロナール抗体産生細胞の作製
本発明のレセプター蛋白質等は、 哺乳動物に対して投与により抗体産生が可能 な部位にそれ自体あるいは担体、 希釈剤とともに投与される。 投与に際して抗体 産生能を高めるため、 完全フロイントアジュバントゃ不完全フロイントアジュバ ントを投与してもよい。 投与は通常 2〜 6週毎に 1回ずつ、 計 2〜 1 0回程度行 なわれる。 用いられる哺乳動物としては、 例えば、 サル、 ゥサギ、 ィヌ、 モルモ ット、 マウス、 ラット、 ヒッジ、 ャギがあげられるが、 マウスおよびラットが好 ましく用いられる。
モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、 抗原を免疫された温血動物、 例えば、 マウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の 2〜 5日後に脾 臓またはリンパ節を採取し、 それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合 させることにより、 モノクローナル抗体産生ハイプリドーマを調製することがで きる。 抗血清中の抗体価の測定は、 例えば、 後記の標識化レセプ夕一蛋白質等と 抗血清とを反応させたのち、 抗体に結合した標識剤の活性を測定することにより 行なうことができる。 融合操作は既知の方法、 例えば、 ケーラ一とミルスタイン の方法 〔ネイチヤー （Nature), 256巻、 495頁 （1975年） 〕 に従い実施 することができる。 融合促進剤としては、 例えば、 ポリエチレングリコール （P EG)やセンダイウィルスなどがあげられる力 好ましくは PEGが用いられる。 骨髄腫細胞としては、 例えば、 NS— 1、 P 3U1、 SP 2/0などがあげら れるが、 P 3U 1が好ましく用いられる。 用いられる抗体産生細胞 （脾臓細胞） 数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は 1 ： 1〜20 ： 1程度であり、 PEG (好 ましくは、 PEG1000〜PEG6000) が 10〜 80 %程度の濃度で添加 され、 約 20〜 40 °C、 好ましくは約 30〜 37 °Cで約 1〜 10分間ィンキュベ ートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。
モノクローナル抗体産生ハイプリドーマのスクリーニングには種々の方法が使 用できるが、 例えば、 レセプ夕一蛋白質等抗原を直接あるいは担体とともに吸着 させた固相 （例、 マイクロプレート） にハイプリドーマ培養上清を添加し、 次に 放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロプリン抗体 （細胞融合に用いられる 細胞がマウスの場合、 抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる） またはプロテ イン Aを加え、 固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、 抗免疫グロ ブリン抗体またはプロテイン Aを吸着させた固相にハイプリドーマ培養上清を添 加し、 放射性物質や酵素などで標識したレセプ夕一蛋白質等を加え、 固相に結合 したモノクローナル抗体を検出する方法などがあげられる。
モノクローナル抗体の選別は、 自体公知あるいはそれに準じる方法に従って行 なうことができるが、 通常は HAT (ヒポキサンチン、 アミノプテリン、 チミジ ン） を添加した動物細胞用培地などで行なうことができる。 選別および育種用培 地としては、 ハイプリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても 良い。 例えば、 1〜2 0 %、 好ましくは 1 0〜2 0 %の牛胎児血清を含む R P M I 1 6 4 0培地、 1〜1 0 %の牛胎児血清を含む G I T培地 (和光純薬工業 (株)） またはハイプリドーマ培養用無血清培地 （S F M— 1 0 1、 日水製薬 （株） ） な どを用いることができる。 培養温度は、 通常 2 0〜4 0 °C、 好ましくは約 3 7 °C である。 培養時間は、 通常 5日〜 3週間、 好ましくは 1週間〜 2週間である。 培 養は、 通常 5 %炭酸ガス下で行なうことができる。 ハイブリド一マ培養上清の抗 体価は、 上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。
( b ) モノクロナ一ル抗体の精製
モノクローナル抗体の分離精製は、 通常のポリクローナル抗体の分離精製と同 様に免疫グロブリンの分離精製法 〔例、 塩析法、 アルコール沈殿法、 等電点沈殿 法、 電気泳動法、 イオン交換体 （例、 D E A E ) による吸脱着法、 超遠心法、 ゲ ルろ過法、 抗原結合固相またはプロティン Aあるいはプロティン Gなどの活性吸 着剤により抗体のみを採取し、 結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕 に従 つて行なうことができる。
〔ポリクローナル抗体の作製〕
本発明のポリクローナル抗体は、 それ自体公知あるいはそれに準じる方法にし たがって製造することができる。 例えば、 免疫抗原 （レセプ夕ー蛋白質等抗原） とキャリアー蛋白質との複合体をつくり、 上記のモノクローナル抗体の製造法と 同様に哺乳動物に免疫を行ない、 該免疫動物から本発明のレセプ夕一蛋白質等に 対する抗体含有物を採取して、 抗体の分離精製を行なうことにより製造できる。 哺乳動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリアー蛋白質との複合体 に関し、 キャリアー蛋白質の種類およびキャリアーとハプテンとの混合比は、 キ ャリア一に架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれば、 どの 様なものをどの様な比率で架橋させてもよいが、 例えば、 ゥシ血清アルブミン、 ゥシサイログロブリン、 キーホール · リンぺット ·へモシァニン等を重量比でハ プテン 1に対し、 約 0. 1〜2 0、好ましくは約 1〜 5の割合でカプルさせる方法 が用いられる。 また、 ハプテンとキャリアーの力プリングには、 種々の縮合剤を用いることが できるが、 ダルタルアルデヒドやカルポジイミド、 マレイミド活性エステル、 チ オール基、 ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。 縮合生成物は、 哺乳動物に対して、 抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは 担体、 希釈剤とともに投与される。 投与に際して抗体産生能を高めるため、 完全 フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。 投 与は、 通常約 2〜 6週毎に 1回ずつ、 計約 3〜 1 0回程度行なうことができる。 ポリクロ一ナル抗体は、 上記の方法で免疫された哺乳動物の血液、 腹水など、 好ましくは血液から採取することができる。
抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、 上記の血清中の抗体価の測定と同 様にして測定できる。 ボリクロ一ナル抗体の分離精製は、 上記のモノクローナル 抗体の分離精製と同様の免疫グロプリンの分離精製法に従って行なうことができ る。
本発明のレセプ夕一蛋白質、 その部分ペプチドまたはそれらの塩、 およびそれ らをコードする D NAは、 （1 )本発明のレセプ夕一蛋白質に対するリガンド（ァ ゴニスト） の決定、 （2 ) 本発明の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質の機能不全 に関連する疾患の予防および Zまたは治療剤、 （3 ) 遺伝子診断剤、 （4 ) 本発 明の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質に対するリガンドの定量、 （5 ) 本発明の G蛋白質共役型レセプター蛋白質とリガンドとの結合性を変化させる化合物 （ァ ゴニスト、 アン夕ゴニストなど） のスクリーニング、 （6 ) 本発明の G蛋白質共 役型レセプ夕一蛋白質とリガンドとの結合性を変化させる化合物 （ァゴ二スト、 アン夕ゴニス卜） を含有する各種疾病の予防および/または治療剤、 （7 ) 本発 明のレセプター蛋白質、 その部分ペプチドまたはそれらの塩の定量、 （8 ) 本発 明のレセプタ一蛋白質、 その部分ペプチドまたはそれらの塩に対する抗体による 中和、 （9 ) 本発明の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質をコードする D NAを有 する非ヒト動物の作製などに用いることができる。
特に、 本発明の組換え型 G蛋白質共役型レセプター蛋白質の発現系を用いたレ セプター結合アツセィ系を用いることによって、 ヒトゃ哺乳動物に特異的な G蛋 白質共役型レセプターに対するリガンドの結合性を変化させる化合物 （例、 ァゴ 二スト、 アン夕ゴニストなど） をスクリーニングすることができ、 該ァゴ二スト またはアン夕ゴニストを各種疾病の予防 ·治療剤などとして使用することができ る。
本発明のレセプ夕一蛋白質、 部分ペプチドまたはそれらの塩 （以下、 本発明の レセプ夕一蛋白質等と略記する場合がある） 、 本発明のレセプ夕一蛋白質または その部分ペプチドをコードする DN A (以下、 本発明の DNAと略記する場合が ある） および本発明のレセプ夕一蛋白質等に対する抗体 （以下、 本発明の抗体と 略記する場合がある） の用途について、 以下に具体的に説明する。
(1)本発明の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質に対するリガンド （ァゴ二スト） の決定
本発明のレセプ夕一蛋白質もしくはその塩または本発明の部分べプチドもしく はその塩は、 本発明のレセプ夕一蛋白質またはその塩に対するリガンド （ァゴ二 スト） を探索し、 または決定するための試薬として有用である。
すなわち、 本発明は、 本発明のレセプ夕一蛋白質もしくはその塩または本発明 の部分ペプチドもしくはその塩と、 試験化合物とを接触させることを特徴とする 本発明のレセプ夕一蛋白質に対するリガンドの決定方法を提供する。
試験化合物としては、 公知のリガンド （例えば、 アンギオテンシン、 ボンべシ ン、 カナピノイド、 コレシストキニン、 グルタミン、 セロトニン、 メラトニン、 ニューロペプチド Y、 ォピオイド、 プリン、 バソプレツシン、 ォキシトシン、 Ρ ACAP、 セクレチン、 グルカゴン、 カルシ卜ニン、 アドレノメジュリン、 ソマ トス夕チン、 GHRH、 CRF、 ACTH、 GRP、 PTH、 V I P (バソァク ティブ インテスティナル ポリペプチド） 、 ソマトス夕チン、 ド一パミン、 モ チリン、 アミリン、 ブラジキニン、 CGRP (カルシトニンジーンリレーテイツ ドペプチド） 、 ロイコトリェン、 パンクレアスタチン、 プロスタグランジン、 ト ロンポキサン、 アデノシン、 アドレナリン、 αおよび /3—ケモカイン（chemokine) (例えば、 I L— 8、 GROひ、 GROi3、 GROァ、 NAP— 2、 ENA- 7 8、 PF4、 I P 10、 GCP_2、 MCP— 1、 HC 14、 MCP_3、 I - 309、 MI P 1ひ、 MI P— 1 /3、 RANTESなど） 、 エンドセリン、 ェン テロガストリン、 ヒスタミン、 ニューロテンシン、 TRH、 パンクレアティック ポリぺプ夕イド、 ガラニンまたは L P Aなどの他に、 例えば、 ヒトまたは哺乳動 物 （例えば、 マウス、 ラット、 ブ夕、 ゥシ、 ヒッジ、 サルなど） の組織抽出物、 細胞培養上清などが用いられる。 例えば、 該組織抽出物、 細胞培養上清などを本 発明のレセプ夕一蛋白質に添加し、 細胞刺激活性などを測定しながら分画し、 最 終的に単一のリガンドを得ることができる。
具体的には、 本発明のリガンド決定方法は、 本発明のレセプター蛋白質、 その 部分ペプチドもしくはそれらの塩を用いるか、 または組換え型レセプ夕一蛋白質 の発現系を構築し、 該発現系を用いたレセプ夕一結合アツセィ系を用いることに よって、 本発明のレセプ夕一蛋白質に結合して細胞刺激活性 （例えば、 ァラキド ン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 C a 2 +遊離、 細胞内 c AM P生成、 細胞 内 c GM P生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリ ン酸化、 c一 f o s活性化、 p Hの低下などを促進する活性または抑制する活性） を有する化合物 （例えば、 ペプチド、 蛋白質、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物など） またはその塩を決定する方法である。
本発明のリガンド決定方法においては、 本発明のレセプ夕一蛋白質またはその 部分ペプチドと試験化合物とを接触させた場合の、 例えば、 該レセプター蛋白質 または該部分べプチドに対する試験化合物の結合量や、 細胞刺激活性などを測定 することを特徴とする。
より具体的には、 本発明は、 ①標識した試験化合物を、 本発明のレセプ夕ー蛋 白質もしくはその塩または本発明の部分べプチドもしくはその塩に接触させた場 合における、 標識した試験化合物の該蛋白質もしくはその塩、 または該部分ぺプ チドもしくはその塩に対する結合量を測定することを特徴とする本発明のレセプ 夕一蛋白質またはその塩に対するリガンドの決定方法、
②標識した試験化合物を、 本発明のレセプ夕一蛋白質を含有する細胞または該細 胞の膜画分に接触させた場合における、 標識した試験化合物の該細胞または該膜 画分に対する結合量を測定することを特徴とする本発明のレセプ夕一蛋白質また はその塩に対するリガンドの決定方法、
③標識した試験化合物を、 本発明のレセプター蛋白質をコードする D N Aを含有 する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現したレセプ夕一蛋白質に 接触させた場合における、 標識した試験化合物の該レセプ夕ー蛋白質またはその 塩に対する結合量を測定しすることを特徴とする本発明のレセプ夕一蛋白質に対 するリガンドの決定方法、
④試験化合物を、 本発明のレセプ夕一蛋白質を含有する細胞に接触させた場合に おける、 レセプ夕一蛋白質を介した細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 C a 2 +遊離、 細胞内 c AM P生成、 細胞内 c GM P 生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 c - f o sの活性化、 p Hの低下などを促進する活性または抑制する活性など） を 測定することを特徴とする本発明のレセプ夕一蛋白質またはその塩に対するリガ ンドの決定方法、 および
⑤試験化合物を、 本発明のレセプ夕一蛋白質をコードする D N Aを含有する形質 転換体を培養することによって細胞膜上に発現したレセプター蛋白質に接触させ た場合における、 レセプ夕一蛋白質を介する細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン 酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 C a 2 +遊離、 細胞内 c AM P生成、 細胞内 c GM P生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン 酸化、 c— f o sの活性化、 p Hの低下などを促進する活性または抑制する活性 など） を測定することを特徴とする本発明のレセプ夕一蛋白質またはその塩に対 するリガンドの決定方法を提供する。
特に、 上記①〜③の試験を行ない、 試験化合物が本発明のレセプ夕一蛋白質に 結合することを確認した後に、 上記④〜⑤の試験を行なうことが好ましい。
まず、 リガンド決定方法に用いるレセプター蛋白質としては、 前記した本発明 のレセプタ一蛋白質または本発明の部分ペプチドを含有するものであれば何れの ものであってもよいが、 動物細胞を用いて大量発現させたレセプ夕一蛋白質が適 している。
本発明のレセプ夕一蛋白質を製造するには、 前述の発現方法が用いられるが、 該レセプター蛋白質をコードする D N Aを哺乳動物細胞や昆虫細胞で発現するこ とにより行なうことが好ましい。 目的とする蛋白質部分をコードする D N A断片 には、 通常、 c D NAが用いられるが、 必ずしもこれに制約されるものではない。 例えば、 遺伝子断片や合成 D NAを用いてもよい。 本発明のレセプ夕一蛋白質を コードする DNA断片を宿主動物細胞に導入し、 それらを効率よく発現させるた めには、 該 DN A断片を昆虫を宿主とするバキュロウィルスに属する核多角体病 ウィルス （nuclear polyhedrosis virus； NPV) のポリヘドリンプロモータ一、 SV40由来のプロモーター、 レトロウイルスのプロモーター、 メタロチォネィ ンプロモータ一、 ヒトヒートショックプロモータ一、 サイトメガロウィルスプロ モ一夕一、 S R αプロモーターなどの下流に組み込むのが好ましい。 発現したレ セプ夕一の量と質の検査はそれ自体公知の方法で行うことができる。 例えば、 文 献〔Nambi,P. ら、ザ ·ジャーナル ·ォブ ·バイオロジカル ·ケミストリー（J. Biol. Chem. ) , 267巻， 19555〜 19559頁， 1992年〕 に記載の方法に従 つて行うことができる。
したがって、本発明のリガンド決定方法において、本発明のレセプター蛋白質、 その部分ペプチドまたはそれらの塩を含有するものとしては、 それ自体公知の方 法に従って精製したレセプター蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩で あってもよいし、 該レセプター蛋白質を含有する細胞またはその細胞膜画分を用 いてもよい。
本発明のリガンド決定方法において、 本発明のレセプ夕一蛋白質を含有する細 胞を用いる場合、 該細胞をダルタルアルデヒド、 ホルマリンなどで固定化しても よい。 固定化方法はそれ自体公知の方法に従って行なうことができる。
本発明のレセプター蛋白質を含有する細胞としては、 本発明のレセプ夕一蛋白 質を発現した宿主細胞をいうが、 該宿主細胞としては、 大腸菌、 枯草菌、 酵母、 昆虫細胞、 動物細胞などが用いられる。
細胞膜画分としては、 細胞を破砕した後、 それ自体公知の方法で得られる細胞 膜が多く含まれる画分のことをいう。 細胞の破砕方法としては、 Po t t e r— E 1 V e h j em型ホモジナイザーで細胞を押し潰す方法、 ヮ一リングプレンダ 一やポリトロン （Kinematica社製） による破碎、 超音波による破砕、 フレンチプ レスなどで加圧しながら細胞を細いノズルから噴出させることによる破砕などが あげられる。 細胞膜の分画には、 分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法などの遠 心力による分画法が主として用いられる。 例えば、 細胞破砕液を低速 （500 r pm〜3000 r pm) で短時間 （通常、 約 1分〜 10分） 遠心し、 上清をさら に高速 （15000 r pm〜30000 r pm) で通常 30分〜 2時間遠心し、 得られる沈澱を膜画分とする。 該膜画分中には、 発現したレセプ夕一蛋白質と細 胞由来のリン脂質や膜蛋白質などの膜成分が多く含まれる。
該レセプター蛋白質を含有する細胞やその膜画分中のレセプター蛋白質の量は、 1細胞当たり 103〜108分子であるのが好ましく、 105〜107分子であるの が好適である。 なお、 発現量が多いほど膜画分当たりのリガンド結合活性 （比活 性） が高くなり、 高感度なスクリーニング系の構築が可能になるばかりでなく、 同一ロットで大量の試料を測定できるようになる。
本発明のレセプ夕一蛋白質またはその塩に対するリガンドを決定する前記の① 〜③の方法を実施するためには、 適当なレセプ夕一蛋白質画分と、 標識した試験 化合物が用いられる。
レセプ夕一蛋白質画分としては、 天然型のレセプ夕一蛋白質画分か、 またはそ れと同等の活性を有する組換え型レセプ夕一画分などが望ましい。 ここで、 同等 の活性とは、 同等のリガンド結合活性、 シグナル情報伝達作用などを示す。
標識した試験化合物としては、 〔3H〕 、 〔125 I〕 、 〔14C〕 、 〔35S〕 など で標識したアンギオテンシン、 ボンべシン、 カナピノイド、 コレシストキニン、 グルタミン、 セロトニン、 メラ卜ニン、 ニューロペプチド Y、 ォピオイド、 プリ ン、 バソプレツシン、 ォキシトシン、 PACAP、 セクレチン、 グルカゴン、 力 ルシトニン、 アドレノメジュリン、 ソマトス夕チン、 GHRH、 CRF、 ACT H、 GRP、 PTH、 V I P (バソアクティブ インテスティナル ポリべプチ ド） 、 ソマトス夕チン、 ドーパミン、 モチリン、 アミリン、 ブラジキニン、 CG RP (カルシトニンジーンリレーティッドペプチド） 、 ロイコトリェン、 パンク レアスタチン、 プロスタグランジン、 トロンポキサン、 アデノシン、 アドレナリ ン、 αおよび /3—ケモカイン （chemokine) (例えば、 I L一 8、 G R 0 α GR 0/3、 GROr > NAP- 2, ENA— 78、 PF4、 I P 10、 GCP— 2、 MCP - 1、 HC 14、 MCP - 3、 1—309、 ΜΙ Ρ 1 α、 ΜΙ Ρ_ 1 /3、 RANTESなど） 、 エンドセリン、 ェンテロガス卜リン、 ヒスタミン、 ニュー 口テンシン、 TRH、 パンクレアティックポリぺプ夕イド、 ガラニンまたは LP Aなどが好適である。 具体的には、 本発明のレセプ夕一蛋白質またはその塩に対するリガンドの決定 方法を行なうには、 まず本発明のレセプ夕一蛋白質を含有する細胞または細胞の 膜画分を、 決定方法に適したバッファーに懸濁することによりレセプター標品を 調製する。 バッファーには、 pH4〜10 (望ましくは pH6〜8) のリン酸バ ッファー、 トリス—塩酸バッファ一などのリガンドとレセプ夕一蛋白質との結合 を阻害しないバッファーであればいずれでもよい。 また、 非特異的結合を低減さ せる目的で、 CHAPS、 Twe e n- 80™ (花王一アトラス社） 、 ジギトニ ン、 デォキシコレートなどの界面活性剤ゃゥシ血清アルブミンやゼラチンなどの 各種蛋白質をバッファーに加えることもできる。 さらに、 プロテア一ゼによるリ セプ夕一やリガンドの分解を抑える目的で PMS F、 ロイぺプチン、 E— 64 (ぺ プチド研究所製） 、 ぺプス夕チンなどのプロテアーゼ阻害剤を添加することもで きる。 0. 0 lm 1〜 10mlの該レセプター溶液に、 一定量 （5000 c pm〜 500000 c pm) の 〔3H〕 、 〔125 I〕 、 〔14C〕 、 〔35S〕 などで標識し た試験化合物を共存させる。 非特異的結合量 （NSB) を知るために大過剰の未 標識の試験化合物を加えた反応チューブも用意する。 反応は約 0°Cから 50°C、 望ましくは約 4°Cから 37°Cで、 約 20分から 24時間、 望ましくは約 30分か ら 3時間行なう。 反応後、 ガラス繊維濾紙等で濾過し、 適量の同バッファーで洗 浄した後、 ガラス繊維濾紙に残存する放射活性を液体シンチレーシヨンカウンタ —あるいはァ一カウンターで計測する。 全結合量 （B) から非特異的結合量 （N SB) を引いたカウント （B— NSB) が 0 c pmを越える試験化合物を本発明 のレセプ夕一蛋白質またはその塩に対するリガンド （ァゴ二スト） として選択す ることができる。
本発明のレセプター蛋白質またはその塩に対するリガンドを決定する前記の④ 〜⑤の方法を実施するためには、 該レセプター蛋白質を介する細胞刺激活性 （例 えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 Ca2+遊離、 細胞内 cA MP生成、 細胞内 c GMP生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細 胞内蛋白質のリン酸化、 c一 f 0 sの活性化、 pHの低下などを促進する活性ま たは抑制する活性など） を公知の方法または市販の測定用キットを用いて測定す ることができる。 具体的には、 まず、 レセプ夕一蛋白質を含有する細胞をマルチ ゥエルプレート等に培養する。 リガンド決定を行なうにあたっては前もって新鮮 な培地あるいは細胞に毒性を示さない適当なバッファーに交換し、 試験化合物な どを添加して一定時間ィンキュベ一トした後、 細胞を抽出あるいは上清液を回収 して、 生成した産物をそれぞれの方法に従って定量する。 細胞刺激活性の指標と する物質 （例えば、 ァラキドン酸など） の生成が、 細胞が含有する分解酵素によ つて検定困難な場合は、 該分解酵素に対する阻害剤を添加してアツセィを行なつ てもよい。 また、 cAMP産生抑制などの活性については、 フォルスコリンなど で細胞の基礎的産生量を増大させておいた細胞に対する産生抑制作用として検出 することができる。
本発明のレセプ夕一蛋白質またはその塩に結合するリガンド決定用キットは、 本発明のレセプ夕一蛋白質もしくはその塩、 本発明の部分べプチドもしくはその 塩、 本発明のレセプ夕一蛋白質を含有する細胞、 または本発明のレセプ夕一蛋白 質を含有する細胞の膜画分などを含有するものである。
本発明のリガンド決定用キットの例としては、 次のものがあげられる。
1. リガンド決定用試薬
①測定用緩衝液および洗浄用緩衝液
Hanks' Balanced Salt Solution (ギブコ社製） に、 0. 05%のゥシ血清アル ブミン （シグマ社製） を加えたもの。
孔径 0.45 mのフィルターで濾過滅菌し、 4°Cで保存するか、 あるいは用時 調製しても良い。
② G蛋白質共役型レセプター蛋白質標品
本発明のレセプ夕一蛋白質を発現させた CHO細胞を、 12穴プレートに 5 X 105個 穴で継代し、 37°C、 5%C〇2、 95%a i rで 2日間培養したもの
③標識試験化合物
市販の 〔3H〕 、 〔125 I〕 、 〔14C〕 、 〔35S〕 などで標識した化合物、 また は適当な方法で標識化したもの
水溶液の状態のものを 4°Cあるいは一 2 にて保存し、 用時に測定用緩衝液 にて 1 Mに希釈する。 水に難溶性を示す試験化合物については、 ジメチルホル ムアミド、 DMSO、 メタノール等に溶解する。 ④非標識試験化合物
標識化合物と同じものを 100〜1000倍濃い濃度に調製する。
2. 測定法
① 12穴組織培養用プレートにて培養した本発明のレセプ夕ー蛋白質発現 C H〇 細胞を、 測定用緩衝液 1 m 1で 2回洗浄した後、 490 X 1の測定用緩衝液を各 穴に加える。
②標識試験化合物を 5 1加え、 室温にて 1時間反応させる。 非特異的結合量を 知るためには非標識試験化合物を 5 1加えておく。
③反応液を除去し、 1 m 1の洗浄用緩衝液で 3回洗浄する。 細胞に結合した標識 試験化合物を 0.2 N NaOH— 1 %SDSで溶解し、 4m 1の液体シンチレ一 ター A (和光純薬製） と混合する。
④液体シンチレーシヨンカウン夕一 （ベックマン社製） を用いて放射活性を測定 する。
本発明のレセプ夕一蛋白質またはその塩に結合することができるリガンドとし ては、 例えば、 脳、 下垂体、 滕臓などに特異的に存在する物質などがあげられ、 具体的には、 アンギオテンシン、 ボンべシン、 カナピノイド、 コレシストキニン、 グルタミン、 セロトニン、 メラトニン、 ニューロペプチド Y、 ォピオイド、 プリ ン、 バソプレツシン、 ォキシトシン、 PACAP、 セクレチン、 グルカゴン、 力 ルシトニン、 アドレノメジュリン、 ソマトス夕チン、 GHRH、 CRF、 ACT H、 GRP、 PTH、 V I P (バソアクティブ インテスティナル ポリべプチ ド） 、 ソマトス夕チン、 ドーパミン、 モチリン、 アミリン、 ブラジキニン、 CG RP (カルシトニンジーンリレ一ティッドペプチド） 、 ロイコトリェン、 パンク レアスタチン、 プロスタグランジン、 トロンポキサン、 アデノシン、 アドレナリ ン、 αおよび i3—ケモカイン （chemokine) (例えば、 I L— 8、 GROa、 GR 0/3、 GR〇了、 NAP— 2、 ENA— 78、 PF4、 I P 10、 GCP_2、 MCP— 1、 HC 14、 MCP_3、 1—309、 ΜΙ Ρ 1 α、 MI P_ 1 )S、 RANTESなど） 、 エンドセリン、 ェンテロガストリン、 ヒスタミン、 ニュー 口テンシン、 TRH、 パンクレアティックポリぺプ夕イド、 ガラニン、 LP Aな どが用いられる。 より具体的には LP A (lysop osphatidic acid) である。 ( 2 ) 本発明の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質の機能不全に関連する疾患の予 防および/または治療剤
上記 （1 ) の方法において、 本発明のレセプター蛋白質に対するリガンドが明 らかになれば、 該リガンドが有する作用に応じて、 ①本発明のレセプ夕一蛋白質 または②該レセプ夕一蛋白質をコードする D N Aを、 本発明のレセプ夕一蛋白質 の機能不全に関連する疾患の予防および Zまたは治療剤などの医薬として使用す ることができる。
例えば、 生体内において本発明のレセプター蛋白質が減少しているためにリガ ンドの生理作用が期待できない （該レセプ夕一蛋白質の欠乏症） 患者がいる場合 に、 ①本発明のレセプ夕一蛋白質を該患者に投与し該レセプ夕一蛋白質の量を補 充したり、 ② （ィ） 本発明のレセプ夕一蛋白質をコードする D N Aを該患者に投 与し発現させることによって、 あるいは （口） 対象となる細胞に本発明のレセプ タ一蛋白質をコードする D NAを挿入し発現させた後に、 該細胞を該患者に移植 することなどによって、 患者の体内におけるレセプ夕一蛋白質の量を増加させ、 リガンドの作用を充分に発揮させることができる。 したがって、 本発明のレセプ ター蛋白質をコードする D NAは、 安全で低毒性な本発明のレセプタ一蛋白質の 機能不全に関連する疾患の予防および Zまたは治療剤などの医薬として有用であ る。
本発明のレセプ夕一蛋白質は、 G蛋白共役型レセプ夕一蛋白質である E D G— 2受容体にアミノ酸配列レベルで約 5 0 %の相同性が認められる。
本発明のレセプ夕一蛋白質は中枢疾患 (例えばアルツハイマー病、痴呆、摂食障 害など)、炎症性疾患 (例えばアレルギー、喘息、 リュウマチなど）、循環器疾患 (例 えば高血圧症、 心肥大、 狭心症、 動脈硬化症等）、 癌 （例えば非小細胞肺癌、 卵巣 癌、 前立腺癌、 胃癌、 膀胱癌、 乳癌、 子宮頸部癌、 結腸癌、 直腸癌等） 、 糖尿病 などの予防および/または治療に有用である。
本発明のレセプ夕一蛋白質を上記予防 ·治療剤として使用する場合は、 常套手 段に従つて製剤化することができる。
一方、 本発明のレセプター蛋白質をコードする D N A (以下、 本発明の D N A と略記する場合がある） を上記予防 ·治療剤として使用する場合は、 本発明の D NAを単独あるいはレトロウイルスベクタ一、 アデノウイルスベクター、 アデノ ウィルスァソシェ一テッドウィルスベクタ一などの適当なベクターに揷入した後、 常套手段に従って実施することができる。 本発明の D NAは、 そのままで、 ある いは摂取促進のための補助剤とともに、 遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのよ うなカテーテルによって投与できる。
例えば、 ①本発明のレセプ夕一蛋白質または②該レセプ夕一蛋白質をコードす る D NAは、 必要に応じて糖衣を施した錠剤、 カプセル剤、 エリキシル剤、 マイ クロ力プセル剤などとして経口的に、. あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許 容し得る液との無菌性溶液、 または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用 できる。 例えば、 ①本発明のレセプター蛋白質または②該レセプ夕一蛋白質をコ ードする D NAを生理学的に認められる公知の担体、 香味剤、 賦形剤、 べヒクル、 防腐剤、 安定剤、 結合剤などとともに一般に認められた製剤製造に要求される単 位用量形態で混和することによって製造することができる。 これら製剤における 有効成分量は指示された範囲の適当な用量が得られるようにするものである。 錠剤、 カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、 例えばゼラチ ン、 コーンスターチ、 トラガント、 アラビアゴムのような結合剤、 結晶性セル口 —スのような賦形剤、 コーンスターチ、 ゼラチン、 アルギン酸などのような膨化 剤、 ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、 ショ糖、 乳糖またはサッカリン のような甘味剤、 ペパーミント、 ァカモノ油またはチェリ一のような香味剤など が用いられる。 調剤単位形態がカプセルである場合には、 前記タイプの材料にさ らに油脂のような液状担体を含有することができる。 注射のための無菌組成物は 注射用水のようなべヒクル中の活性物質、 胡麻油、 椰子油などのような天然産出 植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤製造法に従って処方するこ とができる。 注射用の水性液としては、 例えば、 生理食塩水、 ブドウ糖やその他 の補助薬を含む等張液 （例えば、 D—ソルビトール、 D—マンニトール、 塩化ナ トリウムなど） などが用いられ、 適当な溶解補助剤、 例えば、 アルコール （例、 エタノール） 、 ポリアルコール （例、 プロピレングリコール、 ポリエチレンダリ コール） 、 非イオン性界面活性剤 （例、 ポリソルベート 8 0 (TM) 、 H C O - 5 0 ) などと併用してもよい。 油性液としては、 例えば、 ゴマ油、 大豆油などが 用いられ、 溶解補助剤である安息香酸ベンジル、 ベンジルアルコールなどと併用 してもよい。
また、 上記予防 ·治療剤は、 例えば、 緩衝剤 （例えば、 リン酸塩緩衝液、 酢酸 ナトリウム緩衝液） 、 無痛化剤 （例えば、 塩化ベンザルコニゥム、 塩酸プロカイ ンなど） 、 安定剤 （例えば、 ヒ卜血清アルブミン、 ポリエチレングリコールなど） 、 保存剤 （例えば、 ベンジルアルコール、 フエノールなど） 、 酸化防止剤などと配 合してもよい。 調製された注射液は通常、 適当なアンプルに充填される。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトゃ哺乳 動物 （例えば、 ラット、 マウス、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サ ルなど） に対して投与することができる。
本発明のレセプ夕一蛋白質の投与量は、 投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法 などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、動脈硬化症患者（6 Okgとして） においては、 一日につき約 0. lmg〜l'00mg、 好ましくは約 1. 0〜50mg、 より好ましくは約 1. 0〜20mgである。 非経口的に投与 する場合は、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などによつ ても異なるが、 例えば、 注射剤の形では通常例えば、 動脈硬化症患者 （60 kg として） においては、 一日につき約 0. 01〜30mg程度、 好ましくは約 0. l〜20mg程度、 より好ましくは約 0. 1〜1 Omg程度を静脈注射により投 与するのが好都合である。 他の動物の場合も、 60 k g当たりに換算した量を投 与することができる。
本発明の DN Aの投与量は、 投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などにより 差異はあるが、 経口投与の場合、 一般的に例えば、 動脈硬化症患者 （60 kgと して） においては、 一日につき約 0. lmg〜l 0 Omg、 好ましくは約 1. 0〜 5 Omg, より好ましくは約 1. 0〜20mgである。 非経口的に投与する場合 は、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などによっても異な るが、 例えば、 注射剤の形では通常例えば、 動脈硬化症患者 （6 O kgとして） においては、 一日につき約 0. 01〜3 Omg程度、 好ましくは約 0. 1〜20 mg程度、 より好ましくは約 0. 1〜 1 Omg程度を静脈注射により投与するの が好都合である。 他の動物の場合も、 6 O kg当たりに換算した量を投与するこ とができる。
(3) 遺伝子診断剤
本発明の DN Aは、 プローブとして使用することにより、 ヒトまたは哺乳動物 (例えば、 ラット、 マウス、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルな ど） における本発明のレセプ夕一蛋白質またはその部分ペプチドをコードする D N Aまたは mRNAの異常 （遺伝子異常） を検出することができるので、 例えば、 該 DNAまたは mRNAの損傷、 突然変異あるいは発現低下や、 該 DNAまたは mRNAの増加あるいは発現過多などの遺伝子診断剤として有用である。
本発明の DNAを用いる上記の遺伝子診断は、 例えば、 自体公知のノーザン八 イブリダィゼーシヨンや PCR— S SCP法 （ゲノミックス （Genomics) , 第 5 巻， 874〜 879頁 （1989年） 、 プロシージングズ ·ォブ .ザ ·ナショナ ル 'アカデミー'ォブ 'サイェンシィズ 'ォブ 'ユーエスェ一（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America) ， 第 86巻， 2766〜 2770頁 （1989年） ） などにより実施することができる。
(4) 本発明の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質に対するリガンドの定量法 本発明のレセプタ一蛋白質等は、 リガンドに対して結合性を有しているので、 生体内におけるリガンド濃度を感度良く定量することができる。
本発明の定量法は、 例えば、 競合法と組み合わせることによって用いることが できる。 すなわち、 被検体を本発明のレセプ夕一蛋白質等と接触させることによ つて被検体中のリガンド濃度を測定することができる。 具体的には、 例えば、 以 下の①または②などに記載の方法あるいはそれに準じる方法に従って用いること ができる。
①入江寛編 「ラジオイムノアツセィ」 （講談社、 昭和 49年発行）
②入江寛編 「続ラジオィムノアツセィ」 （講談社、 昭和 54年発行）
(5) 本発明の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質とリガンドとの結合性を変化さ せる化合物 （ァゴ二スト、 アン夕ゴニス卜など） のスクリーニング方法
本発明のレセプ夕一蛋白質等を用いるか、 または組換え型レセプ夕一蛋白質等 の発現系を構築し、 該発現系を用いたレセプ夕一結合アツセィ系を用いることに よって、 リガンドと本発明のレセプ夕一蛋白質等との結合性を変化させる化合物 (例えば、 ペプチド、 蛋白質、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物な ど） またはその塩を効率よくスクリーニングすることができる。
このような化合物には、 （ィ） G蛋白質共役型レセプ夕一を介して細胞刺激活 性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 C a 2 +遊離、 細胞 内 c AM P生成、 細胞内 c GM P生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位変 動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 c一 f o sの活性化、 p Hの低下などを促進する 活性または抑制する活性など） を有する化合物 （いわゆる、 本発明のレセプ夕一 蛋白質に対するァゴニスト） 、 （口） 該細胞刺激活性を有しない化合物 （いわゆ る、 本発明のレセプ夕一蛋白質に対するアン夕ゴニスト） 、 （八） リガンドと本 発明の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質との結合力を増強する化合物、 あるいは (二） リガンドと本発明の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質との結合力を減少さ せる化合物などが含まれる （なお、 上記 （ィ） の化合物は、 前記したリガンド決 定方法によってスクリーニングすることが好ましい） 。
すなわち、 本発明は、 （ i ) 本発明のレセプター蛋白質もしくはその部分ぺプ チドまたはその塩と、 リガンドとを接触させた場合と （i i) 本発明のレセプ夕一 蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩と、 リガンドおよび試験化合物と を接触させた場合との比較を行なうことを特徴とするリガンドと本発明のレセプ ター蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩との結合性を変化させる化合 物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
本発明のスクリーニング方法においては、 （ i ) と （i i) の場合における、 例 えば、 該レセプター蛋白質等に対するリガンドの結合量、 細胞刺激活性などを測 定して、 比較することを特徴とする。
より具体的には、 本発明は、
①標識したリガンドを、 本発明のレセプ夕一蛋白質等に接触させた場合と、 標識 したリガンドおよび試験化合物を本発明のレセプター蛋白質等に接触させた場合 における、 標識したリガンドの該レセプ夕一蛋白質等に対する結合量を測定し、 比較することを特徴とするリガンドと本発明のレセプ夕一蛋白質等との結合性を 変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
②標識したリガンドを、 本発明のレセプ夕一蛋白質等を含有する細胞または該細 胞の膜画分に接触させた場合と、 標識したリガンドおよび試験化合物を本発明の レセプ夕一蛋白質等を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合にお ける、 標識したリガンドの該細胞または該膜画分に対する結合量を測定し、 比較 することを特徴とするリガンドと本発明のレセプ夕一蛋白質等との結合性を変化 させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
③標識したリガンドを、 本発明の D N Aを含有する形質転換体を培養することに よつて細胞膜上に発現したレセプ夕一蛋白質等に接触させた場合と、 標識したリ ガンドおよび試験化合物を本発明の D N Aを含有する形質転換体を培養すること によって細胞膜上に発現した本発明のレセプター蛋白質等に接触させた場合にお ける、 標識したリガンドの該レセプター蛋白質等に対する結合量を測定し、 比較 することを特徴とするリガンドと本発明のレセプ夕一蛋白質等との結合性を変化 させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
④本発明のレセプ夕一蛋白質等を活性化する化合物 （例えば、 本発明のレセプ夕 一蛋白質等に対するリガンドなど） を本発明のレセプ夕一蛋白質等を含有する細 胞に接触させた場合と、 本発明のレセプ夕一蛋白質等を活性化する化合物および 試験化合物を本発明のレセプ夕一蛋白質等を含有する細胞に接触させた場合にお ける、 レセプ夕一を介した細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 ァセチル コリン遊離、 細胞内 C a 2 +遊離、 細胞内 c AM P生成、 細胞内 c G M P生成、 ィ ノシトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 c一 ί o s の活性化、 Ρ Ηの低下などを促進する活性または抑制する活性など） を測定し、 比較することを特徴とするリガンドと本発明のレセプ夕一蛋白質等との結合性を 変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、 および
⑤本発明のレセプ夕一蛋白質等を活性化する化合物 （例えば、 本発明のレセプタ 一蛋白質等に対するリガンドなど） を本発明の D N Αを含有する形質転換体を培 養することによって細胞膜上に発現した本発明のレセプター蛋白質等に接触させ た場合と、 本発明のレセプター蛋白質等を活性化する化合物および試験化合物を 本発明の D N Aを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現し た本発明のレセプ夕一蛋白質等に接触させた場合における、 レセプ夕一を介する 細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 C a 2 + 遊離、 細胞内 c AM P生成、 細胞内 c GM P生成、 イノシトールリン酸産生、 細 胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 c一 f o sの活性化、 p Hの低下など を促進する活性または抑制する活性など） を測定し、 比較することを特徴とする リガンドと本発明のレセプター蛋白質等との結合性を変化させる化合物またはそ の塩のスクリーニング方法を提供する。
本発明のレセプ夕一蛋白質等が得られる以前は、 G蛋白質共役型レセプ夕一ァ ゴニストまたはアン夕ゴニストをスクリーニングする場合、 G蛋白質共役型レセ プ夕一蛋白質を含む細胞、 組織またはその細胞膜画分を用いて G蛋白質共役型レ セプ夕一蛋白質とリガンドとの結合を阻害するか否かを確認する方法が採られて いた。 しかし、 細胞、 糸且織または細胞膜画分をそのまま用いれば他のレセプ夕一 蛋白質も混在するために、 目的とするレセプ夕一蛋白質に対するァゴニストまた はアン夕ゴニストを実際にスクリーニングすることは困難であった。
しかしながら、 例えば、 本発明のレセプ夕一蛋白質を用いることによって、 リ ガンドと G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質との結合を阻害する化合物を効率良く スクリーニングすることができる。 さらに、 スクリーニングされた化合物がァゴ ニストかアンタゴニストかを簡便に評価することができる。
本発明のスクリーニング方法の具体的な説明を以下にする。
まず、 本発明のスクリーニング方法に用いる本発明のレセプ夕一蛋白質等とし ては、 前記した本発明のレセプ夕一蛋白質等を含有するものであれば何れのもの であってもよいが、 本発明のレセプター蛋白質等を含有する哺乳動物の臓器の細 胞膜画分が好適である。 しかし、 スクリーニングに用いる大量のレセプ夕一蛋白 質を得るには、 組換え体を用いて大量発現させたレセプ夕一蛋白質等などが適し ている。
本発明のレセプ夕一蛋白質等を製造するには、 前述の方法が用いられるが、 本 発明の D N Aを哺乳細胞や昆虫細胞で発現することにより行なうことが好ましい。 目的とする蛋白質部分をコードする D NA断片には c D NAが用いられるが、 必 ずしもこれに制約されるものではない。 例えば、 遺伝子断片や合成 D NAを用い てもよい。 本発明のレセプ夕一蛋白質をコードする D NA断片を宿主動物細胞に 導入し、 それらを効率よく発現させるためには、 該 D NA断片を昆虫を宿主とす るバキュロウィルスに属する核多角体病ウィルス (nuc lear poly edros i s vi rus； N P V) のポリヘドリンプロモータ一、 S V 4 0由来のプロモーター、 レトロゥ ィルスのプロモー夕一、 メタ口チォネインプロモーター、 ヒ卜ヒ一卜ショックプ 口モータ一、 サイトメガロウィルスプロモーター、 S R αプロモーターなどの下 流に組み込むのが好ましい。 発現したレセプターの量と質の検査はそれ自体公知 の方法で行うことができる。 例えば、 文献 〔Nambi， P. ら、 ザ ·ジャーナル ·ォ ブ 'バイオロジカル 'ケミストリー（J. Bio l. Chem. ) , 267巻， 19555〜19559頁， 1992 年〕 に記載の方法に従って行なう.ことができる。
したがって、 本発明のスクリーニング方法において、 本発明のレセプ夕一蛋白 質等を含有するものとしては、 それ自体公知の方法に従って精製したレセプ夕一 蛋白質等であってもよいし、 該レセプター蛋白質等を含有する細胞を用いてもよ く、 また該レセプ夕一蛋白質等を含有する細胞の膜画分を用いてもよい。
本発明のスクリーニング方法において、 本発明のレセプ夕一蛋白質等を含有す る細胞を用いる場合、 該細胞をダルタルアルデヒド、 ホルマリンなどで固定化し てもよい。 固定化方法はそれ自体公知の方法に従って行なうことができる。
本発明のレセプ夕一蛋白質等を含有する細胞としては、 該レセプター蛋白質等 を発現した宿主細胞をいうが、 該宿主細胞としては、 大腸菌、 枯草菌、 酵母、 昆 虫細胞、 動物細胞などが好ましい。
細胞膜画分としては、 細胞を破砕した後、 それ自体公知の方法で得られる細胞 膜が多く含まれる画分のことをいう。 細胞の破砕方法としては、 P o t t e r— E 1 V e h j e m型ホモジナイザーで細胞を押し潰す方法、 ヮーリングブレンダ 一やポリトロン （Kinemat i ca社製） のよる破砕、 超音波による破砕、 フレンチプ レスなどで加圧しながら細胞を細いノズルから噴出させることによる破砕などが あげられる。 細胞膜の分画には、 分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法などの遠 心力による分画法が主として用いられる。 例えば、 細胞破砕液を低速 （5 0 0 r p m〜3 0 0 0 r p m) で短時間 （通常、 約 1分〜 1 0分） 遠心し、 上清をさら に高速 （1 5 0 0 0 r p m〜3 0 0 0 0 r p m) で通常 3 0分〜 2時間遠心し、 得られる沈澱を膜画分とする。 該膜画分中には、 発現したレセプ夕一蛋白質等と 細胞由来のリン脂質や膜蛋白質などの膜成分が多く含まれる。 該レセプ夕一蛋白質等を含有する細胞や膜画分中のレセプ夕一蛋白質の量は、
1細胞当たり 103〜108分子であるのが好ましく、 105〜107分子であるの が好適である。 なお、 発現量が多いほど膜画分当たりのリガンド結合活性 （比活 性） が高くなり、 高感度なスクリーニング系の構築が可能になるばかりでなく、 同一ロットで大量の試料を測定できるようになる。
リガンドと本発明のレセプ夕一蛋白質等との結合性を変化させる化合物をスク リーニングする前記の①〜③を実施するためには、 例えば、 適当なレセプター蛋 白質画分と、 標識したリガンドが必要である。
レセプ夕一蛋白質画分としては、 天然型のレセプ夕一蛋白質画分か、 またはそ れと同等の活性を有する組換え型レセプター蛋白質画分などが望ましい。ここで、 同等の活性とは、 同等のリガンド結合活性、 シグナル情報伝達作用などを示す。 標識したリガンドとしては、 標識したリガンド、 標識したリガンドアナログ化 合物などが用いられる。 例えば 〔3H〕 、 〔125 I〕 、 〔14C〕 、 〔35S〕 などで 標識されたリガンドなどが用いられる。
具体的には、 リガンドと本発明のレセプ夕一蛋白質等との結合性を変化させる 化合物のスクリーニングを行なうには、 まず本発明のレセプ夕一蛋白質等を含有 する細胞または細胞の膜画分を、 スクリ一ニングに適したバッファーに懸濁する ことによりレセプ夕一蛋白質標品を調製する。バッファ一には、 pH4〜10 (望 ましくは pH6〜8) のリン酸バッファー、 トリス—塩酸バッファ一などのリガ ンドとレセプ夕一蛋白質との結合を阻害しないバッファ一であればいずれでもよ い。 また、 非特異的結合を低減させる目的で、 CHAPS、 Twe e n - 80™ (花王一アトラス社） 、 ジギトニン、 デォキシコレートなどの界面活性剤をバッ ファーに加えることもできる。 さらに、 プロテア一ゼによるレセプ夕一やリガン ドの分解を抑える目的で PMS F、 ロイぺプチン、 E— 64 (ペプチド研究所製）、 ぺプス夕チンなどのプロテア一ゼ阻害剤を添加することもできる。 0. 01ml〜 10mlの該レセプ夕ー溶液に、一定量（5000 c pm〜 500000 c m) の標識したリガンドを添加し、 同時に 10— 4M〜10— 1QMの試験化合物を共存 させる。 非特異的結合量 （NSB) を知るために大過剰の未標識のリガンドを加 えた反応チューブも用意する。 反応は約 0°Cから 50°C、 望ましくは約 4°Cから 3 7 °Cで、 約 2 0分から 2 4時間、 望ましくは約 3 0分から 3時間行う。 反応後、 ガラス繊維濾紙等で濾過し、 適量の同バッファーで洗浄した後、 ガラス繊維濾紙 に残存する放射活性を液体シンチレ一シヨンカウン夕一またはァーカウン夕一で 計測する。 拮抗する物質がない場合のカウント（B Q) から非特異的結合量 （N S B ) を引いたカウント （B。一 N S B ) を 1 0 0 %とした時、 特異的結合量（B— N S B) が、 例えば、 5 0 %以下になる試験化合物を拮抗阻害能力のある候補物 質として選択することができる。
リガンドと本発明のレセプ夕一蛋白質等との結合性を変化させる化合物スクリ 一二ングする前記の④〜⑤の方法を実施するためには、 例えば、 レセプ夕一蛋白 質を介する細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細 胞内 C a遊離、 細胞内 c AM P生成、 細胞内 c GM P生成、 イノシトールリン酸 産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 c一 f o sの活性化、 p Hの 低下などを促進する活性または抑制する活性など） を公知の方法または市販の測 定用キットを用いて測定することができる。
具体的には、 まず、 本発明のレセプ夕一蛋白質等を含有する細胞をマルチゥェ ルプレート等に培養する。 スクリーニングを行なうにあたっては前もつて新鮮な 培地あるいは細胞に毒性を示さない適当なバッファーに交換し、 試験化合物など を添加して一定時間ィンキュベ一卜した後、 細胞を抽出あるいは上清液を回収し て、 生成した産物をそれぞれの方法に従って定量する。 細胞刺激活性の指標とす る物質 （例えば、 ァラキドン酸など） の生成が、 細胞が含有する分解酵素によつ て検定困難な場合は、 該分解酵素に対する阻害剤を添加してアツセィを行なって もよい。 また、 c AM P産生抑制などの活性については、 フオルスコリンなどで 細胞の基礎的産生量を増大させておいた細胞に対する産生抑制作用として検出す ることができる。
細胞刺激活性を測定してスクリーニングを行なうには、 適当なレセプター蛋白 質を発現した細胞が用いられる。 本発明のレセプ夕一蛋白質等を発現した細胞と しては、 天然型の本発明のレセプ夕一蛋白質等を有する細胞株、 前述の組換え型 レセプ夕一蛋白質等を発現した細胞株などが望ましい。
試験化合物としては、 例えば、 ペプチド、 タンパク、 非ペプチド性化合物、 合 成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液などが用いら れ、 これら化合物は新規な化合物であってもよいし、 公知の化合物であってもよ い。
リガンドと本発明のレセプ夕一蛋白質等との結合性を変化させる化合物または その塩のスクリーニング用キットは、 本発明のレセプ夕一蛋白質等、 本発明のレ セプタ一蛋白質等を含有する細胞、 または本発明のレセプター蛋白質等を含有す る細胞の膜画分を含有するものなどである。
本発明のスクリーニング用キットの例としては、 次のものがあげられる。
1. スクリーニング用試薬
①測定用緩衝液および洗浄用緩衝液
Hanks' Balanced Salt Solution (ギブコ社製） に、 0. 05%のゥシ血清アル ブミン （シグマ社製） を加えたもの。
孔径 0.45 のフィルターで濾過滅菌し、 4°Cで保存するか、 あるいは用時 調製しても良い。
② G蛋白質共役型レセプター標品
本発明のレセプ夕一蛋白質を発現させた CHO細胞を、 12穴プレートに 5 X 105個7穴で継代し、 37°C、 5%C02、 95%a i rで 2日間培養したもの。
③標識リガンド
市販の 〔3H〕 、 〔125 I〕 、 〔14C〕 、 〔35S〕 などで標識したリガンド 水 溶液の状態のものを 4°Cあるいは— 20°Cにて保存し、 用時に測定用緩衝液にて 1 Mに希釈する。
④リガンド標準液
リガンドを 0. 1 %ゥシ血清アルブミン（シグマ社製） を含む PBSで ImMと なるように溶解し、 一 20°Cで保存する。
2. 測定法
① 12穴組織培養用プレートにて培養した本発明のレセプ夕一蛋白質発現 CHO 細胞を、 測定用緩衝液 1 m 1で 2回洗浄した後、 490 1の測定用緩衝液を各 穴に加える。
② 10— 3〜10— 1GMの試験化合物溶液を 5 1加えた後、 標識リガンドを 5 1加え、 室温にて 1時間反応させる。 非特異的結合量を知るためには試験化合物 の代わりに 10— 3Mのリガンドを 5 X 1加えておく。
③反応液を除去し、 1 m 1の洗浄用緩衝液で 3回洗浄する。 細胞に結合した標識 リガンドを 0. 2N NaOH- 1 %SDSで溶解し、 4m 1の液体シンチレ一夕 一 A (和光純薬製） と混合する。
④液体シンチレ一シヨンカウンター （ベックマン社製） を用いて放射活性を測定 し、 Percent Ma imum Binding (PMB) を次式で求める。
PMB= [ (B-NS B) Z (B。― NSB) ] X 100
PMB ： Percent Maximum Binding
B ：検体を加えた時の値
NSB ： Non-specific Binding (非特異的結合量)
B 0 ：取大口口 本発明のスクリ一二ング方法またはスクリ一二ング用キットを用いて得られる 化合物またはその塩は、 リガンドと本発明のレセプ夕一蛋白質等との結合性を変 化させる作用を有する化合物であり、 具体的には、 （ィ） G蛋白質共役型レセプ 夕一を介して細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 C a2+遊離、 細胞内 c AMP生成、 細胞内 c GMP生成、 イノシト一ルリ ン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 c一 : f o sの活性化、 p Hの低下などを促進する活性または抑制する活性など） を有する化合物 （いわゆ る、 本発明のレセプ夕一蛋白質に対するァゴニスト） 、 （口） 該細胞刺激活性を 有しない化合物（いわゆる、本発明のレセプ夕一蛋白質に対するアン夕ゴニスト） . (八） リガンドと本発明の G蛋白質共役型レセプター蛋白質との結合力を増強す る化合物、 あるいは （二） リガンドと本発明の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質 との結合力を減少させる化合物である。
該化合物としては、 ペプチド、 タンパク、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物などがあげられ、 これら化合物は新規な化合物であってもよいし、 公 知の化合物であってもよい。 本発明のレセプ夕一蛋白質等に対するァゴニストは、 本発明のレセプ夕一蛋白 質等に対するリガンドが有する生理活性と同様の作用を有しているので、 該リガ ンド活性に応じて安全で低毒性な医薬として有用である。
本発明のレセプ夕一蛋白質等に対するアン夕ゴニス卜は、 本発明のレセプ夕一 蛋白質等に対するリガンドが有する生理活性を抑制することができるので、 該リ ガンド活性を抑制する安全で低毒性な医薬として有用である。
リガンドと本発明の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質との結合力を増強する化 合物は、 本発明のレセプ夕一蛋白質等に対するリガンドが有する生理活性を増強 するための安全で低毒性な医薬として有用である。
リガンドと本発明の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質との結合力を減少させる 化合物は、 本発明のレセプ夕一蛋白質等に対するリガンドが有する生理活性を減 少させるための安全で低毒性な医薬として有用である。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる 化合物またはその塩を上述の医薬組成物として使用する場合、 常套手段に従って 製剤化することができる。 例えば、 前記した本発明の D N Aを含有する医薬と同 様にして、 錠剤、 カプセル剤、 エリキシル剤、 マイクロカプセル剤、 無菌性溶液、 懸濁液剤などとすることができる。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトゃ哺乳 動物 （例えば、 ラッ卜、 マウス、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サ ルなど） に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、 投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法など により差異はあるが、 経口投与の場合、 一般的に例えば、 動脈硬化症患者 （6 0 k gとして） においては、 一日につき約 0. ：!〜 1 0 O m g、 好ましくは約 1 . 0 〜5 0 m g、 より好ましくは約 1 . 0〜2 0 m gである。 非経口的に投与する場 合は、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などによっても異 なるが、 例えば、 注射剤の形では通常例えば、 動脈硬化症患者 （6 O k gとして） においては、 一日につき約 0 . 0 1〜3 O m g程度、 好ましくは約 0 . 1〜2 0 m g程度、 より好ましくは約 0 . 1〜1 O m g程度を静脈注射により投与するの が好都合である。 他の動物の場合も、 6 O k g当たりに換算した量を投与するこ とができる。
( 6 ) 本発明の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質とリガンドとの結合性を変化さ せる化合物 （ァゴ二スト、 アン夕ゴニスト） を含有する各種疾病の予防および/ または治療剤
本発明のレセプ夕一蛋白質は前述のとおり、 例えば中枢機能など生体内で重要 な役割を果たしている。 従って、 本発明のレセプ夕一蛋白質とリガンドとの結合 性を変化させる化合物 （ァゴ二スト、 アン夕ゴニスト） は、 本発明のレセプ夕一 蛋白質の機能不全に関連する疾患の予防および/または治療剤として用いること ができる。
該化合物を本発明のレセプター蛋白質の機能不全に関連する疾患の予防および Zまたは治療剤として使用する場合は、 常套手段に従って製剤化することができ る。
例えば、 該化合物は、 必要に応じて糖衣を施した錠剤、 カプセル剤、 エリキシ ル剤、 マイクロカプセル剤などとして経口的に、 あるいは水もしくはそれ以外の 薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、 または懸濁液剤などの注射剤の形で非経 口的に使用できる。 例えば、 該化合物を生理学的に認められる公知の担体、 香味 剤、 賦形剤、 べヒクル、 防腐剤、 安定剤、 結合剤などとともに一般に認められた 製剤製造法に要求される単位用量形態で混和することによって製造することがで きる。 これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な用量が得られる ようにするものである。
錠剤、 カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、 例えばゼラチ ン、 コーンスターチ、 トラガント、 アラビアゴムのような結合剤、 結晶性セル口 —スのような賦形剤、 コーンスターチ、 ゼラチン、 アルギン酸などのような膨化 剤、 ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、 ショ糖、 乳糖またはサッカリン のような甘味剤、 ペパーミント、 ァカモノ油またはチェリーのような香味剤など が用いられる。 調剤単位形態がカプセルである場合には、 前記タイプの材料にさ らに油脂のような液状担体を含有することができる。 注射のための無菌組成物は 注射用水のようなべヒクル中の活性物質、 胡麻油、 椰子油などのような天然産出 植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤製造法に従って処方するこ とができる。 注射用の水性液としては、 例えば、 生理食塩水、 ブドウ糖やその他 の補助薬を含む等張液 （例えば、 D—ソルビトール、 D—マンニトール、 塩化ナ トリウムなど） などが用いられ、 適当な溶解補助剤、 例えば、 アルコール （例、 エタノール） 、 ポリアルコール （例、 プロピレングリコール、 ポリエチレンダリ コール） 、 非イオン性界面活性剤 （例、 ポリソルベート 80 (TM) 、 HCO— 50) などと併用してもよい。 油性液としては、 例えば、 ゴマ油、 大豆油などが 用いられ、 溶解補助剤である安息香酸ベンジル、 ベンジルアルコールなどと併用 してもよい。
また、 上記予防 ·治療剤は、 例えば、 緩衝剤 （例えば、 リン酸塩緩衝液、 酢酸 ナトリウム緩衝液） 、 無痛化剤 （例えば、 塩化ベンザルコニゥム、 塩酸プロカイ ンなど） 、 安定剤（例えば、 ヒト血清アルブミン、 ポリエチレングリコールなど） 、 保存剤 （例えば、 ベンジルアルコール、 フエノールなど） 、 酸化防止剤などと配 合してもよい。 調製された注射液は通常、 適当なアンプルに充填される。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトゃ哺乳 動物 （例えば、 ラット、 マウス、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サ ルなど） に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、 投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法など により差異はあるが、 経口投与の場合、 一般的に例えば、 動脈硬化症患者 （60 kgとして） においては、 一日につき約 0. 1〜10 Omg、 好ましくは約 1. 0 〜5 Omg、 より好ましくは約 1. 0〜2 Omgである。 非経口的に投与する場 合は、 その 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などによっても異 なるが、 例えば、 注射剤の形では通常例えば、 動脈硬化症患者 （6 O kgとして） においては、 一日につき約 0. 01〜3 Omg程度、 好ましくは約 0. 1〜20 mg程度、 より好ましくは約 0. 1〜1 Omg程度を静脈注射により投与するの が好都合である。 他の動物の場合も、 60 kg当たりに換算した量を投与するこ とができる。
(7) 本発明のレセプター蛋白質、 その部分ペプチドまたはそれらの塩の定量 本発明の抗体は、 本発明のレセプ夕一蛋白質等を特異的に認識することができ るので、 被検液中の本発明のレセプ夕一蛋白質等の定量、 特にサンドイッチ免疫 測定法による定量などに使用することができる。 すなわち、 本発明は、 例えば、
( i ) 本発明の抗体と、 被検液および標識化レセプ夕一蛋白質等とを競合的に反 応させ、 該抗体に結合した標識化レセプ夕一蛋白質等の割合を測定することを特 徴とする被検液中の本発明のレセプター蛋白質等の定量法、
( i i ) 被検液と担体上に不溶化した本発明の抗体および標識化された本発明の抗 体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、 不溶化担体上の標識剤の活性を測 定することを特徴とする被検液中の本発明のレセプタ一蛋白質等の定量法を提供 する。
上記 （i i ) においては、 一方の抗体が本発明のレセプ夕一蛋白質等の N端部を 認識する抗体で、 他方の抗体が本発明のレセプ夕一蛋白質等の C端部に反応する 抗体であることが好ましい。
本発明のレセプター蛋白質等に対するモノクローナル抗体 （以下、 本発明のモ ノクローナル抗体と称する場合がある） を用いて本発明のレセプ夕一蛋白質等の 測定を行なえるほか、 組織染色等による検出を行なうこともできる。 これらの目 的には、 抗体分子そのものを用いてもよく、 また、 抗体分子の F ( a b ' ) 2 、 F a b '、 あるいは F a b画分を用いてもよい。本発明のレセプ夕一蛋白質等に対する 抗体を用いる測定法は、 特に制限されるべきものではなく、 被測定液中の抗原量 (例えば、 レセプター蛋白質量） に対応した抗体、 抗原もしくは抗体一抗原複合 体の量を化学的または物理的手段により検出し、 これを既知量の抗原を含む標準 液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば、 いずれの測定法を用 いてもよい。 例えば、 ネフロメトリ一、 競合法、 ィムノメトリック法およびサン ドイッチ法が好適に用いられるが、 感度、 特異性の点で、 後述するサンドイッチ 法を用いるのが特に好ましい。
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、 例えば、 放射性同位元 素、 酵素、 蛍光物質、 発光物質などが用いられる。 放射性同位元素としては、 例 えば、 〔1 2 5 I〕 、 〔1 3 1 I〕 、 C 3 H] , 〔1 4 C〕 などが用いられる。 上記酵素 としては、 安定で比活性の大きなものが好ましく、 例えば、 3—ガラクトシダ一 ゼ、 /3—ダルコシダーゼ、 アルカリフォスファターゼ、 パ一ォキシダーゼ、 リン ゴ酸脱水素酵素などが用いられる。 蛍光物質としては、 例えば、 フルォレスカミ ン、 フルォレツセンイソチオシァネートなどが用いられる。 発光物質としては、 例えば、 ルミノール、 ルミノール誘導体、 ルシフェリン、 ルシゲニンなどが用い られる。 さらに、 抗体あるいは抗原と標識剤との結合にピオチン一アビジン系を 用いることもできる。
抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、 物理吸着を用いてもよく、 また通常、 蛋白質あるいは酵素等を不溶化、 固定化するのに用いられる化学結合を用いる方 法でもよい。 担体としては、 例えば、 ァガロース、 デキストラン、 セルロースな どの不溶性多糖類、 ポリスチレン、ポリアクリルアミド、 シリコン等の合成樹脂、 あるいはガラス等が用いられる。
サンドィツチ法においては不溶化した本発明のモノクローナル抗体に被検液を 反応させ （1次反応） 、 さらに標識化した本発明のモノクローナル抗体を反応さ せ （2次反応） たのち、 不溶化担体上の標識剤の活性を測定することにより被検 液中の本発明のレセプ夕一蛋白質量を定量することができる。 1次反応と 2次反 応は逆の順序に行なっても、 また、 同時に行なってもよいし時間をずらして行な つてもよい。標識化剤および不溶化の方法は前記のそれらに準じることができる。 また、 サンドイッチ法による免疫測定法において、 固相用抗体あるいは標識用 抗体に用いられる抗体は必ずしも 1種類である必要はなく、 測定感度を向上させ る等の目的で 2種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。
本発明のサンドィツチ法によるレセプ夕一蛋白質等の測定法においては、 1次 反応と 2次反応に用いられる本発明のモノクローナル抗体はレセプ夕一蛋白質等 の結合する部位が相異なる抗体が好ましく用いられる。 即ち、 1次反応および 2 次反応に用いられる抗体は、 例えば、 2次反応で用いられる抗体が、 レセプター 蛋白質の C端部を認識する場合、 1次反応で用いられる抗体は、 好ましくは C端 部以外、 例えば N端部を認識する抗体が用いられる。
本発明のモノクローナル抗体をサンドイッチ法以外の測定システム、 例えば、 競合法、ィムノメトリック法あるいはネフロメトリーなどに用いることができる。 競合法では、 被検液中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応させたの ち、 未反応の標識抗原（F ) と抗体と結合した標識抗原 （B ) とを分離し （B / F 分離） 、 Bおよび Fいずれかの標識量を測定し、 被検液中の抗原量を定量する。 本反応法には、 抗体として可溶性抗体を用い、 BZF分離をポリエチレングリコ ール、 前記抗体に対する第 2抗体などを用いる液相法、 および、 第 1抗体として 固相化抗体を用いるか、 あるいは、 第 1抗体は可溶性のものを用い第 2抗体とし て固相化抗体を用いる固相化法とが用いられる。
ィムノメトリック法では、 被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化抗 体に対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、 あるいは、 被検液中の抗 原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、 次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗 体を固相に結合させたのち、 固相と液相を分離する。 次に、 いずれかの相の標識 量を測定し被検液中の抗原量を定量する。
また、 ネフロメトリ一では、 ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果、 生 じた不溶性の沈降物の量を測定する。 被検液中の抗原量が僅かであり、 少量の沈 降物しか得られない場合にもレーザ一の散乱を利用するレーザ一ネフロメトリー などが好適に用いられる。
これら個々の免疫学的測定法を本発明の測定方法に適用するにあたっては、 特 別の条件、操作等の設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、 操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発明のレセプ夕一蛋白質またはそ の塩の測定系を構築すればよい。 これらの一般的な技術手段の詳細については、 総説、 成書などを参照することができる 〔例えば、 入江 寛編 「ラジオィムノア ッセィ〕 （講談社、 昭和 49年発行） 、 入江 寛編 「続ラジオィムノアツセィ〕 (講談社、 昭和 54年発行） 、 石川栄治ら編 「酵素免疫測定法」 （医学書院、 昭 和 53年発行） 、 石川栄治ら編 「酵素免疫測定法」 （第 2版） （医学書院、 昭和 57年発行） 、 石川栄治ら編 「酵素免疫測定法」 （第 3版） （医学書院、 昭和 6 2年発行） 、 「メソッズ ·イン'ェンジモノジー （Methods in ENZYM0L0GY)」 Vol. 70 (Immunochemical Techniques (Part A)) 、 同書 Vol. 73 (Immunochemical Techniques (Part B)) 、 同書 Vol. 74 (Immunochemical Techniques (Part 0) 、 同書 Vol. 84 (Immunochemical Techniques (Part D:Selected Immunoassays)) 、 同書 Vol. 92 (Immunochemical Techniques (Part E:Monoclonal Antibodies and General I画腿 ssay Methods))、同書 Vol. 121 (Immunochemical Techniques (Part r.Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies)) (以上、 アカデミックプ レス社発行） など参照〕 。
以上のように、 本発明の抗体を用いることによって、 本発明のレセプ夕一蛋白 質またはその塩を感度良く定量することができる。
さらに、 本発明の抗体を用いて、 生体内での本発明のレセプ夕一蛋白質または その塩を定量することによって、 本発明のレセプ夕一蛋白質の機能不全に関連す る各種疾患の診断をすることができる。
また、 本発明の抗体は、 体液や組織などの被検体中に存在する本発明のレセプ 夕一蛋白質等を特異的に検出するために使用することができる。 また、 本発明の レセプ夕一蛋白質等を精製するために使用する抗体カラムの作製、 精製時の各分 画中の本発明のレセプ夕一蛋白質等の検出、 被検細胞内における本発明のレセプ 夕一蛋白質の挙動の分析などのために使用することができる。
( 8 ) 本発明のレセプ夕一蛋白質、 その部分ペプチドまたはそれらの塩に対する 抗体による中和
本発明のレセプター蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗 体の、 それらレセプ夕一蛋白質などに対する中和活性とは、 該レセプ夕一蛋白質 の関与するシグナル伝達機能を不活性化する活性を意味する。 従って、 該抗体が 中和活性を有する場合は、該レセプ夕ー蛋白質の関与するシグナル伝達、例えば、 該レセプター蛋白質を介する細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 ァセチ ルコリン遊離、 細胞内 C a 2 +遊離、 細胞内 c AM P生成、 細胞内 c GM P生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 c 一 f o sの活性化、 p Hの低下などを促進する活性または抑制する活性など） を不活性 化することができる。 従って、 該レセプター蛋白質の過剰発現などに起因する疾 患の予防および Zまたは治療に用いることができる。
( 9 ) 本発明の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質をコードする D NAを有する動 物の作製
本発明の D N Aを用いて、 本発明のレセプ夕一蛋白質等を発現するトランスジ エニック動物を作製することができる。 動物としては、 哺乳動物 （例えば、 ラッ ト、 マウス、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） など （以下、 動物と略記する場合がある） があげられるが、 特に、 マウス、 ラッ卜などが好適 である。
本発明の D N Aを対象動物に転移させるにあたっては、 該 D N Aを動物細胞で 発現させうるプロモーターの下流に結合した遺伝子コンストラクトとして用いる のが一般に有利である。 例えば、 ヒト由来の本発明の D N Aを転移させる場合、 これと相同性が高い動物由来の本発明の D NAを動物細胞で発現させうる各種プ 口モータ一の下流に結合した遺伝子コンストラクトを、 例えば、 マウス受精卵へ マイクロインジェクションすることによって本発明のレセプ夕一蛋白質等を高産 生する D NA転移動物を作出できる。 このプロモー夕一としては、 例えば、 ウイ ルス由来プロモ一夕一、 メタ口チォネイン等のュビキアスな発現プロモーターも 使用しうるが、 好ましくは脳で特異的に発現する N G F遺伝子プロモー夕一ゃェ ノラ一ゼ遺伝子プロモータ一などが用いられる。
受精卵細胞段階における本発明の D N Aの転移は、 対象動物の胚芽細胞および 体細胞の全てに存在するように確保される。 D N A転移後の作出動物の胚芽細胞 において本発明のレセプター蛋白質等が存在することは、 作出動物の子孫が全て その胚芽細胞及び体細胞の全てに本発明のレセプ夕一蛋白質等を有することを意 味する。 遺伝子を受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞の 全てに本発明のレセプ夕一蛋白質等を有する。
本発明の D NA転移動物は、 交配により遺伝子を安定に保持することを確認し て、 該 D N A保有動物として通常の飼育環境で飼育継代を行うことができる。 さ らに、 目的 D NAを保有する雌雄の動物を交配することにより、 導入遺伝子を相 同染色体の両方に持つホモザィゴート動物を取得し、 この雌雄の動物を交配する ことによりすべての子孫が該 D N Aを有するように繁殖継代することができる。 本発明の D N Aが転移された動物は、 本発明のレセプター蛋白質等が高発現さ せられているので、 本発明のレセプ夕一蛋白質等に対するァゴニストまたはアン 夕ゴニストのスクリーニング用の動物などとして有用である。
本発明の D N A転移動物を、 組織培養のための細胞源として使用することもで きる。 例えば、 本発明の D N A転移マウスの組織中の D NAもしくは R NAを直 接分析するか、 あるいは遺伝子により発現された本発明のレセプ夕一蛋白質が存 在する組織を分析することにより、 本発明のレセプター蛋白質等について分析す ることができる。 本発明のレセプター蛋白質等を有する組織の細胞を標準組織培 養技術により培養し、 これらを使用して、 例えば、 脳や末梢組織由来のような一 般に培養困難な組織からの細胞の機能を研究することができる。 また、 その細胞 を用いることにより、 例えば、 各種組織の機能を高めるような医薬の選択も可能 である。 また、 高発現細胞株があれば、 そこから、 本発明のレセプ夕一蛋白質等 を単離精製することも可能である。
本明細書および図面において、 塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、 I UP AC - I UB Commission on Biochemical Nomenclature による略号あるい は当該分野における慣用略号に基づくものであり、 その例を下記する。 またアミ ノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、 特に明示しなければ L体を示すものと する。
DNA デォキシリボ核酸
c DNA 相補的デォキシリボ核酸
A アデニン
TT ：チミン
G グァニン
C シ
RNA リボ核酸
mRNA メッセンジャーリボ核酸
dATP デォキシアデノシン三リン酸
dTTP デォキシチミジン三リン酸
dGTP デォキシグアノシン三リン酸
d CTP デォキシシチジン三リン酸
ATP アデノシン三リン酸
EEDDTTAA エチレンジァミン四酢酸
SDS ドデシル硫酸ナトリウム
G 1 y
A 1 a ァラニン
V a 1 ン Le u ： ロイシン
I 1 e ：イソロイシン
S e r ：セリン
Th r ：スレオニン
Cy s ： システィン
Me t ：メチォニン
G 1 u ： グルタミン酸
As p ：ァスパラギン酸
L y s ： リジン
A r g ：アルギニン
H i s ： ヒスチジン
P h e ： フエ二ルァラニン
Ty r ：チロシン
T r p ： 卜リブトフアン
P r o ：プロリン
A s n ：ァスパラギン
G 1 n ：グルタミン
p G 1 u ： ピログルタミン酸
Me ：メチル基
E t ：ェチル基
t U . ~ ェ Π ,甘
. ノナノレ
Ph ： フエニル基
TC ：チアゾリジン— 4 (R) 一力ルポキサミド基 また、 本明細書中で繁用される置換基、 保護基および試薬を下 する。
To s ： P一トルエンスルフォニル
CHO ：ホルミル
B z 1 ：ベンジル C 12B z 1 2， 6—ジクロ口べンジル
Bom ベンジルォキシメチル
Z ベンジルォキシカルボニル
Figure imgf000069_0001
B o c t一ブトキシカルボニル
DNP ジニトロフエノール
T r t 卜リチル
Bum t一ブトキシメチル
Fm o c N— 9一フルォレニルメ卜キシカルボニル
HOB t 1ーヒドロキシベンズトリアゾ一ル
HOOB t 3， 4—ジヒドロー 3—ヒドロキシ一 4—ォキソ一 1, 2,
3—べンゾトリアジン
HONB 1ーヒドロキシー 5—ノルボルネンー 2, 3—ジカルボキ シィミド
DCC 本明細書の配列表の配列番号は、 以下の配列を示す。
〔配列番号： 1〕
本発明のマウス脾臓由来新規 G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質 mAL 7 TO 2 4のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 2〕
配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列を有する本発明のマウス脾臓由来新規 G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質 mAL 7T024をコードする c D N Aの塩基 配列を示す。
〔配列番号： 3〕
本発明のマウス脾臓由来新規 G蛋白質共役型レセプター蛋白質 mAL 7T02 4をコ一ドする c DN Aをクローニングするために使用したプライマ一 1の塩基 配列を示す。 〔配列番号： 4〕
本発明のマウス脾臓由来新規 G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質 mAL 7T024 をコードする c DN Aをクロ一ニングするために使用したプライマ一 2の塩基配 列を示す。
〔配列番号： 5〕
本発明のヒト肺由来新規 G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質 hAL 7 TO 24の アミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 6〕
配列番号： 5で表わされるアミノ酸配列を有する本発明のヒト肺由来新規 G蛋 白質共役型レセプ夕一蛋白質 hAL 7 T 024をコードする cDNAの塩基配列 を示す。
〔配列番号： 7〕
本発明のヒト肺由来新規 G蛋白質共役型レセプター蛋白質 hAL 7 TO 24を コードする c DN Aをクローニングするために使用したプライマ一 3の塩基配列 を示す。
〔配列番号： 8〕
本発明のヒト肺由来新規 G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質 hAL 7 TO 24を コードする c DN Aをクローニングするために使用したプライマ一 4の塩基配列 を示 ί"。 後述の実施例 1で得られた形質転換体ェシエリヒア コリ （Escherichia col i) TOP 10 F'/pCR 3. l—mAL 024は、 1998年 12月 2日から通商 産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（N I BH) に寄託番号 FERM BP — 6591として、 1998年 11月 25日から財団法人 ·発酵研究所（I FO) に寄託番号 I FO 16222として寄託されている。 以下に実施例を示して、 本発明をより詳細に説明するが、 これらは本発明の範 囲を限定するものではない。 なお、 大腸菌を用いての遺伝子操作法は、 モレキュ ラー *クローニング （Molecular cloning) に記載されている方法に従った。 実施例 1
マウス脾臓の G蛋白質共役型レセプター蛋白質をコ一ドする c DN Aのクロー ニングと塩基配列の決定
マウス脾臓由来 c DNAを铸型とし、 2個のプライマ一、 プライマ一 1 (配列 番号： 3) およびプライマー 2 (配列番号： 4) を用いて PC R反応を行った。 該反応における反応液の組成は上記 c DNAの 1 0分の 1量を铸型として使用し、 Ad v a n t a g e c DNA P o l yme r a s e M i x (CLONTEC H社） 1/5 0量、 プライマー 1 (配列番号： 3) およびプライマー 2 (配列番 号： 4) を各 0. 2 xM、 dNTP s 2 0 0 Μ, および酵素に添付のバッファ —を加え、 2 5 1の液量とした。 P CR反応は、① 94°C · 3 0秒の後、② 9 4°C · 5秒、 6 8°C · 2分のサイクルを 3 5回繰り返し、 ③最後に 6 8°C · 7分 の伸長反応を行った。該 PC R反応後の反応産物を T Aクローニングキット（I n V i t r o g e n社）の処方に従いプラスミドベクタ一 p CR 3. 1 ( I n v i t r o g e n社）へサブクロ一ニングした。 これを大腸菌 T O P 1 0 F'に導入し、 c DNAをもつクローンをアンピシリンを含む LB寒天培地中で選択した後、 個々のクローンの配列を解析した結果、 新規 G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質を コードする c DNA配列 （配列番号： 2) を得た。 この c DNAより導き出され るアミノ酸配列 （配列番号： 1を含有する新規 G蛋白質共役型レセプター蛋白質 を mAL 7 T 0 24と命名し、 この形質転換体を大腸菌 （Escherichia col i) T OP 1 0 F'/p CR 3. 1—mAL 024と命名した。 実施例 2
ヒト肺由来新規 G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質 hAL 7 TO 24の c DNA のクローニングと塩基配列の決定
ヒト肺 c DNA (CLONTECH社） を铸型とし、 2個のプライマ一、 ブラ イマ一 3 (配列番号： 7) およびプライマ一 4 (配列番号： 8) を用いて PC R 反応を行った。 該反応における反応液の組成は上記 c DN Aの 2 5分の 1量を铸 型として使用し、 Ad v a n t a g e c DNA P o l yme r a s e M i x (CLONTECH社） 1ノ5 0量、 プライマ一 3 (配列番号： 7) およびブラ イマ一 4 (配列番号： 8) を 各 0. 2 M、 dNTP s 2 0 0 M、 および酵 素に添付のバッファ一を加え、 2 5 / 1の液量とした。 PC R反応は、① 94°0 3 0秒の後、② 94°C · 5秒、 6 8°C · 2分のサイクルを 3 5回繰り返し、③最 後に 68°C ' 7分の伸長反応を行った。 該 PCR反応後の反応産物を TAクロー ニングキット（ I n V i t r o g e n社）の処方に従いプラスミドベクター p CR 3. 1 ( I n V i t r o g e n社）へサブクロ一ニングした。 これを大腸菌 DH 5 ひに導入し、 c DNAをもつクローンをアンピシリンを含む LB寒天培地中で選 択した後、 個々のクローンの配列を解析した結果、 新規 G蛋白質共役型レセプ夕 —蛋白質をコードする c DNA配列 （配列番号： 6) を含む形質転換体：大腸菌
(Escherichia coli) DH 5 a/p CR 3. 1— h 0 24を得た。 この c DNA より導き出されるアミノ酸配列 （配列番号： 5) を含有する新規 G蛋白質共役型 レセプ夕一蛋白質を hAL 7 T 0 24と命名した。 産業上の利用可能性
本発明の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質、 その部分ペプチドまたはそれらの 塩、 およびそれらをコードするポリヌクレオチド （例えば、 DNA、 RNAおよ びそれらの誘導体） は、 ①リガンド （ァゴ二スト） の決定、 ②抗体および抗血清 の入手、 ③組み替え型レセプター蛋白質の発現系の構築、 ④同発現系を用いたレ セプター結合アツセィ系の開発と医薬品候補化合物のスクリーニング、 ⑤構造的 に類似したリガンド ·レセプ夕一との比較にもとづいたドラッグデザィンの実施、 ⑥遺伝子診断におけるプローブや PC Rプライマ一の作成のための試薬、 ⑦トラ ンスジエニック動物の作製または⑧遺伝子予防 ·治療剤等の医薬等として用いる ことができる。

Claims

請求の範囲
1 . 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミ ノ酸配列を含有することを特徴とする G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質またはそ の塩。
2 . 実質的に同一のアミノ酸配列が配列番号： 5で表されるアミノ酸配列である 請求項 1記載の蛋白質。
3 . 請求項 1記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質の部分べプチドまたはその
4 . 請求項 1記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質をコードする塩基配列を有 するポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
5 . D NAである請求項 4記載のポリヌクレオチド。
6 . 配列番号： 2または配列番号： 6で表される塩基配列を有する請求項 4記載 のポリヌクレオチド。
7 . 請求項 4記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
8 . 請求項 7記載の組換えべクタ一で形質転換させた形質転換体。
9 . 請求項 8記載の形質転換体を培養し、 請求項 1記載の G蛋白質共役型レセプ 夕一蛋白質を生成せしめることを特徴とする請求項 1記載の G蛋白質共役型レセ プター蛋白質またはその塩の製造法。
1 0 . 請求項 1記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質もしくは請求項 3記載の 部分ペプチドまたはその塩に対する抗体。
1 1 . 請求項 1記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質のシグナル伝達を不活性 化する中和抗体である請求項 1 0記載の抗体。
1 2 . 請求項 1 0記載の抗体を含有してなる診断薬。
1 3 . 請求項 1記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質もしくは請求項 3記載の 部分べプチドまたはその塩を用いることにより得られる請求項 1記載の G蛋白質 共役型レセプ夕一蛋白質またはその塩に対するリガンド。
1 4 . 請求項 1 3記載のリガンドを含有してなる医薬。
1 5 . 請求項 1記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質もしくは請求項 3記載の 部分ペプチドまたはその塩を用いることを特徴とする請求項 1記載の G蛋白質共 役型レセプ夕一蛋白質またはその塩に対するリガンドの決定方法。
1 6 . 請求項 1記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質もしくは請求項 3記載の 部分べプチドまたはその塩を用いることを特徴とするリガンドと請求項 1記載の G蛋白質共役型レセプター蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物ま たはその塩のスクリーニング方法。
1 7 . 請求項 1記載の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質もしくは請求項 3記載の 部分べプチドまたはその塩を含有することを特徴とするリガンドと請求項 1記載 の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物 またはその塩のスクリーニング用キット。
1 8 . 請求項 1 6記載のスクリーニング方法または請求項 1 7記載のスクリ一二 ング用キットを用いて得られる、 リガンドと請求項 1記載の G蛋白質共役型レセ プ夕ー蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩。
1 9 . 請求項 1 6記載のスクリーニング方法または請求項 1 7記載のスクリー二 ング用キットを用いて得られる、 リガンドと請求項 1記載の G蛋白質共役型レセ プター蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩を含有し てなる医薬。
2 0 . 請求項 4記載のポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイ プリダイズするポリヌクレオチド。
2 1 . 請求項 4記載のポリヌクレオチドと相補的な塩基配列およびその一部を含 有してなるポリヌクレオチド。
2 2 . 請求項 4記載のポリヌクレオチドまたはその一部を用いることを特徴とす る請求項 1記載のレセプ夕一蛋白質の mR N Aの定量方法。
2 3 . 請求項 1 0記載の抗体を用いることを特徴とする請求項 1記載のレセプタ —蛋白質の定量方法。
2 4. 請求項 2 2または請求項 2 3記載の定量方法を用いることを特徴とする請 求項 1記載の G蛋白質共役型レセプターの機能が関連する疾患の診断剤。
2 5 . 請求項 2 2または請求項 2 3記載の定量方法を用いることを特徴とする請 求項 1記載の G蛋白質共役型レセプターの発現を変化させる化合物またはその塩 のスクリ一ニング方法。
2 6 . 請求項 2 5記載のスクリーニング方法を用いて得られる請求項 1記載の G 蛋白質共役型レセプ夕一の発現を変化させる化合物またはその塩。
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