WO2000034464A1 - Procede de criblage en levure de modulateurs de proteine-kinases specifiques de cellules eucaryotes superieures, y compris les cellules humaines - Google Patents

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hybrid
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Richard Benarous
Florence Margottin
Hervé DURAND
Fernando Arenzana-Seisdedos
Mathias Kroll
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Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale
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Definitions

  • the present invention relates to a method for screening yeast for positive and negative modulators of protein kinases specific for higher eukaryotic cells, including human cells.
  • negative modulators means inhibitors and the term “positive modulators” activators.
  • This process consists of 1) detecting changes in the interaction properties of a protein, which is the substrate of a protein kinase and which binds to a specific partner, by a double-hybrid yeast test, and 2) to detect its phosphorylation state by antibodies capable of recognizing the phosphorylated protein compared to the same non-phosphorylated protein.
  • the screening method of the invention is based on the expression in yeast of protein kinase substrates specific for higher eukaryotic cells, including human cells.
  • Expression in yeast makes it possible to detect the phosphorylation of said substrates by protein kinases endogenous to yeast, in the absence of any coexpression of protein kinases which ensure their phosphorylation in higher eukaryotic cells, including human cells. After detection of this phosphorylation, modulators of the phosphorylation of said protein kinase substrates can be sought.
  • the principle and application of the present method is based on the fact that, if a yeast protein kinase is capable of specifically phosphorylating a protein kinase substrate of higher eukaryotic cells, including human cells, then a compound capable of specifically inhibiting or activating the activity of this yeast kinase on this substrate is also capable of inhibiting the same activity exerted by human kinase on this substrate or constitutes a compound of choice for the isolation of such a modulator.
  • the subject of the present invention is a method for screening for yeast inhibitors of protein kinases specific for higher eukaryotic cells, including human cells, characterized in that it consists in: a) expressing the substrate (s) of these protein kinases and the specific interaction partner (s) of this protein kinase substrate (s) in a double-hybrid system in the yeast Saccharomyces cerevisiae in a selective growth medium in the presence of agents inhibiting potential phosphorylation- dependent on said substrate (s) with its or their specific partner, b) screening in said double-hybrid system for said protein kinase inhibitors, and c) determining the specificity of the inhibitors obtained in step b) by a reaction with an antibody specific for the phosphorylated form of substrates.
  • the subject of the present invention is also a method of screening for yeast inhibitors of protein kinases specific for higher eukaryotic cells, including human cells, characterized in that it comprises the steps consisting in: a) cotransforming the yeast Saccharomyces cerevisiae by a double-hybrid vector containing the cDNA of the protein kinase protein substrate in fusion either with a DNA binding domain, or with an activation domain, and a vector double-hybrid containing the cDNA of a specific partner of said fusion protein either with a DNA binding domain or with an activation domain, causing said yeast to express said protein and said specific partner in a medium of culture according to conventional double-hybrid conditions, verify by the double-hybrid method that there is interaction
  • the total number of protein kinases is estimated at a thousand (Hunter T., Cell, 80, 225-236, 1995). Since the availability of the complete yeast genome sequence, the total number of protein kinases in yeast is estimated to be approximately 120 (Hunter T. and Plowman GD, Reviews, Tibs 22, 18-21, 1997) .
  • protein kinases are known which are relatively well conserved from yeast to humans and which regulate some major signal transduction pathways, such as protein kinases A, MAPs. kinases, cell cycle kinases, casein kinase II, etc. These human protein kinases can complement the corresponding yeast kinases whose gene has been disabled.
  • specific protein kinase substrates of higher eukaryotic cells including human cells, as used in the present description, is meant protein substrates which are phosphorylated in said higher eukaryotic cells, including human cells, by said proteins.
  • -kinases By specific partner of the substrate, or protein, is meant a protein partner capable of interaction with said substrate when the latter has been phosphorylated.
  • Phosphorylations / dephosphorylations are often accompanied by changes in the ability of one protein to interact with another protein. These interaction modifications are the basis for the regulation of metabolic pathways and the transmission of signals in the cell.
  • I ⁇ B or ⁇ -catenin interact with h- ⁇ TrCP only in phosphorylated form, which causes degradation of the phosphorylated form of the protein, while the dephosphorylated form is resistant to degradation (Margottin and al., Molecular Cell, 1 (4), 565-574, 1998).
  • the Pho4 protein interacts with the Mns5 protein only when it is phosphorylated, which leads to its export from the nucleus.
  • the protein Pho4 dephosphorylated which is unable to interact with the Mns5 protein will specifically interact with the Psel protein, which will lead to its import into the nucleus. Phosphorylated Pho4 is unable to interact with Psel (Kaffman A. et al., Nature, 396, 482-486, 1998).
  • protein kinase substrate that is to say protein which can be phosphorylated
  • the protein I ⁇ B is specifically mentioned, its specific partner being the human protein ⁇ TrCP as described by Margottin et al. (Molecular Cell, Vol. 1, 565-574, 1998).
  • the interaction detected in a double-hybrid system for a given protein with a given partner is an interaction dependent on the phosphorylation of the protein.
  • a protein mutated on its phosphorylation sites and which cannot therefore be phosphorylated will be used, in fusion with a DNA binding or transcription activation domain, in the double-hybrid test described by Fields & Song , (Nature, 340, 245-246, 1989 and US 5,667,973, incorporated in the present description for reference), either with a particular partner or with a complementary DNA bank also fused with a transcription activation domain .
  • the phosphorylation dependent interaction are those that will be positive with the normal protein and negative with the mutated protein. This can only be done if the protein phosphorylation sites are known beforehand, which is the case with many phosphoproteins (Biolabs Catalog 1998-1999).
  • the double-hybrid test is based on the detection, in a selective medium, of protein-protein interactions by activation of the reporter gene His or LacZ under the control of domains of the transcriptional activator Gal4 in yeast.
  • a yeast is cotransformed by a double-hybrid vector containing the cDNA of one of the proteins and a vector containing the cDNA of the other protein, each of said vectors containing either a binding domain DNA, a domain of activation of transcription.
  • the two proteins are then made to express by yeast in a selective culture medium such as as described by Bartel P. and Fields S. (Meth. Enzymol., 254, 241-263, 1995).
  • the selective medium is either a medium lacking histidine which makes it possible to detect the activation of the reporter gene His3 causing yeast growth without histidine, or a medium which makes it possible to detect the activation of the reporter gene LacZ which is revealed by a reaction colorimetric assay of the production of ⁇ -galactosidase.
  • the interaction between the two hybrid proteins therefore allows the activation of the His3 gene and the growth of yeasts on a medium without histidine on the one hand, as well as the activation of the LacZ gene and a colorimetric reaction on the other hand.
  • mice or other animals by immunization of mice or other animals with synthetic phosphorylated peptides representative of protein phosphorylation sites.
  • synthetic phosphorylated peptides representative of protein phosphorylation sites.
  • These antibodies will be used on a yeast lysate expressing the protein and its specific partner, in a conventional test of antigen-antibody reaction, either by western blot or by Elisa (Harlow & Lane, supra).
  • the specificity of the antico ⁇ s for the exclusive recognition of the phosphorylated form will be verified by absence of reactivity with the mutated protein on the phosphorylation sites.
  • the specific antico ⁇ s of the phosphorylated form S32S36 of I ⁇ B (Biolab) is used which make it possible to demonstrate that the yeast causes the phosphorylation of I ⁇ B on its phosphorylation motif by yeast endogenous protein kinases, even if there are no corresponding human cell kinases in yeast, homologs of these kinases (identifiable by current sequence comparison methods) and substrates.
  • the screening for phosphorylation inhibitors will be carried out by a double-hybrid test with the phosphorylation-dependent interaction (s). There are two ways to select inhibitors:
  • the screening tests for interaction inhibitors may be carried out by conventional double hybrid as described above (Fields & Song, 1989, supra; Bartel P & Fields S. Meth. Enzymol., 254, 241-263, 1995) , by conjugation (Fromont-Racine et al., nature Genetics, 16, 277-282, 1997), by hybrid reverse (Vidal et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 10315-10320), by double -hybrid membrane (Broder et al., Curr. Biol., 8, 1121-1124, 1998), by triple-hybrid (Tirode et al., J. Biol.
  • a reactivity test is carried out between the specific antico ⁇ s of the phosphorylated form of the protein and a yeast lysate expressing said protein in the presence of the inhibitor to determine the specificity of said inhibitors. If the reactivity test with said antico ⁇ s (Western Blot or Elisa, for example) is negative, it will make it possible to conclude that the inhibitor acts well as an inhibitor of phosphorylation. If the reactivity test with said antico ⁇ s is positive, it will make it possible to conclude that the inhibitor acts at the interaction level, but not at the phosphorylation level.
  • the screening method of the invention which makes it possible to identify inhibitors of phosphorylation, is very useful in pathological states in which one of the elements leading to these states needs to be phosphorylated. This is the case for example of inflammatory phenomena triggered by the following process:
  • the protein I ⁇ B which exists in different forms ( ⁇ , ⁇ , ⁇ ), is the major inhibitor of the transcription factor NFKB, which maintains it in the form of an inactive complex in the cytoplasm (Beg A. et al ., Genes and Dev., 7, 2064-2070, 1993).
  • NFKB transcription factor 1
  • TNF tumor necrosis factor
  • the protein I ⁇ B is phosphorylated on the serine residues S32 and S36. This phosphorylation very quickly leads to the ubiquitinylation of the protein and its targeting towards degradation by the proteasome.
  • the active NFKB factor for example in the form of two subunits P50 and P65, is then released, imported into the nucleus where it will be able to activate very many genes and in particular cause said inflammatory phenomena.
  • the method of the present invention makes it possible to find inhibitors of the phosphorylation of I ⁇ B.
  • the ⁇ -catenin protein a cellular protein controlling the essential signal transduction pathways, such as the Wingless pathways (MILLER et al., Genes and Dev. 10, 2527-2539, 1996 and POLAKIS , P., Biochim. Biophys. Acta 1332, F 127-47, 1997), accumulates in cells cancer, either as a result of mutations which prevent phosphorylation on serine residues 33 and 37 (mutated ⁇ -catenin proteins), or as a result of mutations of its co-factor, the APC protein, which is necessary for its degradation.
  • Wingless pathways such as the Wingless pathways
  • ⁇ -catenin linked to its non-degradation, leads to its import into the nucleus and to the activation of genes controlled by TCF-LEF promoters, which causes phenomena of cell transformation and proliferation.
  • Another object of the present invention therefore relates to a method of screening for yeast positive modulators of interaction between a mutated protein on its phosphorylation sites and the partner of said normal phosphorylated protein, characterized in that it comprises the stages consisting to: a) cotransform the yeast Saccharomyces cerevisiae with a double-hybrid vector containing the cDNA of said mutated protein fusion either with a DNA binding domain or with an activation domain and a double-hybrid vector containing the cDNA of a specific partner of said normal protein in fusion either with a DNA binding domain or with an activation domain, causing said yeast to express said mutated protein and said specific partner in a culture medium according to the conditions of the double-hybrid, verify by the double-hybrid method that there is interaction between said normal protein and said partner, and that there is no interaction with said mutated protein, and verifying by a reaction with an antico ⁇ s specific for the phosphorylated form of the normal protein that said normal protein
  • normal phosphorylated protein partner is intended to mean any protein partner capable of interacting with the normal protein, therefore not mutated, when the latter has been phosphorylated.
  • step c) The sequencing technique used in step c) is widely described by Ausubel et al. (supra, chapter 3).
  • step d) The determination of the specificity of the positive modulators described in step d) is based on the result of the reaction with the specific antico ⁇ s of the phosphorylated form of the normal protein. If the reaction is positive, this means that the positive modulator has made it possible to recover the conformation of the phosphorylated protein: it is therefore an activator of phosphorylation. If the reaction is negative, this means that the positive modulator has enabled the interaction: it is therefore an activator of the interaction between the mutated protein and the specific partner of the normal protein.
  • FIGS. 1 and 2 The description below will be better understood with the aid of FIGS. 1 and 2 in which:
  • FIG. 1 is the photograph in a Petri dish showing the growth of Saccharomyces cerevisiae cells cotransformed by the plasmids containing ⁇ TrCP + I ⁇ ; ⁇ TrCP + I ⁇ S32-36A; ⁇ TrCP + Raf; Ras + I ⁇ ; ⁇ TrCP + Vpuc and Ras + Raf on a medium in the presence of histidine (His +), that is to say not selective for interaction, on a medium devoid of histidine (His-), that is to say say selective for the interaction, and on a medium making it possible to detect the production of ⁇ -galactosidase, which depends on the interaction, in the presence of the substrate of ⁇ -galactosidase X-Gal ( ⁇ -Gal),
  • FIG. 2 is the photograph of a western blot of a lysate of the strain Saccharomyces cerevisiae L40 expressing the activation domain of the protein Gal4 fused respectively to the proteins Raf, I ⁇ B ⁇ and I ⁇ B ⁇ S32-36A in the presence of anti -I ⁇ B ⁇ and anti-I ⁇ B ⁇ S32 P.
  • the cDNA of the proteins described below was fused either to the activation domain of the transcription of Gal4 (Gal4D) in the vector pGAD1318 (Bartel PL. El al. In Cellular Interactions In development: a practical approach , DA Hartley editor, IRL Press Oxford), or to the DNA binding domain of LexA (LexABD) in the vector pBTMl 16 (Bartel PL. Et al., Supra):
  • I ⁇ B ⁇ S32-36A mutant of I ⁇ B ⁇ at the level of serines S32 and S36 so that there is no phosphorylation.
  • the h- ⁇ TrCP protein cDNA was fused to the binding domain of
  • LexA and those of I ⁇ B ⁇ and I ⁇ B ⁇ S32-36A were merged into the domain of activation of the transcription of Gal4.
  • Vpuc cytoplasmic Vpu protein as described in Margottin et al. (1998, supra). Ras cDNA has been fused to the binding domain of LexA and those of
  • Example 2 Use of phosphorylated anti-I ⁇ B antico ⁇ s for the screening of phosphorylation inhibitors
  • Antico ⁇ s 9241S specific for the phosphorylated form of I ⁇ B ⁇ recognized in western blot (WB) the normal protein expressed in yeast (right panel). Neither the protein mutated on its S32S36 phosphorylation sites, nor the Raf control protein were recognized (right panel). In contrast, antibody 10B which recognizes all forms of IKBCC reacted with the normal protein and the mutated protein, but not with the control protein Raf.

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Abstract

La présente invention concerne un procédé de criblage en levure d'inhibiteurs de protéine-kinases spécifiques de cellules eucaryotes supérieures, y compris les cellules humaines, caractérisé en ce qu'il consiste à: a) faire exprimer le ou les substrats de ces protéine-kinases et le ou les partenaires d'interaction spécifiques de ce ou ces substrats de protéine-kinases en système double-hybride dans la levure Saccharomyces cerevisiae dans un milieu de croissance sélectif en présence d'agents inhibiteurs potentiels des interactions phosphorylation-dépendantes dudit ou desdits substrats avec son ou leur partenaire spécifique, b) cribler dans ledit système double-hybride pour lesdits inhibiteurs de protéine-kinases, et c) déterminer la spécificité des inhibiteurs obtenus dans l'étape b) par une réaction avec un anticorps spécifique de la forme phosphorylée des substrats. Elle concerne également un procédé de criblage en levure de modulateurs positifs de protéine-kinases spécifiques de cellules eucaryotes supérieures, y compris les cellules humaines.

Description

Procédé de criblage en levure de modulateurs de protéine-kinases spécifiques de cellules eucaryotes supérieures, y compris les cellules humaines
La présente invention concerne un procédé de criblage en levure de modulateurs positifs et négatifs de protéine-kinases spécifiques de cellules eucaryotes supérieures, y compris les cellules humaines.
Dans la présente description, on entend par "modulateurs négatifs" des inhibiteurs et par "modulateurs positifs" des activateurs.
La régulation de la plupart des voies métaboliques et de transduction de signaux dans les cellules humaines, et plus généralement dans les cellules eucaryotes supérieures, est effectuée par des réactions de phosphorylation/déphosphorylation (Hunter T., Oncoproteins network, Cell, 88, 333-346, 1997). Identifier les protéine- kinases responsables de ces phosphorylations, et isoler des modulateurs positifs ou négatifs de leur activité, devrait permettre de développer de nouveaux médicaments pour le contrôle de processus pathologiques majeurs tels que cancers, inflammation, maladies infectieuses, etc.
L'étude de l'activité catalytique des protéine-kinases, l'identification de leurs substrats in vivo et a fortiori l'isolement de modulateurs positifs ou négatifs de leur activité, exige souvent une méthodologie très lourde de marquage de la protéine phosphorylée avec du phosphate radioactif, d'immunoprécipitation et purification de cette protéine, d'identification des sites phosphorylés après clivage, séparation et détection des peptides comprenant les sites phosphorylés. Ce type d'étude in vivo est très complexe et difficile à utiliser pour mettre en évidence des modulateurs d'activité de protéine-kinases par criblage à grande échelle. In vitro, cette technologie est également trop lourde pour être communément appliquée à des criblages d'inhibiteurs. Par ailleurs, pour effectuer ce type d'étude in vitro, il faut disposer de la protéine-kinase purifiée ou recombinante. La purification d'une protéine-kinase est une opération compliquée et la protéine recombinante, produite le plus souvent dans des bactéries, n'est pas dans une conformation "native" et perd en général sa spécificité pour un substrat.
Il existe maintenant une banque, en extension rapide, d'anticorps reconnaissant spécifiquement les formes phosphorylées de certaines protéines (Catalogue Biolabs 1998). Ces anticorps anti-phosphoprotéines sont souvent disponibles dans le commerce. Cependant, utilisés tels quels, ces anticorps ne peuvent pas non plus permettre la mise en oeuvre aisée d'un criblage à grande échelle de modulateurs d'une protéine-kinase, par une utilisation classique en immunoblotting, Elisa ou immunoprécipitation sur des lysats de cellules humaines exprimant les protéine-kinases d'intérêt (Harlow, E. & Lane D., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1998).
On a maintenant découvert un nouveau procédé de criblage de modulateurs de protéine-kinases spécifiques de cellules eucaryotes supérieures, y compris les cellules humaines, qui permet de surmonter les problèmes de méthodologie de l'art antérieur décrits ci-dessus.
Ce procédé consiste 1) à détecter les modifications des propriétés d'interaction d'une protéine, qui est le substrat d'une protéine kinase et qui se lie à un partenaire spécifique, par un test double-hybride en levure, et 2) à détecter son état de phosphorylation par des anticorps capables de reconnaître la protéine phosphorylée par rapport à la même protéine non phosphorylée. Par la combinaison de ces deux techniques, il est possible, par simple criblage double-hybride de modulateurs d'interaction, de trouver des modulateurs de l'activité protéine-kinase responsable de la phosphorylation de la protéine. Dans la suite de la présente description, on parlera indifféremment de substrat de protéine-kinase ou de protéine pour les composés protéiques qui peuvent être phosphorylés par une protéine-kinase et interagir avec un partenaire spécifique.
Le procédé de criblage de l'invention est basé sur l'expression dans la levure des substrats de protéine-kinases spécifiques de cellules eucaryotes supérieures, y compris les cellules humaines. L'expression dans la levure permet de détecter la phosphorylation desdits substrats par des protéine-kinases endogènes à la levure, en l'absence de toute coexpression des protéine-kinases qui assurent leur phosphorylation dans les cellules eucaryotes supérieures, y compris les cellules humaines. Après détection de cette phosphorylation, on peut rechercher des modulateurs de la phosphorylation desdits substrats de protéine-kinases. Le principe et l'application du présent procédé repose sur le fait que, si une protéine-kinase de levure est capable de phosphoryler spécifiquement un substrat de protéine-kinase de cellules eucaryotes supérieures, y compris les cellules humaines, alors un composé capable d'inhiber ou d'activer spécifiquement l'activité de cette kinase de levure sur ce substrat est également capable d'inhiber la même activité exercée par la kinase humaine sur ce substrat ou constitue un composé de choix pour l'isolement d'un tel modulateur.
Ainsi, la présente invention a pour objet un procédé de criblage en levure d'inhibiteurs de protéine-kinases spécifiques de cellules eucaryotes supérieures, y compris les cellules humaines, caractérisé en ce qu'il consiste à : a) faire exprimer le ou les substrats de ces protéine-kinases et le ou les partenaires d'interaction spécifiques de ce ou ces substrats de protéine-kinases en système double-hybride dans la levure Saccharomyces cerevisiae dans un milieu de croissance sélectif en présence d'agents inhibiteurs potentiels des interactions phosphorylation-dépendantes dudit ou desdits substrats avec son ou leur partenaire spécifique, b) cribler dans ledit système double-hybride pour lesdits inhibiteurs de protéine-kinases, et c) déterminer la spécificité des inhibiteurs obtenus dans l'étape b) par une réaction avec un anticorps spécifique de la forme phosphorylée des substrats.
Dans le cas où on veut vérifier que le substrat de protéine-kinase est bien spécifiquement phosphorylé par la levure, ce qui lui permet alors de se lier avec son partenaire, il est nécessaire d'effectuer préalablement au procédé ci-dessus les étapes a) et b) ci-après. Ainsi, la présente invention a également pour objet un procédé de criblage en levure d'inhibiteurs de protéine-kinases spécifiques de cellules eucaryotes supérieures, y compris les cellules humaines, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant à : a) cotransformer la levure Saccharomyces cerevisiae par un vecteur double- hybride contenant l'ADNc de la protéine substrat de protéine-kinase en fusion soit avec un domaine de liaison à l'ADN, soit avec un domaine d'activation, et un vecteur double-hybride contenant l'ADNc d'un partenaire spécifique de ladite protéine en fusion soit avec un domaine de liaison à l'ADN, soit avec un domaine d'activation, faire exprimer par la levure ladite protéine et ledit partenaire spécifique dans un milieu de culture selon les conditions classiques de double-hybride, vérifier par la méthode double-hybride qu'il y a interaction entre ladite protéine et ledit partenaire spécifique et vérifier par une réaction avec un anticorps spécifique de la forme phosphorylée de la protéine, que ladite protéine est reconnue par ledit anticorps, b) vérifier qu'un mutant des sites de phosphorylation de la protéine n'interagit pas en test double-hybride avec ledit partenaire et qu'il n'est pas reconnu par ledit anticorps spécifique de la forme phosphorylée de la protéine, c) ajouter dans le milieu de croissance sélectif des levures cotransformées soumises au test double-hybride des agents inhibiteurs potentiels de l'interaction entre ladite protéine et ledit partenaire spécifique et sélectionner tous les agents capables d'inhiber l'interaction entre ladite protéine et ledit partenaire spécifique, d) déterminer la spécificité des inhibiteurs obtenus dans l'étape c) par une réaction avec un anticorps spécifique de la forme phosphorylée de la protéine en sélectionnant d'une part les inhibiteurs capables d'inhiber la phosphorylation (test avec l'anticorps négatif) et d'autre part les inhibiteurs capables d'inhiber l'interaction sans inhiber la phosphorylation (test avec l'anticorps positif). Par protéine-kinases spécifiques de cellules eucaryotes supérieures, y compris les cellules humaines, telles qu'utilisées dans la présente description, on entend des protéine-kinases qui n'existent que dans les cellules eucaryotes supérieures, y compris les cellules humaines, et qui n'existent pas dans la levure.
En effet, dans les cellules humaines et mammifères, on estime le nombre total de protéine-kinases à un millier (Hunter T., Cell, 80, 225-236, 1995). Depuis la disponibilité de la séquence complète du génome de levure, on estime que le nombre total de protéine-kinases dans la levure s'élève environ à 120 (Hunter T. and Plowman G.D., Reviews, Tibs 22, 18-21, 1997).
Parmi les protéine-kinases, on connaît certaines kinases qui sont relativement bien conservées de la levure jusqu'à l'homme et qui régulent quelques grandes voies de transduction de signal, comme les protéine-kinases A, les MAP kinases, les kinases du cycle cellulaire, la caséine-kinase II, etc. Ces protéine-kinases humaines peuvent complémenter les kinases correspondantes de levure dont le gène a été invalidé.
Mais de telles kinases sont finalement très minoritaires. Le plus souvent, les protéine-kinases humaines très spécialisées, responsables du contrôle de voies métaboliques très spécifiques des cellules humaines ou d'eucaryotes supérieurs, n'ont pas leur homologue dans la levure. C'est le cas des tyrosine-kinases ou même des sérine/thréonine-kinases très spécialisées, comme par exemple IKKα et IKKβ, qui sont responsables de la phosphorylation des IκB, qui sont eux-mêmes les inhibiteurs qui contrôlent l'activation du facteur de transcription NFKB (Mercurio et al., Science, 278, 860-866, 1997). On ne connaît pas d'équivalent à IKKα et IKKβ ou à IκB et NFKB dans la levure. On ne pouvait donc pas généralement espérer pouvoir utiliser la levure pour l'étude in vivo de ces kinases très spécialisées spécifiques des régulations de voies métaboliques majeures des cellules humaines. Par substrats de protéine-kinases spécifiques de cellules eucaryotes supérieures, y compris les cellules humaines, tels qu'utilisés dans la présente description, on entend des substrats protéiques qui sont phosphorylés dans lesdites cellules eucaryotes supérieures, y compris les cellules humaines, par lesdites protéine-kinases Par partenaire spécifique du substrat, ou protéine, on entend un partenaire protéique capable d'une interaction avec ledit substrat lorsque celui-ci a été phosphorylé.
Les phosphorylations/déphosphorylations s'accompagnent souvent de modifications dans la capacité d'une protéine à interagir avec une autre protéine. Ces modifications d'interaction sont à la base de la régulation des voies métaboliques et de la transmission de signaux dans la cellule. C'est ainsi par exemple que IκB ou la β-caténine interagissent avec la h-βTrCP uniquement sous forme phosphorylée, ce qui cause la dégradation de la forme phosphorylée de la protéine, alors que la forme déphosphorylée est résistante à la dégradation (Margottin et al., Molecular Cell, 1(4), 565-574, 1998). La protéine Pho4 interagit avec la protéine Mns5 uniquement quand elle est phosphorylée, ce qui conduit à son exportation du noyau. La protéine Pho4 déphosphorylée qui est incapable d'interagir avec la protéine Mns5 va interagir spécifiquement avec la protéine Psel, ce qui va conduire à son importation dans le noyau. Pho4 phosphorylée est incapable d'interagir avec Psel (Kaffman A. et al., Nature, 396, 482-486, 1998). A titre de substrat de protéine-kinase, c'est-à-dire de protéine pouvant être phosphorylée, on cite spécifiquement la protéine IκB, son partenaire spécifique étant la protéine humaine βTrCP telle que décrit par Margottin et al. (Molecular Cell, Vol. 1, 565-574, 1998).
Dans le procédé de la présente invention, on vérifie tout d'abord que l'interaction détectée en système double-hybride pour une protéine donnée avec un partenaire donné est une interaction dépendante de la phosphorylation de la protéine. Pour cela une protéine mutée sur ses sites de phosphorylation et qui ne peut donc être phosphorylée sera utilisée, en fusion avec un domaine de liaison à l'ADN ou d'activation de la transcription, dans le test double-hybride décrit par Fields & Song, (Nature, 340, 245-246, 1989 et US 5,667,973, incorporés dans la présente description à titre de référence), soit avec un partenaire particulier soit avec une banque d'ADN complémentaires fusionnés également avec un domaine d'activation de la transcription. La ou les interactions dépendantes de la phosphorylation sont celles qui seront positives avec la protéine normale et négatives avec la protéine mutée. Ceci ne peut être fait que si l'on connaît au préalable les sites de phosphorylation de la protéine, ce qui est le cas de nombreuses phosphoprotéines (Catalogue Biolabs 1998- 1999).
Le test double-hybride, bien connu de l'homme du métier, est basé sur la détection, dans un milieu sélectif, des interactions protéine -protéine par activation du gène rapporteur His ou LacZ sous le contrôle de domaines de l'activateur transcriptionnel Gal4 dans la levure.
Dans ce système double-hybride, on cotransforme une levure par un vecteur double-hybride contenant l'ADNc de l'une des protéines et un vecteur contenant l'ADNc de l'autre protéine, chacun desdits vecteurs contenant soit un domaine de liaison à l'ADN, soit un domaine d'activation de la transcription. On fait ensuite exprimer par la levure les deux protéines dans un milieu de culture sélectif tel que décrit par Bartel P. et Fields S. (Meth. Enzymol., 254, 241-263, 1995). Le milieu sélectif est soit un milieu dépourvu d'histidine qui permet de détecter l'activation du gène rapporteur His3 provoquant la pousse des levures sans histidine, soit un milieu qui permet de détecter l'activation du gène rapporteur LacZ qui est révélée par une réaction de dosage colorimétrique de la production de β-galactosidase. L'interaction entre les deux protéines hybrides permet donc l'activation du gène His3 et la croissance des levures sur un milieu sans histidine d'une part, ainsi que l'activation du gène LacZ et une réaction colorimétrique d'autre part. On peut donc vérifier l'interaction soit par un test colorimétrique, soit par croissance des levures sur un milieu sans histidine, soit par les deux tests.
L'insertion des ADNc dans les vecteurs, leur production, ainsi que la transformation et la croissance des levures seront effectuées par les techniques classiques bien connues de l'homme du métier (Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology). On vérifie ensuite que la protéine qui interagit est bien phosphorylée. Le moyen le plus simple de contrôler la phosphorylation de la protéine consiste par exemple à utiliser des anticoφs spécifiques de la forme phosphorylée de la protéine. Des anticoφs spécifiques de la forme phosphorylée de nombreuses phosphoprotéines ou anticoφs anti-phosphoprotéines sont disponibles, y compris commercialement (Catalogue Biolabs 1998-1999). Dans le cas contraire de tels anticoφs peuvent être obtenus par le procédé de Kohler et Milstein (Nature, 256, 490-497, 1975) ou de Harlow E. et Lane D. (supra), par immunisation de souris ou autres animaux avec des peptides synthétiques phosphorylés représentatifs des sites de phosphorylation de la protéine. Ces anticoφs seront utilisés sur un lysat de levure exprimant la protéine et son partenaire spécifique, dans un test classique de réaction antigène-anticoφs, soit par western blot, soit par Elisa (Harlow & Lane, supra). La spécificité des anticoφs pour la reconnaissance exclusive de la forme phosphorylée sera vérifiée par absence de réactivité avec la protéine mutée sur les sites de phosphorylation.
Dans le cas de la kinase IκB, on utilise les anticoφs spécifiques de la forme phosphorylée S32S36 de IκB (Biolab) qui permettent de démontrer que la levure provoque la phosphorylation de IκB sur son motif de phosphorylation par des protéine-kinases endogènes de levure, même s'il n'existe pas chez la levure les kinases de cellules humaines correspondantes, des homologues de ces kinases (identifiables par les méthodes actuelles de comparaison de séquence) et les substrats. Le criblage d'inhibiteurs de la phosphorylation sera effectué par test double- hybride avec la ou les interactions phosphorylation-dépendantes. On peut sélectionner les inhibiteurs de deux façons :
1) soit à partir de l'expression dans la levure de banques aléatoires de peptides selon la technique de Colas P. et al. (Nature, 380, 548-550, 1996) ; 2) soit en ajoutant des inhibiteurs potentiels au milieu de culture des levures sélectif pour l'interaction, par exemple le milieu sans histidine tel que décrit par Fields & Song (US 5,667,973). Ces inhibiteurs devront pénétrer dans la levure et inhiber la croissance des levures sur milieu sélectif pour l'interaction, mais pas sur milieu non sélectif, par inhibition de la ou les interactions phosphorylation- dépendantes. De même ces inhibiteurs ne devront pas inhiber la croissance de levures cotransformées avec deux protéines témoins d'interaction comme Ras et Raf par exemple (Margottin et al., 1998, supra). L'activité de ces inhibiteurs pourra également être détectée par inhibition de la production de β-galatosidase.
Les tests de criblage d'inhibiteurs d'interaction pourront être effectués par double-hybride classique tel que décrit précédemment (Fields & Song, 1989, supra ; Bartel P & Fields S. Meth. Enzymol., 254, 241-263, 1995), par conjugaison (Fromont-Racine et al., nature Genetics, 16, 277-282, 1997), par réverse hybride (Vidal et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 10315-10320), par double-hybride membranaire (Broder et al., Curr. Biol., 8, 1121-1124, 1998), par triple-hybride (Tirode et al., J. Biol. Chem., 272, 22995-22999, 1997) et éventuellement, si les phosphorylations peuvent prendre place dans les bactéries, par double-hybride bactérien (Karimova et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 5752-5756, 1998). On pourra également utiliser le test du halo (Valtz & Peter, Meth. Enzymol. 283, 350- 365, 1997). Toutes ces techniques pourront donner lieu à des tests automatisées, sur plaques de microtitration. Une fois les inhibiteurs sélectionnés après le criblage double-hybride décrit ci-dessus, on effectue un test de réactivité entre les anticoφs spécifiques de la forme phosphorylée de la protéine et un lysat de levure exprimant ladite protéine en présence de l'inhibiteur pour déterminer la spécificité desdits inhibiteurs. Si le test de réactivité avec lesdits anticoφs (Western Blot ou Elisa, par exemple) est négatif, il permettra de conclure que l'inhibiteur agit bien comme un inhibiteur de la phosphorylation. Si le test de réactivité avec lesdits anticoφs est positif, il permettra de conclure que l'inhibiteur agit au niveau de l'interaction, mais pas au niveau de la phosphorylation. Le procédé de criblage de l'invention, qui permet d'identifier des inhibiteurs de phosphorylation, est très utile dans les états pathologiques dans lesquels un des éléments conduisant à ces états a besoin d'être phosphorylé. C'est le cas par exemple des phénomènes inflammatoires déclenchés par le processus suivant :
La protéine IκB, qui existe sous différentes formes (α, β, ε), est l'inhibiteur majeur du facteur de transcription NFKB, qui maintient celui-ci sous la forme d'un complexe inactif dans le cytoplasme (Beg A. et al., Gènes and Dev., 7, 2064-2070, 1993). Après stimulation des cellules par des facteurs tels que l'interleukine 1 (IL1) et le facteur de nécrose tumorale (TNF), la protéine IκB est phosphorylée sur les résidus serine S32 et S36. Cette phosphorylation conduit très rapidement à l'ubiquitinylation de la protéine et à son ciblage vers la dégradation par le protéasome . Le facteur NFKB actif, par exemple sous la forme de deux sous-unités P50 et P65, est alors libéré, importé dans le noyau où il va pouvoir activer de très nombreux gènes et entraîner notamment lesdits phénomènes inflammatoires. Pour lutter contre ces phénomènes inflammatoires, le procédé de la présente invention permet de trouver des inhibiteurs de la phosphorylation de IκB.
Dans d'autres états pathologiques, il faut au contraire activer la phosphorylation d'une protéine pour empêcher le développement de ces états. Par exemple, dans le cas de certains cancers, la protéine β-caténine, protéine cellulaire contrôlant les voies essentielles de transduction de signaux, comme les voies Wingless (MILLER et al., Gènes and Dev. 10, 2527-2539, 1996 et POLAKIS, P., Biochim. Biophys. Acta 1332, F 127-47, 1997), s'accumule dans les cellules cancéreuses, soit par suite de mutations qui empêchent la phosphorylation sur les résidus serine 33 et 37 (protéines β-caténines mutées), soit par suite de mutations de son co-facteur, la protéine APC, qui est nécessaire à sa dégradation.
L'accumulation de la β-caténine, liée à sa non-dégradation, conduit à son importation dans le noyau et à l'activation de gènes contrôlés par des promoteurs TCF-LEF, ce qui provoque des phénomènes de transformation et prolifération cellulaire.
En utilisant une variante du procédé tel que décrit précédemment, mais en utilisant le mutant des sites de phosphorylation de la protéine d'intérêt qui n'est pas phosphorylé (également appelé protéine mutée) et n'est donc pas capable d'interagir avec le partenaire dont l'interaction est phosphorylation-dépendante, nous pouvons :aire un crible double-hybride pour des modulateurs positifs qui pourraient favoriser l'interaction entre mutant et partenaire en mimant la conformation du site de phosphorylation. Ainsi, un autre objet de la présente invention concerne un procédé de criblage en levure de modulateurs positifs d'interaction entre une protéine mutée sur ses sites de phosphorylation et le partenaire de ladite protéine normale phosphorylée, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant à : a) cotransformer la levure Saccharomyces cerevisiae par un vecteur double- hybride contenant l'ADNc de ladite protéine mutée en fusion soit avec un domaine de liaison de l'ADN, soit avec un domaine d'activation et un vecteur double-hybride contenant l'ADNc d'un partenaire spécifique de ladite protéine normale en fusion soit avec un domaine de liaison à l'ADN, soit avec un domaine d'activation, faire exprimer par la levure ladite protéine mutée et ledit partenaire spécifique dans un milieu de culture selon les conditions du double-hybride, vérifier par la méthode double-hybride qu'il y a interaction entre ladite protéine normale et ledit partenaire, et qu'il n'y a pas d'interaction avec ladite protéine mutée, et vérifier par une réaction avec un anticoφs spécifique de la forme phosphorylée de la protéine normale que ladite protéine normale est reconnue par ledit anticoφs, mais que ladite protéine mutée n'est pas reconnue, b) ajouter dans le milieu de croissance sélectif des levures cotransformees soumises au test double-hybride des agents modulateurs positifs potentiels de l'interaction entre ladite protéine mutée et ledit partenaire de ladite protéine normale et sélectionner tous les agents capables d'activer l'interaction entre ladite protéine mutée et le partenaire de ladite protéine normale, c) vérifier par séquençage d'ADN qu'aucune mutation de réversion au type sauvage n'a été introduite dans ladite protéine mutée mise en présence du modulateur, et d) déterminer la spécificité des modulateurs positifs obtenus dans l'étape b) par une réaction avec un anticoφs spécifique de la forme phosphorylée de la protéine normale.
On entend par partenaire de la protéine normale phosphorylée, tout partenaire protéique capable d'interagir avec la protéine normale, donc non mutée, lorsque celle-ci a été phosphorylée. Les techniques utilisées dans les étapes a) et b) sont telles que décrites précédemment.
La technique de séquençage utilisée dans l'étape c) est largement décrite par Ausubel et al. (supra, chapitre 3).
La détermination de la spécificité des modulateurs positifs décrite dans l'étape d) est basée sur le résultat de la réaction avec les anticoφs spécifiques de la forme phosphorylée de la protéine normale. Si la réaction est positive, cela signifie que le modulateur positif a permis de récupérer la conformation de la protéine phosphorylée : c'est donc un activateur de phosphorylation. Si la réaction est négative, cela signifie que le modulateur positif a permis l'interaction : c'est donc un activateur de l'interaction entre la protéine mutée et le partenaire spécifique de la protéine normale.
La description ci-après sera mieux comprise à l'aide des figures 1 et 2 sur lesquelles :
- la figure 1 est la photographie en boîte de Pétri montrant la croissance de cellules de Saccharomyces cerevisiae cotransformees par les plasmides contenant βTrCP + Iκβ ; βTrCP + Iκβα S32-36A ; βTrCP + Raf ; Ras + Iκβα ; βTrCP + Vpuc et Ras + Raf sur un milieu en présence d'histidine (His+), c'est-à-dire non sélectif pour l'interaction, sur un milieu dépourvu d'histidine (His-), c'est-à-dire sélectif pour l'interaction, et sur un milieu permettant de détecter la production de β- galactosidase, qui dépend de l'interaction, en présence du substrat de la β- galactosidase X-Gal (β-Gal),
- la figure 2 est la photographie d'un western blot d'un lysat de la souche Saccharomyces cerevisiae L40 exprimant le domaine d'activation de la protéine Gal4 fusionné respectivement aux protéines Raf, IκBα et IκBα S32-36A en présence d'anticoφs anti-IκBα et anti-IκBαS32P.
Exemple 1 : Mise en évidence de l'interaction entre la protéine Iκβ et la protéine h-βTrCP
On a réalisé un test double-hybride avec la protéine Iκβ et la protéine h- βTrCP (Margottin et al., 1998, supra) en utilisant la levure Saccharomyces cerevisiae L40 (Hollenberg et al. Mol. Cell. Biol., 15, 3813-3822, 1995).
Pour ce faire, on a fusionné l'ADNc des protéines décrites ci-dessous soit au domaine d'activation de la transcription de Gal4 (Gal4D) dans le vecteur pGAD1318 (Bartel PL. el al. dans Cellular Interactions In development : a practical approach, D.A. Hartley editor, IRL Press Oxford), soit au domaine de liaison de l'ADN de LexA (LexABD) dans le vecteur pBTMl 16 (Bartel PL. et al., supra) :
- βTrCP = protéine humaine βTrCP,
- IκBα = protéine IκB forme et,
- IκBα S32-36A = mutant de IκBα au niveau des serines S32 et S36 de sorte qu'il n'y a pas phosphorylation. L'ADNc de la protéine h-βTrCP a été fusionné au domaine de liaison de
LexA, et ceux de IκBα et IκBαS32-36A ont été fusionnés au domaine d'activation de la transcription de Gal4.
On a détecté l'interaction sur des milieux sélectifs de croissance. Comme milieux de croissance, on a utilisé un milieu avec histidine (His+), un milieu sélectif pour l'interaction sans histidine (His-) et un milieu sélectif permettant la mise en évidence de la production de β-galactosidase (β-Gal). Comme classiquement décrit dans le système double-hybride, la pousse des levures en absence d'histidine et la production de β-galactosidase sont des témoins montrant l'interaction.
A titre de comparaison, on a réalisé le même test avec les protéines ci- dessous :
- Ras = protéine contrôle,
- Raf = protéine contrôle,
- Vpuc = protéine Vpu cytoplasmique telle que décrite dans Margottin et al. (1998, supra). L'ADNc de Ras a été fusionné au domaine de liaison de LexA et ceux de
Raf et Vpu ont été fusionnés au domaine d'activation de la transcription de Gal4. Le résultat de ces tests sont donnés sur la figure 1. Sur cette figure, il est montré que :
- les deux protéines h-βTrCP et IκB sont capables d'interagir, - l'interaction h-βTrCP/IκB est spécifique des deux hybrides puisque, lorsque l'un des deux hybrides est remplacé par un hybride avec une autre protéine telle que Gal4AD-Raf ou LexABD-Ras, il n'y a plus interaction, alors que ces deux hybrides contrôles sont capables d'interagir, et
- cette interaction est perdue quand les résidus serines S32 et S36 de la protéine IκB sont mutés en résidus non phosphorylables comme Alanine.
Il est à noter qu'on observe également une interaction, déjà décrite par Margottin et al. (1998, supra), entre la protéine Vpu du virus HIV-1 et la protéine h- βTrCP.
Exemple 2 : Utilisation des anticoφs anti- IκB phosphorylée pour le criblage d'inhibiteurs de phosphorylation
On a réalisé un lysat en tampon Laemli 1%SDS (Ausubel et al., chapitre 10.7, supra), de la souche Saccharomyces cerevisiae L40 exprimant le domaine d'activation de la protéine Gal4 fusionné respectivement aux protéines Raf, IκBα, IκBα muté sur les résidus serine S32 et S36 remplacés tous deux par un résidu alanine. Après migration électrophorétique en gel SDS-polyacrylamide 8%, on a transféré les lysats sur membrane de nitrocellulose et on a effectué un Western Blot soit avec des anticoφs contre la protéine IκB reconnaissant toutes les formes de la protéine (anticoφs monoclonal 10B, Jaffray et al. Mol. Cell. Biol., 15, 2166-2172, 1995) (α-IκBα), soit contre des anticoφs spécifiques de la forme phosphorylée de la protéine (9241S, New England Biolabs) (α-IκB S32P).
Les anticoφs 9241S spécifiques de la forme phosphorylée de IκBα ont reconnu en western blot (WB) la protéine normale exprimée dans la levure (panneau de droite). Ni la protéine mutée sur ses sites de phosphorylation S32S36, ni la protéine contrôle Raf n'ont été reconnues (panneau de droite). En revanche, l'anticoφs 10B qui reconnaît toutes le formes de IKBCC a réagi avec la protéine normale et la protéine mutée, mais pas avec la protéine contrôle Raf.
Cette expérience démontre que IκBα est bien phosphorylée dans la levure sur ses sites "canoniques" de phosphorylation, malgré l'absence dans la levure de protéine-kinases analogues aux IKK humaines.
La combinaison des expériences illustrées dans les figures 1 et 2 démontre la faisabilité des criblages de modulateurs de phosphorylation proposés dans ce brevet.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de criblage en levure d'inhibiteurs de protéine-kinases spécifiques de cellules eucaryotes supérieures, y compris les cellules humaines, caractérisé en ce qu'il consiste à : a) faire exprimer le ou les substrats de ces protéine-kinases et le ou les partenaires d'interaction spécifiques de ce ou ces substrats de protéine-kinases en système double-hybride dans la levure Saccharomyces cerevisiae dans un milieu de croissance sélectif en présence d'agents inhibiteurs potentiels des interactions phosphorylation-dépendantes dudit ou desdits substrats avec son ou leur partenaire spécifique, b) cribler dans ledit système double-hybride pour lesdits inhibiteurs de protéine-kinases, et c) déterminer la spécificité des inhibiteurs obtenus dans l'étape b) par une réaction avec un anticoφs spécifique de la forme phosphorylée des substrats.
2. Procédé de criblage en levure d'inhibiteurs de protéine-kinases spécifiques de cellules eucaryotes supérieures, y compris les cellules humaines, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant à : a) cotransformer la levure Saccharomyces cerevisiae par un vecteur double- hybride contenant l'ADNc de la protéine substrat de protéine kinase en fusion soit avec un domaine de liaison à l'ADN, soit avec un domaine d'activation, et un vecteur double-hybride contenant l'ADNc d'un partenaire spécifique de ladite protéine en fusion soit avec un domaine de liaison à l'ADN, soit avec un domaine d'activation, faire exprimer par la levure ladite protéine et ledit partenaire spécifique dans un milieu de culture selon les conditions classiques de double-hybride, vérifier par la méthode double-hybride qu'il y a interaction entre ladite protéine et ledit partenaire spécifique et vérifier par une réaction avec un anticoφs spécifique de la forme phosphorylée de la protéine, que ladite protéine est reconnue par ledit anticoφs, b) vérifier qu'un mutant des sites de phosphorylation de la protéine n'interagit pas en test double-hybride avec ledit partenaire et qu'il n'est pas reconnu par ledit anticoφs spécifique de la forme phosphorylée de la protéine, c) ajouter dans le milieu de croissance sélectif des levures cotransformees soumises au test double-hybride des agents inhibiteurs potentiels de l'interaction entre ladite protéine et ledit partenaire spécifique et sélectionner tous les agents capables d'inhiber l'interaction entre ladite protéine et ledit partenaire spécifique, d) déterminer la spécificité des inhibiteurs obtenus dans l'étape c) par une réaction avec un anticoφs spécifique de la forme phosphorylée de la protéine en sélectionnant d'une part les inhibiteurs capables d'inhiber la phosphorylation (test avec l'anticoφs négatif) et d'autre part les inhibiteurs capables d'inhiber l'interaction sans inhiber la phosphorylation (test avec l'anticoφs positif).
3. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que ladite protéine est la protéine IκB et son partenaire spécifique est la protéine h-βTrCP.
4. Procédé de criblage en levure de modulateurs positifs entre une protéine mutée sur ses sites de phosphorylation et le partenaire de ladite protéine normale phosphorylée, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant à : a) cotransformer la levure Saccharomyces cerevisiae par un vecteur double- hybride contenant l'ADNc de ladite protéine mutée en fusion soit avec un domaine de liaison de l'ADN, soit avec un domaine d'activation et un vecteur double-hybride contenant l'ADNc d'un partenaire spécifique de ladite protéine normale en fusion soit avec un domaine de liaison à l'ADN, soit avec un domaine d'activation, faire exprimer par la levure ladite protéine mutée et ledit partenaire spécifique dans un milieu de culture selon les conditions du double-hybride, vérifier par la méthode double-hybride qu'il y a interaction entre ladite protéine normale et ledit partenaire, et qu'il n'y a pas d'interaction avec ladite protéine mutée, et vérifier par une réaction avec un anticoφs spécifique de la forme phosphorylée de la protéine normale que ladite protéine normale est reconnue par ledit anticoφs, mais que ladite protéine mutée n'est pas reconnue, b) ajouter dans le milieu de croissance sélectif des levures cotransformees soumises au test double-hybride des agents modulateurs positifs potentiels de l'interaction entre ladite protéine mutée et ledit partenaire de ladite protéine normale et sélectionner tous les agents capables d'activer l'interaction entre ladite protéine mutée et le partenaire de ladite protéine normale, c) vérifier par séquençage d'ADN qu'aucune mutation de réversion au type sauvage n'a été introduite dans ladite protéine mutée mise en présence du modulateur, et d) déterminer la spécificité des modulateurs positifs obtenus dans l'étape b) par une réaction avec un anticoφs spécifique de la forme phosphorylée de la protéine normale.
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