WO1999067394A1

WO1999067394A1 - Vecteur exprimant le gene pleine longueur de virus a arn et son utilisation

Info

Publication number: WO1999067394A1
Application number: PCT/JP1999/003380
Authority: WO
Inventors: Michinori Kohara; Kyoko Kohara; Kazunari Taira; Junichi Matsuzaki; Hiroshi Ohmori
Original assignee: Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
Priority date: 1998-06-24
Filing date: 1999-06-24
Publication date: 1999-12-29
Also published as: AU761012B2; CA2330837C; JP2010046083A; CA2330837A1; EP1090996A4; US6524853B1; AU4393299A; EP1090996A1

Description

明糸田書

RNAウィルスの完全長遺伝子を発現するベクター及びその用途発明の属する技術分野

本発明は、 RNAウィルスの完全長遺伝子を発現することのできるベクター、それを含む動物細胞及び RNAウィルス感染モデル動物、並びにそれらの細胞及びモデル動物を用いて薬物のスクリーニング方法に関する。これらは、 RNA ウィルス複製の機構および RNAゥィルス感染症の発症機構の解明、治療薬および治療手段の開発等に有用である。従来の技術

C型肝炎ウィルス（以下「HCV」という）は、輸血後非 A非 B肝炎の主な原因ゥィルスであり（Saito, I. et al.， Pro Natl. Acad. Sci. USA, 87, 6547-6549 (1990))、このウィルスに起因する肝炎は慢性化率が高く、肝硬変や肝がんに移行する率も高いことから、確実な治療手段の発見が急がれている疾患のひとつである。このウィルスの cDNAは 1989年に Chooらによりクローニングされ（Choo， Q. - L.， et al. , Science, 244, 359-362 (1989))、フラビウィルス科に属する一本鎖 RNAウィルスであることも知られている（Kato, N.， et al.， Pro Natl. Acad. Sci., USA, 87, 9524-9528 (1990))。これまでにいくつかの研究グループにより全塩基配列およびアミノ酸配列の解明がなされいる（Kato， N.， et al., Pro Natl. Acad. Sci. , USA, 87, 9524-9528 (1990)、 Pro Natl. Acad. Sci. , USA, 88， 245卜 2455 (1991)、 J. Virol. , 65， 1105-1113 (1991)、 J. Gen. Virol., 72， 2697-2704 (1991)、 Virology, 188, 331-341 (1992))。

HCVの invitro感染系の確立に関しては、いくつかの報告があるが、その複製量の低さ等の問題で、再現性のある安定な感染系で種々の機構の解明や治療法の開発に活用できるような実用的な系はできていないのが実情である（ Lanf ord， RE， et al., Virology, 202, 606(1994), Yoo, BJ, et al. , J. Vi rol.， 69， 32(1995)， Shimizu, YK， et al.， Pro Natl. Acad. Sci. USA, 89, 5477(1992)， Kato, N. , et al.， Biochem. Biophys. Res. Comm. , 206, 863(1995), Batolini, L.， et al. , Res. Virol. , 144， 281 (1993))。

一方、 HCVを生成する別の手法として、対応する cDNAから転写により、 RNAゥィルスゲノムを生成させ、蛋白質合成を経てウィルスを生成させる方法がある (Racaniello, VR, Science, 214, 916(1981) 、ポリオウイルス）。この方法についてもこれまでいくつかの研究グループにより精力的な検討が行われてきたが、上述の感染系と同様に実用的な系はない（Mizuno, M， et al. , Gastroenterology, 109， 1933(1995), Dash, S.， et al., Am. J. Pathol. , 151, 363(1997) )。また、 cDNAを発現する小動物、たとえば、トランスジエニックマウスについても、一部または全長 cDNAを発現するマウスの報告はあるが、ウィルス遺伝子に対応する全てのウィルス蛋白質を効率良く発現できるようなものは知られていない（特開平 9-9965号公報、特開平 10-84813号公報）。発明の解決しょうとする課題

発明者らのこれまでの研究により、有効な量のウィルス粒子あるいはウィルス蛋白質が生成されない理由として、途中で生成されるウィルスゲノムの両末端が正確に転写されず、効率良く複製可能な完全長の遺伝子が生成していないことが考えられた。

本発明の目的は、完全長のウィルスゲノムを生成する発現系を構築し、より本来のウィルス複製に近い発現系を確立することであり、それを用いて、 cDNAよりウィルスを発現する細胞あるいはモデル動物を樹立することにある。課題を解決するための手段

本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、完全長の RNA ウィルス遺伝子を発現することのできるベクターの構築に成功し、更に、それを組み込んだ細胞株を樹立し、発明を完成するに至った。

すなわち、本発明の第一は、 RNAウィルスの遺伝子をコードする cDNAを含むベクタ一であって、該 RNAウィルスの遺伝子の両末端を正確かつ均一に転写できるように構築されていることを特徴とするベクタ—である。

本発明の第二は、上記のベクタ一を含むことを特徴とする動物細胞である。本発明の第三は、その細胞中に上記のベクタ一を含むことを特徴とする RNAゥィルス感染モデル動物である。

本発明の第四は、上記の動物細胞、又は上記の RNAウィルス感染モデル動物を用いた RNAウィルスの複製を阻害する薬物のスクリ一ニング方法である。本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願（特願平 10- 177820号）の明細書および Zまたは図面に記載される内容を包含する。

発明の開示

以下、本発明を詳細に説明する。

( 1 ) 第一発明（ベクター）

本発明のベクタ一は、 RNAウィルスの遺伝子をコ一ドする cDNAを含むベクタ一であって、該 RNAウィルスの遺伝子の両末端を正確かつ均一に転写できるように構築されていることを特徴とするものである。ここで、「両末端を正確に転写できる」とは、 cDNAから作られる RNAが、ウィルス本来のゲノム RNAと全く同一かあるいは翻訳能力に影響を与えない程度の塩基配列の差異しか存在しない、という意味である。また、「両末端を均一に転写できる」とは、一定の再現性をもって特定の塩基配列を持つ RNAを作ることができる、という意味である。

本発明に使用できる RNAウィルスとしては、ポリオ、コクサツキ一、エコーゥィルス等のピコルナウィルス、レオウィルス、 HCV 等のフラビウィルス属を含むトガウィルス、ォーソ、パラミキソウィルス、コロナウィルス、あるいは、タパコモザイクウイルス等の植物 RNAゥィルスなどを例示することができるが、これらに限定されるわけではない。好ましい RNAウィルスとしては、 HCVを挙げることができる。

RNA ウィルスの遺伝子の両末端を正確かつ均一に転写する手段としては、 RNA ウィルスの遺伝子をコードする cDNAの 5'末端の上流及び 3'末端の下流のそれぞれにセルフプロセッシングにより切断するリボザィムをコードする DNAを配置する方法を例示することができるが、これに限定されるわけではない。

セルフプロセッシングにより切断するリボザィムとしては、 δ型肝炎ウィルス

(Hepatitis Delta Virus: HDV) リボザィム、ハンマーヘッドリボザィム、ヘアピンリボザィム、インビトロおよびィンビボセレクションにより得られる人エリボザィムなどを例示することができる。各リボザィムの塩基配列に関しては、大塚栄子等、蛋白質 '核酸 '酵素 40， 1400(1995) に記載されている。とくに、 HDV リボザィムについては、 Suh, Y-A. , et al. , Nucleic Acids Research, 20, 747(1992)に、ハンマ一ヘッドリボザィムについては、 Shimayama, T.， et al.， Biochemistry, 34, 3649(1995) に塩基配列が記載されている。ベクタ一中に配置するリボザィムをコードする DNAは、これらの文献に記載されている共通塩基配列を参考にして、使用する RNAウィルスの種類、塩基配列に応じて決定することができる。例えば、 HCVの場合は 5'末端側にハンマーへッドリボザィムをコ一ドする DNA (具体的な配列としては配列 Χ)、 3'末端側に HDVリボザィムをコードする DNA (具体的な配列としては配列 Y) が好ましいものとして挙げられる。配列番号 X：

CTGATGAGGCCGAAAGGCCGAAACGGCGAAAGCCGTC (配列番号 7 )

配列番号 Y ：

TGGCGAATGGGAC (配列番号 8 )

本発明のベクタ一は、上述したようなリボザィムをコードする 2つの DNA と RNAウィルスをコードする DNAとを含む DNA断片を PCRなどによリ作製し、この DNA 断片を適当なプロモーターとターミネータ一を含むベクタ一に揷入することにより作製できる。

本発明のベクタ一は、宿主細胞内に移入された後、直ちに発現するものであつてもよいが、特定の処理によりはじめて発現を開始するものの方が好ましい。特定の処理により発現を開始させる手段としては、宿主細胞の RNAポリメラーゼに認識されないプロモータ一を使用する手段、 Cre/lox 発現システム（Nat Sternbe rg et al . J. Mo l ecu l ar B i o l ogy 150. P467-486 、特開平 10- 84813号公報）を使用する手段などを例示することができる。前者の手段では、ベクタ一中のプロモータ一を認識できる RNAポリメラーゼを宿主細胞内で発現させることにより、目的遺伝子の発現を開始させることができる。後者の手段では、 Cre 酵素を宿主細胞内で発現させることにより、目的遺伝子の発現を開始させることができる。

( 2 ) 第二発明（動物細胞）

本発明の動物細胞は、本発明のベクター（第一発明）を含むことを特徴とするものである。

本発明の動物細胞は、本発明のベクタ一を宿主となる動物細胞内に移入することにより作製できる。宿主動物細胞としては、 IMY、 HuH- 7、 HepG2、 M0LT-4、 MT- 2、 Daud i、肝プライマリー細胞、その他の肝細胞、血球系細胞由来の細胞または細胞株などを使用することができるが、これらに限定されるわけではない。ベクタ一を宿主内に移入する方法としては、 L i pofect i on Reagant 法などを例示することができる力これに限定されるわけではない。

( 3 ) 第三発明（RNAウィルス感染モデル動物）

本発明の RNAウィルス感染モデル動物は、その細胞中に本発明のベクター（第一発明）を含むことを特徴とするものである。

本発明の RNAウィルス感染モデル動物は、本発明のベクターを受精卵に移入した後、受精卵を仮親に移植し、前記受精卵に由来する動物を得、その中から組み込んだ RNAゥィルスの遺伝子が発現している個体を選抜することにより作製できる。

受精卵への移入は、マイクロインジェクション法など常法に従って行うことができる。対象とする動物は、トランジェニック動物の作出技術が確立されている動物であればどのようなものでもよく、マウス、ラット、ゥサギ、ブタ、メダカ、ゼブラフィッシュなどを使用することができる。 RNA ウィルスの遺伝子が発現している個体の選抜は、例えば、 RNA ウィルスの遺伝子に特異的に存在する塩基配列に基づいて作製されたプライマーを使用した PCRなどにより行うことができる。 (4) 第四発明（薬物のスクリーニング方法）

本発明の RNAウィルスの複製を阻害する薬物のスクリーニング方法は、本発明の動物細胞（第二発明）、又は本発明の RNAウィルス感染モデル動物（第三発明）を用いることを特徴とするものである。

動物細胞を使用する場合には、スクリーニングは培地内に対象薬剤を添加することなどにより行うことができる。モデル動物を使用する場合には、スクリ一二ングは対象薬剤を動物に静脈内又は経口投与することなどにより行うことができる。実施例

〔実施例 1〕完全長 HCV遺伝子発現ベクターの構築

( 1 ) HCVcDNAのクロ一ニング

HCV患者血清 R6 (genotype lb ) から AGPC法（Chomczynsky. P. et al. , Anal. Biochem. , 162, 156 (1987)) により HCV-RNA を抽出し、得られた RNA から Superscript II (Gibco-BRL) キットを用いて cDNAを合成した。患者血清 R6は、チンパンジーに感染性を示し（現在のところ、他の実験動物に対する感染性は確認されていない）、その力価は 10— 4.5 CID50 であり、また、 PCR 価は 10— 8 である。

これまでに発表されている HCV遺伝子配列（genotype I) のうち、保存性の高い領域の配列を基にプライマ一をデザインし、 Pfu ポリメラーゼ（Stratagene) で PCR増幅した。これらの DNAフラグメントは常法（Maniatis, T.， "Molecular Cloning, 2nd Edノ'， CHS Press(1989) ) に従って、 pBM プラスミド（特開平 6 - 225770号公報）にサブクローニングし、塩基配列の決定を行った。

HCVはクロ一ニングの工程で容易に変異を起こすので、 3つ以上のクローンで共通する配列を本来のウィルス配列とみなし、そのような配列を複数つなぎ合わせ、全長のクローンを構築した。

全長クローンの構築方法は、特開平 6-225770号公報の記載に従った。

(2) pCALN/HCV RBZの作製 ρ5' RBZの作製

まず EcoRI サイト、 Swalサイト、 Xholサイト、 T7 プロモータ一、ハンマーへッドリボザィムおよび HCVの 5'端（ l-45bp)の配列を含んだ DNAを PCRで合成した。 PCRは検出 DNAの増幅感度と特異性を向上させるため 2ステツプ法を用いた。 2ステップ法とは、まず、 2種類のプライマーで 1回目の PCRを行い、（1st step PCR)。次にその PCR産物の DNA配列両端から内側に存在する 2種類のプライマ一を用いて 2回目の PCRを行う方法である（2nd step PCR)。以下に使用した PCR プライマ一の塩基配列を示す。

ESXT7RBZ1 ： 5' -GCC GGA ATT CAT TTA AAT CTC G- 3' (配列番号 9 )

ESXT7RBZ2： 5' -GCC GGA ATT CAT TTA AAT CTC GAG TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC TGG CCC CTG ATG AGG CCG AAA GGC CGA AAC GGC G- 3' (配列番号 1 0 )

ESXT7RBZ3： 5' -GGG GAG TGA TCT ATG GTG GAG TGT CGC CCC CAA TCG GGG GCT GGC CCG ACG GCT TTC GCC GTT TCG GCC TTT CG- 3' (配列番号 1 1 )

ESXT7RBZ4： 5' - GGG GAG TGA TCT ATG GTG G- 3' (配列番号 1 2)

PCR反応液は、 0.5mlチューブに 10X ThermoPol Buf f e r ( lOmM KC K 20mM Tr i s-HC 1 pH8.8、 lOmM (NH₄)₂S0₄、 2mM MgS0₄、 0· 1% Triton X- 100)を 5μ 1、 20mM dNTP mixture を 0.5μ 1、 10pmol/Ai 1の template兼 1st step プライマ一 2 種（ESXT7RBZ2、 ESXT7RBZ3)を 5 1ずつ、 2units/ 1の vent DNA polymerase(Biolabs)を 0.5μ 1 加え滅菌水で 50 t 1に調製した。 PCRはまず 96°Cで 30秒間加熱した後、変性 96°C 30秒間、アニーリング 58°C 15秒間、伸長 72°C40秒間の条件で 20サイクル行つた。増幅された配列を配列番号 1に示す。

次に新しい 0.5ml チューブに 1st PCR 反応終了液を 0.5μ 1、 10X ThermoPol bufferdOmM KCK 20mM Tris- HC1 pH8.8、（NH₄)₂S0₄、 2mM MgS0₄、 0.1% Ttiton X-100) を 5μ 1、 20mM dNTP mixture を 0.5 1、 lOpmol/ μ 1の 2nd step プライマ一 2 種（ESXT7RBZ1 、 ESXT7RBZ4) を 2 ^ 1 ずつ、 2units/ μ I の vent DNA polymerase(Biolabs)を 0.5 1 を加え滅菌水で 50μ 1 に調製した。 PCR反応は先の条件で行つた。この PCR反応液をポリアクリルアミドゲル電気泳動し、特異的に増幅した目的の断片をゲルから抽出した。目的の断片の抽出は、以下のようにして行った。まず、チャンバ一のゲルコンポーネント側に通常の透析膜をセットし、ついで DNAコレクティング側に Sartorius透析膜をセットした。電気溶出装置のチャンバ一の外側に 2xTBEを、内側に 0. lxTBE- 0.005%SDSを入れた後、切り出しておいた目的の DN A断片を含んだゲルを、チャンバ一のゲルコンポーネント側に置き、 DNAコレクティングコンポーネント側に Xylene cyanoleを含んだ TE を数^ 1加えた。 150Vで 1時間電気泳動を行った後、電極を変えてさらに 45秒間泳動した。泳動装置からチャンバ一をはずし、 DNA コレクティングコンポ一ネント側に約 300μ 1 溶液が残るまでチャンバ一内の溶液を除去した。残った 300μ 1 の溶液を回収した後、 DNAコレクティングコンポ一ネン卜を 100μ 1で washし、その液も先の溶液に加えた。回収した溶液についてフエノール、クロ口ホルム抽出を行い、エタノール沈殿をした後、 10 1の TEに溶解した。抽出した一部をポリアクリルアミドゲル電気泳動し、濃度を 20 / 1 と概算した。この PCR産物を ESXT7RBZ PCR productと命名した。増幅された配列は配列番号 1に示した配列と同一である。

さらに HCV 5'端から core領域の一部（26 - 613bp)までの DNAを PCRで合成した。以下に使用した PCR プライマ一の配列を示す。

ESXT7RBZ5： 5' -CCA CCA TAG ATC ACT CCC C- 3，（配列番号 1 3 )

ESXT7RBZ6： 5' -ATG CCC TCG TTG CCA TAG AG- 3' (配列番号 1 4 )

PCR反応液は 0.5ml チューブに 10X ThermoPol Buffer(10mM KC1、 20mM Tris- HC1 pH8.8、 lOmM (NH₄)_zS0₄、 2mM MgS0₄、 0.1% Triton X-100) を 10 / 1、 0mM dNTP mixture を 1 / 1、 lOpmol/μ 1 のプライマー 2種（ESXT7RBZ5、 ESXT7RBZ6)を 4 β \ ずつ、 2units/ β 1 の vent DNA polymerase(Biolabs)を 1 μ 1, \ ^g/ μ \ の template (pT702R6 14- 8)を 1 μ 1加え滅菌水で 100 μ 1 に調製した。 PCRは 96°C で 30秒間加熱した後、変性 96°C30秒間、アニーリング 58°C15秒間、伸長 72°C 40秒間の条件で 20サイクル行った。この PCR反応終了液をァガロースゲル電気泳動し、特異的に増幅した目的の断片を QIAEX II Agarose Gel Extraction(QIAGEN)を用いてゲルから抽出した。目的の断片の抽出は、以下のようにして行った。まずゲル切り出し、その 3倍量の QX1 Buffer を添加し、ついで QIAEX II を 10μ 1加え、 50°Cで 10分間インキュベーションした。この際 2分毎に振って QIAEX II を混和させた。インキュベーション後、遠心し、上清を除去し、その後、沈殿物を PE Bufferで 2回洗浄、約 15分程度風乾し、滅菌水を 20μ 1加え、沈殿物を再懸濁させ、室温で 5分間インキュベーションし、遠心後、上清を回収した。抽出した一部をァガロースゲル電気泳動し、濃度を 200η_§/μ 1 と概算した。この PCR産物を 5'-HCV PCR product と命名した。増幅された配列を配列番号 2に示した。

上記 2種類のゲル抽出 PCR産物（ESXT7RBZ PCR product, 5， - HCV PCR product) を用いて EcoRIサイト、 Swalサイト、 Xholサイト、 T7プロモーター、ハンマーへッドリボザィムおよび HCVの 5'端から core領域の一部（1- 613bp)までを含んだ目的の cDNA を PCRで合成した。 PCR反応液は 0.5ml チューブに 10X ThermoPol Buffer ( lOraM KCし 20mM Tris-HCl pH8.8, lOmM (NH₄)₂S0₄、 2mM MgS0₄、 0.1% Triton X-100) を 5 1、 20mM dNTP mixture 0.5μ 1、 lOpmol/^ 1 のプライマー 2 種 (ESXT7RBZ1 、 ESXT7RBZ6) を 2 ^ 1 ずつ、 2units/ 1 の vent DNA polymerase(Biolabs)を 0.5 1、 templateとして 4ng/ μ 1の ESXT7RBZ PCR product, 5' -HCV PCR product をそれぞれ Ιμ ΐ加え、滅菌水で 50 μ ΐ に調製した。 PCRは 96°Cで 30秒間加熱した後、変性 96°C 30秒間、ァニ一リング 58°C 15秒間、伸長 72°C40秒間の条件で 20サイクル行った。この PCR product を 5'- ribozyme PCR productと命名した。増幅された配列を配列番号 3に示した。

5' -ribozyme PCR productに 4倍量のクロ口ホルムと 3倍量の TE bufferを混和し、遠心後、その水層を 1.5mlチューブに移し、 2.35倍量の 100%エタノールと 1/4量の 3M酢酸ナトリウムと \β I μΛのグリコ一ゲンを Ιμ ΐ加え、エタノール沈殿（_80°C、 20分間）を行い、最終的に滅菌水に溶解した。

精製した 5'- ribozyme PCR product(10 1)を制限酵素反応液（10mM Tris-HCl pH7.5、 10mMMgCl₂、 ImM Dithiothrei tol)20 1中で Kpnl 1 1で消化（37°C、 1.5 時間）後、 1M塩化ナトリゥムを 2μ 1 を添加しさらに EcoRI \n\で二重消化（37°C、 2.5時間）した。

クローニングベクターには pBMを用いた。 HCV遺伝子は複製時に変異が導入されやすい可能性があり、クローニング時にもそのことが懸念される。そこでクロ一二ング時に発生する人為的な変異を極力少なくするために構築されたベクターが pBMである。 PBR322の制限酵素 EcoRVサイトから Ballサイトの間の配列を制限酵素で欠失させ、 EcoRIサイトと Hindlllサイトの間に pUC119のマルチクローニングサイトの EcoRI サイトから Hindi II サイトまでを組み込み、次に pBR322 の Vsplサイトから Sealサイトの間の配列を pUC119の Vsplサイトから Sealサイトの配列に置き換え、この間の Pstlサイトを欠失させて pBMベクターが作製されている。

0.25M /M 1の ΡΒΜ 10μ 1 を制限酵素反応液（ 10mM Tris-HCl pH7.5、 lOmM MgCl₂、 ImM Dithiothreitol)100 1 中で Kpnl Ιμ ΐ で消化（37°C、 1.5時間）後、 1M塩化ナトリウムを 10 を添加しさらに EcoRI l j 1で二重消化（37°C、 2時間）した。酵素反応終了液に

1の CIAP (子牛小腸由来、宝酒造） 5 1 を添加し、 37°C、 30分間反応を行い、 5'末端の脱リン酸化を行った。

Kpnl、 EcoRIで消化した 5'- ribozyme PCR product と Kpnl、 EcoRIで消化後ァルカリフォスファタ一ゼ処理を行った pBMをァガロースゲル電気泳動し、目的の DNA断片およびクローニングベクターをゲルから抽出（QIAEX II)し、滅菌水 20 1 に溶解した。これらの一部をァガロースゲル電気泳動し、濃度を Kpnl、 EcoRI で消化した 5' -ribozyme PCR product(DNA断片）は 30ng/ μ 1、 Kpnl、 EcoRIで消化後アルカリフォスファタ一ゼ処理を行った pBM (クロ一ニングべクタ一）は 20ng/ l と概算した。

5'-ribozyme PCRproduct(DNA断片）を l z l、 pBM (クロ一ニングベクター）を 1 ju DNA Ligation Kit Ver.2(宝酒造）の solution I を 6μ 1、滅菌水を 4 1混和し、 16°Cで 1時間ライゲ一シヨン反応を行った。

ライゲ一シヨン反応終了液 10μ 1 を大腸菌 DH5a株（コンビテントセル） 100〃 1 に添加し、氷上に 30分間置いた後、 42°Cで 30秒間のヒートショックを行い、再度氷上に 2分間置いた後、 S0C培地 900^1に加え、 37°Cで 1時間インキュべ一ションした。形質転換菌は LB- Ampプレート（1%パクトトリプトン、 0.5%酵母エキス、 1%塩化ナトリウム、 1.5%寒天、アンピシリン lOO^g/ml)上で一夜培養した後、プレート上に出現したコロニーをそれぞれ 4ml LB- Amp培地（1 パクトトリプトン、 0.5%酵母エキス、 1%塩化ナトリウム、アンピシリン 75 g/ml)の入った 13mlチューブで培養（37°C、 6時間）し、培養液を遠心して集菌し、プラスミド DNAを QIAprep Spin Plasmids Kits(QIAGEN社製）を用いてミニプレパレ一ションを行い 20μΙの DNA液を調製した。ミニプレパレ一シヨンは、以下のようにして行った。まず、菌体ペレットに PI Bufferを 250μ】加え、懸濁させ、次に Ρ2 Bufferを 250μ1 添加し、混和させ室温で 5分間反応させた。反応後、即座に冷 Ν3 Buffer 350μ 1 を加え、氷上に 5分間置いた後、遠心を行い、上清を 2mlの microcentrifuge tube に置力、れた QIAprep— spin columnに移し、冉度遠した。 flowthrough fraction を除去し、洗浄のため 750μ1の PE Bufferを QIAprep- spin columnに加え、遠心を行い、 flowthrough fractionを除去し、再度遠心を行い完全に PE Bufferを除去した。 QIAprep- spin columnを 1.5mlチューブに移し、 TEを適当量加え、遠心し、プラスミドを溶出させた。

調製した DNA溶液 1のうち 16 1を制限酵素反応液（10mM Tris-HCl pH7.5、 10mM MgCl₂、 ImM Dithiothreitol)18 z 1中で Kpnl 0.5 1で消化（37°C、 40分間）後、 1M塩化ナトリウムを 2 し EcoRI を 0.5μ1 を添力 []し、二重消化（37°C、 40 分間）した。酵素反応終了液をァガロースゲル電気泳動し、的の DNA断片が揷入されたクロ一ンを得た。このクローンを p5'RBZと命名した。

3' RBZ PCR productの作製

HCV遺伝子の 3'端（9073- 9609bp)、 HDV リボザィム、 Xbalサイト、 Swalサイト、 Hindlllサイトを含んだ DNAを PCRで合成した。以下に使用した PCR プライマ一の配列を示す。

HDRBZ1 5，- TTG GGG TAC CAC CCT TGC G-3' (配列番号 1 5)

HDRBZ2 5' -ACA TGA TCT GCA GAG AGG CC- 3' (配列番号 1 6) HDRBZ3 5'- GGC CTC TCT GCA GAT CAT GTG GCC GGC ATG GTC CCA G-3' (配列番号 1 7 )

HDRBZ4 5' -GCC CAA GCT TAT TTA AAT CTA GAG TCC CAT TCG CCA TTA CCG AG- 3' (配列番号 1 8 ) まず HCV遺伝子の 3'端（9073- 9609bp)の配列を含んだ cDNAを PCRで合成した。 PCR反応液は 0.5mlチューブに 10X ThermoPol Buffer(10mM KC1、 20mM Tris-HCl pH8.8、 lOmM (NH₄)₂S0₄ 2mMMgS0₄、 0.1% Tr i ton X- 100)を 5 1、 20mM dNTP mixture 0.5μ 1、 template(N25- 3'X+6)を 0.5μ 1、 lOpmol/ ^ 1のプライマー 2種（HDRBZ1、 HDRBZ2)を 2 1ずつ、 2units/ 1の vent DNA polymerase(Biolabs)を 0.5 1 を加え滅菌水で 50/ l(x2)に調製した。 PCRはまず 96°Cで 30秒間加熱した後、変性 96°C 30秒間、ァニ一リング 58°C 15秒間、伸長 72°C 40秒間の条件で 20サイクル行った。この反応終了液を低融点ァガロースゲル電気泳動し、特異的に増幅した目的の断片を Gene Cleanll を用いてゲルから抽出した。 Gene Cleanll を用いた抽出は以下のようにして行った。まず目的の DNA断片を含んだゲルを切り出し、 3 倍量の Nal stock solutionを添加し、 50°Cで 10分間インキュベーションしてゲルを融解させた後、 GLSSMILK suspension を 5μ 1加え、さらに 50°Cで 5分間ィンキュベ一シヨンし、遠心した。遠心後、上清を除去し、 300μ 1 の NEW WASH を加え沈殿物を洗浄した。この操作を 3回繰り返した後、沈殿物に滅菌水を 15μ 1 添加し、 DNA断片を溶出させた。抽出した DNA断片の一部をァガロースゲル電気泳動し、濃度を 20ng/ 1 と概算した。この PCR産物を 3' productと命名した。増幅された配列を配列番号 4に示した。

次に HCV遺伝子の 3'端（9590-9609bp)と HDV リボザィム、 Xbal サイト、 Swal サイト、 Hindlllサイトを含んだ cDNAを PCRで合成した。 0.5mlチューブに 10X ThermoPol buffer ( 10mM KC1、 20mM Tris-HCl pH8.8、 lOmM (匪 ₄)₂S0₄、 2mM MgS0₄、 0. l%Triton X - 100)を 5 U 20mM dNTP mixture 0·5μ 1、 tempi ate (Cis-HDV-88) を 0.4μ 1、 10pmol/ 1のプライマー 2種（HDRBZ3、 HDRBZ4)を 2μ 1ずつ、 2units/ 1の vent DNA polymerase(Biolabs)を 0.5μ 1 を加え滅菌水で 50μ 1(χ4)に調製した。 PCRはまず 96°Cで 30秒間加熱した後、変性 96°C30秒間、ァニ一リング 58°C 15秒間、伸長 72°C40秒間の条件で 20サイクル行った。この PCR反応液をポリァクリルアミドゲル電気泳動し、特異的に増幅した目的の断片をゲルから抽出した。抽出した DNA断片の一部をポリアクリルアミドゲル電気泳動し、濃度を 50ng/ l と概算した。この PCR産物を Ribo product と命名した。増幅された配列を配列番号 5に示した。

上記 2種類の抽出 PCR産物（3' product, Ribo product)を用いて HCV遺伝子 3' 端および HDV リボザィム、 Xbal サイト、 Swal サイト、 Hindi II サイトを含んだ目的の DNA を PCR で合成した。 PCR反応液は 0.5ml チューブに 10X ThermoPol BufferdOmM KCU 20mM Tr i s-HCl pH8.8, lOmM (NH₄)₂S0₄、 2mM MgS0₄、 0.1% Triton X - 100) を S UOraM dNTPmixture O.5 1、 10 1/ 1のプライマ一 2種（HDRBZ1、 HDRBZ4)を 2 l^units/M 1の vent DNA polymerase(Biolabs)を 0.5μ 1、 tem late として lOng/μ 1の 3' product, 5ng/ t 1の 5' - Ribo productをそれぞれ 2μ iカロえ、滅菌水で 50μ 1(χ2)に調製した。 PCRは 96°Cで 30秒間加熱した後、変性 96°C 30秒間、ァニ一リング 58°C 15秒間、伸長 72°C40秒間の条件で 20サイクル行つた。 PCR product(90 1)をフエノール、クロ口ホルム抽出し、エタノール沈殿を行い、滅菌水に溶解した。この PCR product を 3' - terminal region PCR productと命名した。増幅された配列を配列番号 6に示した。

この内 45 を制限酵素反応液（10mM Tris-HCl pH7.5、 lOmM MgCl₂、 ImM 0 1^01:1^6 01)51.5 1 中で 1^111 1.5 / 1で消化（37°C、 45分間）後、 5M塩化ナトリウムを 0.5 1 を添加しさらに Hindlll 1.5 1で二重消化（37°C、 1時間）した。反応後、ァガロースゲル電気泳動し、特異的に増幅した目的の断片を QIAEX II Agarose Gel Extraction(QIAGEN)を用いてゲルから抽出し、滅菌水 15μ 1に溶解した。 ρ5， -3' RBZの構築

ρ5' RBZを Kpnl、 Hindlllで消化後、 CIAPでアルカリフォスファタ一ゼ処理し、ァガロースゲル電気泳動を行い、ゲルからクロ一ニングベクター用の DNA断片を QIAEX II Agarose Gel Extraction(QIAGEN)を用いて抽出した。この一部をァガロースゲル電気泳動し、濃度を 40ng/ l と概算した。

Kpnl、 Hindlllで消化後、ゲル抽出した 3' -terminal region PCR productの一部をァガロースゲル電気泳動し、濃度を 20ng/ l と概算した。

8ng/ 1 の p5'RBZ (クロ一ニングべクタ一）を 1 1、 0ng/ 1 の 3' -terminal region PCR product (DNA 断片）を 1μ 1、 DNA Ligation Kit Ver.2(宝酒造）の solution I を 6 1、滅菌水を 4μΙ混和し、 16°Cで一夜ライゲ一シヨン反応を行つた。ライゲ一シヨン反応終了液 ΙΟμΙ を大腸菌 DH5a株 ΙΟΟμΙに添加し、氷上に 30分間置いた後、 42°Cで 30秒間のヒートショックを行い、再度氷上に 2分間置いた後、 S0C培地 900μ 1に加え、 37°Cで 1.5時間インキュベーションした。形質転換菌は LB-Ampプレート（1%パクトトリプトン、 0.5%酵母エキス、 1%塩化ナトリウム、 1.5%寒天、アンピシリン 100 g/ml)上で一夜培養した後、プレート上に出現したコロニーをそれぞれ 4ml LB- Amp培地（1%パクトトリプトン、 0.5%酵母ェキス、 1%塩化ナトリウム、アンピシリン 75 g/ml)の入った 13mlチューブで培養 (37°C、一夜）し、培養液を遠心して集菌し、プラスミド DNA を QIAprep Spin Plasmids Kits(QIAGEN社製）を用いてミニプレパレ一ションして 30 1 の DNA液を調製した。内 20μ 1 を制限酵素反応液（10mM Tris- HC1 pH7.5、 lOmM MgCl₂、 lmM Dithiothreitol, 50mM NaCl)22.8_i 1中で Hindi 110.5^ 1で消化（37°C、 40分間) 後、 0.5M塩化ナトリウムを 2.6μ 1、 EcoRI を 0.5μ 1 を添加し、二重消化（37°C、 40分間）した。酵素反応終了液をァガロースゲル電気泳動し、目的の DNA断片が揷入されたクローンを得た。

ここまで形質転換には遺伝子導入の簡便性から大腸菌 DH5 α株を使用したが、これをホスト株にした場合、複製時に HCV遺伝子に変異が導入されやすい可能性が考えられた。そこで目的の DNA断片が揷入されたベクタ一を大腸菌 JM109株に移し新たな形質転換菌を獲得した。

得られたクローンについて挿入された DNA断片部の塩基配列を DNA sequencing kit Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction(PERKIN ELMER)を用いて解析を行い決定した。 Sequence はまず、 Sequence 反応溶液として、 Terminator Ready Reaction Mixを 8.0μ 1、 0.1 g/ 1 の Template DNAを 3μ 1、 l.Opmol/ μ 1の Primerを 3.2 μ 1 を混ぜ、滅菌水で 20 μ 1に調製した。反応は 96°C 5分間 96°C30秒間、 50°C15秒間、 60°C4分間の条件で 25サイクル行った。反応終了液を CENTRI-SEP COLUMNS (Ap lied Biosystems)で精製後、泳動サンプルとして用い、 sequenceを行った。目的の塩基配列を有したクロ一ンを ρ5' - 3' RBZと命名した。 pCALN/5' -3' RBZの構築

ρ5' -3' RBZ 24 μ g, pCALN/pBR 2A μ g をそれぞれ酵素反応液 500 μ 1 中で SwaKBoeheringer Mannheim)4 1 で消化（25°C、一夜）した後、 TE飽和フエノール、フエノール/クロ口ホルム及びクロ口ホルム処理を行い、エタノール沈殿し、 TE 400 1 に溶解した。この全量をァガロースゲル電気泳動し、 p5'-3'RBZ からは約 1.3kbpの DNA断片を、 pCALN/pBRからは約 8kbpの DNA断片（クローニングべクタ一）を QIAEX II Agarose Gel Extraction(QIAGEN)を用いてゲルから抽出し、それぞれを滅菌水 96 1、 222μ 1に溶解した。これらの一部をァガロースゲル電気泳動し、それらの濃度を ρ5' - 3'RBZの DNA断片は 70ng/ z l、クロ一ニングべクタ一 pCALN/pBRは 35ng/ μ 1 と概算した。クローニングベクター pCALN/pBR 40 μ 1 に 10X CIAP buffer 10μ 1、 22units/M 1 の CIAP 5 1 を添力 Qし、滅菌水で 100 1 にした。アルカリフォスファタ一ゼ反応を 37°Cで 30分間行なった後、 75°Cで 10 分間インキュベーションし、酵素を失活させた。その後フエノール/クロロホルム処理を 2回、クロ口ホルム処理を 1回行い、エタノール沈殿し、滅菌水 20μ 1に溶解した。その一部をァガロースゲル電気泳動し、その濃度を 25ng/^ 1 と概算した。

70ng/^ 1 の p5，- 3'RBZ DNA 断片を 2μ 1、 25ng/, 1 のクローニングベクタ一 pCALN/pBRを 1.5μ 1、滅菌水を 4.5μ 1混ぜ、 70°C、 5分間インキュベーションした後、氷冷水で急冷し、即座に 5X DNA dilution buf fer(Boeheringer Mannheim, Rapid DNA Ligation Kit)を 2μ 1、 2X T4 DNA ligation buf fer(Boeheringer Mannheim , Rapid DNA Ligation Kit) を 10 μ 1 、 5units/ μ, 1 の T4 DNA 1 igase(Boeheringer Mannheim, Rapid DNA Ligation Kit)を 1 1 添カロし、室温で 1.5時間ライゲ一シヨン反応を行った。この反応終了液 2 1 を大腸菌 DH5a株 ΙΟΟμΙに添加し、氷上に 30分間置いた後、 42°Cで 45秒間のヒートショックを行い、再度氷上に 2分間置いた後、 S0C培地 400 1 に加え、 37°Cで 1時間インキュベ一シヨンした。形質転換菌は LB-Arapプレート（1%パクトトリプトン、 0.5%酵母エキス、 1%塩化ナトリウム、 1.5%寒天、 lOO g/ml)上で一夜培養した後、プレート上に出現したコロニーをそれぞれ 4mlの LB- Amp培地（1%パクトトリプトン、 0.5% 酵母エキス、 1%塩化ナ卜リゥム、 75 g/ml)の入った 13mlチューブで培養（37°C、 6.5時間）し、培養液を遠心して集菌し、プラスミド DNAを QIAprepSpinPlasmids Kits(QIAGEN社製）を用いてミニプレパレ一ションし、 TEで 50 ^ 1の MA液を調製した。この内 15μ1 を制限酵素反応液（10mM Tris-HCl pH7.5、 10mM MgCl₂、 ImM DithiothreitoU 50mM NaCl、 0.01% BSA)20^ 1中で Xbalで消化（37°C、 30分間）し、これをァガロースゲル電気泳動し、目的の DNA断片が揷入されたクローンを得た。これらのクロ一ンについて揷入された DNA 断片部の塩基配列を DNA sequencing kit Dye Terminator Cycle Sequencing Ready React i on(PERKIN ELMER) を用いて解析し、決定した。目的の塩基配列を有したクローンを pCALN/5'- 3'RBZ と命名した。 pCALN/HCV RBZの構築

1の pCALN · R6 · CR8を 4 し制限酵素反応液（10mM Tris-HCl pH7.5、 10mM MgCl₂、 ImM DithiothreitoUSO 1中で Kpnl 2μ 1で消化（37°C、一夜）し、その酵素反応終了液 28μ1 に 0.5Μ塩化ナトリゥムを 4 μ1、 Hindlll を 2μ 1添カロし、滅菌水で 40μ 1 にしてさらに消化（37°C、 3.5時間）を行った。反応後、フエノール処理、フエノール/クロ口ホルム処理、クロ口ホルム処理を行い、ェタノ一ル沈殿し、 TE 30^ 1 に溶解した。この一部をァガロースゲル電気泳動し、約 8.5kbp の DNA断片を QIAEX II Agarose Gel Extract ion(QIAGEN)を用いてゲルから抽出し、滅菌水 20μ1に溶解した。そして再度フエノール処理、フエノール/クロロホルム処理、クロ口ホルム処理を行い、エタノール沈殿し、滅菌水 20^1 に溶解した。同様に nも I β \ の pCALN/5'- 3'RBZ を 5 zl、制限酵素反応液（10mM Tris-HCl pH7.5、 10mM MgCl₂、 ImM Dithiothreitol)30 1中で Kpnl 2μ 1で消化（37°C、一夜）し、その反応終了液をフエノール処理、フエノール/クロ口ホルム処理、クロ口ホルム処理を行い、エタノール沈殿し、 ΤΕ30μ1に溶解した。これをァガ口一スゲル電気泳動し、約 9.2kbpのクローニングベクタ一を QIAEX II Agarose Gel Extraction(QIAGEN)を用いてゲルから抽出し、滅菌水 27/ 1に溶解した。次いでこのクロ一ニングベクタ一 27μ1 に 10X CIAP bufferを 5μ1、 22units/ i 1 の CIAPを 2 1加え、滅菌水で 50 1にし、 50°C、 30分間インキュベーションしてアルカリフォスファタ一ゼ処理を行った。反応後、 75°C、 10分間の加熱で酵素を失活させ、フエノール/クロ口ホルム処理を 2回、クロ口ホルム処理を 1回行い、エタノール沈殿し、滅菌水 20μ1に溶解した。

pCALN · R6 · CR8から回収した DNA断片とクロ一ニングべクタ一 pCALN/5' -3' RBZ の一部をァガロースゲル電気泳動し、それらの濃度を共に約 20ng/^l と概算した。ライゲ一シヨン反応は、 pCALN · R6 ' CR8から回収した DNA断片 4 1 とクロ一ニングベクター pCALN/5'- 3'RBZ 1 を混ぜ 80°C、 3分間インキュベーションした後、氷冷水につけ、即座に 5X DNA dilution buffer 2 1、 2Χ DNA ligation buffer 10 5units/ 1の T4 DNA ligase 1 1を添加し、室温で 1.5時間行った。反応液 2μ1 を大腸菌 DH5a株 100 に添力 []し、氷上に 30分間置いた後、 42°Cで 45 秒間のヒートショックを行い、再度氷上に 2分間置いた後、 S0C培地 400 lに加え、 37°Cで 1時間インキュベーションした。形質転換菌は LB-Ampプレート（1%バクトトリプトン、 0.5%酵母エキス、 1%塩化ナトリウム、 1.5%寒天、アンピシリン lOO^g/ml)上で一夜培養した後、プレート上に出現したコロニーをそれぞれ 4ml の LB-Amp培地（1%パクトトリプトン、 0.5%酵母エキス、 1%塩化ナトリウム、アンピシリン 75 tg/nd)の入った 13mlチューブで培養（37°C、 6時間）し、培養液を遠心して集菌し、プラスミド DNAを QIAprep Spin Plasmids Kits(QIAGEN社製）を用いてミニプレパレ一シヨンし、 TEで 100 1の DNA液を調製した。この内 12.5 H 1 を制限酵素反応液（50mM Tris-HCl pH7.5、 10mM MgCl₂、 ImM Di thiothrei tol, lOOmM NaCl)15/ 1中で EcoRI Ιμΐで消化（37°C、 30分間）した後、ァガロースゲル電気泳動し、目的の DNA断片の挿入されたクローンを得た。

HCV 遺伝子の複製時における変異を極力抑える目的で得られたクローンのホスト株を大腸菌 DH5a株から JM109株に変え、新たな形質転換菌を得た。また細胞への transfectionや tgm作製といった本発明のベクタ一の応用性を考慮して、以降のプラスミド調製は Triton法を用いた。

まず Super broth(3.3%パクトトリプトン、 2%酵母エキス、 0.75%塩化ナトリウム、 10N水酸化ナトリウム 1 000量）でクローンを大量培養し、遠心（5000rpm、 10 分間）で菌体を回収した。そこに冷 TE Sucrose(25% Sucrose, 50mM Tris-HCl pH8.0、 ImM EDTA)を培養量の 1/20量加え、チューブに移し、以後氷上で 20mg/ml lysozymeを培養量の 1/100量加え 5分間インキュベーション、 0.5M EDTA pH8.0 を培養量の 1/50量加え 10分間ィンキュベーション、 Tyiton-lyticmixture(0.1% Triton X-100、 50mM Tris-HCl pH8.0、 62.5mM EDTA)を培養量の 2/25 量加え 15 分間インキュベーションといった操作を行った。インキュベーション後、超遠心 (Beckman rotor 45Ti、 30krpm 30分間、 4°C)を行い、上清をビ一カーに移した。上清の重量の 1/10量（w/w)の PEG 6000と 1/ 10量（v/w)の 5M塩化ナトリゥムを加え攪拌して完全に溶解させ、溶解後、氷上で 1,5時間インキュベーションした。その後、遠心チューブに移し、 8000rpm、 10分間、 4°Cで遠心を行った。沈殿物に TE-Sarkosyl(0.4% SarkosyK lOmM Tris-HCl pH7.5, ImM EDTA)を培養量の 3/200 量加え、塩化セシウムを培養量の 3/200量（w/v)加え、 10mg/mlのエチレンブロマイドを 3/8000量加え、チューブに移して遠心（8000rpm、 10分間、 15°C)した。遠心後、液体表面上に形成されたタンパクの膜を除去し、上清をチューブに移し、再度 10mg/ml のエチレンブロマイドを 3/4000 量加えた後、超遠心チューブ (polyal lomer Quick-seal 1x3 1/2 in)に移し、超遠心（Beckman rotor Vti50、 4.8krpm、一夜、 15°C)を行った。遠心終了後、プラスミドを回収し、再度超遠心チューフ polyal lomer Quick-seal 1x3 1/2 in) (こ移し、超 ¾ (Beckman rotor Vti80、 6.5krpm、 3.5時間、 20°C)を行った。遠心終了後、プラスミドを回収し、 5M塩化ナトリゥム飽和イソプロパノールで 6回抽出を行い、エチレンブロマイドを除去した。回収したサンプル量の 3倍量の TEを添加後、エタノール沈殿を行い、適当量の TE に溶解した。このプラスミドに挿入された HCV遺伝子の塩基配列を DNA sequencing kit Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction(PERKIN ELMER)を用いて決定した。目的の塩基配列を有したプラスミドベクタ一を pCALN/HCVRBZと命名した（図 1 )。このプラスミドを導入した大腸菌は工業技術院生命工学工業技術研究所（日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番 3号）に寄託されている（FERM BP-6763、寄託日：平成 9年 10月 31 日）。

〔実施例 2〕完全長 HCV遺伝子発現の確認

( 1 ) ノーザンブロッテイングによる確認

pCALN/HCV RBZ を IMY 細胞（Itoh， T. et al. , submitted) に Lipofectin Reagant(GIBCO-BRL)の方法 (Feigner, PL, et al. , Pro Natl. Acad. Sci. USA, 84， 7413(1987) ) に従いトランスフエクトし、 T7- RNAポリメラーゼを持つ組み換えワクチニァウィルス（文献： Yasui, K. et al. , J.Virol, in press) を感染させ、 HCV-RNAを発現させた。具体的には、 IMY細胞、 6cm dish当たり、 Rz-DNA4 igを用い、 Lipofectinを 18%の割合になるように Opt i-MEMで希釈したものを混合し、室温で 15分間放置後、 Opti-MEM 1.6ral を加え静かに混合し、 dish上にまく。その後 37°Cで 5時間インキュベートし、 M01 = 10で T7ポリメラ一ゼを持つ組換えワクチニァウィルスを 1時間吸着させた。その後、 37°Cで、 12時間培養し、感染細胞を集め、 HCVの発現を検討した。 Isogen (二ツボンジーン）を用いて RNA を抽出し、そのうちのトータル RNA4 もをホルムアルデヒトゲルで電気泳動し、ナイロン膜（アマシャム）に転写して 10%Dextran sulfate, 1%SDS 溶液でノーザンンブロットを行った。 HCV遺伝子の 5'UTRから coreの領域に相当する 600bp の cDNAを pdCTPでラベルしプローブとし、発現された HCV- RNAを検出した。また、対照として、 pCALN/HCV RBZを in vitroで発現させた場合、及びリボザィムをコードする DNA を含まない T702X を発現させた場合についても同様に HCV- RNAの検出を試みた。この結果を図 2に示す。

pCALN/HCV RBZを in vitroで発現させた場合、 HCV- RNA は完全にトリミングされず、約 llkbの RNA が検出された。一方、 pCALN/HCV RBZ を細胞内で発現させた場合、完全長（9.6kb ) の HCV- RNA のみが検出された。また、 T702X を用いた場合、完全長の HCV-RNA は検出されたが、その RNA 量は pCALN/HCV RBZを用いた場合に比べ著しく少なかった。

( 2 ) 5' -Race 及び 3' -Race による確認

pCALN/HCV RBZをトランスフエクトした IMY細胞から HCV-RNA を抽出し、その両末端の塩基配列を調べた（図 3及び図 4)。

5'末端のク口一ニング及びシークエンス

発現した HCV- RNA の 5'末端配列の確認は、 5' Race System (Gibco-BRL) を用いて、 5'Race 法により行った。抽出した HCV- RNA から A5'-IR プライマ一と Superscriptll (Gibco-BRL) を用いて cDNAを合成した。合成された cDNAを、 TdT で dA tailingし、これを铸型とし、 sense プライマ一： CAC-T35、 antisense プライマー： A5' -II として PCRを行った。得られた増幅産物を錡型とし、 senseプライマ一： KM2、 antisenseプライマ一： CAC-T35として再度 PCRを行った。増幅された DNAフラグメントは pGEM- Tベクタ一（プロメガ）にクローニングし、塩基配列の決定を行った。

3 '末端のクローニング及びシークェンス

抽出した HCV- RNA に poly A Polymerase (タカラ）で A tailing を行い、これから CAC- T35プライマーで cDNA合成を行った（Superscript II、 Gibco- BRL)。この cDNA を錄型として、 CAC- T35プライマー、 Takara Taqで 1回目の PCRを、続いて 3'-X- K6H3と CAC-T35で 2回目の PCRを行い、得られたフラグメントを 5' 末端の場合と同様に配列決定した。

以下に使用したプライマ一の塩基配列を示す。

CAC-T35 ： CAC(T)₃₅ (配列番号 1 9 )

匿： 5， -CTGTACGACACTCATACTAA - 3' (配列番号 2 0 )

3' -XR6H3： 5' -TTTTTGGTGGCTCCATCTTAGCC-3' (配列番号 2 1 )

A5' - IR:5' -GGGTTTGGGATTTGTGCTCATGAT, (配列番号 2 2) A5' - 11： 5' -CACTCGCAAGCACCCTATCAGGCAGT, (配列番号 2 3 ) 以上のシークェンスの結果を HCV 遺伝子の両末端の塩基配列と比較したところ、 3'末端については完全な一致がみられたが、 5'末端については、得られたシ —クエンスは、 HCV 遺伝子の配列に G がーつ付加したものであった。この G は pCALN/HCV RBZ中に揷入した cDNAに含まれていないものなので、 mRNAの 5'末端のキヤップ構造に由来するものと考えられた。

(3) HCV蛋白質発現の確認

pCALN/HCV RBZ をトランスフェクトした IMY細胞についてウェスタンブロッテイング法（新生化学実験講座タンパク質 I、東京化学同人（1990)) により、構成蛋白質の発現を解析した。

IMY細胞を RIPAバッ 77— (l%SDS、0.5%NP40、0.15匪 aCl、 lOmMTri s-HCl (pH7.4) ) で可溶化し、 SDS-PAGEで電気泳動し、 I誦 obilon- P (ミリポア）に転写溶液（25mM Tris, 192mM Glycine, 20%メタノール）で転写した。その後、抗 core、 El、 E2、 NS3、 NS4A/4B 、 NS4B、 NS5A、 NS5Bの各ビォチン化モノクローナル抗体（ 1— 2 6g/ml) と 37°Cで反応させ、ァビジン化-111^0( 6 (^ 316111:1:1500)で反応後、 ECL (アマシャム）で HCV蛋白質を検出した。対照として、 pCALN/HCV RBZをトランスフェクトしなかった IMY細胞についても同様に構成蛋白質の発現を解析した。この結果を図 5に示す（図中の 2- 18がトランスフエクトした場合、 Mockがトランスフェクトしなかった場合を示す）。

図に示すように作製したすべてのモノクローナル抗体について特異的に結合する蛋白質が検出された。これより、 pCALN/HCV RBZは、全 HCV蛋白質を発現できるものと考えられる。

〔実施例 3〕 HCV 遺伝子発現細胞株の樹立

HepG2、 IMY 細胞、 6 cm dish 1 枚当たり、プラスミド DNA4 μ g と Lipofectin(GIBCO-BRL)を Opti- MEM(GIBCO-BRL)に約 18%の割合で溶解したものを、混合し、室温で 15分放置後、 Opti- MEMを 1.6ml加え、静かに混合し、予め Opti- MEMで洗浄した細胞の上にまいた。 37°Cで C0₂インキュベータ一内に 5時間置いた後、上清を 10%FCS-DMEM (細胞培養液）と置換した。 37°C、 48時間後、細胞を 1 : 5の割合で継代し、 G418を SOO g/mKBi oact ive)で加えた。約 3週間後、形成されたコロニ一をピックァップした。

ピックアップした細胞に cre-adenovi rusを感染させ（感染量： mo i = 100 )、ゥエルあたりの core蛋白質の発現量を調べた。特に発現量の多かった 3 系統についての結果を図 6に示す。

次に、 ere- adenov i rusの感染量を mo i = l から 100 まで変化させ、その際の発現量を調べた。この結果を図 7に示す。図 7に示すように、 mo i =30でほぼプラト —に達した。このことから全細胞で HCV が発現するためにはある程度の ere 酵素が必要であると考えられた。なお、図 7では、最も発現の高い 2 - 18系統のみ示したが、 2-8 系統及び 2-22系統でも同様の反応性を示した。なお、本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとリ入れるものとする。発明の効果

本発明は、 RNAウィルスの完全長遺伝子を発現することのできるベクタ一等を提供する。これらは、 RNAウィルス複製の機構および RNA ウィルス感染症の発症機構の解明、治療薬および治療手段の開発等に有用である。図面の簡単な説明

図 1 ： pCALN/HCV RBZ の構造を示す図である。

図 2 ： pCALN/HCV RBZ からの転写産物に対するノーザンブロットの結果を示す写真である。

図 3 ： 5' -Race 法の概要を示す図である。

図 4 ： 3' - Race 法の概要を示す図である。

図 5 ： pCALN/HCV RBZ からの翻訳産物に対するウェスタンプロットの結果を示す写真である。図 6 ： HCV 遺伝子発現細胞株の Core蛋白質の発現量を示す図である。

図 7 ： HCV遺伝子発現細胞株の Core蛋白質の発現量と ere- adenovi rus感染量との関係を示す図である。

Claims

請求の範囲

1 . RNAウィルスの遺伝子をコードする cDNAを含むベクタ一であって、該 RNA ウィルスの遺伝子の両末端を正確かつ均一に転写できるように構築されていることを特徴とするベクター。

2 . RNAウィルスの遺伝子をコードする cDNAの 5'末端の上流及び 3'末端の下流のそれぞれにセルフプロセッシングによリ切断するリボザィムをコードする DNAが配置されていることを特徴とする請求項 1記載のベクタ一。

3 . RNA ウィルスが C型肝炎ウィルスであることを特徴とする請求項 1又は 2 記載のベクター。

4 . 請求項 1又は 2記載のベクターを含むことを特徴とする動物細胞。

5 . 請求項 3記載のベクターを含むことを特徴とする動物細胞。

6 . その細胞中に請求項 1又は 2記載のベクターを含むことを特徴とする RNA ウィルス感染モデル動物。

7 . RNA ウィルスが C型肝炎ウィルスであることを特徴とする請求項 6記載の RNAウィルス感染モデル動物。

8 . 請求項 4記載の動物細胞、又は請求項 6記載の RNAウィルス感染モデル動物を用いることを特徴とする Aウィルスの複製を阻害する薬物のスクリ一ニング方法。

9 . 請求項 5記載の動物細胞、又は請求項 7記載の RNAウィルス感染モデル動物を用いることを特徴とする C型肝炎ウィルスの複製を阻害する薬物のスクリ一ニング方法。