JPH1084813A - Ｃ型肝炎モデル動物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【解決手段】 Ｃ型肝炎ウイルス由来のｃＤＮＡがスイ
ッチング発現するように導入されているＣ型肝炎モデル
動物。 【効果】 Ｃ型肝炎の発症機構の解明、治療手段の開発
に有用なＣ型肝炎モデル動物を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、Ｃ型肝炎モデル動
物に関する。本発明のモデル動物は、Ｃ型肝炎の発症機
構の解明、治療手段の開発等に有用である。

【０００２】

【従来の技術】Ｃ型肝炎ウイルス（以下、「ＨＣＶ」と
いう）の遺伝子をマウスなどの小動物に導入し、導入し
た遺伝子を発現させて肝炎の発症モデルをつくろうとい
う試みはこれまでも多く行われてきた（C.Pasquinelli
ら Abstract book of 2nd international meeting on h
epatitis C virus and related viruses(July 31-Augus
t 5, 1994 San Diego,USA)、C.Pasquinelli ら Abstrac
t book of 3nd international meeting on hepatitis C
virus and related viruses(August 28-September 3,1
995 Gold coast,Australia) 、Kazuhiko Koikeら J.Gen
eral Virology 76p3031-3038 1995、T.Kato Arch Virol
141 p951-958 1996 ）。しかし、ほかの多くの遺伝子
と異なり、ＨＣＶ遺伝子はマウス個体への組み込みが困
難であり、また、うまく組み込まれてもＨＣＶ蛋白質の
産生が認められない例がほとんどであった。さらに、Ｈ
ＣＶ蛋白質の産生が認められたきわめて稀な例でも胎児
期より蛋白質が産生され、免疫寛容になるために、生後
も典型的な肝炎症状を呈するものはなく、肝炎モデルに
はなりえていなかった。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】ヒトの疾患の発症機構
を解明し、その治療手段を開発するにあたっては、その
疾患と酷似した病態を示すモデル動物が重要な役割を果
たす。しかし、上記のようにＣ型肝炎に関しては、その
ようなモデル動物が未だに作りだされておらず、このこ
とがＣ型肝炎の発症機構を解明する上での一つの障害と
なっている。本発明は、このような技術的背景の下にな
されたものであり、その目的は、ヒトＣ型肝炎と同様の
病態を示す新規なモデル動物を提供することにある。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題を
解決するため鋭意検討を重ねた結果、ＨＣＶ由来のｃＤ
ＮＡをスイッチング発現するようにマウスに導入するこ
とにより、マウスにヒトのＣ型肝炎と酷似した病態を発
症させることができるのを見いだし、本発明を完成し
た。即ち、本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス由来のｃＤＮＡ
が導入されていることを特徴とするＣ型肝炎モデル動物
である。

【０００５】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
最初に、本発明のモデル動物の特徴について説明する。
本発明のＣ型肝炎モデル動物の一例では、ＨＣＶ由来の
ｃＤＮＡがスイッチング発現するように導入さている。
ここで「スイッチング発現」とは、所望の時期に特定の
遺伝子を発現させることができる発現システムをいう。
スイッチング発現は、例えば、発現させようとする遺伝
子とそのプロモーターの間に、所望の時期に除去可能な
配列を介在させることや薬物などにより誘導可能なプロ
モーターを使用することにより構築できる。前者の具体
例としては、Cre/loxP発現システム（Nat Sternberg ら
J.Molecular Biology 150.p467-486 1981、Nat Sternb
erg ら J.Molecular Biology 150.p487-507 1981）を挙
げることができる。Cre/loxP発現システムは、２つのlo
xP配列にはさまれた挿入遺伝子（これが、プローモータ
ーと目的とする遺伝子の間に介在し、その遺伝子の発現
を抑制する）と、挿入遺伝子を１つのloxP配列とともに
除去するP1ファージCre ＤＮＡ組換え酵素（以下、単に
「Cre 」という）とからなり、Cre を作用させることに
より任意の時期に目的の遺伝子を発現させることができ
る。loxP配列は、大腸菌P1ファージの遺伝子に由来する
ＤＮＡであって、下記のような塩基配列を有する長さ34
bpのＤＮＡである。

【０００６】ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT Cre は、大腸菌P1ファージに由来する分子量約38kDのＤ
ＮＡ組換え酵素である。ＨＣＶ由来のｃＤＮＡをスイッ
チング発現させることにより、動物がある程度成長した
段階でＨＣＶ由来のタンパク質を産生させることができ
る。このため、従来のＣ型肝炎モデル動物で問題となっ
ていた免疫寛容の問題を回避することができる。

【０００７】本発明のＣ型肝炎モデル動物の外形的な特
徴は、ヒトのＣ型肝炎と同様の病態を示すことである。
具体的な病態としては、本実施例にあるように血清中の
ＧＰＴの上昇、肝組織での好酸体の出現と肝細胞の脱
落、クッパー細胞の肥大と増加、リンパ球の集簇などを
挙げることができる。但し、これらの病態は、導入する
ＤＮＡ断片、モデル動物の種類などにより変動するの
で、本発明の技術的範囲を限定的に定めるものではな
い。

【０００８】次に、本発明のモデル動物の作出方法につ
いて説明する。本発明のＣ型肝炎モデル動物は、例え
ば、以下のようにして作出することができる。まず、Ｈ
ＣＶ由来のｃＤＮＡをスイッチング発現させることので
きるベクターを作製する。このようなベクターは、例え
ば、プロモーターとloxP配列を含むベクターに、ＨＣＶ
由来のｃＤＮＡをloxP配列の下流に挿入することにより
作製できる。プロモーターとloxP配列を含むベクターと
しては、Yumi Kanegaeらが作製したPCALNLW 、本発明者
が作製したpCALN/pBR などがある。なお、pCALN/pBR を
導入した大腸菌は、工業技術院生命工学工業技術研究所
に寄託番号FERM P-15753として寄託されている（寄託
日：平成８年７月22日）。ベクターに挿入するｃＤＮＡ
としては、例えば、実施例にあるＣＮ２、Ｎ２４、ＣＲ
などを用いることができるが、これらに限定されるわけ
ではない。このようなｃＤＮＡは、Nobuyuki Kato らの
方法（Proc.Natl.Acad.Sci.USA.87,9524-9528,1990）に
従って作製することができる。

【０００９】次に、作製したベクターから発現カセット
を切り出し、これを受精卵に導入し、導入後の受精卵を
仮親に移植する。受精卵への導入は、例えば、マイクロ
インジェクション法など常法に従って行い得る。また、
ｃＤＮＡ導入の対象とする動物の種類は、トランスジェ
ニック動物の作出技術が確立されている動物であれば特
に制限はない。実施例では、マウスを用いているが、こ
れに限定されることなく、ラット、ウサギ、ブタ、メダ
カ、ゼブラフィッシュなどでもよい。

【００１０】次に、仮親から得られた動物の中からＨＣ
Ｖ由来のｃＤＮＡを有しているものを選抜し、さらに、
ＨＣＶ由来のｃＤＮＡがスイッチング発現するものを選
抜して、本発明のＣ型肝炎モデル動物を得る。ＨＣＶ由
来のｃＤＮＡを有しているかどうかは、ＰＣＲ法により
判断できる。即ち、選抜しようとする動物からＤＮＡを
抽出し、それを鋳型とし、導入したｃＤＮＡの両末端に
対応するオリゴヌクレオチドを合成してプライマーと
し、ＰＣＲを行う。ＨＣＶ由来のｃＤＮＡが導入されて
いれば増幅断片が検出されるが、ＨＣＶ由来のｃＤＮＡ
が導入されていなければ増幅断片は検出されない。ま
た、ＨＣＶ由来のｃＤＮＡがスイッチング発現している
かどうかは、ＨＣＶ由来のｃＤＮＡの発現を阻害してい
る配列を除去し、in vitro又はin vivo で該ｃＤＮＡに
対応するタンパク質が産生されているかどうかを調べれ
ばよい。ＨＣＶ由来のｃＤＮＡに対応するタンパク質が
産生されているかどうかは、ウェスタンブロット法や蛍
光抗体染色法などにより調べることができる。

【００１１】ＨＣＶ由来のｃＤＮＡは、スイッチング発
現するので本発明のＣ型肝炎モデル動物は、そのままの
状態では肝炎を発症せず、肝炎を発症させるためには、
当該ｃＤＮＡの発現を抑制している配列を除去すること
が必要である。そのような抑制配列を除去するには、Ｄ
ＮＡ組換え酵素を用いればよく、例えば、抑制配列が、
loxP配列であれば、loxP配列を除去する酵素であるCre
を発現するアデノウイルスAxNCreを感染させればよい。
Cre 及びAxNCreは、Yumi Kanegaeら Nucl.Acids Res.2
3,19,38 16-21.1995 の記載に従って作製できる。

【００１２】

【実施例】以下、実施例を用いて本発明を更に詳細に説
明する。但し、本発明の技術的範囲は、実施例により限
定されるものではない。 〔実施例１〕Cre/loxP発現システムを利用した発現ベク
ターの構築 ＣＡＧプロモーター下流の２つのloxP配列にはされまれ
たネオマイシン耐性遺伝子を挿入した発現カセットを p
CALNLW（Yumi Kanegaeら Nucl.Acids Res.23,19,38 16-
21.1995 ）から切り出し、pBR322に組み込みpCALN/pBR
を作成した（図１）。ネオマイシン耐性遺伝子およびlo
xP配列の下流のSwaI切断部位でpCALN/pBR を開裂し、３
種類のＨＣＶ由来のｃＤＮＡ (ＣＮ２，Ｎ２４，ＣＲ)
を挿入した（図２) 。

【００１３】ＣＮ２はＨＣＶ遺伝子の 294番から3435番
の塩基に対応する3160bpのｃＤＮＡであり、Ｎ24はＨＣ
Ｖ遺伝子の2769番から6823番の塩基に対応する4055bpの
ｃＤＮＡであり、ＣＲはＨＣＶ遺伝子の 294番から9455
番の塩基に対応する9162bpのｃＤＮＡである。このＨＣ
Ｖ由来のｃＤＮＡは小原らによって、チンパンジーおよ
びＨＰＢＭａ細胞に感染性が確認されたＲ６血清（Yohk
o K.Shimizu ら Proc.Natl.Acad.Sci.USA.90,6037-6041
中の「plasma K」に相当する血清である。）からＲＴ−
ＰＣＲ法により分離したものを使用した（Nobuyuki Kat
o ら Proc.Natl.Acad.Sci.USA.87,9524-9528,1990 ）。

【００１４】ＨＣＶ由来のｃＤＮＡを挿入した発現ベク
ターから HindIII切断により、発現カセットを切り出
し、アガロースゲル電気泳動により分離精製した。この
ＤＮＡをさらに塩化セシウムを用いた比重遠心法にて精
製した。得られたＤＮＡを脱塩、エタノール沈殿後ＴＥ
buffer (10mM Tris-HCl, 1mM EDTA) に溶解した。

【００１５】〔実施例２〕トランスジェニックマウスの
作出 雌マウス（BALB/cCrSlc 及びC57Bl/10SnSlc 、共に日本
エスエルシー株式会社製）に排卵誘起剤投与後、同系統
の雄と交配し、翌日雌マウスの卵管より前核受精卵を採
取した。実施例１で調製したＤＮＡ断片溶液（1-5 μg/
ml）を微小ガラス管を用いて受精卵の前核に約２pl注入
した。この操作は、〔「受精卵へのＤＮＡの注入、発生
工学実験マニュアル」（野村達次 監修、勝木元也
編）41-76頁、講談社1987年〕及び〔「前核へのＤＮＡ
のマイクロインジェクション、マウス胚の操作マニュア
ル」(Manipulating the Mouse Embryo, A Laboratory M
anual ）（B.Hogan, F.Costantini and E.Lacy/ 著、山
内一也、豊田裕、森庸厚、岩倉洋一郎／訳）、155-173
頁、近代出版1989年〕の記載に従って行った。ＤＮＡを
注入した受精卵は、偽妊娠仮親雌マウス（Slc:ICR 、日
本エスエルシー株式会社製）の卵管に移植し、約20日後
に自然分娩又は帝王切開により出生させた。

【００１６】〔実施例３〕トランスジェニックマウスの
スクリーニング ＨＣＶ遺伝子に特異的な配列をもつプライマーを用いた
ＰＣＲにより、得られたマウスの体細胞遺伝子へのトラ
ンスジーンの組み込みをスクリーニングした。

【００１７】マウスの耳介切片を125mg/mlプロティネー
スＫ溶液（50mM KCl/10mM Tris-HClpH8.3/1.5mM MgCl₂
/0.1% ゲラチン/0.45% NP40/0.55% Tween20)中で55℃１
ｈインキュベート後96℃10分間加熱した。得られたＤＮ
Ａ溶液５μl をＰＣＲに使用した。ＣＮ２を使用したマ
ウスのスクリーニングのためのＰＣＲのプライマーには
センスプライマーとして6-294-S20 (5'-TGATAGGGTGCTTG
CGAGTG-3')、アンチセンスプライマーとして6-604-R18
(5'-TTGCCATAGAGGGGCCAA-3')を各最終濃度１μM で用い
た。ＰＣＲは94℃２分加熱後、94℃１分、55℃２分、72
℃２分の反応を40回、サーマルサイクラー（パーキンエ
ルマー）で行った。得られたＰＣＲ産物を３％アガロー
スに電気泳動し、エチジウムブロマイド染色にて、目的
のＤＮＡ産物（311bp)の有無を判定した。図３にＰＣＲ
産物のアガロース電気泳動による検出の例を示す。図中
のＡおよびＣは陰性マウス、Ｂは陽性マウス、Ｎは陰性
対照（BALB/cマウス）、Ｍは陽性対照（pCALN-CN2 プラ
スミドＤＮＡ）からのＰＣＲ産物、ＭはＤＮＡサイズマ
ーカーを示す。BALB/cCrSlc から得られたマウス28匹の
うち７匹が陽性であり、C57Bl/10SnSlc から得られたマ
ウス３匹のうち１匹が陽性であった。それぞれの陽性マ
ウスを繁殖し、以後の検討に用いた。

【００１８】Ｎ24遺伝子のスクリーニングにはセンスプ
ライマーとして 6-4269-S20 (5'-TATGACATCATAATATGTGA
-3')、アンチセンスプライマーとして6-4599-R20 (5'-C
CCGATAATATGCTACAGCA-3') を使用してＣＮ２と同様の方
法でＰＣＲを行った。この結果、BALB/cCrSlc から得ら
れたマウス55匹のうち８匹が陽性であり、C57Bl/10SnSl
c から得られたマウス16匹のうち４匹が陽性だった。Ｃ
Ｒ遺伝子のスクリーニングはＣＮ２と同じプライマーを
使用した。BALB/cCrSlc から得られたマウス16匹のうち
１匹が陽性だった。

【００１９】〔実施例４〕培養細胞によるトランスジェ
ニックマウスの発現スクリーニング 本発明のトランスジェニックマウスはスイッチング発現
システムを用いているので通常の状態ではＨＣＶ遺伝子
は発現しない。発現を開始させるためにCre を作用させ
る必要がある。このため本発明者は、Cre を発現する組
み換えアデノウイルスAxNCreを作成した。アデノウイル
スAxNCreの作成は、Yumi Kanegaeらの方法に従った（ N
ucl.Acids Res.23,19,38 16-21.1995 ）。

【００２０】トランスジェニックマウス（ＣＮ２導入、
BALB/cCrSlc 由来）より脾臓を外科的に摘出し、脾細胞
と線維芽細胞を分離培養した。培養した脾細胞および線
維芽細胞にAxNCreを moi＝0,10,100で感染させ、48時
間、５％ＣＯ₂ 、37℃で培養した後細胞を回収した。得
られた脾細胞を遠心し、酸性フェノール・グアニジン法
にてＲＮＡを抽出し、このＲＮＡを鋳型として6-604-R2
0 をプライマーとしてｃＤＮＡ合成を行った。ｃＤＮＡ
合成終了後6-294Sプライマーを追加し、ＰＣＲを行い、
ＰＣＲ産物の有無によりＨＣＶ由来のＲＮＡ産生の有無
を調べた。この方法で２マウス中２マウスに（line8 と
line13) ＨＣＶ由来のＲＮＡの産生を確認した（図
４）。

【００２１】さらに、ＨＣＶ蛋白質の発現を確認するた
めにウェスタンブロット法と蛍光抗体染色法を行った。
AxNCreを感染させた３×10⁷ 細胞の脾細胞を１×Sample
buffer (50mM Tris-HCl pH6.8, ２％ＳＤＳ，10％グリ
セロール、５％２ＭＥ）60μｌで溶解し 100℃５分間加
熱した。得られたサンプルを10−20％グラジエントＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥゲルにて泳動した。泳動終了後セミドライ
ブロット装置（ミリポア) にてＰＶＤＦ膜（ミリポア）
に転写した。転写した膜を抗コアモノクローナル抗体お
よび抗Ｅ２モノクローナル抗体と反応させた。８マウス
中２マウス（line8 とline29) に陽性反応を得た（図
５）。なお、本実施例で用いたモノクローナル抗体は、
ＨＣＶの遺伝子からコア、Ｅ１、Ｅ２の蛋白質を遺伝子
組み換えにより作製し、BALB/cマウスに免疫して、作製
した（Masahiko Kaitoら J.GeneralVirology 75 p1775-
1760 1994、Tomiko Kashiwakuraら J.Immunological Me
thods 190 p78-89 1996）。

【００２２】またスライドグラス上で培養した線維芽細
胞にもAxNCreを moi＝100 で感染させ、48時間培養後、
アセトン：メタノール＝１：１溶液中で20℃、10分間、
固定した。固定した細胞を抗コアモノクローナル抗体、
抗Ｅ１モノクローナル抗体および抗Ｅ２モノクローナル
抗体と反応させ、間接蛍光法にて検出した。ウェスタン
ブロット法と同様に８マウス中２マウス（line8 とline
29) に陽性所見が得られ（図６〔line8 〕）、陽性マウ
ス（line8 とline29) はウェスタンブロット法と蛍光抗
体法で同じだった。

【００２３】〔実施例５〕in vivo でのＨＣＶ蛋白質発
現 細胞培養実験でＨＣＶ蛋白質発現陽性だったマウス（li
ne8 とline29) を用いてin vivo での発現実験を行っ
た。AxNCreは、マウスの尾静脈から静注により投与、ま
たは脾臓に直接注入した。３日後にマウスの肝臓を摘出
し、ＨＣＶ蛋白質の発現を解析した。マウス肝切片に１
mlのＲＩＰＡバッファー（10mM Tris-HClpH7.4/１% SDS
/0.5% NP40/0.15M NaCl/1mM PMSF)を加えダウンスホモ
ゲナイザー中で20ストロークホモゲナイズした。溶液を
100℃、５分間加熱後、４℃、15分間超音波処理をし
た。１万４千回転で10分間遠心し、上清を分離した。得
られた上清の蛋白濃度を測定し、また、コア蛋白質のＥ
ＩＡ（Takeshi Tanakaら J.Hepatology23:742-745.199
5）及びウェスタンブロッティングを行った。

【００２４】上清５μl に、コア蛋白質ＥＩＡ用の分散
液（20mMクエン酸Na、O.5%NaCl、10N Urea）50μl 、さ
らにコア蛋白質に対する変性液（O.5%NaOH）50μl を加
え室温で10分間反応させた。中和液（0.5M NaH₂PO₄、5%
Triton X-100 ）を50μl 加えた後、ＥＩＡ反応を行っ
た。AxNCreを投与したトランスジェニックマウス（line
8 とline29) の肝サンプルではＥＩＡ陽性となったが、
非トランスジェニックマウスでは陰性だった。ウェスタ
ンブロット法でも同様にトランスジェニックマウスでは
21kDa のコア蛋白質、37〜38kDa のＥ１蛋白質、67〜69
kDa のＥ２蛋白質が検出されたが（line8 とline29) 、
非トランスジェニックマウスでは検出されなかった。

【００２５】〔実施例６〕トランスジェニックマウスに
おけるＨＣＶ蛋白質発現による肝障害 トランスジェニックマウス（line8 とline29) にＨＣＶ
構造蛋白質（コア、Ｅ１、Ｅ２）を発現させて、肝臓に
おけるＨＣＶ蛋白質の発現と肝臓組織像および血清ＧＰ
Ｔ値の変化を経時的に観察した。 AxNCre 10⁹ pfu をマ
ウスの尾静脈より投与した。AxNCre投与後３、５、７、
10日目にマウスをと殺した。トランスジェニックマウス
肝臓におけるＨＣＶコア蛋白質の発現を定量的にＥＩＡ
法で測定すると、７日目まで増加し、10日目には減少し
た（図７）。血清ＧＰＴ値は５日目まで低値だが、７日
目に急激に上昇し、10日目まで上昇した（図７）。肝組
織では好酸体の出現と肝細胞の脱落、クッパー細胞の肥
大と増加、リンパ球の集族像が３日目から観察でき、そ
の所見は７日目および10日目に急激に増強した。７日
目、10日目にはこれらの所見に加え、肝細胞の再生像が
強く見られた（図８、図９、図１０）。これらの所見は
ヒトの急性肝炎とよく似ており、ＨＣＶ構造蛋白質の発
現により急性肝障害が誘導されたと考えられた。また好
酸体がアポトーシスをおこした肝細胞であることを確認
するためにTunnel法（R.Gold Lab.Invest 71 p219-225
1994）により断裂化したＤＮＡを染色、陽性所見を得
た。

【００２６】

【発明の効果】本発明は、新規なヒト疾患モデル動物を
提供する。このモデル動物は、ヒトのＣ型肝炎に酷似し
た病態を示すので、Ｃ型肝炎の発症機構の解明、治療手
段の確立に有用である。

【図面の簡単な説明】

【図１】pCALN/pBR ベクターの構造を示す図である。

【図２】ＨＣＶ由来のｃＤＮＡのpCALN/pBR への挿入部
位を示す図である。

【図３】ＰＣＲ産物のアガロース電気泳動の結果を示す
写真である。

【図４】ＰＣＲ産物のアガロース電気泳動の結果を示す
写真である。

【図５】マウス脾細胞由来のタンパク質のウエスタンブ
ロットの結果を示す写真である。

【図６】マウス繊維芽細胞由来のタンパク質の蛍光抗体
染色の結果を示す写真である。

【図７】ＨＣＶ由来のｃＤＮＡを導入したマウス中の血
清ＧＰＴ値及びＨＣＶコアタンパク質の経時的な変化を
示す図である。

【図８】AxNCre投与前のＨＣＶ由来のｃＤＮＡを導入し
たマウスの肝細胞の顕微鏡写真である。

【図９】AxNCre投与後５日目のＨＣＶ由来のｃＤＮＡを
導入したマウスの肝細胞の顕微鏡写真である。

【図１０】AxNCre投与後７日目のＨＣＶ由来のｃＤＮＡ
を導入したマウスの肝細胞の顕微鏡写真である。

【手続補正書】

【提出日】平成９年７月４日

【手続補正２】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】全図

【補正方法】変更

【補正内容】

【図１】

【図２】

【図３】

【図７】

【図４】

【図５】

【図６】

【図８】

【図９】

【図１０】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 多屋 長治 東京都北区王子本町１−13−12−303 (72)発明者 斎藤 泉 東京都渋谷区代々木２−37−15−412

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 Ｃ型肝炎ウイルス由来のｃＤＮＡが導入
   されていることを特徴とするＣ型肝炎モデル動物。
2. 【請求項２】 Ｃ型肝炎ウイルス由来のｃＤＮＡが、ス
   イッチング発現するように導入されていることを特徴と
   する請求項１記載のＣ型肝炎モデル動物。
3. 【請求項３】 Ｃ型肝炎ウイルス由来のｃＤＮＡをスイ
   ッチング発現させる手段が、Ｃ型肝炎ウイルス由来のｃ
   ＤＮＡとプロモーターの間にloxP配列を介在させること
   である請求項２記載のＣ型肝炎モデル動物。