WO1999038971A1

WO1999038971A1 - Proteine se liant a la midkine

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Publication number: WO1999038971A1
Application number: PCT/JP1999/000423
Authority: WO
Inventors: Takashi Muramatsu; Kenji Kadomatsu; Shinya Ikematsu; Sadatoshi Sakuma
Original assignee: Meiji Milk Products Co., Ltd.
Priority date: 1998-02-02
Filing date: 1999-02-02
Publication date: 1999-08-05
Also published as: AU2076599A

Description

ミッドカインに結合するタンパク質技術分野

本発明は、へパリン結合性成長因子ミツドカインに結合するタンパク質、および該タンパク質を利用した医薬品候補化合物のスクリーニング方法に関する。背景技術

ミツドカインは、胚性腫瘍細胞の分化の間のレチノイン酸応答性遺伝子の産物として発見された (Kadomatsu, K. et al. , Biochem. Biophys. Res. Co翻 un.， 151: 1312-1318,1988; Tomomura, M. et al., J. Biol. Chem., 265: 10765-107 70,1990) 。ミツドカインはへパリン結合性の成長因子であり（Tomomura, M. et al., Biochem. Biophys. Res. Co匪 un.， 171: 603-609,1990) 、発癌 (Tsutsui, J. et al., Cancer Res., 53: 1281-1285,1993)、神経の生存および分化 (Mura matsu, H. et al., Dev. Biol., 159: 392-402, 1993)、ならびに組織修復 (Yos hida, Y. et al., Dev. Brain Res., 85: 25-30,1995) 、等に関与していると考えられている。発癌との関連では、ミヅド力インの高レベル発現が、様々なヒトの癌で高頻度に観察されている（Tsutsui, J. et al., Cancer Res., 53: 1281- 1285,1993; Garver, R. 1. et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 9: 463- 466,1993; Garver, R. 1. et al., Cancer, 74:1584-1590 ,1994; Nakagawara, A. et al., Cancer Res., 55:1792-1797,1995; Aridome, K. et al., Jpn. J. C ancer Res., 86:655-661,1995; Koshizawa, S. H. et al., Cancer Lett., Ill: 117-125,1997; Nakanishi, T. et al., Obs. & Gyn., 90: 285-290,1997; 0'Bri en, T. et al., Cancer Res., 56:2515 - 2518, 1996) 。ミツドカインはまた、ヒトの結腸直腸組織の前癌病変に強く発現している。そして、 NIH3T3細胞に対して発癌活性を示す (Kadomatsu, K. et al., Br. J. Cancer, 75: 354-359 ,1997) 。この発癌活性に加えて、ミツドカインは、少なくとも部分的に、線維素溶解活性

(プラスミノ一ゲンァクチべ一夕一活性の増大）（Kojima， S. et al., J. Biol.

Chem.， 270: 9590-9596,1995) および血管新生活性 (Choudhuri, R. et al., C ancer Res., 57: 1814-9,1997) を介して、発癌過程に関与している可能性もある _c 発癌過程におけるミッドカインの生物学的意義に関する証拠は、次第に蓄積されてきているが、ミツドカインの機能に関する分子機構は、依然不明なままである。ミツドカインには、 2つの作用形態が考えられている。 1つは、培養皿にコーテイングされたミツドカインが、神経細胞の基質への接着と、その生存を促進する

(Muramatsu, H. et al., Dev. Biol., 159: 392-402 (1993); Kaneda, N. et a l.， J. Biochem.， 119:1150-1156,1996) ことである。これらの作用形態の生理学的な意義は、ラットの胚の脳内で分化中の神経細胞が移動する過程で、ミツドカィンが、ラジアル ·グリアル 'プロセス（radial glial process) で発現しているという事実からも裏付けられる（Matsumoto, K. et al., Dev. Brain Res., 7 9: 229-241,1994) 。この場合、ミツドカインは、おそらく、そのへパリン結合性のために、主に接着分子として機能していると考えられる。なぜならば、その接着は、外からのへパリンの添加によって大きく阻害されるからである（Kaneda, N. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. , 220:108-112,1996; Kaneda, N. et al., J. Biochem., 119:1150-1156,1996) 。 2つめは、可溶型ミツドカインはまた、いくつかの初代培養細胞に対して、神経親和性因子として作用し（Michik awa, M. et al., J, Neurosci. Res., 35: 530-539,1993; Kikuchi, S. et al.,

Neurosci. Lett., 160:9-12, 1993) 、また、内皮細胞では、その線維素溶解活性を示す (Kojima, S. et al., J. Biol. Chem. , 270: 9590-9596,1995) ことである。眼内に注入されたミツドカインは、連続光照射の際の網膜細胞の劣化を妨げる（Unoki, K. et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci.， 35:907-915,1995)。従って、ミツドカインは、可溶性のリガンドとして機能し、その信号は、それ自身の細胞表面のレセプ夕一、及び細胞内の信号伝達システムを介して、伝達されている、と考えられている。

このように、ミツドカインと発癌や神経細胞の生存 ·分化などとの関係は、徐々に明らかにされてきてはいるものの、ミツドカインからのシグナル伝達におけるミツドカインの標的分子については、依然、解明されていないのが現状である。ミツドカインの標的分子の解明は、この分子を標的とした癌治療薬などの医薬品の開発へつながると考えられるため、この分子のいち早い解明が望まれていた。発明の開示

本発明者等は、抗ミツドカイン抗体を用いた免疫沈降により、野生型 ICRマウスの 13.5日胚の脳細胞の抽出液から、ミッドカインに結合するタンパク質を単離することに初めて成功した。単離したタンパク質は細胞膜に存在し、またへパリチナ一ゼなどの酵素に対する感受性を有しなかった。

上述したようにミツドカインに関しては、これまでに癌などとの関連が報告されており、本発明者らにより見出されたミツドカインに結合するタンパク質は、癌などの疾患に対する医薬品候補化合物のスクリーニングのためのッールとして利用しうる。

従って、本発明は、ミツドカインに特異的に結合する新規な細胞膜タンパク質およびその利用に関し、より具体的には、

1 . 下記（a ) から（d ) の特徴を有するタンパク質、

( a ) ミツドカインおよびへパリン結合ミッドカインに結合する。

( b ) 抗受容体型ホスホチロシンホスファタ一ゼポリクローナル抗体に結合しない。

( c ) 細胞表面の膜タンパク質である。

( d ) へパリチナ一ゼ I、へパリチナ一ゼ I I、へパリチナーゼ I I I、ケラ夕ナ一ゼ、およびコンドロイチナ一ゼに対し感受性を有しない。 2. 下記の（a) から（e) の工程により調製することができる、ミヅドカインに結合するタンパク質、

(a) ミツドカイン結合タンパク質を発現しうる動物細胞とミツドカインとをィンキュベ一トし、

(b) 溶解緩衝液で該細胞を溶解し、

(c) その細胞溶解液に対し、抗ミツドカインポリクローナル抗体、および該抗体に親和性を有するタンパク質を吸着させた支持体を加え、

(d) 抗ミツドカインポリクローナル抗体、ミツドカイン、ミツドカインに結合するタンパク質、および該抗体に親和性を有するタンパク質を吸着させた支持体からなる免疫複合体を形成させ、

(e) 該免疫複合体からミッドカインに結合するタンパク質を単離する。

3. 工程（c) における支持体がプロテイン Aセファロ一スビーズである（2) に記載の工程により調製することができる、ミツドカインに結合するタンパク質、

4. ( 1) から（3) のいずれかに記載のタンパク質をコードする DNA、

5. (4) に記載の DNAを含有するべクタ一、

6. (5) に記載のベクタ一を保持する形質転換体、

7. (6) に記載の形質転換体を培養する工程を含む、（ 1) から（3) のいずれかに記載のタンパク質の製造方法、

8. ( 1) から（3) のいずれかに記載のタンパク質に結合する抗体、

9. ( 1) から（3) のいずれかに記載のタンパク質とミツドカインとの結合を阻害する活性を有する化合物のスクリーニング方法であって、

(a) 被検化合物の存在下で（ 1) から（3) のいずれかに記載のタンパク質またはその部分ペプチドとミヅド力インとを接触させ、（ 1) から（3) のいずれかに記載のタンパク質またはその部分ペプチドとミツドカインとの結合活性を検出する工程、

(b) 被検化合物の非存在下において検出した（ 1) から（3) のいずれかに記載のタンパク質またはその部分べプチドとミツドカインとの結合活性と比較して、

(1) から（3) のいずれかに記載のタンパク質またはその部分ペプチドとミツドカインとの結合活性を低下させる化合物を選択する工程、を含む方法、

10. (1) から（3) のいずれかに記載のタンパク質に結合するァゴニストをスクリーニングする方法であって、

(a) 被検化合物を（1) から（3) のいずれかに記載のタンパク質またはその部分べプチドを発現する細胞に接触させ、該化合物による細胞刺激活性を検出する工程、

(b) ミツドカインによる細胞刺激活性と実質的に同一の細胞刺激活性を有する化合物を選択する工程、を含む方法、

11. (1) から（3) のいずれかに記載のタンパク質に結合するアン夕ゴニストをスクリーニングする方法であって、

(a) 被検化合物の存在下で（1) から（3) のいずれかに記載のタンパク質またはその部分ぺプチドを発現する細胞とミヅドカインとを接触させ、ミヅドカィンによる細胞刺激活性を検出する工程、

(b) ミッドカインによる細胞刺激活性を低下させる化合物を選択する工程、を含む方法、

12. ミツドカインによる細胞刺激活性が（1) から（3) のいずれかに記載のタンパク質またはその部分べプチドのセリン残基のリン酸化の増強である、

(10) または（11) に記載の方法、に関する。

なお、本発明において、「ァゴ二スト」とは、「ミツドカイン結合タンパク質」に対し、ミツドカインと同様の作用を有する化合物を指す。また、本発明において「アン夕ゴニスト」とは、「ミツドカイン結合タンパク質」に対するミツドカインの作用を抑制する作用を有する化合物を指す。

本発明は、へパリン結合性成長因子ミツドカインが高分子量の細胞表面タンパク質（以下、必要に応じて「ミツドカイン結合タンパク質（MBP) 」と称する）に結合するという本発明者等による知見に基づく。従って、本発明は第一にミツド力インに結合するタンパク質「MBP」に関する。

「MBPj はミツドカインに結合するが、ミッドカインと同じくへパリン結合性成長因子である ΗΒ- EGFや、無関係の蛋白質である GST-ベーシジン融合蛋白質には結合しない。このことは「ΜΒΡ」のミツドカインへの結合が特異的であることを示唆する。また、ミツドカインは可溶型「ΜΒΡ」のみならず、生理学的な型、すなわち細胞表面に存在する膜結合型の「ΜΒΡ」にも結合する。さらに、この結合はミツド力インに反応することが知られている細胞系にもみられる。また、へパリン結合ミッドカインは「ΜΒΡ」と結合する。そして、ミツドカインの発現がィンビボで検出される発生中期と後期のマウスの胚の脳の細胞にも同様に見られる。これら事実は、「ΜΒΡ」がミツドカインのシグナル伝達に関与する分子の有力な候補であることを示唆するものである。

ミッドカインは、多種類のヒト癌で発現が増加していることが知られており (Tsutsui J.et al., Cancer Res.53:1281-1285(1993)) 、実際に、小児の腎臓癌であるウィルムス腫瘍において 6例の手術献体のすべてがミッドカインを高発現していたとの報告例がある。また、肝癌や食道癌において、非癌部ではミツドカインは発現せず、癌部でしばしば強い発現が認められることが報告されている（Ar idome.K.et al. ,Jpn. J. Cancer Res. ,86:655-661(1995)) 。大腸癌や胃癌においては、大部分の場合、癌部の方が非癌部よりもミツドカインの発現が高いことが報告されている。肺癌（Garver, R. 1. et al., Cancer, 74: 1584-1590 (1994)) 乳癌 (Garver, R. 1. et al., Am. J. espir. Cell Mol. Biol., 9: 463-466 ( 1993)) 、ニューロブラス卜一マ (Nakagawara, A. et al. , Cancer Res 55: 1792-1797 (1995)) においてもミツドカインの発現の増加が見いだされている。最近になりミツドカインとプレイオト口フィン（Pleiotrophin) が血管新生や転移に関与していることを示唆する報告もなされた（Hangana. et al., Cancer Re s., 57,1814-1819(1997)) 。これら事実から、「MBP」がミツドカインからのシグナルにより癌化に関与していることが考えられ、「MBP」は癌治療薬や癌転移予防剤を開発するための非常に重要な標的である。

「MBP」は、天然のタンパク質の他、遺伝子組み換え技術を利用した組換えタンパク質として調製することができる。天然のタンパク質は、例えば、「MBP」が発現する野生型 ICRマウスの 13.5日胚の脳細胞などの組織や、 G401細胞、 NIH3T3細胞などの培養細胞の抽出液に対し、抗ミッドカイン抗体や後述する抗「MBP」抗体を用いた免疫沈降ゃミッドカインを用いたァフィ二ティークロマトグラフィーを行うことにより調製することが可能である。一方、組換えタンパク質は、後述するように「MBP」をコードする DNAで形質転換した細胞を培養することにより調製することが可能である。

具体的には、まず、マウス胚由来の脳細胞や腫瘍細胞系である G401細胞や NIH3 T3細胞などのミツドカイン結合タンパク質を産生する細胞を [ ^{3 2} P]正リン酸などで標識し、ミツドカインとインキュベートする。次いで、該細胞を溶解緩衝液で溶解する。細胞を溶解するための緩衝液としては、例えば、実施例 1に記載の Tris -HCl(pH7.6 )、 1% NP40、 20mM EDTA、 10〃M ロイぺプチン、 ImM フエニルメチルスルホニルフルオリド、 ImM バナジウム酸ナトリウムを含む溶解緩衝液を用いることができる。次いで、その細胞溶解液を遠心してその上清を得る。遠心は、

「MBP」が含まれる画分を得るために、例えば、 lOOOOxgで 20分間の条件で行うことができる。次いで、抗ミツドカイン抗体およびプロテイン Aセファロ一スビーズを添加して、インキュベートし、抗ミヅドカイン抗体、ミツドカイン、「MBP」、およびプロティン Aセファロ一スビーズを含む不溶性の免疫複合体を形成させる。インキュベートは、該免疫複合体を形成するのに十分な時間、例えば、 4 °Cで 1 時間の条件で行うことができる。次いで、該免疫複合体を遠心により回収する。免疫複合体を SDS- PAGEで展開し、オートラジオグラフィーを行う。 SDS- PAGE後、

「MBP」のバンドを検出してゲルから切り出し、該ゲルから「MBP」を電気的に溶出することができる。また、本発明は、上記「MBP」をコードする DNAに関する。「MBP」をコードする DNAとしては、該タンパク質をコードしうるものであれば特に制限はなく、 cDNA、ゲノム DNAの他、合成 DNAも含まれる。「MBP」 cDNAは、例えば、精製した「MBP」の部分アミノ酸配列（N末端配列）をフエ二ルイソチオシァネート法（PITC法、 E dman分解法）により決定し、コドン表より決定した 1つ、またはそれ以上の合成ォリゴヌクレオチドを作製し、 ^{3 2}Pラベルしたプローブでマウス胎児の脳より作製した cDNAライブラリ一をスクリーニングすることによって調製することができる。 cDNAが得られれば、同様のゲノムライブラリーをスクリーニングすることによつて「MBP」をコードするゲノム DNAを調製することも可能である。

これら DNAは、「MBP」を組換えタンパク質として生産するために利用することができる。即ち、「MBP」をコードする DNAを適当な発現ベクターに挿入し、該べクタ一を適当な細胞に導入して得た形質転換体を培養し、発現させた夕ンパク質を精製することにより「MBP」を組換えタンパク質として調製することが可能である。「MBP」組み換えタンパク質の生産に用いられる宿主 -ベクター系における宿主としては、大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞等が考えられ、それそれ用いるベクタ一が特定される。ベクタ一としては、例えば、酵母では pHIL- Dl，pHIL- D4などが挙げられる。ベクタ一の宿主への導入方法としては、生物学的方法、物理的方法、化学的方法などが考えられる。生物学的方法としては、例えば、ウィルスベクターを使用する方法、特異的受容体を利用する方法、細胞融合法（HVJ (センダイウィルス）、ポリエチレングリコール（PEG) 、電気的細胞融合法、微少核融合法（染色体移入））が挙げられる。また、物理的方法としては、マイクロインジェクシヨン法、エレクト口ポレーシヨン法、ジーンパーティクルガン（gene g un) を用いる方法が挙げられる。化学的方法としては、リン酸カルシウム沈殿法、リボソーム法、 DEAEデキストラン法、プロトプラスト法、赤血球ゴースト法、赤血球膜ゴースト法、マイクロカプセル法が挙げられる。組換えタンパク質の精製方法としては、公知の方法、例えば、イオン交換カラム、ァフィ二ティーカラム等を利用する方法などが用いられる。最終的には、精製ミツドカイン抗原を固相化したァフィ二ティ一カラムを通して精製すると好ましい。

また、「MBP」をコードする DNAは、「MBP」と同等の機能を有するタンパク質を単離するために用いることも可能である。例えば、当業者であれば、公知の方法を用いて天然型の「MBP」中のアミノ酸の置換などを適宜行い、天然型のタンパク質と同等の機能を有する改変タンパク質を調製することが可能である。当業者に公知のアミノ酸を改変する方法としては、例えば、部位特異的変異誘発（Site - D irected Mutagenesis) 、インビトロ変異誘発 un vitro Mutagenesis) による方法が挙げられる。部位特異的変異誘発については、「01igonucleotide- directed Dual Amberj 法（Hashimoto- Gotoh，T. , et al . ( 1995)Gene 152,271-275. ,Zoller, M.J. and Smith, M. ( 1983 )Methods in Enzymolog 100，468.,広瀬進 (1986) 続生化学実験講座 1 「遺伝子研究法 II」 105.,Ausubel,F.M.,et al. ( 1987)Current P rotocols In Molecular Biology 1.6.1-1.6.10. ) 、「Gapped duplexj 法 (Kram er,W.,et al.(1984)Nucl. Acids Res.12, 9441. , Kramer, W. and Frits,H. J. ( 1987) Methods in Enzymology 154,350.) 、「Kunkel」法 (Kunkel,T.A. ( 1985)Proc.Na tl. Acad. Sci. USA 82,488. ,Kunkel,T. A. ,et al. ( 1987)Methods in Enzymology 15 4,367.) などが挙げられ、インビトロ変異誘発については、「LA PCR in vitro Mutagenesis j (Ito,W. , Ishiguro,H. and Kurosawa, Y. (1991 )Gene 102,67-70.) などが挙げられる。また、ハイプリダイゼーシヨン技術（例えば、 Sambrook,J.， Fritsh,E.F. ,Maniatis,T. (eds):Molecular Cloning, 2nd ed.，Cold Spring Harbo r Laboratory, 1989, Gubler,U. , Hoffman, B.J.： Gene, 25:263-269, 1983, Hanahan, D.:J.Mol.Biol.， 166:557-580, 1983参照) などを用いて、「MBP」をコードする DN A配列またはその一部を基に、種々の生物からこれと相同性の高い DNAを単離し、該 DNAから「MBP」と同等の機能を有するタンパク質を得ることもできる。これらタンパク質も「MBP」と同様の目的に利用しうる。

また、本発明は、「MBP」に結合する抗体に関する。「MBP」に結合する抗体は、当業者に公知の方法により調製することが可能である。ポリクローナル抗体は、例えば、以下のような方法により作成することができる。適当な方法で生産した組換え「MBP」をフロイン卜の完全アジュバント（FCA) と等量混合し、均一な乳濁液（ェマルジヨン）を得る。これをゥサギ（ニュージーランドホワイト、 2500 〜3000gr. ) の 70%アルコール綿で消毒した皮下 10ケ所程度に注入し、初回免疫とする。 2回目以降の免疫には、アジュバントとしてフロイントの不完全アジュバント（FIA) を使用する。免疫は、 2週間に 1回の割合で行い、 3回目の免疫終了後、 1週間経過したところで、予備採血を行う。得られた血液を 4°C、 1600回転で遠心し、血清を得る。この血清中の「MBP」に対する抗体価を測定する。抗体価の充分な上昇が確認されたら、計 4〜5回の免疫終了後、全採血を実施する。得られた血液は、同様に 4°C、 1600回転（rpm)で遠心し、血清とする。この血清をプロテイン Aを利用して精製する。プロテイン A精製後、「MBP」を固相化したァフィ二ティー精製用カラムを利用して、抗血清のァフィ二ティー精製を行う。このような過程でゥサギ抗「MBP」ポリクロ一ナル抗体の作製は行われる。但し、免疫動物は、ゥサギに限定されるものではなく、同様な手法で様々な動物に免疫して抗体を得ることが可能である。一方、モノクローナル抗体は、ケ一ラーとミルスタインの方法 (Kohler, G. and C. Milstein, Nature 256 : 495-497 ( 1975 )) によって作成することができる。

これにより調製された抗体は、「MBP」のァフィ二ティー精製のために用いられる他、ミッドカインの発現異常などに起因する疾患の抗体治療などに利用することが可能である。抗体治療に用いる場合には、ヒト化抗体もしくはヒト抗体であることが好ましい。ヒト化抗体は、例えば文献（野ロ浩、東隆親：抗体工学によるキメラ抗体の作製とその応用、 Medical Immunol . 22 : 628-638, 1991、野ロ浩：キメラ抗体 · ヒト型化抗体の原理と臨床応用、医学のあゆみ 167:457-462， 1 993、中谷知右、野ロ浩：抗体のヒト化、フアルマシア 33 : 24-28, 1997) 記載の方法により、またヒト抗体は、例えば、文献（Chothia, C. et al . , Nature, 324, 877( 1989 )、 Roguska,M.L. et al . , Proc. Natl . Acad. Sci . U. S. A. , 91, 969( 1994), W inter, G. et al . ,Annu.Rev. Immunol . , 12, 433( 1994)_N Lonberg,N. et al . , Nature, 368,856( 1994) ) 記載の方法により調製することが可能である。

また、本発明は、「MBP」とミツドカインとの結合を阻害する化合物のスクリーニング方法に関する。このスクリーニング方法は、（a ) 被検化合物の存在下で

「MBP」タンパク質またはその部分ペプチドとミヅド力インとを接触させ、「MB P」タンパク質またはその部分べプチドとミツドカインとの結合活性を検出するェ程、（b ) 被検化合物の非存在下において検出した「MBP」タンパク質またはその部分ペプチドとミツドカインとの結合活性と比較して、「MBP」に記載のタンパク質またはその部分べプチドとミツドカインとの結合活性を低下させる化合物を選択する工程、を含む。

これらのスクリーニング方法の基礎となる結合実験 (binding assay) は、当業者であれば、文献に記載の方法、例えば、「 "受容体の性質と測定"増殖因子とその受容体 (新生化学実験講座 7)、日本生化学会編、 p236- 267、東京化学同人、 ( 1991 )」、 Γ Schumacher, R. et al. :J. Biol. Chem.266 : 19288-19295, 1991」等に準じて実施できる。その原理は、放射性同位元素（radioisotope )で標識ラベルした薬物を用いて、組織より得られた単一細胞、ホモジネート、或いは膜分画に含まれる受容体への結合の様式を解明するものである。被検化合物としては、細胞抽出液としてのタンパク質、精製タンパク質、もしくはペプチド、人工的に合成された低分子化合物、などが挙げられるが、これらに制限されない。これにより単離される化合物としては、例えば受容体に結合するァゴニスト、アン夕ゴンニスト等があげられるが、結合実験においては、これらを総称して、リガンド（ligan d)と呼ぶことが多い。

また、本発明は、「MBP」に結合するァゴニスト若しくはアン夕ゴニストのスクリーニング方法に関する。本発明のァゴニストのスクリーニング方法は、（a ) 被検化合物を「MBP」タンパク質またはその部分ペプチドを発現する細胞に接触させ、該化合物による細胞刺激活性を検出する工程、（b ) ミツドカインによる細胞刺激活性と実質的に同一の細胞刺激活性を有する化合物を選択する工程、を含む。また、本発明のアン夕ゴニストのスクリーニング方法は、（a ) 被検化合物の存在下で「MBP」タンパク質またはその部分ペプチドを発現する細胞とミツド力インとを接触させ、ミヅド力インによる細胞刺激活性を検出する工程、（b ) ミツドカインによる細胞刺激活性を低下させる化合物を選択する工程、を含む。被検化合物としては、細胞抽出液としてのタンパク質、精製タンパク質、もしくはペプチド、人工的に合成された低分子化合物、などが挙げられるが、本発明は、これらに制限されない。被検化合物としては、上記の「MBP」とミツドカインとの結合を阻害するの化合物のスクリーニングにより単離された化合物を用いることもできる。ここで「細胞刺激活性」とは、例えば、「MBP」又はその部分ペプチドを発現する細胞系における「MBP」又はそのペプチド部分のセリン残基のリン酸化の増強が挙げられる。これにより単離された化合物は、癌の治療薬や癌転移予防剤として利用しうるのみならず、炎症性疾患（特願平 9- 205332) 、アルッハイマ —病 (Yasuhara, 0. et al . , Biochem. Biophys. Res. Commun. 192 : 246-251 , 199 3)などの治療薬を開発する標的としても重要であると考えられる。図面の簡単な説明

図 1は、実施例 1の in vivoリン酸化実験の結果を示す、 SDS-ポリアクリルアミド電気泳動図である。「MK」は可溶型ミッドカインと可溶型「MBP」との結合を示す。「MK-Hep Seph」はへパリン · ビーズ結合ミッドカインと「MBP」との結合を示す。「BSA- Hep Sephj はへパリン · ビーズ結合 BSAと「MBP」との結合を示す (陰性対照）。分子量マーカ一として、分子量の大きい方から順に、非還元状態のフイブロネクチン、還元状態のゥサギ骨格筋ミオシン、及び還元状態の大腸菌

-ガラクトシダーゼを用いた。

図 2は、実施例 1の in vivoリン酸化実験の結果を示す、 SDS-ポリアクリルアミド電気泳動図である。（A) ^{3 2}P標識タンパク質を、ミヅド力イン又は HB-EGFの存在下（それそれ「MK」または「HB-EGF」と表示）または非存在下（「つと表示）でィンキュベートし、抗ミッドカイン抗体（anti- MK) 、又は抗 HB- EGF抗体（ant i -HB-EGF) で免疫沈降させた。（B) ^{3 2}P標識タンパク質を、 l〃g/ml ミツドカイン又は GST-ベ一シジン（GST-Bsg) の存在下でインキュベートし、抗ミツドカイン抗体、杭べ一シジン抗体、又は抗 GST抗体（anti-GST) で免疫沈降させた。

図 3は、抗 PTP ポリクロ一ナル抗体（anti- PTP) は、ミツドカインの有無に関わらず、「MBP」と免疫沈降しないことを示す、電気泳動図である。ミツドカイン存在下の場合はレーンの上に「MK」で、非存在下の場合は「-」で示した。

図 4は、細胞質画分及び膜画分に対する結合実験の結果を示す電気泳動図である。

図 5は、ミヅドカイン添加の 0分後、 10分後、 30分後の「MBP」のリン酸ィ匕を示す、電気泳動図である。

図 6は、「MBP」に含まれるリン酸化アミノ酸の 2次元薄層電気泳動図である。「 8」はホスホセリン、「pT」はホスホトレオニン、「ρΥ」はホスホチロシンの標品の移動部位を示す。（Α) はミヅドカイン添加の 0分後、（Β) はミツドカイン添加の 10分後の図である。

図 7の（Α) は G401細胞、 ΝΙΗ3Τ3細胞、及び 13.5日胚の脳細胞における「ΜΒΡ」の発現を示す電気泳動図である。（Β) は 12.5日胚及び 19.5日胚の脳細胞における「ΜΒΡ」の発現を示す電気泳動図である。「ΜΚ」は、ミツドカインと共にインキュベートしたサンプル、「一」はミッドカインと共にィンキュベ一トしていないサンプルを示す。

図 8は、ミヅドカイン結合リン酸化タンパク質と抗ミッドカイン抗体との免疫沈降物の酵素分解に対する感受性を示す電気泳動図である。「Hep I」、「Hep I I j 、「Hep I I I」は、へパリナ一ゼ I、へパリナーゼ I I、へパリナーゼ I I Iを示し、「一」は酵素を添加していないことを示す。発明を実施するための最良の形態

以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

[実施例 1 ] ミツドカイン結合タンパク質の同定

ミツドカインは、マウスの 13.5日胚の脳に豊富に発現している（Mitsiadis, T. A. et al .： Development, 121 : 37-51 , 1995 ; KadomatsuJ. et al .： J. Cel l Biol . 110 :607-616, 1990) ため、マウスの 13.5日胚の脳は、ミツドカインの結合タンパク質を同定するのに、適切な材料である。野生型 ICRマウスの 13.5日胚の脳細胞を、文献記載の方法 (Kaneda,N. et al .： J. Biochem.119: 1150-1156, 1996) に従い、直径 3cmの培養皿で初代培養した。この培養細胞を、 0.1%ゥシ胎児血清及び 0. 1 % 1 TSを含み、リン酸を含まないダルベッコ改変型イーグル培地（DMEM)中で、 300〃C i/mLの^{3 2} P-正リン酸存在下、 2時間インキュベートし、細胞を標識した。 ^{3 2}P標識細胞を、 ImMバナジウム酸ナトリウムと 0.5mM EDTAを含む PBSで洗浄した後、溶解緩衝液 [0.5mLの 50mM Tris- HCl (pH7.6)、 1% NP40、 20mM EDTA, 10 /M ロイぺプチン、 ImM フエ二ルメチルスルホニルフルオリド、 ImM バナジウム酸ナトリウム] 中で、 4°C1時間撹拌し、溶解した。 4°Cで 20分間遠心分離（lOOOOxg)し、上清を得た。

上清を、ミツドカイン（l〃g/mL)の存在下、或いは非存在下、 4°Cで 1時間インキュべ一卜した。ミツドカインとその結合タンパク質との複合体を、抗ゥサギミツドカインポリク口一ナル抗体、及びプロテイン Aセファロ一ス CL4B (フアルマシァ）により免疫沈降させた。免疫沈降物を上記溶解緩衝液で洗浄し、 4%SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS- PAGE)で展開し、イメージアナライザ一 BAS200 0 (富士フィルム）で可視化した。ミツドカインと共にインキュベーションしたサンプルにのみ、分子量マーカ一である非還元状態のフイブロネクチンのバンド付近に明らかなシグナルが検出された（図 1 :MKと表示したレーンの矢印）。ミツドカインは、生理学的条件のもとでは、例えば、シンデカン- 1 (syndecan -1) (Mitsiadis,T.A.et al .： Development, 121： 37-51 , 1995； Nakanishi,T.et al. ： J. Biochem.121 :197-205, 1997) 、 N-シンデカン（N- syndecan) (Nakanishi, T.e t al.: J. Biochem.121 :197-205, 1997) 、及びリュウドカン (ryudocan) (Kojima, T.et al.： J. Biol. Chem.271 :5914- 5920, 1996) 等のへパラン硫酸プロテオグリカンと結合し、それにより、その特異的レセプ夕一と結合することが想定される。すなわち、へパラン硫酸プロテオグリカン（例えば、へパリン · ビーズ）に結合した形態のミツドカイミンにより、部分的に生理学的状況を設定することができる。そこで、 200 Lの lmg/mLミツドカインまたは 200〃Lの 1 mg/mL牛血清アルブミン (BSA)の PBS溶液を、 10%へパリンセファロース CL6B (へパリン · ビーズ；フアルマシア） 15〃Lと、 4°Cで 4時間インキュベートした後、該へパリン - ビーズを、 5 OmM Tris- HCl(pH7.6)、 1% NP40、 20mM EDTAヽ 10 /M ロイぺプチン、 ImM フエ二ルメチルスルホニルフルオリド、 ImMバナジウム酸ナトリウムを含む Ifflg/mL BSA 溶液 IfflLで、 3回洗浄した。 ³²P標識細胞を、上記と同様の方法で溶解し、該へパリン · ビーズと共に、 4°Cで、ー晚インキュベートした。免疫沈降及び SDS- PAGEは、上記と同様の方法で行った。

その結果、ミツドカインとへパリン 'セファロースとの組み合わせでは、「MB P」の分子量の位置に明らかなシグナルが検出された（図 1 ： MK-Hep Sephと表示したレーン）。しかしながら、 BSAとへパリン 'セファロ一スとの組み合わせでは、非特異的なバンドのみが検出された（図 1 ： BSA- Hep Sephと表示したレーン）。ミツドカインを用いたサンプルでは、分離ゲルの高分子量側の頂上付近にも、強いシグナル（図 1に矢印の頭だけで表示）が検出された。

検出されたシグナルが、ミツドカインに特異的なものであるかどうかを、 HB-E GF、及び GST-ベーシジン（basigin) 融合タンパク質（GST- Bsg)を用いて調べた。 HB-EGFは、へパリン結合性成長因子である (Higashiyama,S.et al.： Science, 251 :936-939,1991) 、 GST- Bsgは、免疫グロブリンスーパーファミリーに属する膜糖タンパク質であるべ一シジンの細胞外領域を用いて構築されたものである（Miya uchi , T. et al .， J. Biochem. 107: 316-323, 1990) 。結合実験は、図 1の方法に準じて行った。

その結果、該シグナルは、 HB- EGFと、抗ミヅドカイン抗体、或いは抗 HB-EGF抗体（いずれも S. Higashiyama博士より譲り受けた）との組み合わせでは、出現しなかった（図 2- A) 。また、 GST- Bsgと、抗ミツドカイン抗体、抗ベーシジン抗体、との組合せの場合も、該シグナルは、出現しなかった（図 2- B) 。これらの結果より、該シグナルは、ミツドカインと特異的に結合するタンパク質であることが、明らかとなった。該タンパク質を「MBP」と命名した。

[実施例 2 ] 「MBP」と ΡΤΡ との関連性

「ΜΒΡ」に対する一つの候補化合物として、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンであるレセプ夕一型のホスホチロシンホスファタ一ゼ（ΡΤΡ ）が考えられる c ΡΤΡ は、ミツドカインと 50%の配列の相同性を持ち、ミツドカインと多くの生物活性を共有しているプレイオト口フィンと結合する（Maeda, N. et al .： J. Biol . Chem.271 : 21446-21452, 1996 ) 。 PTP は、また、同じような親和性で、ミツド力インとも結合する（前田ら、未公開データ）。しかしながら、抗 PTP ポリクローナル抗体は、「MBP」と反応しなかった（図 3 ) 。

[実施例 3 ] 「MBP」の細胞分布

細胞分画のために、 ^{3 2}Pで標識された細胞を、セルスクレーパーを用いて lmM バナジゥム酸ナトリゥムと 0.5mM EDTAを含む PBSで収集し、ポヅ夕一型のホモジナイザ一でホモジナイズした。 4°Cで 20分間遠心分離（lOOOOxg)して、上清（細胞質画分）と沈殿物を分離した。沈殿物を溶解緩衝液で溶解し、遠心分離を行い上清 (膜画分）を得た。細胞質画分と膜画分を、実施例 1と同様の結合実験によって分析した。その結果、膜画分にのみ、「MBP」のバンドが検出された（図 4 ) 。すなわち、「MBP」は、細胞表面の膜タンパク質であることが明らかとなった。

[実施例 4 ] 「 MBP」の自己リン酸化レセプ夕一型キナーゼの自己リン酸化の単純なモデルが、「MBP」の場合に適用できるならば、「MBP」の自己リン酸化は、ミツドカインによって、誘導されると考えられる。「MBP」の自己リン酸化を調べるために、初代培養でのミツドカインの基準レベルを枯渴させた、ミツドカインノックァゥトマウスの 13.5日胚の脳の細胞を使用した。 ^{3 2}P標識細胞を、 lOOng/mLのミツドカインと共に、図 5に示された時間インキュベートした。細胞を溶解し、溶解産物について、実施例 1と同様の方法で結合実験を行った。「MBP」は、ミツドカインの非存在下でも、リン酸ィ匕されていた（図 5 ：レーン 0， ) 。リン酸化は、ミツドカインを加えて 10分後に増強した（図 5 ：レーン 10，）。ミツドカイン添加後、 0、 10、 30分後のシグナル強度の比は、 1： 1. 57： 1.31であった（図 5 ：レーン 0，，レーン 10，，及びレーン 10，）。

[実施例 5 ] 「MBP」のリン酸化部位

抗リン酸化チロシン抗体（PY20) を用いたウエスタンブロット解析において、

「ΜΒΡ」は、検出されなかった。次に、「ΜΒΡ」のリン酸化残基を決定するために、酸加水分解を行った。「ΜΒΡ」のバンドをポリアクリルアミドゲルから切り出し、 50 g/mLのプロティナ一ゼ Κと 50mMの重炭酸アンモニゥムと共に、 37°Cで 16時間ィンキュベ一卜し、「MBP」を抽出した。酸加水分解と二次元薄層電気泳動は、文献記載の方法 (Boyle, W. J. et al . : Methods Enzymol .201B : 110-149, 1991) に従つた。その結果、図 6- Aに示したように、マウスの胚から得られた「MBP」中のセリンは、ミツドカインを添加する以前（0分後）にリン酸化されていた。図 5に示した結果と一致して、セリン残基のリン酸化は、 10分後にわずかに強くなつた。しかし、他の残基、スレオニン及びチロシンはいずれもリン酸化されなかった

(図 6- B) 。 0分と 30分のセリンの強度の比率は、 1 : 1 .49であった。

[実施例 6 ] 「MBP」の細胞での発現

抗ミツドカイン抗体は、ウィルムス（Wi lm' s) 腫瘍細胞系である G401細胞の増殖を部分的に阻害する (Murajnatsu, H. et al . , Dev. Biol . , 159 : 392-402 ( 19 93 ) ) 。ミツドカインは、 NIH3T3細胞の増殖を促進し（Muramatsu, H. and Muram atsu, T.， Biochem. Biophys. Res. Co誦 un. , 177: 652-658 ( 1991 )) 、またその細胞を形質転換することができる（Kadomatsu, K. et al .， Br. J. Cancer, 75 : 354-359 ( 1997) ) 。従って、これらの細胞系は、ミツドカインの機能的なレセプ夕一 ·シグナル伝達経路を有する、と予想される。 10%牛胎児血清（FCS) を含む

DMEM培地で培養した G401細胞と NIH3T3細胞における、「MBP」の発現を調べた。図 7 - Aは、これらの細胞系で、「MBP」が発現していることを示す。 G401細胞での— 印のレーンに見られる「MBP」の弱いバンドは、 G401細胞に豊富に発現している内因性のミツドカインによるものであると思われる。さらに、 in vivoでミツドカインが発現していることが検出されている、 12.5日胚、及び 19.5日胚の脳細胞においても、「層」が発現していた（図 7-B)。

[実施例 7 ] 「MBP」の酵素感受性

「MBP」が、へパラン硫酸、或いは他のグリコサミノグリカンに結合しているかどうかを調べるために、へパリチナ一ゼ（heparitinase) (図 8の Hep I、 Hep I I、及び Hep I I I) 、ケラ夕ナ一ゼ（図 8 ) 、及びコンドロイチナ一ゼ（データは示していない）等に対する「MBP」の感受性を試験した。酵素的分解は、以下に記載するように、抗ミツドカイン抗体で免疫沈降したミツドカイン結合リン酸化タンパク質に対して行った。

Hep I、 I I、及び I I Iによる消化では、免疫沈降物を、 2 mMの塩化カルシウムを含む 40mMの Tris HCl (pH7.4)で洗浄した後、 10ュニッ卜/ mLの Hep I、 1ュニット /m Lの Hep I I、或いは 1ユニット/ mLの Hep I I I (生化学工業）を含む 20〃Lの同緩衝液で、 37°C、 1時間インキュベートした。ケラタナーゼによる消化では、免疫沈降物を 10mMの Tris- HCl(pH7.5 )で洗浄した後、 20ユニット/ mLのケラクナーゼ（生化学工業）を含む 40 zLの同緩衝液で 37°C、 1.5時間インキュベートした。コンドロイチナーゼによる消化では、免疫沈降物を 30mMの酢酸ナトリウム、 5mMの EDTA、 ImM の PMSF、 O. lmMのぺプス夕チン Aを含む 0. 1Mの Tris- HCl (pH7.4)溶液で洗浄し、 0.5 ユニット/ mLのコンドロイチナ一ゼ ABC (生化学工業）を含む 20 /Lの同緩衝液でィンキュペートした。その結果、「MBP」は、これらの酵素に感受性がないことが明らかとなつた。産業上の利用の可能性

本発明により、へパリン結合性成長因子ミッドカインと結合するタンパク質が単離され、該タンパク質を利用した化合物のスクリーニング方法が提供される。これにより新たな癌治療薬や癌転移予防薬、抗炎症剤、アルツハイマー病治療薬などの開発が可能になると考えられる。

Claims

請求の範囲

1. 下記（a) から（d) の特徴を有するタンパク質。

(a) ミヅドカインおよびへパリン結合ミッドカインに結合する。

(b)抗受容体型ホスホチロシンホスファタ一ゼポリクロ一ナル抗体に結合しない。

(c) 細胞表面の膜タンパク質である。

(d) へパリチナーゼ I、へパリチナ一ゼ II、へパリチナーゼ III、ケラ夕ナ一ゼ、およびコンドロイチナーゼに対し感受性を有しない。

2. 下記の（a) から（e) の工程により調製することができる、ミツドカインに結合するタンパク質。

(a) ミツドカイン結合タンパク質を発現しうる動物細胞とミツドカインとをィンキュベートし、

(b) 溶解緩衝液で該細胞を溶解し、

(c) その細胞溶解液に対し、抗ミツドカインポリク口一ナル抗体、および該抗体に親和性を有するタンパク質を吸着させた支持体を加え、

(d) 抗ミツドカインポリク口一ナル抗体、ミツドカイン、ミツドカインに結合するタンパク質、および該抗体に親和性を有するタンパク質を吸着させた支持体からなる免疫複合体を形成させ、

(e) 該免疫複合体からミツドカインに結合するタンパク質を単離する。

3. 工程（c) における支持体がプロテイン Aセファロースビーズである請求項 2 に記載の工程により調製することができる、ミツドカインに結合する夕ンパク質、

4. 請求項 1から 3のいずれかに記載の夕ンパク質をコ一ドする DNA。

5. 請求項 4に記載の DNAを含有するべクタ一。

6. 請求項 5に記載のベクターを保持する形質転換体。

7. 請求項 6に記載の形質転換体を培養する工程を含む、請求項 1から 3のいずれかに記載のタンパク質の製造方法。

8 . 請求項 1から 3のいずれかに記載のタンパク質に結合する抗体。

9 . 請求項 1から 3のいずれかに記載の夕ンパク質とミッドカインとの結合を阻害する活性を有する化合物のスクリーニング方法であって、

( a ) 被検化合物の存在下で請求項 1から 3のいずれかに記載のタンパク質またはその部分べプチドとミツドカインとを接触させ、請求項 1から 3のいずれかに記載のタンパク質またはその部分べプチドとミツドカインとの結合活性を検出する工程、

( b ) 被検化合物の非存在下において検出した請求項 1から 3のいずれかに記載のタンパク質またはその部分べプチドとミツドカインとの結合活性と比較して、請求項 1から 3のいずれかに記載の夕ンパク質またはその部分べプチドとミツド力インとの結合活性を低下させる化合物を選択する工程、

を含む方法。

1 0 . 請求項 1から 3のいずれかに記載のタンパク質に結合するァゴニストをスクリーニングする方法であって、

( a ) 被検化合物を請求項 1から 3のいずれかに記載のタンパク質またはその部分べプチドを発現する細胞に接触させ、該化合物による細胞刺激活性を検出する工程、

( b ) ミツドカインによる細胞刺激活性と実質的に同一の細胞刺激活性を有する化合物を選択する工程、

を含む方法。

1 1 . 請求項 1から 3のいずれかに記載のタンパク質に結合するアン夕ゴニストをスクリ一ニングする方法であって、

( a ) 被検化合物の存在下で請求項 1から 3のいずれかに記載のタンパク質またはその部分ペプチドを発現する細胞とミツドカインとを接触させ、ミツドカインによる細胞刺激活性を検出する工程、 (b) ミッドカインによる細胞刺激活性を低下させる化合物を選択する工程、を含む方法。

12. ミツドカインによる細胞刺激活性が請求項 1から 3のいずれかに記載のタンパク質またはその部分ぺプチドのセリン残基のリン酸化の増強である、請求項 10または 11に記載の方法。