WO1999029905A3 - Methode de detection de l'apoptose a l'aide d'oligonucleotides marques par fret - Google Patents

Methode de detection de l'apoptose a l'aide d'oligonucleotides marques par fret Download PDF

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Abstract

L'invention concerne des méthodes d'amplification en chaîne par polymérase induite par ligase (LM-PCR) utilisées pour détecter des fragments cibles d'acides nucléiques à double brin tels que ceux qui sont générés lors du processus apoptosique. Selon ces méthodes, un oligonucléotide détectable est incorporé dans la cible. Cet oligonucléotide détectable renferme la fraction donneur et/ou la fraction receveur d'une paire de transfert d'énergie moléculaire (MET). Un exemple de paire MET est une paire de transfert par résonance d'énergie de fluorescence (FRET) constituée d'une fraction fluorophore (donneur) et d'une fraction extinctrice de luminescence (receveur). La fraction donneur de la paire MET émet de l'énergie détectable telle que de la lumière seulement lorsque l'oligonucléotide détectable est incorporé dans la cible. Selon ces méthodes, un oligonucléotide lieur-amorce est attaché à un oligonucléotide d'aide à la liaison, ou un oligonucléotide lieur-amorce renfermant une séquence d'aide à la liaison est lié à l'extrémité 5' de chacun des brins d'un fragment d'acides nucléiques à double brin renfermant soit une extrémité franche soit un surplomb terminal. Après cette étape de liaison, un oligonucléotide détectable capable d'être attaché au complément de l'oligonuléotide lieur-amorce est incorporé dans la cible par réactions catalysées par polymérase. Selon un autre mode de réalisation, l'oligonucléotide lieur-amorce est également un oligonucléotide détectable. Eventuellement, la cible marquée par l'oligonucléotide détectable est ensuite amplifiée, l'oligonucléotide détectable étant incorporé au produit d'amplification. La cible est détectée par détection de l'énergie émise par le groupe donneur de l'oligonucléotide détectable.
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