WO1999024461A1 - Inhibiteurs de toxines clostridiales et compositions pharmaceutiques les contenant - Google Patents

Inhibiteurs de toxines clostridiales et compositions pharmaceutiques les contenant Download PDF

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WO1999024461A1
WO1999024461A1 PCT/FR1998/002401 FR9802401W WO9924461A1 WO 1999024461 A1 WO1999024461 A1 WO 1999024461A1 FR 9802401 W FR9802401 W FR 9802401W WO 9924461 A1 WO9924461 A1 WO 9924461A1
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alkyl
amino
cycloalkyl
general formula
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PCT/FR1998/002401
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Inventor
Loïc MARTIN
Fabrice Cornille
Marie-Claude Fournie-Zaluski
Bernard Roques
Original Assignee
Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm)
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/02—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing at least one abnormal peptide link
    • C07K5/0202—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing at least one abnormal peptide link containing the structure -NH-X-X-C(=0)-, X being an optionally substituted carbon atom or a heteroatom, e.g. beta-amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
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    • C07K5/06078—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aromatic or cycloaliphatic
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    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
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    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • Clostridial toxin inhibitors and pharmaceutical compositions containing them ".
  • the present invention relates to new compounds endowed with properties inhibiting the activity of clostridial toxins (tetanus and botulinum), their preparation methods and the corresponding pharmaceutical compositions Despite large vaccination programs in the world, many bacteria remain a threat to the introduced into an organism, they induce the production of various toxins and thus initiate the development of serious or even lethal diseases 0 Tetanus and botulism are two particular examples of serious neuromuscular diseases, induced by clostridial neurotoxins, respectively tetanus toxin and the seven botulinum toxin serotypes, A, B, C, D, E, F and G
  • thermolysin captop ⁇ l for the angiotensin converting enzyme and thiorphan for neutral endopeptidase 24 1 1 and many others have been shown to be ineffective even at millimolar concentrations on these toxins (Soleilhac et al . (1996)
  • the object of the present invention is precisely to propose new compounds capable of inhibiting, selectively or jointly, the enzymatic activities of tetanus toxin and of various serotypes of botulinum toxins. These compounds are potential therapeutic agents for tetanus and botulism.
  • heterocycloalkyl alkyl, aryl, arylalkyl, heteroaryl, or (heteroaryl) alkyl, substituted on the alkyl chain or on the ring by at least one group R 7 chosen from: * • ⁇ •. a sulfonamide group -SO 2 NH 2 , -SO 2 NHR 8 or
  • R 2 , R 3 independently of one another represent a hydrogen atom, an alkyl, alkoxyalkyl, carboxyalkyl, haloalkyl, hydroxyalkyl, aminoalkyl, alkylthioalkyl, cycloalkyl, heterocycloalkyl, (cycloalkyl) alkyl, (heterocycloalkyl) group ) alkyl, aryl, arylalkyl, arylarylalkyl, heteroaryl, (heteroaryl) alkyl, carbamoylalkyl, guanidinylalkyl,
  • R 1 t X, R 5, R 2, R 8, R3 and Z as defined above or below,
  • R 5 and R 6 independently of one another represent a hydrogen atom, an alkyl, cycloalkyl, (cycloalkyl) ajkyl, aryl, arylalkyl, heteroaryl, (heteroaryl) alkyl group,
  • R 2 and R 5 taken together may optionally constitute, with the nitrogen atom carrying R 5, a heterocycloalkyl group optionally
  • R 3 and R 6 taken together may optionally constitute, with the nitrogen atom carrying R 6, a heterocycloalkyl group optionally condensed with an aryl or a heteroaryl, - Z represents an OH, OR 10 , NH 2 , NHR 10 , N (R 10 ) 2 group , with R 10 being an alkyl, cycloalkyl, (cycloalkyl) alkyl, aryl or arylalkyl group and their derivatives.
  • alkyl and alkoxy a linear or branched hydrocarbon chain containing from 1 to 7 carbon atoms
  • halo-alkyl an alkyl group in which at least one hydrogen is replaced by a chlorine, bromine, iodine or fluorine atom.
  • a representative of such a group mention may in particular be made of pentafluoroethyl, 2,2,2-thchloroethyl, chloromethyl, bromomethyl and more preferably bromomethyl groups;
  • cycloalkyle a cycloalkyle group having 3, 4, 5, 6 or 7 o carbon atoms unsubstituted or substituted by 1, 2, or 3 groups alkyl, aryl, alkoxy, alkylthio, hydroxy, amino, alkylamino, dialkylamino, nitro, trifluoromethyl, or chlorine, bromine, iodine or fluorine atoms;
  • cycloalkyle a cycloalkyle group comprising at least one heteroatom taken among nitrogen, oxygen or sulfur and carrying if necessary at least one substituent as defined previously for the cycloalkyle;
  • aryl a phenyl or naphthyl group unsubstituted or substituted by 1, 2 or 3 alkyl, alkoxy, alkylthio, hydroxy, amino, alkylamino, dialkylamino, nitro, trifluoromethyle, or atom of
  • ⁇ 5 likely to be constituted by R 3 , Rs and the nitrogen atom carrying R 5 or by R 3 , R 6 and the nitrogen atom carrying R 6 , mention may in particular be made of nitrogen heterocycles such as carboxy 2-piperidinyl and carboxy 2-pyrrolidinyl.
  • organic or mineral acids may for example be salts such as the hydrochloride, hydrobromide, sulphate, nitrate, borate, phosphate, methane sulphonate, acetate, fumarate, succinate, ascorbate, oxalate, lactate, pyruvate, citrate, tartrate, maleate, malonate, benzoate , diaminobenzene sulfonate, chromoglycate, benzene sulfonate, cyclohexane sulfonate, toluene sulfonate, dipropyl acetate, glucose-1 phosphate, palmoate and palmitate.
  • salts such as the hydrochloride, hydrobromide, sulphate, nitrate, borate, phosphate, methane sulphonate, acetate, fumarate, succinate, ascorbate, oxalate, lactate, pyruvate, citrate, tart
  • R4 is represented by the group -S-CH [CHR -NH2] -X- N (R5) CHR2CON (R6) CHR3COZ, identified previously.
  • the present invention extends to the different eniantomeric forms of the claimed compounds.
  • Optically pure compounds can be isolated by enantioselective syntheses or resolutions by chiral amines.
  • a separation by semi-preparative HPLC on column v ) (Vydac C 18 , 10x250 mm, CH 3 CN-H 2 O) is carried out, allowing a biochemical and pharmacological study separate from each stereoisomer.
  • the compounds according to the invention comprise, as R, an alkyl, cycloalkyl, aryl or heteroaryl group. substituted by at least one group -SO 2 NH 2l -SO 2 NHR 8 , -SO 2 N (R 8 ) 2 , with R 8 as defined above.
  • these are compounds of general formula (I) in which X represents a carbonyl function.
  • X represents a carbonyl function and R represents an alkyl, cycloalkyl, aryl or heteroaryl group, substituted by at least a group -SO 2 NH 2 , -SO 2 NHR 8, -SO 2 N (R 8 ) 2 , -CONH 2 , -
  • R, y represents a group chosen from the groups (CH 2 ) n SO 2 NH 2l (CH 2 ) n CONH 2 or (SO 2 NH 2 ) Ph, with preferably n between 1 and 5. More preferably, it is a compound with a group
  • these are compounds of general formula I in which R 4 , R5 and R 6 represent a hydrogen atom, X a CO function and with R ⁇ representing a group (CH 2 ) 2 SO 2 NH 2 25 or a group (SO 2 NH 2 ) Ph.
  • the present invention also relates to methods of preparation. of the claimed compounds.
  • d - Pi represents a tert-butyloxycarbonyl or benzyloxycarbonyl group
  • P 2 represents a 4-methoxybenzyl or 2,4 dimethoxybenzyl group, with RT- being defined as above. 5 with an amine of general formula (III)
  • R 2 and R 3 , R 5 , R 6 and Z are defined as above, in an organic solvent, in the presence of a coupling agent and a tertiary amine, at a temperature of the order of 20 ° C.
  • the general amine (III) is carried out by operating in an organic solvent such as dichloromethane or dimethylformamide, using as coupling reagent, a compound of the BOP type [be ⁇ zotriazol-1 -yl-oxytris (dimethylamino) -phosphonium hexafluorophosphate], HATU [O- (7-azabenzotriazol-1-yl) 1, 1, 3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate], or 0 TFFH [tetramethylfluoro formamidinium hexafluorophosphate] at a reaction mixture temperature close to 20 ° C and in the presence a tertiary amine such as diisopropylethylamine.
  • an organic solvent such as dichloromethane or dimethylformamide
  • P-> and Rt are defined as above, P 3 represents a methoxy, ethoxy, allyloxy group or a chiral copula o such as that described by Evans or by Oppolzer thus allowing an enantioselective synthesis by the action of an asymmetric disulfide .
  • asymmetric disulfide of 4-methoxybenzyl and 2,4-dinitrophenyl is added to the enolate of the protected ⁇ -amino ester (IV), obtained by treatment of the ⁇ -amino ester (IV) with lithium diisopropylamide in THF at -78 ° C.
  • the saponification of the products obtained above is carried out with sodium hydroxide in a mixture of water and methanol at a temperature between 0 ° C and 20 ° C, to yield the products of general formula (II).
  • the ester (VI) can itself be obtained by Wittig reaction of a compound of formula (VII) on an aldehyde of formula (VIII).
  • the products of formula (IX) are generally obtained by reduction in alcohol of the compounds of formula (II) followed by an oxidation of Swern to aldehyde.
  • the amines of formula (III) are generally obtained by successive formation of peptide bonds either in the liquid phase or in the solid phase according to the Merrifield method on variously substituted resins in order to obtain the various protections for C-terminal acid.
  • R 2 and R 5 (respectively R 3 and R 6 ) taken together constitute a cycle
  • the substitutions R5 and R6 of the amino groups are obtained either by formation of the base of schiff between the aldehyde corresponding to R5 and the amino acid supporting R2, or between the aldehyde corresponding to R6 and the amino acid supporting R3 respectively then reduction with sodium cyanoborohydride.
  • the claimed compounds prove capable of significantly inhibiting the enzymatic activity of clostridial toxins such as tetanus toxin and the seven serotypes of botulinum toxin
  • the claimed compounds can be used in therapy in all pathological processes induced by clostridial toxins
  • the clinical applications for which the use of these compounds can be envisaged include diseases initiated by tetanus or botulinum type toxins.
  • the claimed compounds and their derivatives can be used for the preparation of corresponding pharmaceutical compositions
  • the present invention relates, according to another of its aspects, to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising as active principle at least one compound of general formula (I) or one of its derivatives
  • this compound can be associated therewith at least one pharmaceutically acceptable vehicle
  • compositions can be administered by the oral, parenteral, sublingual, transdermal or topical route.
  • oral or sublingual administration use is made in particular of tablets, simple or coated, capsules, optionally release granules. delayed, drops or liposomes as regards the intravenous, subcutaneous or intramuscular administration, recourse is had to • ** ⁇ ) sterile solutions or sté ⁇ iisables in particular for venous infusion, whereas one can make conventional patches for transdermal administration.
  • creams or lotions to spread on the skin
  • compositions according to the present invention can be prepared according to usual methods well known in the field of pharmaceutical technology.
  • the active principle can be incorporated in the excipients usually used in these pharmaceutical compositions, such as talc, gum arabic, lactose, starch, magnesium stearate, aqueous or non-aqueous vehicles, fatty substances of animal origin or vegetable, paraffinic derivatives, glycols, different wetting agents, dispersants or emulsifiers, preservatives, etc.
  • the amount of active ingredient to be administered per day depends of course on the particularity of the therapeutic indication, the severity of the conditions to be treated, as well as the weight of the patient and the route of administration.
  • the overall dose in humans generally varies between 1 and 100 mg per day, for example from 2 to 50 mg, and more suitably from 3 to 40 mg per day.
  • Unit dosage forms for systemic administration will generally comprise from 3 to 50 mg (i.e. 3, 5, 10,
  • unit doses will normally be administered one or more times a day, preferably one to three times a day.
  • the pharmaceutical compositions generally contain from 0.0001 to 1% of active principle and preferably from 0.01 to 5%.
  • the compounds according to the invention advantageously provide an antidote for any unwanted activity of botulinum neurotoxins, administered in human clinics.
  • the present invention also relates to the joint use of at least one compound of general formula (I) with at least one clostridial toxin such as tetanus toxin or botulinum neurotoxin and provides a pharmaceutical composition comprising at least one compound of general formula I in admixture with at least one clostridial toxin.
  • at least one compound of general formula (I) with at least one clostridial toxin such as tetanus toxin or botulinum neurotoxin and provides a pharmaceutical composition comprising at least one compound of general formula I in admixture with at least one clostridial toxin.
  • it is a tetanus toxin or a botulinum neurotoxin
  • the compounds described according to the invention can also be used in the context of non-therapeutic applications, in particular in systems for the diagnosis and detection of clostridial neurotoxins in muscle targets.
  • the selective inhibition of a particular serotype of clostridial toxins by the compounds described in this invention can make it possible, in an in vitro enzymatic test, to identify with certainty the serotype of toxin contaminating an aqueous solution and which may contain other enzymes.
  • the present invention also relates to a diagnostic o system for detecting clostridial neurotoxins (tetanus and botulinum) characterized in that it comprises at least one compound of general formula I.
  • HMDS 1, 1, 1, 3,3,3-hexamethyldisilazane
  • the product is purified on a silica column with the following mixture as eluent (20% AcOEt, 30% CH2Cl2, 50% cyclohexane). After concentration, with a yield of 95%, 20.06 g of (3SR) are obtained, 3- (N-benzyloxycarbonyl-amino), 5- (N-tertiobutylaminosulfonyl) methyl pentanoate, the characteristics of which are as follows:
  • Vlll-A (3S1. 3- (N-benzyloxycarbonyl-amino). 5- (M-N-tert-butylaminosulfonyl) pentanoate
  • the second pair of configuration diastereoisomers (2SR, 3R) is obtained by the same protocol using the compound described in IX-B (synthon 1).
  • BIP SYNTHESIS SYNTHESIS PATHWAY 2 2-paramethoxybenzyl-thio, 3-Boc-amino, 5-trityl-carbamoyl pentanoic acid.
  • This compound is obtained by the same protocol from Boc (D) Gin (Trt) COOH. ll-A ) (2RS. 3S ) . 2-paramethoxybenzyl-thio. 3-Boc-amino. Methyl 5-tert-carbamoyl-pentanoate.
  • reaction mixture is stirred for an additional 5 minutes at -65 ° C and then the bath is allowed to return to room temperature.
  • HF deprotection is therefore carried out at 0 ° C. with the HF: metacresol 10: 0.2 mixture for 1 hour. After distilling off the HF, the residue is taken up with a little TFA and then precipitated with a mixture cold diethyl ether: n-hexane 50:50. The product is then lyophilized. 100 mg of crude are obtained.
  • the product is purified on a semi-preparative column (Vydac C18 ref 218TP510, 20x250 mm). The two diastereomers are thus separated.
  • ⁇ CH2 (lle) 1.40 to 1.52 (m, 1 H, ⁇ CH2 (lle)), 1.60 to 1.65 (m, 1 H, ⁇ CH (lle)), 1.93 to 2.08 ( m, 1 H, ⁇ CH (Val)), 3.65 (dd, 1 H, ⁇ CH (lle)), 4.1 1 to 4.20 (m, 2H, ⁇ H2-C6H5), 4.31 (dd, 1 H, ⁇ CH (Val)) , 7.20 (m, 5H, aromatics), 8.03 (s, 3H, NH3 + ), 8.38 (d, 1H, NH (He)), 8.60 (t, 1H, NH-CH2-C6H5)
  • HF deprotection is then carried out at 0 ° C. with the HF: metacresol mixture 10: 0.2 for 1 hour. After distilling off the HF, the residue is taken up in a little TFA and then precipitated with a cold mixture of diethyl ether: n-hexane 50:50. The product is then lyophilized. 460 mg of crude is obtained.
  • the product is purified on a semi-preparative column (Vydac C18 ref 218TP510, 20x250 mm). The two diastereomers are not separated.
  • the peptide is cleaved from the resin by treatment with the trifluoroethanol: dichloromethane 2: 8 mixture (20 ml).
  • TFA deprotection is carried out with the TFA water: triisopropylsilane 40 ml mixture: 2 ml: 1 ml for 3 hours at room temperature.
  • the reaction mixture is evaporated under reduced pressure, taken up with water and then lyophilized.
  • HF deprotection is therefore carried out at 0 ° C. with the HF mixture: metacresol 10 ml: 0.2 ml for 1 hour. After distilling off the HF, the residue is taken up in a little TFA and then precipitated with a cold mixture of diethyl ether: n-hexane 50:50. After centrifugation, the pellet is taken up with water and then lyophilized. 100 mg of crude are obtained.
  • the product is purified on a semi-preparative column (Vydac C18 ref 218TP510, 20x250 mm). The two diastereomers are thus separated.
  • H-Tyr (tBu) -His (Trt) -NHBz the characteristics of which are as follows, is obtained in the liquid phase by successive condensations and deprotections of Fmoc-His (Trt) -OH and Fmoc-Tyr (tBu) -OH on the benzylamine, using the protocols known to those skilled in the art.
  • NaBH4 sodium borohydride
  • the reaction is stirred for 18 hours at a temperature in the region of 20 ° C. It is stopped by adding KHSO4O N) and extracted with AcEt. The organic phases are washed with water, KHSO4O N), NaHC ⁇ 3 (10%), a saturated NaCl solution, dried over Na2S ⁇ 4 (1 N) and then concentrated under reduced pressure.
  • HF deprotection is therefore carried out at 0 ° C. with the HF mixture: metacresol 10 ml: 0.2 ml for 1 hour. After distilling off the HF, the residue is taken up in a little TFA and then precipitated with a cold mixture of diethyl ether: n-hexane 50:50. The product is then lyophilized.
  • the two diastereoisomers obtained are purified and separated on a semi-preparative column.
  • H-Tyr (tBu) -His (Trt) -NHBz the characteristics of which are as follows, is obtained in the liquid phase by successive condensations and deprotections of Fmoc-His (Trt) -OH and Fmoc-Tyr (tBu) -OH on the benzylamine.
  • HPLC gradient 10% B to 90% B in 30 min; Macherey-Nagel C18 column: 2 peaks at 12.85 min and 14.35 min (flow rate 1.5 ml / min).
  • the two products obtained are then treated with anhydrous hydrofluoric acid in the presence of 2% m-cresol in order to deprotect the p-methoxy benzyl group protecting the sulfur and then repurified by HPLC.
  • H-Trp-Leu-OtBu the characteristics of which are as follows, is obtained by condensation of Fmoc-Trp-OH on H-Leu-OtBu followed by deprotection.
  • the inhibitory power can be determined on the activity - ⁇ endopeptidasique of the light chains purified from tetanus toxin and botulinum toxin type B by following the protocol described in the literature (Soleilhac et al, Analytical Biochemistry, 241, 120, 1996) because these two enzymes both cleave synoptobnévi ⁇ e at the same cleavage site
  • test compound (10 ⁇ l) is pre-cubed with 10 ⁇ l of light chain purified from tetanus toxin (250 ng) or botulinum toxin B for 30 minutes at 37 ° C. in a total volume of 80 ⁇ l of buffer
  • table I gives the in vitro inhibitory activity of certain compounds on the hydrolytic properties of tetanus toxin

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Abstract

La présente invention a pour objet un composé de formule générale (I). Elle se rapporte en outre à des compositions pharmaceutiques les contenant, utiles notamment pour inhiber l'activité des toxines clostridiales, en particulier la toxine tétanique et les sept sérotypes de neurotoxines botuliques de types A à G.

Description

Inhibiteurs de toxines clostridiales et compositions pharmaceutiques les contenant" .
La présente invention concerne de nouveaux composés dotés de propriétés inhibttπces de l'activité des toxines clostridiales (tétaniques et botuliques), leurs procédés de préparation et les compositions pharmaceutiques correspondantes Malgré de larges programmes de vaccination dans le monde de nombreuses bactéries demeurent une menace pour l'homme Introduites dans un organisme, elles y induisent la production de toxines variées et initient ainsi le développement de maladies graves voire létales 0 Le tétanos et le botulisme sont deux exemples particuliers de maladies neuromusculaires graves, induites par des neurotoxines clostridiales, respectivement la toxine tétanique et les sept sérotypes de toxines botuliques, A, B, C, D, E, F et G
En termes de prophylaxie, seuls un vaccin ainsi qu'un sérum 5 antitétanique sont aujourd'hui disponibles. En revanche, il n'existe à ce jour aucune thérapie pour traiter les maladies déclarées.
Le mode d'action de ces toxines, au niveau moléculaire, n'a été mis en évidence que fort récemment, en 1992 par Schiavo et al (Nature, 359, 832) Elles sont constituées de deux chaînes o polypeptidiques, l'une lourde et l'autre légère, associées par un pont disulfure La chaîne lourde est responsable de la liaison spécifique au neurone et de la pénétration cellulaire La chaîne légère bloque l'exocytose des neurotransmetteurs par protéolyse sélective et distincte de trois protéines impliquées dans ce phénomène la synaptobrévine, la 5 syntaxine et SNAP -25 La dégradation de l'une ou l'autre de ces protéines inhibe, dans le cas de la toxine tétanique, la libération des neurotransmetteurs inhibiteurs et, dans le cas des neurotoxines botuliques, la libération des neurotransmetteurs excitateurs
Cette voie de protéolyse et l'appartenance de ces toxines à ) la famille des métalloendopeptidases à zinc ont dans un premier temps conduit les chercheurs à envisager une thérapie basée sur la mise en oeuvre d'inhibiteurs puissants et sélectifs de cette activité enzymatique
Toutefois, toutes les molécules connues comme étant des inhibiteurs puissants et sélectifs de protéases à zinc telles que le
" phosphoramidon pour la thermolysine, le captopπl pour l'enzyme de conversion de l'angiotensine et le thiorphan pour l'endopeptidase neutre 24 1 1 et bien d'autres se sont révélées inefficaces même à des concentrations millimolaires sur ces toxines (Soleilhac et al. (1996)
Analytical Biochemistry, 241 , 120-127 ; Cornille et al. (1994) Europ. J.
Biochem., 222, 173-181 ; Shone et al. (1993) Europ. J. Biochem. , 217
965-971 ). Il demeure donc à ce jour un besoin de médicaments pour traiter les maladies induites par les toxines clostridiales.
La présente invention a précisément pour objet de proposer de nouveaux composés capables d'inhiber, sélectivement ou conjointement, les activités enzymatiques de la toxine tétanique et des in divers sérotypes de toxines botuliques. Ces composés sont des agents thérapeutiques potentiels du tétanos et du botulisme.
Plus précisément, la présente invention concerne des nouveaux composés de formule générale (I) :
Figure imgf000004_0001
dans laquelle :
- X représente :
:u • un groupement méthylène ou
• un groupement carbonyle,
- RT représente :
2^ « un groupement alkyle, alkoxyalkyle, alkylthioalkyle, halo- alkyle, cycloalkyle, hétérocycloalkyle, (cycloalkyl)alkyle.
(hétérocycloalkyle)alkyle, aryle, arylalkyle, hétéroaryle, ou (hétéroaryl)alkyle, substitué sur la chaîne alkyle ou sur le cycle par au moins un groupement R7 choisi parmi : *•<• . un groupe sulfonamide -SO2NH2, -SO2NHR8 ou
-SO2N(R8)2,
. un groupe amide, -CONH2, -CONHR8 ou -CON(R8)2,
. un groupe aminé NH2, -NHR8 ou -N(R8)2 et
. un groupe guanidinyle avec R8 étant un groupement alkyle, cycloalkyle, (cycloalkyl)alkyle, aryle ou arylalkyle,
- R2, R3 représentent indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène, un groupement alkyle, alkoxyalkyle, carboxyalkyle, halo- alkyle, hydroxyalkyle, aminoalkyle, alkylthioalkyle, cycloalkyle, heterocycloalkyle, (cycloalkyl)alkyle, (hétérocycloalkyle)alkyle, aryle, arylalkyle, arylarylalkyle, hétéroaryle, (hétéroaryl)alkyle, carbamoylalkyle, guanidinylalkyle,
10
- R4 représente
• un atome d'hydrogène,
• un groupement acétyle, 1 • un groupement benzoyle,
• un groupement -SR avec R9 étant un groupement alkyle, cycloalkyle, (cycloalkyl)alkyle, aryle, arylalkyle, ou
• un groupement
2u -S-CH[CHRι-NH2]-X-N(R5)CHR2CON(R6) CHR3COZ,
avec R1 t X, R5, R2, R8, R3 et Z tels que définis ci-dessus ou ci-après,
- R5 et R6 représentent indépendamment l'un de l'autre un atome 25 d'hydrogène, un groupement alkyle, cycloalkyle, (cycloalkyl)ajkyle, aryle, arylalkyle, hétéroaryle, (hétéroaryl)alkyle,
- R2 et R5 pris ensemble peuvent éventuellement constituer avec l'atome d'azote portant R5 un groupement heterocycloalkyle éventuellement
**(> condensé avec un aryle, ou un hétéroaryle,
- R3 et R6 pris ensemble peuvent éventuellement constituer avec l'atome d'azote portant R6 un groupement heterocycloalkyle éventuellement condensé avec un aryle ou un hétéroaryle, - Z représente un groupement OH, OR10, NH2, NHR10, N(R10)2, avec R10 étant un groupement alkyle, cycloalkyle, (cycloalkyl)alkyle, aryle ou arylalkyle et leurs dérivés.
5 Les définitions des différents groupements proposés dans la formule générale I des composés revendiqués sont précisées dans la liste ci-dessous. Ces définitions s'appliquent aux termes tels qu'ils sont utilisés à travers ce texte (à moins qu'elles soient limitées à des exemples précis) soit individuellement soit en tant que faisant partie d'un groupe plus large. io C'est ainsi qu'au sens de l'invention, on entend désigner par :
- alkyle et alkoxy, une chaîne hydrocarbonée linéaire ou ramifiée comportant de 1 à 7 atomes de carbone ;
- halo-alkyle, un groupement alkyle dans lequel au moins un 15 hydrogène est remplacé par un atome de chlore, de brome, d'iode ou de fluor. A titre représentatif d'un tel groupement on peut citer notamment les groupements pentafluoroéthyle, 2,2,2-thchloroéthyle, chlorométhyle, bromométhyle et plus préférentiellement le bromométhyle ;
- cycloalkyle, un groupement cycloalkyle ayant 3, 4, 5, 6 ou 7 o atomes de carbone non substitué ou substitué par 1 , 2, ou 3 groupements alkyle, aryle, alkoxy, alkylthio, hydroxy, amino, alkylamino, dialkylamino, nitro, trifluoromethyle, ou atomes de chlore, brome, iode ou fluor ;
- heterocycloalkyle, un groupement cycloalkyle comportant au moins un hétéroatome pris parmi l'azote, l'oxygène ou le soufre et 5 portant le cas échéant au moins un substituant tel que défini précédemment pour le cycloalkyle ;
- aryle, un groupement phényle ou naphtyle non substitué ou substitué par 1 , 2 ou 3 groupements alkyle, alkoxy, alkylthio, hydroxy, amino, alkylamino, dialkylamino, nitro, trifluoromethyle, ou atome de
-o chlore, brome, iode ou fluor ;
- hétéroaryle, un groupement 2- ou 3-furanyle, 2- ou 3- thiényle, 2-, 3- ou 4-pyπ'dinyle, 4-imidazoiyie et 3-indolyle.
A titre illustratif des groupements hétérocycliques
^5 susceptibles d'être constitués par R3, Rs et l'atome d'azote portant R5 ou par R3, R6 et l'atome d'azote portant R6, on peut notamment citer les hétérocycles azotés comme les carboxy 2-pipéridinyle et carboxy 2- pyrrolidinyle.
Au sens de la présente invention, on entend couvrir sous le terme "dérivés" notamment les sels d'addition des composés de formule
5 générale (I) obtenus avec des acides organiques ou minéraux pharmacologiquement acceptables. Il peut par exemple s'agir de sels tels que les chlorhydrate, bromhydrate, sulfate, nitrate, borate, phosphate, méthane sulfonate, acétate, fumarate, succinate, ascorbate, oxalate, lactate, pyruvate, citrate, tartrate, maléate, malonate, benzoate, îo diaminobenzène sulfonate, chromoglycate, benzène sulfonate, cyclohexane sulfonate, toluène sulfonate, dipropyl acétate, glucose-1 phosphate, palmoate et palmitate.
Parmi ces dérivés, on peut également citer les dimères de
15 composés de formule générale I, constitués par deux molécules de composés de formule générale I, identiques ou différentes, couplées entre elles au niveau de leurs atomes de soufre respectifs. Dans ce cas particulier, R4 est représenté par le groupement -S-CH[CHR -NH2]-X- N(R5)CHR2CON(R6) CHR3COZ, identifié précédemment.
20 De même, la présente invention s'étend aux différentes formes éniantomériques des composés revendiqués.
En effet, les composés de formule (I), possédant plusieurs carbones asymétriques, ils existent sous forme de mélanges soit racémiques ou de diastéréoisomères ou encore sous forme de
2^ stéréoisomères purs.
Les composés optiquement purs peuvent être isolés par des synthèses énantiosélectives ou des résolutions par des aminés chirales. Dans le cas de procédés de préparation conduisant à des mélanges de stéréoisomères, une séparation par HPLC semi-préparative sur colonne v) (Vydac C18, 10x250 mm, CH3CN-H2O) est effectuée, permettant une étude biochimique et pharmacologique séparée de chaque stéréoisomères.
Parmi ces stéréoisomères, sont préférés ceux possédant une configuration absolue (S) ou (R) sur le carbone portant le groupement Ri . ?5 (S) ou (R) sur le carbone portant la fonction -SR4, et (S) sur les carbones portant les groupements R2 et R3 De préférence, les composés selon l'invention comprennent à titre de R, un groupement alkyle, cycloalkyle, aryle, ou hétéroaryle. substitué par au moins un groupement -SO2NH2l -SO2NHR8, -SO2N(R8)2, avec R8 tel que défini précédemment.
Selon un autre mode particulier de l'invention, il s'agit de composés de formule générale (I) dans laquelle X représente une fonction carbonyle.
ιo A titre de composés préférés selon la présente invention, on peut plus particulièrement citer les composés de formule générale (I) dans laquelle X représente une fonction carbonyle et R, représente un groupement alkyle, cycloalkyle, aryle, ou hétéroaryle, substitué par au moins un groupement -SO2NH2, -SO2NHR8, -SO2N(R8)2, -CONH2, -
15 CONHR8. -CON(R8)2, NH2, -NHR8 ou -N(R8)2l avec R8 tel que défini précédemment. Selon un mode préféré de l'invention, R, y représente un groupement choisi parmi les groupements (CH2)nSO2NH2l (CH2)nCONH2 ou (SO2NH2)Ph, avec de préférence n compris entre 1 et 5. Plus préférentiellement, il s'agit d'un composé avec un groupement
-" (CH2)nSO2NH avec n compris entre 1 et 5
Plus préférentiellement, il s'agit de composés de formule générale I dans laquelle R4, R5, et R6 représentent un atome d'hydrogène, X une fonction CO et avec R^ représentant un groupement (CH2)2SO2NH2 25 ou un groupement (SO2NH2)Ph.
A titre illustratif des composés revendiqués selon l'invention on peut plus particulièrement citer les dérivés suivants :
) - N-(N-(2-mercapto, 3-amino, 5-sulfamoyl pentanoyl)- L-Valyl- L-
Isoleucine,
N-(N-(2-mercapto, 3-amino, 5-sulfamoyl pentanoyl)- L-Valyl)- L- Isoleucyl- benzylamide,
N-(N-(2-mercapto, 3-amino, 5-sulfamoyl pentanoyl)- L-Tyrosyl- L- 55 Histidine,
N-(N-(2-mercapto, 3-amino, 5-sulfamoyl pentanoyl)- L-Tyrosyl)- L- Histidyl-benzylamide, N-(N-(2-mercapto, 3-amino, 5-sulfamoyl pentyl)-L-Tyrosyl)-L- Histidine, -(N-(2-mercapto, 3-amino, 3-(3-sulfamoyl) phényl propanoyl)- L- Tyrosyl)- L-Histidyl-beπzylamide, * - N-(N-(2-mercapto, 3-amino, 5-carbamoyl pentanoyl)-L-β (2- naphtyl)-Ala-L-β(2-naphtyl)-Alanine,
N-(N-(2-mercapto, 3-amino, 5-carbamoyl pentanoyl)-L-Trp)-L- Leucine.
m La présente invention a également pour objet des procédés de préparation. des composés revendiqués.
Les composés de formule générale (I) dans laquelle X représente un groupement carbonyle, CO, peuvent être préparés par 15 couplage d'un acide de formule générale (II) :
Figure imgf000009_0001
dans laquelle:
d - Pi représente un groupement tertbutyloxycarbonyle ou benzyloxycarbonyle,
P2 représente un groupement 4-méthoxybenzyle ou 2,4 diméthoxybenzyle, avec RT- étant défini comme précédemment . 5 avec une aminé de formule générale (III)
Figure imgf000009_0002
dans laquelle: R2 et R3, R5, R6 et Z sont définis comme précédemment, dans un solvant organique, en présence d'un agent de couplage et d'une aminé tertiaire, à une température de l'ordre de 20°C.
Généralement, le couplage de l'acide de formule (II) sur
5 l'aminé générale (III) est effectué en opérant dans un solvant organique comme le dichlorométhane ou le diméthylformamide, en utilisant comme réactif de couplage, un composé du type BOP [beπzotriazol-1 -yl-oxy- tris(diméthylamino)-phosphonium hexafluorophosphate], HATU [O-(7- azabenzotriazol-1-yl)1 ,1 ,3,3-tétraméthyluronium hexafluorophosphate], ou 0 TFFH [tétraméthylfluoro formamidinium hexafluorophosphate] à une température de mélange réactionπel voisine de 20°C et en présence d'une aminé tertiaire comme la diisopropyléthylamine.
Ces produits de formule générale (II) peuvent préalablement 5 être obtenus par sulfénylation électrophile du β-amiπo ester protégé de formule (IV),
Figure imgf000010_0001
Dans cette formule, P-> et Rt sont définis comme précédemment, P3 représente un groupement méthoxy, éthoxy, allyloxy ou une copule chirale o telle que celle décrite par Evans ou par Oppolzer permettant ainsi une synthèse énantiosélective par action d'un disulfure asymétique.
Généralement, le disulfure asymétrique de 4-méthoxybenzyle et de 2,4-dinitrophényle est ajouté sur l'énolate du β-amino-ester protégé (IV), obtenu par traitement du β-amino ester (IV) par le diisopropylamidure 5 de lithium dans le THF à -78°C. La saponification des produits obtenus précédemment est effectuée par la soude dans un mélange d'eau et de méthanol à une température comprise entre 0°C et 20°C, pour conduire aux produits de formule générale (II).
Ces produits de formule (IV) peuvent préliminairement être o obtenus soit :
- par homologation selon la réaction de Arndt-Eistert à partir de l'amino-acide protégé de formule (V): 61
Figure imgf000011_0001
ce produit de formule (V) étant converti en diazocétone par addition de diazomethane sur l'anhydride mixte obtenu par traitement de (V) avec le chloroformiate d'isobutyle. Le réarrangement de Wolff avec du benzoate d'argent en présence d'un alcool (méthanol, éthanol, alcool allylique ou autre) conduit alors au composé de formule (IV), ou
- par addition de Michael de l'amidure de lithium de la benzyl-1 -phényléthylamine (+) ou (-) sur l'ester α,β insaturé de formule (VI). L'utilisation de cette aminé secondaire chirale permet une synthèse parfaitement énantiosélective (ee> 99%), la configuration obtenue dépendant de la configuration absolue de l'aminé de départ. La débenzylation du β-amino acide est obtenue par hydrogénolyse sous 20 bars d'hydrogène en présence d'hydroxyde de palladium sur charbon et en présence de B0C2O afin de protéger l'aminé primaire obtenue par un groupement f-butoxycarbonyl (Pi).
\
COP,
(VI)
L'ester (VI) peut être lui même obtenu par réaction de Wittig d'un composé de formule (VII) sur une aldéhyde de formule (VIII) .
Figure imgf000011_0002
Les composés de formule générale (I) dans laquelle X représente un groupement méthylène, CH2., peuvent être préparés par traitement d'une aminé de formule générale (III) telle que définie précédemment avec une aldéhyde de formule (IX)
Figure imgf000012_0001
dans laquelle R^ P^ et P2 sont définis comme précédemment, au sein d'un solvant organique et en présence d'un catalyseur.
De préférence, le traitement de l'aminé (III) sur l'aldéhyde (IX) est effectué dans un solvant organique en présence d'acide paratoluènesulfonique en tant que catalyseur pour la formation de l'imine suivie de la réduction par le cyanoborohydrure de sodium conduisant au composé de formule (I), dans lequel X = CH2.
Les produits de formule (IX) sont généralement obtenus par réduction en alcool des composés de formule (II) suivie d'une oxydation de Swern en aldéhyde.
La transformation de (II) en alcool est obtenue par réduction au borohydrure de sodium de l'anhydride mixte de (II) . L'oxydation de Swern est réalisée par action du DMSO en présence de chlorure d'oxalyle dans un solvant organique.
Les aminés de formule (III) sont généralement obtenues par formation successive de liaisons peptidiques soit en phase liquide soit en phase solide selon la méthode de Merrifield sur des résines diversement substituées afin d'obtenir les différentes protections de l'acide C-terminal. A l'exception des structures où R2 et R5 (respectivement R3 et R6) pris ensemble constituent un cycle, les substitutions R5 et R6 des groupes amino sont obtenues soit par formation de la base de schiff entre l'aldéhyde correspondant à R5 et l'acide aminé supportant R2, ou entre l'aldéhyde correspondant à R6 et l'acide aminé supportant R3 respectivement puis réduction par le cyanoborohydrure de sodium. Les composés revendiqués s'avèrent capables d'inhiber significativement l'activité enzymatique des toxines clostridiales comme la toxine tétanique et les sept sérotypes de toxine botulique
A ce titre, les composés revendiqués peuvent être utilises en thérapie dans tous les processus pathologiques induits par des toxines clostridiales
Plus précisément, les applications cliniques pour lesquelles on peut envisager l'utilisation de ces composés comprennent les maladies initiées par des toxines de type tétanique ou botulique m A ces fins, les composés revendiqués et leurs dérivés peuvent être utilisés pour la préparation de compositions pharmaceutiques correspondantes
Plus particulièrement, la présente invention concerne, selon un autre de ses aspects, une composition pharmaceutique comprenant en tant que principe actif au moins un composé de formule générale (I) ou un de ses dérivés
Bien entendu, ce composé peut y être associé à au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable
De même on peut envisager d'introduire conjointement deux 2o ou plusieurs composés de formule générale I dans une même composition pharmaceutique
Ces compositions pharmaceutiques peuvent être administrées par voie orale, parentérale, sublinguale, transdermique ou topique 25 En ce qui concerne l'administration par voie orale ou sublinguale, on utilise en particulier des comprimés, simples ou dragéifiés, des gélules, des granules éventuellement à libération retardée, des gouttes ou encore des liposomes En ce qui concerne l'administration par voie intraveineuse, sous-cutanée ou intramusculaire, on a recours à des **•<) solutions stériles ou stéπiisables en particulier pour perfusion veineuse, tandis que l'on peut réaliser les patches conventionnels pour l'administration par voie transdermique. Pour l'utilisation topique on peut utiliser des crèmes ou des lotions à étendre sur la peau
Les compositions pharmaceutiques selon la présente "Ô invention peuvent être préparées selon des méthodes usuelles bien connues dans le domaine de la technique pharmaceutique Le principe actif peut être incorporé dans les excipients habituellement employés dans ces compositions pharmaceutiques, tels que le talc, la gomme arabique, le lactose, l'amidon, le stéarate de magnésium, les véhicules aqueux ou non, les corps gras d'origine animale ou végétale, les dérivés paraffiniques, les glycols, les différents agents mouillants, dispersants ou émulsifiants, les conservateurs, etc.
La quantité de principe actif à administrer par jour dépend bien entendu de la particularité de l'indication thérapeutique, de la gravité des affections à traiter, ainsi que du poids du malade et de la voie d'administration.
Pour une administration systémique, la dose globale chez l'homme varie généralement entre 1 et 100 mg par jour, par exemple de 2 à 50 mg, et plus convenablement de 3 à 40 mg par jour.
Des formes unitaires de dosage pour l'administration systémique comprendront généralement de 3 à 50 mg (à savoir 3, 5, 10,
20, 30, 40, et 50 mg de produit). Ces doses unitaires seront administrées normalement une ou plusieurs fois par jour, de préférence une à trois fois par jour.
Pour l'administration topique, les compositions pharmaceutiques contiennent généralement de 0,0001 à 1 % de principe actif et de préférence de 0,01 à 5 %.
Outre cette utilisation des composés de formule générale (I), à titre d'agent thérapeutique potentiel des maladies induites par des toxines clostridiales, comme le tétanos ou le botulisme, on peut également envisager leur utilisation conjointe avec des toxines, botuliques par exemple, à des fins thérapeutiques.
En effet, il a été développé en clinique humaine des méthodes de traitement thérapeutiques symptomatiques des dystonies par hyperactivité motoneuronale. Ce type de prophylaxie est en particulier proposé pour traiter des troubles du type strabisme, blépharospasme, crampe de l'écrivain, spasme hémifacial. La thérapie consiste à injecter des doses de toxines clostridiales au niveau de l'organisme traité. Il est clair que compte tenu du caractère toxique de ces toxines, les doses mises en oeuvre, doivent être minimisées de manière à prévenir tout effet secondaire néfaste. La co-administration d'un composé selon l'invention avec une toxine offre donc la possibilité d'employer des doses plus importantes et donc plus efficaces de ces toxines.
En conséquence, les composés selon l'invention fournissent 5 avantageusement un antidote pour toute activité non désirée de neurotoxines botuliques, administrées en clinique humaine.
On peut également envisager le développement de protocole de co-administration permettant la détection et/ou titration de l'activité de 0 ces toxines dans des cibles musculaires définies pour atteindre le résultat clinique désiré.
En conséquence, la présente invention a également pour objet l'utilisation conjointe d'au moins un composé de formule générale (I) avec au moins une toxine clostridiale comme la toxine tétanique ou la 5 neurotoxine botulique et propose une composition pharmaceutique comprenant au moins un composé de formule générale I en mélange avec au moins une toxine clostridiale. Selon un mode particulier de l'invention, il s'agit d'une toxine tétanique ou d'une neurotoxine botulique
Les composés décrits selon l'invention peuvent également o être utilisés dans le cadre d'applications non thérapeutiques en particulier dans des systèmes de diagnostic et de détection de neurotoxiπes clostridiales dans des cibles musculaires.
En effet, l'inhibition sélective de tel ou tel serotype de toxines clostridiales par les composés décrits dans cette invention peut 5 permettre dans un test enzymatique in vitro d'identifier avec certitude le serotype de toxine contaminant une solution aqueuse et pouvant contenir d'autres enzymes.
La présente invention a également pour objet un système de o diagnostic pour détecter des neurotoxines clostridiales (tétanique et botuliques) caractérisé en ce qu'il comprend au moins un composé de formule générale I.
Les exemples présentés ci-après à titre non limitatif mettront 5 en évidence d'autres avantages de la présente invention. Les protons de spectre de résonance magnétique nucléaire sont numérotés selon les règles de nomenclature en vigueur et les déplacements chimiques sont mesurés en ppm en utilisant le 1 ,1 ,1 ,3,3,3- hexaméthyldisilazane (HMDS) comme étalon interne.
5 " '
A - PROCEDE DE PREPARATION GENERAL DE PEPTIDYL RESINE
La synthèse des peptidyl résines H-Aι-A2-dichlorotritylrésine (respectivement H-A-|-A2-HMP-résine ou H-A-ι-A2-Rink-amide-résine) est o réalisée sur la dichlorot tylrésine substituée à 1 ,35 mmol/g
(respectivement HMP-résine ou Rinkamide-résine substituée à 1 ,0 mmol/g) en utilisant la stratégie Fmoc sur un synthétiseur Applied Biosystems ABI 431 B'\ L'acide aminé protégé Fmoc-An-OH (1 mmol) est couplé à 125 mg (200 μmol) de dichlorotrityl-résine dans la NMP en 5 présence de diisopropyléthylamine (DIEA) (respectivement, à 150 mg de
HMP-résine (150 μmol)) en présence de DCC (dicyclohexylcarbodiimide) et de DMAP (diméthylaminopyridine). Le groupement α-amino est déprotégé par un traitement avec 20% de piperidine dans la NMP (N- méthylpyrrolidone). Les différents acides Fmoc-An-OH (1 mmol), sont o successivement couplés dans la NMP en utilisant comme agent d'activation le couple dicyclohexylcarbodiimide (DCC)/ 1 - hydroxybenzotriazole (HOBt). Le groupement Fmoc est clivé avec une solution de 20% en piperidine dans la NMP. Après chaque couplage et déprotection, la résine est alternativement lavée avec de la NMP et du 5 dichlorométhane.
B - PROCEDE DE PREPARATION DES DIFFERENTS SYNTHONS:
Bl . SYNTHESE DU SYNTHON 1 :
Acide 2-(paraméthoxybenzyl-thio)-, 3-(N-benzyloxycarbonyl-amino)-,
5-(N-tertiobutylaminosulfonyl) pentanoïque.
Ce synthon est commun aux exemples 1 , 2, 3, 4 et 5. I-) Acide (2SR). 4. 4'-dithiobis. 2-ι/N-benzyloxycarbonvn-amino. butanoïσue ou (SR) (Z - HOMOCYS - OH)9
A un mélange de dioxanne (100 ml) / eau (100 ml), on ajoute
5 à 0 °C, 5,52 g de soude en pastilles (137,9 mmol) puis 18,5 g (68,94 mmol) de (SR) (D,L) Homocystine commerciale . On coule alors goutte à goutte une solution de chloroformiate de benzyle (100 ml). Pendant l'addition, on ajuste le pH à 9 avec une solution de NaOH (1 N) puis on laisse revenir à température ambiante et on agite pendant 2 heures. On
I O évapore le dioxanne puis on ajoute de l'acétate d'éthyle et on acidifie la phase aqueuse avec HCI 2N jusqu'à pH=1 . On l'extrait à trois reprises avec de l'acétate d'éthyle puis on sèche la phase organique avec une solution de NaCI saturée et un passage sur Na2Sθ4. Après évaporation à sec, on reprend la phase organique avec du toluène puis avec du
15 dichlorométhane.
On obtient, avec un rendement de 99,2%, 36,7 g (68,39mmol) de (Z - Homocys- OH)2 dont les caractéristiques sont les suivantes:
2o Rf (MeOH:CH2Cl2:H2θ:AcOH 3:7:0,6:0,3)= 0,55
1 H RMN (d6-DMSO) δ 1.85 à 2.00 (m, 1 H, CH-ÇH2-CH2), 2.00 à 2.15 (m, 1 H, CH-CHrCH?). 2.70 (t, 2H, CH-CH?-CH?). 4.08 (m, 1 H, ÇH-CH2-CH2), 4.97 (s, 2H, ÇH2-C6H5), 7.30 (m, 5H, CH aromatiques), 7.58 (d, 1 H, NH- Z).
25
II-) (2SR L 4, 4'-dithiobis, 2-(N-benzyloxycarbonyl)-amino butanoate de méthyle ou (SR) (Z - Homocys - OMe)?
A une solution de 36,7 g de (Z-Homocys-OH)2, dans un mélange de dichlorométhane (50 ml) / éther (50 ml) refroidi à O°C, on ajoute un excès de diazomethane. Après 1 heure, l'excès de diazomethane est neutralisé par ajout d'AcOH jusqu'à disparition de la coloration jaune. On évapore à sec. On obtient, avec un rendement de 89,5%, 34,52 g de (Z - Homocys - OMe )2 dont les caractéristiques sont les suivantes: - ,„ , ^- /24461 16
Rf (AcOEt/cyclohexane 3:7) = 0,27
1 H RMN (d6-DMSO) δ 1 .82 à 2.10 (m, 2H, CH-CH?-CH9). 2.68 (m, 2H, CH-CH2-ÇH2), 3.60 (s, 3H, COOMe), 4.13 (m, 1 H, ÇH-CH2-CH2), 4 " (s, 2H,_Ç_H2-C6H5), 7.2 à 7.4 (m, , 5H, CH aromatiques), 7.73 (d, 1 H, NH-Z)
III-) (2SR), 2-(N-benzyloxycarbonyl)-amino. 4-(N-tertiobutylaminosulfonyl) butanoate de méthyle
A une solution de 34,51 g (61 , 19 mmol) de (Z - Homocys -
OMe )2 refroidie à 0 °C dans 20 ml de MeOH et 250 ml de CCI4, du chlore gazeux est mis à buller sous vive agitation pendant 35 minutes. On purge le mélange réactionnel avec de l'azote. L'évaporation à sec permet d'obtenir, avec un rendement de 87%, 37,25 g de 2-(N- benzyloxycarbonyl)-amino 4- (chlorosulfonyl) butanoate de méthyle .
A une solution de 37,25 g (106,5 mmol) du composé précédent dans 140 ml de CH2CI2, refroidi à 0 °C est ajoutée rapidement une solution de 50 ml de tBuNH2 dans 50 ml de CH2CI2. Après 30 minutes d'agitation, on filtre le chlorhydrate de tBuNH2- On rince avec un peu de CH2CI2 puis on évapore à sec. On obtient, avec un rendement de
95%, 39,12 g de (2SR), 2-(N-benzyloxycarbonyl-amino), 4-(N- tertiobutylaminosulfonyl) butanoate de méthyle dont les caractéristiques sont les suivantes:
Rf (AcOEt:CH2Cl2 10:90) = 0,35
1 H RMN (d6-DMSO) δ 1 .18 (s, 9H, tBu), 1 .89 à 2.15 (m, 2H, CH-CH9- CH2), 2.84 à 3.09 (m, 2H, CH-CH9-CH9). 3.59 (s, 3H, COOMe), 4.22 (m, 1 H, ÇH-CH2-CH2), 4.99 (s, 2H, CH9-CfiH.g). 6.84 (s, 1 H, SO2-NH), 7.29 (m, 5H, CH aromatiques), 7.80 (d, 1 H, NH-Z)
IV-) Acide (2SR), 2-(N-beπzyloxycarbonyl-amino), 4-(N- tertiobutylaminosulfonyl) butanoïque
A une solution de 39, 12 g (101 ,22 mmol) de (2SR), 2-(N- beπzyloxycarbonyl-amino), 4-(N- tertiobutylaminosulfonyl) butanoate de méthyle dans 100 ml, refroidie à 0 °C, est ajoutée une solution de 1 1 ,33 g (283,42 mmol) de NaOH dans 100 ml de MeOH. Après 3 heures d'agitation, on évapore le MeOH.. On ajoute de l'eau. La phase aqueuse est extraite avec Et2θ. On acidifie la phase aqueuse avec KHSO4 (2N) puis on extrait 3 fois avec de l'acétate d'éthyle. L'ensemble des phases organiques est lavé par de l'eau, séché sur sulfate de sodium et évaporé.
On obtient avec un rendement de 99%, 37,40 g d'acide (2SR), 2-(N- benzyloxycarbonyl-amino), 4-(N-tertiobutylaminosulfonyl) butanoïque dont les caractéristiques sont les suivantes:
Pf = 133°C
Rf (MeOH:AcOH:CH2Cl2) = 0,31
1 H RMN (d6-DMSO) δ 1.08 (s, 9H, tBu), 1.75 à 2.00 (m, 2H, CH-CH9- CH2), 2.70 à 2.84 (m, 1 H, CH-CH9-CH9). 2.84 à 2.98 (m, 1 H, CH-CH2- CHZ). 3.98 (m, 1 H, ÇH-CH2-CH2), 4.86 (s, 2H, CH9-CfiH*). 6.72 (s, 1 H, SO2-NH), 7.19 (m, 5H, CH aromatiques), 7.56 (d, 1 H, NH-Z). 12.70 (s, 1 H,
COOH).
V-) (3SRL 3-(N-benzyloxycarbonyl-amino), 5-(N-tertiobutylaminosulfonyl) pentanoate de méthyle
On dissout 20 g (53,7 mmol) d'acide (2SR), 2-(N- benzyloxycarbonyl-amino), 4-(N-tertiobutylaminosulfonyl) butanoïque dans 15 ml de DMF, on y ajoute 100 ml de THF fraîchement distillé puis 7,1 ml (1 ,2 eq) de N-méthylmorpholine. A -15°C, on ajoute goutte à goutte 8,5 ml d'iBuOCOCI sous azote et on laisse agiter 20 minutes. Après filtration du chlorhydrate de N-méthylmorpholine, on ajoute un excès de diazomethane. Après une heure d'agitation, on évapore et on reprend à l'acétate d'éthyle. Les phases organiques sont lavées avec H2O, NaHCθ3 (10%), NaCI saturé puis on sèche sur Na2Sθ4 et on évapore pour obtenir avec un rendement quantitatif, 21 ,12 g de (3SR), 3-(N-benzyloxycarbonyl- amino), 4-oxo, 5-diazenyl, N-tertiobutylsulfonamide pentanoate.
A une solution de 21 ,12 g (53,28 mmol) de (3SR), 3-(N- benzyloxycarbonyl-amino), 4-oxo, 5-diazenyl, N-tertiobutylaminosulfonyl pentanoate dans 180 ml de méthanol, on coule goutte à goutte une solution de 1 ,64 g de benzoate d'argent dans 70 ml de triéthylamine. Après une agitation d'1 h 30, on ajoute une spatule de célite, une spatule de charbon actif et 50 ml de NaCI. On agite pendant 1 heure et on filtre sur célite.
Le filtrat est évaporé à sec. Le résidu est repris avec de l'AcOEt. Les phases organiques sont lavées avec NaHCθ3 (10%), H2O, KHSO4CI N) et NaCI saturé. On sèche sur Na2SÛ4 et on évapore à sec.
Le produit est purifié sur une colonne de silice avec comme éluant le mélange suivant (20% AcOEt, 30% CH2CI2, 50% cyclohexane).Après concentration, on obtient avec un rendement de 95%, 20,06 g de (3SR), 3- (N-benzyloxycarbonyl-amino), 5-(N-tertiobutylaminosulfonyl) pentanoate de méthyle dont les caractéristiques sont les suivantes:
Pf = 88°C
Rf (AcOEt:CH2Cl2:cyclohexane 1 : 1 :1 ) = 0,48
1 H RMN (CDCI3) δ 1.29 (s, 9H, tBu), 1 .99 (m, 2H, CH-CH9-CH9). 2.54 (d, 2H, CH9-COOMe), 3.05 (t, 2H, CH-CH9-CH?). 3.61 (s, 3H, COOMe), 4.02
(m, 1 H, ÇH-CH2-CH2), 4.14 (s, 1 H, SO2-NH), 5.03 (s, 2H, CH9-C6H . 5.37 (d, 1 H, NH-Z), 7.2 à 7.4 (m, 5H, CH aromatiques)
VI-) Acide (3SR~). 3-(N-benzyloxycarbonyl-amino). 5-(N- tertiobutylaminosulfonyl) pentanoïque
10 g (25mmol) de (3SR), 3-(N-benzyioxycarbonyl-amino), 5- (N-tertiobutylaminosulfonyl) pentanoate de méthyle est saponifié selon la méthode décrite précédemment dans l'exemple Biv en utilisant 2 équivalents de NaOH.
On obtient avec un rendement quantitatif, 9,65 g (25 mmol) d'acide (3SR), 3-(N-benzyloxycarbonyl-amino), 5-(N- tertiobutylaminosulfonyl) pentanoïque dont les caractéristiques sont les suivantes:
Rf (MeOH:AcOH:CH2Cl2) = 0,46 H RMN (d6-DMSO) δ 1.18 (s, 9H, tBu), 1 .67 à 1 .90 (m, 2H, CH-CH9- CH2), 2.37 (d, 2H, CH9-COOH). 2.89 (t, 2H, CH-CH9-CH9). 3.83 (m, 1 H, ÇH-CH2-CH2), 4.95 (s, 2H, ÇH2-C6H5), 6.77 (s, 1 H, SO2-NH), 7.29 (m,
5H, CH aromatiques) Vll-A) Acide (3S). 3-(N-benzyloxycarbonyl-amino). 5-(N- tertiobutylaminosulfonyl) pentanoïque
9,65 g (25 mmol) d'acide (3SR), 3-(N-benzyloxycarbonyl- amino), 5-(N-tertiobutylarninosulfonyl) pentanoïque sont résolus en utilisant un équivalent de D(+)-α-méthyl-benzylamine dans un système chloroforme/ isopropanol. On obtient avec un rendement de 73,9%, 3,571 g (9,24 mmol) d'acide (3S), 3-(N-benzyloxycarbonyl-amino), 5-(N- tertiobutylaminosulfonyl) pentanoïque. L'excès énantiomérique (94%) est déterminé après couplage avec la D(+)-α-méthyl-benzylamine et comparé avec la synthèse réalisée sur la L-homocystine. Les caractéristiques de ce produit sont les suivantes:
Rf (MeOH:AcOH:CH2Cl2 5:5:90) = 0,46
1 H RMN (d6-DMSO) δ 1.18 (s, 9H, tBu), 1.67 à 1.90 (m, 2H, CH-CH?- CH2), 2.37 (d, 2H, CH9-COOH). 2.89 (t, 2H, CH-CH9-CH9). 3.83 (m, 1 H,Ç_H-CH2-CH2), 4.95 (s, 2H, CHp-CfiHfi., 6.77 (s, 1 H, SO2-NH), 7.29 (m, 5H, CH aromatiques)
VH-B) L'acide (3R). 3-(N-benzyloxycarbonyl-amino) 5-(N- tertiobutylaminosulfonyl) pentanoïque
Il est obtenu par un protocole analogue en utilisant la D(-)-α- méthyl benzylamine.
Vlll-A) (3S1. 3-(N-benzyloxycarbonyl-amino). 5-(N-tertiobutylaminosulfonyl) pentanoate de méthyle
A une solution de 2,405 g (6,22 mmol) d'acide (3S), 3-(N- benzyloxycarbonyl-amino), 5-(N-tertiobutylaminosulfonyl) pentanoïque, 675 mg (7,09 mmol) de 4-hydroxypyridine dans 15 ml de pyridine, est ajouté à 0°C 1 ,580 g ( 7,66 mmol) de dicyclohexylcarbodiimide (DCC). La suspension est agitée pendant 3 heures à température ambiante puis concentrée sous pression réduite. On ajoute, à 0°C, 10 ml de méthanol.
On agite pendant une nuit à 50°C. La suspension est concentrée puis repris avec de l'AcOEt, le précipité de dicyclohexylurée est filtré. Le filtrat «/^ OO/-M,.A .
WO 99/24461 20
est ensuite lavé avec KHSO4 (1 N), NaHCθ3(10%), une solution saturée de NaCI, séché sur Na2SÛ4 puis évaporé sous pression réduite.
On obtient avec un rendement quantitatif, 2,49 g ( 6,22 mmol) de (3S), 3-(N-benzyloxycarbonyl-amino), 5-(N- tertiobutylaminosulfonyl) pentanoate de méthyle dont les caractéristiques sont les suivantes:
Rf (AcOEt:CH2Cl2*cyclohexane 1 :1 :1 ) = 0,48
1 H RMN (CDCI3) δ 1.29 (s, 9H, tBu), 1.99 (m, 2H, CH-CH9-CH9). 2.54 (d, 2H, CH9-COOMe), 3.05 (t, 2H, CH-CH2-ÇH2), 3.61 (s, 3H, COOMe), 4.02
(m, 1 H, ÇH-CH2-CH2), 4.18 (s, 1 H, SO2-NH), 5.03 (s, 2H, CH9-CfiH.q). 5.37 (d, 1 H, NH-Z), 7.2 à 7.4 (m, 5H, CH aromatiques)
Vlll-B) L'ester (3R) 3-(N-benzyloxycarbonyl amino) 5-. N-tertiobutyl amino sulfonyl) pentanoate de méthyle
Il est obtenu par un protocole analogue en utilisant l'acide (3R) décrit dans le paragraphe Vll-B (synthon 1 ).
IX-A) (2S.3S). 2-(ρaraméthoxybenzyl-thio), 3-(N-benzyloxycarbonyl- amino), 5-(N-tertiobutylaminosulfonyl) pentanoate de méthyle.
Sous azote, 1 ,5 g (3,75 mmol) d'ester (3S), 3-(N- benzyloxycarbonyl-amino), 5-(N-tertiobutylamino-thio) pentanoate de méthyle est dissout dans 10 ml de THF. A -78°C, 6 ml de LDA (2M/ heptane/THF/ethyl benzène ; 4,80 mmol) sont ajoutés goutte à goutte. Après 30 minutes, on ajoute à -78°C 1 ,98 g (5,625 mmol) de disulfure de paraméthoxybenzyle et 2,4 dinitrophenyle, et la solution est agitée pendant 2 heures à -78°C. On ajoute KHSO4 (1 N), on extrait avec de l'acétate d'éthyle ; les phases organiques sont lavées par KHSθ4(1 N),
NaCI saturée, séchées sur Na2Sθ puis évaporées sous pression réduite.
Après purification sur colonne de silice
(AcOEt:CH2Cl2*cyclohexane 2:3:5), on obtient avec un rendement de
54%, 1 ,125g de (2S.3S) 2-(paraméthoxybenzyl-thio), 3-(N- benzyloxycarbonyl-amino), 5-(N-tertiobutylaminosulfonyl) pentanoate de méthyle dont les caractéristiques sont les suivantes. L'excès énantiomérique est supérieur à 95 % comme en témoigne l'analyse HPLC. Rf (AcOEt:CH2Cl2:cyclohexane 1 :1 : 1 ) = 0,57
Rf (AcOEt:CH2Cl2:cyclohexane 15:25:60) = 0,15
1 H RMN (CDCI3) δ 1.25 (s, 9H, tBu), 1.86 à 2.30 (m, 2H, CH-CH9-CH9). 5 2.96 (t, 2H, CH-CH9-CH9). 3.29 (2d, 1 H, CH-S), 3.64 (s, 3H, COOMe),
3.72 (s, 5H, S-CH9-CfiH4-OMe). 4.02 (m, 1 H, ' ÇJH-CH2-CH2), 4.87 (s, 1 H,
SO2-NH), 5.05 (s, 2H, ÇJH2C6H5), 5.50 (d, 1 H, NH-Z), 6.75 (d, 2H, CH aromatiques ortho à OMe), 7.14 (d, 2H, CH aromatiques meta à OMe),
7.27 (m, 5H, CH aromatiques), m SM (ES), (M+H)+ m/z 539.3, (M+Na)+ m/z 561.3
IX-B) 2-(paraméthoxybenzyl-thio). 3-(N-benzyloxycarbonyl-amino). 5-. N- tertiobutylaminosulfonyl) pentanoate de méthyle.
15 Le composé analogue de configuration (2R, 3R) est obtenu par le même protocole en utilisant le composé décrit en Vlll-B (Synthon 1 ).
X-A) Acide (2SR.3S). 2-(paraméthoxybenzyl-thio). 3-. N- benzyloxycarbonyl-amino), 5-(N-tertiobutylaminosulfonyl) pentanoïque.
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A 0,546 g de (2S.3S) 2-(paraméthoxybenzyl-thio),3-(N- benzyloxycarbonyl-amino), 5-(N-tertiobutylaminosulfonyl) pentanoate de méthyle dans 5 ml de méthanol, on ajoute 1 ml de NaOH (6N). En suivant les conditions opératoires décrites dans l'exemple Biv, on obtient avec un
25 rendement de 91 %, 484 mg d'acide (2SR, 3S), 2-(paraméthoxybenzyl- thio), 3-(N-benzyloxycarbonyl-amino), 5-(N-tertiobutylaminosulfonyl) pentanoïque dont les caractéristiques sont les suivantes:
Rf (AcOEt:AcOH:CH2Cl2 30:2:70) = 0,24 et 0,32 1 H RMN (CDCI3) δ 1 .21 (s, 9H, tBu), 1 .79 à 1 .93 (m, 1 H, CH-CH9-CH?).
1 .96 à 2.10 (m, 1 H, CH-CH9-CH9). 2.97 (t, 2H, CH-CH9-CH9). 3.24 et 3.30 (d, 1 H, CH-S), 3.70 (s, 3H, OMe), 3.76 (s, 2H, CH9-CH4-OMe). 4.04 (m, 1 H, ÇH-CH2-CH2), 5.01 (s, 2H, CHp-CfiHfi). 5.60 (d, 1 H, NH-Z), 6.72 et 6.77 (d, 2H, CH aromatiques ortho à OMe), 7.12 et 7.17 (d, 2H, CH
35 aromatiques meta à OMe), 7.25 (br s, 5H, CH aromatiques). X-B) (2SR. 3R) 2-(paraméthoxybenzyl-thio). 3-(N-beπzyloxycarbonyl- amino). 5-(N-tertiobutylaminosulfonyl) pentanoïque.
Le deuxième couple de diastéréoisomères de configuration (2SR, 3R) est obtenu par le même protocole en utilisant le composé décrit en IX-B (synthon 1 ).
BIP VOIE DE SYNTHESE DU SYNTHON 2 : Acide 2-paraméthoxybenzyl-thio, 3-Boc-amino, 5-trityl-carbamoyl pentanoïque.
Ce synthon est commun aux exemples 7 et 8 .
l-A) (3S .. 3-(N-tButyloxycarbonyl-amino). S-fN-Trityl-carbamovD- pentanoate de méthyle
A partir de 10 g (20,5 mmol) de (L) Boc Gln(Trt)COOH, on obtient en suivant les conditions opératoires de l'exemple By (Synthon 1 ), avec un rendement de 85 %, 4,35 g de (3S), 3-Boc-amino-5-Trityl- carbamoyl-pentanoate de méthyle dont les caractéristiques sont les suivantes:
Rf (AcOEt:CH2Cl2 1 :3) = 0,58 "" H RMN (d6-DMSO) δ 1.32 (s, 9H, tBu), 1.25 à 1.37 (m, 1 H, CH-CH9-
CH2), 1.40 à 1.53 (m, 1 H, CH-CH9-CH9). 2.20 (t, 2H, CH-CH9-CH9). 2.30 (d, 2H, CH2COOMe), 3.50 (s, 3H, COOMe), 3.63 à 3.77 (m, 1 H, ÇH-CH2- CH2), 6.67 (d, 1 H, NH-Boc), 7.08 à 7.22 (m, 15H, Trt), 8.50 (s, 1 H, NH-Trt)
IB) (3R) 3-ιΕoc-amino. 5-(trityl carbamoyl) pentanoate de méthyle.
Ce composé est obtenu par le même protocole à partir de la Boc (D) Gin (Trt) COOH. ll-A) (2RS. 3S). 2-paraméthoxybenzyl-thio. 3-Boc-amino. 5-Tπtyl- carbamoyl-pentanoate de méthyle.
A partir de 1 ,032 g de (3S), 3-Boc-amino-5-Trityl-carbamoyl- pentanoate de méthyle, on obtient en suivant les conditions opératoires de l'exemple B|χ (Synthon 1 ), avec un rendement de 43%, 574 mg de (2RS,
3S), 2-paraméthoxybenzyl-thio, 3-Boc-amino, 5-Trityl-carbamoyl- pentanoate de méthyle dont les caractéristiques sont les suivantes:
Rf (AcOEt:CH2Cl2:cyclohexane 20:30:50) = 0,27
1 H RMN (d6-DMSO) δ 1.32 (s, 9H, tBu), 1.28 à 1.37 (m, 1 H, CH-CH9- CH2), 1.86 à 1.95 (m, 1 H, CH-CH9-CH9). 2.10 à 2.24 (m, 2H, CH-CH2- CH9), 3.22 (d, 1 H, CH-S), 3.55 (s, 3H, COOMe), 3.67 (2s, 5H, S-CH9- CfiH4-OMe), 3.70 à 3.78 (m, 1 H, ÇH-CH2-CH2), 6.72 (d, 1 H, NH-Boc), 6.79 (d, 2H, CH aromatiques ortho à OMe), 7.12 (d, 2H, CH aromatiques meta à OMe), 7.10 à 7.23 (m, 15H, Trt), 8.50 (s, 1 H, NH-Trt) MS (EI) 153, 243, 559, 669.
Il-B) (2 RS. 3R). 2-paraméthoxy benzyl-thio. 3-(Boc-amino). 5-(Trityl- carbamovD-pentanoate de méthyle
Il est obtenu par le même protocole à partir du composé (IB) (Synthon 2).
lll-A) Acide (2RS. 3S). 2-ρaraméthoxybenzyl-thio. 3-Boc-amino. 5-trityl- carbamoyl pentanoïque
A partir de 334 mg (0,5 mmol) de (2RS, 3S), 2-( synthon 1 ) Bx paraméthoxybenzylsulfanyl, 3-Boc-amino, 5-trityl-carbamoyl-pentanoate de méthyle, on obtient en suivant les conditions opératoires de l'exemple (Synthon 1 ) Bx, avec un rendement de 97%, 317 mg d'acide (2RS, 3S), 2- paraméthoxybenzylthio, 3-Boc-amino, 5-trityl-carbamoyl pentanoïque dont les caractéristiques sont les suivantes:
Rf (MeOH:CH2Cl2 10:90) = 0,4 1 H RMN (d6-DMSO) δ 1.30( 1.39) (s, 9H, tBu), 1.55 à 1.66 (m, 1 H, βCH2(Gln)), 1.80 à 1.93 (m, 1 H, βCH2(Gln)), 2.13 à 2.26 (m, 2H, yCH2(Gln)), 3.12 (3.18) (d, 1 H, CH-S), 3.68 (s, 5H, ÇH2-C6H5-OÇH3), 3.70 à 3.80 (m, 1 H, αCH(Gln)), 6.62(6.70) (d, 1 H, BocNH), 6.80 (d, 2H, CH arom ortho à OMe), 7.12 (d, 2H, CH arom meta à OMe), 7.10 à 7.25 (m, 15 H, Trt), 8.48 (8.52) (s, 1 H, NHTrt)
Ill-B) Acide (2RS. 3R), 2-paraméthoxybenzyl-thio. 3-Boc-amino. 5-trιtyl- carbamoyl pentanoïque
Le composé analogue de configuration (2RS, 3R) est obtenu par le même protocole à partir du composé décrit en (IIB) (Synthon 2).
Bill) VOIE DE SYNTHESE DU SYNTHON 3:
Acide 2-(para éthoxybenzyl-thio)-, 3-{N-t-butoxycarbonyl-amino)-, 3- (3-(N-tertiobutylaminosuifonyi)phényi) propanoïque.
Ce synthon est utilisé dans l'exemple 6.
I-) Acide 3-(N-tertiobutylaminosulfoπyl) benzoïque
A une solution de 12,5 g (56,6 mmol) de l'acide 3- chlorosulfonyl benzoïque dans 200 ml de CH2CI2, refroidi à 0 °C est ajoutée rapidement une solution de 21 ml (198 mmol) de tBuNH2 dans 50 ml de CH2CI2. Après 30 minutes d'agitation, on filtre le chlorhydrate de tBuNH2- On rince avec un peu de CH2CI2 puis on évapore à sec. On obtient, avec un rendement de 95%, 13,83 g d'acide 3-(N- tertiobutylaminosulfonyl) benzoïque dont les caractéristiques sont les suivantes :
Rf (AcOH Toluene, 3/7) = 0,45
1 H RMN (d6-DMSO) δ 1.05 (s, 9H, tBu), 7,65 (s, 1 H, S0 NH) 7,65(t, 1 H aromatique), 8,00 (d, 1 H, aromatique), 8,08 (d, 1 H, aromatique), 8,33 (s, 1 H, aromatique). II-) 3-(N-tertiobutylaminosulfonyl) phenyl méthanol
A une solution de 12,94 g (50,3 mmol) d'acide 3-(N- tertiobutylaminosulfonyl) benzoïque dans 100 ml de 1 ,2-diméthoxyéthane (DME) sont ajoutés successivement à -15°C 6,6 ml (60,3 mmol) de N- méthyl morpholine et 7,8 ml (60,3 mmol) de chlσroformiate d'isobutyle. Après 5 minutes, le précipité de chlorhydrate de N-méthyl morpholine est filtré et lavé avec du DME. Au filtrat recueilli dans un grand ballon, est ajoutée à -15°C une solution de 5g (130 mmol) de NaBH4 dans 10 ml d'eau. Après 30 minutes de réaction, 100 ml d'eau sont ajoutés et le DME évaporé sous, pression réduite. La phase aqueuse est alors extraite par 2x100 ml d'acétate d'éthyle. La phase organique est alors lavée par NaCI saturé avant d'être séchée sur Na2Sθ4- On obtient, avec un rendement de 90 %, 10,9 g de 3-(N-tertiobutylaminosulfonyl) phenyl méthanol dont les caractéristiques sont les suivantes:
1 H RMN (d6-DMSO) δ 1.04 (s, 9H, tBu), 4,52 ( d, 2H, CH?OH). 5,36(t, 1 H, CH2OH) , 7,45 (s, 1 H, SO2NH), 7,46(d, 2H, aromatique), 7,64 (dd, 1 H, aromatique), 7,77 (s, 1 H, aromatique). Rf (AcOH/Toluène, 3/7) = 0,24
III-) 3-(N-tertiobutylaminosulfonyl) benzaldehyde
A une solution de 4,7 ml (53,7 mmol) de chlorure d'oxalyl (fraîchement distillé) dans 100 ml de dichlorométhane , est ajouté goutte à goutte, à -78°C, sous azote, une solution de 9,5 ml (134 mmol)* de DMSO dans 20 ml de dichlorométhane. Une solution de 10,9 g (44,8 mmol) de 3- (N-tertiobutylaminosulfonyl) phényl méthanol dans 4ml de DMSO puis 30 ml de CH2CI2 est coulé goutte à goutte. L'agitation est maintenue pendant 30 minutes, puis on ajoute 31 ,2 ml (224 mmol) de triéthylamine.
Le mélange réactionnel est agité pendant 5 minutes supplémentaires à -65°C puis on laisse revenir le bain à température ambiante.
Après 1 h d'agitation, on ajoute de l'eau et la phase aqueuse est extraite au dichlorométhane. Les phases organiques sont combinées, lavées avec KHSO4O N), NaHCθ3(10%), NaCI saturée, séchées sur
Na2SÛ4- Après concentration sous pression réduite, on obtient avec un rendement de 96%, 10,45 g de 3-(N-tertiobutylaminosulfonyl) benzaldehyde dont les caractéristiques sont les suivantes :
Rf (AcOEt cyclohexane, 1/2) = 0,32
1 H RMN (DMSO) δ 1.05 (s, 9H, tBu), 7,70 (s, 1 H, SO2NH), 7,78(t, 1 H, aromatique), 8, 10 (d, 2H, aromatiques), 8,29 (s, 1 H, aromatique), 10,05 (s, 1 H, CHO).
IV-) 3-(3-(N-tertiobutylaminosulfonyl) phenyl) propenoate d'éthyle
20,4 ml(102 mmol) de triéthyl phosphonoacetate sont coulés goutte à goutte à une suspension d'hydrure de sodium ( 3g, 104 mmol) dans le DME (200 ml). Après 30 minutes d'agitation à 45°C, 16,8 g (69,6 mmol) de 3-(N-tertiobutyiaminosulfonyl) benzaldehyde sont ajoutés rapidement et le mélange agité pendant 45 minutes à 50 °C. On ajoute alors 250 ml de mélange eau-glace et on extrait par 250 ml d'acétate d'éthyle. La phase organique est lavée par NaCI saturé avant d'être séchée sur Na2S04. Après concentration sous pression réduite, on obtient avec un rendement de 95 %, 20,56 g de 3-(3-(N- tertiobutylaminosulfonyl) phenyl) propenoate d'éthyle dont les caractéristiques sont les suivantes :
Rf (AcOEt/cyclohexane, 4/6) = 0,40 H RMN (DMSO) δ 1.05 (s, 9H, tBu), 1 ,20 (t,3H, CH3-CH2), 4,15 (q,2H,
CH3-CH9.. 6,65(d, 1 H, ÇHφ), 7,50 (s, 1 H, SO2NH), 7,58 (t, 1 H, aromatique) 7,68(d, 1 H, Ç_H-COOEt),7,82 (d, 1 H, aromatique) 7,91 (d, 1 H, aromatique), 8,10 (s, 1 H, aromatique).
V-A) (3R) 3-(3-(N-tertiobutylaminosulfonyl) phenyl) 3-(ΥS)-N-benzyl-1 - phényléthylamino) propanoate d'éthyle
A une solution de 4g(18,9 mmol) de (S) (-) N-benzyl-1 - phényléthylamine(préparé selon la procédure décrite par Juaristi , Murer et Seebach(1993) Synthesis, p 1243-1246) dans 70 ml de THF anhydre sont ajoutés à 0°C 1 1 ,8 ml (18,9 ml) de nBuLi (1 ,6 M dans l'hexane). Le mélange réactionnel est agité 15 minutes puis refroidi à -78°C. 2,36 g Λ „ - - ^ 9/24461 27
(7,56 mmol) dans 30 ml de THF sont ajoutés goutte à goutte au mélange réactionnel qui est agité 30 minutes supplémentaires avant d'ajouter 30 ml d'une solution aqueuse de KHSO4 (1M). Après évaporation du THF, la phase aqueuse est extraite avec de l'acétate d'éthyle. La phase organique est lavée par KHSθ4(1 N), NaHCθ3 saturé, NaCI saturé, séchée sur
Na2S04 puis évaporée sous pression réduite.
Après purification sur colonne de silice (AcOEt CH2CI2/cyclohexane 1 ,5/1 ,5/7), on obtient avec un rendement de 87%, 3,28 g de (3R) 3-(3-(N-tertiobutylaminosulfonyl) phényl) 3-((S)-N- benzyl-1-phényléthylamino) propanoate d'éthyle dont les caractéristiques sont les suivantes. L'excès énantiomérique est supérieur à 95 % comme en témoigne l'analyse HPLC et la RMN.
Rf (AcOEt cyclohexane, 3/7) = 0,41 1 H RMN (CDCI3) δ 1 ,02 (t,3H, CH2ÇH3), 1.13 (s, 9H, tBu), 1 ,20 (t,3H, CH-
CH3), 2,57 (M, 2H, ÇH2-COO ), 3,64 (d, 2H, ÇJH2Φ), 3,84 à 3,95 (m, 3H, CH3-ÇH2 et CH3-ÇH), 4,47 (q, 1 H, ÇH-CH2-COOB) 4,51 (s, 1 H, SO2NH), 7,11 à 7,35 (m, 2φ, 10H), 7,39 (dd, 1 H, aromatique) ,7,51 (d, 1 H, aromatique) 7,71 (d, 1 H, aromatique), 7,90 (s, 1 H, aromatique).
V-B) 3-(3-(N-tertiobutylaminosulfonyl) phenyl) 3-((S)-N-benzyl-1 - phényléthylamino) propanoate d'éthyle
Le composé analogue de configuration (3S) est obtenu par le même protocole en utilisant la (R) (-) N-benzyl-1 -phényléthylamino) propanoate d'éthyle.
Vl-A) (3R) 3-(N-t-butoxycarbonyl-amino)-. 3-(3-(N-tertiobutylaminosulfonyl) phenyl) propanoate d'éthyle
3,28 g (6,28 mmol) de (3R) 3-(3-(N-tertiobutylaminosulfonyl) phenyl) 3-((S)-N-benzyl phénylét ylamino) propanoate d'éthyle et 4,8 g (22 mmol) de B0C2O sont solubilisés dans 60 ml d'acétate d'éthyle contenant 4,4 g Pd(OH)2 /C (20%). La solution est vigoureusement agitée en présence de 20 bars d'hydrogène à 25 °C pendant 18 heures. Après élimination du catalyseur par filtration sur célite, le filtrat est évaporé sous pression réduite et purifié sur colonne de silice (AcOEt/cyclohexane, 1/3) „ _ __-, 24461 28
pour obtenir avec un rendement de 85% 2,28g de (3R) 3-(N-t- butoxycarbonyl-amino)-, 3-(3-(N-tertiobutylaminosulfonyl)phényl) propanoate d'éthyle dont les caractéristiques sont les suivantes.
Rf (AcOEt cyclohexane, 3/7) = 0,21
1 H RMN (CDCI3) δ 1 , 13 (t,3H, CH2 H3), 1.15 (s, 9H, tBu-NH-S02 -), 1 35 (s, 9H, Boc), 2,76 (d, 2H, CH9-COOE-), 3,99 (q, 2H, CH3-CH9). 4,60 (s, 1 H, SO2NH), 5,08 (m, 1 H, ÇH-CH2-COOEt), 5,58 (d, 1 H, NH-Boc), 7,38 (dd, 1 H, aromatique) ,7,40 (d, 1 H, aromatique) 7,72 (d, 1 H, aromatique), 7,77 (s, 1 H, aromatique).
Vl-B) (3S1 3-(N-t-butoxycarbonyl-amino)-. 3-(3-(N- tertiobutylaminosulfonyl) phényl) propanoate d'éthyle
Le composé analogue de configuration (3S) est obtenu par le même protocole à partir du composé décrit en (V-B) (Synthon 3).
Vll-A) (2S.3S) 2-(paraméthoxybenzyl-thio)-, 3-(N-t-butoxycarbonyl-amino)- . 3-(3-(N-tertiobutylaminosulfonyl)phényl) propanoate d'éthyle
Sous azote, 0,5 g (1 , 17 mmol) d'ester (3R) 3-(N-t- butoxycarbonyl-amino)-, 3-(3-(N-tertiobutylaminosulfonyl)phényl) propanoate d'éthyle est dissous dans 10 ml de THF. A -78°C, 1 ,9 ml de LDA (2M/ heptane/THF/ethylbenzene; 3,8 mmol) sont ajoutés goutte à goutte. Après 30 minutes, on ajoute à -78°C 0,5 g (1 ,4 mmol) de disulfure de paraméthoxybenzyle et 2,4 dinitrophenyle (préparé selon Bischoff et al., (1997) J.Org.Chem., 62(14), p 4848-4850), et la solution est agitée pendant 2 heures à -78°C. On ajoute KHSO4 (1 N), on extrait avec AcOEt ; les phases organiques sont lavées par KHSθ4(1 N), NaCI saturée, séchées sur Na2Sθ4 puis évaporées sous pression réduite.
Après purification sur colonne de silice (AcEt/cyclohexane 1/3), on obtient avec un rendement de 49%, 331 mg de (2S,3S) 2- (paraméthoxybenzyl-thio)-, 3-(N-t-butoxycarbonyl-amino)-, 3-(3-(N- tertiobutylaminosulfonyl)phényl) propanoate d'éthyle dont les caractéristiques sont les suivantes. L'excès énantiomérique est supérieur à 95 % comme en témoigne l'analyse HPLC et la RMN. Rf (AcOEt/cyclohexane, 3/7) = 0,31 H RMN (CDCl3) δ 1 ,08 (t,3H, CH2ÇH3), 1.12 (s, 9H, tBu-NH-SQ9 -). 1.36 (s, 9H, Boc), 3,40 (d, 1 H, ÇH-COOEt), 3,75(s, 3H et 2H, OMe et φ-CH9-S) 3,96 (q, 2H, CH3-CH7). 4,51 (s, 1 H, SO2NH), 5,00 (m, 1 H, BocNH-ÇH), 6,11 (d, 1 H, NH-Boc), 6,82(d, 2H, φ-OMe), 7,22(d, 2H, φ-OMe),7,25 (d, 1 H, aromatique), 7,30 (t, 1H, aromatique) , 7,50 (s, 1H, aromatique), 7,68 (d, 1 H, aromatique).
Vll-B) (2R. 3R). 2-(paraméthoxybenzyl-thio)-. 3-.N-t-butoxycarbonyl- amino)-. 3-(3-(N-tertiobutylaminosulfonyl)phényl) propanoate d'éthyle
Le composé analogue de configuration (2R, 3R) est obtenu par le même protocole à partir du composé décrit en (Vl-B) (Synthon 3).
Vlll-A) acide (2SR.3S). 2-(paraméthoxybenzyl-thio)-. 3-(N-t-butoxy- carbonylamino)-. 3-(3-(N-tertiobutylaminosulfonyl)phényl) propanoïque.
A 0,33 g (0,57 mmole) de (2S,3S) 2-(ρaraméthoxybenzyl- thio)-, 3-(N-t-butoxycarbonyl-amino)-, 3-(3-(N- tertiobutylaminosulfony phényl) propanoate d'éthyle dans 2,5 ml d'éthanol, on ajoute 2,5 ml de NaOH (2N). En suivant les conditions opératoires décrites dans l'exemple (Synthon 1 ) B|v, on obtient avec un rendement de 98%, 310 mg d'acide (2SR.3S), 2-(paraméthoxybenzyl- thio)-,3-(N-t-butoxycarbonyl-amino)-,3-(3-(N-tertiobutylamino sulfonyl)phényl) propanoïque dont les caractéristiques sont les suivantes :
Rf (CH2Cl2/MeOH/AcOOH, 96/3/1 ) = 0, 16
1 H RMN (CDCI3) (deux diastéréoisomères A et B) δ 1 ,1 1 (A) et 1 .12 (B) (s, 9H, tBu-NH-S02 -), 1 ,30 (A) et 1 ,35 (B) (s, 9H, Boc), 3,40 (A) et 3,45
(B) (d, 1 H, ÇH-COOEt), 3,72 et 3,75 (A+B) (s, 3H et 2H, OMe et φ-CH?- S), 3,65 (s, 1 H, SO2NH), 5,05 (A) et 5,32 (B) (m, 1 H, BocNH-ÇH), 5,37 (A) et 6,20 (B) (d, 1 H, NH-Boc), 6,75 (A) et 6,80 (B) (d, 2H, φ-OMe), 7, 12 (A) et 7,20 (B) (d, 2H, φ-OMe),7,30 (A+B) (d, 1 H, aromatique), 7,40 (A+B) (t, 1 H, aromatique) , 7,81 (B) et 7,70 (A) (s, 1 H, aromatique), 7,68 (A) et 7,75
(B) (d, 1 H, aromatique). Vlll-B) (2SR. 3R). 2-(paraméthoxybenzyl-thio)-, 3-fN-t-butoxy- carbonylamino)-. 3-(3-(N-tertiobutylaminosulfonyl)phényl) propanoïque.
Le composé de configuration (2SR, 3R) est obtenu par le même protocole à partir du composé décrit en Vll-B (Synthon 3).
EXEMPLE N° 1
N-(N-(2-mercapto, 3-amino, 5-sulfamoyl pentanoyl)- L-Valyl)- L- Isoleucine
I-) H-Val-lle-HMP-résine
La synthèse du dipeptidyl-résine H-Val-lle-HMP-résine est réalisée en utilisant la procédure A sur 150 mg (0,15 mmol) de HMP- résine avec A2 = Fmoc-lle-OH et A = Fmoc-Val-OH.
Il-A) (2RS.3S). N-(N-.2-mercapto, 3-amino. 5-sulfamoyl pentanoyl)- L- ValvD- L-lsoleucine
A 135 mg (250 μmol) d'acide (2RS, 3S), 2- (paraméthoxybenzyl-thio), 3-(N-benzyloxycarbonyl-amino), 5-(N- tertiobutylaminosulfonyl) pentanoïque (Synthon 1 A), 122 mg (320 μmol) de HATU (O-(7-azabenzotriazol-1 -yl)1 , 1 ,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate), 150 μmol de H-Val-lle-HMPrésine dans 5 ml de dichlorométhane est ajoutée, sous agitation à température ambiante, 200 μl de diisopropyléthylamine. La fin de la réaction est suivie par le test de Kaiser. Après 6 heures de réaction à cette température, la résine est lavée alternativement avec NMP (N-méthyl-pyrrolidone) et dichlorométhane. On effectue une déprotection TFA avec le mélange TFA : eau : triisopropylsilane 40: 2: 1 pendant 3 heures à température ambiante. Le mélange réactionnel est évaporé sous pression réduite, repris avec de l'eau puis lyophilisé.
On effectue dès lors une déprotection HF à 0°C avec le mélange HF : métacrésol 10:0,2 pendant 1 heure. Après distillation du HF, le résidu est repris avec un peu de TFA puis précipité avec un mélange froid éther diéthylique : n-hexane 50:50. Le produit est ensuite lyophilisé. On obtient 100 mg de brut.
Le produit est purifié sur une colonne semi-préparative (Vydac C18 ref 218TP510, 20x250 mm). Les deux diastéréoiomères sont 5 ainsi séparés.
HPLC (gradient 20% de B à 60% de B en 15 min; colonne Macherey- Nagel C18): 2 pics 8.9 et 9.4 SM (ES): (M+H)+ m/z = 441 ,1 îo 1 H-RMN (D2O) δ 0.90 (t, 3H, δCH3(lle)), 0.92 à 1.10 (m, 9H, γCH3(lle)// γCH3(Val)/ γCH3(Val)), 1.20 à 1.30 (m, 1 H, γCH2(lle)), 1.42 à 1.53 (m, 1 H, γCH2(lle)), 1.88 à 1.96 (m, 1 H, βCH(lle), 2.06 à 2.14 (m, 1 H, βCH(Val)) 2.22 à 2.32 (m, 2H, CH-CH9-CH9). 3.39 (m, 2H, CH-CH9-CH9). 3.82 (d, 1 H, ÇH-SH), 3.88 (d, 1 H, ÇH-CH2-CH2), 4.16 (m, 1 H, αCH(Val), 4.27 (d,
15 1 H, αCH(lle)).
Il-B) (2RS.3R) N- N-(2-mercapto. 3-amino. 5-sulfamoyl pentanoyl)- L- ValvD- L-lsoleucine
0 Les deux autres diastéréoisomères sont obtenus par le même protocole à partir du synthon 1 de configuration (2RS, 3R).
EXEMPLE N° 2 25 N-(N-(2-mercapto, 3-amino, 5-sulfamoyl pentanoyl) - L-Valyl)- L-
Isoleucyl- Benzylamide
I-) H-Val-lle-NHBz
"!()
Le composé H-Val-lle-NHBz est obtenu en phase liquide par condensation et déprotection successives du Boc-lle-OH et du Boc-Val- OH sur la benzylamine. Ce composé présente les caractéristiques suivantes :
H RMN (d6-DMSO) δ 0.80 (t, 3H, δCH3(He)), 0.82 (d, 3H, γCH3(Val)), 0.84 (d, 3H, γCH3(He)), 0.86 (d, 3H, γCH3(Val)), 0.99 à 1.11 (m, 1 H, «,_O-- 32
γCH2(lle)), 1 .40 à 1 .52 (m, 1 H, γCH2(lle)), 1 .60 à 1 .65 (m, 1 H, βCH(lle)), 1 .93 à 2.08 (m, 1 H, βCH(Val)), 3.65 (dd, 1 H, αCH(lle)), 4.1 1 à 4.20 (m, 2H, ÇH2-C6H5), 4.31 (dd, 1 H, αCH(Val)), 7.20 (m, 5H, aromatiques), 8.03 (s, 3H, NH3+), 8.38 (d, 1 H, NH(He)), 8.60 (t, 1 H, NH-CH2-C6H5)
ll-A) (2RS.3S). N-(N-(2-mercapto. 3-amino. 5-sulfamoyl oentanoyl) - L- ValvD- L-lsoleucyl- Benzylamide
A 269 mg (500 μmol) d'acide (2RS, 3S), 2- (paraméthoxybenzyl-thio), 3-(N-benzyloxycarbonyl-amino), 5-(N- tertiobutylaminosulfonyl) pentanoïque (dont la synthèse est détaillée dans la procédure 2), 380 mg (1 mmol) de HATU (O-(7-azabenzotriazol-1 - yl)1 .1 ,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate), 192 mg (600 μmol) de H-Val-lle-NHBz dans 5 ml de dichlorométhane est ajouté, sous 5 agitation à température ambiante, 305 μl de diisopropyléthylamine.
Après 6 heures de réaction à cette température, on évapore le dichlorométhane sous pression réduite. On reprend le résidu avec de l'AcOEt ; les phases organiques combinées sont lavées avec NaHC03 (10%), KHSO4 (1 N), une solution saturée de NaCI. Après avoir séché sur 0 Na2S04 puis évaporée sous pression réduite, on effectue une déprotection TFA avec le mélange TFA : eau : triisopropylsilane 40: 2: 1 pendant 3 heures à température ambiante. Le mélange réactionnel est évaporé sous pression réduite, repris avec de l'eau puis lyophilisé.
On effectue des lors une déprotection HF à 0°C avec le - mélange HF : métacrésol 10:0,2 pendant 1 heure. Après distillation du HF, le résidu est repris avec un peu de TFA puis précipité avec un mélange froid éther diéthylique : n-hexane 50:50. Le produit est ensuite lyophilisé. On obtient 460 mg de brut.
Le produit est purifié sur une colonne semi-préparative (Vydac C18 ref 218TP510, 20x250 mm). Les deux diastéréoiomères ne sont pas séparés.
HPLC (gradient 40% de B à 80% de B en 15 min; colonne Macherey- Nagel C18): un seul pic à 8.6 min
1 H-RMN (d6-DMSO) δ 0.75 à 0.85 (m, 12H, γCH3(He)/ δCH3(lle)/ γCH3(Val)/ γCH3(Val)), 0.96 à 1 .07 (m, 1 H, γCH2(lle)), 1 .35 à 1 .45 (m, 1 H, γCH2(He)), 1.62 à 1 .72 (m, 1 H, βCH(lle), 1 .90 à 2.10 (m, 3H, βCH(Val)/ CH-ÇH2-CH2), 2.94 à 3.07 (m, 2H, CH-CH9-CH9). 3.47 et 3.57 (m, 1 H, ÇH-CH2-CH2), 3.83 et 3.87 (d, 1 H, ÇH-SH), 4.13 (m, 1 H, αCH(lle)), 4.17 et 4.24 (m, 2H, ÇH2-C6H5), 4.28 (m, 1 H, αCH(Val), 6.69 et 6.71 (s, 2H, SO2NH2), 7.15 à 7.25 (m, 5H, CH2-Ç6H5), 8.02 et 8.09 (d, 1 H, NH(lle)), 8.34 et 8.38 (d, 1 H, NH(Val)), 8.48 et 8.52 (t, 1 H, NH-CH2-C6H5) 1 H-RMN (D2O) δ 0.84 à 0.97 (m, 12H, γCH3(lle)/ δCH3(lle)/ γCH3(Val)/ γCH3(Val)), 1.16 à 1.23 (m, 1 H, γCH2(lle)), 1 .47 à 1 .56 (m, 1 H, γCH2(lle)), 1 .82 à 1 .88 (m, 1 H, βCH(lle), 2.02 à 2.08 (m, 1 H, βCH(Val)), 2.22 à 2.28 (m, 2H, CH-ÇH2-CH2), 3.33 à 3.41 (m, 2H, CH-CH9-CH9). 3.78 (m, 1 H, ÇH-SH), 3.79 (m, 1 H, ÇH-CH2-CH2), 4.10 (d, 1 H, αCH(Val), 4.12 (d, 1 H, αCH(lle)), 4.40 (s, 2H, ÇH2-C6H5), 7.29 à 7.41 (m, 5H, CH2-Ç6H5) SM (ES): (M+H)+ m/z = 530,2
ll-B)
Les deux autres diastéréoisomères sont obtenus par le même protocole à partir du synthon 1 de configuration (2RS, 3R).
EXEMPLE N° 3
N-(N-(2-mercapto, 3-amino, 5-sulfamoyl pentanoyl)- L-Tyrosyl)- L- Histidine
I-) H-Tyr(tBu)-His(Trt)-dichlorotritylrésine
La synthèse du dipeptidyl-résine H-Tyr(tBu)-His(Trt)- dichlorotritylrésine est réalisée en utilisant la procédure 1 sur 125 mg (168 μmol) de dichlorotritylresine avec A2 = Fmoc-His(Trt)-OH et A = Fmoc- Tyr(tBu)-OH.
Il-A) (2RS.3S). N-(N-(2-mercapto, 3-amino, 5-sulfamoyl pentanoyl)- L- TyrosvD- L-Histidyl-OH
A 135 mg (250 μmol) d'acide (2RS, 3S), 2- (paraméthoxybenzyl-thio), 3-(N-benzyloxycarbonyl-amino), 5-(N- tertiobutylaminosulfonyl) pentanoïque (dont la synthèse est détaillée dans la procédure 2), 140 mg (320 μmol) de BOP, 168 μmol de H-Tyr(tBu)- - -. ,-. - - ^ . 99/24461 34
Hιs(Trt)-dichlorotritylrésine dans 5 ml de dichlorométhane, est ajouté, sous agitation à température ambiante, 200 μl de diisopropyléthylamine. La fin de la réaction est suivie par le test de Kaiser. Après 6 heures de réaction à cette température, la résine est lavée alternativement avec NMP et dichlorométhane.
Le peptide est clivé de la résine par traitement avec le mélange trifluoroéthanol : dichlorométhane 2:8 (20 ml).
On effectue une déprotection TFA avec le mélange TFA eau : triisopropylsilane 40 ml: 2 ml: 1 ml pendant 3 heures à température ambiante. Le mélange réactionnel est évaporé sous pression réduite, repris avec de l'eau puis lyophilisé.
On effectue dès lors une déprotection HF à 0°C avec le mélange HF : métacrésol 10 ml:0,2 ml pendant 1 heure. Après distillation du HF, le résidu est repris avec un peu de TFA puis précipité avec un mélange froid éther diéthylique : n-hexane 50:50. Après centrifugation, le culot est repris avec de l'eau puis lyophilisé. On obtient 100 mg de brut.
Le produit est purifié sur une colonne semi-préparative (Vydac C18 ref 218TP510, 20x250 mm). Les deux diastéréoiomères sont ainsi séparés.
HPLC (gradient 0% de B à 40% de B en 15 min; colonne Macherey-Nagel
C18): 2 pics 10.6 min et 11.5 min
SM (ESI): (M+H)+ m/z = 529,1 et 2+ 265,2
Il-B) (2RS.3R) N-(N-.2-mercapto, 3-amino. 5-sulfamoyl pentanoyl)- L-
TyrosvO- L-Histidine
Les deux autres diastéréoisomères sont préparés par le même protocole à partir du synthon 1 de configuration (2RS, 3R). EXEMPLE N° 4
N-(N-(2-mercaρto, 3-amino, 5-sulfamoyl pentanoyl)-L-Tyrosyl)-L-
Histidyl-NHBz.
I-) H-Tyr(tBu)-His(Trt)-NHBz
H-Tyr(tBu)-His(Trt)-NHBz dont les caractéristiques sont les suivantes est obtenu en phase liquide par condensations et déprotections successives du Fmoc-His(Trt)-OH et du Fmoc-Tyr(tBu)-OH sur la benzylamine, en utilisant les protocoles connus de l'homme de l'art.
1 H RMN (d6-DMSO) δ 1 .20 (s, 9H, Trt), 2.40 (dd, 1 H, βCH2(His) / βCH2(Tyr)), 2.80 (dd, 2H, βCH2(His) / βCH2(Tyr)), 3.30 (m, 1 H, αCH(His)), 4.17 (m, 2H, CH2-C6H5), 4.48 (m, 1 H, αCH(His)), 6.60 (s, 1 H, His), 6.77 (d, 2H, H3 H5 (Tyr)), 6.95 (d, 2H, H2 H6 (Tyr)), 7.00 à 7.33 (m,
20H, C6H5 / Trityl), 8.12 (d, 1 H, NH(His)), 8.30 (t, 1 H, NH-CH2-C6H5), 8.52 (d, 2H, NH2(Tyr)).
Il-A) (2RS.3S). N-(N-(2-mercapto. 3-amino. 5-sulfamoyl. pentanoyl)-L- Tyrosyl)-L-Histidyl-NHBz.
239 mg (444 μmol) d'acide (2RS, 3S), 2-(paraméthoxybenzyl- thio), 3-(N-benzyloxycarbonyl-amino), 5-(N-tertiobutylaminosulfonyl) pentanoïque (dont la synthèse est détaillée dans la procédure 2) sont condensés sur 367 mg (533 μmol) de H-Tyr(tBu)-His(Trt)-NHBz dans 5 ml de dichlorométhane selon le mode opératoire décrit dans l'exemple n°2 étape II . Après déprotection, on obtient 460 mg de brut qui est purifié sur une colonne semi-préparative (Vydac C18 ref 218TP510, 20x250 mm). Les deux diastéréoiomères sont séparés.
HPLC (gradient 20% de B à 60% de B en 15 min ; colonne Macherey- Nagel C18): 2 pics à 9.5 min et 9.9 min.
1 H RMN (D2O) δ 2.12 (m, 2H, CH-CH9.CH9). 2.96 (dd, 2H, β(Tyr)), 3.08
(dd, 1 H, β(His)), 3.18 (dd, 1 H, β(His)), 3.33 (t, 2H, CH-CH9-CH?). 3.70 (d, 1 H, ÇH-SH), 3.72 (m, 1H, CH-CH2-CH2), 4.22 (d, 1H, CH2-C6H5), 4.37
(d, 1 H, CH2-C6H5), 4.55 (t, 1 H, α(Tyr)), 4.60 (t, 1 H, α(His)), 6.82 (d, 2H, H3-H5(Tyr)), 7.13 (d, 2H, H2-H6(Tyr)), 7.14 (s, 1 H, H (His)), 7.19 (d, 2H, C6H5), 7.37 (m, 3H, C6H5), 8.51 ( s, 1 H, H2(His)). SM (ESI): (M+H)+ m/z = 618, 1
ll-B) (2RS.3R) N-(N-(2-mercaρto. 3-amino. 5-sulfamoyl. pentanoyl)-L- Tyrosyl)-L-Histidyl-NHBz.
Les deux autres diastéréoisomères sont préparés par le même protocole à partir du synthon 1 de configuration (2RS, 3R).
EXEMPLE N°5
N-(N-(2-mercaρto, 3-amino, 5-sulfamoyl ρentyl)-L-Tyrosyl)-L-Histidine
l-A) (2RS.3SV 2-(ρaraméthoxybenzyl-thio). 3-(N-benzyloxycarbonyl- amino). S-fN-tertiobutvIaminosulfonvI) pentanol
A une solution de 284 mg (0,51 mmol) de (2SR,3S), 2- (paraméthoxybenzyl-thio), 3-(N-benzyloxycarbonyl-amino), 5-(N- tertiobutylaminosulfonyl) pentanoate de méthyle dans 2 ml de THF et 2 ml d'éthanol absolu, sont ajoutés 90 mg (2,1 mmol) de chlorure de lithium et
80 mg (2, 1 mmol) de borohydrure de sodium (NaBH4). La réaction est agitée pendant 18 heures à température voisine de 20°C. Elle est arrêtée en additionnant KHSO4O N) et extraite avec de l'AcEt. Les phases organiques sont lavées avec de l'eau, KHSO4O N), NaHCθ3(10%), une solution deNaCI saturée, séchées sur Na2Sθ4(1 N) puis concentrées sous pression réduite.
On obtient avec un rendement quantitatif, 270 mg de (2SR,3S), 2-(paraméthoxybenzyl-thio), 3-(N-benzyloxycarbonyl-amino), 5- (N-tertiobutylaminosulfonyl) pentanol dont les caractéristiques sont les suivantes :
1 H RMN (d6 - DMSO) δ 1,18 (s, 9H, tBu), 1 ,60 à 1 ,72 (m, 1 H, CH-CH9- CH2), 1 ,82 à 1 ,97 (m, 1 H, CH-CH9-CH?), 2,89 (t, 2H, CH-CH9-CH9). 3,20 à 3,30 (m, 2H, CH9OH), 3,49 (m, 1 H, ÇH-CH2-CH2), 4,70 (t, 1 H, CH?OH), 4,96 (d, 2H, ÇH2C6H5), 6,73 (s, 1 H, SO?NH), 7,10 (d, 1 H, ZNH), 7,28 (s,
5H, CH aromatiques) l-B) (2RS.3R) 2-(paraméthoxybenzyl-thio). 3-(N-benzyloxycarbonyl- âmino), 5-(N-tertiobutylaminosulfonyl) pentanol
Le composé analogue de configuration (2RS, 3R) est obtenu par le même protocole à partir du synthon 1 sous forme d'ester méthylique et de configuration (2SR, 3R).
Il-A) (2SR.3S). 2-(paraméthoxybenzyl-thio). 3-(N-benzyloxycarbonyl- amino). 5-(N-tertiobutylaminosulfonyl) pentanal
A une solution de 0,056 ml (0,63) mmol) de chlorure d'oxalyl (fraîchement distillé) dans 2,5 ml de dichlorométhane , est ajoutée goutte à goutte, à -78°C, sous azote, une solution de 0,115 ml (1 ,6 mmol) de DMSO dans 0,5 ml de dichlorométhane. Une solution de 270 mg de (2SR,3S), 2-(paraméthoxybenzyl-thio), 3-(N-benzyloxycarbonyl-amino), 5-
(N-tertiobutylaminosulfonyl) pentanol dans 1 ,5 ml de CH2CI2 est coulée goutte à goutte. L'agitation est maintenue pendant 30 minutes, puis on ajoute 375 μl de triéthylamine. Le mélange réactionnel est agité pendant 5 minutes supplémentaire à -65°C puis on laisse revenir le bain à température ambiante.
Après 1 h d'agitation, on ajoute de l'eau et la phase aqueuse est extraite au dichlorométhane. Les phases organiques sont combinées, lavées avec KHS04(1 N), NaHCθ3(10%), NaCI saturée, séchées sur
Na2Sθ4- Après concentration sous pression réduite, on obtient avec un rendement de 94%, 0,747 g de (2SR,3S), 2-(paraméthoxybenzyl-thio), 3-(N-benzyloxycarbonyl-amiπo), 5-(N-tertiobutylaminosulfonyl) pentanal dont les caractéristiques sont les suivantes :
1 H RMN (d6 - DMSO) δ (s, 9H, tBu), 1 ,80 à 1 ,92 (m, 1 H, CH-CH9-CH9).
2,05 à 2,18 (m, 1 H, CH-CH9-CH9). 2,86 à 3,02 (m, 2H, CH-CH9-CH9). 4,03 (m, 1 H, ÇH-CH2-CH2), 5,00 (s, 1 H, ÇH2C6H5), 6,87 (s, 1 H, SO2NH), 7,27 à 7,37 (m, 5H, CH aromatiques), 7,87 (d, 1 H, ZNH), 9,45 (s, 1 H, CHO) ll-B) (2RS.3R) 2-(paraméthoxybenzyl-thio). 3-(N-benzyloxycarbonyl- amino). 5-(N-tertiobutylaminosulfonyl) pentanal
Le composé analogue de configuration (2SR, 3S) est obtenu par le même protocole à partir du composé décrit en IB.
HI-) H-Tyr(tBu)-His(Trt)-HMPrésine
La synthèse du dipeptidyl-résine H-Tyr(tBu)-His(Trt)- HMPrésine est réalisée en utilisant la procédure 1 sur 150 mg (0,15mmol) de HMP-résine avec A2 = Fmoc-His(Trt)-OH et Ai = Fmoc-Tyr(tBu)-OH.
IV-) (2 SR. 3S~) N-fN-fë-mercapto, 3-amino. 5-sulfamoyl pentyl)-L-Tyrosyl)- L-Histidine
A une solution de 200 mg (0,4 mmol) de (2SR.3S) 3-(N-Z), 2- (paraméthoxybenzyl-thio), 3-(N-benzyloxycarbonyl-amino), 5-(N- tertiobutylaminosulfonyl) pentanal, 150 μmol de résine H-Tyr(tBu)-His(Trt)- HMPrésine, 30 mg (0, 16 mmol) d'acide paratoluènesulfonique (APTS) dans 6 ml de DMF, est ajoutée une solution de 25 mg de NaBH3CN dans
1 ml de DMF. Le mélange réactionnel est agité pendant 16 heures à température ambiante. La résine est lavée alternativement avec NMP et dichlorométhane. On effectue une déprotection TFA avec le mélange TFA : eau : triisopropylsilane 40 ml: 2 ml: 1 ml pendant 3 heures à température ambiante. Le mélange réactionnel est évaporé sous pression réduite, repris avec de l'eau puis lyophilisé.
On effectue dès lors une déprotection HF à 0°C avec le mélange HF : métacrésol 10 ml: 0,2 ml pendant 1 heure. Après distillation du HF, le résidu est repris avec un peu de TFA puis précipité avec un mélange froid éther diéthylique : n-hexane 50:50. Le produit est ensuite lyophilisé.
Les deux diastéréoisomères obtenus sont purifiés et séparés sur une colonne semi-préparative.
Les deux autres diastéréoisomères sont obtenus par le même protocole à partir du synthon 1 de configuration (2RS, 3R). HPLC (gradient 0% à 40% de B en 15 min ; colonne Macherey-Nagel Ci 8) : 4 pics à 10.80, 10.90, 1 1.03 et 1 1.14 min. SM(ES): (M+H)+ m/z = 515.2 ; (M+2H)2+ m/z = 258.1
EXEMPLE N° 6
N-(N-(2-mercapto, 3-amino, 3-(3-sulfamoyf)phényl propanoyl)- L-
Tyrosyl)- L-Histidyl-benzylamide.
I-) H-Tyr(tBu)-His(Trt)-NHBz
H-Tyr(tBu)-His(Trt)-NHBz dont les caractéristiques sont les suivantes est obtenu en phase liquide par condensations et déprotections successives du Fmoc-His(Trt)-OH et du Fmoc-Tyr(tBu)-OH sur la benzylamine.
1 H RMN (d6-DMSO) δ 1.20 (s, 9H, Trt), 2.40 (dd, 1 H, βCH2(His) / βCH2(Tyr)), 2.80 (dd, 2H, βCH2(His) / βCH2(Tyr)), 3.30 (m, 1 H, αCH(His)), 4.17 (m, 2H, CH2-C6H5), 4.48 (m, 1 H, αCH(His)), 6.60 (s, 1 H, His), 6.77 (d, 2H, H3 H5 (Tyr)), 6.95 (d, 2H, H2 H6 (Tyr)), 7.00 à 7.33 (m, 20H, C6H5 / Trityl), 8.12 (d, 1 H, NH(His)), 8.30 (t, 1 H, NH-CH2-C6H5),
8.52 (d, 2H, NH2(Tyr)).
Il-A) (2RS.3S). N-(N-(2-mercapto, 3-amino. 3-(3-sulfamoyl)phényl propanoyl)- L-TyrosvD- L-Histidyl-benzylamide.
300 mg (0,57 mmol) d'acide (2SR.3S), 2- (paraméthoxybenzyl-thio)-, 3-(N-t-butoxycarbonyl-amino)-, 3-(3-(N- tertiobutylaminosulfonyl)phényl) propanoïque (dont la synthèse est détaillée dans la procédure 2 Bill) sont condensés sur 470 mg (0,68 mmol) de H-Tyr(tBu)-His(Trt)-NHBz dans 5 ml de dichlorométhane selon le mode opératoire décrit dans l'exemple n°2 étape II. Après déprotection par l'acide trifluoroacétique, on obtient 460 mg de brut qui est purifié sur une colonne semi-préparative (Vydac C18 ref 218TP510, 20x250 mm). Les deux diastéréoiomères sont séparés à ce niveau là de la synthèse par HPLC sur une colonne Vydac C18 10X250 mm.
HPLC (gradient 10% de B à 90% de B en 30 min ; colonne Macherey-Nagel C18) : 2 pics à 12,85 min et 14,35 min (débit 1 ,5 ml/min). Les deux produits obtenus sont alors traités à l'acide fluorhydrique anhydre en présence de 2% m-crésol afin de déprotéger le groupe p- méthoxy benzyl protégeant le soufre puis repurifiés par HPLC.
5 H RMN (D2θ) δ 2.96 (dd, 2H, β(Tyr)), 3.08 (dd, 1 H, β(His)), 3.18 (dd,
1 H, β(His)), 3.70 (d, 1 H, ÇH-SH), 4.22 (d, 1 H, CH?-CfiH.ς). 4.37 (d, 1 H, ÇH2-C6H5), 4.55 (t, 1 H, α(Tyr)), 4.60 (t, 1 H, α(His)), 6.82 (d, 2H, H3- H5(Tyr)), 7.13 (d, 2H, H2-H6(Tyr)), 7.14 (s, 1 H, H4(His)), 7.19 (d, 2H, C6H5), 7.37 (m, 3H, C6H5), 8.51( s, 1 H, H2(His)). 10 SM (ESI): (M+H)+ m/z 666,2
ll-B) N-(N-(2-mercaρto. 3-amino, 3-(3-sulfamoyl)phényl propanoyl)- L- TyrosvD- L-Histidyl-benzylamide.
1.5 Les deux autres diastéréoiomères sont obtenus par le même protocole à partir du synthon 3 de configuration (2RS, 3R).
EXEMPLE N°7
N-(N-(2-mercapto, 3-amino, 5-carbamoyl pentanoyl)-L-β(2-naphtyl)- 0 Ala)-L-b(2-naphtyl)-Alanine
I-) H-β(2-naphtyl)-L-Ala-β(2-naphtyl)-L-Ala-dichlorotritylrésine
La synthèse du dipeptidyl-résine H-β(2-naphtyl)-L-Ala-β(2- 5 naphtyl)-L-Ala-dichlorotritylrésine est réalisée en utilisant la procédure 1 sur 125 mg (200 μmol) de dichlorotritylresine avec A et A2 = Fmoc-β(2- naphtyl)-L-Ala-OH.
Il-A) (2RS.3S) N-(N-(2-mercapto. 3-amino. 5-carbamoyl. pentanoyl)-L-β(2- 30 naphtyl)-Ala)-L-β(2-naphtyl)-Alanine
200 mg (300 μmol) d'acide (2RS, 3S), 2-(paraméthoxybenzyl- thio), 3-(N-Boc), 5-trityl-carbamoyl pentanoïque (dont la synthèse est détaillée dans la procédure 3) sont condensés sur 200 μmol de H-β(2- 35 naphtyl)-L-Ala-β(2-naphtyl)-L-Ala-dichlσrotritylrésine dans 5 ml de dichlorométhane en suivant le mode opératoire décrit dans l'exemple n°3 étape II. Après déprotection, on obtient 149 mg de brut qui est purifié sur une colonne semi-préparative (Vydac C18 ref 218TP510, 20x25 mm). Les deux diastéréoisomères obtenus sont ainsi séparés.
HPLC (gradient de 40% à 80% de B en 15 min ; colonne Interchrom®) : 2
5 pics à 12.3 min et 13.2 min.
1 H RMN (d6-DMSO) δ 1.18 (m, 1 H, βCH2(Gln)), 1.33 (m, 1 H, βCH2(Gln)), 1 .87 (m, 2H, γCH2(Gln)), 2.80 à 3.15 (m, 4H, βCH2(β(2-naphtyl)-L-Ala)), 3.23 (m, 1 H, αCH(Gln)), 3.52 (m, 1 H, CH-SH), 4.54 et 4.67 (m, 2H, αCH((β(2-naphtyl)-L-Ala))/ CH((β(2-naphtyl)-L-Ala)), 7.00 (s, 1 H, o CONH2(Gln)), 7.38 (s, 1 H, CONH2(Gln)), 7.38 à 7.85 (m, 16 H, arom (β(2- naphtyl)-L-Alà)/ NH2 (Gin)), 8.62 et 8.66 (d, 2H, NH(β(2-naphtyl)-L-Ala)) SM(ES) : (M+H)+ = 586,22
ll-B) (2RS.3R) N-(N-(2-mercapto, 3-amino. 5-carbamoyl. pentanoyl)-L- 5 β(2-naphtyl)-Ala)-L-β(2-naphtyl)-Alanine
Les deux autres diastéréoisomères sont obtenus par le même protocole à partir du synthon 2 de configuration (2RS, 3R).
» EXEMPLE N°8
N-(N-(2-mercapto, 3-amino, 5-carbamoyl pentanoyl)-L-Trp)-L-Leucine
l-)H-Trp-Leu-OtBu 5
H-Trp-Leu-OtBu dont les caractéristiques sont les suivantes est obtenu par condensation du Fmoc-Trp-OH sur la H-Leu-OtBu suivie par une déprotection.
Rf (MeOH:dichlorométhane 10:90)=0,30
1 H RMN (d6-DMSO) δ 0.75(d, 3H, δCH3(Leu)), 0.81 (d, 3H, δCH3(Leu)), 1 .35 (s, 9H, tBu), 1 .42 (m, 1 H, γCH(Leu)), 1 .63 (m, 2H, βCH2(Leu)), 2.68 (dd, 1 H, βCH2(Trp)), 3.01 (dd, 1 H, βCH2(Trp)), 3.43 (m, 1 H, αCH(Leu)), 4.15 (m, 1 H, CH(Trp)), 6.91 (t, 1 H, H5(Trp)), 7.00 (t, 1 H, H6(Trp)), 7.01 (d, 1 H, H2(Trp)), 7.27 (d, 1 H, H7(Trp)), 7.51 (d, 1 H, H4(Trp)), 8.00 (d, 1 H, NH(Leu)), 10.79 (s, 1 H, NH(Trp)) ll-A) (2RS. 3S). N-(N-(2-mercapto. 3-amino, 5-carbamoyl ρentanoyl)-L- Trp)-L-Leucine
200 mg (300 μmol) d'acide (2RS, 3S), 2-(paraméthoxybenzyl- thio), 3-(N-Boc), . 5-trityl-carbamoyl pentanoïque (dont la synthèse est détaillée dans la procédure 3) sont condensés sur 200 μmol de H-Trp-
Leu-OtBu dans 5 ml de dichlorométhane en utilisant le mode opératoire décrit dans l'exemple n°2, étape II.
Après déprotection, on obtient 223 mg de brut qui sont purifiés sur une colonne semi-péparative (Vydac C18 ref 218TP510,
20x25 mm). Les deux diastéréoisomères obtenus sont ainsi séparés.
H RMN (d6-DMSO) δ 0.83 (δ, 3H, δCH3(Leu)), 0.88 (d, 3H, δCH3(Leu)), 1 .32 (m, 1 H, γCH(Leu)), 1 .50 (m, 3H, βCH2(Leu)/βCH2(Gln)), 1 .60 (m, 1 H, βCH2(Gln)), 2.01 (t, 2H, γCH2(Gln)), 2.91 (dd, 1 H, βCH2(Trp)), 3.07 à
3.17 (m, 2H, βCH2(Trp)/ CH(Gln)), 3.63 (m, 1 H, ÇH-SH), 4.27 (m, 1 H, αCH(Leu)), 4.64 (m, 1 H, αCH(Trp)), 6.97 (t, 1 H, Hs(Trp)), 6.99 (s, 1 H, CONH2), 7.03 (t, 1 H, H6(Trp)), 7.13 (t, 1 H, H2(Trp)), 7.32 (d, 1 H, H7(Trp)), 7.40 (s, 1 H, CONH2), 7.63 (d, 1 H, H4(Trp)), 7.95 (br s, 3H, NH3+), 8.40 (d, 1 H, NH(Leu)), 8.63 (d, 1 H, NH(Trp)), 10.76 (s, 1 H,
NHι (Trp)), 12.5 (br s, 1 H, COOH).
Il-B) (2RS.3R) N-(N-(2-mercapto. 3-amino, 5-carbamoyl pentanoyl)-L-Trp)- L-Leucine
Les deux autres diastéréoisomères sont obtenus par le même protocole à partir du synthon 2 de configuration (2RS, 3R).
EXEMPLE 9
Caractérisation de l'activité biologique de composés de formule générale (I)
Le pouvoir inhibiteur peut être déterminé sur l'activité -< endopeptidasique des chaînes légères purifiées de toxine tétanique et de toxine botulique de type B en suivant le protocole décrit dans la littérature (Soleilhac et al, Analytical Biochemistry, 241, 120, 1996) car ces deux enzymes clivent toutes deux la synoptobnéviπe au même site de clivage
Le composé à tester (10μl) est préiπcubé avec 10μl de chaîne légère purifiée de toxine tétanique (250 ng) ou de toxine botulique B pendant 30 minutes à 37°C dans un volume total de 80 μl de tampon
20mM Hépes, 100 mM NaCI à pH 7,4 On ajoute alors 20 μl d'une solution a 100 μM du substrat fluorescent (Pya88)Syb 39-88 dans le même tampon , l'incubation est prolongée pendant 30 minutes à 37°C et à l'abris de la lumière On arrête la réaction par addition de 0,9 ml de 72% de MeOH dans l'eau contenant 0,1 % de TFA Le métabolite fluorescent généré (Pya88)Syb 77-88 est séparé du substrat total par chromatographie sur colonne Sep-Pak Vac Ci8 contenant 500 mg de phase inverse C18 (Waters)® La quantité de métabohte formée est mesurée par fluoπmétπe avec comme longueur d'onde d'excitation 343 nm et comme longueur d'onde d'émission 377 nm
A titre d'exemples, le tableau I ci-après donne l'activité inhibitπce in vitro de certains composés sur les propriétés hydrolytiques de la toxine tétanique
Figure imgf000045_0001
(R4, R5, R6 = Hydrogène)
En ce qui concerne le tableau II, y sont soumises les activités mhibitπces de certains composés revendiqués, sur les propriétés hydrolytiques de la toxine botulique de type B
Figure imgf000046_0001
Figure imgf000047_0001

Claims

99/24461
46
REVENDICATIONS
Composé caractérisé en ce qu'il répond à la formule générale (I)
Figure imgf000048_0001
dans laquelle
- X représente
un groupement méthylène ou un groupement carbonyle,
R-, représente
• un groupement alkyle, alkoxyalkyle, alkylthioalkyle, halo- alkyle, cycloalkyle, heterocycloalkyle, (cycloalkyl)alkyle,
(hétérocycloalkyle)alkyle, aryle, arylalkyle, hétéroaryle, ou (hétéroaryl)alkyle, substitué sur la chaîne alkyle ou sur le cycle par au moins un groupement R choisi parmi :
. un groupe sulfonamide -SO2NH2, -SO2NHR8 ou -SO2N(R8)2,
. un groupe amide, -CONH2, -CONHR8 ou -CON(R8)2, avec R8 étant un groupement alkyle, cycloalkyle, (cycloalkyl)alkyle, aryle ou arylalkyle,
- R2, R3 représentent indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène, un groupement alkyle, alkoxyalkyle, carboxyalkyle, halo- alkyle, hydroxyalkyle, aminoalkyle, alkylthioalkyle, cycloalkyle, heterocycloalkyle, (cycloalkyl)alkyle, (hétérocycloalkyle)alkyle, aryle, arylalkyle, arylarylalkyle, hétéroaryle, (hétéroaryl)alkyle, carbamoylalkyle, guanidinylalkyle, - R4 représente
• un atome d'hydrogène,
• un groupement acétyle, • un groupement benzoyle,
• un groupement -SR9 avec R9 étant un groupement alkyle, cycloalkyle, (cycloalkyl)alkyle, aryle, arylalkyle ou
• un groupement
-S-CH[CHR1-NH2]-X-N(R5)CHR2CON(R6) CHR3COZ,
avec R1 f X, R5, R2ι R6, R3 et Z tels que définis ci-dessus ou ci-après,
-R5 et R6 représentent indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène, un groupement alkyle, cycloalkyle, (cycloalkyl)alkyle, aryle, arylalkyle, hétéroaryle, (hétéroaryl)alkyle,
- R2 et R5 pris ensemble peuvent éventuellement constituer avec l'atome d'azote portant R5 un groupement heterocycloalkyle éventuellement condensé avec un aryle, ou un hétéroaryle,
- R3 et Rβ pris ensemble peuvent éventuellement constituer avec l'atome d'azote portant Rβ un groupement heterocycloalkyle éventuellement condensé avec un aryle ou un hétéroaryle,
- Z représente un groupement OH, OR10, NH2, NHR10, N(Rιo)2, avec R10 étant un groupement alkyle, cycloalkyle, (cycloalkyl)alkyle, aryle ou arylalkyle,
et leurs dérivés.
2. Composé de formule générale I selon la revendication
1 , dans laquelle Ri est un groupement alkyle, cycloalkyle, aryle, hétéroaryle, substitué par au moins un groupement -SO2NH2, -SO2NHR8, - SO2N(R8)2, avec R8 représentant un groupement alkyle, cycloalkyle,
(cycloalkyl)alkyle, aryle ou arylalkyle. 99/24461
48
3. Composé de formule générale I selon la revendication 1 ou 2, dans laquelle X représente un groupement carbonyle.
4. Composé de formule générale I selon la revendication 1 ou 3 dans laquelle X représente une fonction carbonyle et R^ représente un groupement alkyle, cycloalkyle, aryle ou hétéroaryle, substitué par au moins un groupement -SO2NH2, -SO2NHR8, -SO2N(R8)2, -CONH2, - CONHR8ι -CON(R8)2, avec R8 représentant un groupement alkyle, cycloalkyle, (cycloalkyl)alkyle, aryle ou arylalkyle.
5. Composé de formule générale I selon la revendication 4 dans laquelle Ri représente de préférence un groupement (CH2)nSO2NH2, (CH2)nCONH2 ou (SO2NH2)Ph avec n compris entre 1 et 5.
6. Composé de formule générale I selon l'une des revendications 1 à 5 dans laquelle R4, R5, et R6 représentent un atome d'hydrogène, X une fonction CO, et R, un groupement (CH2)2SO2NH2.
7. Composé de formule générale I selon l'une des revendications 1 à 5 dans laquelle R , R5, et R6 représentent un atome d'hydrogène, X une fonction CO, Ri un groupement (SO2NH2)Ph.
8. Composé de formule générale selon l'une des revendications 1 à 7 caractérisé en ce qu'il présente de préférence une configuration absolue (S) ou (R) sur le carbone portant le groupement R^
(S) ou (R) sur le carbone portant la fonction -SR4, et (S) sur les carbones portant les groupements R2 et R3.
9. Composé selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce qu'il s'agit de préférence d'un composé choisi parmi
N-(N-(2-mercapto, 3-amino, 5-sulfamoyl pentanoyl)- L-Valyl)- L- isoleucine,
N-(N-(2-mercapto, 3-amino, 5-sulfamoyl pentanoyl)- L-Valyl)- L- Isoleucyl- benzylamide, - N-(N-(2-mercapto, 3-amino, 5-sulfamoyl pentanoyl)- L-Tyrosyl)- L-
Histidine, N-(N-(2-mercapto, 3-amino, 5-sulfamoyl pentanoyl)- L-Tyrosyl)- L- Histidyl-benzylamide,
N-(N-(2-mercapto, 3-amino, 5-sulfamoyl pentyl)-L-Tyrosyl)-L- Histidine, - N-(N-(2-mercapto, 3-amino, 3-(3-sulfamoyl) phényl propanoyl)- L-
Tyrosyl)- L-Histidyl-benzylamide,
N-(N-(2-mercapto, 3-amino, 5-carbamoyl pentanoyl)-L-β(2-naphtyl)- Ala-L-β(2-naphtyl)-Alanine,
N-(N-(2-mercapto, 3-amino, 5-carbamoyl pentanoyl)-L-Trp)-L- Leucine.
10. Procédé de préparation d'un composé de formule générale (I) selon l'une des revendications 1 à 9 dans laquelle X représente un groupement carbonyle, CO, par couplage d'un acide de formule générale (II) :
Figure imgf000051_0001
dans laquelle:
- P-, représente un groupement tertbutyloxycarbonyle ou benzyloxycarbonyie,
P2 représente un groupement 4-méthoxybenzyie ou 2,4 diméthoxybenzyle, avec Ri étant défini selon la revendication 1 ,
avec une aminé de formule générale (III)
Figure imgf000051_0002
dans laquelle: R2 et R3, R5, R6 et Z sont définis selon la revendication 1 , 99/24461
50
dans un solvant organique, en présence d'un agent de couplage et d'une aminé tertiaire à une température de l'ordre de 20°C.
11. Procédé de préparation d'un composé de formule générale (I) selon l'une des revendications 1 , 2 et 8 dans laquelle X représente un groupement méthylène, CH2, par traitement d'une aminé de formule générale (III) telle que définie en revendication 10 avec une aldéhyde de formule (IX)
Figure imgf000052_0001
dans laquelle R1 ( P et P2 sont définis selon la revendication 10 au sein d'un solvant organique et en présence d'un catalyseur.
12. Composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend à titre de principe actif au moins un composé de formule générale (I) tel que défini en revendication 1 à 9.
13. Composition pharmaceutique selon la revendication 12 caractérisée en ce qu'elle comprend en outre au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
14. Composition pharmaceutique selon la revendication 12 ou 13, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre au moins une toxine clostridiale.
15. Composition selon la revendication 13 caractérisée en ce qu'il s'agit d'une neurotoxine botulique ou tétanique.
16. Système de diagnostic pour détecter des neurotoxines clostridiales caractérisé en ce qu'il comprend au moins un composé de formule générale I selon l'une des revendications 1 à 9.
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