WO1999023251A1 - Methode de diagnostic in vitro de pathologies associees a des remaniements geniques et trousses de diagnostic - Google Patents

Methode de diagnostic in vitro de pathologies associees a des remaniements geniques et trousses de diagnostic Download PDF

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WO1999023251A1
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    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Definitions

  • the invention relates to the detection of gene rearrangements, with exchange of genetic material. These modifications correspond to the formation of fusion genes by joining the translocated part to a portion of the genome located on the partner chromosome, or a modification of the regulation of the expression of a gene.
  • the term gene thus used will designate the gene involved in various modifications while the expression "fusion partners" will refer to the portions of the genome attached to said gene.
  • the invention relates more particularly to a method and kits for the in vitro diagnosis of pathologies associated with such modifications.
  • leukemias As regards, for example, leukemias, it is known that they are associated with the rearrangements of numerous genes, some of which, such as the MLL gene, intervene recurrently.
  • the MLL gene belongs to the llq23 band of the human genome, frequently involved in molecular rearrangements, in particular in the context of acute lymphoid leukemia (ALL) and also acute myeloid leukemia (AML). Cytogenetic studies carried out to date have counted around thirty bands different chromosomal partners. Thirteen MLL fusion partners have currently been cloned and sequenced, which represents approximately 95% of the known rearrangements. These changes are most often associated with poor clinical prognoses, hence the importance given to their study in recent years.
  • ALL acute lymphoid leukemia
  • AML acute myeloid leukemia
  • Cytogenics with the establishment of the karyotype, corresponds to one of the methods conventionally used. This technique made it possible to show the existence of modifications with a large number of partners in the chromosomal region llq23 and to establish the prognostic value of the anomaly. But it has many false negatives and its success rate does not exceed 50 to 70%.
  • the Southern blot has the advantage of highlighting all the changes, but remains difficult to use by clinical laboratories because of its length and heaviness, and the constraints of radioactivity. Indeed, a result in a few weeks, case by case, is essential for a therapeutic decision.
  • In situ hybridization (FISH) could a priori make it possible to highlight genetic anomalies, but its sensitivity is not always sufficient due to the frequency of deletions which often accompany translocations, the application of this technique can also lead to the establishment of false negatives.
  • FISH in situ hybridization
  • the solution provided by the invention is based on carrying out an anchored PCR, that is to say with a unique pair of primers, making it possible to amplify, without discrimination, all types of fusion genes involving the targeted gene, and the specific revelation of the fusion genes alone. All types of fusion genes can be amplified and detected according to a simple and rapid execution protocol.
  • the object of the invention is therefore to provide a method of in vitro diagnosis of pathologies associated with gene modifications, making it possible to detect such changes and can be performed on almost all patients.
  • the in vitro diagnostic method according to the invention is characterized in that the DNA of a patient is subjected to at least one anchored PCR step, by performing at least one asymmetric amplification step, at 1 using a single pair of primers formed by a specific primer of the DNA of the gene capable of being involved in a fusion gene and by a random complementary primer, and that such a gene is only revealed in the to the extent that he is involved in said merger.
  • the primers used in the amplification step are advantageously chosen, in particular for the amplification of long fragments, so as to satisfy the criteria of length, Tm and stability at the ends.
  • the length of the primers must provide stability allowing elongation.
  • Advantageous primers comprise approximately 25 to 40 nucleotides, and in particular from 30 to 35 nucleotides.
  • the temperature Tm, at which half of the DNA is in denatured form, is advantageously of the order of
  • the base composition of the sequence is chosen so as to satisfy this requirement.
  • the stability at the 3 ′ and 5 ′ ends will be taken into account, the end of the primer which undergoes elongation having to be less stable than the opposite end, to avoid the initiation and elongation of products. non-specific PCR. It is also important to avoid the formation of duplexes and 3 'loops, which would interfere with the proper matching of the primers to the DNA or cDNA sequence.
  • primers as defined above can be easily carried out using software.
  • the anchored PCR strategy can be directed in 3 'as defined above, but also in 5', an artificial tail then being added to the 5 'end of the gene, which can be used as a primer.
  • the terminal enzyme deoxyribonucleotidyltransferase is used for this purpose.
  • probes specific to nucleotide sequences of known fusion partners are brought into contact with denatured PCR products, labeled for revelation, under conditions allowing specific interaction between probes and PCR products when there is complementarity. bases. PCR products carry a marker
  • This marker is carried by a deoxynucleotide which is incorporated into the PCR products during the second amplification.
  • the probes can be covalently attached to a support, such as 96-well plates.
  • This covalent attachment can advantageously be carried out by coupling the biotinylated probe / plate-streptavidin.
  • this covalent bond can be carried out using a phosphorylated probe at its end and a carbodiimide group on the plate or else a probe modified by an amino group at one end and linked by N-oxysuccinimide ester groups.
  • a satisfactory method includes the use of the ELISA technique to specifically reveal those of the nucleotide sequences which contain the gene involved in a rearrangement.
  • PCR products in which a marker has been incorporated, are reacted with an antibody itself labeled, directed against the markers of the PCR products, under conditions allowing an antigen-antibody type reaction, revealing the reaction.
  • antigen-antibody when it occurs, being carried out by detection of the marker of the antibody or of a reaction involving it.
  • PCR technology which makes it possible to detect products of PCR by internal probe-PCR product hybridization in solution. It can be either a hybridization probe or a hydrolysis probe.
  • a variant of revelation making it possible to demonstrate, in the same test, numerous gene rearrangements on a large number of genes, is based on the DNA microarray technique and includes the use of oligonucleotide or cDNA probes fixed on miniature support. Each probe or hybridization unit can advantageously be individually controlled by an electric field.
  • the internal probes are advantageously immobilized on strips.
  • the DNA subjected to amplification advantageously corresponds to the cDNA, as obtained by reverse transcription of the RNA extracted from the sample.
  • it is genomic DNA extracted from the sample to be studied.
  • the internal probes are advantageously immobilized on strips.
  • a reverse transcription step (RT for short) is carried out, before amplification by PCR, in order to synthesize a population of cDNA from the RNA of the cells of the sample to study.
  • a stable nucleotide sequence is advantageously used, the Tm of which is of the order of 80 to 90 ° C.
  • Appropriate sequences comprise a cassette of approximately 40 to 60 nucleotides and have at one end 10 to 20 T motifs or, alternatively, a repeat of a random nucleotide motif.
  • the genomic DNA or the RNA, extracted from the cells of the sample to be studied is subjected to the action of a compound capable of specifically cutting or blocking the DNA of the gene whose fusion is being studied.
  • a compound capable of specifically cutting or blocking the DNA of the gene whose fusion is being studied are for example PNA (polypeptide nucleic acids) or ribozymes.
  • the steps of PCR, or if necessary of RT-PCR are then carried out with primers optionally comprising cloning sites. Then the products obtained are reacted with on the one hand two probes specific for the gene to be studied, one upstream of the region of the breakpoints (probe “a”) and one downstream (probe “b”), on the other share of probes developed from known partner genes (“c” probes).
  • a positive detection with the probe “a” and negative with the probe “b” allows to conclude to the rearrangement of the gene considered and a negative revelation with the probes “c” to the absence of detection of a known fusion product.
  • the new -fusion genes when they are revealed by the test, can be secondarily cloned and sequenced by conventional techniques. This technique thus provides elements for understanding the molecular events involved in cell transformation.
  • a cDNA pool is synthesized by RT from the RNA extracted from the sample to be studied using d primers comprising a cassette of approximately 30 to 35 nucleotides, supplemented by a sequence of 6 or 9 nucleotide motifs at random, and an anchored PCR is carried out with, as a specific sense primer, a primer located on exon 5 of MLL.
  • a primer is used which is internal to the first, which makes it possible to increase the specificity.
  • the random primer is advantageously complementary to the oligonucleotide cassette used during the reverse transcription step.
  • a first step consists in bringing a probe specific to known fusion partners of MLL into contact with denatured PCR products, labeled with digoxygenin during the second round of amplification, under conditions allowing hybridization when there is a complementarity of bases *
  • the resulting products are then brought into contact with anti-digoxygenin antibodies, these antibodies being coupled to an enzyme, capable of reacting with its substrate by releasing a detectable colored product in the case where the antibodies are attached to the products of PCR.
  • the washing conditions are chosen so as to obtain an optimal signal / background noise ratio.
  • the enzyme substrate is reacted with the reaction mixture of probes / PCR products under the same conditions of time and temperature, and the product possibly released is detected, for example by measurement of optical density.
  • the total RNAs are subjected to the action of ribozymes specific for the MLL gene before carrying out the RT-PCR, then the amplification products are reacted with a probe corresponding to a sequence of exon 5 of MLL, 3 'to the primer used, then with a second probe always specific for the MLL gene located between the breakpoints and the ribozyme site of action and finally with probes from known partners.
  • Obtaining a positive signal in the first case and negative with the second probe on the MLL gene is indicative of a rearrangement of MLL, while a negative signal in the third step indicates that no known fusion product exists. has been detected. We then proceed to the discovery of a new fusion gene.
  • the search for partners can be carried out by implementing the steps of PCR, and if appropriate of RT-PCR, described above, and by revealing the PCR products using DNA chips formed oligonucleotide or cDNA probes fixed on a miniaturized surface.
  • the invention also relates to diagnostic kits for the implementation of the method defined above.
  • kits are characterized in that they contain the reagents necessary for carrying out at least one PCR and of the revelation test, and if necessary of the reverse transcription and / or of the reaction with the agents capable of incising or to specifically block the gene which we are studying to modify, such as ribozymes or PNAs.
  • kits include the primers for these different reactions and advantageously the solvents or buffers suitable for their production, in particular for hybridization and washing, as well as instructions for use.
  • kits contain specific probes of fusion partners attached to a support. These probes are for example fixed on a plate and are such as obtained by coupling a reagent which they comprise at one of their ends with a reagent of the plate. These are, for example, 5 'biotinylated probes fixed on streptavidin covering the bottom of the wells of a microplate.
  • oligonucleotide or cDNA probes fixed on a miniaturized support are used.
  • the internal probes are fixed on strips.
  • the invention therefore finds particular interest in the diagnosis of leukemias. It is also especially useful in oncology. Mention will in particular be made of the diagnosis of solid tumors, and especially of modifications of the EWS gene in Ewing tumors.
  • Application of the method of the invention makes it possible to detect EWS / FLI1 or other members of the ETS gene family, such as the ERG, ETV1 or E1AF genes.
  • the invention thus provides the means for a simple, reliable and highly sensitive diagnosis, on a large number of samples.
  • the amplification of the starting material is also of great interest since it concerns samples taken from patients, in particular blood or bone marrow.
  • a large number of probes can be tested, for example, up to about 500 probes on 96-well plates. It will be noted with interest that the provisions of the invention allow automation of the tests, in particular at the revelation stage.
  • the invention provides the means to detect genes which hitherto had not been identified as involved in a given pathology.
  • FIG. 1A to 1C gives the general diagram of the steps implemented for detecting fusion transcripts.
  • Example 1 Protocol for the detection of gene alterations with known fusion partners.
  • the cells of the sample to be studied are put into lysis solution by the addition of Trizol R (Life Technology). Chloroform (20% final) is then added to the cell lysate obtained, then after 5 min of incubation at room temperature, the whole is centrifuged for 15 min at 4 ° C. and 12000 g.
  • Three phases are obtained, namely a colorless aqueous phase containing the RNA, a whitish intermediate phase containing the DNA, and a red phenol organic phase.
  • the precipitate is dried at room temperature before being taken up in 10 ⁇ l of water and treated with RNase H.
  • RNA 1 ⁇ g of RNA is subjected to denaturation (volume of 9.5 ⁇ l) 10 min at 70 ° C., then added to the reaction mixture (10.5 ⁇ l): nucleotides (1 mM) + dTT (10 mM) + primer 0, 5 ⁇ M) + R ⁇ ase inhibitors (20 units) + enzyme (50 units of Expand Reverse Transcriptase, 200 units of Superscript), all in a buffer suitable for each of the two enzyme systems:
  • AD ⁇ c The synthesis of AD ⁇ c is done according to the cycle: 10 min at 20 ° C / 45 min at 42 ° C / 3 min at 99 ° C.
  • AD ⁇ c are taken up in a final volume of 60 ⁇ l (1/3 dilution) and stored at -20 ° C. 2) - Amplification of AD ⁇ c by PCR The results obtained with ELONGASE R (BRL, 10481-018) and Expand Long template PCR System (Boehringer, 175 9060) are reported.
  • reaction is carried out in each case in a volume 50 ⁇ l respecting the following conditions: dXTP (500 ⁇ M), sense and antisense primers (1 ⁇ M), MgCl 2 (3 mM), enzymes (2.5 units), all in 50 mM buffer
  • a second round of amplification is carried out during the study of long fragments, using 1 ⁇ l of product from the first PCR. Is used 'then an internal sense primer with respect to that of the first round, the antisense primer is the same; for revelation by
  • dTTP is replaced by a mixture of dTTP + DIG- dUTP (Boehringer; 1558 706) respecting the proportions
  • the probes are chosen on the sequences of the different partners, just downstream of the breakpoints described in each of the translocations.
  • the probes are then biotinylated in 5 ′ and purified by HPLC.
  • 10 ⁇ l of PCR products are denatured in 10 ⁇ l of alkaline solution (0.3M NaOH), then deposited in a well with a streptavidin coating, in the presence of the biotinylated probe at 7.5 pmol / ml (final volume of 220 ⁇ l).
  • the hybridization reaction is carried out between 37 and 50 ° C, for three hours and with stirring.
  • the anti-DIG antibody coupled to peroxidase is added (2 mU in a volume of 200 ⁇ l); incubation is 30 min at 37 ° C. We then proceed to a series of three washes.
  • the peroxidase substrate is in turn added at a rate of 1 mg / ml (30 min at 37 ° C).
  • the OD is read at 405 nm against 492 nm. prior attachment of the biotinylated probes to the ELISA plates (after R. Giorda et al., 14):
  • probe solution 100 ⁇ l (per well) of probe solution at 0.75 pmol / ⁇ l are incubated for 1 hour at room temperature, with shaking. After washing, 100 ⁇ l of 5x Denhardt's solution / 0.02% Na azide are deposited in each of the wells.
  • the plates can thus be stored at 4 ° C. and used as the manipulations are carried out: it is sufficient to wash them (three times), then to deposit the denatured PCR products in 100 ⁇ l of hybridization buffer; the rest of the protocol is done as described above.
  • Example 2 Protocol for the detection of gene alterations with unknown fusion partners.
  • RNAs extracted from the cells of the sample to be studied are treated with the ribosomes, operating as follows: 2 ⁇ g of RNA are placed in the presence of the ribozymes (1 ⁇ M) in a buffer: MgCl 2 (20 mM ); Tris HC1 pH 8 (50 mM), all in a volume of 10 ⁇ l; the reaction mixture is incubated for 2 hours at 37 ° C.
  • reaction products are recovered by precipitation with absolute alcohol (2.5 volumes), in the presence of glycogen and sodium acetate (0.3 M final): 30 min in ice then 30 min at 14000 g , 4 ° C; after rinsing with 75% alcohol (20 min at 14,000 g, 4 ° C) the precipitates are taken up 'in 10 .mu.l of water and subjected to RT and PCR reactions according to the invention.
  • absolute alcohol 2.5 volumes
  • glycogen and sodium acetate 0.3 M final
  • MLL breakpoints are all distributed between exon 5 and exon 11 of the gene; the fusion proteins formed are then homologous for their NH 2 part, due to the conservation of patterns specific to MLL.
  • DSM ACC15 cells of the ML-2 line (DSM ACC15) which have been cultured in RPMI medium (90%) + SVF (10%).
  • RPMI medium 90% + SVF (10%).
  • the cells were frozen in DMSO (5.10 / ml) to be stored, or dissolved lysis (Trizol) in order to extract the nucleic acids therefrom.
  • the TF1 line (derived from an erythroleukemic patient without an abnormality llq23) was used as a control, at various stages of the manipulations (T. Kitamura et al, 21).
  • RNAs are extracted from the cells by operating as indicated above and subjected to the action of RNase H.. reverse transcription
  • Amplification is carried out as described in Example 1, using as sense primers - in the first round, a sequence primer
  • the signal / background noise ratio obtained during the ELISA reflects the revelation efficiency of each of the probes.
  • the first value of the ratio corresponds to a washing with the undiluted solution while the second was obtained with a solution diluted to 1/2.
  • the biotinylated probes used are characterized by a Tm of between 71 ° C and 75 ° C, calculated according to the GC richness method using software.
  • the ODs are measured for each fusion transcript. The results obtained show that the different partners are detected. Obtaining strong signals makes it easy to interpret the results compared to the negative controls.
  • RNAs of the positive control of the t (9; ll) line Monomac 6) and those of the line TF1 are subjected to the action of ribozymes.
  • ribozymes Two ribozymes are used, the enzymatic action of which is specific to the unmodified MLL gene, their cleavage sites being located downstream of the region of the breakpoints. These ribozymes respectively have the following sequences: • ribozyme 1: CUCCAGCUGA UGAGUCCGUG AGGACGAAAC CUUUGG [SEQ ID N ° 6)
  • - ribozyme 2 CUGGAAUCUG AUGAGUCCGU GAGGACGAAA uuuucuuc (SEQ ID N ° 7).
  • the underlined sequences correspond to the sequences complementary to those of MLL around the cleavage points, and the non-underlined sequences to the unpaired sequences leading to the formation of secondary structures essential to the catalytic activity of the ribozymes.
  • the cleavage takes place 3 ′ from the nucleotide which follows the uracil complementary to the underlined adenine.
  • reaction products were converted into cDNA, then subjected to amplification using a pair of primers located on either side of the cut points.
  • the invention thus provides molecular tools and a diagnostic method making it possible to identify on a large number of patients the different partners of MLL as well as their different breakpoints and to better understand the mechanisms of development of pathologies linked to gene rearrangements. , for example the leukemogenesis mechanisms underlying the MLL gene shifts.

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Abstract

L'invention vise une méthode de diagnostic in vitro de pathologies associées à des remaniements géniques dans laquelle on soumet l'ADN à étudier à au moins une étape de PCR ancrée, en effectuant au moins une étape d'amplification asymétrique avec un seul couple d'amorces et qu'on ne révèle le gène susceptible d'être impliqué dans un gène de fusion que dans le mesure où la fusion existe. Application en particulier au diagnostic de leucémies.

Description

Méthode de diagnostic in vitro de pathologies associées à des remaniements gëniques et trousses de diagnostic.
L'invention se rapporte à la détection de remaniements géniques, avec échange de matériel génétique. Ces remaniements correspondent à la formation de gènes de fusion par accolement de la partie transloquée à une portion du génome située sur le chromosome partenaire, ou une modification de la régulation de l'expression d'un gène. Le terme gène ainsi utilisé désignera le gène impliqué dans divers remaniements alors que l'expression "partenaires de fusion" se référera aux portions de génome accolées audit gène .
L'invention vise plus particulièrement une méthode et des trousses pour le diagnostic in vitro de pathologies associées à de tels remaniements.
En ce qui concerne par exemple les leucémies, on sait qu'elles sont associées aux remaniements de nombreux gènes dont certains, tels que le -gène MLL, interviennent de manière récurrente . Le gène MLL appartient à la bande llq23 du génome humain, fréquemment impliquée dans des remaniements moléculaires, en particulier dans le cadre des leucémies aigùes lymphoides (LAL) et également de leucémies aiguës myéloides (LAM) . Les études cytogenetiques effectuées ont permis de dénombrer à ce jour une trentaine de bandes chromosomiques partenaires différentes. Treize partenaires de fusion de MLL ont été actuellement clones et séquences, ce qui représente approximativement 95 % des remaniements connus. Ces remaniements sont le plus souvent associés à de mauvais pronostics cliniques, d'où l'importance accordée à leur étude depuis quelques années .
La cytogénique, avec l'établissement du caryotype, correspond à l'une des méthodes classiquement utilisées. Cette technique a permis de montrer l'existence de remaniements avec un grand nombre de partenaires dans la région chromosomique llq23 et d'établir la valeur pronostique de l'anomalie. Mais elle comporte de nombreux faux négatifs et son taux de réussite n'excède pas 50 à 70 %.
D'autres techniques connues comprennent le Southern blot et l'hybridation in si tu .
Le Southern blot présente l'avantage de mettre en évidence tous les remaniements, mais reste peu exploitable par les laboratoires cliniques du fait de sa longueur et de sa lourdeur, et des contraintes de la radioactivité. En effet, un résultat en quelques semaines, au cas par cas, est indispensable pour une décision thérapeutique. L'hybridation in situ (FISH) pourrait a priori permettre de mettre en évidence des anomalies génétiques, mais sa sensibilité n'est pas toujours suffisante du fait de la fréquence des délêtions qui accompagnent souvent les translocations, l'application de cette technique peut également conduire à l'établissement de faux négatifs. Les problèmes soulevés par ces deux types de démarche expliquent l'importance prise par l'amplification par PCR.
Cette technique permet en effet de mettre en évidence la présence d'un remaniement avec un partenaire particulier. Mais, dans sa réalisation actuelle, elle ne permet de détecter que les remaniements les plus fréquents et n'est pas applicable pour l'ensemble des partenaires, car le test deviendrait alors très lourd et consommerait beaucoup trop de matériel du patient.
Récemment, on a proposé une technique de PCR multiplex, qui permet la mise en évidence de 4 à 6 partenaires, voire plus. Il s'agit cependant d'une technique délicate, dont la difficulté augmente avec le nombre de partenaires à tester et qui, de plus, nécessite un appareillage très cher (sequenceur automatique avec plusieurs marqueurs fluorescents) , ce qui limite sa diffusion à quelques laboratoires experts.
La solution apportée par 1 ' invention repose sur la réalisation d'une PCR ancrée, c'est-à-dire avec un couple unique d'amorces, permettant d'amplifier sans discrimination tous les types de gènes de fusion impliquant le gène visé, et la révélation spécifique des seuls gènes de fusion. L'ensemble des types de gènes de fusion peut être amplifié et détecté selon un protocole simple et rapide d'exécution.
L'invention a donc pour but de fournir une méthode de diagnostic in vitro de pathologies associées aux remaniements de gènes, permettant de détecter de tels remaniements et pouvant être réalisée sur la quasi- totalité des patients.
Elle vise également à fournir des trousses de diagnostic pour la mise en oeuvre de cette méthode. La méthode de diagnostic in vitro, selon l'invention, est caractérisée en ce qu'on soumet de l'ADN d'un patient à au moins une étape de PCR ancrée, en effectuant au moins une étape d'amplification asymétrique, à l'aide d'un seul couple d'amorces formé par une amorce spécifique de l'ADN du gène susceptible d'être impliqué dans un gène de fusion et par une amorce complémentaire aléatoire, et qu'on ne révèle un tel gène que dans la mesure où il est impliqué dans ladite fusion.
On observera que ces dispositions permettent avantageusement d'amplifier toute séquence impliquant le gène considéré, quel que soit le partenaire de fusion, et même si la séquence associée au gène considéré présente une longueur importante. L'étape de révélation est au contraire spécifique et ne permet de détecter le gène considéré que dans la mesure où il est remanié avec un partenaire donné .
Les amorces utilisées dans l'étape d'amplification sont avantageusement choisies,' en particulier pour l'amplification de long fragments, de manière à satisfaire les critères de longueur, Tm et de stabilité aux extrémités .
Ainsi, la longueur des amorces doit assurer une stabilité permettant 1 'élongation. Des amorces avantageuses comportent 25 à 40 nucléotides environ, et notamment de 30 à 35 nucléotides. La température Tm, à laquelle la moitié de l'ADN est sous forme dénaturée, est avantageusement de l'ordre de
80°C à 86°C, et notamment voisine de 80°C. La composition en bases de la séquence est choisie de manière à satisfaire cette exigence.
De même, on prendra en compte la stabilité aux extrémités 3' et 5', l'extrémité de l'amorce qui subit l'élongation devant être moins stable que l'extrémité opposée, pour éviter l'initiation et l'élongation de produits de PCR non spécifiques. Il est également important d'éviter la formation de duplex et de boucles en 3 ' , qui gêneraient le bon appariement des amorces à la séquence d'ADN ou d 'ADNc
L'élaboration d'amorces telles que définies ci- dessus peut être aisément réalisée à l'aide de logiciels. La stratégie de PCR ancrée peut être dirigée en 3 ' comme défini ci-dessus, mais également en 5', une queue artificielle étant alors rajoutée à l'extrémité 5' du gène, utilisable comme amorce. On a recours avec avantage, à cet effet, à l'enzyme terminal déoxyribonucléotidyltransférase .
La révélation des gènes remaniés est effectuée par tout marquage approprié .
De manière générale, on met en contact des sondes spécifiques des séquences nucléotidiques de partenaires de fusion connus avec les produits de PCR dénaturés, marqués aux fins de révélation, dans des conditions permettant une interaction spécifique sondes-produits de PCR lorsqu'il existe une complémentarité des bases. Les produits de PCR portent un marqueur
(digoxigénine, biotine ou fluorophore par exemple) qui va permettre leur révélation. Ce marqueur est porté par un desoxynucleotide qui est incorporé aux produits PCR pendant la deuxième amplification.
Les sondes peuvent être fixées de façon covalente sur un support, tel que des plaques à 96 puits.
Cette fixation covalente peut être réalisée avantageusement par le couplage sonde biotinylée/plaque- streptavidine .
En variante, cette liaison covalente peut être réalisée à l'aide d'une sonde phosphorylée à son extrémité et un groupement carbodiimide sur la plaque ou encore une sonde modifiée par un groupement aminé à une extrémité et liée par des groupements N-oxysuccinimide esters .
Une méthode satisfaisante comprend l'utilisation de la technique ELISA pour révéler spécifiquement celles des séquences nucléotidiques qui comportent le gène impliqué dans un remaniement .
On fait réagir les produits de PCR, dans lesquels on a incorporé un marqueur, avec un anticorps lui-même marqué, dirigé contre les marqueurs des produits de PCR, dans des conditions permettant une réaction de type antigène-anticorps, la révélation de la réaction antigène-anticorps, lorsqu'elle se produit, étant effectuée par détection du marqueur de l'anticorps ou d'une réaction l'impliquant.
Selon encore une autre méthode, on a recours à la technologie de PCR qui permet de détecter des produits de PCR par hybridation sonde interne-produit de PCR en solution. Il peut s'agir soit d'une sonde d'hybridation, soit d'une sonde d'hydrolyse.
On observera que la mise en oeuvre de PCR multiples, avec différents gènes, permet, en marquant ces derniers avec des marqueurs distincts les uns des autres, de révéler dans un même test plusieurs gènes remaniés impliqués dans une pathologie.
Une variante de révélation, permettant de mettre en évidence, dans un même test, de nombreux remaniements géniques sur un grand nombre de gènes, est basée sur la technique des puces à ADN et comprend l'utilisation de sondes oligonucléotidiques ou d'ADNc fixées sur un support miniaturisé. Chaque sonde ou unité d'hybridation peut être avantageusement contrôlée individuellement par un champ électrique.
Dans une autre variante, les sondes internes sont avantageusement immobilisées sur des bandelettes.
L'ADN soumis à amplification correspond avantageusement à l'ADNc, tel qu'obtenu par transcription inverse de 1 'ARN extrait de l'échantillon. En variante, il s'agit d'ADN génomique extrait de l'échantillon à étudier.
Les sondes internes sont immobilisées avantageusement sur des bandelettes .
Selon un mode de mise en oeuvre de l'invention, on procède à une étape de transcription inverse (RT en abrégé), avant l'amplification par PCR, afin de synthétiser une population d'ADNc à partir des ARN des cellules de l'échantillon à étudier. Pour cette étape, on utilise avantageusement une séquence de nucléotides stable, dont le Tm est de l'ordre de 80 à 90°C.
Des séquences appropriées comprennent une cassette de 40 à 60 nucléotides environ et comportent à l'une des extrémités de 10 à 20 motifs T ou, en variante, une répétition d'un motif nucléotidique au hasard.
Selon un autre mode de mise en oeuvre de l'invention, on soumet l'ADN génomique ou l'ARN, extraits des cellules de l'échantillon à étudier, à l'action d'un composé capable d'inciser ou de bloquer spécifiquement l'ADN du gène dont on étudie la fusion. Il s'agit par exemple de PNA (acides nucléiques polypeptidiques) ou de ribozymes. On effectue ensuite les étapes de PCR, ou le cas échéant de RT-PCR avec des amorces comportant éventuellement des sites de clonage. Ensuite on fait réagir les produits obtenus avec d'une part deux sondes spécifiques du gène à étudier, une en amont de la région des points de cassure (sonde «a») et une en aval (sonde «b») , d'autre part des sondes élaborées à partir des gènes partenaires connus (sondes «c») . Une détection positive avec la sonde «a» et négative avec la sonde «b» permet de conclure au réarrangement du gène considéré et une révélation négative avec les sondes «c» à l'absence de détection d'un produit de fusion connu. Les nouveaux gènes de -fusion, lorsqu'ils sont mis en évidence par le test, peuvent être secondairement clones et séquences par les techniques classiques. Cette technique apporte ainsi des éléments dans la compréhension des événements moléculaires impliqués dans la transformation cellulaire.
Selon un mode avantageux de réalisation de l'invention, mis en oeuvre pour détecter des translocations impliquant le gène MLL, on synthétise par RT un pool d'ADNc à partir de l 'ARN extrait de l'échantillon à étudier à l'aide d'amorces comportant une cassette d'environ 30 à 35 nucléotides, complétée par une séquence de 6 ou 9 motifs nucléotidiques au hasard, et on réalise une PCR ancrée avec, comme amorce sens spécifique, une amorce située sur 1 ' exon 5 de MLL. Lorsqu'on a recours à un deuxième tour d'amplification, on utilise une amorce sens interne par rapport à la première, ce qui permet d'augmenter la spécificité. L ' amorce aléatoire est avantageusement complémentaire de la cassette d'oligonucléotides utilisée lors de l'étape de transcription inverse.
La révélation des transcrits de fusion éventuellement présents est réalisée selon la technique ELISA et comprend l'utilisation de sondes situées à intervalles réguliers sur les partenaires de fusion considérés, de façon à couvrir la- totalité des points de cassure. Une première étape consiste à mettre en contact une sonde spécifique des partenaires de fusion connus de MLL avec les produits de PCR dénaturés, marqués par de la digoxygénine lors du deuxième tour de l'amplification, dans des conditions permettant une hybridation lorsqu'il existe une complémentarité de bases* Dans une deuxième étape, on met ensuite en contact les produits résultants avec des anticorps anti- digoxygénine, ces anticorps étant couplés à une enzyme, capable de réagir avec son substrat en libérant un produit coloré détectable dans le cas où les anticorps sont fixés aux produits de PCR.
Des résultats satisfaisants sont obtenus en réalisant l'hybridation entre 37 à 50 °C environ pendant 2 à 4 heures . L'interaction sondes-produits de PCR est réalisée à une température supérieure à 30°C, notamment de 35 à 65°C, en particulier de 55°C environ, pendant une durée de 0,5 à 5 h, notamment de 1 h environ.
Les conditions de lavage sont choisies de manière à obtenir un rapport signal/bruit de fond optimal.
On fait réagir le substrat de l'enzyme avec le mélange réactionnel sondes/produits de PCR dans les mêmes conditions de durée et de température, et on détecte le produit éventuellement libéré, par exemple par mesure de densité optique.
Les résultats obtenus à l'aide de cette méthode montrent que les produits de fusion des translocations considérées sont détectés aisément, avec des signaux forts . Ces résultats sont aisément interprétables par rapport aux contrôles négatifs.
Il est ainsi possible de détecter 95 % des remaniements du gène MLL.
Pour détecter de nouvelles associations MLL-gène partenaire, on soumet les ARN totaux à l'action de ribozymes spécifiques du gène MLL avant de procéder à la RT-PCR, puis on fait réagir les produits d'amplification avec une sonde correspondant à une séquence de l'exon 5 de MLL, en 3' de l'amorce utilisée, puis avec une deuxième sonde toujours spécifique du gène MLL située entre les points de cassure et le site d'action des ribozymes et enfin avec des sondes des partenaires connus. L'obtention d'un signal positif dans le premier cas et négatif avec la deuxième sonde sur le gène MLL est significatif d'un réarrangement de MLL, alors qu'un signal négatif dans la troisième étape indique qu'aucun produit de fusion connu n'a été détecté. On procède alors à la mise en évidence d'un nouveau gène de fusion.
En variante, la recherche de partenaires peut être réalisée en mettant en oeuvre les étapes de PCR, et le cas échéant de RT-PCR, décrites ci-dessus, et en révélant les produits de PCR à l'aide de puces d'ADN formées de sondes oligonucléotidiques ou d'ADNc fixées sur une surface miniaturisée.
L'invention vise également des trousses de diagnostic pour la mise en oeuvre de la méthode définie ci-dessus .
Ces trousses sont caractérisées en ce qu'elles comportent les réactifs nécessaires pour la réalisation d'au moins une PCR et du test de révélation, et le cas échéant de la transcription inverse et/ou de la réaction avec les agents capables d'inciser ou de bloquer spécifiquement le gène dont on étudie le remaniement, tels que les ribozymes ou les PNA.
En particulier, ces trousses comportent les amorces pour ces différentes réactions et avantageusement les solvants ou tampons appropriés pour leur réalisation, notamment pour l'hybridation et les lavages, ainsi qu'une notice d'utilisation.
Des trousses préférées renferment les sondes spécifiques de partenaires de fusion fixées à un support. Ces sondes sont par exemple fixées sur une plaque et sont telles qu'obtenues par couplage d'un réactif qu'elles comportent à l'une de leurs extrémités avec un réactif de la plaque. Il s'agit par exemple de sondes biotinylées en 5 ' fixées sur de la streptavidine recouvrant le fonds des puits d'une microplaque.
En variante, on utilise des sondes oligonucléotidiques ou d'ADNc fixées sur un support miniaturisé (puces à ADN) . Selon encore une autre variante, les sondes internes sont fixées sur des bandelettes.
La possibilité de stocker ces plaques-support sur lesquelles sont fixées les sondes permet de standardiser la technique de révélation et de l'alléger pour la révélation des gènes de fusion ou des transcrits de fusion recherchés.
Les expérimentations menées sur des lignées cellulaires ont été validées chez des patients dont le type de remaniement génétique avait déjà été établi, confirmant leur intérêt pour une utilisation dans un cadre clinique pour l'établissement d'un diagnostic moléculaire ainsi que pour le définition des points de cassure .
On mesurera 1 ' intérêt particulier de la méthode de l'invention dans les cas, notamment de LAM, où l'étude cytogénétique ne révèle pas d'anomalies chromosomiques, alors que la biologie moléculaire permet de mettre en oeuvre un remaniement moléculaire . La méthode de 1 ' invention permet ainsi de cribler les patients atteints de LAM et pour lesquels le caryotype n'est pas disponible ou a été décrit comme normal, et de vérifier l'existence ou non de remaniements associés à une pathologie.
L'invention trouve donc un intérêt particulier pour le diagnostic des leucémies. Elle s'avère également tout spécialement utile en cancérologie. On citera en particulier le diagnostic de tumeurs solides, et tout spécialement de remaniements du gène EWS dans les tumeurs d ' Ewing . L'application de la méthode de 1 ' invention permet de détecter des remaniements EWS/FLI1 ou d'autres membres de la famille du gène ETS, tels que les gènes ERG, ETV1 ou E1AF.
De manière générale, l'invention fournit ainsi les moyens pour un diagnostic simple, fiable et de grande sensibilité, sur un grand nombre d'échantillons. L'amplification du matériel de départ revêt également un grand intérêt puisqu'il s'agit de prélèvements effectués sur les patients, notamment sang ou moelle osseuse. On peut tester un grand nombre de sondes, par exemple, jusqu'à 500 sondes environ sur les plaques 96 puits. On notera avec intérêt que les dispositions de l'invention permettent une automatisation des tests, notamment à l'étape de révélation.
De plus, comme déjà souligné, l'invention fournit les moyens de détecter des gènes qui jusqu'alors n'avaient pas été identifiés comme impliqués dans une pathologie donnée .
D'autres caractéristiques et avantages de
1 ' invention seront donnés dans les exemples qui suivent. et en se référant à la figure 1A à 1C qui donne le schéma général des étapes mises en oeuvre pour une détection de transcrits de fusion.
Exemple 1 : Protocole pour la détection de remaniements d'un gène avec des partenaires de fusion connus .
A partir des ARN totaux de l'échantillon à étudier, Don synthétise les ADNc par transcription inverse (RT) , puis 2) on amplifie le pool d'ADNc par PCR, et 3) on procède à la vérification de la spécificité des transcrits. Ces étapes sont illustrées par le schéma donné sur la figure unique. Préparation des ARN
Les cellules de l'échantillon à étudier sont mises en solution de lyse par addition de TrizolR (Life Technologie) . On ajoute ensuite du chloroforme (20% final) au lysat cellulaire obtenu, puis après 5 min d'incubation à température ambiante, le tout est centrifugé 15 min à 4°C et 12000 g.
On obtient trois phases, à savoir une phase incolore aqueuse renfermant l'ARN, une phase intermédiaire blanchâtre renfermant l'ADN, et une phase organique phénolée rouge .
On ajoute de 1 ' isopropanol à l'ARN, (500 μl pour
1 ml de TrizolR) , puis on centrifuge 10 min à 4°C et 12000 g, après une incubation de 10 min à température ambiante ; le précipité est rincé dans 1 ml d'éthanol 75% (5 min à 4°C et 7500 g) .
Le précipité est séché à température ambiante avant d'être repris dans 10 μl d'eau et traité par la RNase H. La quantité d'ARΝ extrait est calculée par mesure de la DO à 260 nm : concentration (μg/μl) = DO mesurée x 40
(coefficient d'extinction) x coefficient de dilution x 10"
3
1) . Transcription inverse On utilise, comme système enzymatique SuperscriptR (Life Technologie, 18064-014) ou Expand Reverse
Transcrip-taseR (Boehringer, 1 785 834) , en appliquant le protocole suivant :
1 μg d' ARN est soumis à dénaturation (volume de 9,5 μl) 10 min à 70°C, puis ajouté au mélange réactionnel (10,5 μl) : nucléotides (1 mM) + dTT (lOmM) + amorce 0,5 μM) + inhibiteurs des RΝases (20 unités) + enzyme (50 unités d'Expand Reverse Transcriptase , 200 unités de Superscript) , le tout dans un tampon approprié à chacun des deux systèmes enzymatiques :
SuperscriptR : 20 mM Tris HC1 , 50 mM KCl , 5 M MgCl2 Expand Reverse TranscriptaseR : 50 mM Tris HC1, 40 mM KCl, 5 mM MgCl2.
La synthèse des ADΝc se fait selon le cycle : 10 min à 20°C / 45 min à 42°C / 3 min à 99°C.
Les échantillons sont ensuite soumis à la RΝase H (Boehringer, 786 357 : 2 unités) pendant 10 min, à 42°C.
Les ADΝc sont repris dans un volume final de 60 μl (dilution au 1/3) et stockés à -20°C. 2) - Amplification des ADΝc par PCR On rapporte les résultats obtenus avec, comme systèmes enzymatiques, ELONGASER (BRL, 10481-018) et Expand Long template PCR System (Boehringer, 175 9060) .
On utilise deux programmes d'amplification différents selon la longueur des fragments :
- pour l'amplification de fragments allant jusqu'à 1 kb:
94°C 3 min 94°C 30 sec | 58°C 30 sec | x 34 72°C 30 sec |
16°C ∞
- pour l'amplification de fragments supérieurs à lkb
95°C 30 sec
94°C 10 sec / 68°C 8 min x 10 94°C 10 sec / 68°C 8 min + 20 sec par cycle x20 68°C 7 min 16°C ∞ La réaction s'effectue dans chaque cas dans un volume de 50 μl en respectant les conditions suivantes : dXTP (500 μM) , amorces sens et antisens (1 μM) , MgCl2 (3 mM) , enzymes (2,5 unités), le tout dans un tampon 50 mM
Tris HC1 (pH 9,2), 16 mM (NH4)2S04, 2% DMSO, 0,1% Tween
20.
Un deuxième tour d'amplification est effectué lors de l'étude de longs fragments, à partir d' 1 μl de produit de la première PCR. On utilise ' alors une amorce sens interne par rapport à celle du premier tour, l'amorce antisens est identique ; en vue de la révélation par
ELISA, le dTTP est remplacé par un mélange dTTP + DIG- dUTP (Boehringer ; 1558 706) respectant les proportions
1 :19.
3) . Révélation par ELISA (kit Boehringer, 1636 111) des hybrides sondes/produits de PCR. Dans une première étape, on met en contact des sondes biotinylées spécifiques de partenaires connus avec les produits de PCR et dans une deuxième étape on révèle les hybrides formés . a. hybridation
A l'aide du logiciel oligo 5, on choisit les sondes sur les séquences des différents partenaires, juste en aval des points de cassure décrits dans chacune des translocations. Les sondes sont alors biotinylées en 5' et purifiées par HPLC .
- fixation extemporanée des sondes sur les plaques ELISA
10 μl de produits de PCR sont dénaturés dans 10 μl de solution alcaline (NaOH 0,3M), puis déposés dans un puits avec un revêtement de streptavidine, en présence de la sonde biotinylée à 7,5 pmol/ml (volume final de 220 μl) . La réaction d'hybridation se fait entre 37 et 50°C, pendant trois heures et sous agitation.
Après trois lavages, l'anticorps anti-DIG couplé à la peroxydase est ajouté (2 mU dans un volume de 200 μl) ; l'incubation est de 30 min à 37°C. On procède ensuite à une série de trois lavages.
Enfin, le substrat de la peroxydase est à son tour ajouté à raison de 1 mg/ml (30 min à 37°C) . La DO est lue à 405 nm contre 492 nm. fixation préalable des sondes biotinylées aux plaques ELISA (d'après R. Giorda et col., 14) :
100 μl (par puits) de solution de sonde à 0,75 pmol/μl sont incubés 1 heure à température ambiante, sous agitation. Après lavage, lOOμl de solution 5x Denhardt's / 0,02% Na azide sont déposés dans chacun des puits.
Les plaques peuvent ainsi être stockées à 4°C et utilisées au fur et à mesure des manipulations : il suffit de les laver (trois fois) , puis de déposer les produits de PCR dénaturés dans lOOμl de tampon d'hybridation ; la suite du protocole se fait comme décrit ci-dessus.
Exemple 2 : Protocole pour la détection de remaniements d'un gène avec des partenaires de fusion inconnus .
On traite tout d'abord les ARN totaux extraits des cellules de l'échantillon à étudier par les ribosomes en opérant comme suit : 2 μg d 'ARN sont mis en présence des ribozymes (1 μM) dans un tampon : MgCl2(20 mM) ; Tris HC1 pH 8 (50 mM) , le tout dans un volume de 10 μl ; le mélange réactionnel est incubé 2 heures à 37°C.
Les produits de réaction sont récupérés par précipitation avec de l'alcool absolu (2,5 volumes), en présence de glycogène et d'acétate de sodium (0,3 M final) : 30 min dans la glace puis 30 min à 14000 g, 4°C; après rinçage avec de l'alcool 75 % (20 min à 14000 g, 4°C) les précipités sont repris' dans 10 μl d'eau et soumis aux réactions de RT et de PCR selon l'invention. Exemple 3 : Détection de remaniements du gène MLL • translocations de MLL
On rappelle dans le tableau suivant la caractérisation des translocations impliquant MLL et des partenaires de fusion telle qu'établie à ce jour. Tableau Transcrits de fusion de MLL
Figure imgf000021_0002
* = le transcrit de fusion peut être présent avec un caryotype normal, r = résumé de congrès.
Figure imgf000021_0001
Les différents travaux menés sur MLL et ses partenaires ont permis d'établir les faits suivants :
1. Seule la protéine chimère obtenue par fusion de la partie NH2 de MLL avec l'extrémité C terminale du partenaire semble avoir un rôle dans la tumorogénèse .
2. Malgré l'hétérogénéité des points de cassure de MLL, ceux-ci sont tous répartis entre l'exon 5 et l'exon 11 du gène ; les protéines de fusion formées sont alors homologues pour leur partie NH2, du fait de la conservation de motifs propres à MLL.
3. Il existe un très grand nombre de partenaires : au moins autant que pour les Ig ou les TCR dans le cadre des LAL, les partenaires connus représentant plus de 95 % des translocations de MLL rapportées à ce jour. Ces partenaires ne présentent pas de réelle homologie structurale ; seuls AF9 , AF4 et ENL sont homologues et AF10 et AF17 semblent appartenir à une nouvelle famille génique . MLL peut se trouver associé à lui-même dans un processus de duplication. . étude de cellules LAM
On rapporte ci-après les résultats obtenus avec des cellules de lignées leucémiques (LAM humaine) dont l'analyse cytogénétique révèle en particulier des réarrangements Ilq23/6q27. La lignée peut donc servir de contrôle positif pour la translocation t(6 ;11) .
Il s'agit de cellules de la lignée ML-2 (DSM ACC15) qui ont été cultivées en milieu RPMI (90%) + SVF (10%) . En fin de culture, les cellules ont été congelées dans DMSO (5.10 /ml) pour être stockées, ou mises en solution de lyse (Trizol ) en vue d'en extraire les acides nucléiques .
La lignée TF1 (dérivée d'un patient érythroleucemique sans anomalie llq23) a été utilisée en tant que contrôle, à différentes étapes des manipulations (T. Kitamura et al, 21) .
Les ARN sont extraits des cellules en opérant comme indiqué ci-dessus et soumis à l'action de la RNase H. . transcription inverse
On opère comme décrit dans l'exemple 1 en utilisant une amorce avec une répétition de 9 motifs au hasard, de séquence : 5 '
CGTCGTCGTG AATTCCTAGA TCTTCTAGAT ATGTT NNNN NNNN
(SEQ ID N° 2, 44 nuclétotides, Tm = 84°C) . . amplification
L'amplification est réalisée comme décrit dans l'exemple 1, en utilisant comme amorces sens - au premier tour, une amorce de séquence
AGCCCAAGTT TGGTGGTCGC AATATAAAGA AG
(SEQ ID N° 3, 32 nucléotides, Tm = 84°C) , et - au deuxième tour, une amorce interne de séquence
GCCGAATTCA TGCCTTCCAA AGCCTACCT
(SEQ ID N° 4, 29 nucléotides, Tm = 86°C) , et
comme amorce aléatoire, une amorce de séquence
CGTCGTCGTG AATTCCTAGA TCTTCTAGAT ATGTT
(SEQ ID N° 5, 35 nucléotides, Tm = 81°C) . . révélation - hybridation
Pour chacun des partenaires de MLL, une sonde spécifique a été définie, en aval du point de cassure du contrôle positif correspondant. Le rapport signal/bruit de fond obtenu lors de l' ELISA traduit l'efficacité de révélation de chacune des sondes . Pour ENL et la duplication, la première valeur du rapport correspond à un lavage avec la solution non diluée alors que la seconde a été obtenue avec une solution diluée au 1/2. Les sondes biotinylées utilisées sont caractérisées par un Tm compris entre 71 °C et 75 °C, calculé selon la méthode de la richesse en GC à l'aide d'un logiciel.
- mesure de la DO
On mesure les DO pour chaque transcrit de fusion. Les résultats obtenus montrent que les différents partenaires sont détectés. L'obtention de signaux forts permet d'interpréter aisément les résultats par rapport aux contrôles négatifs.
De plus l'utilisation de sondes définies en aval des points de cassures rapportés dans la littérature permet de situer l'événement moléculaire sur le gène impliqué.
- détection de nouveaux partenaires
On soumet les ARN du contrôle positif de la t(9;ll) lignée Monomac 6) et ceux de la lignée TF1 à l'action de ribozymes .
On utilise deux ribozymes dont l'action enzymatique est spécifique du gène MLL non modifié, leurs sites de coupure se situant en aval de la région des points de cassure. Ces ribozymes présentent respectivement les séquences suivantes : • ribozyme 1 : CUCCAGCUGA UGAGUCCGUG AGGACGAAAC CUUUGG [SEQ ID N° 6)
- ribozyme 2 : CUGGAAUCUG AUGAGUCCGU GAGGACGAAA uuuucuuc (SEQ ID N° 7) .
Les séquences soulignées correspondent aux séquences complémentaires de celles de MLL autour des points de clivage, et les séquences non soulignées aux séquences non appariées aboutissant à la formation de structures secondaires indispensables à l'activité catalytique des ribozymes. Le clivage se fait en 3 ' du nucléotide qui suit l'uracile complémentaire de 1 ' adénine soulignée.
Les produits de réactions ont été convertis en ADNc, puis soumis à l'amplification à l'aide d'un couple d'amorces situées de part et d'autre des points de coupure .
L'invention fournit ainsi des outils moléculaires et une méthode de diagnostic permettant d'identifier sur un grand nombre de patients les différents partenaires de MLL ainsi que leurs différents points de cassure et de mieux appréhender les mécanismes de développement de pathologies liées aux remaniements de gène, par exemple les mécanismes de leucémogénèse sous-jacents aux remaniements du gène MLL.
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Claims

REVENDICATIONS 1/ Méthode de diagnostic in vitro de pathologies associées à des remaniements géniques, caractérisée en ce qu'on soumet de l'ADN d'un patient à au moins une étape de PCR ancrée, en effectuant au moins une étape d'amplification asymétrique, à l'aide d'un seul couple d'amorces formé par une amorce spécifique de l'ADN du gène susceptible d'être impliqué dans un gène de fusion et par une amorce aléatoire, et qu'on procède à une étape de révélation des produits de PCR dans laquelle on ne révèle un tel gène que dans la mesure où il est impliqué dans ladite fusion, l'ensemble des partenaires de fusion présents étant ainsi révélés .
2/ Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que les amorces utilisées dans l'étape d'amplification comportent 25 à 40 nucléotides environ et notamment de 30 à 35 nucléotides, Tm est de l'ordre de 75 à 85°C, notamment voisine de 80°C.
3/ Méthode selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce qu'on met en contact des sondes spécifiques des séquences nucléotidiques de partenaires de fusion connus avec les produits de PCR dénaturés, marqués aux fins de révélation, dans des conditions permettant une interaction spécifique sondes-produits de PCR lorsqu'il existe une complémentarité des bases.
4/ Méthode selon la revendication 3, caractérisée en ce que la révélation est effectuée soit par marquage des produits de PCR, les sondes étant fixées à un support de façon covalente, soit par marquage des sondes en solution. 5/ Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que l'ADN soumis à amplification est l'ADNc tel qu'obtenu par transcription inverse (RT) de l'ARN extrait de l'échantillon, ou l'ADN génomique total extrait de l'échantillon à étudier.
6/ Méthode selon la revendication 5, caractérisée en ce qu'elle comprend une étape de transcription inverse avant l'étape d'amplification.
7/ Méthode selon la revendication 6, caractérisée en ce qu'on utilise comme amorces pour la transcription inverse des séquences comprenant une cassette de 40 à 60 nucléotides environ et à l'une des extrémités de 10 à 20 motifs T ou une répétition d'un motif nucleotidique au hasard, ou qu'en variante on met en oeuvre des PCR multiples, avec différents gènes, en marquant ces derniers avec des marqueurs différents les uns des autres .
8/ Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisée en ce qu'on soumet l'ADN génomique, ou l'ARN, extraits des cellules de l'échantillon à étudier, à l'action d'un composé capable d'inciser ou de bloquer spécifiquement l'ADN ou l'ARN du gène dont on étudie la fusion et, après l'étape de PCR ou RT-PCR, avec des amorces comportant éventuellement des sites de clonage, les produits obtenus étant mis à réagir avec d'une part deux sondes spécifiques du gène à étudier, et plus précisément, en amont et en aval de la région susceptible d'être concernée par les points de cassure, d'autre part des sondes élaborées à partir des gènes partenaires connus, une détection positive avec la sonde d'amont et négative avec la sonde d'aval dans le premier cas permettant de conclure au réarrangement du gène considéré, et une conclusion négative dans le deuxième cas, à l'absence de détection d'un produit de fusion connu, ou qu'en variante on fixe une pluralité de sondes sur un support miniaturisé, l'hybridation spécifique sonde-produits de PCR marqués, mettant en évidence le partenaire du gène de fusion.
9/ Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisée en ce qu'elle est appliquée à la détection de translocations impliquant le gène MLL et comprend la synthèse par RT d'un pool d'ADNc à partir de l'ARN extrait de l'échantillon à étudier, à l'aide d'amorces comportant une cassette d'environ 30 à 35 nucléotides complétée par une séquence de 6 ou 9 motifs nucléotidiques au hasard, et on réalise une PCR ancrée avec, avec comme amorce sens spécifique, une amorce située sur l'exon 5 de MLL, et lorsqu'on réalise un deuxième tour, une amorce sens interne par rapport à la première, l'amorce aléatoire étant à chaque tour la même et complémentaire de la cassette d' oligonucléotides utilisées dans l'étape de RT.
10/ Méthode selon la revendication 9, caractérisée en ce que la révélation des transcrits de fusion éventuellement présents comprend la mise en contact
- d'une sonde spécifique des partenaires de fusion connus de MLL avec les produits de PCR dénaturés, marqués par de la digoxygénine lors de l'amplification, dans des conditions permettant une hybridation lorsqu'il existe une complémentarité de bases, - des produits résultants avec des anticorps anti- digoxygénine , ces anticorps étant couplés à une enzyme, capable de réagir avec son substrat en libérant un produit coloré détectable dans le cas où les anticorps sont fixés aux produits de PCR, puis
- du mélange réactionnel sondes/produits de PCR avec le substrat de l'enzyme, le produit éventuellement formé étant alors détecté .
11/ Méthode selon la revendication 9 ou 10, caractérisée en ce que pour détecter de nouvelles associations MLL-gène partenaire, on soumet les ARN totaux à l'action de ribozymes avant de procéder à la RT- PCR, puis on fait réagir les produits d'amplification d'une part avec une sonde correspondant à une séquence de l'exon 5 de MLL, en 3 ' de l'amorce utilisée, puis avec une deuxième sonde toujours spécifique du gène MLL, située entre les points de cassure et le site d'action des ribozymes, et enfin avec des sondes de partenaires connus . 12/ Application de la méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, au diagnostic de leucémies.
13/ Application de la méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, au diagnostic de tumeurs solides, telles que les tumeurs d'E ing. 14/ Trousses de diagnostic pour la mise en oeuvre de la méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, caractérisées en ce qu'elles comportent les réactifs nécessaires pour la réalisation de la PCR et du test de révélation, et le cas échéant de la transcription inverse et/ou de la réaction avec des agents capables d'inciser ou de bloquer le gène tels les PNA ou les ribozymes, ces trousses comportant en outre les amorces pour ces différentes réactions et avantageusement les solvants ou tampons appropriés pour leur réalisation. 15/ Trousses selon la revendication 14, caractérisées en ce qu'elles comportent des sondes oligonucléotidiques pour réaliser les hybridations mises en oeuvre lors de l'étape de révélation, ces sondes étant fixées sur un support tel qu'une une plaque à multipuits, et sont telles qu'obtenues par couplage d'un réactif qu'elles comportent à l'une de leurs extrémités avec un réactif de la plaque, par exemple par couplage de biotine fixée à leur extrémité 5 ' sur de la streptavidine recouvrant le fonds des puits d'une microplaque, ou qu'en variante les sondes oligonucléotidiques sont fixées sur un support miniaturisé ou, selon encore une autre variante, les sondes internes sont fixées sur des bandelettes.
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