WO1999013334A2 - Method for diagnosing preliminary stages of cancer of the liver and kidney - Google Patents

Method for diagnosing preliminary stages of cancer of the liver and kidney Download PDF

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Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts
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Abstract

The invention relates to a method for diagnosing preliminary stages of cancer of the liver and kidney. Detection of the presence of insulin receptor substrate (IRS-1) in glycogenolytic foci (GSF) and/or mixed cellular foci (MCF) in a tissue sample or from the extracted nucleinic acid is assisted by the bonding of a specific reagent, for example an antibody or a nucleinic acid probe, and the display of the formed complex. In addition, the invention provides a method for testing substances which are suspected to cause liver or kidney cancer.

Description

Verfahren zur Diagnose von frühen Krebsvorstufen der Leber und NiereProcedure for the diagnosis of early stages of cancer of the liver and kidney
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Diagnose von frühen Krebsvorstufen in der Leber und den Nieren, wobei in einer Leber- oder Nierengewebe- probe die Gegenwart des Insulin-Rezeptor-Substrats (IRS- 1 ) in glykogenotischen Foci (GSF) und/oder gemischtzelligen Foci (MCF) anhand der Bindung eines spezifischen Reagenzes, beispielsweise eines Antikörpers, und der Sichtbarmachung des gebildeten Komplexes nachgewiesen wird. Die vorliegende Erfindung betrifft darüber hinaus die Verwendung des Verfahren zum Testen von Substanzen, die im Verdacht stehen, Leber- und/oder Nierenkrebs erzeugen zu können.The present invention relates to methods for the diagnosis of early cancer precursors in the liver and kidneys, the presence of the insulin receptor substrate (IRS-1) in glycogenotic foci (GSF) and / or mixed-cell foci in a liver or kidney tissue sample (MCF) is detected on the basis of the binding of a specific reagent, for example an antibody, and the visualization of the complex formed. The present invention further relates to the use of the method for testing substances that are suspected of being able to produce liver and / or kidney cancer.
Das hepatozelluläre Karzinom (HCC) zählt zu den häufigsten malignen Neoplas- men beim Menschen und verursacht jährlich weltweit mindestens 250.000 Tote. Chronische Infektionen mit dem Hepatitis B- bzw. Hepatitis C-Virus, die Aufnahme von Nahrungsmitteln, die Hepatokarzinogene enthalten, beispielsweise das natürlich vorkommende Aflatoxin B1 f sowie Alkoholmißbrauch werden als die hauptsächlichen Risikofaktoren für das Entstehen von HCC angesehen. Darüber hinaus wurde ein erhöhtes Risiko für die Entwicklung eines hepatozel- lulären Adenoms bei Frauen beobachtet, die Empfängnisverhütungsmittel einnehmen, sowie sowohl bei Frauen als auch bei Männern, die mit anabolen Steroidhormonen behandelt wurden. Zu den weiteren Stoffen, die in der menschlichen Umwelt auftreten und für die zumindest bei Nagern gezeigt werden konnte, daß sie an der Entstehung von Leberkrebs beteiligt sind, gehören bei¬ spielsweise Nitrosamine, organische chlorierte Pestizide, polychlorierte Bipheny- le, Phthalate und Hypolipidämie bewirkende Medikamente.Hepatocellular carcinoma (HCC) is one of the most common malignant neoplasms in humans and causes at least 250,000 deaths worldwide every year. Chronic infections with the hepatitis B or hepatitis C virus, the intake of foods that contain hepatocarcinogens, for example the naturally occurring aflatoxin B 1 f, and alcohol abuse are considered to be the main risk factors for the development of HCC. In addition, an increased risk of developing hepatocellular adenoma has been observed in women taking contraceptives and in both women and men treated with anabolic steroid hormones. Other substances that occur in the human environment, it could be shown for at least in rodents that they are involved in the development of liver cancer, include at ¬ play as nitrosamines, organic chlorinated pesticides, polychlorinated biphenyls le, phthalates and hypolipidaemia effecting Medication.
Zur Diagnose von Krebsvorstufen der Leber bei Labortieren und neuerdings auch beim Menschen wurden bisher konventionelle, beispielsweise mit Hämatoxylin und Eosin gefärbte Gewebeschnitte hergestellt, daneben aber auch verschiedene Markerenzyme, wie zum Beispiel die plazentare Form der Glutathion-S-Trans- ferase oder die Gamma-Glutamyltransferase, bestimmt. Die Karzinogenese wird auch durch frühe Änderungen im Energiestoffwechsel begleitet, beispielsweise durch die exzessive Glykogenspeicherung in herdförmigen präneoplastischen Läsionen. Somit kann eine Diagnose auch mittels des histochemischen Nachweises von Veränderungen des Glykogengehalts der Leberzellen durchgeführt werden.Conventional tissue sections, for example stained with hematoxylin and eosin, have previously been produced for the diagnosis of cancer precursors of the liver in laboratory animals and more recently also in humans, but also various marker enzymes, such as the placental form of glutathione-S-trans, ferase or the gamma glutamyl transferase. Carcinogenesis is also accompanied by early changes in energy metabolism, for example by excessive glycogen storage in focal prenoplastic lesions. A diagnosis can therefore also be carried out by means of histochemical detection of changes in the glycogen content of the liver cells.
Ein entscheidender Nachteil der Diagnose unter Verwendung dieser Marker ist jedoch, daß entweder keine Unterscheidung von frühen und späten Gewebsver- änderungen bei der Krebsentstehung möglich ist oder die Tumorvorstufen für diagnostische Zwecke nicht deutlich genug vom umgebenden Gewebe abgegrenzt werden können. Letzteres trifft insbesondere auf die Glykogenbestim- mung zu, da Glykogen auch in unverändertem Gewebe in großen Mengen vorkommt. Es ist somit mit dem im Stand der Technik beschriebenen diagnostischen Verfahren nicht möglich, frühe Krebsvorstufen zu erkennen, was eine wesentliche Voraussetzung für eine möglichst frühzeitige und damit wirksame Therapie ist.A decisive disadvantage of the diagnosis using these markers is, however, that either no distinction between early and late tissue changes in the development of cancer is possible, or that the tumor precursors cannot be clearly differentiated from the surrounding tissue for diagnostic purposes. The latter applies in particular to the determination of glycogen, since glycogen is also present in large quantities in unchanged tissue. It is therefore not possible with the diagnostic method described in the prior art to detect early stages of cancer, which is an essential prerequisite for early and thus effective therapy.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht somit in der Bereitstellung eines diagnostischen Verfahrens zur Diagnose von frühen Krebsvorstufen in der Leber und den Nieren.The object of the present invention is therefore to provide a diagnostic method for diagnosing early precancerous stages in the liver and kidneys.
Die Lösung dieser Aufgabe wird durch die Bereitstellung der in den Patentansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen gelöst.This object is achieved by providing the embodiments characterized in the patent claims.
Das erfindungsgemäße Diagnoseverfahren erlaubt die Erkennung von frühen Krebsvorstufen in der Leber und den Nieren und ist damit zur Krebsfrüherkennung geeignet. Es basiert darauf, daß man in einer Gewebeprobe die Gegenwart des Insulin-Rezeptor-Substrats (IRS-1 ) in glykogenotischen Foci (GSF) und/oder gemischtzelligen Foci (MCF) anhand der Bindung an ein Reagenz nachweist.The diagnostic method according to the invention allows the detection of early stages of cancer in the liver and kidneys and is therefore suitable for early cancer detection. It is based on the fact that the presence of the insulin receptor substrate (IRS-1) in glycogenotic foci (GSF) and / or mixed cell foci (MCF) is detected in a tissue sample by binding to a reagent.
Die Karzinogenese in Leber und Niere ist dadurch gekennzeichnet, daß zuerst präneoplastische Foci (glykogenotische Foci, GSF; gemischtzellige Foci, MCF; basophile Foci, BCF) entstehen, aus denen sich dann schließlich das hepatozel- luläre Karzinom (HCC) oder Nierenzellkarzinom (NCC) entwickelt. Bei der Umwandlung von GSF zu HCC bzw. NCC kommt es, wie schon vorstehend angedeutet, in der Leber zu enzymatischen Veränderungen, wobei Glukose bevorzugt über den Pentosephosphatzyklus und Glykolyse metabolisiert wird. Dabei nimmt dann das ursprünglich im Überschuß gespeicherte Glykogen allmählich ab, andererseits kommt es zu einer Zunahme der basophilen Ribosomen und der Zellvermehrung. Über die Zwischenstufe der MCF entsteht schließlich der basophile neoplastische Phänotyp. Durch verschiedene Untersuchungen wurde nachgewiesen, daß in den GSF das Stoffwechselmuster der Antwort der Hepa- tozyten auf Insulin entspricht. Tatsächlich wurde bei diabetischen Ratten beobachtet, daß nach Transplantation von Inselzellen in die Leber, die unter diesen Bedingungen Insulin im Übermaß sezernierten, hepatozelluläre Neoplasmen entstehen. Insulin ist ein pleiotropes Hormon, das sich in Hepatozyten auf den Stoffwechsel sowie die Mitose auswirkt. Dies erfolgt durch eine Signaltransduk- tionskaskade, bei der IRS-1 das intrazelluläre Substrat der Insulinrezeptortyrosin- kinase darstellt. Die Überexpression von IRS-1 in HCC oder NCC konnte nachgewiesen werden. Darüber hinaus wurde auch gezeigt, daß es bei Überexpression von IRS-1 in Leberzellinien zur Transformation der Zellen kommt. Bisher wurde jedoch die Expression von IRS-1 in frühen Stadien der Leber- und Nieren- zellkrebsentstehung nicht untersucht.Carcinogenesis in the liver and kidney is characterized in that first preneoplastic foci (glycogenotic foci, GSF; mixed cell foci, MCF; basophilic foci, BCF) develop from which hepatocellular carcinoma (HCC) or renal cell carcinoma (NCC) develops. As already indicated above, the conversion of GSF to HCC or NCC leads to enzymatic changes in the liver, whereby glucose is preferably metabolized via the pentose phosphate cycle and glycolysis. The glycogen originally stored in excess then gradually decreases, on the other hand there is an increase in basophilic ribosomes and cell proliferation. The basophilic neoplastic phenotype finally emerges via the intermediate stage of the MCF. Various studies have shown that the GSF metabolic pattern corresponds to the response of the hepatocytes to insulin. In fact, it has been observed in diabetic rats that hepatocellular neoplasms develop after transplantation of islet cells into the liver that excessively secrete insulin under these conditions. Insulin is a pleiotropic hormone that affects the metabolism and mitosis in hepatocytes. This is done by a signal transduction cascade, in which IRS-1 is the intracellular substrate of insulin receptor tyrosine kinase. The overexpression of IRS-1 in HCC or NCC could be demonstrated. In addition, it was also shown that overexpression of IRS-1 in liver cell lines leads to cell transformation. So far, however, the expression of IRS-1 has not been investigated in the early stages of liver and renal cell cancer development.
In der vorliegenden Anmeldung wurde überraschenderweise festgestellt, daß in den frühen, glykogenspeichernden Krebsvorstufen (GSF, MCF) IRS-1 stark über- exprimiert wird, während es im normalen Leber- und Nierengewebe nur in sehr geringen, histochemisch nicht nachweisbaren Mengen vorkommt. Während der Untersuchungen, die zu der vorliegenden Erfindung führten, wurde in Ratten die Expression von IRS-1 in mehr als 400 präneoplastischen Foci von veränderten Hepatozyten (FAH) und in 1 2 hepatozellulären Karzinomen (HCC; induziert mit N-Nitrosomorpholin, NNM) mittels Westernblots und über immunhistochemi- schen Nachweis untersucht. Mittels Westernblots konnte IRS-1 in der Leber von NNM-behandelten und unbehandelten Ratten nachgewiesen werden. IRS-1 war jedoch in normalem Leberparenchym immunhistologisch nicht nachweisbar. Im Gegensatz dazu ergab der immunhistochemische Nachweis, daß IRS-1 besonders in den GSF und MCF, die auch exzessiv Glykogen gespeichert hatten, überexprimiert wurde. Somit ist eindeutig, daß die Überexpression von IRS-1 in GSF und MCF zu einer präneoplastischen Glykogenose führt und ein frühes Ereignis bei der Karzinogenese darstellt. Während der Progression der frühzeitig auftretenden GSF zu MCF, BCF und HCC bzw. NCC wird dann die Expression von IRS-1 wieder herunterreguliert. Dabei wird der präneoplastische insulinomi- metische Phänotyp allmählich in den malignen neoplastischen Phänotyp umgewandelt. Diese im Tiermodell gewonnenen Erkenntnisse decken sich auch mit den bisherigen Untersuchungen am Menschen, so daß die obigen Ergebnisse voll übertragbar sind. Somit kann die Überexpression von IRS-1 als ein spezifischer Marker für frühe Krebsvorstufen in der Leber und den Nieren verwendet werden.In the present application it was surprisingly found that IRS-1 is strongly overexpressed in the early, glycogen-storing cancer precursors (GSF, MCF), whereas it occurs only in very small, histochemically undetectable amounts in normal liver and kidney tissue. During the studies leading to the present invention, expression of IRS-1 in more than 400 preneoplastic foci of altered hepatocytes (FAH) and in 1 2 hepatocellular carcinomas (HCC; induced with N-nitrosomorpholine, NNM) was induced in rats Western blots and examined by immunohistochemical detection. Using Western blots, IRS-1 in the liver of NNM-treated and untreated rats can be detected. However, IRS-1 was undetectable in normal liver parenchyma. In contrast, the immunohistochemical detection showed that IRS-1 was overexpressed especially in the GSF and MCF, which had also stored glycogen excessively. It is therefore clear that overexpression of IRS-1 in GSF and MCF leads to preneoplastic glycogenosis and is an early event in carcinogenesis. During the progression of the early GSF to MCF, BCF and HCC or NCC, the expression of IRS-1 is then downregulated again. The preneoplastic insulinometric phenotype is gradually converted into the malignant neoplastic phenotype. This knowledge gained in the animal model also coincides with previous studies on humans, so that the above results are fully transferable. Thus, the overexpression of IRS-1 can be used as a specific marker for early cancer precursors in the liver and kidneys.
Die vorliegende Erfindung betrifft somit Verfahren zur Diagnose von frühen Krebsvorstufen in der Leber und Nieren, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man eine Leber- oder Nierengewebeprobe bzw. daraus gewonnene Nukleinsäu¬ ren mit einem für das Insulin-Rezeptor-Substrat (IRS-1 ) spezifischen Reagenz in Berührung bringt und die Gegenwart von IRS-1 in glykogenetischen Foci (GSF) und/oder gemischtzelligen Foci (MCF) anhand der spezifischen Bindung an das Reagenz nachweist.The present invention thus relates to methods for the diagnosis of early precancerous lesions in the liver and kidneys, which is characterized in that a liver or kidney tissue sample, or from nucleic ¬ obtained ren with the insulin receptor substrate (IRS-1) brings specific reagent into contact and detects the presence of IRS-1 in glycogenetic foci (GSF) and / or mixed cell foci (MCF) based on the specific binding to the reagent.
Die für das erfindungsgemäße Diagnoseverfahren verwendbaren Nachweisverfahren sind dem Fachmann bekannt und umfassen immunhistochemische Nachweisverfahren (z.B. die APAAP-Methode) oder den Nachweis von IRS-1 mittels geeigneter Nukleinsäure-Sonden, da die Gegenwart von überexprimiertem IRS-1 mit einer stark erhöhten Konzentration der entsprechenden RNA korreliert ist. Die für IRS-1 codierende cDNA wurde von Sun et al., Nature 352, S. 72-77 ( 1 991 ) veröffentlicht und es ist für einen Fachmann in Kenntnis dieser Sequenz kein Problem die geeigneten Sonden zum Nachweis der IRS- 1 mRNA auszuwählen und zu konstruieren. Dafür kommt die dem Fachmann bekannte in-situ Hybrisidierung, Northern Blot oder Dot Blot in Frage.The detection methods which can be used for the diagnostic method according to the invention are known to the person skilled in the art and comprise immunohistochemical detection methods (for example the APAAP method) or the detection of IRS-1 by means of suitable nucleic acid probes, since the presence of overexpressed IRS-1 with a greatly increased concentration of the corresponding RNA is correlated. The cDNA coding for IRS-1 was published by Sun et al., Nature 352, pp. 72-77 (1 991) and it is no problem for a person skilled in the art knowing this sequence to select the suitable probes for detecting the IRS-1 mRNA and construct. For this comes the in-situ known to the expert Hybridization, Northern Blot or Dot Blot in question.
Die Nachweisverfahren umfassen die Entnahme einer Gewebeprobe der Leber, die Herstellung von Gewebeschnitten, die Inkubation der Gewebeschnitte mit einem für IRS-1 spezifischen Reagenz und die Sichtbarmachung der erhaltenen spezifischen Komplexe in den Gewebeschnitten.The detection methods include taking a tissue sample from the liver, producing tissue sections, incubating the tissue sections with a reagent specific for IRS-1 and visualizing the specific complexes obtained in the tissue sections.
Die Entnahme der Gewebeprobe der Leber kann durch verschiedene, dem Fachmann bekannte Verfahren erfolgen, beispielsweise mittels Feinnadelbiopsie oder laparoskopischer Biopsie. Für die anschließende Behandlung mit dem für IRS-1 spezifischen Reagenz werden Gewebeschnitte nach üblichen Verfahren hergestellt, beispielsweise mittels Gefrierschnitt. Im Anschluß daran werden die präparierten Gewebeschnitte mit dem für IRS-1 spezifischen Reagenz behandelt.The tissue sample of the liver can be removed by various methods known to the person skilled in the art, for example by means of fine needle biopsy or laparoscopic biopsy. For the subsequent treatment with the reagent specific for IRS-1, tissue sections are produced by customary methods, for example by means of a frozen section. The prepared tissue sections are then treated with the reagent specific for IRS-1.
Zu geeigneten Reagenzien für das erfindungsgemäße Verfahren zählen IRS-1 spezifische Antikörper sowie mit IRS-1 mRNA hybridisierende Nukleinsäure- Sonden (DNA oder RNA)Suitable reagents for the method according to the invention include IRS-1 specific antibodies and nucleic acid probes (DNA or RNA) hybridizing with IRS-1 mRNA.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Gewebeprobe mit einem polyklonalen Antikörper, einem monoklonalen Antikörper oder einem Fragment davon, die IRS-1 erkennen können, als Reagenz in Berührung gebracht und so dann bestimmt, ob der Antikörper oder das Fragment davon an die Gewebeprobe gebunden ist.In a preferred embodiment of the method according to the invention, the tissue sample is brought into contact with a polyclonal antibody, a monoclonal antibody or a fragment thereof, which can recognize IRS-1, as a reagent and so it is then determined whether the antibody or the fragment thereof is attached to the tissue sample is bound.
Verfahren zur Gewinnung solcher Antikörper sind dem Fachmann bekannt und umfassen beispielsweise bezüglich der polyklonalen Antikörper die Verwendung von IRS-1 -Präparaten zur Immunisierung geeigneter Tiere und die Gewinnung von Serum. Ein geeigneter polyklonaler Antikörper ist beispielsweise ein gegen IRS- 1 gerichteter Antikörper wie er von der Firma Upstate Biotechnology Inc., Lake Placid, NY, USA erhältlich ist.Methods for obtaining such antibodies are known to the person skilled in the art and include, for example with respect to the polyclonal antibodies, the use of IRS-1 preparations for the immunization of suitable animals and the production of serum. A suitable polyclonal antibody is, for example, an antibody directed against IRS-1, as is available from Upstate Biotechnology Inc., Lake Placid, NY, USA.
Bevorzugt wird in dem erfindungsgemäßen Verfahren ein monoklonaler Antikör- per oder ein Fragment davon eingesetzt. Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper sind dem Fachmann ebenfalls bekannt. Dazu werden beispielsweise Zeil-Hybride aus Antikörper produzierenden Zellen und Knochenmark-Tumorzellen hergestellt und kloniert. Anschließend wird ein Klon selektioniert, der einen Antikörper produziert, der für IRS-1 spezifisch ist. Dieser Antikörper wird dann hergestellt. Beispiele von Zellen, die Antikörper produzieren, sind Milzzellen, Lymphknotenzellen, B-Lymphozyten etc.. Beispiele von Tieren, die zu diesem Zweck immunisiert werden können, sind Mäuse, Ratten, Pferde, Ziegen und Kaninchen. Die Myelomzellen lassen sich aus Mäusen, Ratten, Menschen oder anderen Quellen erhalten. Die Zellfusion kann man beispielsweise durch das allgemein bekannte Verfahren von Köhler und Milstein durchführen. Die durch Zellfusion erhaltenen Hybridome werden mittels IRS-1 nach dem Enzym-Antikörper-Verfahren oder nach einem ähnlichen Verfahren abgesucht. Klone werden beispielsweise mit dem Grenz-Verdünnungsverfahren erhalten. Die erhaltenen Klone werden BALB/c-Mäusen intraperitoneal implantiert, nach 1 0 bis 14 Tagen wird der Ascites der Maus entnommen, und der monoklonale Antikörper durch bekannte Verfahren (beispielsweise Ammoniumsulfatfraktionierung, PEG-Fraktio- nierung, lonenaustauschchromatographie, Gelchromatographie oder Affinitätschromatographie) gereinigt. Der gewonnene Antikörper kann direkt verwendet werden oder es kann ein Fragment davon verwendet werden. In diesem Zusammenhang bedeutet der Begriff "Fragment" alle Teile des monoklonalen Antikörpers (z.B. Fab-, Fv- oder "single chain Fv"-Fragmente), welche die gleiche Epitopspezifität wie der vollständige Antikörper aufweisen.A monoclonal antibody is preferably used in the method according to the invention. used or a fragment of it. Methods for producing monoclonal antibodies are also known to the person skilled in the art. For this purpose, for example, Zeil hybrids are produced and cloned from antibody-producing cells and bone marrow tumor cells. A clone is then selected which produces an antibody which is specific for IRS-1. This antibody is then made. Examples of cells that produce antibodies are spleen cells, lymph node cells, B-lymphocytes, etc. Examples of animals that can be immunized for this purpose are mice, rats, horses, goats and rabbits. The myeloma cells can be obtained from mice, rats, humans or other sources. Cell fusion can be carried out, for example, by the well-known Köhler and Milstein method. The hybridomas obtained by cell fusion are screened using IRS-1 according to the enzyme-antibody method or a similar method. For example, clones are obtained using the limit dilution method. The clones obtained are implanted intraperitoneally in BALB / c mice, the ascites are removed from the mouse after 10 to 14 days, and the monoclonal antibody is purified by known methods (for example ammonium sulfate fractionation, PEG fractionation, ion exchange chromatography, gel chromatography or affinity chromatography). The antibody obtained can be used directly or a fragment thereof can be used. In this context, the term “fragment” means all parts of the monoclonal antibody (for example Fab, Fv or “single chain Fv” fragments) which have the same epitope specificity as the complete antibody.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist der genannte monoklonale Antikörper ein aus einem Tier (z.B. Maus) stammender Antikörper, ein humanisierter Antikörper oder ein menschlicher Antikörper oder ein Fragment davon.In a particularly preferred embodiment, the monoclonal antibody mentioned is an antibody derived from an animal (e.g. mouse), a humanized antibody or a human antibody or a fragment thereof.
Nach Behandlung des Gewebeschnitts mit dem Antikörper erfolgt eine Weiterbehandlung zur Sichtbarmachung und Lokalisation der immunhistochemischen Reaktion durch spezielle Reagenzien, die mit bestimmten Enzymen, Fluoreszenzfarbstoffen oder radioaktiven Verbindungen markiert sind. Die Auswertung der spezifisch angefärbten Gewebeschnitte erfolgt bevorzugt visuell mittels mikroskopischer Vergrößerung. Dabei sind GSF durch eine übermäßige Speicherung von Glykogen gekennzeichnet, das am alkoholfixierten Gewebeschnitt durch Behandlung mit dem Perjod-Schiff's Reagenz als rote Granula im Zytoplasma der Leberzellen dargestellt ist. Die MCF zeichnen sich durch eine Mischung von rotgefärbten Glykogenspeicherzellen und glykogenärmeren Zellen aus, die im Extremfall kein Glykogen mehr enthalten und dann durch Gegenfärbung der Schnitte mit basischen Farbstoffen, z.B. Toluidinblau oder Cuprolinblau, die im Zytoplasma vor allem die Ribosomen anfärben, als blaue Zellen in Erscheinung treten.After treatment of the tissue section with the antibody, further treatment is carried out to visualize and localize the immunohistochemical reaction using special reagents which are labeled with certain enzymes, fluorescent dyes or radioactive compounds. The evaluation of the Specifically stained tissue sections are preferably made visually using microscopic magnification. GSF are characterized by an excessive storage of glycogen, which is shown on the alcohol-fixed tissue section by treatment with the Periodod-Schiff's reagent as red granules in the cytoplasm of the liver cells. The MCF are characterized by a mixture of red-stained glycogen storage cells and cells with less glycogen, which in extreme cases no longer contain any glycogen and then by counter-staining of the sections with basic dyes, e.g. toluidine blue or cuprolin blue, which stain the ribosomes in the cytoplasm, as blue cells in Appearance.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird als IRS-1 nachweisendes Reagenz eine mit der IRS-1 mRNA hybridisierende Nukleinsäuren-Sonde eingesetzt. Der Nachweis erfolgt über die dem Fachmann bekannte in-situ Hybrisidie- rung, Northern Blot oder Dot Blot. Diese Verfahren sind dem Fachmann hinrei¬ chend bekannt und es ist ihm auch vertraut aus den Gewebeschnitten mRNA zu gewinnen. In diesem Zusammenhang sei auf Maniatis, Fritsch & Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual ( 1 989); DNA Cloning, Vol. I und II (D.N. Glover eds. , 1 985) und Nucleic Acid Hybridisation (B.D. Harnes & S.J. Higgins eds., 1 984) hingewiesen.In a further preferred embodiment, a nucleic acid probe hybridizing with the IRS-1 mRNA is used as the reagent which detects IRS-1. The detection is carried out via the in-situ hybridization known to the person skilled in the art, Northern blot or dot blot. These methods are professional rea ¬ accordingly known and it is also familiar to win him from the tissue sections mRNA. In this connection, Maniatis, Fritsch & Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1 989); DNA cloning, vol. I and II (DN Glover eds., 1 985) and nucleic acid hybridization (BD Harnes & SJ Higgins eds., 1 984).
Die gebildeten Komplexe zwischen IRS-1 und Reagenz können dadurch sichtbar gemacht werden, daß ein anders markiertes Reagenz oder andere Substrate verwendet werden. Beispiele für geeignete Markierungen sind Enzyme (Per- oxidase, Galaktosidase), fluoreszierende (Fluoreszeinisothiocyanat, Rhodamin- isothiocyanat) oder radioaktive Verbindungen. Neben farbigen Substraten (Bro- mo-Chloro-lndolylphosphat/Nitroblau-Tetrazolium,Diaminobenzidin,Aminoethyl- carbazol) können alternativ auch lumineszierende Verbindungen (Dioxetane) angewendet werden.The complexes formed between IRS-1 and reagent can be made visible by using a differently labeled reagent or other substrates. Examples of suitable labels are enzymes (peroxidase, galactosidase), fluorescent (fluorescein isothiocyanate, rhodamine isothiocyanate) or radioactive compounds. In addition to colored substrates (bromo-chloro-indolyl phosphate / nitro-blue tetrazolium, diaminobenzidine, aminoethyl carbazole), luminescent compounds (dioxetanes) can alternatively also be used.
Ferner betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung des Verfahrens zur Bestimmung von Substanzen, die Leber- und/oder Nierenkrebs induzieren kön- nen, wobei man sich die oben beschriebenen Beobachtungen zunutze macht, d.h. die zu untersuchende Substanz wird einem Tier appliziert, nach einem geeigneten Zeitraum wird eine Gewebeprobe entnommen, diese mit einem für das Insulin-Rezeptor-Substrat (IRS- 1 ) spezifischen Reagenz in Berührung gebracht und die mögliche Gegenwart von IRS-1 in glykogenotischen Foci (GSF) und/oder gemischtzelligen Foci (MCF) anhand der spezifischen Bindung an das Reagenz nachgewiesen. Das Vorhandensein von IRS-1 in GSF und/oder MCF läßt dann darauf schließen, daß die verabreichte Substanz hepato- bzw. nephro- karzinogen wirkt.The present invention further relates to the use of the method for determining substances which can induce liver and / or kidney cancer. NEN, taking advantage of the observations described above, ie the substance to be examined is applied to an animal, after a suitable period of time a tissue sample is taken, which is in contact with a reagent specific for the insulin receptor substrate (IRS-1) brought and the possible presence of IRS-1 in glycogenotic foci (GSF) and / or mixed cell foci (MCF) detected based on the specific binding to the reagent. The presence of IRS-1 in GSF and / or MCF then suggests that the substance administered is hepatocarcinogenic or nephrocarcinogenic.
Dabei wird die zu untersuchende Substanz dem Tier, beispielsweise einer Maus, einem Kaninchen oder einer Ratte, in geeigneter Weise und in geeigneten Konzentrationen appliziert. Bevorzugt wird eine Dosis von 10% der Dosis bei der nach einmaliger Gabe 50% der Versuchstiere sterben (LD 50) appliziert, eventuell nach Sensibilisierung der Leber durch einmalige Gabe eines bekannten Karzino- gens (z. B. Diethylnitrosamin) . Nach einem Zeitraum von ca. 4 Wochen bis 4 Monaten werden Feinnadelbiopsien durchgeführt bzw. den getöteten Tieren Gewebeproben entnommen und die Gewebeschnitte hinsichtlich der Expression von IRS-1 in GSF und MCF untersucht. Dadurch sollte es im Vergleich zu den bisher gebräuchlichen Testverfahren (Langzeitversuch über 2-3 Jahre mit Tumornachweis als Endpunkt) möglich sein, die Anzahl an Versuchstieren zu reduzieren und den Zeitraum zwischen Applikation des potentiellen Karzinogens und Untersuchung der Versuchstiere zu verkürzen, da nicht bis zur Entstehung eines HCC oder NCC gewartet werden muß.The substance to be examined is applied to the animal, for example a mouse, a rabbit or a rat, in a suitable manner and in suitable concentrations. A dose of 10% of the dose at which 50% of the test animals die after a single administration (L D 50) is preferred, possibly after sensitization of the liver by one administration of a known carcinogen (eg diethylnitrosamine). After a period of about 4 weeks to 4 months, fine needle biopsies are carried out or tissue samples are taken from the killed animals and the tissue sections are examined for the expression of IRS-1 in GSF and MCF. This should make it possible to reduce the number of test animals and to shorten the time between application of the potential carcinogen and examination of the test animals, compared to the test methods previously used (long-term test over 2-3 years with tumor detection as the end point), since not until HCC or NCC must be maintained.
Von den Erfindern wurde überraschenderweise herausgefunden, daß auch in der Niere lange Zeit vor Ausbildung von Nierenzellkarzinomen glykogenotische Herde auftreten. Sie lassen sich im Prinzip wie die präneoplastischen Herde der Leber erfassen. Der Nachweis einer IRS-1 Überexpression kann damit auch zur Früh¬ erkennung der Nierenkrebsentstehung eingesetzt werden. Dies gilt für Labortiere ebenso wie für den Menschen. Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem ein Kit zur Durchführung der oben diskutierten Verfahren, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es ein für IRS-1 spezifisches Reagenz, wie vorstehend definiert, enthält. In einer bevorzugten Ausführungsform enthält das Kit ebenfalls IRS-1 , beispielsweise zur Durchführung einer Kontrollreaktion. Das Kit enthält außerdem noch weitere Reagenzien, die üblicherweise in immunhistochemischen Verfahren verwendet werden, wie Puffer, Träger, Marker usw.The inventors surprisingly found that glycogenotic foci also appeared in the kidney long before kidney cell carcinomas developed. In principle, they can be recorded like the preneoplastic foci of the liver. The detection of an IRS-1 overexpression may thus also for early detection of the renal cancer ¬ be used. This applies to laboratory animals as well as to humans. The present invention also relates to a kit for carrying out the methods discussed above, which is characterized in that it contains a reagent specific for IRS-1 as defined above. In a preferred embodiment, the kit also contains IRS-1, for example for carrying out a control reaction. The kit also contains other reagents commonly used in immunohistochemical procedures, such as buffers, carriers, markers, etc.
Es kann davon ausgegangen werden, daß die Überexpression des IRS-1 nicht nur eine Begleiterscheinung bei der Entstehung des Leberkrebses ist, sondern auch damit ursächlich in Zusammenhang steht. Somit würde es die Repression der Überexpression an IRS-1 oder die Reduzierung der Menge an überexprimier- tem IRS-1 bzw. dessen Inaktivierung erlauben, bereits in einem sehr frühen Stadium der Krebsentstehung therapeutische Maßnahmen zu ergreifen.It can be assumed that the overexpression of the IRS-1 is not only a side effect in the development of liver cancer, but is also causally related. The repression of overexpression on IRS-1 or the reduction in the amount of overexpressed IRS-1 or its inactivation would therefore allow therapeutic measures to be taken at a very early stage of cancer development.
Die Erfindung wird weiter anhand der Figuren beschreiben, welche zeigen:The invention is further described on the basis of the figures, which show:
Fig.1 : Westernblot-Analvse von Lebergewebe zum Nachweis von IRS-1 Spuren A - D, Westernblot-Analyse zum Nachweis des 1 65 kD IRS-1 in Homo- genaten von unbehandeltem (Spur B) und mit N-Nitrosomorpholin behandeltem (Spuren C + D) Rattenlebergewebe. Aliquots ( 1 0 μg) von zellulärem Gesamtprotein wurden einer SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen unterworfen und mit polyklonalem anti-IRS-1 -Antikörper (Fa. Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY, USA) inkubiert. Der gebundene Antikörper wurde mit Ziegen-anti- Kaninchen-IgG, welches mit alkalischer Phosphatase markiert war, nachgewiesen; Spur A, 3T3-Zellen (positive Kontrolle); Spur B, unbehandelte Rattenleber; Spur C, präneoplastische Rattenleber; Spur D, hepatozelluläres Karzinom; links, MolekulargewichtsmarkerFig. 1: Western blot analysis of liver tissue for the detection of IRS-1 lanes A - D, Western blot analysis for the detection of the 1 65 kD IRS-1 in homogenates of untreated (lane B) and treated with N-nitrosomorpholine (lanes C + D) rat liver tissue. Aliquots (10 μg) of total cellular protein were subjected to SDS-PAGE under reducing conditions and incubated with polyclonal anti-IRS-1 antibody (Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY, USA). The bound antibody was detected with goat anti-rabbit IgG labeled with alkaline phosphatase; Lane A, 3T3 cells (positive control); Lane B, untreated rat liver; Lane C, preneoplastic rat liver; Lane D, hepatocellular carcinoma; left, molecular weight marker
Fiq.2: Immunhistochemische Analyse von Gewebeschnitten bezüglich derFiq.2: Immunohistochemical analysis of tissue sections with respect to the
Korrelation des Glykogengehalts und der IRS-1 -ExpressionCorrelation of glycogen content and IRS-1 expression
Die Korrelation von Glykogengehalt (bestimmt durch die PAS-Reaktion, A,E,G- ,I, K) und der Expression von IRS- 1 (nachgewiesen in situ mit polyclonalem anti- IRS1 -Antikörper (Kaninchen), B,F,H,J,L) wurden untersucht. Die Spezifität der Immunreaktion (APAAP-Verfahren) wurde durch Substitution (C) und Kontrolle der Flüssigkeitsadsorption (D) in seriellen Gefrierschnitten von präneoplastischen (A-H) und neoplastischen (l-L) hepatozellulären Läsionen, die in Ratten mit N- Nitrosomorpholin induziert wurden, bestätigt. A, präneoplastische Glykogenoti- sche Foci [ ▼], die eine deutliche positive Immunreaktion für IRS-1 zeigen, während in dem umgebenden Gewebe die Reaktion negativ ist (B, mit Cuprolin-Blau gegengefärbt), bei Substitution (C) und bei den Kontrollen der Flüssigkeitsadsorption, (D); E, gemischte Zell-Foci [▼ ], die sich aus glykogenotischen und glykogenarmen Zellen zusammensetzen, die eine Immunreaktion für IRS-1 zeigen (F); G, glykogenarme, basophile Zell-Foci [★] innerhalb eines glykogenotischen Focus [ ▼], die mit einer positiven Immunreaktion für IRS-1 in glykogenotischen [ ▼], jedoch einer negativen Reaktion in einer glykogenarmen [★] Zellpopulation assoziiert sind; I, Teil eines glykogenarmen, basophilen hepatozellulären Karzinoms in Nachbarschaft zu MCF [▼ ], assoziiert mit einer negativen Immunreaktion für IRS-1 (J), allerdings jedoch einer schwachen Immunreaktion in der präneoplastischen Zellpopulation [▼]; K, Teil eines hepatozellulären Karzinoms, das relativ große Mengen an Glykogen enthält und das einige deutliche glykoge- notische (klare) Zellen einschließt [▼], wobei sich eine Immunreaktion für IRS-1 zeigt, vor allem in glykogenotischen Zellen [▼].The correlation of glycogen content (determined by the PAS reaction, A, E, G- , I, K) and the expression of IRS-1 (detected in situ with polyclonal anti-IRS1 antibody (rabbit), B, F, H, J, L) were examined. The specificity of the immune response (APAAP method) was confirmed by substitution (C) and control of fluid adsorption (D) in serial frozen sections of preneoplastic (AH) and neoplastic (IL) hepatocellular lesions induced in rats with N-nitrosomorpholine. A, preneoplastic glycogenotic foci [▼], which show a clearly positive immune response for IRS-1, while the reaction in the surrounding tissue is negative (B, counterstained with cuprolin blue), with substitution (C) and with the controls liquid adsorption, (D); E, mixed cell foci [▼], which are composed of glycogenotic and low-glycogen cells that show an immune response for IRS-1 (F); G, low-glycogen, basophilic cell foci [★] within a glycogenotic focus [▼] associated with a positive immune response for IRS-1 in glycogenotic [▼] but a negative response in a low-glycogen [★] cell population; I, part of a low-glycogen, basophilic hepatocellular carcinoma in the vicinity of MCF [▼], associated with a negative immune response for IRS-1 (J), but with a weak immune response in the preneoplastic cell population [▼]; K, part of a hepatocellular carcinoma that contains relatively large amounts of glycogen and that includes some distinct glycogenetic (clear) cells [▼], showing an immune response for IRS-1, especially in glycogenotic cells [▼].
Vergrößerung bei Fig.1 und 2: 64x; Der Balken entspricht 100 μm; hv, kleineMagnification in Fig. 1 and 2: 64x; The bar corresponds to 100 μm; hv, little one
LeberveneHepatic vein
PAS, Periodsäure-Schiff ' sehe Reaktion; APAAP, Alkalische Phosphatase-anti-PAS, periodic acid ship see reaction; APAAP, alkaline phosphatase anti
Alkalische PhosphataseAlkaline phosphatase
Die nachstehenden Beispiele erläutern die ErfindungThe following examples illustrate the invention
Beispiel 1 : Allgemeine Verfahren Verwendete Tiere und Probeentnahme: Präneoplastsiche hepatozelluläre Läsionen wurden in erwachsenen männlichen Sprague-Dawley-Ratten durch eine begrenzte Exposition gegenüber oral verabreichtem NNM (Stop-Modell; 1 2 mg NNM pro kg Körpergewicht) über einen Zeitraum von 7 Wochen induziert. Das Gewebe von NNM-behandelten bzw. unbehandelten Ratten wurde 1 5 und 20 Wochen nach Absetzen von NNM entnommen. HCC wurden durch orale Verabreichung derselben Dosis an NNM über einen Zeitraum von 1 0 Wochen oder einer geringeren Dosis ( 1 mg/kg Körpergewicht pro Tag) über einen Zeitraum von bis zu 73 Wochen erzeugt. Lebergewebe wurde bei -1 50°C schockgefroren und bei -80°C aufbewahrt. Serielle Gefrierschnitte (6 μm) wurden mit Haematox- ylin und Eosin gefärbt oder mit PAS-T (Periodsäure-Schiff ' sehe Reaktion, Gegenfärbung mit Toluidinblau) zum Nachweis von Glykogen behandelt.Example 1: General procedures Animals used and sampling: Preneoplastic hepatocellular lesions were induced in adult male Sprague-Dawley rats by limited exposure to orally administered NNM (stop model; 1 2 mg NNM per kg body weight) over a period of 7 weeks. Tissue from NNM-treated and untreated rats was removed 1 5 and 20 weeks after discontinuation of NNM. HCC was generated by oral administration of the same dose of NNM over a period of 10 weeks or a lower dose (1 mg / kg body weight per day) for up to 73 weeks. Liver tissue was snap frozen at -150 ° C and stored at -80 ° C. Serial frozen sections (6 microns) were stained with Haematox- Ylin and eosin or with SOS-T (periodic acid-Schiff 'see reaction, counterstained with toluidine blue) treated for the detection of glycogen.
Beispiel 2: Westernblot-Analyse von Lebergewebe mittels anti-IRS-1 -AntikörpernExample 2: Western blot analysis of liver tissue using anti-IRS-1 antibodies
Gefriergetrocknetes Lebergewebe wurde in Puffer lysiert, der 0,05 M TBS (Tris- gepufferte Kochsalzlösung), pH-Wert 7,4, 1 50 mM NaCI, 1 % Nonidet P-40, 1 mM PMSF, 1 mM EGTA, 1 μg/ml Aprotinin, 1 μg/ml Leupeptin, 1 μg/ml Pep- statin, 1 mM Na3VO4, 1 mM NaF, 2,5% SDS und 5% 2-Mercaptoäthanol enthielt. Zur Entfernung von Zelltrümmern wurde bei 4°C zweimal jeweils 10 min. bei 1 5000 g zentrifugiert. Danach wurde 5 min. gekocht und eine PAGE unter reduzierenden Bedingungen unter Verwendung von Gradientengelen (4-1 5%) durchgeführt. Die Proteinauftrennung und die Überführung auf eine Nitrozellulose-Membran (Hybond Cc, 0,45 μ, Amersham Int., Little Chaltfont, England) wurden mittels des "PhastSystem" von Pharmacia (Uppsala, Schweden) durchgeführt. Im Anschluß daran wurde die Membran 20 min. mit fettfreier Trockenmilch (3%) in PBS behandelt, 30 min. bei Raumtemperatur und zusätzlich 24 Stunden bei 4 °C mit 3 μg/ml polyclonalem anti-IRS-1 -Kaninchen-Antikörper (Upstate Biotechnology Inc., Lake Placid, NY, USA) inkubiert, worauf die Inkuba¬ tion mit 1 ,2 μg/ml mit alkalischer Phosphatase markiertem Ziegen-anti-Kanin- chen-IgG erfolgte (90 min., RT; Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA, USA) . Nach Behandlung mit 0,05% Twen-20 in PBS ( 1 5 min.) wurden Banden im Gel mit Nitroblau-Tetrazoliumchlorid und 5-Brom-4-Chlor-3- Indolylphosphat (Bachern Biochemica, Heidelberg, Deutschland) sichtbargemacht. Für Positivkontrollen wurde ein 3T3-Zellysat (Upstate Biotechnology Inc., Lake Placid, NY, USA) verwendet (Fig.1 , Spur A).Freeze-dried liver tissue was lysed in buffer containing 0.05 M TBS (Tris-buffered saline), pH 7.4, 1 50 mM NaCl, 1% Nonidet P-40, 1 mM PMSF, 1 mM EGTA, 1 μg / ml aprotinin, 1 μg / ml leupeptin, 1 μg / ml pepstatin, 1 mM Na 3 VO 4 , 1 mM NaF, 2.5% SDS and 5% 2-mercaptoethanol. To remove cell debris at 4 ° C twice 10 min. centrifuged at 1 5000 g. Then 5 min. cooked and PAGE under reducing conditions using gradient gels (4-1 5%). Protein separation and transfer to a nitrocellulose membrane (Hybond C c , 0.45 μ, Amersham Int., Little Chaltfont, England) were carried out using the "PhastSystem" from Pharmacia (Uppsala, Sweden). The membrane was then 20 min. treated with fat-free dry milk (3%) in PBS, 30 min. at room temperature and an additional 24 hours at 4 ° C with 3 ug / ml polyclonal anti-IRS-1 rabbits antibody (Upstate Biotechnology Inc., Lake Placid, NY, USA) and incubated, after which the Inkuba ¬ tion with 1, 2 ug / ml goat anti-rabbit IgG labeled with alkaline phosphatase (90 min., RT; Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA, USA). After treatment with 0.05% Twen-20 in PBS (1 5 min.) bands in the gel were made visible with nitro blue tetrazolium chloride and 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (Bachern Biochemica, Heidelberg, Germany). A 3T3 cell lysate (Upstate Biotechnology Inc., Lake Placid, NY, USA) was used for positive controls (FIG. 1, lane A).
Die Ergebnisse sind in Figur 1 dargestellt. Es zeigte sich, daß der verwendete Antikörper spezifisch an ein Protein mit etwa 1 65 kD gebunden war (Fig.1 , Spuren A-D) . Dieses Molekulargewicht ist im Bereich von 1 65- 1 80 kD, der dem Molekulargewicht von IRS-1 entspricht, das von verschiedenen Gruppen für IRS- 1 aus verschiedenen Geweben bestimmt wurde. IRS- 1 konnte deutlich sowohl in unbehandelten (Spur B), als auch in mit NNM behandelten Rattenlebern nachgewiesen werden (Spuren C und D) . In der präneoplastischen Leber (Spur C), die viele FAH enthielt, die weniger als 5% der Parenchym-Fraktion besiedelten oder im HCC (Spur D) war eine Tendenz zu einer erhöhten Menge an IRS-1 im Vergleich zu der unbehandelten Kontrolle zu beobachten.The results are shown in Figure 1. It was found that the antibody used was specifically bound to a protein with approximately 165 kD (FIG. 1, lanes A-D). This molecular weight is in the range of 65-180 kD, which corresponds to the molecular weight of IRS-1 determined by different groups for IRS-1 from different tissues. IRS-1 was clearly detectable both in untreated (lane B) and in rat liver treated with NNM (lanes C and D). In the preneoplastic liver (lane C), which contained many FAHs that colonized less than 5% of the parenchymal fraction, or in the HCC (lane D), a tendency towards an increased amount of IRS-1 was observed compared to the untreated control .
Beispiel 3: Immunhistochemischer Nachweis von IRS-1 in LebergewebeExample 3: Immunohistochemical detection of IRS-1 in liver tissue
Gefrierschnitte (6 μm) wurden auf mit Poly-L-Lysin beschichteten Objektträgern (Sigma Diagnostics, St. Louis, MO, USA) befestigt, in 100% Methanol (1 5 min., -20 °C) fixiert, mit Ziegenserum, 1 :30 in TBS, abgeblockt und zuerst 30 min. bei RT, dann zusätzlich 24 Stunden bei 4 °C mit 10 μg/ml anti-IRS-1 -Antikörper inkubiert. Nach jedem der nachstehen beschriebenen Schritte wurden die Gefrierschnitte mit 0,05 M Tris-Puffer (pH-Wert 7,4) zweimal jeweils 3 min. gespült. Anschließend wurden 1 8 μg/ml Ziegen-anti-Kaninchen-IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA, USA) und danach ein 1 : 10 verdünnter Kaninchen-APAAP-Komplex (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) in zwei Zyklen dazugegeben. Nach Waschen mit destilliertem Wasser über einen Zeitraum von 5 min. wurden die Gefrierschnitte mit Neufuchsin gefärbt. Das Abblocken der endogenen alkalischen Phosphatase erfolgte durch Zugabe von 1 ,73 mM Levamisol (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) . Einige der Gefrierschnitte wurden mit 1 % Cuprolin-Blau (BDH Chemicals Ltd., Poole, England) gegengefärbt. Schließlich wurden die Gefrierschnitte mit Glycerin- Gelatine bedeckt. Zum Nachweis der Spezifität der Immunfärbung wurde der primäre Antikörper in seriellen Gefrierschnitten gegen Affinitäts-gereinigtes IgG ( 1 0 μg/ml) (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA, USA) ausgetauscht. Zusätzlich zu dieser Substitutionskontrolle wurde in den Gefrierschnitten eine Flüssigkeitsadsorptionskontrolle nach Vorinkubation des anti-IRS- 1 -Antikörpers mit dem enstprechenden immunisierenden Peptid (Ratten-IRS-1 - Peptid, Upstate Biotechnology Inc., Lake Placid, NY, USA) über einen Zeitraum von 3 Stunden bei RT und bei einem Mengenverhältnis von 1 : 10 g/g durchgeführt. Beide Kontrollen erwiesen sich als negativ.Frozen sections (6 μm) were attached to slides coated with poly-L-lysine (Sigma Diagnostics, St. Louis, MO, USA), fixed in 100% methanol (15 min., -20 ° C.), with goat serum, 1 : 30 in TBS, blocked and first 30 min. at RT, then additionally incubated for 24 hours at 4 ° C. with 10 μg / ml anti-IRS-1 antibody. After each of the steps described below, the frozen sections were run with 0.05 M Tris buffer (pH 7.4) twice for 3 min each. rinsed. Subsequently, 18 μg / ml goat anti-rabbit IgG (Jackson Immuno Research Laboratories, Inc., West Grove, PA, USA) and then a 1:10 diluted rabbit APAAP complex (Sigma Chemical Co., St. Louis , MO, USA) added in two cycles. After washing with distilled water for 5 minutes. the frozen sections were stained with Neufuchsin. The endogenous alkaline phosphatase was blocked by adding 1.73 mM levamisole (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA). Some of the frozen sections were coated with 1% Cuprolin blue (BDH Chemicals Ltd., Poole, England) counterstained. Finally, the frozen sections were covered with glycerine gelatin. To demonstrate the specificity of the immunostaining, the primary antibody was replaced in serial frozen sections with affinity-purified IgG (10 μg / ml) (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA, USA). In addition to this substitution control, a liquid adsorption control was performed in the frozen sections after preincubation of the anti-IRS-1 antibody with the corresponding immunizing peptide (rat IRS-1 peptide, Upstate Biotechnology Inc., Lake Placid, NY, USA) for a period of 3 hours at RT and in a ratio of 1:10 g / g. Both controls turned out to be negative.
Die Ergebnisse der immunhistochemischen Untersuchungen sind in Figur 2 dargestellt. Wie in (A) zu sehen ist, kann IRS-1 in normalem Leberparenchym immunhistochemisch nicht nachgewiesen werden. Dieses Ergebnis läßt sich dadurch erklären, daß in normalen Hepatozyten nur eine sehr geringe Menge an IRS-1 enthalten ist. Im Gegensatz dazu zeigt jedoch die Mehrzahl der präneoplastischen FAH eine mehr oder weniger starke Immunreaktion bezüglich IRS-1 . Die Immunreaktion ist auf das Zytoplasma beschränkt, wobei sich gelegentlich eine auffallende perinucleäre Lokalisation zeigt. Insgesamt wurden über 400 FAH untersucht und entsprechend den veröffentlichten Kriterien in die Klassen GSF, MCF und BCF eingeteilt. Die IRS-1 -Expression war besonders deutlich in den früh auftretenden GSF (Fig.2A + B) . Von den 93 untersuchten GSF waren 96% positiv bezüglich IRS-1 . In den sich etwas später entwickelnden MCF war IRS-1 immunhistochemisch ebenfalls eindeutig nachweisbar (Fig.2E + F) . 97% der beobachteten MCF waren ebenfalls positiv, allerdings war die Expression von IRS-1 nicht ganz so stark im Vergleich zu den GSF. Die Stärke der Immunreak¬ tion bezüglich IRS-1 war eng mit der Anzahl der Glykogen-speichernden Zellen innerhalb der FAH korreliert. Die Immunreaktion nahm mit dem zunehmenden Ersatz der glykogenotischen durch Glykogen-arme basophile Zellen ab, was ein Anzeichen dafür ist, daß eine grundsätzliche Verschiebung des Metabolismus beim Übergang von frühen zu späten FAH stattfindet. Dies ist in Übereinstim¬ mung mit früheren Beobachtungen. FAH, die ausschließlich aus basophilen Zellen bestanden, werden kaum beobachtet, jedoch waren von den 6 aufgefundenen BCF alle negativ bezüglich IRS-1 (Fig.2G + H) . Dies trifft ebenfalls auf die Mehrheit der 1 2 untersuchten HCC zu, in denen Glykogen-arme basophile Zellen vorherrschten (Fig.2l + J) . Lediglich in 3 HCC konnte eine schwache Anfärbung für IRS-1 beobachtet werden, die Immunreaktion war jedoch auf hochdifferenzierte Zell-Subpopulationen beschränkt, die immer noch etwas Glykogen enthielten (Fig.2K + L) .The results of the immunohistochemical tests are shown in FIG. 2. As can be seen in (A), IRS-1 cannot be detected immunohistochemically in normal liver parenchyma. This result can be explained by the fact that only a very small amount of IRS-1 is contained in normal hepatocytes. In contrast, however, the majority of preneoplastic FAH show a more or less strong immune response to IRS-1. The immune response is limited to the cytoplasm, with a striking perinuclear localization occasionally showing. A total of more than 400 FAH were examined and classified into the classes GSF, MCF and BCF according to the published criteria. The IRS-1 expression was particularly evident in the early GSF (Fig. 2A + B). Of the 93 GSFs examined, 96% were positive for IRS-1. In the MCF that developed somewhat later, IRS-1 was also clearly detectable by immunohistochemistry (Fig. 2E + F). 97% of the observed MCF were also positive, however the expression of IRS-1 was not quite as strong compared to the GSF. The strength of the Immunreak ¬ tion with respect to IRS-1 was closely correlated with the number of glycogen storage cells within the FAH. The immune response decreased with the increasing replacement of glycogenotic by low-glycogen basophilic cells, which is an indication that there is a fundamental shift in metabolism during the transition from early to late FAH. This is ¬, in conformity with previous observations. FAH made exclusively from basophils Cells passed are hardly observed, but all of the 6 BCFs found were all negative for IRS-1 (Fig. 2G + H). This also applies to the majority of the 1 2 examined HCC, in which low-glycogen basophilic cells predominated (Fig. 21 + J). A weak staining for IRS-1 was only observed in 3 HCC, but the immune response was limited to highly differentiated cell subpopulations that still contained some glycogen (Fig. 2K + L).
Diese Ergebnisse zeigen, daß die Überexpression von IRS-1 ein frühes Ereignis bei der Karzinogenese der Leber darstellt, das mit der Akkumulation von Glykogen in GSF und MCF eng korreliert ist. Diese Korrelation betrifft nicht nur die gesteigerte Expression von IRS-1 in glykogenotischen Zellen des Typs GSF und MCF, sondern auch die praktisch zeitgleich damit einhergehende Reduktion sowohl der IRS-1 -Überexpression und der Glykogenakkumulation während des Auftretens von entdifferenzierten basophilen Zellen in MCF, BCF und hepatozellulären Neoplasmen. Es kann ausgeschlossen werden, daß der starke Zusammenhang zwischen IRS-1 -Expression und der Glykogenakkumulation durch eine unspezifische Bindung des Antikörpers an das Glykogenmolekül bedingt ist, und zwar anhand der nachstehenden Beobachtungen. Obwohl beträchtliche Mengen an Glykogen auch in den extrafocalen Hepatozyten von NNM-behandelten Tieren (Fig.2A) und im Parenchym von unbehandelten Kontrolltieren gespeichert wurden, war die Immunraktion für IRS-1 in diesen Bereichen des Parenchyms grundsätzlich negativ (Fig.2B) . Darüber hinaus wurde Glykogen während der einzelnen Schritte der immunhistochemischen Verarbeitung ausgewaschen, vor allem während der hohen Anzahl an Waschschritten. Dies konnte dadurch verifiziert werden, daß in denselben Gefrierschnitten sowohl eine Immunreaktion als auch die PAS-Reaktion durchgeführt wurden. Bei der Durchführung der PAS- Reaktion nach der Immunreaktion enthielten die Schnitte einschließlich der IRS- 1 -positiven Foci kein Glykogen mehr. Diese Ergebnisse zeigen, daß der Phänotyp der frühen Phase der Entstehung des Leberkrebses, d.h. die praneoplastische Glykogenose in der Leber, durch eine Überexpression von IRS-1 bedingt ist. These results show that overexpression of IRS-1 is an early event in carcinogenesis of the liver that is closely correlated with the accumulation of glycogen in GSF and MCF. This correlation concerns not only the increased expression of IRS-1 in glycogenotic cells of the type GSF and MCF, but also the practically simultaneous reduction of both IRS-1 overexpression and glycogen accumulation during the occurrence of undifferentiated basophilic cells in MCF, BCF and hepatocellular neoplasms. It can be excluded that the strong connection between IRS-1 expression and glycogen accumulation is due to non-specific binding of the antibody to the glycogen molecule, based on the following observations. Although considerable amounts of glycogen were also stored in the extrafocal hepatocytes from NNM-treated animals (FIG. 2A) and in the parenchyma of untreated control animals, the immune response for IRS-1 in these areas of the parenchyma was fundamentally negative (FIG. 2A). In addition, glycogen was washed out during the individual steps of immunohistochemical processing, especially during the high number of washing steps. This could be verified by carrying out both an immune reaction and the PAS reaction in the same frozen sections. When the PAS reaction was carried out after the immune reaction, the sections, including the IRS-1 positive foci, no longer contained any glycogen. These results show that the phenotype of the early stage of liver cancer development, i.e. praneoplastic liver glycogenosis caused by overexpression of IRS-1.

Claims

Patentansprüche claims
1 ) Verfahren zur Diagnose von frühen Krebsvorstufen in Leber und/oder Niere, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Leber- oder Nierengewebe- probe bzw. daraus gewonnene Nukleinsäuren mit einem für das Insulin- Rezeptor-Substrat (IRS- 1 ) spezifischen Reagenz in Berührung bringt und die Gegenwart von IRS-1 in glykogenotischen Foci (GSF) und/oder gemischtzelligen Foci (MCF) nachweist.1) Method for diagnosing early cancer precursors in the liver and / or kidney, characterized in that a liver or kidney tissue sample or nucleic acids obtained therefrom are contacted with a reagent specific for the insulin receptor substrate (IRS-1) brings and detects the presence of IRS-1 in glycogenotic foci (GSF) and / or mixed cell foci (MCF).
2) Verfahren nach Anspruch 1 , wobei das IRS-1 spezifische Reagenz zum Nachweis von IRS-1 in einer Gewebeprobe ein Antikörper oder Fragment davon ist und man die Gewebeprobe mit dem Antikörper oder einem Fragment davon in Berührung bringt und sodann bestimmt, ob der Antikörper oder das Fragment davon an die Gewebeprobe gebunden ist.2) The method according to claim 1, wherein the IRS-1 specific reagent for the detection of IRS-1 in a tissue sample is an antibody or fragment thereof and the tissue sample is brought into contact with the antibody or a fragment thereof and then it is determined whether the antibody or the fragment thereof is bound to the tissue sample.
3) Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Antikörper ein monoklonaler Antikörper oder ein Fragment davon ist.3) The method of claim 1 or 2, wherein the antibody is a monoclonal antibody or a fragment thereof.
4) Verfahren nach Anspruch 3, wobei der Antikörper ein Mausantikörper, ein humanisierter Antikörper oder ein menschlicher Antikörper ist, oder ein Fragment davon.4) The method of claim 3, wherein the antibody is a mouse antibody, a humanized antibody or a human antibody, or a fragment thereof.
5) Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Reagenz mit Enzymen, fluoreszierenden Verbindungen, lumineszierenden Verbindungen, ferromagnetischen Sonden oder radioaktiven Verbindungen markiert ist.5) Method according to one of claims 1 to 4, wherein the reagent is labeled with enzymes, fluorescent compounds, luminescent compounds, ferromagnetic probes or radioactive compounds.
6) Verfahren nach Anspruch 1 , wobei das Reagenz zum Nachweis von IRS-1 eine mit einer für IRS-1 codierenden Nukleinsäure hybridisierende Nu- kleinsäure ist.6) Method according to claim 1, wherein the reagent for the detection of IRS-1 is a nucleic acid hybridizing with a nucleic acid coding for IRS-1.
7) Kit zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß es ein wie in einem der Ansprüche 1 bis 6 definiertes Reagenz enthält und andere Puffer, Lösungen, Vorrichtungen oder Träger, die üblicherweise in immunologischen oder molekularbiologischen Nachweisverfahren verwendet werden.7) kit for performing the method according to one of claims 1 to 6, characterized in that it contains a reagent as defined in one of claims 1 to 6 and other buffers, solutions, devices or carriers which are usually used in immunological or molecular biological detection methods.
8) Verfahren zur Bestimmung von hepato- oder nephrokarzinogenen Substanzen, dadurch gekennzeichnet, daß man die zu untersuchende Substanz einem Tier appliziert, nach einem geeigneten Zeitraum eine Gewebeprobe entnimmt, diese bzw. daraus gewonnene Nukleinsäuren mit einem für das Insulin-Rezeptor-Substrat (IRS- 1 ) spezifischen Reagenz in Berührung bringt und die mögliche Gegenwart von IRS-1 in glykogenotischen Foci (GSF) und/oder gemischtzelligen Foci (MCF) nachweist.8) Method for the determination of hepatocarcinogenic or nephrocarcinogenic substances, characterized in that the substance to be examined is applied to an animal, a tissue sample is taken after a suitable period of time, this or nucleic acids obtained therefrom with a for the insulin receptor substrate (IRS - 1) brings specific reagent into contact and detects the possible presence of IRS-1 in glycogenotic foci (GSF) and / or mixed cell foci (MCF).
9) Verfahren nach Anspruch 8, wobei das IRS-1 spezifische Reagenz zum Nachweis von IRS-1 in einer Gewebeprobe ein Antikörper oder Fragment davon ist und man die Gewebeprobe mit dem Antikörper oder einem Fragment davon in Berührung bringt und sodann bestimmt, ob der Antikörper oder das Fragment davon an die Gewebeprobe gebunden sind.9) The method according to claim 8, wherein the IRS-1 specific reagent for the detection of IRS-1 in a tissue sample is an antibody or fragment thereof and the tissue sample is brought into contact with the antibody or a fragment thereof and then it is determined whether the antibody or the fragment thereof is bound to the tissue sample.
1 0) Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, wobei der Antikörper ein monoklonaler Antikörper oder ein Fragment davon ist.1 0) Method according to claim 8 or 9, wherein the antibody is a monoclonal antibody or a fragment thereof.
1 1 ) Verfahren nach Anspruch 1 0, wobei der Antikörper ein Mausantikörper, ein humanisierter Antikörper oder ein menschlicher Antikörper ist, oder ein Fragment davon.1 1) The method of claim 1 0, wherein the antibody is a mouse antibody, a humanized antibody or a human antibody, or a fragment thereof.
1 2) Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 1 1 , wobei das Reagenz mit Enzymen, fluoreszierenden Verbindungen, lumineszierenden Verbindungen, ferromagnetischen Sonden oder radioaktiven Verbindungen markiert ist.1 2) Method according to one of claims 8 to 1 1, wherein the reagent is labeled with enzymes, fluorescent compounds, luminescent compounds, ferromagnetic probes or radioactive compounds.
1 3) Verfahren nach Anspruch 8, wobei das Reagenz eine mit einer für IRS-1 codierenden Nukleinsäure hybridisierende Nukleinsäure ist. 1 3) The method of claim 8, wherein the reagent is one with one for IRS-1 coding nucleic acid is hybridizing nucleic acid.
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