DE2463435C2

DE2463435C2 - Device for carrying out a method for the detection of proteins and antibodies

Info

Publication number: DE2463435C2
Application number: DE19742463435
Authority: DE
Inventors: Ivar Schenectady N.Y. Giaever
Original assignee: General Electric Co
Current assignee: General Electric Co
Priority date: 1973-07-30
Filing date: 1974-07-11
Publication date: 1986-12-04
Also published as: SE7409777L; JPS6130215B2; JPS5944583B2; JPS59160763A; NL177939C; SE464784B; DE2433246A1; DE2433246C2; BR7406086D0; NL7410231A; NL177939B; IT1212274B; JPS5076226A; CA1047918A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung zum Bestimmen der Anwesenheit oder Abwesenheit eines spezifischen Proteins in einer biologischen Probe durch einfaches Betrachten, um festzustellen, ob eine oder zwei Proteinschichten auf dem Substrat vorhanden sind, bestehend aus einem Substrat, das mit einem Goldüberzug versehen ist, an dem ein mit dem genannten spezifischen Protein spezifisch reagierendes Protein haftet, nach Patent 23 30 702.The present invention relates to an apparatus for determining the presence or absence of a specific protein in a biological sample by simply looking at it to determine if a or two protein layers are present on the substrate, consisting of a substrate covered with a gold coating is provided on which a protein that specifically reacts with said specific protein adheres, according to patent 23 30 702.

Immunologische Reaktionen sind hochspezifische biochemische Reaktionen, in denen ein als Antigen bezeichnetes erstes Protein sich mk einem zweiten Protein verbindet, das für dieses Antigen spezifisch ist und dessen Antikörper genannt wird, wobei ein immunologisch komplexiertes Protein gebildet wird. Immunologische Reaktionen, die innerhalb eines biologischen Systems, wie einem tierischen Lebewesen, stattfinden, sind von großer Bedeutung für das Tier bei der Bekämpfung von Krankheit. In einem biologischen System veranlaßt der Eintritt eines fremden Proteins, d. h. des Antiges, das biologische System zur Erzeugung der für das entsprechende Antigen spezifischen Antikörper-Proteine in einem Verfahren, das bisher noch nicht vollständig verstanden wird. Die Antikörper-Proteinmoliküle weisen verfügbare chemische Bindestellen auf, die die am Antigenmolekül ergänzen, und so können das Antigen und der Antikörper sich chemisch unter Bildung eines immunologisch komplexierten Proteins verbinden.Immunological reactions are highly specific biochemical reactions in which one is referred to as an antigen first protein combines with a second protein that is specific for this antigen and its Antibody is called, whereby an immunologically complexed protein is formed. Immunological Reactions that take place within a biological system, such as an animal living being, are of of great importance for the animal in the fight against disease. In a biological system, the causes Entry of a foreign protein, d. H. of the antigen, the biological system generating the for the corresponding Antigen specific antibody proteins in a process that is not yet fully understood will. The antibody protein molecules have available chemical binding sites that are those on the antigen molecule complement each other, and so the antigen and antibody can chemically combine to form an immunological one connect complexed protein.

Da Antikörper durch biologische Systeme als Antwort auf das Eindringen von fremden Proteinen erzeugt werden, ist der Nachweis von in einem biologischen System vorhandenen Antikörpern von medizinisch diagnostischem Wert bei der Bestimmung der Antigene, denen das System ausgesetzt wurde. Umgekehrt hat auch der Nachweis bestimmter Antigene in einem biologischen System medizinisch diagnostischen Wert. Beispiele des diagnostischen Nachweises von Antigenen sind der Nachweis von HCG-Proteinmolekülen im Urin zur Feststellung der Schwangerschaft und der Nachweis der mit der Hepatitis verbundenen Antigenmoleküle im Blut von in Aussicht genommenen Blutspendern.Because antibodies are generated by biological systems in response to the invasion of foreign proteins the detection of antibodies present in a biological system is medically diagnostic Value in determining the antigens to which the system has been exposed. The other way around also the detection of certain antigens in a biological system has a medical diagnostic value. Examples The diagnostic detection of antigens is the detection of HCG protein molecules in the urine to determine the pregnancy and the detection of the hepatitis-related antigen molecules in the Blood from prospective donors.

Um solche diagnostischen Untersuchungen durchführen zu können, muß das geeignete Protein mindestens einen immunologisch reagierenden Paares in konzentrierter gereinigter Form erhältlich sein. Die einzige bekannte Quelle für Antikörper-Proteine ist ein lebendes biologisches System. Darüber hinaus ist es bisher nur von Wirbeltieren bekannt, daß sie der Einführung eines Fremdproteins mit immunologischen Reaktionen begegnen. Beispielsweise wurden viele Antikörper im Blutserum von tierischen Lebewesen gefunden, die den entsprechenden Antigenen ausgesetzt worden waren. Das Blutserum ist jedoch eine sehr komplexe Mischung, in der die erforderlichen Antikörper in sehr geringen Konzentrationen bei Anwesenheit einer Vielzahl anderer Bestandteile vorkommen. Viele Antigene können andererseits in kontrollierbarer Weise in Laboratoriumskulturen hergestellt werden. Einige Antigene jedoch, wie z. B. das mit der Hepatitis verbundene Antigen, sind derzeit, wie Antikörper, nur aus höheren Iebenden biologischen Systemen erhältlich.In order to be able to carry out such diagnostic examinations, the appropriate protein must at least be an immunologically reactive couple in a concentrated, purified form. The only known one The source of antibody proteins is a living biological system. In addition, it is only so far known from vertebrates that they encounter the introduction of a foreign protein with immunological reactions. For example, many antibodies have been found in the blood serum of animals that have the corresponding antigens had been exposed. However, the blood serum is a very complex mixture, in which the required antibodies in very low concentrations in the presence of a multitude of others Components occur. Many antigens, on the other hand, can be controlled in laboratory cultures getting produced. However, some antigens, such as B. the antigen associated with hepatitis, are currently, like antibodies, only from higher ages biological systems available.

In der derzeit praktizierten Weise basieren sowohl die Ansammlung als auch die Reinigung und die diagnostische Verwendung immunologisch aktiver Proteine auf den Ausfällungs- oder Agglutinierungseigenschaften, die für die Proteine charakterisch sind, die aus der immunologischen Komplexierungsreaktion herrühren. Das klassische Beispiel dieser diagnostischen Verwendungen ist das Verfahren zur Feststellung der Blutgruppe, bei dem Blutproben mit Serum-Antikörpern vom Typ » und β vermischt werden und man bestimmt die Blutgruppe durch Feststellen irgendwelcher Agglutination in den Blutproben.As currently practiced, both the collection, purification and diagnostic use of immunologically active proteins are based on the precipitation or agglutination properties characteristic of the proteins resulting from the immunological complexation reaction. The classic example of these diagnostic uses is the blood group determination method in which blood samples are mixed with serum antibodies of the » and β type and the blood group is determined by detecting any agglutination in the blood samples.

Die Schwangerschaftsbestimmung über das HCG-Protein, wie sie derzeit durchgeführt wird, ist ein Inhibitions-Test, der ausgeführt wird, indem man eine Menge des HCG-Antiserums in eine Urin-Probe einmischt. Eine Vielzahl von Poylstyrolkügelchen, die mit HCG-Protein beschichtet worden sind, bringt man in eine so vorbereitete Urinprobe ein. Die Polystyrolkugeln agglutinieren, wenn, aber nur wenn in der Probe kein HCG-Protein vorhanden ist. Ist in einer Urinprobe kein HCG-Protein vorhanden, dann bildet das HCG-Protein auf den Polystyrolkugeln mit dem zuvor in die Urinprobe eingebrachten HCG-Antiserum Komplexe und die Kugeln agglutinieren. Wenn andererseits in der Urinprobe HCG-Protein vorhanden ist, dann bildet diese mit dem zuvor eingebrachten HCG-Antiserum einen Komplex, der aus der Probe ausfällt, so daß das vorher eingeführte Serum nicht länger für die Komplexbildung mit dem HCG-Protein auf den Kugeln verfügbar ist und so auch keine Agglutinierung der Kugeln verursachen kann. Gemäß der Lehre der vorliegenden Erfindung kann die bekannte Schwangerschaftbestimmung über das HCG-Protein vereinfacht werden, indem man das HCG-Antiserum auf den Poylstyrolkugeln haften läßt, und eine Urinprobe direkt untersucht. In diesem Falle würden die Polystyrolkugeln agglutinieren, wenn, aber nur wenn in der Probe HCG-Protein vorhanden ist.Determination of pregnancy via the HCG protein, as it is currently done is an inhibition test that is done by standing a crowd of the HCG antiserum mixed into a urine sample. A variety of polystyrene beads made with HCG protein have been coated, are brought into a urine sample prepared in this way. Agglutinate the polystyrene balls, if, but only if no HCG protein is present in the sample. If there is no HCG protein in a urine sample present, then the HCG protein forms on the polystyrene balls with that previously in the urine sample introduced HCG-antiserum complexes and agglutinate the spheres. On the other hand, if in the urine sample HCG protein is present, then this forms a complex with the previously introduced HCG antiserum, which precipitates out of the sample so that the previously introduced serum no longer has to complex with the HCG protein is available on the balls and so cannot cause agglutination of the balls. According to The teaching of the present invention can use the known pregnancy determination via the HCG protein can be simplified by letting the HCG antiserum adhere to the polystyrene spheres, and one Urine sample examined directly. In this case the polystyrene spheres would agglutinate if, but only if in HCG protein is present in the sample.

Es scheint, daß der Grund, weshalb dieses einfache Verfahren bisher nicht angewendet worden ist, der ist, daß die verfügbaren HCG-Antiseren komplexe Mischungen sind, die einen großen Anteil an Bestandteilen anderer Art als HCG-Antikörper enthalten. Die zusätzliche Bemühung, die nach dem bekannten Verfahren erforderlich ist, um die Antikörper aus den HCG-Antiseren zu extrahieren führen dazu, daß die Seren für den Inhibitionstest bisher direkt verwendet worden sind. Jedes Antigenmolekül bildet typischerweise Komplexe mit einer Vielzahl von Antikörpermolckühlen, die mit verschiedenen Teilchen verbunden sein können und bildet dabei sichtbare Klumpen von /.. B. beschichteten Polystyrolkügelchen oder roten IJIut/.ellen. Rine Unzulänglichkeit von Agglutinierungs-Untcrsuehungen istIt appears that the reason why this simple procedure has not been followed is because that the available HCG antisera are complex mixtures that contain a large proportion of ingredients contain antibodies other than HCG. The extra effort made after the known method is required to extract the antibodies from the HCG antisera lead to the fact that the sera for the Inhibition tests have previously been used directly. Each antigen molecule typically forms complexes with a variety of antibody molecules that may be associated with and form different particles visible clumps of / .. B. coated polystyrene beads or red IJIut / .ellen. Rine inadequacy of agglutination investigations

ϊϊ 33 44th

die, daß die beteiligten Teilchen aus irgendeinem einer Diese Aufgabe wird erfindungsgemaß gelöst durchthat the particles involved from any one This object is achieved according to the invention by

"i| Vielzahl von Gründen agglomerieren können, die mit ein weiteres Metall zur Verbesserung der Haftung zwi-"i | can agglomerate for a variety of reasons that involve using another metal to improve the adhesion between

f| der immunologischen Agglutinierung nichts zu tun ha- sehen dem Goldüberzug und dem Substratf | the immunological agglutination has nothing to do with the gold coating and the substrate

ff ben, und auf diese Weise die Zuverlässigkeit der Unter- Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform ist dasff ben, and in this way the reliability of the sub-According to an advantageous embodiment that is

If suchung vermindern. Üblicherweise werden Agglutinie- 5 andere Metall unter Bildung einer Legierung in dasIf search diminish. Usually, agglutinates are transformed into other metals to form an alloy

r-'i rungs-Untersuchungen mit größter Sorgfalt von ausge- Gold diffundiert, wodurch die Empfindlichkeit der Vor-r-'i tion investigations with the greatest care diffused from gold, whereby the sensitivity of the pre-

V; bildeten Fachkräften durchgeführt, doch treten trotz- richtung erhöht wird.V; trained professionals carried out, but occur despite- direction is increased.

j"! dem gelegentlich diagnostische Fehler auf. Die Erfindung wird nachfolgend unter Bezugnahmej "! which occasionally has diagnostic errors. The invention is referred to below with reference to

■'^r·■ ' ^r · Beim derzeitigen Verfahren zur Gewinnung gerei- auf die Zeichnung näher erläutert Im einzelnen zeigtIn the current method of extraction, explained in more detail on the drawing In detail shows

:' nigter Anreicherungen von Antikörpern wird zuerst 10 F i g. 1 eine Seitenansicht einer Ausführungsform der: Less concentrations of antibodies are first shown in FIG. 1 is a side view of an embodiment of FIG

,j| durch Einführung des Antigens in das tierische System diagnostischen Vorrichtung nach Patent 23 30 702 und, j | by introducing the antigen into the animal system diagnostic device according to patent 23 30 702 and

p die Erzeugung von Antikörpern in einem tieirischen Le- F i g. 2 eine graphische Darstellung des Betriebsprin-p the generation of antibodies in an Irish animal. 2 a graphic representation of the operational principle

|ä bewesen angeregt dann entnimmt man dem Tier Blut- zips, der in F i g. 1 dargestellten Ausführungsform einer| ä consciously stimulated, blood zips are then taken from the animal, which is shown in FIG. 1 illustrated embodiment of a

p serum, welches die Antikörper in hochverdünnter Form diagnostischen Vorrichtung.p serum, which contains the antibodies in a highly diluted diagnostic device.

Jf enthält und vermischt eine bestimmte Menge des spezi- 15 Eine Ausführungsform einer diagnostischen Vorrich-■fI Jf contains and mixes a certain amount of the specific 15 An embodiment of a diagnostic device ■ f I Fischen Antigens mit dem Serum. Die Mischung aus An- tiujg ist strukturell in F i g. 1 gezeigt, und ihr Betriebs-Il tigen und Antikörper bildet Komplexe und fällt aus der prinzip ist graphisch in F i g. 2 illustriert If Serumlösung aus. Die verbleibenden Bestandteile des Die Vorrichtung nach F i g. 1 umfaßt ein Goldsubstrat ui Fishing antigen with the serum. The mixture of antiujg is structurally shown in FIG. 1, and their operating conditions and antibodies form complexes and fail the principle is graphically shown in FIG. 2 illustrates if serum solution is made. The remaining components of the device according to FIG. 1 comprises a gold substrate ui Serums werden abgezogen und der Niederschlag aus 91, das aus wirtschaftlichen Gründen vorzugsweise aus H Antikörper und Antigen wird in einer Säure gelöst, wel- 20 einem mit einer dünnen Goldschicht versehenen ande-[| ehe die Komplexverbindungen trennt Man erhält da- ren Metall besteht und auf dem eine monomolekulare fl Serum is drawn off and the precipitate from 91, which for economic reasons preferably consists of H antibody and antigen, is dissolved in an acid which is coated with a thin layer of gold before the complex compounds are separated One obtains its metal and on which a monomolecular fl durch eine. Lösung der Antigen- und Antikörpermolekü- Schicht 92 eines ersten Proteins adsorbiert ist Gold hat ;V Ie in der Säure. Da die Antikörper- und Antigenmolekü- ein Absorptionsband innerhalb des sichtbaren Spek- |S Ie unterschiedliche physikalische Eigenschaften haben, trums. Diese Tatsache ist für die charakteristische Goldig z. B. unterschiedliches Gewicht, können sie voneinander 2s farbe verantwortlich und ermöglicht diese Ausfüh-P mechanisch, z.B. durch Zentrifugieren, getrennt wer- rungsform der Vorrichtung.by a. Solution of the antigen and antibody molecule layer 92 of a first protein has adsorbed gold ; V Ie in the acid. Since the antibody and antigen molecules - an absorption band within the visible spectrum | S Ie have different physical properties, trums. This fact is for the characteristic Goldig z. B. different weight, they can be responsible for each other for 2 seconds color and enables this execution mechanically, e.g. by centrifugation, separated form of the device.

§ den. F i g. 2 illustriert den Betrieb dieser Ausführungsform te Es ist bekannt, daß die Antikörper-Antigen-Komple- und gibt eine Reihe von Reflektivitätskurven wieder, bei ·:} § the. F i g. Fig. 2 illustrates the operation of this embodiment. It is known that the antibody-antigen complex and gives a series of reflectivity curves where ·:} xierungsreaktion stattfindet wenn ein Antigen an einer denen die relative Reflektivität als Funktion der Wellen-Ψ; xierungreaktion takes place when an antigen at one of which the relative reflectivity as a function of the wave Ψ; Oberfläche absorbiert ist Die Komplexierungsreaktion 30 länge aufgetragen ist Die Kurve 93 repräsentiert die Κ Surface is absorbed The complexation reaction 30 is plotted length The curve 93 represents the Κ an einer Oberfläche ist mittels Eilipsometers beobachtet Reflektivität von Goldmetall. Die Kurve 94 gibt die Re-Il worden. Ein Eilipsometer ist ein komplexes, speziell zur flektivität von Goldmetall wieder, das eine monomole-'. on one surface, the reflectivity of gold metal is observed by means of an ellipsometer. The curve 94 indicates the Re-Il has been. An egg ipsometer is a complex, specially designed for the flexibility of gold metal, which is a monomole- '. Bestimmung der Elliptizität polarisierten Lichtes kulare Proteinschicht aufweist Kurve 95 zeigt die Re-'< Determination of the ellipticity of polarized light kulare protein layer has curve 95 shows the Re- '< brauchbares optisches Instrument, mit dessen Hilfe man flektivität von Goldmetall mit einer bimolekularen Pro-■ useful optical instrument by means of which one flektivität of gold metal with a bimolecular process ■ Filmdicken in der Größenordnung von 0,1 A messen 35 teinschicht darauf. Ein Goldsubstrat, wie 91, hat in Überkann. Eilipsometer sind teuer und erfordern ausgebilde- einstimmung mit Kurve 93, die leuchtend gelbe Farbe ': Film thicknesses on the order of 0.1 Å measure 35 layers of stone on top. A gold substrate such as 91 has over can. Egg ipsometers are expensive and require training to conform to curve 93, the bright yellow color : tes Bedienungspersonal. Bei Untersuchungen immuno- des Goldmetalles. Wird die Testproteinschicht 92 auf ; logischer Reaktionen unter Verwendung von Ellipso- das Substrat 91 aufgebracht, dann hat die Testplatte . meiern, soweit sie bisher durchgeführt wurden, verwen- gemäß Kurve 94 ein dunkelgelbes Aussehen. Nachdem dete man zwei Verfahren. Nach dem einen Verfahren 40 die Testplatte einer Lösung ausgesetzt worden ist in der : ließ man die zu untersuchende Reaktion ablaufen und man das mit dem Protein der Schicht 92 immunologisch ordnete dann den Objektträger, auf dem die Reaktion reagierende Protein vermutet, dann weist die Testplatte, iύ operating personnel. When investigating immunogenic gold metal. If the test protein layer 92 is applied; logical reactions using Ellipso- the substrate 91 applied, then the test plate. As far as they have been carried out up to now, use a dark yellow appearance according to curve 94. Two procedures were then used. According to one method 40, the test plate was exposed to a solution in which: the reaction to be investigated was allowed to proceed and the protein of layer 92 was immunologically arranged, then the slide on which the reaction-reacting protein is suspected, then the test plate, i ύ stattgefunden hatte, in einem Eilipsometer an, um die wenn ein solches spezifisch reagierendes Protein in der \A had taken place, in an egg ipsometer to determine if such a specifically reacting protein in the \ A Filmdicke zu bestimmen. Bei dem anderen Verfahren Lösung vorhanden war eine Reflektivitätscharakterij^ wurde der Objektträger von vornherein im Ellipsome- 45 stik, wie sie in Kurve 95 gezeigt ist auf und die Platte hat γ\ To determine film thickness. In the case of the other method, the solution was a reflectivity characteristic, the slide was ellipsometrically 45 from the outset, as shown in curve 95, and the plate has γ \ ter befestigt und man beobachtete mit dem Ellipsome- deutlich grünes Aussehen.attached and one observed with the ellipsome - clearly green appearance.

j$ ter die sich mit dem Fortschreiten der immunologischen Nach bisher durchgeführten Versuchen haben die Jw Reaktion ändernde Filmdicke. Die Bestimmung der ab- Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung, die ein U According to experiments carried out so far, the Jw reaction has a changing film thickness. The determination of the ab embodiments of the present invention that require a U soluten Dicke erfordert eine außerordentliche Sorgfalt Substrat mit Metallkügelchen und ein Goldsubstrat ver-)l solutes thickness requires extreme care substrate with metal balls and a gold substrate ver-) l Ist andererseits die Konzentration der Antikörper in der 50 wenden, die im allgemeinen brauchbarsten zu sein. Weil| Lösung gering, dann erfordert die Messung der relati- ter wurde festgestellt, daß diese Ausführungsformen un-Xf ven Dickenänderung, obwohl sie leichter durchzuführen terschiedliche Empfindlichkeiten haben in Abhängigkeit j£ ist als die Bestimmung der absoluten Dicke, eine lange von den Dicken der interessierenden Proteinfilme. Im S\j Zeit. Aus wirtschaftlichen Gründen ist daher der Nach- einzelnen weist die Ausführungsform mit einem Sub- || weis immunologischer Reaktionen auf einer Oberfläche 55 strat und Metallkügelchen die größte Empfindlichkeit ■■;: unter Verwendung eines Eilipsometers nicht für diagno- auf, wenn die Filmdicken unterhalb von etwa 200 A Hell stische Zwecke verwendet worden. gen. Das Goldsubstrat hat die größte Empfindlichkeit te Die vorliegende Erfindung schließt die Feststellung für Filme, die eine Dicke von 30 A übersteigen. uj ein, daß irgendein willkürlich ausgewähltes Protein sich In einem diagnostischen Verfahren, das mit der Vor-[| an einem Substrat nur in einer monomolekularen 60 richtung gemäß der vorliegenden Erfindung ausgeführt Jp Schicht absorbiert und d?9 ein spezifischer Antikörper worden ist wurden Glasobjektträger mit einer dünnen '*'- (oder Antigen) für ein solches willkürlich ausgewähltes Indiumschicht bedeckt und mit einer Goldschicht über-'h' On the other hand, the concentration of antibodies in the 50 turn is generally to be the most useful. Because | Solution low, then requires the measurement of the relati- onally it has been found that these embodiments un- Xf ven change in thickness, although they have easier to carry out different sensitivities as a function of the determination of the absolute thickness, a long time on the thicknesses of the protein films of interest . In the S \ j time. For economic reasons, therefore, the individual has the embodiment with a sub- || If immunological reactions on a surface 55 strat and metal spheres have the greatest sensitivity ■■ ;: using an ellipsometer not for diagnostic purposes, if the film thicknesses below about 200 Å light have been used. The gold substrate has the greatest sensitivity. The present invention includes the detection for films exceeding 30 Å in thickness. uj, that some arbitrarily selected protein could be used in a diagnostic procedure that is preceded by [| carried out on a substrate only in a monomolecular 60 direction according to the present invention Jp layer absorbed and d? 9 a specific antibody was covered glass slides with a thin '*' - (or antigen) for such an arbitrarily selected indium layer and with a gold layer about- 'h' Protein sich mit diesem unter Bildung einer bimolekula- schichtet Die Verwendung einer Indiumunterschicht ■' ren Proteinschicht auf dem Substrat verbinden wird. wai erforderlich, um die Adhäsion zwischen Glas und :;.j Es ist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ei- 65 Gold zu verbessern. Es wurde weiter festgestellt, daß t · ne verbesserte Vorrichtung für den Nachweis immun- die Diffusion des Indiums in die darüberliegende GoId- |; ologischer Reaktionen zu schaffen, die auf einer Ober- schicht die optischen Charakteristiken der Testobjekt-M, Protein combines with this to form a bimolecular layer. The use of an indium sublayer will bond with the protein layer on the substrate. wai necessary to ensure the adhesion between glass and:; j It is therefore the object of the present invention to improve gold. It was further established that an improved device for the detection of immune - the diffusion of indium into the overlying gold - |; to create ecological reactions which, on a top layer, reflect the optical characteristics of the test object M, fläche stattfinden. träger verbesserte.take place. carrier improved.

Die so vorbereiteten Objektträger wurden mit einer monomolekularen Schicht des mit der Hepatitis verbundenen Antigens bedekt Proben menschlichen Blutes, die auf die Anwesenheit von Hepatitis zu untersuchen waren, wurden durch Einmischen einer Menge gegenüber dem mit der Hepatitis verbundenen Antigen zubereitet, wobei eine ausreichende Menge der Antiköper verwendet wurde, um immunologisch aus der Mischung entfernt zu werden, wenn das mit der Hepatitis verbundene Antigen in der Probe vorhanden ist Dann wurden die Testobjektträger in die so vorbereiteten Blutproben eingetaucht Nach dem Herausnehmen wiesen die in die Hepatitis-negativen Proben eingetauchten Objektträger eine bimonokulare Proteinschicht auf, die das zuerst aufgebrachte mit der Hepatitis verbundene Antigen umfaßten und eine zweite Schicht von Antikörpern gegenüber dem mit der Hepatitis verbundenen Antigen, die immunologisch damit verbunden waren, wie ein grüngefärbter Streifen auf dem Objektträger zeigt Die-Objektträger, die in Hepatitis-positive Proben eingetaucht waren, bleiben ihre ursprüngliche dunkelgelbe Färbung bei, und dies zeigt an, daß nur die monomolekulare Schicht aus mit der Hepatitis verbundenem Antigen auf dem Objektträger vorhanden war, während die in die Probe eingebrachten Antikörper durch Komplexbildung mit dem darin enthaltenen Antigen aus der Probe ausgefallen waren und nicht mehr mit dem Antigen auf dem Testobjektträger reagieren konnte.The slides prepared in this way were covered with a monomolecular layer of the antigen associated with hepatitis. Samples of human blood, to be examined for the presence of hepatitis were prepared by mixing in an amount against the hepatitis-related antigen with a sufficient amount of the antibody was used to be immunologically removed from the mixture if the hepatitis-related antigen is present in the sample the test slides immersed in the blood samples prepared in this way Hepatitis-negative specimens dipped slides with a bimonocular protein layer on top of that first applied hepatitis-related antigen and a second layer of antibodies to the hepatitis-related antigen, which were immunologically related, as shown by a green-colored strip on the slide. The slides that were immersed in hepatitis-positive samples remain their original dark yellow Staining at, indicating that only the monomolecular layer of hepatitis-related antigen was present on the slide during the Antibodies introduced into the sample had precipitated out of the sample through complex formation with the antigen contained therein and no longer with the antigen could react on the test slide.

Es zeigt sich, daß der oben beschriebene Test ein Inhibitionstest ist In einem anderen diagnostischen Verfahren wurde ein direkter Test mit einer Vorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung durchgeführt Bei dem direkten Test wurden Objektträger aus Glas-Indium-Gold und wie oben beschrieben vorbereitet und dann mit einer monomolekularen Schicht aus Antikörpern gegenüber dem mit der Hepatitis verbundenen Antigen beschichtet Einige der Objektträger wurden dann in Serum eingetaucht daß von hepatitispatienten entnommen war und von dem man daher wußte, daß es das mit der Hepatitis verbundene Antigen enthält Andere Objektträger wurden in Serumproben eingetaucht von denen man wußte, daß sie frei sind von dem mit der Hepatitis verbundenen Antigen. Wie erwartet wiesen die in das Hepatitisserum eingetauchten Objektträger eine bimolekulare Proteinschicht auf, während die in das Hepatitisfreie Blut eingetauchten Objektträger nur eine monomolekulare Schicht aufwiesen.The test described above is shown to be an inhibition test. In another diagnostic method, a direct test with a device was used performed in accordance with the present invention. In the direct test, glass-indium-gold slides were prepared and as described above then with a monomolecular layer of antibodies to that associated with hepatitis Antigen Coated Some of the slides were then immersed in serum from that of hepatitis patients and was therefore known to contain the hepatitis-related antigen. Other slides were immersed in serum samples known to be free of the antigen associated with hepatitis. As expected, pointed the slides immersed in the hepatitis serum have a bimolecular protein layer, while those in the Hepatitis-free blood immersed slides had only one monomolecular layer.

Theoretisch ist der eben beschriebene direkte Test das bevorzugte diagnostische Verfahren sowohl wegen seiner relativen Einfachheit als auch weil in diesem Falle der direkte Test eine höhere Empfindlichkeit hat als der Inhibitionstest Die höhere Empfindlichkeit des direkten Tests resultiert aus der Tatsache, daß die mit der Hepatitis verbundenen Antigenmoleküle sehr viel größer sind als die Moleküle des Antikörpers gegenüber dem mit der Hepatitis verbundenen Antigen. Daher bewirkt der direkte Test eine sehr viel größere prozentuale Änderung der Filmdicke und demgemäß ist ein größerer Kontrast beobachtbar.In theory, the direct test just described is the preferred diagnostic method because of both its relative simplicity as well as because in this case the direct test has a higher sensitivity than the inhibition test The higher sensitivity of the direct test results from the fact that those with the Hepatitis related antigen molecules are much larger than the molecules of the antibody opposite the antigen associated with hepatitis. Hence, the direct test causes a much greater percentage change in film thickness and accordingly greater contrast is observable.

Die Konzentration des mit der Hepatitis verbundenen Antigens im Blut einer Person, die der Krankheit ausgesetzt ist ist eine Funktion der Zeit Die Konzentration des Hepatitisantigens ist sehr hoch, während der klinischen und unmittelbar vor klinischen Phasen der Hepatitis. In den weit nachklinischen Phasen ist die Konzentration des Hepatitisantigens im Blut einer Person jedoch sehr gering. Beide Zustände sind medizinisch von Interesse. Der Nachweis des Antigens während derThe concentration of the antigen associated with hepatitis in the blood of a person who has the disease The concentration of the hepatitis antigen is very high during the exposure is a function of time clinical and immediately before clinical phases of hepatitis. In the far post-clinical phases, the However, the concentration of the hepatitis antigen in a person's blood is very low. Both conditions are medical of interest. Detection of the antigen during the klinischen und unmittelbar vorklinischen Phasen ist für Diagnosezwecke wertvoll. Der Nachweis des Antigens in der weit nachklinischen Phase ist für die Untersuchung des Blutes von in Aussicht genommenen BIm-Spendern wertvoll. Der einfachere empfindliche direkte Test ist daher für diagnostische Zwecke bevorzugt, da er leicht durchgeführt werden kann, wegen der relativ hohen Konzentration des Hepatitisantigens in der Blutprobe.clinical and immediate preclinical phases is for Valuable for diagnostic purposes. The detection of the antigen in the post-clinical phase is valuable for examining the blood of potential BIm donors. The easier sensitive direct Test is therefore preferred for diagnostic purposes as it can be easily performed because of its relative ease high levels of hepatitis antigen in the blood sample.

Der für Überprüfungszwecke beschriebene Inhibitionstest ist experimentell ausgewertet worden, um seinen Wert relativ zu anderen bekannten Überprüfungstests zu bestimmen. In diesen Tests wurde das Hepatitispositive Serum mit bekanntem Hepatitis-negativem Se-The inhibition test described for verification purposes has been evaluated experimentally to determine its value relative to other known verification tests. In these tests, the hepatitis positive serum with known hepatitis negative serum rum verdünnt. Unter Anordnung der oben beschriebenen Inhibitionsprozedur führt eine Verdünnung eines Teiles Hepatitis-positiven Serums mit 32 Teilen bekannten Hepatitis-negativem Serum zu einem zuverlässigen Nachweis während einer Stunde. Die Anwendung einerrum diluted. In accordance with the inhibition procedure described above, dilution of a Partial hepatitis positive serum with 32 parts known hepatitis negative serum into a reliable one Evidence for one hour. The application of a Verdünnung eines Teiles Hepatitis-positiven Serums mit 3000 Teilen bekannt negativem Serums, ergab einen zuverlässigen Nachweis während 24 Stunden. Diese Ergebnisse erweisen sich als sehr ähnlich in der Empfindlichkeit bzw. der erforderlichen Zeit wie das bekannteDilution of part of the hepatitis positive serum with 3000 parts of known negative serum, gave reliable detection during 24 hours. These results turn out to be very similar in sensitivity or time required to the known one Verfahren der Gegenelektrophorese bzw. der Radioimmunisierung. Ein Uberprüfungsverfahren mit der Vorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung ergibt also Resultate, die vergleichbar sind mit den besten nach bekannten Verfahren erhältlichen, wobei ein zusätziiMethod of counterelectrophoresis or radioimmunization. A verification method with the device according to the present invention thus results Results which are comparable to the best available by known methods, with an additional eher Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens der ei nes beträchtlich billigeren Verfahrens ist.rather advantage of the inventive method of the egg is a considerably cheaper process.

Die bevorzugte Verwendung eines goldbeschichteten Substrates gegenüber einem mit Metallkügelchen beschichteten Substrat bei dem vorbeschriebenen diagno-The preferred use of a gold-coated substrate as opposed to a substrate coated with metal beads in the above-described diagnostic stischen Hepatitis-Verfahren ist durch den Durchmesser der Hepatitis-Antigenmoleküle bedingt, der bei etwa 210 Ä liegt. Solche Filmdicken liegen gut im Bereich der Möglichkeiten goldbeschichteter Substrate, um eine empfindliche Anzeige zu geben, doch sind sie zu dick fürStic hepatitis procedure is due to the diameter of the hepatitis antigen molecules, which is about 210 Ä lies. Such film thicknesses are well in the range of the possibilities of gold-coated substrates to achieve a to give a sensitive display, but they are too thick for eine hochempfindliche Anzeige unter Verwendung mit Metallkügelchen beschichteten Substrats.a highly sensitive display using with Metal beads coated substrate.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen1 sheet of drawings

Claims

Patent claims:

1. Apparatus for determining the presence or absence of a specific protein in a biological sample by simply looking to determine if one or two protein layers are present on the substrate, consisting of a substrate which is provided with a gold coating is to which a protein that specifically reacts with said specific protein adheres, according to Patent 2330702, characterized by a further metal to improve the adhesion between the gold plating and the substrate

2. Device according to claim 1, characterized in that that the other metal diffuses into the gold to form an alloy, thereby increasing the sensitivity the device is increased.