WO1999009447A1 - Dispositif pour la microscopie automatique - Google Patents

Dispositif pour la microscopie automatique Download PDF

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WO1999009447A1
WO1999009447A1 PCT/FR1998/001806 FR9801806W WO9909447A1 WO 1999009447 A1 WO1999009447 A1 WO 1999009447A1 FR 9801806 W FR9801806 W FR 9801806W WO 9909447 A1 WO9909447 A1 WO 9909447A1
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automatic microscopy
plane
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PCT/FR1998/001806
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Inventor
Jean-Claude Bisconte De Saint-Julien
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Biocom S.A.
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    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/24—Base structure
    • G02B21/241—Devices for focusing

Definitions

  • Era present invention relates to the field of automatic microscopy in general and the biology of rare events "in particular.
  • the aim of the invention is to provide a system which can be used routinely, by an operator who may be poorly qualified or available, while minimizing operator intervention.
  • Another aim is to propose a system capable of operating at any wavelength, and in weak light (photon counting).
  • the classic design of the microscope includes a very rigid stand carrying the optics and the camera.
  • the object plate forms a complex mechanical assembly, using several slides performing micro- or macrometric movements, and a cantilever plate.
  • the evolution of cameras towards a reduction in volume and weight and, conversely, the motorization of the microscope slide, makes such solutions ill-suited.
  • the motorization leads to plates of a high weight, of the order of 5 10 kg, whose overhang will vary very significantly if the size of the object explored is large. This results in flexions which vary according to the position of the field. explored. These flexions result in variations in the focus which the operator must correct, or which are corrected by an automatic mechanism. Such adjustments result in loss of time and risk of errors.
  • This patent relates to a method of automatic analysis of elements in low concentration on a support of objects of low occurrence having a contrast surface state, consisting in illuminating the observation area with a first light source emitting in a first range wavelength and a second source emitting objects of low occurrence in the excitation spectrum, to focus the image acquisition means and to trigger, after focusing, the accumulation of photons emitted by the objects of low occurrence illuminated with a source emitting in the excitation spectrum of said objects.
  • the focusing of the image acquisition means is modified until the contrast of an area in said first wavelength range is maximized, said area being separable from the observation area. illuminated by the second light source.
  • the object of the present invention is to remedy these drawbacks by proposing a robust and space-saving equipment, usable without risk of errors by an inexperienced operator, and guaranteeing a table focus and easy to adjust.
  • the invention relates in its most general sense to a device for the counting of rare target elements visible on a support plate consisting of:
  • the device according to the invention is characterized in that it comprises a rigid chassis and in that the sample-holder plate is rigidly fixed to said rigid chassis.
  • the lens is mounted on a beam substantially parallel to the observation plane, the first end of which is rigidly fixed to the chassis in the direction perpendicular to the longitudinal plane at least, and its second end being movable in a direction perpendicular to the longitudinal, adjustment means allowing the adjusting the position of said second end.
  • This embodiment avoids the overhang that usually presents the stage of a microscope. It also results in great rigidity, insofar as one of the ends of the plate is fixed, or mounted on a transverse pivot axis.
  • the first end of the beam is rigidly fixed to the chassis, said beam being elastically deformable.
  • the objective is fixed between the middle and the second end of the flexible beam.
  • the senor for, the digitization of the images is secured to the beam supporting the objective.
  • the light source is integral with the beam supporting the objective.
  • FIG. 1 shows a perspective view of the device according to the invention
  • FIG. -2 shows a view according to a longitudinal section plane
  • FIG. 3 shows a view along a transverse section plane.
  • the equipment consists of a light-tight housing (1).
  • a hatch (20) visible in FIG. 3 allows access for loading the sample to be analyzed. This hatch also allows the change of objective, the change of filters or access to the light shutter.
  • the housing (1) is mounted on a rigid frame (2) formed by a base (3) extended by a vertical upright (4) rigidly assembled by screws or by welding, or even forming a single piece with the base (3).
  • the base is formed in the example described by an aluminum plate of 460x500 mm, and a thickness of 18 mm.
  • the vertical upright (4) is formed by an aluminum plate of 150x460 mm, and a thickness of 18 mm.
  • the chassis (2) is made of a material capable of guaranteeing great robustness and a high mechanical resistance preventing any deformation.
  • the base (3) supports a blade holder assembly (5) rigidly fixed by screws or by any equivalent means.
  • This blade holder assembly has a plate (6) movable in a horizontal plane, under the action of control motors (7, 8) and a drive screw.
  • the plate (6) is mounted on ball bearings in a known manner, so as to ensure high rigidity in the plane perpendicular to the movement.
  • This plate is intended to receive a slide or an analysis membrane on which the target elements appear.
  • Under this plate (6) is placed a light source (7) for epi-fluorescence lighting, or to facilitate the adjustments of the optical unit.
  • a first part of the equipment therefore consists of the chassis supporting the means for positioning the support of the elements to be counted.
  • This first part forms a very rigid assembly in the vertical plane, the only degree of freedom possibly being the horizontal displacement of the plate (6).
  • a flexible beam (8) supporting the optical counting means On this first part is mounted a flexible beam (8) supporting the optical counting means.
  • This flexible beam is produced in the example described in the form of a steel plate with a length of 500 mm and a thickness of 150 mm. It has a relative rigidity, and allows elastic deformation by bending. It is fixed by a first end (9) to the upright (4) of the chassis (2) in a rigid manner, by screws, by welding, or by any other known means to guarantee a rigid connection. It is also also possible to make the frame (2) and the flexible beam (8) in the form of a single machined or molded part.
  • the assembly formed by the frame (2) and by the flexible beam (8) has, seen in median section, the general shape of a frame with three sides, with two parallel branches connected by a perpendicular upright.
  • the other end (10) is free in the direction perpendicular to the plane of the beam.
  • a micrometric screw (11) connects it to the base (3).
  • An adjustment wheel (12) makes it possible to adjust the distance between the end (10) and the base (3). At rest, this distance corresponds to the height of the upright (4), so that the beam (8) is parallel to the base (3).
  • you act on the thumbwheel (12) to reduce the length of the micrometric screw (11) a slight deformation of the flexible beam (8) is caused downward, and conversely, when the wheel (12) is acted in the opposite direction, the flexible beam is pushed back ( 8) up.
  • the arrow varies from about
  • the base (3) and the upright (4) form a particularly rigid and stable frame.
  • the objective (13) is fixed substantially in the center of the flexible beam (8).
  • This objective is a low magnification objective, preferably between x2 and x20, which allows a large depth of field, of the order of 0.5 mm.
  • the focal length of the lens is 170 mm in the example described.
  • the flexible beam (8) also supports an optical unit (14) containing a dichroic mirror (15).
  • One of the optical paths corresponds to lighting using an optical system (16) connecting a light source (17) to said optical unit (15).
  • the optical system is also fixed to the flexible beam (8).
  • the light source for example a mercury vapor lamp, is arranged outside the housing to avoid overheating or stray light.
  • the optical system (16) consists of a tube containing focusing lenses and an excitation filter of known types.
  • the optical unit (14) also transmits the image to a CCD accumulation sensor (17).
  • This sensor (17) is also mounted on the flexible beam (8).
  • the optical path is reflected by a folding of the beam and a horizontal position of the camera.

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Abstract

La présente invention concerne un dispositif pour la microscopie automatique, notamment la numération d'éléments rares constitué d'une platine (6) porte-lame, d'une optique de grossissement microscopique, d'un capteur pour la numérisation de l'image, d'une source lumineuse au moins pour l'éclairage de la zone d'observation et/ou l'excitation des éléments cibles et de moyens pour l'ajustement de la position relative de la platine (6) et de l'objectif (13) pour le positionnement des éléments cibles dans le plan focal. La platine (6) porte-lame est fixée sur un châssis (2) rigide. L'objectif (13) est monté sur une poutre (8) sensiblement parallèle au plan d'observation.

Description

DISPOSITIF POUR LA MICROSCOPIE AUTOMATIQUE. Era présente invention concerne le domaine de la microscopie automatique en général et de la biologie des événements rares «en particulier.
Le but visé par l'invention est de proposer un système utilisable en routine, par un opérateur éventuellement peu qualifié ou peu disponible, en réduisant au minimum les interventions de l'opérateur. Un autre but est de proposer un système susceptible de fonctionner dans n'importe quelle longueur d'onde, et en lumière faible (comptage de photons) .
Dans l'état de la technique, on connaît différents systèmes d'imagerie numérique dont la base est un microscope automatisé par motorisation de la platine porte-objet. Une vis micrométrique motorisée permet de placer l'objet observé dans le plan focal, et facilite l'automatisation de la focalisation. Un exemple de réalisation est connu sous le nom commercial de COBRA. Il s'agit d'un dispositif commercialisé par la demanderesse, la société BIOCOM, dont certains sous- ensembles comme la platine spéciale à aspiration font l'objet du brevet français FR2657543 de la demanderesse.
D'une façon générale, la conception classique du microscope comprend un statif très rigide porteur des optiques et de la caméra. La platine porte- objet forme un ensemble mécanique complexe, mettant en oeuvre plusieurs glissières effectuant des mouvements micro- ou macrométriques, et une platine en porte-à- faux. L'évolution des caméras vers une réduction de volume et de poids et, à l'inverse, la motorisation de la platine porte-objet, rend de telles solutions mal adaptées. En effet, la motorisation conduit à des platines d'un poids élevé, de l'ordre de 5 10 kg, dont le porte-à-faux va varier de façon très sensible si la taille de l'objet exploré est importante. Il en résulte des flexions qui varient suivant la position du champ exploré. Ces flexions se traduisent par des variations de la focalisation que l'opérateur doit corriger, ou qui sont corrigées par un automatisme. De tels réglages se traduisent par une perte de temps et des risques d ' erreurs .
La demanderesse à déjà proposé une amélioration au problème de la focalisation dans son brevet français FR2716003. Ce brevet concerne un procédé d'analyse automatique d'éléments en faible concentration sur un support d'objets de faible occurrence présentant un état de surface contraste, consistant à éclairer la zone d'observation avec une première source de lumière émettant dans une première plage de longueur d'ondes et une deuxième source émettant dans le spectre d'excitation des objets de faible occurrence, à procéder à la focalisation des moyens d'acquisition d'images et à déclencher âpres focalisation l'accumulation de photons émis par les objets de faible occurrence illumines avec une source émettant dans le spectre d'excitation desdits objets. Selon cette invention, on procède à une modification de la focalisation des moyens d'acquisition des images jusqu'à la maximalisation du contraste d'une zone dans ladite première plage de longueur d'ondes, ladite zone étant dissociable de la zone d'observation éclairée par la seconde source de lumière.
Toutefois, il est apparu que le champs d'application de tels équipement peut dépasser le cadre de la recherche et du laboratoire, et intéresser des domaines d'analyse de routine où les utilisateurs ne sont pas toujours très qualifiés.
Dans de telles situation, la mise en oeuvre de ces équipements peut s'avérer trop délicate. En effet, il faut rappeler que le but est de dénombrer un nombre d'événements généralement très rares, et qu'un réglage erroné peut entraîner des résultats de type " faux positif " qui peuvent avoir des conséquences graves . De même , certaines applications nécessite 1 ' interprétation par un expert à qui le résultat de la numération sont transmis . Si les conditions de réalisation des numérations ne sont pas parfaitement maîtrisées par l ' opérateur se trouvant sur le terrain, l ' interprétation est imposs ible , ou pire encore faussée .
Le but de la présente invention est de remédier à ces inconvénients en proposant un équipement robuste et peu encombrant , utilisable sans risque d ' erreurs par un opérateur peu expérimenté , et garantissant une focalisation s table et facile à ajuster .
Pour atteindre ce but , l ' invention concerne dans son acception la plus générale un dispositif pour la numération d ' éléments cibles rares visibles sur une lame support constitué :
- d'une platine porte-échantillon,
- d'une optique de grossissement microscopique ,
- d'un capteur pour la numérisation de 1 ' image,
- d'une source lumineuse au moins pour l'éclairage de la zone d'observation et/ou l'excitation des éléments cibles et
de moyens pour l'ajustement de la position relative la platine et de l'objectif pour le positionnement des éléments cibles dans le plan focal . Le dispositif selon l'invention est caractérisé en ce qu'il comporte un châssis rigide et en ce que la platine porte-échantillon est fixée rigidement audit châssis rigide. L'objectif est monté sur une poutre sensiblement parallèle au plan d'observation dont la première extrémité est fixée sur le châssis de façon rigide dans la direction perpendiculaire au plan longitudinal au moins, et sa deuxième extrémité étant mobile selon une direction perpendiculaire au est longitudinal, des moyens de réglages permettant l'ajustement de la position de ladite deuxième extrémité .
Ce mode de réalisation permet d'éviter le porte-à-faux que présente habituellement la platine d'un microscope. Il se traduit également par une grande rigidité, dans la mesure où une des extrémités de la platine est fixe, ou montée sur un axe de pivotement transversal .
Selon un mode de réalisation préféré, la première extrémité de la poutre est fixée rigidement sur le châssis, ladite poutre étant déformable élastiquement .
Avantageusement, l'objectif est fixé entre le milieu et la deuxième extrémité de la poutre flexible .
Selon une variante préférée, le capteur pour, la numérisation des images est solidaire de la poutre supportant 1 ' ob ectif .
De préférence, la source lumineuse est solidaire de la poutre supportant l'objectif.
L'invention sera mieux comprise à la lecture de la description qui suit, se référant à un exemple non limitatif de réalisation où :
- la figure 1 représente une vue en perspective du dispositif selon l'invention ;
- la figure -2 représente une vue selon un plan de coupe longitudinal ;
- la figure 3 représente une vue selon un plan de coupe transversal .
La description d'un exemple de réalisation de l'invention qui suit fera références aux dessins 1 à 3 représentant des vues respectivement en perspective, en coupe longitudinale et en coupe transversale.
L'équipement est constitué par un boîtier (1) étanche à la lumière. Une trappe (20) visible sur la figure 3 permet un accès pour le chargement de l'échantillon à analyser. Cette trappe permet également le changement d'objectif, le changement de filtres ou l'accès au shutter de lumière. Le boîtier (1) est monté sur un châssis rigide (2) formé par une embase (3) prolongée par un montant vertical (4) assemblé de façon rigide par des vis ou par soudure, ou encore formant une pièce unique avec l'embase (3). L'embase est formé dans l'exemple décrit par une plaque d'aluminium de 460x500 mm, et d'une épaisseur de 18 mm. Le montant vertical (4) est formé par une plaque d'aluminium de 150x460 mm, et d'une épaisseur de 18 mm. Le châssis (2) est réalisé en un matériau apte à garantir une grande robustesse et une résistance mécanique élevée évitant toute déformation.
L'embase (3) supporte un ensemble porte- lame (5) fixé de manière rigide par des vis ou par tout moyen équivalent. Cet ensemble porte-lame présente une platine (6) mobile dans un plan horizontal, sous l'action de moteurs de commande (7, 8) et d'une vis d'entraînement. La platine (6) est montée sur des roulements à bille de façon connue, de façon à assurer une grande rigidité dans le plan perpendiculaire au déplacement. Cette platine est destinée à recevoir une lame ou une membrane d'analyse sur laquelle apparaissent les éléments-cibles . Sous cette platine (6) est placée une source lumineuse (7) pour l'éclairage par épi- fluorescence, ou pour faciliter les réglages du bloc optique .
Une première partie de l'équipement est donc constituée par le châssis supportant les moyens de positionnement du support des éléments à dénombrer. Cette première partie forme un ensemble très rigide dans le plan vertical, le seul degré de liberté étant éventuellement le déplacement horizontal de la platine (6) .
Sur cette première partie est montée une poutre flexible (8) supportant les moyens optique dénombrement. Cette poutre flexible est réalisée dans l'exemple décrit sous la forme d'une plaque d'acier d'une longueur de 500 mm et d'une épaisseur de 150 mm. Elle présente une relative rigidité, et autorise une déformation élastique par flexion. Elle est fixée par une première extrémité (9) sur le montant (4) du châssis (2) d'une façon rigide, par des vis, par soudure, ou par tout autre moyen connu pour garantir une liaison rigide. Il est d'ailleurs également envisageable de réaliser le châssis (2) et la poutre flexible (8) sous la forme d'une pièce unique usinée ou moulée. L'ensemble formé par le châssis (2) et par la poutre flexible (8) présente, vue en coupe médiane, la forme générale d'un cadre à trois cotés, avec deux branches parallèles reliées par un montant perpendiculaire. L'autre extrémité (10) est libre dans la direction perpendiculaire au plan de la poutre. Une vis micrométrique (11) la relie à l'embase (3) . Une molette de réglage (12) permet d'ajuster la distance entre l'extrémité (10) et l'embase (3). Au repos, cette distance correspond à la hauteur du montant (4), de telle sorte que la poutre (8) est parallèle à l'embase (3). Lorsque l'on agit sur la molette (12) pour réduire la longueur de la vis micrométrique (11) , on provoque une légère déformation de la poutre flexible (8) vers le bas, et inversement, lorsque l'on agit sur la molette (12) en sens inverse, on repousse la poutre flexible (8) vers le haut. La flèche varie d'environ
±10 mm. à titre d'exemple, un rotation d'un tour de la molette (12) entraîne un déplacement de l'extrémité
(10) d'environ 100 μm . Des butées peuvent éventuellement limiter le débattement de l'extrémité (10) de la poutre (8) . Lorsque la position recherchée est atteinte, la poutre flexible (8), la vis de réglage
(11), l'embase (3) et le montant (4) forme un cadre particulièrement rigide et stable.
L'objectif (13) est fixé sensiblement au centre de la poutre flexible (8) . Cet objectif est un objectif de faible grossissement, compris préférentiellement entre x2 et x20, ce qui autorise une grande profondeur de champ, de l'ordre de 0,5 mm. La focale de l'objectif est de 170 mm dans l'exemple décrit .
La poutre flexible (8) supporte par ailleurs un bloc optique (14) contenant un miroir dichroïque (15) . L'un des chemin optique correspond à l'éclairage à l'aide d'un système optique (16) reliant une source de lumière (17) audit bloc optique (15). Le système optique est également fixé sur la poutre flexible (8) . La source de lumière, par exemple une lampe à vapeur de mercure, est disposée en dehors du boîtier pour éviter 1 ' échauffement ou la lumière parasite. Le système optique (16) est constitué par un tube renfermant des lentilles de focalisation et un filtre d'excitation de types connus.
Le bloc optique (14) transmet par ailleurs l'image à un capteur CCD à accumulation (17) . Ce capteur (17) est également monté sur la poutre flexible (8) . Le chemin optique est se traduit par un repliement du faisceau et une position horizontale de la caméra .
L'invention est décrite dans ce qui précède à titre d'exemple non limitatif. L'Homme du métier sera à même de réaliser différentes variantes sans pour autant sortir du cadre de l'invention.

Claims

R E V E N D I C A T I O N S
1 - Dispositif pour la microscopie automatique, notamment la numération d'éléments rares, le dispositif étant constitué d'une platine (6) porte- lame, d'une optique de grossissement microscopique, d'un capteur pour la numérisation de l'image, d'une source lumineuse au moins pour l'éclairage de la zone d'observation et/ou l'excitation des éléments cibles et de moyens pour l'ajustement de la position relative la platine (6) et de l'objectif (13) pour le positionnement des éléments cibles dans le plan focal, caractérisé en ce qu'il comporte un châssis (2) rigide, la platine (6) porte-lame étant fixée rigidement audit châssis (2), l'objectif (13) étant monté sur une poutre (8) sensiblement parallèle au plan d'observation, la première extrémité (9) de cette poutre (8) étant fixée sur le châssis (2) de façon rigide dans la direction perpendiculaire au plan longitudinal au moins, la deuxième extrémité (10) étant mobile selon une direction perpendiculaire au plan longitudinal, des moyens de réglages permettant l'ajustement de la position de ladite deuxième extrémité (10) .
2 - Dispositif pour la microscopie automatique, notamment la numération d'éléments rares, selon la revendication 1 caractérisé en ce que la première extrémité (9) de la poutre (8) est fixée rigidement sur le châssis (2), ladite poutre (8) étant déformable élastiquement .
3 - Dispositif pour la microscopie automatique, notamment la numération d'éléments rares, selon la revendication 1 ou 2 caractérisé en ce que l'objectif (13) est fixé entre le milieu et la deuxième extrémité (10) de la poutre (8) flexible.
4 - Dispositif pour la microscopie automatique, notamment la numération d'éléments rares, selon la revendication 2 ou 3 caractérisé en ce que le capteur pour la numérisation des images est solidaire de la poutre (8) supportant l'objectif (13).
5 - Dispositif pour la microscopie automatique, notamment la numération d'éléments rares, selon l'une au moins des revendication 2 à 4 caractérisé en ce que la source lumineuse est solidaire de la poutre (8) supportant l'objectif (13).
6 - Dispositif pour la microscopie automatique, notamment la numération d'éléments rares, selon l'une au moins des revendication précédentes caractérisé en ce que l'objectif présente une grossissement compris entre x2 et x20.
7 - Dispositif pour la microscopie automatique, notamment la numération d'éléments rares, selon l'une au moins des revendication précédentes caractérisé en ce que le capteur (17) est un capteur à accumulation.
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