WO1999006446A2 - Verfahren zum transglutaminase-katalysierten koppeln von protein oder peptid an einen träger - Google Patents

Verfahren zum transglutaminase-katalysierten koppeln von protein oder peptid an einen träger Download PDF

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peptide
coupled
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Hans-Lothar Fuchsbauer
Ralf Pasternack
Rolf Eymann
Jens Otterbach
Uwe Bechtold
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Fuchsbauer Hans Lothar
Ralf Pasternack
Rolf Eymann
Jens Otterbach
Uwe Bechtold
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    • G01N2333/91085—Transglutaminases; Factor XIIIq (2.3.2.13)

Definitions

  • the present invention relates to a method for transglutaminase-catalyzed coupling of protein or peptide to a carrier while maintaining at least 50% of the biological activity of the protein or peptide, carrier-coupled protein immobilizates and carrier-protein conjugates obtainable according to this method, and the use of carrier-coupled protein immobilizates and carrier-protein conjugates according to the invention.
  • the covalent linking of proteins to stable aggregates or their covalent binding to carrier materials are important processes in medical technology, food technology and diagnostics.
  • Crosslinking usually takes place with chemical reagents, among which glutardialdehyde plays an outstanding role.
  • Other organic compounds with at least two reactive functional groups can also be used.
  • Stable binding can also be achieved by chemically activating a protein before coupling it with a second protein.
  • a common method is, for example, the oxidation of glycoproteins with periodic acid while opening a sugar ring and generating reactive carbonyl functions.
  • the carrier material In immobilization processes, the carrier material usually already has a suitable reactive group for the formation of a covalent bond between the protein and the carrier matrix, e.g. an oxirane group.
  • transglutaminases protein glutamine: amine - ⁇ - glutamyl transferase E.C. 2.3.2.13 specifically catalyze the construction of stable cross bridges between proteins.
  • the ⁇ -carboxamide function of glutamine side chains is transferred to the ⁇ -amino group of lysine residues with the release of ammonium ions (Folk and Finlayso ⁇ , Adv. Protein Chem. 31, 1-133 (1977)).
  • the newly formed isopeptide bond also withstands hydrolysis by proteases and is only physiologically cleaved by a ⁇ -glutamylamine cyclotransferase after the proteins have completely broken down (Fink et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4564-4568 (1980 )).
  • JP 59 66 886 describes a method in which carrier material and protein to be coupled are simultaneously precipitated for the production of protein immobilized products (simultaneous immobilization process).
  • various enzymes glucose oxidase, catalase, diaphorase, RNase, glucosidase, mannosidase, glutamate dehydrogenase
  • This method has also been successfully used to produce active casein membranes (JP 61 227 783 and Motoki et al., Agric. Biol. Chem.
  • the object of the invention is therefore to provide a method with which proteins or peptides can be coupled to a carrier while maintaining their biological activity.
  • this object is achieved by a process for the transglutaminase-catalyzed coupling of protein or peptide to a carrier while maintaining at least 50% of the biological activity of the protein or peptide, the carrier being a bioactive molecule or a predetermined insoluble one Is a matrix comprising the step of bringing the carrier into contact with the protein to be coupled and with transglutaminase, the carrier and the protein or peptide acting as an acyl and / or amine donor and being suitable as a transglutaminase substrate.
  • biological activity of the protein or peptide means the respective enzymatic activity of enzymes, the antibody-binding activity of antibodies, the inhibitory activity of inhibitors and the antigenicity of antigens.
  • biological activity not only whole proteins, but also protein fragments or peptides can be biologically active.
  • the method according to the invention enables protein or peptide immobilizates and conjugates to be produced with all carriers accepted by a transglutaminase.
  • proteins and peptides require glutamine and / or lysine residues that are accessible to transglutaminase.
  • Other compounds and modified proteins or peptides must have at least one acid amide function or a primary amine group.
  • Proteins and other compounds are also suitable as starting materials for the enzymatic crosslinking if they have been modified beforehand by extension with an oligo or polyglutaminyl chain, a glutaminyl peptide, an oligo or polylysine chain or a primary amine with the aid of chemical and / or molecular biological methods have been.
  • transglutaminase substrate a suitable enzyme substrate or reaction partners
  • the suitability as a transglutaminase substrate can be determined by the incorporation of usually fluorescent transglutaminase substrates. the.
  • acyl and glutamine donors on the one hand and amine donors (glutamine acceptors ⁇ ) on the other.
  • example 2 With proteins, two different incubation approaches should be carried out for each protein (example 2).
  • a labeled amino e.g. C-DNA (I)
  • the other a labeled acid amide e.g. CBZ-Gln-Gly-C-DNA (II)
  • reactive lysine side chains e.g. CBZ-Gln-Gly-C-DNA (II)
  • the proteins are separated electrophoretically and then visible by irradiation with UV light of wavelength 366 ⁇ m. makes.
  • Peptides and other small molecules can be separated from the excess reagent by chromatography, for example analytical HPLC, and can be recognized as a transglutaminase substrate by their emission.
  • radioactive or biotinylated labeling reagents eg Biotinylamidopentylamine from Pierce
  • Successful labeling is then detected after separation by autoradiography or with avidin / streptavidin-enzyme conjugates.
  • Unmodified proteins can be classified into four categories:
  • Table 1 shows examples of important bioactive proteins with reactive side chains that can serve as transglutaminase substrates. In principle, other biopolymers and synthetic polymers can be recognized as transglutaminase substrates with the test method described. TABLE 1
  • the method according to the invention can be carried out with any type of acyl- and / or ami-donor, provided that this is suitable as a transglutaminase substrate, which, as stated above, can be tested.
  • the protein or peptide to be coupled is a glutamine donor and the carrier comprises reactive amine groups.
  • the protein or peptide to be coupled is a glutamine acceptor and the carrier provides reactive carboxamide groups.
  • the carrier can contain amine groups or carboxamide groups or amine and carboxamide groups.
  • the carrier can also be a protein, so that the reactive amine groups of the carrier also include, for example, lysine side chains reactive carboxamide groups of the support can be reactive glutamine side chains.
  • the carrier can be a bioactive molecule in solution.
  • the bioactive molecule is preferably an enzyme.
  • the coupling of a protein or peptide to an enzyme is used, for example, to provide molecules with two different enzymatic activities.
  • the crosslinking of two molecules can also be useful for the provision of protein dimers or higher forms of aggregation which, for example, have a biological activity as a ligand of a receptor.
  • reactive amines must be provided by at least one reaction partner and reactive carboxamide groups by at least one further reaction partner.
  • the carrier is a predetermined insoluble matrix.
  • proteins such as gelatin and casein
  • Cross-linked proteins are preferred as the insoluble matrix.
  • the protein or peptide to be coupled can be a native protein or peptide, a recombinant or a synthetically produced one. Furthermore, the protein or peptide to be coupled can be modified or unmodified. Modifications mean mutations of the primary structure including deletions and insertions as well as amino acid exchanges, as well as chemical modifications such as the subsequent PEGylation, glycosylation or deglycosylation, the subsequent addition or insertion of cysteine residues etc. The same applies to the wearer and refers to both the insoluble carrier matrix and the bioactive molecule. According to the invention, the protein or peptide to be coupled retains at least 50% of the initial activity after it has been coupled. In preferred embodiments, however, the activity is 60% or 70%, particularly preferably 80% or 90% or even more than 90% of its starting activity.
  • the biological activity of the bioactive molecule also remains at least 50%.
  • Preferred embodiments also provide activities of 60 or 70%, preferably 80, 90 or more than 90%.
  • the method according to the invention allows the use of any protein glutamine: amine ⁇ -glutamyl transferase.
  • Bacterial transglutaminase, plant or mammalian transglutaminase are preferred.
  • Transglutaminases have also been described in mollusks and crustaceans and are likely to be ubiquitous.
  • the use of a bacterial transglutaminase is particularly preferred.
  • the best characterized bacterial transglutaminase is the transglutaminase from Streptoverticillium mobaraense.
  • the transglutaminase from guinea pig liver is preferably used.
  • An example of a mammalian transglutaminase with high substrate specificity is the blood coagulation factor XII l a .
  • the conditions for performing the transglutaminase-catalyzed coupling depend on the origin of the transglutaminase used.
  • a carrier for example an enzymatically crosslinked gelatin film (example 3)
  • the temperatures during the enzymatic linkage are preferably 25 to 55 ° C. and particularly preferably 30 to 45 ° C.
  • the reaction is at 37 ° C or 37 ° C + 5 ° C.
  • the incubation time is preferably between half a and 18 hours and is particularly preferably between 1 and 4 hours.
  • the pH of the buffered solution should be between pH 5 and 9; preferred ranges depend on the buffer system used and for most buffers are pH 6 to 8, particularly preferably pH 7 + . 0.5.
  • the following buffer solutions can be used as buffers:
  • Phosphate buffer pH 6.0 - 8.0, preferably pH 6.0 - 7.0
  • TRIS 1 -HCI buffer, pH 7.0 - 9.0, preferably pH 7.0 - 8.5
  • TRIS acetate pH 6.0 - 9.0, preferably pH 6.0
  • Tricin 2 -HCI buffer, pH 7.0 - 9.0, preferably pH 7.5
  • MOPS 3 buffer pH 6.0 - 8.0, preferably pH 7.5
  • TEA 4 buffer, pH 6.0 - 9.0, preferably pH 7.5
  • the preferred buffer is tricin-HCl buffer
  • the mammalian enzyme obtained from guinea pig liver gives the best results in TRIS-HCl buffer with EDTA, dithiotreitol and calcium ions.
  • the carrier-coupled protein immobilizates obtained have an unexpectedly high document density.
  • a gelatin protein A is obtained. Immobilisate with a coverage of at least 2 ng (50 fmol) protein A per mm 2 foil, if 1 ⁇ mol protein A and 2 g (approx. 4 dm 2 ) gelatin foil in Tris-acetate buffer, pH 6.0, with 50 nmol bacterial transglutaminase are incubated for 60 min at 37 ° C (Examples 4 and 5).
  • immobilized protein A still binds the maximum number of 2 antibody molecules of the IgG class. However, a higher document density may be achieved with this procedure.
  • the protein or peptide to be coupled can comprise more than one protein and / or peptide sequence.
  • several proteins or biologically active peptides can be immobilized in a very small space (multi-enzyme immobilization).
  • the optimal molar ratio of protein or peptide to carrier to be coupled can be determined experimentally according to the respective needs.
  • the mixing ratio for both compounds depends on the number of reactive groups, the molecular size and the intended use of the conjugate.
  • the molar ratio is usually 5: 1 to 1: 100 (protein or peptide to carrier to be coupled).
  • Preferred ranges are 1: 5 to 1:50 in the case of coupling to an insoluble support.
  • transglutamine substrate molecules ideally a glutamine donor (category 1) and a glutamine acceptor (category 2), are incubated with transglutaminase at pH 5-9 and temperatures of 20-60 ° C.
  • glutamine donor category 1
  • glutamine acceptor category 2
  • the preferred ratio of protein or peptide to be coupled to bioactive molecule is 1:20 to 5: 1.
  • the product can be purified if necessary by dialysis, ultrafiltration, precipitation or a chromatographic process.
  • One of the advantages of the method according to the invention is that the biological activity of the reactants is generally completely retained.
  • a further decisive advantage of the process according to the invention over a known chemical coupling can be seen above all in the fact that the expensive, unreacted starting compounds can be recovered by separation processes.
  • a conjugate with two different biological activities can be produced by crosslinking protein G (a category 2 protein, see also Table 3) with soy peroxidase (a category 3 protein) in a 1:20 ratio with transglutaminase (example 7).
  • Successful coupling can be checked by fixing antibodies of class G (IgG) that specifically bind protein G to a nitrocellulose membrane, applying the test solution and staining with 4-chloro-1-naphthol and hydrogen peroxide after several washing steps ("Dot - Blot ").
  • the conjugates formed are quantified using a microtiter plate assay (Example 8). Enrichment or complete purification of the protein G-peroxidase conjugates and recovery of the unreacted starting materials is achieved by chromatography on an anion exchanger (example 9) or by geipermeation chromatography.
  • the invention further relates to a carrier-coupled protein immobilizate and to a carrier-protein conjugate which can be obtained by the method according to the invention.
  • a preferred carrier-protein conjugate is a transglutaminase-catalyzed coupling obtained conjugate of monoclonal or polyclonal antibody and marker enzyme.
  • This marker enzyme can be, for example, alkaline phosphatase, horseradish peroxidase or any other marker enzyme known in the art.
  • the transglutamine-catalyzed coupling allows the connection of an antibody molecule with up to 20 enzyme molecules, which amplifies the signal, for example in subsequent ones Antigen-antibody reactions allowed. Oligomeric enzymes created by cross-linking also amplify the signal.
  • the invention also relates to the use of a carrier-coupled protein immobilizate or carrier-protein conjugate in the enzymatic analysis.
  • the substrate proteins listed in Table 3 can be coupled to an insoluble support and used for establishing a new transglutaminase activity assays, in particular for the development of a specific and sensitive analytical method for the determination of active Factor XIII a in human blood serum.
  • a microtiter plate is coated with a good transglutaminase substrate, eg casein. Binding sites that were still free were saturated with bovine serum albumin. After adding an enzyme that has reactive glutamine or lysine residues, e.g.
  • the transglutaminase sample or a comparison sample is pipetted in and incubated at pH 5 for 0.5 to 5 hours or longer, depending on the desired sensitivity to 9 and temperatures of 20-50 ° C.
  • the covalently bound enzyme fraction is quantitatively determined using a colorimetric enzyme reaction, for example in the case of alkaline phosphatase via the hydrolysis of para-nitrophenyl phosphate. If the substrate proteins protein A and protein G, avidin and streptavidin are used, a second incubation with antibody-enzyme conjugates or biotin-enzyme conjugates is necessary before a detection reaction can be carried out. This improves the sensitivity through a higher enzyme concentration on the microtiter plate, since protein A and protein G can bind up to 2, avidin and streptavidin up to 4 conjugate molecules.
  • a modification of the test can be that the coated microtiter plate is replaced by a cross-linked gelatin foil. This is then immersed in an enzyme solution, to which the transglutaminase sample is subsequently added becomes. After incubation and multiple washing, the gelatin strip can be used directly for the photometric measurement in a cuvette.
  • multi-enzyme immobilizates can be produced by sequential immobilization on supports, which can be used, for example, in a multi-stage synthesis of organic or biological compounds.
  • the multi-enzyme immobilizates prepared according to the invention are also suitable for diagnostic applications, for example for the determination of glycerol lipids after enzymatic release and oxidation of glycerol, and photometric measurement of the reduction equivalents formed in this reaction.
  • the protein immobilizates and carrier-protein conjugates according to the invention can also be used to produce biosensors.
  • Biosensor technology requires stable bioactive compounds that are fixed in the smallest possible space.
  • Active protein foils or other active insoluble protein complexes could offer advantages over soluble enzymes.
  • a biosensor could be constructed, the surface of which is coated with a specific antigen, for example hepatitis B surface virus protein. After the biosensor is brought into contact with a sample containing an unknown concentration of antibodies against HbsAg and a known concentration of a ⁇ ti-HbsAg-antibody-enzyme conjugate, the enzyme-conjugated antibodies compete with the antibodies to be determined for the binding sites.
  • the carrier-coupled protein immobilizates can be coated microtiter plates with biological activity. Active membranes, enzyme carriers and analytical test strips can also be produced using the protein immobilizates according to the invention. A large number of test strips are known in diagnostics and analysis, which are based on the activity of an enzyme immobilized on the test strip. Test strips are also increasingly used in the home. For example, a test stick was developed in Japan which, by enzymatically determining the proportion of carcassin on the surface of fish, allows a statement to be made about its freshness.
  • Figure 3 the determination of transglutaminase by covalent binding of alkaline phosphatase to a casein coated microtiter plate and subsequent hydrolysis of paranitrophenyl phosphate
  • Figure 4 shows the enrichment of protein G peroxidase conjugates by ion exchange chromatography on Fractogel EDM-TMAE 650 S.
  • Transglutaminase was derived from the culture supernatant of Streptoverticillium mobaraense as described by Gerber et al., Biochem. J. 299, 825-829 (1994), purified by chromatography on a strongly acidic ion exchanger and material. Polyacrylamide gel electrophoresis showed the enzyme as a single band with a specific activity greater than 30 U / mg when it was in accordance with that of Grossowicz et al., J. Biol. Chem. 187, 111-125 (1950), described method for hydroxamate formation with CBZ-glutaminylglycine was tested. Protein concentrations were determined using a standard bicinchoninic acid protocol as described by the manufacturer.
  • the protein solutions of the transglutaminase substrates described here are dissolved in the concentrations given in Tab. 2 in 0.02 M sodium phosphate buffer, pH 7.3.
  • Transglutaminase is obtained, for example, as described in Example 1 by cultivating Streptoverticillium mobaraense (DSM 40847) and enriched by ion exchange chromatography using a standard method (Gerber et al, Biochem. J. 299, 825-829 (1994)). The enzyme activity is determined according to the method of Grossowicz et al. (J. Biol. Chem. 187, 111-125 (1950)). The amount of enzyme used is given in Table 2.
  • the reagent solutions are mixed in the order of Table 3 and analyzed after a given incubation period.
  • Example 4 Production of a gelatin film with protein A activity
  • a crosslinked gelatin film (2 g dry matter) is heated to 37 ° C. in 70 ml 0.2 M Tris acetate buffer, pH 6.0. After adding 10 ml of 10 mM protein A in 0.2 M Tris acetate buffer, pH 6.0, and 20 ml of transglutaminase with activity 4 U / ml, the mixture is incubated at 37 ° C. for 60 min. The film is then washed twice with 100 ml of Tris acetate buffer, pH 6.0, air-dried and cut into strips (approx. 2 mg).
  • a rabbit anti-chicken antibody (IgG) conjugated to alkaline phosphatase (Sigma) is mixed with 0.05 M Tris-HCl buffer, pH 8.0, which is additionally 150 mM NaCI, 0.005% (v / v) Tween 20 and contains 0.09% (w / v) NaN 3 (AK binding buffer), diluted 1: 2000 to 1: 10000. With each dilution, a color reaction is carried out according to the scheme in Table 4. The calibration line is shown in Fig.1.
  • a 2 mg strip of gelatin protein A immobilizate is placed in AK binding buffer for 30 minutes to swell.
  • the well-drained aliquot is transferred to 100 ⁇ l of a 1: 2000 dilution of the antibody-alkaline-phosphatase conjugate and incubated at 37 ° C. for 10 min.
  • the color reaction is carried out according to the scheme in Table 4.
  • a crosslinked gelatin film without protein A is used for the comparison approach.
  • Fig. 2 shows the dependence of the protein A covering density on the concentration of the crosslinking enzyme.
  • 250 ⁇ l of a casein solution (1 mg / ml in coating buffer consisting of 40 mM Tris-HCl with 150 mM NaCl, pH 8.3) are pipetted into each well of a microtiter plate made of polystyrene.
  • the microtiter plates are kept at 4 ° C overnight incubated and remaining binding sites saturated with 250 ⁇ l of a 1% (w / v) bovine serum albumin solution in coating buffer.
  • Soybean peroxidase and protein G are dissolved in a molar ratio of 20: 1 in 0.3 M Tris-HCl buffer, pH 7.0. After adding transglutaminase (0.5 U / mg protein), the mixture is incubated at 37 ° C. for 18 h.
  • Example 8 Quantitative detection of a protein G-peroxidase conjugate
  • coating buffer consisting of 40 mM Tris-HCl with 150 mM NaCl, pH 8.3
  • a sample or reference sample eg conjugate mixture without transglutaminase
  • 100 ⁇ l of a sample or reference sample are pipetted into each well and incubated for 60 min at room temperature. It is then rinsed again three times with 200 ⁇ l of coating buffer.
  • a substrate solution is prepared from 2 ml of 0.1 M phosphate buffer, pH 6.0, 2 ml of a 5% (w / v) pyrogallol solution in H 2 O, 1 ml of 0.05% H 2 O 2 solution and 13 ml H 2 O. 100 ⁇ l of the substrate solution are pipetted into each well of the microtiter plate, and after 30 min the absorbance is measured at 405 nm.
  • Example 9 Enrichment of a protein-G-peroxidase conjugate and recovery of the starting materials
  • a 10x150 mm ion exchange column filled with Fractogel-EMD-TMAE-650 S (Merck) is equilibrated with five times the bed volume of 50 mM sodium phosphate buffer, pH 7.0. 1 ml of a protein-G-peroxidase conjugate mixture is pumped onto the column and the non-binding proteins (transglutaminase and protein G in this order) are rinsed off the column with equilibration buffer. The conjugates are then eluted within 60 min by linearly increasing the ion concentration with NaCl from 0 to 0.15 M. The highest conjugate concentrations are found in fractions at 0.08-0.12 M NaCI (Fig. 4).

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Abstract

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Transglutaminase-katalysierten Koppeln von Protein oder Peptid an einen Träger unter Erhalt von mindestens 50 % der biologischen Aktivität des Proteines oder Peptides, gemäß diesem Verfahren erhältliche, trägergekoppelte Proteinimmobilisate und Träger-Protein-Konjugate sowie die Verwendung der erfindungsgemäßen trägergekoppelten Proteinimmobilisate und Träger-Protein-Konjugate. Es ist bereits bekannt, Enzyme mit Trägermaterialien durch Transglutaminase-katalysierte Kopplung simultan zu immobilisieren. Dieses Verfahren ist jedoch für Enzyme mit polymeren Substratmolekülen nicht geeignet. Weitergehende Versuche, Enzyme mit polymeren Substraten an Ionenaustauschermaterial zu binden und mit Transglutaminase zu stabilisieren, hat zu Immobilisaten mit sehr niedriger Aktivität geführt. Das neue Verfahren ermöglicht die Herstellung von trägergekoppelten Proteinimmobilisaten und Träger-Protein-Konjugaten unter Erhalt von mindestens 50 % der biologischen Aktivität des Proteines oder Peptides. Erfindungsgemäß werden Proteine oder Peptide unter Transglutaminase-Einwirkung an einen Träger gekoppelt, indem der Träger mit dem zu koppelnden Protein oder Peptid und mit Transglutaminase in Kontakt gebracht wird, wobei der Träger und das Protein als Acyl- und/oder Amindonor wirken und als Transglutaminasesubstrat geeignet sind.

Description

Verfahren zum Transglutaminase-katalysierten Koppeln von Protein oder Peptid an einen Träger
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Transglutaminase- katalysierten Koppeln von Protein oder Peptid an einen Träger unter Erhalt von mindestens 50 % der biologischen Aktivität des Proteines oder Peptides, gemäß diesem Verfahren erhältliche trägergekoppelte Proteinimmobilisate und Träger- Protein-Konjugate sowie die Verwendung der erfindungsgemäßen trägergekoppelten Proteinimmobilisate und Träger-Protein-Konjugate.
Die kovalente Verknüpfung von Proteinen zu stabilen Aggregaten bzw. ihre kova- lente Bindung an Trägermaterialien sind wichtige Verfahren in der Medizintechnik, Lebensmitteltechnik und Diagnostik. Üblicherweise findet die Vernetzung mit chemischen Reagenzien statt, unter denen Glutardialdehyd eine herausragende Rolle spielt. Andere organische Verbindungen mit mindestens zwei reaktiven funktioneilen Gruppen (eine Ausnahme stellt Formaldehyd dar) können ebenfalls eingesetzt werden. Eine stabile Bindung läßt sich auch dadurch erreichen, daß ein Protein vor der Kopplung mit einem zweiten Protein chemisch aktiviert wird. Eine gängige Methode ist beispielsweise die Oxidation von Glykoproteinen mit Periodsäure unter Öffnung eines Zuckerrings und Erzeugung reaktiver Carbonyl- funktionen. Bei Immobilisierungsverfahren besitzt meistens das Trägermaterial schon eine geeignete reaktive Gruppe für die Ausbildung einer kovalenten Bindung zwischen Protein und Trägermatrix, z.B. eine Oxirangruppe.
Die Proteinkopplung mit chemischen Vernetzungsmitteln verläuft durch die hohe Reaktivität der funktionellen Gruppen in der Regel unter milden Reaktionsbedingungen, d.h. in neutralem Milieu und bei Raumtemperatur. Diese Verfahrensparameter sind auch notwendig, um eine weitgehende Denaturierung der Biomoleküle und damit einhergeheπd den Verlust der biologischen Aktivität zu vermeiden. Dennoch läßt sich bei Verwendung chemischer Reagenzien eine Desakti- vierung der Proteine nicht verhindern, und in vielen Fällen kommt es zu hohen Verlusten an biologischer Aktivität. Die wesentliche Ursache für den Aktivitätsver- lust muß in der vollkommen unkontrollierten und unspezifischen Reaktion zwischen chemischem Reagenz und Protein gesehen werden.
Es ist bereits bekannt, daß Transglutaminasen (Protein-Glutamin: Amin-^- glutamyltransferase E.C. 2.3.2.13) den Aufbau stabiler Querbrücken zwischen Proteinen spezifisch katalysieren. Dabei wird die γ-Carboxamidfunktion von Glutaminseitenketten auf die ε-Aminogruppe von Lysinresten unter Freisetzung von Ammoniumionen übertragen (Folk und Finlaysoπ, Adv. Protein Chem. 31 , 1 - 133 (1977)). Die neu gebildete Isopeptidbindung hält auch einer Hydrolyse durch Proteasen stand und wird physiologisch erst nach vollständigem Abbau der Proteine durch eine γ-Glutamylamin-Cyclotransferase gespalten (Fink et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77, 4564-4568 (1980)).
Transglutaminasen wurden im Stand der Technik bereits zum Immobilisieren von Enzymen verwendet. Beispielsweise beschreibt die JP 59 66 886 ein Verfahren, bei dem Trägermaterial und zu koppelndes Protein zum Herstellen von Pro- teinimmobilisaten simultan ausgefällt werden (simultanes Immobilisieruπgsverfah- ren). Dazu wurden verschiedene Enzyme (Glucoseoxidase, Katalase, Diaphora- se, RNase, Glucosidase, Mannosidase, Glutamatdehydrogenase) mit >2% (w/v) Trägermaterial in einer gepufferten Lösung vernetzt. Dieses Verfahren wurde auch erfolgreich zum Herstellen aktiver Caseinmembraneπ verwendet (JP 61 227 783 und Motoki et al., Agric. Biol. Chem. 51 , 997-1002 (1987)), indem die Proteinlösung unmittelbar nach Zugabe der Enzyme auf eine Vinyl- oder Polymethacry- latplatte aufgebracht und an der Luft bei 37-40°C getrocknet wurde. Man erhielt auf diese Weise eine zugfeste Membran oder Folie. Ein Nachteil dieses Verfahrens ist jedoch die geringe spezifische Aktivität des erhaltenen Proteinimmobilisa- tes. Die Immobilisatausbeuten variieren zwischen <1 % (Glucoseoxidase) und 30% (ß-Galactosidase), bezogen auf die Ausgangsaktivität. Die Abhängigkeit der Immobilisatausbeute von Proteinkoπzentration und Quervemetzungsgrad wurde von Fuchsbauer et al. (Biomaterials 17, 1481 -1488 (1996)) am Beispiel von ß- Galactosidase aus Aspergillus orvzae mit dem Trägerprotein Gelatine untersucht. Die höchsten Immobilisatausbeuten (30-46% der Ausgangsaktivität) konnten mit einer 10-15% Gelatinelösung von hoher Gallertfestigkeit, vernetzt mit 2 mE Transglutaminase pro mg Protein, erzielt werden.
Ein weiterer Nachteil des simultanen Immobilisierungsverfahrens ist es, daß dieses nur für Enzyme mit kleinen Substratmolekülen geeignet ist, die ungehindert in die Trägermatrix eindringen können, da die Enzyme in der Matrix eingeschlossen vorliegen. Größere bzw. polymere Substratmoleküle können in die Trägermatrix nicht eindringen, so daß eine enzymatische Reaktion nicht stattfinden kann. Dieses Problem versuchten Kamata et al. (JP 06 46 855 von 1992 und Biosci. Biotech. Biochem. 56, 1323-1324 (1992)) dadurch zu lösen, daß sie Enzyme mit polymeren Substraten (Trypsin, -Amylase) an ein ionenaustauschermaterial banden und anschließend mit Transglutaminase anstelle von Glutardialdehyd stabilisierten. Reaktionsansätze zur Stabilisierung von α-Amylase-lmmobilisaten mit pH-Werten von 6 bis 8 lieferten jedoch trotz sehr hoher Transglutaminase- konzentrationen (280 mE/mg) keine aktiven Immobilisate. α-Amylase hatte nach einer Immobilisierung an zwei unterschiedlichen loπenaustauschermaterialien und Transglutaminase-katalysierter Stabilisierung bei pH 4 und pH 9 bis 1 1 die höchste Restaktivität (1 ,5-3%). Diese Restaktivität kann wahrscheinlich nicht auf eine Stabilisierung durch Transglutaminase zurückgeführt werden, da Transglutaminase nur im Bereich von pH 5 bis pH 9 aktiv ist. Die Rolle von Transglutaminase bei diesem Verfahren bleibt also unklar.
Aufgabe der Erfindung ist es daher, ein Verfahren bereitzustellen, mit dem Proteine oder Peptide unter Erhalt ihrer biologischen Aktivität an einen Träger gekoppelt werden können.
Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch ein Verfahren zum Transglutaminase-katalysierten Koppeln von Protein oder Peptid an einen Träger unter Erhalt von mindestens 50 % der biologischen Aktivität des Proteines oder Peptides gelöst, wobei der Träger ein bioaktives Molekül oder eine vorgegebene unlösliche Matrix ist, umfassend den Schritt des Inkontaktbringens des Trägers mit dem zu koppelnden Protein und mit Transglutaminase, wobei der Träger und das Protein oder Peptid als Acyl- und/oder Amindonor wirken und als Transglutaminase- substrat geeignet sind.
Unter "biologischer Aktivität" des Proteines oder Peptides ist dabei die jeweilige enzymatische Aktivität von Enzymen, die Antikörper-Bindungsaktivität von Antikörpern, die inhibierende Aktivität von Inhibitoren und die Antigenizität von Antigenen zu verstehen. Im Einklang mit dieser Definition können nicht nur vollständige Proteine, sondern auch Proteinfragmente oder Peptide biologisch aktiv sein.
Durch das erfindungsgemäße Verfahren lassen sich Protein- oder Peptid- Immobilisate und -Konjugate mit allen von einer Transglutaminase akzeptierten Trägern herstellen. Für die Kopplung benötigen Proteine und Peptide Glutamin- und/oder Lysinreste, die für Transglutaminase zugänglich sind. Andere Verbindungen sowie modifizierte Proteine oder Peptide müssen mindestens eine Säu- reamidfunktion oder eine primäre Amingruppe besitzen. Auch eignen sich Proteine und andere Verbindungen als Ausgangsmaterialien für die enzymatische Vernetzung, wenn diese zuvor durch Verlängerung mit einer Oligo- oder Poly- glutaminylkette, einem Glutaminylpeptid, einer Oligo- oder Polylysinkette oder einem primären Amin unter Zuhilfenahme von chemischen und/oder molekularbiologischen Methoden modifiziert worden sind.
Es wird empfohlen, daß vor der enzymatischen Vernetzungsreaktion mit Transglutaminase alle Reaktionspartner, also der Träger sowie das zu koppelnde Protein oder Peptid, auf ihre Eignung als Enzymsubstrat überprüft werden bzw. Reaktionspartner verwendet werden, deren Eignung als Transglutaminase-Substrat bekannt ist. Die Eignung als Transglutaminase-Substrat kann durch den Einbau von in der Regel fluoreszierenden Transglutamiπase-Substraten festgestellt wer- den. Es wird dabei zwischen Acyl- bzw. Glutamindonoren einerseits und Amindo- noren (Glutaminakzeptoreπ) andererseits unterschieden.
Für den Nachweis reaktiver Carboxamidgruppen kann beispielsweise die von Lorand et al. (Anal. Biochem. 44, 207-220 und 221-231 (1971 )) eingeführte fluoreszierende Verbindung 5-N-(5'-N'-N'-Dimethylaminonaphthalinsulfonyl)amido- pentylamin verwendet werden. Diese Verbindung weist die folgende Formel (I) auf:
Figure imgf000007_0001
Die Identifizierung reaktiver Amine in einem breit angelegten Screening-Prozeß wurde erst mit der Synthese des Dipeptids 1-N-(Carbobenzoxy-L-glutaminyl- glycyl)-5-N-(5'-N'-N'-Dimethylaminonaphthalinsulfonyl)diamidopentan möglich, die 1997 durch Pasternack et al. (Anal. Biochem., 249, 54-60 (1997)) eingeführt wurde. Die Verbindung weist die folgende chemische Formel (II) auf:
Figure imgf000007_0002
Bei Proteinen sollten zwei verschiedene Inkubationsansätze je Protein durchgeführt werden (Beispiel 2). Der eine enthält neben Transglutaminase ein markiertes Amiπ, z.B., C-DNS(I), das zur Bestimmung reaktiver Glutaminreste geeignet ist, der andere ein markiertes Säureamid, z.B. CBZ-Gln-Gly-C-DNS(II), zur Bestimmung reaktiver Lysinseitenketten.
Die Proteine werden nach der Inkubation elektrophoretisch aufgetrennt und anschließend durch Bestrahlung mit UV-Licht der Wellenlänge 366 πm sichtbar ge- macht. Um Fehlinterpretationen bei unbekannten oder stark verunreinigten Proteinpräparaten zu vermeiden, wird empfohlen, nach UV-Bestrahlung des Eiektro- phoresegels und Dokumentation eine Silber- oder Coomassie-Färbung des Gels vorzunehmen. Peptide und andere kleine Moleküle können durch Chromatographie, z.B. analytische HPLC, vom Überschußreagenz getrennt und über ihre Emission als Transglutaminase-Substrat erkannt werden. Prinzipiell lassen sich aber auch radioaktive oder biotinylierte Markierungsreagenzien (z.B. Biotinylami- dopentylamin der Fa. Pierce) für die Vorversuche einsetzen. Der Nachweis einer erfolgreichen Markierung erfolgt dann nach der Auftrennung durch Autoradiogra- phie oder mit Avidin-/Streptavidin-Enzym-Konjugaten.
Unmodifizierte Proteine lassen sich so in vier Kategorien einordnen:
- Glutamindonoren: Proteine mit ausschließlich reaktiven Glutaminresten (Kategorie 1);
- Glutaminakzeptoren: Proteine mit ausschließlich reaktiven Lysinresten (Kategorie 2);
- Glutamindonoren und -akzeptoren: Proteine mit reaktiven Glutamin- und Lysinresten (Kategorie 3);
- Proteine ohne reaktive Glutamin- und Lysinreste im nativen Zustand (Kategorie 4).
Tabelle 1 zeigt beispielhaft wichtige bioaktive Proteine mit reaktiven Seitenketten, die als Transglutaminasesubstrate dienen können. Prinzipiell können mit dem beschriebenen Testverfahren auch andere Biopolymere sowie synthetische Polymere als Transglutaminasesubstrate erkannt werden. TABELLE 1
Figure imgf000009_0001
Das erfinduπgsgemäße Verfahren kann mit jeder Art von Acyl- und/oder Amiπdo- nor durchgeführt werden, vorausgesetzt, dieser ist als Transglutaminasesubstrat geeignet, was, wie oben dargelegt, getestet werden kann. In bevorzugten Ausführungsformen ist das zu koppelnde Protein oder Peptid ein Glutamindonor und der Träger umfaßt reaktive Amingruppen. In einer alternativen Ausführungsform ist das zu koppelnde Protein oder Peptid ein Glutaminakzeptor und der Träger stellt reaktive Carboxamidgruppen zur Verfügung. Im Falle von Proteinen mit reaktiven Glutamin- und Lysinseitenketten kann der Träger Amingruppen oder Carboxamidgruppen oder Amin- und Carboxamidgruppen enthalten. Selbstverständlich kann es sich bei dem Träger auch um ein Protein handeln, so daß die reaktiven Amingruppen des Trägers beispielsweise auch Lysinseitenketten, die reaktiven Carboxamidgruppen des Trägers reaktive Glutaminseitenketten sein können.
Erfindungsgemäß kann es sich bei dem Träger um ein in Lösung vorliegendes bioaktives Molekül handeln. Bevorzugt ist das bioaktive Molekül ein Enzym. Die Kopplung eines Proteines oder Peptides an ein Enzym dient beispielsweise der Bereitstellung von Molekülen mit zwei unterschiedlichen eπzymatischen Aktivitäten. Die Vernetzung zweier Moleküle kann außerdem für die Bereitstellung von Proteindimeren oder höheren Aggregationsformen, die zum Beispiel als Ligand eines Rezeptors eine biologische Aktivität haben, sinnvoll sein. In jedem Fall müssen von mindestens einem Reaktionspartner reaktive Amine und von mindestens einem weiteren Reaktionspartner reaktive Carboxamidgruppen zur Verfügung gestellt werden.
In einer weiteren Ausführungsform handelt es sich bei dem Träger um eine vorgegebene unlösliche Matrix. Die enzymatische Vernetzung von Proteinen, zum Beispiel von Gelatine und Casein, führt zu guten Trägern, die auch bei Temperaturen oberhalb von 100°C stabil bleiben. Vernetzte Proteine sind als unlösliche Matrix bevorzugt.
Das zu koppelnde Protein oder Peptid kann ein natives Protein oder Peptid sein, ein rekombinantes oder ein synthetisch hergestelltes. Weiter kann das zu koppelnde Protein oder Peptid modifiziert oder unmodifiziert vorliegen. Unter Modifikationen sind dabei sowohl Mutationen der Primärstruktur einschließlich von De- letionen und Insertioneπ sowie Aminosäureaustausche zu verstehen, als auch chemische Modifikationen, wie die nachträgliche PEGylierung, Glykosylierung oder Deglykosylieruπg, das nachträgliche An- bzw. Einfügen von Cysteinresten etc. Gleiches gilt für den Träger und bezieht sich sowohl auf die unlösliche Trägermatrix als auch auf das bioaktive Molekül. Erfindungsgemäß behält das zu koppelnde Protein oder Peptid nach seiner Kopplung mindestens 50 % der Ausgangsaktivität bei. In bevorzugten Ausführungsformen beträgt die Aktivität jedoch 60 % oder 70 %, besonders bevorzugt 80 % oder 90 % oder sogar mehr als 90 % seiner Ausgangsaktivität.
Bei der Herstellung eines Konjugates aus bioaktiven Molekülen und zu koppelndem Protein oder Peptid ist es bevorzugt, daß die biologische Aktivität des bioaktiven Moleküles ebenfalls mindestens zu 50 % bestehen bleibt. Bevorzugte Ausführungsformeπ sehen hier ebenfalls Aktivitäten von 60 oder 70 %, bevorzugt 80, 90 oder mehr als 90 % vor.
Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt die Anwendung jeder Protein-Glutamin: Amin-γ-glutamyltransferase. Bevorzugt sind bakterielle Transglutaminase, Pflanzen- oder Säugertransglutaminase. Transglutaminasen sind auch in Mollusken und Krustazeen beschrieben worden und sind wahrscheinlich ubiquitär. Besonders bevorzugt ist die Verwendung einer bakteriellen Transglutaminase. Die am besten charakterisierte bakterielle Transglutaminase ist die Transglutaminase aus Streptoverticillium mobaraense.
Im Fall der Durchführung mit Säugertransglutaminase wird bevorzugt die Transglutaminase aus Meerschweiπchenleber verwendet. Die bisher untersuchten Säugertransglutaminasen reagieren jedoch schwächer als bakterielle Transglutaminasen und haben teilweise eine höhere Substratspezifität. Ein Beispiel für eine Säugertransglutaminase mit hoher Substratspezifität ist der Blutgerinnungsfaktor XII la.
Die Bedingungen für die Durchführung der Transglutaminase-katalysierten Kopplung richten sich nach der Herkunft der verwendeten Transglutaminase. Bei Verwendung einer bakteriellen Transglutaminase erfolgt die Traπsglutaminase- katalysierte Verknüpfung eines Proteins oder Peptids mit einem Träger, z.B. einer enzymatisch vernetzten Gelatinefolie (Beispiel 3), bei 20-60°C innerhalb von 24 Stunden in einer gepufferten Lösung bei pH-Werten von 5 bis 9. Die Temperaturen während der enzymatischen Verknüpfung betragen dabei bevorzugt 25 bis 55°C und besonders bevorzugt 30 bis 45 °C. In der am höchsten bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Reaktion bei 37°C oder 37°C + 5°C. Die Inkubationszeit bewegt sich bevorzugt zwischen einer halben und 18 Stunden und beträgt besonders bevorzugt zwischen 1 und 4 Stunden. Der pH-Wert der gepufferten Lösung sollte zwischen pH 5 und 9 liegen; bevorzugte Bereiche hängen vom verwendeten Puffersystem ab und liegen für die meisten Puffer bei pH 6 bis 8, besonders bevorzugt pH 7 +.0,5. Als Puffer können folgende Pufferlösungen verwendet werden:
Phosphatpuffer, pH 6,0 - 8,0, bevorzugt pH 6,0 - 7,0
TRIS1)-HCI-Puffer, pH 7,0 - 9,0, bevorzugt pH 7,0 - 8,5
TRIS-Acetat, pH 6,0 - 9,0, bevorzugt pH 6,0
Tricin2)-HCI-Puffer, pH 7,0 - 9,0, bevorzugt pH 7,5
MOPS3)-Puffer, pH 6,0 - 8,0, bevorzugt pH 7,5
TEA4)-Puffer, pH 6,0 - 9,0, bevorzugt pH 7,5
Dabei bedeutet:
1) TRIS = Tris(hydroxymethyl)aminomethan
2) Tricin = N-[Tris(hydroxymethyl)methylglycin]
3) MOPS = 3-N-Morpholinopropansulfonsäure
4) TEA = Triethanolamin
Bei Verwendung von bakterieller Transglutaminase aus Streptoverticillium moba- raense ist der bevorzugte Puffer Tricin-HCI-Puffer, während das aus Meer- schweiπchenleber gewonnene Säugerenzym die besten Ergebnisse in TRIS-HCI- Puffer mit EDTA, Dithiotreitol und Calciumionen erbringt.
Die erhaltenen Träger-gekoppelten Proteinimmobilisate weisen eine unerwartet hohe Belegdichte auf. Man erhält beispielsweise ein Gelatine-Protein-A- Immobilisat mit einer Belegdichte von mindestens 2 ng (50 fmol) Protein A pro mm2 Folie, wenn 1 μmol Protein A und 2 g (ca. 4 dm2) Gelatinefolie in Tris-Acetat- Puffer, pH 6,0, mit 50 nmol bakterieller Transglutaminase für 60 min bei 37°C inkubiert werden (Beispiel 4 und 5). Bei der Berechnung der Belegdichte wurde davon ausgegangen, daß immobilisiertes Protein A noch die maximale Zahl von 2 Antikörpermolekülen der Klasse IgG bindet. Möglicherweise wird aber eine höhere Belegdichte mit diesem Verfahren erreicht.
Erfindungsgemäß kann das zu koppelnde Protein oder Peptid mehr als eine Protein- und/oder Peptidsequenz umfassen. Wie in einem Multienzymkomplex können so mehrere Proteine oder biologisch aktive Peptide auf engstem Raum immobilisiert werden (Multi-Enzymimmobilisat).
Das optimale molare Verhältnis von zu koppelndem Protein oder Peptid zu Träger kann den jeweiligen Bedürfnissen entsprechend jeweils experimentell bestimmt werden. Das Mischungsverhältnis für beide Verbindungen hängt von der Anzahl reaktiver Gruppen, der Molekύlgröße und der beabsichtigten Verwendung des Konjugats ab. Üblicherweise beträgt das molare Verhältnis 5:1 bis 1 :100 (zu koppelndes Protein oder Peptid zu Träger). Bevorzugte Bereiche sind dabei im Fall einer Kopplung an einen unlöslichen Träger 1 :5 bis 1 :50.
Zum Herstellen von Koπjugaten mit unterschiedlichen biologischen Aktivitäten werden mindestens zwei verschiedene Transglutamiπase-Substratmoleküle, idealerweise ein Glutamindonor (Kategorie 1 ) und ein Glutaminakzeptor (Kategorie 2), mit Transglutaminase bei pH 5-9 und Temperaturen von 20-60°C inkubiert. Im Fall der Bildung von Träger-Protein-Koπjugaten ist das bevorzugte Verhältnis von zu koppelndem Protein oder Peptid zu bioaktivem Molekül 1 :20 bis 5:1.
Nach Beendigung der Reaktion kann das Produkt bei Bedarf durch Dialyse, Ultrafiltration, Fällung oder ein chromatographisches Verfahren gereinigt werden. Zu den Vorteilen des erfindungsgemäßen Verfahrens zählt es, daß die biologische Aktivität der Reaktionspartner in der Regel vollständig erhalten bleibt. Ein weiterer entscheidender Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens gegenüber einer bekannten chemischen Kopplung ist vor allem darin zu sehen, daß durch Trennverfahren die teuren, nicht umgesetzten Ausgangsverbindungen zurückgewonnen werden können. So kann beispielsweise ein Konjugat mit zwei unterschiedlichen biologischen Aktivitäten hergestellt werden, indem man Protein G (ein Protein der Kategorie 2, siehe auch Tabelle 3) mit Soja-Peroxidase (ein Protein der Kategorie 3) im Verhältnis 1 :20 mit Transglutaminase vernetzt (Beispiel 7). Eine erfolgreiche Kopplung kann dadurch überprüft werden, daß man Antikörper der Klasse G (IgG), die Protein G spezifisch binden, auf einer Nitrozellulosemembraπ fixiert, die Testlösung aufbringt und nach mehreren Waschschritten mit 4-Chlor-1 -naphthol und Wasserstoffperoxid anfärbt ("Dot- Blot"). Eine quantitative Erfassung der gebildeten Konjugate erfolgt über einen Mikrotiterplatten-Assay (Beispiel 8). Eine Anreicherung bzw. vollständige Reinigung der Protein G-Peroxidase-Konjugate sowie die Rückgewinnung der nicht umgesetzten Ausgangsmaterialien wird durch Chromatographie an einem Anio- nenaustauscher (Beispiel 9) oder durch Geipermeationschromatographie erreicht.
Die Erfindung bezieht sich weiterhin auf ein trägergekoppeltes Proteinimmobilisat sowie auf ein Träger-Protein-Konjugat, die durch das erfindungsgemäße Verfahren erhältlich sind.
Ein bevorzugtes Träger-Protein-Konjugat ist ein durch Transglutaminase katalysierte Kopplung erhaltenes Konjugat aus moπoklonalem oder polyklonalem Antikörper und Markerenzym. Bei diesem Markerenzym kann es sich beispielsweise um alkalische Phosphatase, Meerrettichperoxidase oder jedes andere im Stand der Technik bekannte Markerenzym handeln. Dabei erlaubt die Transglutamina- se-katalysierte Kopplung die Verbindung eines Antikörpermoleküls mit bis zu 20 Eπzymmolekülen, was die Amplifizierung des Signaies z.B. bei nachfolgenden Antigen-Antikörper-Reaktionen erlaubt. Auch durch Vernetzung entstandene oli- gomere Enzyme verstärken das Signal.
Die Erfindung bezieht sich auch auf die Verwendung eines trägergekoppelten Proteinimmobilisates oder Träger-Protein-Konjugates in der enzymatischen Analyse.
Beispielsweise können die in Tabelle 3 aufgelisteten Substratproteine an einen unlöslichen Träger gekoppelt und zur Etablierung eines neuen Transglutamina- se-Aktivitätstests herangezogen werden, insbesondere zur Entwicklung eines spezifischen und sensitiven Analyseverfahrens zur Bestimmung von aktivem Faktor Xllla in humanem Blutserum. Dafür wird eine Mikrotiterplatte mit einem guten Transglutaminase-Substrat, z.B. Casein, beschichtet. Noch freie Bindungsstellen wurden mit Rinderserumalbumin abgesättigt. Nach Zugabe eines Enzyms, das über reaktive Glutamin- oder Lysinreste verfügt, z.B. alkalische Phosphatase (Beispiel 6), pipettiert man die Transglutaminaseprobe oder eine Vergleichsprobe zu und inkubiert 0,5 bis 5 Stunden oder auch länger, je nach gewünschter Empfindlichkeit, bei pH 5 bis 9 und Temperaturen von 20-50°C. Der kovalent gebundene Enzymanteil wird nach mehrfachem Waschen über eine co- lorimetrische Enzymreaktion quantitativ bestimmt, bei alkalischer Phosphatase beispielsweise über die Hydrolyse von para-Nitrophenylphosphat. Bei Verwendung der Substratproteine Protein A und Protein G, Avidin und Streptavidin ist eine zweite Inkubation mit Aπtikörper-Enzym-Konjugaten bzw. Biotin-Enzym- Konjugaten notwendig, bevor eine Nachweisreaktion durchgeführt werden kann. Dies verbessert die Sensitivität durch eine höhere Enzymkonzentration auf der Mikrotiterplatte, da Protein A und Protein G bis zu 2, Avidin und Streptavidin bis zu 4 Konjugatmoleküle binden können.
Eine Abwandlung des Tests kann darin bestehen, daß die beschichtete Mikrotiterplatte durch eine vernetzte Gelatinefolie ersetzt ist. Diese wird dann in eine Eπzymiösung eingetaucht, der nachfolgend die Transglutaminaseprobe zugesetzt wird. Nach Inkubation und mehrfachem Waschen kann der Gelatinestreifen direkt für die photometrische Messung in einer Küvette verwendet werden.
Weitere erfindungsgemäße Verwendungen sehen die Verwendung als Proteinmodul in oligomerer oder polymerer Form zum Herstellen von Folgeprodukten vor. So können mit dem erfindungsgemäßen Verfahren durch sequenzielle Immobilisierung an Trägern Multi-Enzymimmobilisate hergestellt werden, die beispielsweise bei einer Mehrstufensynthese von organischen oder biologischen Verbindungen eingesetzt werden können. Die erfindungsgemäß hergestellten Multi-Enzymimmobilisate eignen sich auch für diagnostische Anwendungen, beispielsweise für die Bestimmung von Glycerinlipiden nach enzymatischer Freisetzung und Oxidation von Glycerin, und photometrischer Messung der bei dieser Reaktion gebildeten Reduktionsäquivalente.
Die erfindungsgemäßen Proteinimmobilisate und Träger-Protein-Konjugate können auch zum Herstellen von Biosensoren verwendet werden. Für die Biosensortechnik benötigt man stabile bioaktive Verbindungen, die möglichst auf engstem Raum fixiert sind. Aktive Proteiπfolien oder andere aktive unlösliche Proteinkomplexe könnten hierbei Vorteile gegenüber löslichen Enzymen bieten. So könnte beispielsweise ein Biosensor konstruiert werden, dessen Oberfläche mit einem bestimmten Aπtigen, beispielsweise Hepatitis-B-Oberflächenvirusprotein, belegt ist. Nach Inkontaktbringen des Biosensors mit einer Probe, enthaltend eine unbekannte Konzentration von Antikörpern gegen HbsAg und eine bekannte Konzentration aπti-HbsAg-Antikörper-Enzymkonjugat konkurrieren die enzymkonjugierten Antikörper mit den zu bestimmenden Antikörpern um die Bindungsstellen. Nach Besetzung der Bindungsstellen am Biosensor ist ein elektrisches Signal, das durch das Enzym erzeugt wird, umgekehrt proportional zur unbekannten Antikörperkonzentrationen. Der Biosensor kann durch Freisetzen der Antikörper regeneriert werden. Erfindungsgemäß können die Träger-gekoppelten Proteinimmobilisate beschichtete Mikrotiterplatteπ mit biologischer Aktivität sein. Weiter können aktive Membranen, Enzymcarrier und analytische Teststreifen unter Verwendung der erfindungsgemäßen Proteinimmobilisate hergestellt werden. In der Diagnostik und Analytik sind eine Vielzahl von Teststreifen bekannt, die auf der Aktivität eines an dem Teststreifen immobilisierten Enzymes beruhen. Teststreifen finden zunehmend auch im häuslichen Bereich Verwendung. So wurde z.B. in Japan ein Teststäbchen entwickelt, das durch die enzymatische Bestimmung des Kada- verinanteils an der Oberfläche von Fisch eine Aussage über dessen Frische erlaubt.
Im folgenden wird die Erfindung anhand der beigefügten Abbildungen und der Beispiele im einzelnen beschrieben.
Dabei zeigt
Abbildung 1 eine Eichgrade für ein Kanincheπ-anti-Huhn-IgG alkalische Phos- phatasekonjugat,
Abbildung 2 die Bindung von Protein A an eine Gelatinefolie in Abhängigkeit von der Konzentration des Vernetzungsenzyms,
Abbildung 3 die Bestimmung von Transglutaminase durch kovalente Bindung von alkalischer Phosphatase an eine mit Casein beschichtete Mikrotiterplatte und nachfolgender Hydrolyse von Paranitrophenylphosphat, und
Abbildung 4 die Anreicherung von Protein G Peroxidasekonjugaten durch lonen- austauschchromatographie an Fractogel EDM-TMAE 650 S. Beispiele
Beispiel 1: Erzeugung von bakterieller Transglutaminase
Transglutaminase wurde aus dem Kulturüberstand von Streptoverticillium moba- raense, wie von Gerber et al., Biochem. J. 299, 825-829 (1994), beschrieben, durch Chromatographie an einem stark sauren Ionenaustauscher und Material gereinigt. Die Polyacrylamid-Gelelektrophorese zeigte das Enzym als eine einzelne Bande mit einer spezifischen Aktivität von mehr als 30 E/mg, wenn es im Einklang mit dem von Grossowicz et al., J. Biol. Chem. 187, 111 -125 (1950), beschriebenen Verfahren auf Hydroxamatbildung mit CBZ-Glutaminylglycin getestet wurde. Die Proteinkonzentrationen wurden unter Verwendung eines Bicinchonin- säure-Standardprotokolls, wie vom Hersteller beschrieben, bestimmt.
Beispiel 2: Identifizierung von Proteinen als Transglutaminase-Substrate
a) Proteinlösungen
Die Proteinlösungen der hier beschriebenen Transglutaminase-Substrate werden mit den in Tab. 2 angegebenen Konzentrationen in 0,02 M Natriumphosphatpuffer, pH 7.3, gelöst.
Tabelle 2
Figure imgf000019_0001
b) 22 mM C-DNS-Lösung
22 μmol C-DNS (Sigma) werden in 27 μl 1 M HCI und 150 μl 0,2 M Tris-Acetat- Puffer, pH 6.0, gelöst. Nachfolgend wird mit bidest. H2O auf 1 ml aufgefüllt.
c) 4 mM CBZ-Gln-Glv-C-DNS-Lösung
12 μmol CBZ-Gln-Gly-C-DNS (Synthese siehe Pasternack et al., Anal. Biochem. 249, 54-60 (1997)) werden in 300 μl DMSO gelöst und mit 2.7 ml 0,01 M HCI verdünnt.
d) Transglutaminaselösung
Transglutaminase wird beispielsweise wie in Beispiel 1 beschrieben durch Kultivierung von Streptoverticillium mobaraense (DSM 40847) gewonnen und durch lonenaustauschchromatographie nach einem Standardverfahren (Gerber et al, Biochem. J. 299, 825-829 (1994)) angereichert. Die Enzymaktivität wird nach der Methode von Grossowicz et al. (J. Biol. Chem. 187, 111-125 (1950)) bestimmt. Die verwendete Enzymmenge ist in Tab. 2 angegeben.
e) Elektrophorese-Auftragspuffer
2 g Harnstoff werden in einer Mischung aus 2 ml 20 % (w/v) Natriumdodecylsulfat (SDS), 2 ml Glycerin, 2 ml gesättigter Bromphenolblaulösung und 2 ml bidest. H2O gelöst. f) Reaktionsansätze
Die Reagenzlösungen werden in der Reihenfolge von Tab. 3 gemischt und nach einer vorgegebenen Inkubationszeit analysiert.
Tabelle 3
Figure imgf000021_0001
g) Analytik
Jede Probe wird nach der Methode von Laemmli (Nature 227, 680-685 (1970)) auf 12,5 %igen Polyacrylamidgelen mit 5 %igen Obergelen elektrophoretisch aufgetrennt und vor der Silberfärbung nach der Methode von Blum et al. (Electrophoresis 8, 93-99 (1987)) mit UV-Licht der Wellenlänge 366 πm untersucht. Einige Ergebnisse sind in Tab. 1 (s.o.) aufgeführt.
Beispiel 3: Herstellung einer hitzestabilen Gelatinefolie
2 g Gelatine mit einer Gallertfestigkeit von 250-300 g Bloom werden mit 8 g H2O übergössen und nach 30 min bei 60 °C gelöst. Die auf 50 °C abgekühlte Gelatinelösung wird mit Transglutaminase (0,5 E/g Gelatine) versetzt und sofort in eine Foliengießvorrichtung (Folienmaschine oder Gießkammer) übergeführt. Nach 30 min wird die erstarrte Folie abgelöst und an der Luft über Nacht getrocknet.
Beispiel 4: Herstellung einer Gelatinefolie mit Protein-A-Aktivität
Eine vernetzte Gelatinefolie (2 g Trockenmasse) wird in 70 ml 0,2 M Tris-Acetat- Puffer, pH 6,0, auf 37 °C erwärmt. Nach Zugabe von 10 ml 10 mM Protein A in 0,2 M Tris-Acetat-Puffer, pH 6,0, und 20 ml Transglutaminase der Aktivität 4 E/ml inkubiert man 60 min bei 37 °C. Anschließend wird die Folie zweimal mit 100 ml Tris-Acetat-Puffer, pH 6,0, gewaschen, an der Luft getrocknet und in Streifen (ca. 2 mg) geschnitten.
Beispiel 5: Ermittlung der Protein-A-Aktivität
a) Eichkurve für ein Antikörper-Alkalische-Phosphatase-Konjugat
Ein Kaninchen-anti-Huhn-Antikörper (IgG) konjugiert mit Alkalischer Phosphatase (Sigma) wird mit 0,05 M Tris-HCI-Puffer, pH 8,0, der zusätzlich 150 mM NaCI, 0,005 % (v/v) Tween 20 und 0,09 % (w/v) NaN3 enthält (AK-Bindungspuffer), 1 :2000 bis 1 :10000 verdünnt. Mit jeder Verdünnung wird eine Farbreaktion nach dem Schema von Tab. 4 durchgeführt. Die Eichgerade zeigt Abb.1.
Tabelle 4
Figure imgf000023_0001
b) Protein-A-Nachweis
Ein 2-mg-Streifen des Gelatine-Protein-A-Immobilisats wird zum Quellen 30 min in AK-Bindungspuffer gelegt. Das gut abgetropfte Aliquot wird in 100 μl einer 1:2000-Verdünnung des Antikörper-Alkalische-Phosphatase-Konjugats übergeführt und 10 min bei 37 °C inkubiert. Nach dreifachem Waschen mit AK-Bindungspuffer wird die Farbreaktion nach dem Schema von Tab. 4 durchgeführt. Für den Vergleichsansatz dient eine vernetzte Gelatinefolie ohne Protein A. Abb. 2 zeigt die Abhängigkeit der Protein A-Belegdichte von der Konzentration des Vemetzungseπzyms.
Beispiel 6: Mikrotiterplatten-Assay zum Nachweis von Transglutaminase
a) Nicht-kovalente Bindung von Casein
In jede Vertiefung einer Mikrotiterplatte aus Polystyrol werden 250 μl einer Ca- seinlösung (1 mg/ml in Beschichtungspuffer bestehend aus 40 mM Tris-HCI mit 150 mM NaCI, pH 8,3) pipettiert. Die Mikrotiterplatten werden über Nacht bei 4 °C inkubiert und verbliebene Bindungsstellen mit 250 μl einer 1 % (w/v) Rinderserumalbumin-Lösung in Beschichtungspuffer abgesättigt.
b) Spezifische Transglutaminase-Reaktion
In jede Vertiefung pipettiert man 20 μl einer Probe oder Vergleichsprobe (z. B. nur den verwendeten Puffer ohne Transglutaminase) und 20 μl einer Alkalische- Phosphatase-Lösung (67 μg/ml in Beschichtungspuffer) und inkubiert 120 min bei Raumtemperatur. Anschließend wird dreimal mit Substratpuffer für Alkalische Phosphatase, bestehend aus 1 M Diethanolamin-HCI-Puffer mit 0,01 mM MgCI2, pH 9,8, gewaschen.
c) Farbreaktion
100 μl einer Substratlösuπg aus para-Nitrophenylphosphat in Substratpuffer (2 mg/ml) werden in jede Vertiefung pipettiert, und nach 30 min wird die optische Dichte bei 405 nm (Abb. 3) bestimmt.
Beispiel 7: Herstellung eines Protein-G-Peroxidase-Konjugats
Sojabohnen-Peroxidase und Protein G werden in einem molaren Verhältnis von 20:1 in 0,3 M Tris-HCI-Puffer, pH 7,0, gelöst. Nach Zugabe von Transglutaminase (0,5 E/mg Protein) wird 18 h bei 37 °C inkubiert.
Beispiel 8: Quantitativer Nachweis eines Protein G-Peroxidase-Konjugats
a) Nichtkovalente Bindung von Kaninchen-Antikörper
In jede Vertiefung einer Mikrotiterplatte aus Polystyrol werden 100 μl einer Lösung aus 10 μg Kaninchen-Antikörper (IgG, Sigma) in 1 ml Beschichtungspuffer, bestehend aus 40 mM Tris-HCI mit 150 mM NaCI, pH 8,3, pipettiert. Die Mikroti- terplatte wird 60 min bei Raumtemperatur inkubiert, entleert und verbleibende Bindungsstellen mit 200 μl einer 1 % (w/v) Rinderserumalbumin-Lösung in Beschichtungspuffer abgesättigt. Nachfolgend wird dreimal mit 200 μl Beschichtungspuffer gespült.
b) Spezifische Bindung des Konjugats
In jede Vertiefung werden 100 μl einer Probe oder Vergleichsprobe (z. B. Konju- gatansatz ohne Transglutaminase) pipettiert und 60 min bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wird erneut dreimal mit 200 μl Beschichtungspuffer gespült.
c) Farbreaktion
Eine Substratlösung wird hergestellt aus 2 ml 0,1 M Phosphatpuffer, pH 6,0, 2 ml einer 5 % (w/v) Pyrogallol-Lösung in H2O, 1 ml 0,05 % H2O2-Lösung und 13 ml H2O. In jede Vertiefung der Mikrotiterplatte werden 100 μl der Substratlösung pipettiert, und nach 30 min wird die Extinktion bei 405 nm gemessen.
Beispiel 9: Anreicherung eines Protein-G-Peroxidase-Konjugats und Rückgewinnung der Ausgangsmaterialien
Eine 10x150 mm lonenaustauschersäule gefüllt mit Fractogel-EMD-TMAE-650 S (Merck) wird mit dem fünffachen Bettvolumen an 50 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, äquilibriert. 1 ml einer Protein-G-Peroxidase-Konjugatmischung wird auf die Säule gepumpt, und die nicht-bindenden Proteine (Transglutaminase und Protein G in dieser Reihenfolge) werden mit Äquilibrierpuffer von der Säule gespült. Anschließend werden die Konjugate durch lineare Erhöhung der lonenkon- zentration mit NaCI von 0 bis 0,15 M innerhalb von 60 min eluiert. Die höchsten Konjugatkonzentrationen finden sich in Fraktionen bei 0,08-0,12 M NaCI (Abb. 4).

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zum Transglutaminase-katalysierten Koppeln von Protein oder Peptid an einen Träger unter Erhalt von mindestens 50 % der biologischen Aktivität des Proteines oder Peptides, wobei der Träger ein bioaktives Molekül oder eine vorgegebene unlösliche Matrix ist, umfassend den Schritt des Inkontaktbringens des Trägers mit dem zu koppelnden Protein oder Peptid und mit Transglutaminase, wobei der Träger und das Protein als Acyl- und/oder Amindonor wirken und als Transglutaminasesubstrate geeignet sind.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß das zu koppelnde Protein oder Peptid ein Glutamindonor ist und der Träger reaktive Amingruppen umfaßt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß das zu koppelnde Protein oder Peptid ein Glutaminakzeptor ist und der Träger reaktive Carboxamidgruppen enthält.
4. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß das zu koppelnde Protein oder Peptid ein Glutamindonor und -akzeptor ist und der Träger reaktive Amin- und/oder Carboxamidgruppen enthält.
5. Verfahren nach Anspruch 2 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß die reaktiven Amingruppen des Trägers reaktive Lysinseitenketten sind.
6. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß die reaktiven Carboxamidgruppen des Trägers reaktive Glutaminseitenketten sind.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger ein bioaktives Molekül ist und in Lösung vorliegt.
8. Verfahren nach einem der Anspüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger eine unlösliche Matrix ist und die unlösliche Matrix Protein enthält.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger Gelatine oder Casein ist.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß das zu koppelnde Protein oder Peptid ein natives, ein rekombinantes oder ein synthetisches, modifiziertes oder unmodifiziertes Peptid ist.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger ein natives rekombinantes, synthetisches, modifiziertes oder unmodifiziertes Protein oder Peptid ist.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11 , dadurch gekennzeichnet, daß das zu koppelnde Protein oder Peptid nach seiner Kopplung mindestens 60, bevorzugt 70, besonders bevorzugt 80 oder 90 % oder mehr als 90 % seiner Ausgangsaktivität aufweist.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 und 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß das bioaktive Material nach der Kopplung mindestens 50 % seiner Ausgangsaktivität aufweist.
14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß das bioaktive Material nach der Kopplung mindestens 60 %, bevorzugt 70%, besonders bevorzugt 80 % oder 90% oder mehr seiner Ausgangsaktivität aufweist.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Transglutaminase eine bakterielle Transglutaminase, eine Pflanzentrans- glutaminase oder eine Säugertransglutaminase ist.
16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die bakterielle Transglutaminase aus Streptoverticillium erhalten worden ist.
17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß es bei pH 5 bis 9 durchgeführt wird.
18. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß es bei einer Temperatur von 20°C bis 60°C durchgeführt wird.
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß das zu koppelnde Protein oder Peptid mehr als eine Proteinspezies umfaßt.
20. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß das molare Verhältnis von zu koppelndem Protein oder Peptid zu Träger 5:1 bis 1 :100 beträgt.
21. Trägergekoppeltes Proteinimmobilisat, erhältlich durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, 8 bis 12 und 15 bis 20.
22. Träger-Protein-Konjugat, erhältlich durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7 und 10 bis 20.
23. Verwendung eines trägergekoppelten Proteinimmobilisates oder Träger- Protein-Konjugates in der enzymatischen Analyse oder für Immundiagnostiktests.
24. Verwendung eines trägergekoppelten Proteinimmobilisates nach Anspruch 20 oder Träger-Protein-Konjugates nach Anspruch 22 als Proteinmodui in oligome- rer oder polymerer Form zum Herstellen von Folgeprodukten oder in der Diagnostik.
25. Verwendung nach Anspruch 24 zum Herstellen von Biosensoren, beschichteten Mikrotiterplatten mit biologischer Aktivität, aktiven Membranen, Enzym- Carriem, Analytikteststreifen.
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