WO1999003510A1 - Agents diagnostiques pour les complications de diabetes ou insuffisances renales - Google Patents

Agents diagnostiques pour les complications de diabetes ou insuffisances renales Download PDF

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WO1999003510A1
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urine
diabetes
complications
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Tomoko Ohya
Hiroyuki Kobayashi
Mitsuo Akiba
Norihiro Kakimoto
Yasujiro Morimitsu
Toshihiko Ohsawa
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Biremo Science Co., Ltd.
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    • A61K49/0004—Screening or testing of compounds for diagnosis of disorders, assessment of conditions, e.g. renal clearance, gastric emptying, testing for diabetes, allergy, rheuma, pancreas functions
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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Definitions

  • the present invention relates to a diagnostic reagent for complications associated with diabetes or renal failure, comprising a specific pyridinium compound as a main component.
  • a Schiff base is first formed by a non-enzymatic reaction (Darikecation) between the sugar and the proteinamine, and the Schiff base is compared by an Amadori rearrangement reaction from the Schiff base.
  • ketoamine a pre-product of the Maillard reaction
  • the post-product of the Maillard reaction is produced through various steps.
  • HbA1c Glycated hemoglobin
  • glycated albumin fructtosamine
  • the late product of the Maillard reaction is known to be produced by slow-turning proteins such as collagen, nerve myelin and the lens, and is increased by prolonged hyperglycemia (diabetes).
  • this late product of the Maillard reaction has been noted as a cause and inhibits its production It has been suggested that this may prevent the onset and progress of complications.
  • the structures reported as late-stage products of the Maillard reaction include bilarin, pentosidine, and crossrin, among which pyrarin is separated from the reaction product of neopentylamine and glucose, and its structure is determined. Although it is reported to be increasing in some cases, it is not fluorescent and is said to be not a major late product of the Maillard reaction.
  • Pentosidine which has been separated from lysine and arginine-diribose reactants and has been determined in structure, is increased in skin collagen in patients with diabetes and renal failure, and is particularly increased in the blood of patients with renal failure. However, it contributes less than 1% of the total crosslinks between proteins by the late product of the Maillard reaction, and it is said that the main late product of the Maillard reaction still raises questions.
  • Crosslin was isolated and its structure was determined from the reaction product of acetyllysine and glucose, but its relationship to diabetic conditions has not yet been clarified.
  • the present invention specifies the structure of the late product of the Maillard reaction in vivo, which has a close causal relationship with various tissue disorders, Or to provide a diagnostic reagent for complications associated with renal failure. Disclosure of the invention
  • the present invention provides:
  • a diagnostic reagent for complications associated with diabetes or renal failure comprising a pyridinium compound represented by the following formula:
  • FIG. 1 is a chart showing the results of analyzing the pyridinium compound used in the present invention by high performance liquid chromatography.
  • FIG. 2 is a chart showing the results of FAB-mass spectrum measurement of the pyridinium compound used in the present invention.
  • FIG. 3 is a chart showing the results of measuring the spectrum of 1 H—NMR for the pyridinium compound used in the present invention.
  • FIG. 4 is a chart showing the results of measuring the spectrum of 13 C-NMR for the pyridinium compound used in the present invention.
  • BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION Hereinafter, the present invention will be described in detail.
  • the pyridinium compound which is a main component of the diagnostic reagent for complications of the present invention, is a late product of the Maillard reaction, and includes, for example, proteins such as albumin, lysozyme, casein, liponuclease monoglobulin, glucose, and diacetyl. It is produced by a non-enzymatic reaction with a carbonyl compound such as Dalioxal® fructose.
  • the above pyridinium compound is obtained by dialysis of a reaction solution obtained by reacting egret erythrocytes and glucose at 37 ° C for 2 weeks for 48 hours, hydrolysis, and then excitation wavelength by high performance liquid chromatography using an ODS-5 column. 340 nm, Fluorescence wavelength: 402 nm, the amount of production increased in proportion to the concentration of glucose and the reaction time and the browning of the reaction solution, and the production was aminoguanidine, a Maillard reaction inhibitor Inhibited by It was also produced in a system of serum albumin and glucose.
  • the peak in high-performance liquid chromatography coincided with the peak detected in the blood of the diabetic patient.
  • the structure of the pyridinium compound is obtained by hydrolyzing the late product of the Maillard reaction formed by the reaction of glucose serum albumin and glucose, fractionating it by high-performance liquid chromatography using a fluorescence wavelength, and then separating it with glycerol and nitrobenzene.
  • the molecular weight was determined to be 2 12 first by measurement using FAB-mass spectrum using a mixture of the alcohol and matrix as a matrix.
  • the composition formula of the pyridinium compound was determined to be C 9 H 10 O 3 Ni S 1, and as a result of two-dimensional NMR analysis, this pyridinium compound was represented by the formula
  • the pyridinium compound has already been isolated from cattle liver as a hydrolyzate having fluorescence. It is also presumed that this pyridinium compound exists in vivo as a complex of its precursor and protein.
  • the inventors of the present invention reacted various proteins (albumin, globulin, casein, lysozyme, liponuclease, prominin) 1 O mg Zm 1 with glucose 0.1 M, and performed high performance liquid chromatography.
  • the pyridinium compound was produced in a large amount from albumin liponuclease, which contains a large amount of arginine and cysteine, and then produced abundantly from lysozyme. It was found that it was not generated at all from Yu Min.
  • cysteine to prominin and glucose produces the above-mentioned pyridinium compound, indicating that the production of this pyridinium compound requires glucose, polyarginine and cysteine.
  • the late products of the Maillard reaction proposed so far include pyralin, pentosidine, crossrin and the like, as described above.Since all the production involves lysine, the pyridinium compound is It is presumed to be a completely new type. Further, in order to examine the effect of reducing sugars on the formation of the pyridinium compound, compounds having a carbonyl group (glucose, diacetyl, dalioxal, fructose) were reacted with 0.1 M and albumin-1 OmgZm1 for 2 weeks. Analysis by high-performance liquid chromatography showed that the pyridinium compound was formed even when albumin and diacetyl were reacted, and the amount produced was slightly higher than that with glucose.
  • Diacetyl is an acid hydrolyzate of sugar, which reacts specifically with the guanidino group of arginine residue in proteins under weakly acidic conditions, and becomes stable to hydrolysis.
  • oxidative decomposition causes diacetyl to occur, and then attacks arginine residues to produce the above-mentioned pyridinium compound.
  • the content of the pyridinium compound was significantly decreased in serum of experimental diabetic rats to which streptozotocin was administered, but significantly increased in kidney, tendon, skin and nerve.
  • the urinary excretion of the pyridinium compound was increased 4.3-fold per lm urine, 2.9-fold per protein, and 21-fold per day in diabetic rats compared to normal rats.
  • Excretion of pyridinium compounds in the urine of hereditary obese diabetic rats (OLETF) was increased 3 times per protein and 22 times per day compared to normal rats (LETO).
  • the pyridinium compound reflects the development of symptoms in diabetes, particularly the decrease in renal function.
  • Fig. 1 shows the results of analysis by high-performance liquid chromatography at an excitation wavelength of 340 nm and a fluorescence length of 402 nm using a flow of 7 mM phosphoric acid at a flow rate of lm1 / min.
  • the pyridinium compound was detected at an elution time of 13 minutes, and a new peak was detected around 7 minutes. In addition, this new peak was generated in large quantities under high temperature of about 60 ° C and alkaline conditions such as pH 9.0.
  • the Pirijiniumu compound was dissolved in heavy water, iH- NMR (600MHz), 1 3 C- NMR (15 OMH z), HMBC H- De tected H eteronuc 1 ear Mu ltiple B ond Con ectivity) to measure the, the analysis data
  • the results are shown in Table 1.
  • FIG. 3 shows the spectrum of iH-NMR
  • FIG. 4 shows the spectrum of 13 C-NMR.
  • HMBC showed a correlation between protons 6 and 3, indicating that it is linked to the aromatic ring.
  • Protons 2 and 3 show typical ABX patterns Was. In other words, one of the protons 2 has a di-emission coupling of 1.9 Hz with a doublet at 11.9 Hz, and the remaining proton has a di-emission coupling of 4.1 pm with a double doublet at 11.9 Hz. At the same time, it was coupled with the adjacent proton 3 at 8.8 Hz. Also, proton 3 was coupled to one of the protons 2 at 5.8 ppm by a doublet of 8.8 Hz.
  • HMBC The correlation by HMBC is shown by an arrow in the following structural formula.
  • Hereditary obese diabetic rats (OLET-F) were bred for 72 weeks, and the amount of pyridinium compounds in urine was measured and the histopathological changes in the kidneys were observed. The results were compared with those of genuine rats (LOTO). did. Table 3 shows the results.
  • the amount of pyridinium compound in urine of OLET-F increased 23 times at 24 weeks, 22 times at 48 weeks, and 16.4 times at 60 weeks, compared to LETO.
  • Per-protein increased 5.7-fold at 36 weeks of age, 2.8-fold at 48 weeks of age, and 16.4-fold at 60 weeks of age. In both cases, a remarkable increase was observed.
  • kidneys of OLET-F showed glomerular degeneration, sclerosis, atrophy of renal tubules, cell infiltration into intercellular spaces, and thickening of the renal pelvic mucosa. Accordingly, the excretion of the pyridinium compound into the urine was increased.
  • Hereditary obese diabetic rats OLET-F
  • LTO normal rats
  • the amounts of pyridinium compounds in urine at 36, 48, and 60 weeks of age were measured, and the results are shown in Table 4.
  • the unit was expressed as mv / sec / mg urine creatinine.
  • OLET-F markedly increased the amount of pyridinium compound in urine with age. That is, OLET-F showed a 21.0-fold higher value at 36 weeks of age, 24.7 times at 48 weeks of age, and 122 times higher at 60 weeks of age than LETO.
  • the urinary pyridinium compounds of OLET-F and LETO at 36, 48, and 60 weeks of age were measured, and at 72 weeks of age (at the time of sacrifice), histological changes in the kidney, creatinine clearance, ocular lens turbidity and By analyzing the correlation between the two, the possibility of using urinary pyridinium compounds in the diagnosis and prediction of disease states was examined. result Are shown in Table 5.

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Description

明 細 書 糖尿病又は腎不全に伴う合併症の診断試薬 技術分野
本発明は、 特定のピリジニゥム化合物を主たる成分とする糖尿病又は腎不全 に伴う合併症の診断試薬に関するものである。 背景技術
周知のように、 糖と蛋白ァミンとのメイラード反応については、 まずそれら 糖と蛋白ァミンとの非酵素的反応 （ダリケ一シヨン） によってシッフ塩基が形 成され、 このシッフ塩基からアマドリ転位反応により比較的短期間にメイラ一 ド反応前期生成物であるケトァミンが形成され、 更に種々の段階をへてメイラ ―ド反応後期生成物が産生される。
このメイラ一ド反応前期生成物としては、 臨床的には糖化ヘモグロビン （H b A 1 c ) や糖化アルブミン （フルク卜サミン） が、 血糖コントロールの指標 として利用されている。
一方、 メイラード反応後期生成物は、 コラーゲン、 神経ミエリンや水晶体等 生体の代謝回転の遅い蛋白で生成され、 長期高血糖状態 （糖尿病） により増加 することも知られており、 糖尿病において最も特徴的変化である持続性高血糖 状態が、 なぜ糖尿病に特異的である慢性合併症を引き起こすかを説明する仮説 として、 このメイラ一ド反応後期生成物がその成因として注目されると共に、 その産生を阻害することによって合併症の発症や進展を阻止し得る可能性が示 唆されてきた。
又、 メイラード反応後期生成物の血中、 尿中や組織中の濃度を測定すること による、 合併症の診断への可能性が期待されている。 メイラード反応後期生成物の構造体として報告されているものに、 ビラリン、 ペントシジン、 クロスリン等があり、 これらのうちのピラリンは、 ネオペンチ ルァミンとグルコースの反応物より分離、 構造決定され、 糖尿病患者の血中で は増加していると報告されているが、 蛍光性を持たず、 主要なメイラード反応 後期生成物ではないともいわれている。
ペントシジンは、 リジン、 アルギニンゃリボースの反応物より分離、 構造決 定されたもので、 糖尿病や腎不全患者の皮膚コラーゲンでは増加しており、 特 に腎不全患者の血中では顕著に増加するが、 メイラード反応後期生成物による 蛋白間全架橋の 1 %以下しか寄与しておらず、 主要なメイラ一ド反応後期生成 物としては、 なお疑問が残るといわれている。
又、 クロスリンはァセチルリジンとグルコースの反応物より分離、 構造決定 されたが、 未だ糖尿病態との関連は明らかではない。
このように、 これまでに開発されたメイラード反応後期生成物測定法より得 られた知見は、 生体内メイラード反応後期生成物の増量と各種組織障害との間 には密接な因果関係があることを強く示唆しているが、 未だ生体内の主要メイ ラード反応後期生成物の化学構造は不明である。
本発明は、 上記のような従来技術の現状に鑑み、 各種組織障害との間に密接 な因果関係を有する生体内メイラード反応後期生成物の構造を特定すると共に、 この化合物を主たる成分とする糖尿病又は腎不全に伴う合併症の診断試薬を提 供することを目的としてなされた。 発明の開示
上記目的を達成するために、 本発明は、 式、
Figure imgf000005_0001
で表されるピリジニゥム化合物を主たる成分として含有することを特徴とする 糖尿病又は腎不全に伴う合併症の診断試薬を提供する。
即ち、 本発明者等は、 新規でかつ病態の変化を反映する新規な生体内の主要 なメイラード反応後期生成物を発見するために鋭意研究を行った結果、 新規な 蛍光化合物を発見し、 更に研究を続行して当該化合物が上記構造を有するピリ ジニゥム化合物であることを確認し、 更にこのピリジニゥム化合物が糖尿病又 は腎不全に伴う合併症の診断試薬として有用であるとの知見を得、 本発明を完 成したものである。 図面の簡単な説明
図 1は本発明で使用するピリジニゥム化合物を高速液体クロマトグラフィー で分析した結果を示すチヤ一トである。
図 2は本発明で使用するピリジニゥム化合物について F A B—マススぺクト ルを測定した結果を示すチヤ一トである。
図 3は本発明で使用するピリジニゥム化合物について 1 H— NM Rのスぺク トラムを測定した結果を示すチャートである。
図 4は本発明で使用するピリジニゥム化合物について 13 C— NM Rのスぺク 卜ラムを測定した結果を示すチャートである。 発明を実施するための最良の形態 以下、 本発明を詳細に説明する。
本発明の合併症の診断試薬の主たる成分である上記ピリジニゥム化合物は、 一種のメイラード反応後期生成物であり、 例えば、 アルブミン、 リゾチーム、 カゼイン、 リポヌクレア一ゼゃグロブリン等の蛋白質と、 グルコース、 ダイァ セチル、 ダリオキザールゃフルクトース等のカルボニル化合物との、 非酵素的 反応によって産生されるものである。
上記ピリジニゥム化合物は、 ゥサギ赤血球とグルコースとを 3 7 °Cで 2週間 反応させた系の反応液を 4 8時間透析して加水分解した後、 O D S— 5カラム による高速液体クロマトグラフィーにより、 励起波長 3 4 0 n m、 蛍光波長 4 0 2 n mにより検出され、 その生成量はグルコースの濃度と反応時間並びに反 応液の褐変化に比例して増加し、 その生成はメイラード反応阻害物質であるァ ミノグァニジンによって阻害された。 又、 ゥシ血清アルブミンとグルコースと の系においても、 同様に生成した。
そして、 高速液体クロマトグラフィーにおけるピークが、 糖尿病の患者の血 液から検出されたピークと一致したのである。
上記ピリジニゥム化合物の構造は、 ゥシ血清アルブミンとグルコースの反応 で生成したメイラ一ド反応後期生成物を加水分解した後、 蛍光波長を利用した 高速液体クロマトグラフィーにより分取した後、 グリセロールとニトロべンジ ルアルコールとの混合物をマトリクスとした F A B—マススぺクトルを用いて 測定することにより、 まずその分子量が 2 1 2と決定された。
又、 蛍光波長については、 励起波長 3 5 0 n m、 蛍光被長 4 0 5 n mに極大 値が観測された。
次いで、 高分解能マススペクトルを利用することにより、 上記ピリジニゥム 化合物の組成式が C 9 H 10 O 3 N i S 1と決定され、 更に二次元を含む N M R解 析の結果、 このピリジニゥム化合物は、 式
Figure imgf000007_0001
で表される 8—ヒドロキシー 5—メチルジヒドロチアゾロ [ 3 , 2 - a ] ピリ ジニゥム— 3—力ルポキシレートと決定された。
尚、 上記ピリジニゥム化合物は、 牛の肝臓より蛍光を有する加水分解物とし てすでに単離されているものである。 又、 このピリジニゥム化合物は、 生体内 では、 その前駆体とタンパク質との複合体として存在しているものと推定され る。
本発明の発明者等は、 種々の蛋白質 （アルブミン、 グロブリン、 カゼイン、 リゾチ一ム、 リポヌクレア一ゼ、 プロ夕ミン） 1 O m g Zm 1とグルコース 0 . 1 Mを反応させ、 高速液体クロマトグラフィーで測定した結果、 上記ピリジニ ゥム化合物は、 アルギニンとシスティンを多く含むアルブミンリポヌクレア一 ゼから大量に生成し、 次にリゾチームから多く生成する一方で、 アルギニンを 多く含むが、 システィンを含まないプロ夕ミンからは全く生成しないことを見 出した。
しかし、 プロ夕ミンとグルコースにシスティンを添加することにより、 上記 ピリジニゥム化合物が生成することから、 このピリジニゥム化合物の生成には、 グルコースとポリアルギニンとシスティンが必要であることが判明した。
現在までに提唱されているメイラ一ド反応後期生成物としては、 上記の通り ピラリン、 ペントシジン、 クロスリン等が挙げられるが、 その生成には全てリ ジンが関与している点から、 上記ピリジニゥム化合物は、 全く新しいタイプの ものであると推定される。 更に、 上記ピリジニゥム化合物の生成における還元糖の影響を検討するため に、 カルポニル構造を持つ化合物 （グルコース、 ダイァセチル、 ダリオキザ一 ル、 フルクト一ス） 0. 1Mとアルブミン 1 OmgZm 1を 2週間反応させ、 高速液体クロマトグラフィーで分析を行ったところ、 このピリジニゥム化合物 は、 アルブミンとダイァセチルを反応させても生成し、 生成量はグルコースと の反応よりもわずかに増加した。
ダイァセチルは糖の酸加水分解物であり、 弱アル力リ条件下で蛋白質中のァ ルギニン残基のグァニジノ基と特異的に反応し、 加水分解には安定になること から、 溶液中のグルコースがまず酸化分解を受け、 ダイァセチルとなった後、 アルギニン残基を攻撃し、 上記ピリジニゥム化合物が生成する経路が考えられ る。
上記ピリジニゥム化合物の含有量は、 ストレブトゾトシンを投与した実験的 糖尿病ラットの血清中では有意に低下したが、 腎、 腱、 皮膚、 神経中では有意 に増加した。 又、 上記ピリジニゥム化合物の尿中排泄量は、 正常ラットに比べ、 糖尿病ラットでは尿 lm 1当たりで 4. 3倍、 蛋白量当たりで 2. 9倍、 1日 当たりで 2 1倍の増加が認められた。 更に、 遺伝性肥満糖尿病ラッ卜 （OL E T-F) のピリジニゥム化合物の尿中の排泄量は、 正常ラット （LETO) に 比べて、 蛋白量当たりで 3倍、 1日当たりで 22倍の増加が認められた。
これらの事実から、 上記ピリジニゥム化合物は、 糖尿病における症状の進展、 特に腎機能の低下を反映していることが示唆される。
以下に本発明を実施例に基づいて詳細に説明するが、 これらは本発明を何ら 限定するものではない。
実施例 1
ゥサギ赤血球 1 OmgZm 1とグルコース 266mMを 1 OmMリン酸緩衝 液 （PH7. 4) に溶解し、 30°Cで 2週間反応させ、 トリクロ口酢酸にて蛋 白質を回収した後、 1 10°C、 24時間で加水分解を行った。 ODS— 5カラ ムを用い、 7mMリン酸を流速 lm 1 /分で流し、 励起波長 340 nm、 蛍光 被長 402 nmにて高速液体クロマトグラフィーで分析した結果を図 1に示し た。 ピリジニゥム化合物は溶出時間 1 3分に検出され、 更に 7分付近に新しい ピークが検出された。 尚、 この新しいピークは、 60°C程度の高温や pH9. 0等のアルカリ条件下で大量に生成された。
実施例 2
ゥシ血清アルブミンとグルコースの反応系から生成したピリジニゥム化合物 を、 高速液体クロマトグラフィーにより分取し、 グリセロールとニトロべンジ ルアルコールを混合したものをマトリクスとし、 FAB—マススぺクトルを測 定した結果を図 2に示した。 又、 高分解能マススペクトルから分子量 212. 0404が実測され、 対応する組成式は C 9 H 10O3NS (論理値： 212. 0 427) と決定された。
ピリジニゥム化合物を重水に溶解し、 iH— NMR (600MHz) , 13 C— NMR ( 15 OMH z) , HMBC H— De t e c t e d H e t e r o n u c 1 e a r Mu l t i p l e B ond Con e c t i v i t y) を測 定し、 その分析データ一を表 1に示した。 又、 iH— NMRのスペクトラムを図 3に、 13C— NMRのスペクトラムを図 4に示した。
H— NMRと13 C— NMRのケミカルシフ卜とカツプリング定数
( i n D2 〇， 600MHz)
C δ (p pm) H δ ( pm) J (Hz)
-CH3 CH3 19. 9 3 H 2. 6 s
2 CH2 34. 4 2H 3. 9 d 1 1. 9
4. 1 d， d 1 1. 9, 8. 8
3 CH 73. 1 1 H 5. 8 d 8. 8
5 C 146. 3
6 CH 125. 3 1 H 7. 4 d 8. 4
7 CH 129. 5 1 H 7. 6 d 8. 4
8 C 150. 6
9 c 149. 6
-COOH COOH 171. 1 メチル基については、 HMBCよりプロトン 6と 3に相関が認められたこと から、 芳香環に結合していると判断され、 プロトン 2と 3については典型的な ABXパターンを示した。 即ち、 プロトン 2のうち一方は 3. 9 p pmにダブ レットで 1 1. 9H zのジエミナルカップリングを、 残るプロトンは 4. 1 p pmにダブルダブレットで 1 1. 9Hzのジエミナルカップリングをすると共 に、 8. 8Hzで隣接するプロトン 3とカップリングしていた。 又、 プロトン 3はプロトン 2の一方と 5. 8 p pmに 8. 8 H zのダブレットでカップリン グしていた。
これらの観測結果と、 — iHc o s y、 HOHAHA及び 13 C— NMRよ り、 本発明で使用するピリジニゥム化合物の構造は、 以下に示す 8—ヒドロキ シ— 5—メチルジヒドロチアゾロ [3 , 2 - a] ピリジニゥム— 3—力ルポキ シレートと決定した。
尚、 HMBCによる相関を以下の構造式中に矢印で示した。
Figure imgf000011_0001
実施例 3
SDラットに対し、 55mgZkgのストレブトゾトシンを尾静脈より投与 することにより、 糖尿病を誘発したラットの臓器中と尿中のピリジニゥム化合 物を測定し、 正常ラットと比較した。 結果を表 2に示す。
表 2
血清、 尿、 臓器中のピリジニゥム化合物の濃度 正常ラッ卜 糖尿病ラット
血 ¾(mV. sec/ml) 12 7 84. 5 * * * 腱 (mV.sec/g tissue) 1 4. 3 314 * * * 皮膚 (mV.sec/g tissue) 1 1 7 967 * * * 尿 （ V.sec/mlXlO3) 2 8. 5 122. 4 * * *
(μν .sec/ mg protein X 103) 3 1. 6 92. 8 * * *
(HV.sec/24hrX106) 5. 69 120 * * * 平均誤差 ** * pく 0.001 糖尿病ラッ卜のピリジニゥム化合物の濃度は、 正常ラッ卜に比べて血清中 では減少したが、 腱、 皮膚、 尿中の濃度は著しく上昇した。 特に、 尿中濃度は 尿 lm l当たりで 4. 3倍、 蛋白量当たりで 2. 9倍、 1日当たりで 21倍の 増加が認められた。
実施例 4
遺伝性肥満糖尿病ラット （OLET— F) を 72週間飼育し、 尿中のピリジ ニゥム化合物の量を測定すると共に腎臓の病理組織学的変化を観察し、 正幣ラ ッ卜 （LOTO) と比較検討した。 結果を表 3に示す。
表 3
尿中のピリジニゥム化合物の量
(mVsec)
Figure imgf000012_0001
平均誤差 * * p<0.01
OLET— Fの尿中のピリジニゥム化合物の量は LETOに比べて、 24時 間当たりでは 36週齢で 23倍、 48週齢で 22倍、 60週齢で 16 · 4倍に 上昇し、 mg,蛋白当たりでは 36週齢で 5. 7倍、 48週齢で 2. 8倍、 6 0週齢で 16. 4倍に上昇するとともに、 糖尿病の進展に伴って 24時間当た り、 mg蛋白当たりともに著しい増加が認められた。
更に、 病理学組織的検討では OLET— Fの腎臓には糸球体の変性、 硬化、 尿細管の萎縮、 細胞間隙への細胞侵潤、 腎孟粘膜の肥厚等が観察され、 腎症の 増悪に伴いピリジニゥム化合物の尿中への排泄量の増加が認められた。
実施例 5
遺伝性肥満糖尿病ラット （OLET— F) と、 その正常ラット （LETO) の 36、 48、 60週令の尿中のピリジニゥム化合物の量を測定し、 結果を表 4に示した。 尚、 単位は mv/s e c/mg尿中クレアチニンで表示した。
表 4
尿中のピリジニゥム化合物の濃度
Figure imgf000013_0001
平均土標準誤差 * *ρ<ο.οι
〇 L Ε Τ— Fでは、 加令と共に尿中のピリジニゥム化合物の量が著しく増加 した。 即ち、 OLET—Fは LETOに比較して、 36週令では 21. 0倍、 48週令では 24. 7倍、 60週令では 122倍の高値を示した。
実施例 6
O LET— Fの腎臓には、 糸球体の変性、 硬化、 尿細管の委縮、 細胞間隙へ の細胞侵潤、 腎孟粘膜の肥厚等が観察された。 これらの病理組織学的変化を数 式化して、 尿中のピリジニゥム化合物の濃度 （mvZs e cZmgクレアチニ ン） との相関性を分析した結果、 両者の間には相関係数ァ =0. 6485と有 意の相関性が認められた。 又、 尿中のピリジニゥム化合物の濃度は、 クレアチ ニン ·クリアランスとも T =— 0. 6 721と有意の相関性が認められ、 尿中 のピリジニゥム化合物の濃度は腎機能の変化を反映していることが明らかにな つた。
実施例 7
36、 48、 60週令における OL ET—Fと LETOの尿中のピリジニゥ ム化合物を測定し、 72週令 （屠殺時） における腎臓の組織学的変化スコア、 クレアチニン ·クリアランス、 眼レンズ濁度との相関性を分析し、 病態の診断 予測における尿中のピリジニゥム化合物の利用可能性について検討した。 結果 は表 5に示した。
表 5
尿中のピリジニゥム化合物の診断予測 （相関係数）
Figure imgf000014_0001
ピリジニゥム化合物の診断予測への利用可能性についてフルクトサミンと比 較検討した結果、 尿中のピリジニゥム化合物の濃度は屠殺時の 3 6週前の時点 でクレアチニン ·クリアランスの低下、 腎臓の組織学的変化、 眼レンズの混濁 等の糖尿病性合併症の発症診断予測が可能であることが明らかになった。
実施例 8
保存期腎不全患者と健常者の尿中のピリジニゥム化合物を測定し、 腎機能の 変化を示すマ一カーとして利用されている尿中蛋白濃度との相関性を検討した 結果は表 6に示した。
表 6
腎不全患者の尿中のピリジニゥム化合物と蛋白濃度
Figure imgf000014_0002
平均士標準誤差 * * P<0.01 保存期腎不全患者は健常者に比較して尿中のピリジニゥム化合物の濃度は 3 6倍、 尿中蛋白濃度は 2 4. 4倍に増加した。 両者の相関係数が r = 0 . 8 7 0 9と高度に有意の相関性が認められ、 尿中のピリジニゥム化合物が腎機能の マーカーとして有用であることが明らかになった。 産業上の利用可能性
式
Figure imgf000015_0001
で表されるピリジニゥム化合物は、 糖尿病病態において大量に産生して腎、 腱、 皮膚、 神経等の組織に沈着すると共に、 腎機能の低下に伴い尿中に大量に排泄 されてくることから、 糖尿病病態のバイオマ一カーとして適用することが可能 であり、 本発明の糖尿病又は腎不全に伴う合併症の診断試薬は、 このピリジニ ゥム化合物を主たる成分として含有する。

Claims

請求の範囲
式、
Figure imgf000016_0001
で表されるピリジニゥム化合物を主たる成分として含有することを特徴とする 糖尿病に伴う合併症の診断試薬。
2 . 式、
Figure imgf000016_0002
で表されるピリジニゥム化合物を主たる成分として含有することを特徴とする 腎不全に伴う合併症の診断試薬。
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