WO1998058959A1 - Polynucleotides codant pour la grande sous-unite de la polymerase des paramyxovirus rsvb - Google Patents

Polynucleotides codant pour la grande sous-unite de la polymerase des paramyxovirus rsvb Download PDF

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WO1998058959A1
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rsvb
polynucleotide
nucleotide
primers
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PCT/FR1998/001323
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Noël Tordo
François FREYMUTH
Geneviève EUGENE-RUELLAN
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Institut Pasteur
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
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    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18511—Pneumovirus, e.g. human respiratory syncytial virus
    • C12N2760/18522—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Definitions

  • the present invention relates to a polynucleotide comprising all or part of the sequence coding for the large subunit (L) of the paramyxovirus polymerase of
  • the subject of the invention is also a method for diagnosing RSVB type viruses in a biological sample using all or part of the polypeptide of the large (L) subunit of the RSVB paramyxovirus polymerase or antibodies recognizing a such a polypeptide.
  • the invention also relates to polynucleotides derived from genes.
  • the subject of the invention is finally a method for differential diagnosis of paramyxoviruses of RSVA, RSVB and PIV3 type using said polynucleotides,
  • Parainfluenza viruses type 1 and 2 are more generally associated with upper respiratory tract infections or laryngo-tracheitis. Viruses
  • RSV subgroups A and B (RSVA, RSVB) and parainfluenza virus type 3 (PIV3) are the predominant cause of acute viral lower respiratory diseases such as bronchiolitis and pneumonia (Falsey et al ., 1992; Freymuth et al., 1983; Frey uth et al., 1987; Martin et al., 1978; Welliver,
  • VIT virus on cell cultures
  • RSV and PIV3 sequences 25 detection of certain RSV and PIV3 sequences in the nasal aspirates of infected children (Cubie et al., 1992; Freymuth et al., 1995; Karron et al., 1994; Milaan et al., 1993; Paton et al. , 1992; Sullender et al., 1993; Gilbert et al., 1996; Cane et al., 1991).
  • the genome of the RSV and PIV viruses consists of a non-segmented negative strand RNA which is transcribed in a polar fashion (from the 3 ′ end to the 5 ′ end), and in cascade,
  • the N gene which is encoded by a region at the 3 'end of the viral genome, is more intensely transcribed (Banerjee, 1987; Tordo et al. 1988-a) than the other genes, especially the gene L which is encoded by a region located at the 5 'end of the viral genome. Consequently, the N gene was the main target for the detection of RSV and PIV by RT- amplification.
  • Sullender described, in 1993, the use of synthetic oligonucleotide probes complementary to the messenger RNA of the RSV attachment glycoprotein G, known to carry the greatest number of immunological differences between the two subgroups RSVA and RSVB. More particularly, Sullender has synthesized two nucleic acid probes, one of which is complementary to the messenger RNA of the glycoprotein G of RSV type A viruses, based on the corresponding sequences of the RSVA strains "A2" and " Long ”, the second nucleic probe being complementary to the messenger RNA of the glycoprotein G of type B viruses, based on the corresponding sequences of the RSVB strain“ 8/60 ”.
  • the detection test by hybridization of the labeled probes described by Sullender is carried out on fixed cells, after inoculation of a cell culture respectively by laboratory isolates of RSVA and RSVB, without prior amplification reaction of the viral RNA. This test made it possible to effectively differentiate fixed cells previously infected with an RSVB or RSVA isolate without the probes exhibiting a cross-hybridization reaction.
  • the pair of primers specific to RSV does not make it possible to differentiate according to whether the RNA present in the biological sample, in this case a nasopharyngeal wash, comes from an RSVA virus or from an RSVB virus. .
  • Cane et al. In 1991, used, for the diagnosis of RSV viruses, several pairs of primers complementary to the N gene or to the gene coding for small hydrophobic proteins (SH proteins).
  • SH proteins small hydrophobic proteins
  • the amplicon generated using the pair of primers complementary to a region of the RSV N gene exhibits several restriction profiles, respectively three different restriction profiles for RSV type A viruses and two different restriction profiles for RSV virus type B.
  • the test developed by Cane et al. therefore requires a fairly complex analysis to determine the type of RSV present in the sample. Paton et al., In 1992, synthesized a pair of primers specific for a region of the gene for the FI subunit of the fusion glycoprotein F of RSV viruses.
  • This technique allowed Paton to specifically amplify, by an RT-PCR reaction, the RNA of RSVs present in the cultures of cell lines inoculated with aliquots of nasal aspirates of infected patients, without however being able to differentiate the RSVs. type A and type B.
  • Tordo et al. have, during the Congress of July 1995 organized by the journal FEMS in Turkey, described a couple of generic primers, respectively complementary to the motifs A and C of the gene for the large subunit (L) of the polymerase of the viruses RSVA and PIV3 .
  • the L gene of PIV3 is described in particular in PCT application No. WO 97/20468 (St Louis Univ.).
  • the unsegmented negative strand RNA virus polymerase is unique in that it recognizes the viral genome only when it is associated with the nucleocapsid protein (N).
  • This polymerase consists of a phospho-protein (protein P or NS) and a large protein (L), which constitute the different subunits of the catalytically active assembly.
  • the large subunit (L), with a molecular weight of 220 kD, is considered to be the support for transcription and viral replication activity, even if protein P seems essential for the expression of enzymatic activity. .
  • RNA viruses chosen from rhabdoviruses (vesicular stomatitis virus, and rabies virus) and paramyxoviruses (Sendai virus, Newcastle disease virus, and virus measles) made it possible to distinguish, in protein L, six particular regions which are well conserved between the different viral types and numbered from I to VI (Poch et al., 1990).
  • the pairs of primers defined recently by Tordo et al. are located in the region of the L gene coding for region III of the protein. These pairs of primers have been shown to be able to generate, by an RT-PCR reaction, a 350 bp amplicon from prototype strains and clinical isolates of viruses of the RSVA, PIV3 and RSVB type. These authors were able to show that the action of the restriction enzymes Avall, BglII and PvuII on the amplicons generated led to restriction profiles characteristic of each of the three types of respiratory paramyxovirus. The technique developed by Tordo et al.
  • polynucleotides useful as probes and / or primers usable in a method of differential diagnosis of viruses of the RSVA, PIV3 and RSVB type endeavored to isolate the region of the genome of the RSVB virus coding for the large sub -unit (L) of the polymerase and to sequence region III of the latter.
  • the sequencing of region III of the RSVB L gene enabled the inventors to construct polynucleotides having different hybridization characteristics with said sequence of the RSVB L gene, but also, after a comparative analysis, with the corresponding respective sequences of the L gene RSVA and PIV3 viruses.
  • the inventors have thus sequenced region III of the gene coding for the large subunit (L) of the polymerase of RSVB type viruses.
  • the sequence of the polypeptide corresponding to region III enabled them to precisely define, by comparison with the sequences of the polypeptides encoded by the L gene of viruses of the RSVA and PIV3 type, then analysis of the conserved regions, of the pairs of generic primers, different of those described above by Tordo et al., capable of amplifying both the RNA corresponding to particular regions of the L gene of the three types of respiratory paramyxovirus considered.
  • the identification of the sequence of region III of the L gene of the RSVB virus has made it possible, after comparative analysis of the least well-preserved regions of the corresponding polypeptide, the synthesis of pairs of specific primers of a given type of respiratory paramyxovirus, chosen from RSVA, RSVB and PIV3, which do not show a cross-amplification reaction with a nucleic acid originating from a virus of another type.
  • the isolation and characterization of the L gene sequence from the RSVB virus also allowed the inventors to define oligonucleotide probes specifically hybridizing with the RNA of a given type of respiratory paramyxovirus chosen from RSVA, RSVB and PIV3, as well as generic probes hybridizing indifferently with one or the other type of respiratory paramyxovirus, the latter being useful in particular as internal controls in a detection test by hybridization of a nucleic acid present in a biological sample originating from a patient suspected of be infected with a respiratory paramyxovirus.
  • the subject of the present invention is a polynucleotide of 355 base pairs corresponding to region III of the L gene of RSVB type viruses.
  • the invention relates to a polynucleotide characterized in that it is chosen from: a) a polynucleotide comprising at least 12 consecutive nucleotides of the following nucleotide sequence (SEQ ID No. 1):
  • the underlined sequences correspond respectively to the sequence of the oligonucleotide primer PI (SEQ JD No. 7) and to the region of hybridization of the oligonucleotide primer P2 (SEQ ID No. 8).
  • sequence SEQ ID No. 1 can be aligned with the corresponding sequences of the L gene from other types of paramyxovirus.
  • sequence SEQ ID No. 1 can be aligned with the corresponding sequence of the L gene of the strain RSVA S2 ts
  • the base (A) at 3 ′ of the sequence SEQ ID No. 1 corresponds to the nucleotide at position 2092 of the L gene of this RSVA isolate and the base (G) in 5 ′ of the sequence SEQ ID No. 1 corresponds to the nucleotide at position 2446 of the L gene of this RSVA isolate, it being understood that the numbering of the nucleotides of the L gene of said RSVA isolate is produced by taking as a reference the base A of the ATG codon at the start of translation, numbered n ° 1.
  • polynucleotide or nucleic acid is understood to mean both a double-stranded RNA, a single-stranded RNA, a single-stranded or double-stranded DNA corresponding to the reverse transcription product of said RNAs and transcription products of said RNAs or DNAs.
  • Particular fragments of the polynucleotide of sequence SEQ ID No. 1 can be obtained by causing the appropriate restriction enzymes to act according to the method described in Sambrook's book of 1989, the skilled person being guided, for the choice of the enzymes of restriction to be used, by the restriction card of the sequence SEQ
  • polynucleotide of complementary sequence is meant any RNA or DNA whose nucleotides are complementary to those of SEQ ID N ° 1 or part of SEQ ID N ° 1, and whose orientation is reversed.
  • Hybridization under conditions of high stringency means that the conditions of temperature and ionic strength are chosen in such a way that they allow hybridization to be maintained between two complementary nucleic acid fragments.
  • stringency conditions of the hybridization step for the purpose of defining the polynucleotides according to the invention are advantageously as follows: the hybridization is carried out at a preferential temperature of 65 ° C. in the presence of buffer 6 x SSC, 5 x Denhardt's solution, 0.5% SDS and 100 ⁇ g / ml of DNA from salmon sperm.
  • a solution of 1 x SSC corresponds to 0.15 M NaCl and 0.05 M citrate of Na and a solution of 1 x Denhardt corresponds to 0.02% Ficoll, 0.02% of polyvinylpyrrolidone and 0.02% of bovine albumin serum.
  • the washing steps are advantageously as follows:
  • said polynucleotide defined above comprises the polynucleotide of sequence SEQ ED No. 1 and the fragments thereof, as well as the sequences which have at least 90% homology with said polynucleotide or said fragments.
  • percentage of homology within the meaning of the present invention is meant a percentage of identity between the bases of the two homologous polynucleotides, this percentage being purely statistical and the differences between the two polynucleotides being distributed randomly and over their entire length.
  • the invention also relates to a nucleotide fragment characterized in that it is capable of hybridizing under conditions of high stringency with a sequence as defined above.
  • polynucleotides as defined above are capable of constituting oligonucleotide probes for the specific detection of a paramyxovirus of the RSVB type.
  • such probes comprise a sequence of at least 12 consecutive nucleotides of the polynucleotide of sequence SEQ ID No. 1, of a polynucleotide whose sequence is complementary to the sequence of the polynucleotide of SEQ ID No. 1 or also of a polynucleotide hybridizing under conditions of high stringency with the latter.
  • nucleotide sequences characterizing the specific RSVB probes according to the invention are chosen from regions of the L gene of the RSVB virus which are particularly conserved between different isolates of this virus and which are divergent with the corresponding sequences of the other paramyxoviruses ( Figure 2).
  • an oligonucleotide probe specifically hybridizing with the sequence SEQ ID No. 1 according to the invention is advantageously the oligonucleotide characterized by the following nucleotide sequence: SEQ ID No. 2: 5 '-AACTTCATTAAGATTGACAACATGATCCTTTATGAAAGGA- 3', it being understood that the polynucleotide of sequence complementary to the sequence SEQ ID No. 2 also constitutes a probe according to the invention.
  • Other oligonucleotide probes specific for the RSVB type virus are the polynucleotides of sequences SEQ ID No. 14 to 16 described later in this specification, as well as the polynucleotides of sequences complementary to SEQ ID No. 14 to 16.
  • polynucleotides and oligonucleotide probes according to the present invention are advantageously labeled with a radioactive compound or a non-radioactive compound, or else with an unrelated oligonucleotide covalently linked to these and useful as a means of labeling (for example by hybridization with complementary oligonucleotides themselves labeled with an enzyme, a fluorophore compound or a radioactive compound).
  • polynucleotides and oligonucleotide probes are immobilized on a support, covalently or non-covalently.
  • the subject of the invention is also nucleotide primers for the specific amplification of a genome polynucleotide and / or of a complementary DNA corresponding to the messenger RNA of a paramyxovirus of RSVB type, characterized in that they comprise a sequence of at least 12 consecutive nucleotides of a polynucleotide of sequence SEQ ID No. 1, of a polynucleotide whose sequence is complementary to the sequence of the polynucleotide of SEQ ID No. 1 or of a polynucleotide hybridizing in high stringency conditions with these.
  • the nucleotide sequences characterizing the specific primers of RSVB according to the invention are chosen from regions of the L gene of the RSVB virus which are particularly conserved between different isolates of this virus and which are divergent with the corresponding sequences of the other paramyxoviruses ( Figure 2). More particularly, it will be ensured that the last three bases of the 3 'end of said primers are perfectly complementary to the corresponding sequence of the L gene of RSVB and lead to mismatches with respect to the corresponding sequences of the other paramyxoviruses. .
  • nucleotide primers specific for the amplification of a nucleic acid of a paramyxovirus of the RSVB type characterized in that they comprise a nucleic sequence responding to one of the following nucleotide sequences: SEQ ID N ° 3 (primer go): 5'-CTCTTGGTTGCATTTAACAATA-3 '; SEQ ID N ° 4 (primer go): 5'-GTTGTCAATCTTAATGAA-3 '; SEQ ID N ° 5 (return primer): 5'-TATCAGAGCTGTGATG-3 '.
  • the subject of the invention is also a pair of nucleotide primers specific for the amplification of a nucleic acid of a paramyxovirus of the RSVB type, characterized in that it is one of the following pairs of primers : a) SEQ ID N ° 3 and SEQ ID N ° 5 (generating an amplicon of approximately 210 base pairs); b) SEQ ID N ° 4 and SEQ ID N ° 5 (generating an amplicon of approximately 150 base pairs).
  • Polynucleotides having a sequence exactly complementary to sequences SEQ ID No. 3 to 5 can also be used as primers specific for a virus of RSVB type and therefore also form part of the invention.
  • Another object of the present invention consists of a method for the specific detection of the presence of a paramyxovirus belonging to the RSVB type in a biological sample, characterized in that it comprises the following steps: a) bringing the biological sample with a pair of primers specific for the RSVB paramyxovirus according to the invention, the nucleic acid contained in the sample having, where appropriate, been made available beforehand for hybridization, under conditions allowing hybridization of the primers to RSVB type virus nucleic acid; b) amplification of the RSVB type virus nucleic acid; c) demonstrating the amplification of nucleic acid fragments corresponding to the fragment framed by the primers, for example by gel electrophoresis or by means of an oligonucleotide probe specific for RSVB according to the invention
  • the invention also relates to a kit or kit for the specific detection of the presence of a paramyxovirus belonging to the RSVB type in a biological sample, characterized in that it comprises the following elements: a) a pair of nucleotide primers specific for the RSVB virus according to the invention; b) the reagents necessary to carry out an amplification reaction of a nucleic acid; c) where appropriate, a component making it possible to detect the amplified nucleic acid fragment, preferably an oligonucleotide probe specific for RSVB according to the invention, or else a consensus probe according to the invention hybridizing with different paramyxoviruses, said probes being where appropriate radioactively or non-radioactively marked.
  • the present invention also relates to a polypeptide corresponding to region III of the large subunit (L) of the polymerase of RSVB type viruses, characterized in that it is chosen from: a) a polypeptide whose sequence comprises the following sequence of amino acids SEQ ID N ° 6:
  • sequence SEQ ID N ° 6 is represented according to the international one-letter code. The correspondence with the three-letter code can be easily found, for example in the work of Stryer, Biochemistry, Third Ed. (1988). Furthermore, the correspondence between the nucleic acid sequence SEQ ID N ° 1 and the amino acid sequence SEQ ID N ° 6 is shown in paragraph Annex 2.
  • Such a polypeptide is capable of being recognized specifically by the antibodies present in the serum of patients infected with a respiratory paramyxovirus of the RSVB type.
  • the polypeptide of sequence SEQ ID No. 6, its fragments and its modified derivatives are capable of inducing in vivo antibodies capable of recognizing the polypeptide corresponding to region III of the large subunit (L) RSVB type virus polymerase.
  • the polypeptides homologous to the polypeptide of sequence SEQ ID No. 6 as well as the fragments of such homologous polypeptides are included in the invention.
  • homologous polypeptide for the purposes of the present invention is meant a polypeptide comprising one or more deletions and / or substitutions of amino acids in the sequence SEQ ID No. 6.
  • amino acids - consecutive or non-consecutive - are replaced by “equivalent” amino acids.
  • equivalent amino acid is intended here to denote any amino acid capable of being substituted for one of the amino acids of the basic structure without, however, essentially modifying the immunogenic properties of the corresponding peptides.
  • the equivalent amino acids will be those which make it possible to obtain a polypeptide of modified sequence which allows the in vivo induction of antibodies capable of recognizing the polypeptide of sequence SEQ ID No. 6 or one of its fragments defined above.
  • the homologous polypeptides are part of the peptide derivatives in the present description.
  • substitutions which may be carried out without resulting in a profound modification of the immunogenicity of the corresponding modified peptides, the replacements, for example, of leucine by valine or isoleucine, aspartic acid by glutamic acid, glutamine by asparagine, arginine by lysine etc., the reverse substitutions being naturally possible under the same conditions.
  • substitutions of one or more consecutive or non-consecutive amino acids of the polypeptide of sequence SEQ ID No. 6, without significantly modifying the three-dimensional structure and / or the immunogenicity of the resulting polypeptide, compared to the initial polypeptide may also advantageously refer to the work of Bowie et al. (1990).
  • the present invention also relates to a family of recombinant vectors, characterized in that they contain at least one nucleotide sequence in accordance with the invention.
  • said vector comprises the nucleotide sequence SEQ ID No. 1 or a fragment thereof.
  • said vector is a plasmid, this plasmid comprising said sequence associated with a vector of pUC type.
  • One such plasmid corresponding to the above definition is the plasmid pUCl8 into which the sequence SEQ ID No. 1 has been inserted at the Smal restriction site, located between a KpnI site on the 5 ′ side of SEQ ID No.
  • Another object of the present invention is therefore a vector suitable for the cloning and / or the expression and or the insertion of a sequence, characterized in that it comprises a nucleotide sequence described above at a nonessential site. for its replication, if necessary under the control of regulatory elements capable of intervening in the expression of the polypeptide corresponding to region III of the large subunit (L) of the polymerase of RSVB type viruses, in a determined host.
  • the promoter regions of the expression of SEQ ID No. 1 or of a fragment of this sequence are chosen according to the cell host in which the expression of the polynucleotide of interest is desired.
  • Preferred bacterial promoters for the expression of the polynucleotides according to the invention are the lad promoters, lacZ, the promoters of the RNA polymerase of bacteriophage T3 or T7, the promoter of polyhedrin or of the protein plO of baculovirus (Novagen kit) (Smith et al., 1983; O'Reilly et al., 1992), the lambda PR promoter or even the trc promoter.
  • Preferred promoters for the expression of the polynucleotides according to the invention in eukaryotic cell hosts are the CMV early promoter, the herpes simplex virus thymidine kinase promoter, the early promoter or the late promoter of the SV40 virus, the LTR regions of certain retroviruses or the mouse metallothionein I promoter.
  • vectors are for example plasmids, phages, cosmids, phagemids, YACs.
  • the following vectors are used for expression of the polypeptide according to the invention in a particular cellular host: a) vectors for bacteria: pBs, phagescript, PsiX174, pBluescript SK, pNH8a, pHNl ⁇ a, pNH18a, pNH46a, marketed by the Stratagene company; pTrc99A, pKK223-3, pDR540, pRIT5, sold by the company Pharmacia, transfer vector of baculovirus type pNL1392 / 1393 (Pharmingen); pQE-30, marketed by 0 the company QIAexpress; b) vectors for eukaryotic cells: pWLneo, pSV2cat, pOG44, pXTl, pSG, sold by the company Stratagene; pSVK3,
  • a recombinant cell host according to the invention is characterized in that it is modified by a nucleotide sequence or a vector described above.
  • the following cellular hosts are used: a) prokaryotic hosts: Escherichia coli strains (eg the strain DH5- ⁇ ) or Bacillus subtilis; b) eukaryotic hosts: HeLa cells (ATCC N ° CCL 2; N ° CCL 2.1; N ° CCL 2.2), Cv-1 cells (ATCC N ° CCL70), COS cells (ATCC N ° CRL1650; N ° CRU 651), Sf-9 cells (ATCC No. CRL1711).
  • the cell host is modified by the sequence SEQ ID No.
  • a particular recombinant cell host containing the polynucleotide of sequence SEQ ID No. 1 is the E. coli ASC.3 clone deposited at the CNCM on June 20, 1997 under the access number 1-1880.
  • the invention also relates to a recombinant polypeptide characterized in that it is obtained from a recombinant cellular host as defined above, and preferably obtained according to the method described below.
  • polypeptide of sequence SEQ ID No. 1 can be inserted into an expression vector suitable for producing in vitro a polypeptide corresponding to region III of protein L of the RSVB polymerase.
  • This polypeptide may be fixed on a microplate to develop a serological test intended to search, for diagnostic purposes, the specific antibodies in patients infected with the RSVB virus.
  • the present invention relates more particularly to a process for the preparation of a polypeptide of the invention comprising the following steps: a) if necessary, the prior amplification according to the PCR technique of the quantity of polynucleotide coding for said polypeptide at 1 using two nucleotide primers chosen so that one of these primers is identical to the first 10 to 25 nucleotides of the polynucleotide encoding said polypeptide, while the other primer is complementary to the last 10 to 25 nucleotides (or hybridizes with these last 10 to 25 nucleotides) of said polynucleotide, or vice versa so that one of these primers is identical to the last 10 to 25 nucleotides of said polynucleotide, while that the other primer is complementary to the first 10 to 25 nucleotides (or hybridizes with the first 10 to 25 nucleotides) of said polynucleotide, followed by the introduction of said polynucleotide thus ampl
  • polypeptide of sequence SEQ ID No. 6, its fragments and its peptide derivatives can advantageously be used.
  • this method comprising contacting the biological sample with a polypeptide according to the invention under conditions allowing an in vitro immunological reaction between said polypeptide and the antibodies possibly present in the biological sample, and the in vitro detection of the antigen-antibody complexes possibly formed.
  • the biological sample consists of a fluid, for example a patient serum.
  • a preferred method involves immunoenzymatic processes according to the ELISA technique, or immunofluorescent, or radioimmunological (RIA) or equivalent.
  • the invention also relates to the polypeptide of sequence SEQ ID No. 6 according to the invention, or any fragment or peptide derivative as described above, labeled using an adequate marker of the fluorescent enzyme type, radioactive, etc.
  • Such methods include, for example, the following steps: - depositing determined quantities of a polypeptide composition according to the invention in the wells of a microtiter plate,
  • the invention also relates to a kit or a kit for the in vitro diagnosis of an infection with an RSVB virus, comprising:
  • these reagents can also carry a marker, or be capable of being recognized in their turn by a labeled reagent, more particularly in the case where the polypeptide of sequence SEQ ID N ° 6, one of its fragments, one of their peptide derivatives or a recombinant polypeptide according to the invention, is not labeled,
  • a reference biological sample devoid of antibodies recognized by the polypeptide of sequence SEQ ID No. 6, by one of its fragments, by one of their peptide derivatives or by a recombinant polypeptide according to the invention
  • a reference biological sample positive control containing a predetermined quantity of antibodies recognized by the polypeptide of sequence SEQ ID No. 6, by one of its fragments, by one of their peptide derivatives or by a recombinant polypeptide according to the invention.
  • the polypeptides according to the invention make it possible to prepare monoclonal or polyclonal antibodies characterized in that they specifically recognize said polypeptides.
  • the monoclonal antibodies can advantageously be prepared from hybridomas according to the technique described by Kohler and Milstein in 1975.
  • the polyclonal antibodies can be prepared, for example by immunization of an animal, in particular a mouse, with a polypeptide according to the invention associated with an adjuvant of the immune response, then purification of the specific antibodies contained in the serum of the immunized animals on an affinity column on which has been previously fixed the polypeptide having served as antigen.
  • polyclonal antibodies according to the invention can also be prepared by purification on an affinity column, on which a polypeptide according to the invention has previously been immobilized, antibodies contained in the serum of patients infected with a paramyxovirus of RSVB type.
  • the invention therefore relates to a method for the specific detection of the presence of an antigen of a RSVB type virus in a biological sample, characterized in that it comprises the following steps: a) bringing the biological sample (tissue or biological fluid) taken from an individual with an antibody directed against a polypeptide according to the invention, under conditions allowing an immunological reaction in vitro between said antibody and said polypeptide present in the biological sample; b) highlighting of the antigen-antibody complex formed.
  • kits or a kit for the in vitro diagnosis on a biological sample of the presence of RSVB type virus in a biological sample characterized in that it comprises: a) an antibody polyclonal or monoclonal according to the invention; b) if necessary, the means necessary for the detection of the antigen-antibody complex formed.
  • kits or kit for the specific diagnosis of the presence of an RSVB-type paramyxovirus in a biological sample characterized in that it comprises: a) a polyclonal or monoclonal antibody according to the invention; b) where appropriate, a reagent for constituting the medium suitable for carrying out the immunological reaction; c) a reagent allowing the detection of antigen-antibody complexes produced by the immunological reaction, said reagent being able to carry a marker, or to be susceptible to be recognized in turn by a labeled reagent, more particularly in the case where said monoclonal or polyclonal antibody is not labeled; d) where appropriate, reagents for carrying out the lysis of the cells of the test sample.
  • the subject of the invention is also an immunogenic composition characterized in that it comprises one or more polypeptides according to the invention, where appropriate in the presence of an immunity adjuvant such as the complete Freund's adjuvant, incomplete Freund's adjuvant or a compound from the family of muramyl peptides.
  • an immunity adjuvant such as the complete Freund's adjuvant, incomplete Freund's adjuvant or a compound from the family of muramyl peptides.
  • the polypeptide (s) contained in an immunogenic composition according to the present invention can (be) coupled (s) to immunogenic agents, such as KLH (Keyhole lympet Hemocyanin), ovalbubin, serum bovine or human albumin, tetanus toxoid (tetanus toxoid), etc., via a coupling agent such as glutaraldehyde or carbodiimide.
  • immunogenic agents such as KLH (Keyhole lympet Hemocyanin), ovalbubin, serum bovine or human albumin, tetanus toxoid (tetanus toxoid), etc.
  • a coupling agent such as glutaraldehyde or carbodiimide.
  • the polypeptide (s) contained in the composition is (are) conjugated (s) to ovalbumin (Calbiochem) using the benzidine-bis-diazotized protocol described by Gregory et al.
  • polypeptide (s) conjugated or unconjugated
  • the polypeptide (s), conjugated or unconjugated is (are ) then injected into the animal, for example into the rabbit or the mouse, preferably by multi-point intradermal injection; generally, ten injection points are made.
  • the injection at time 0 is carried out with 1 mg of said conjugated polypeptide.
  • the animals are injected with 0.5 mg of the same conjugated polypeptide and a third injection of 0.5 mg of said conjugated polypeptide is carried out two to four months after the second injection.
  • the antiserum is collected between two and four weeks after the third injection of said conjugated polypeptide and is, if necessary, purified on an affinity chromatography column on which the polypeptide having served as antigen has been immobilized beforehand.
  • a technique for preparing such an affinity chromatography column is for example described by Bird et al. in 1984.
  • the invention also relates to polynucleotides characterized in that they code for a polypeptide according to the invention.
  • Multiple alignment of the amino acid sequences of the L gene of the RSVA, PIV3 and RSVB type viruses has enabled the inventors to define regions of great conservation between the viruses.
  • several pairs of consensus or generic primers have been synthesized, characterized in that they can be used in an amplification reaction of a target nucleic acid to amplify indifferently the RNA originating from one or other of the respiratory paramyxoviruses of the RSVA, PIV3 or RSVB type.
  • the degeneracy of the genetic code (“wooble") was taken into account.
  • the amino acids encoded by a small number of codons (example: W) were preferred so as to limit the probability of sequence variability between the sequence of the primers and the sequence of the target nucleic acid and consequently limit the probability of mismatches between primer and target nucleic acid.
  • the generic primers according to the invention are defined in three regions of very high conservation: - the region going from the nucleotide in position nt 1261 to the nucleotide in position nt 1295 (RSVA numbering in FIG. 7); the region going from the nucleotide in position nt 1402 to the nucleotide in position nt 1443 in FIG. 7;
  • a preferred forward primer will comprise the following nucleotide sequence:
  • the primer of SEQ ID N ° 27 has a mismatch with the genome of
  • a preferred forward primer will comprise the following nucleotide sequence: SEQ ID No. 23: 5 875 -AGGTAGATGTTTGCAA-1891-3 '.
  • the primer of SEQ ID No. 23 has a mismatch with the RSVA genome (C / A) and has a mismatch with the PIV3 genome (G / C).
  • SEQ ED N ° 23 is advantageously used as a return initiator; it is the polynucleotide comprising at least 12 consecutive nucleotides of the following sequence:
  • a preferred forward primer will comprise the following nucleotide sequence: SEQ ID No. 25: 5'-2341-TGTCAAAAACTATGGAC-2357-3 '.
  • the primer of SEQ ID No. 25 has a mismatch with the RSVA genome (A / G) and has a mismatch with the PIV3 genome (C / T).
  • This primer has a perfectly complementary sequence with the RSVB genome.
  • SEQ ED No. 25 is advantageously used as a reverse primer; it is the polynucleotide comprising at least 12 consecutive nucleotides of the following sequence: SEQ ID No. 26: 5'-2357-GTCCATAGTTTTTGACA-2341-3 '.
  • the subject of the present invention is also a nucleotide primer for the amplification of a genome polynucleotide and / or of a complementary DNA corresponding to the messenger RNA of a paramyxovirus of RSV and PIV type, characterized in that that it comprises a nucleotide sequence included in the nucleotide regions of the L gene of RSV or PIV as defined above, and more particularly the polynucleotides defined above comprising all or part of the nucleotide sequences of sequences SEQ EDN 23 to 26
  • the present invention also relates to a pair of nucleotide primers for the amplification of a genome polynucleotide and / or of a complementary DNA corresponding to the messenger RNA of a paramyxovirus of RSV and PIV type, characterized in that '' it includes a combination of nucleotide sequences included in nucleotide regions of the L gene of RSV or PIV very highly conserved between t viruses different
  • the primers were chosen so as to hybridize with fairly close sequences on the genome.
  • a pair of nucleotide primers corresponding to the above definition is characterized in that it is one of the following pairs of primers:
  • the different pairs of defined generic primers are used in combination in the reaction mixture necessary for the amplification reaction.
  • the invention also relates to a method for the specific detection of the presence of a paramyxovirus belonging to the RSVA, RSVB or PIV3 type in a biological sample, characterized in that it comprises the following steps: a) the DNA of the biological sample, or the cDNA obtained by reverse transcription of the RNA of the biological sample, is amplified using a pair of primers as defined above, the nucleic acid contained in the sample biological having, where appropriate, previously made available for hybridization, under conditions allowing hybridization of the nucleotide primers to the nucleic acid of a paramyxovirus of the RSVA, RSVB or PIV3 type; b) bringing a polynucleotide or a mixture of probes specific for a paramyxovirus of a given type into contact with the nucleic acid resulting from the amplification of step a); in a particularly preferred mode of said specific detection method, the specific probes are the polynucleotides of sequences SEQ ID No. 10 to
  • the present invention also relates to a kit or necessary for the specific detection of the presence of a paramyxovirus belonging to the RSV or PIV type in a biological sample, characterized in that it comprises: a) at least one pair of primers nucleotides as defined above; b) the reagents necessary for carrying out an amplification reaction of a target nucleic acid.
  • said detection kit or kit is characterized in that it comprises at least two pairs of primers according to the invention.
  • said detection kit or kit is characterized in that it also comprises at least one oligonucleotide probe specific for the L gene of a given paramyxovirus, and very preferably the olignucleotide probe is chosen from polynucleotides of sequences SEQ ID No. 10 to SEQ ID No. 18 and
  • said detection kit or kit can comprise in addition, a generic oligonucleotide probe, such as for example a probe of sequence SEQ ID No 19, SEQ ID No 20, SEQ ID No 21 or SEQ ID No 22.
  • the consensus or generic pairs of primers according to the invention can be advantageously used in a differential diagnosis method for RSVA, RSVB and PIV3 viruses, in which the actual differential diagnosis step consists either of an analysis of the restriction profile characteristic of the amplicons generated using the pair of primers considered, or a specific detection of the amplicon generated using specific probes according to the invention, specifically hybridizing with the corresponding amplicon of an RSVA, PIV3 or RSVB type virus, or even any other conventional technique for characterizing an amplicon well known to those skilled in the art.
  • the pairs of primers specific to RSVB or the pairs of generic primers according to the invention can be used in different types of amplification reaction of a target nucleic acid, if appropriate after transformation of the RNA present in the biological sample into its cDNA by causing an enzyme with reverse transcriptase activity to act.
  • PCR polymerase chain reaction using polymerase, which was first described in 1985 by Saiki et al. and which is the subject of European patents EP 201 184 and EP 200 362 or also in the work of Erlich (1989), Innis (1990) or Rolfs (1991).
  • the oligodeoxyribonucleotide or oligoribonucleotide primers according to the invention advantageously have a length of at least 12 nucleotides.
  • One of the two primers is complementary to the (+) strand [go primer] of the matrix and the other primer is complementary to the (-) strand [return primer]. It is important that the primers do not have a secondary structure or sequence complementary to each other.
  • the length and the sequence of each primer must be chosen so that the primers do not hybridize with other nucleic acids originating from viruses or from prokaryotic or eukaryotic cells, in particular with nucleic acids. coming from paramyxoviruses not belonging to the RSVA, PIV3 or RSVB types, nor with human DNA or RNA which could possibly contaminate the biological sample.
  • the amplified fragments can be identified by agarose or polyacrylamide gel electrophoresis, or by capillary electrophoresis, or by chromatographic technique (gel filtration, hydrophobic chromatography or ion exchange chromatography), where appropriate after having activated one or more appropriate restriction endonucleases, or else by any other technique for visualizing amplified nucleic acid fragments well known from the skilled person.
  • the invention also relates to the nucleotide fragments obtained by amplification of the polynucleotide of sequence SEQ ID No. 1 using a pair of primers according to the invention, more particularly using any of the pairs of specific primers of paramyxovirus type RSVB or of the pairs of generic primers defined above.
  • amplified nucleotide fragments (amplicons) defined above.
  • the SDA (Strand Displacement Amplification) technique or strand displacement amplification technique is an isothermal amplification technique, the principle of which is based on the ability of a restriction enzyme to cut the one of the two strands of its recognition site which is in a hemiphosphorothioate form and on the property of a DNA polymerase to initiate the synthesis of a new strand of DNA from the 3 'OH end created by l restriction enzyme and to move the previously synthesized strand which is downstream.
  • the method comprises two main steps: a) synthesis, in the presence of dCTP-alpha-S, of DNA molecules flanked by restriction sites which can be cut by an appropriate enzyme; b) exponential amplification of these DNA molecules thus modified, by enzymatic cleavage, displacement of strand and copying of the displaced strands.
  • the cutting, moving and copying steps are repeated a sufficient number of times in order to obtain good sensitivity.
  • the protocol of the SDA technique is simple: the target DNA present in the sample to be analyzed is denatured by heat in the presence of all the reagents except the enzymes (restriction enzyme and polymerase) which are added to the reaction medium after the denaturation stage.
  • the doubling time of the target DNA was 26 seconds and its amplification rate reached 10 after 15 minutes of incubation at 60 ° C.
  • the SDA technique is simpler to perform than PCR (a water bath is sufficient) and it is faster than other amplification techniques.
  • Another object of the present invention is therefore the implementation of the specific oligonucleotide primers according to the invention in a DNA or RNA amplification method according to the SDA technique above.
  • the SDA amplification method is based on the use of oligonucleotide primers modified in 5 ′ by the addition of a DNA sequence recognized by a restriction enzyme, for example the enzyme HincII.
  • the process requires the formation of a thiolated restriction site by incorporation of sulfur-containing deoxyadenosine thriphosphate, and the alternating actions of said restriction enzyme (e.g.
  • HincII which partially hydrolyses (on a single strand), said restriction site, and DNA polymerase which synthesizes from the hydrolysis point a new strand, with simultaneous displacement of the previously cut nucleic sequence, without denaturation being necessary.
  • Hybridization of the modified primers on the target requires only a first step of DNA denaturation. The reaction then takes place at 37 ° C. and simultaneously on the two strands of target DNA, which leads to an exponential increase in the number of copies as a function of the reaction time.
  • the method allows an average amplification of the target by ⁇ of the order of at least 10.
  • two pairs of primers are used: a pair of external primers (B1, B2) consisting of a sequence hybridizing with the SEQ ID No. 1 or their complementary sequence, and a pair of internal primers (SI, S2) consisting of an oligonucleotide of fusion between a specific sequence of SEQ ID No. 1 or their complementary sequence fused to a nucleotide sequence containing a site recognized by a restriction endonuclease, for example the enzyme iîsoBI.
  • B1, B2 consisting of a sequence hybridizing with the SEQ ID No. 1 or their complementary sequence
  • SI, S2 pair of internal primers
  • the pairs of primers used for carrying out an amplification reaction of SDA type are the pairs of consensus or generic primers according to the invention.
  • the generic primers according to the invention in an SDA type amplification method, it is possible, to produce a primer which can be used in an SDA reaction, add, at the 5 ′ end of the region of the primer of sequence SEQ ID No. 3 according to the invention, a non-specific sequence of the L gene of the large subunit of the paramyxovirus polymerase, in particular of the RSVA, PIV3 or RSVB viruses, containing a site of restriction, and more particularly a restriction site recognized by the endonuclease HincII or i? soBI.
  • Such an additional sequence containing the restriction site recognized by the JBSOBI endonuclease is advantageously the nucleotide sequence GCATCGAATGCATGTCTCGGGT, the nucleotides represented in bold characters corresponding to the recognition site of the enzyme BsoB1.
  • a primer according to the invention which can be used in the context of an SDA type amplification can be produced from the sequence of the primer chosen and will consist of the sequence: GCATCGAATGCATGTCTCGGGTCTCTTGGTTGCATTTAACAATA (containing SEQ ID N ° 3 ), in which the nucleotides represented in bold type corresponding to the recognition site of the .BsoBI enzyme and the underlined nucleotides correspond to the specific sequence of the target DNA.
  • a second set of primers, amplifying the other end of the target nucleic acid will be produced as described above.
  • the detection probe will be chosen in such a way that it hybridizes with the amplicon generated.
  • Similar primers which can be used in an SDA type amplification technique can be produced from any of the primers according to the invention and more particularly with any of the primers of sequences SEQ ID No. 3, 4, 5, 7, 8, 9 according to the invention.
  • the invention therefore also relates to nucleotide primers in accordance with the primers described above for the implementation of a DNA amplification technique by strand displacement (SDA).
  • SDA strand displacement
  • the incomplete reactions Prior to the addition of HincII, exo ' Klenow and MgC_ 2 , the incomplete reactions (40 ⁇ l) are heated at 95 ° C for 2 min in order to denature the target DNA, then are placed at a temperature of 40 ° C for 2 min in order to hybridize the primers. After the addition of 10 ⁇ l of the enzyme mixture consisting of 5 ⁇ l of MgCl 2 at 77 mM, 0.2 ⁇ l of exo ' Klenow (10 U / ⁇ l), 2 ⁇ l HincII (75 U / ⁇ l) and 2 , 8 ⁇ l of 50% glycerol, the reaction mixture is incubated at 40 ° C for 2 h.
  • the incomplete reactions Prior to the addition of BsoBl, exo ' Bca and MgCl 2 , the incomplete reactions (40 ⁇ l) are heated at 95 ° C for 2 min in order to denature the target DNA and then are placed at 56 ° C for 2 min in order to hybridize the primers.
  • polynucleotides of sequence SEQ ID No. 1 and their nucleotide fragments useful as specific primers for paramyxoviruses of the RSVB type described above, as well as all of the generic primers according to the invention, can also be used in other methods for amplifying a target nucleic acid, such as: - the technique of amplification by strand displacement described in French patent application No. FR-9508945 (Bio Mérieux); - the TAS (Transcription-based Amplification System) technique, described by Kwoh et al. in 1989;
  • TMA Transcription Mediated Amplification
  • polynucleotides of sequence SEQ ID No. 1 as well as their oligonucleotide fragments, useful as primers specific for RSVB-type paramyxoviruses, and the nucleotide primers according to the invention can also be used in acid amplification or modification techniques nucleic acid serving as a probe, such as:
  • a multiple alignment of the known amino acid sequences of the L gene of prototype strains (laboratory strains) and of clinical isolates from viruses of the RSVA, PIV3 type and of the new sequence of region III of the N gene of the RSVB virus has enabled the inventors to define regions of low conservation between these different viruses.
  • probes according to the invention useful for specifically distinguishing viruses from the RSVA and RSVB groups have been selected in the region between the nucleotide at position 159 and the nucleotide at position 200 of the amplicon, that is to say in one of the regions in which the sequences of RSVA and RSVB are the most divergent (FIG. 2) .
  • the inventors have developed a differential detection test by hybridization which uses three oligonucleotide probes internal to a determined amplicon, the sequence of each probe being chosen so that the latter is specific for each type of virus and non-specific other viral types whose genome is amplified thanks to generic primers.
  • Example 5 made it possible to demonstrate a correlation of 97.5% between the results obtained with the aid of the specific probes according to the invention and the sequencing data of the amplicons detected with these probes.
  • the test is indeed positive with a homologous probe (index value much greater than 1), and systematically negative with a heterologous probe (index value less than 1).
  • the results obtained by the inventors in Example 5 clearly indicate the absence of cross-hybridization of the specific probes according to the invention with amplicons derived from heterologous genomes.
  • the specific probes for RSVA, RSVB and PIV3 were tested on most clinical samples and prototype strains, for their specific typing capacity for each of the virus groups, in a molecular hybridization test and in an enzyme immunoassay, respectively.
  • the specificity of the test was previously established between each of the probes and the amplicon of a homologous or heterologous prototype strain, namely the amplicons generated respectively from RSVA (Long strain), RSVB (Strain 9320), PIV3 and the virus. from Sendai (Table 1).
  • another object of the invention relates to a polynucleotide with a length of at least 12 nucleotides, characterized in that it is capable of hybridizing specifically, under conditions of high stringency, to a first nucleic acid. encoding the large subunit (L) of the polymerase of a virus of the family Paramyxoviridae of a given type, chosen from viruses of the RSVA, RSVB or PIV3 type or to a second nucleic acid whose sequence is complementary of the first nucleic acid.
  • L large subunit
  • the oligonucleotide probes specific for a given type of paramyxovirus are chosen from a region of the L gene of a given type of paramyxovirus which is very conserved within the different isolates of the respiratory paramyxovirus type with the nucleic acid from which said probe must hybridize specifically and quite divergent between respiratory paramyxoviruses of different types.
  • the probes specifically hybridizing respectively with paramyxoviruses of a different type will have a maximum of 77% identity with each other from the point of view of their nucleotide sequence, so as to avoid any cross-hybridization reaction under the conditions of stringent hybridization defined above in this specification.
  • the above polynucleotide is characterized in that it hybridizes with the nucleic acid coding for region III of the large subunit (L) of the polymerase of a virus of the family of Paramyxoviridae d 'a given type or nucleic acid of complementary sequence.
  • Such a polynucleotide specifically hybridizes with the corresponding nucleic acid of a given type of PIV virus, in particular PIV1, PIV2 and PIV3, or RSV, and more particularly of a given type chosen from paramyxoviruses PIV3, RSVA or RSVB.
  • the sequence of a specific probe according to the invention is defined such that this hybrid probe, under conditions of high stringency, with an amplicon generated in an amplification reaction of target nucleic acid, using of a pair of consensus or generic primers according to the invention, or else hybrid with the amplicon obtained by causing one of the pairs of generic primers described by Tordo et al. in 1995.
  • Such specific oligonucleotide probes according to the present invention are, for example, the following oligonucleotides: a) RSVA specific probes: SEQ ID No. 10: 5'-TACATTGTTAGGATCTACAGTATGATCTCCTATATAGGGG-3 ';
  • SEQ ID No. 15 5'-AGAGGTATTGTTAAATGCAACCAAGAGAAC-3 ';
  • SEQ ID No. 16 5'-TATCAGAGCTGTGATG-3 ';
  • the above polynucleotides can be labeled with a radioactive compound or with a non-radioactive compound.
  • these polynucleotides described above are immobilized on a support, covalently or non-covalently.
  • Another object of the present invention consists of oligonucleotides comprising a consensus type sequence, capable of hybridizing, under highly stringent conditions, to a nucleic acid originating indifferently from a paramyxovirus of the RSVA, RSVB or PIV3 type, to the exclusion of any other paramyxovirus.
  • These oligonucleotide probes are useful in particular as internal controls in a reaction for detecting target nucleic acids originating from paramyxovirus in a biological sample.
  • these consensus or generic oligonucleotide probes make it possible to quantify the target nucleic acid and thus to corroborate the quantitative data provided by the hybridization reaction of a specific probe according to the invention.
  • a biological sample to be tested contains an isolate of paramyxovirus type RSVA, RSVB or PIV3
  • the use of the consensus or generic probe according to the invention allows the experimenter to observe a difference in the intensity of labeling of genetic material from the biological sample due to hybridization of the specific probe and the generic probe.
  • Such consensus or generic probes are chosen in regions of the L gene for which the nucleotide sequences of the different types of respiratory paramyxovius, in particular RSVA, RSVB and PIV3, are very conserved.
  • such consensus or generic probes will be selected in such a way that the region of the L gene with which they hybridize presents, within the various respiratory paramyxoviruses, and very particularly RSVA, RSVB and PIV3, a nucleotide sequence exhibiting a degree of identity of at least 80% between the different types of virus.
  • the detection probe selected will have a sequence having a degree of identity with the target sequences (or with the consensus sequences represented in FIG. 2) of the various respiratory paramyxoviruses of at least 85% , and advantageously at least 88%.
  • Consensus or generic probes according to the invention are, for example, oligonucleotides comprising at least 12 consecutive nucleotides of one of the following nucleotide sequences:
  • oligonucleotides of sequence exactly complementary to the above sequences are also genes consensus or according to the present invention; these are oligonucleotides comprising the following sequences of sequences: SEQ ID No. 21: 5'-GTCCATAATTTTTGACACCAGCCTTCTATACCACC-3 '
  • the oligonucleotides of sequences SEQ ID N ° 19 to 22 hybridize with the sequence between the nucleotide located in position 2357 and the nucleotide located in position 2323 of the L RSVA gene, and with the sequence between the nucleotide located in position 2166 and the nucleotide located at position 2132 of the L gene of PIV3.
  • the nucleotide positions mentioned above are all calculated by taking as a common reference the base A of the ATG codon at the start of translation of the L gene of the corresponding virus, numbered No. 1.
  • motif B has been determined by the inventors as being a region of amino acids which is particularly conserved between the different amino acid sequences characterizing the L gene of paramyxoviruses of the RSVA, RSVB and PIV3 type.
  • the high conservation of the amino acid sequences of motif B of the large subunit of RNA polymerase has been found to correspond to a region of the gene where the corresponding nucleotide sequences have a very high degree of identity. , as illustrated below:
  • ConsPIV3 5 -2132-GGGGGTATAGAAGGATTTTGTCAAAAATTATGGAC-2166- 3'
  • ConsRSVB, ConsRSVA and ConsPIV3 representing the corresponding part of the consensus sequences of each of the viral types established by the inventors and represented in Figure 2.
  • oligonucleotide probes with sequences SEQ ID No. 19 and SEQ ID No. 20 were designed from the above sequence comparisons and their degree of identity with the consensus sequences of each of the viral types PIV3, RSVA and RSVB is shown. below, the asterisks representing the preserved bases:
  • probes 32 P, 35 S, 3 H, 125 I
  • a non-radioactive molecule biotin, acetylaminofluorene, digoxigenin, 5-bromo-deoxyuridine, fluorescein
  • the specific probes or the generic probes according to the invention are brought into contact with a target nucleic acid which will have been previously amplified.
  • non-radioactive labeling of probes are described, for example, in French patent No. 78.10975 or by Urdea et al. or by Sanchez-Pescador et al. in 1988.
  • the hybridization technique can be carried out in various ways (Matthews et al., 1988).
  • the most general method consists in immobilizing the nucleic acid extracted from the biological sample (saliva or cells in cultures inoculated with saliva from a patient) on a support (nitrocellulose, Nylon TM, polystyrene, ...) and incubating, under well-defined conditions, the target nucleic acid immobilized with the probe. After hybridization, the excess probe is eliminated and the hybrid molecules formed are detected by the appropriate method (measurement of radioactivity, fluorescence or enzymatic activity linked to the probe).
  • the labeled nucleotide probes according to the invention can have a structure such that they make it possible to amplify the radioactive or non-radioactive signal.
  • An amplification system corresponding to the definition above will include detection probes in the form of branched DNA (branched DNA) such as those described by Urdea et al. in 1991.
  • branched DNA branched DNA
  • several types of probes will be used, in particular a capture probe, in order to immobilize the target DNA or RNA on a support, and a detection probe.
  • the detection probe binds “branched” DNA with a branched structure.
  • the connected DNA is capable of attaching oligonucleotide probes which are themselves coupled to alkaline phosphatase molecules. Then the activity of this enzyme is highlighted thanks to a chemiluminescent substrate, for example a dioxetane-phosphate derivative.
  • the latter can be used as capture probes.
  • a probe called a “capture probe”
  • a probe is immobilized on a support and is used to capture by specific hybridization the target nucleic acid obtained from the biological sample to be tested. If necessary, the solid support is separated from the sample and the duplex formed between the capture probe and the target nucleic acid is then detected using a second probe, called the “detection probe", marked with an easily detectable element.
  • oligonucleotide fragments can be obtained from the sequences according to the invention, by cleavage with restriction enzymes as described by
  • An appropriate mode of preparation of the nucleic acids of the invention comprising a maximum of 200 nucleotides (or 200 bp in the case of double-stranded nucleic acids) comprises the following steps: a) DNA synthesis using the automated method beta-cyanethylphosphoramidite described by Sonveaux in 1986, b) the cloning of the nucleic acids thus obtained into an appropriate vector and the recovery of the nucleic acid by hybridization with an appropriate probe.
  • Another mode of preparation, by chemical route, of nucleic acids according to the invention of length greater than 200 nucleotides (or 200 bp in the case of double-stranded nucleic acids) comprises the following steps: a) assembly chemically synthesized oligonucleotides, provided at their end with different restriction sites, the sequences of which are compatible with the amino acid chain of the natural polypeptide according to the principle described by Urdea et al. in 1983, b) cloning the nucleic acids thus obtained into an appropriate vector and recovering the nucleic acid sought by hybridization with an appropriate probe.
  • the oligonucleotide probes according to the invention can be used within a detection device comprising a matrix library of oligonucleotides.
  • a matrix library may consist of a matrix of probe oligonuleotides fixed on a support, each of the probes of the matrix arrangement thus being complementary to a distinct sequence from the target DNA or RNA to detect and each probe of known sequence being fixed at a predetermined position of the support.
  • the target sequence to be detected can be advantageously marked radioactive or not radioactive.
  • the labeled target sequence is brought into contact with the matrix device, this forms hybrids with the probes of complementary sequences.
  • a nuclease treatment, followed by washing makes it possible to eliminate the probe-target sequence hybrids which are not perfectly complementary. Because of the precise knowledge of the sequence of a probe at a determined position of the matrix, it is then possible to deduce the nucleotide sequence from the target DNA or RNA sequence.
  • An alternative to the use of a labeled target sequence may consist of the use of a support allowing “bioelectronic” detection of the hybridization of the target sequence on the probes of the matrix support, when said support consists or comprises a material capable of acting, for example, as an electron donor at the positions of the matrix at which a hybrid has been formed. Such an electron donating material is for example gold. Detection of the nucleotide sequence of the target DNA or RNA is then determined by an electronic device.
  • An exemplary embodiment of a biosensor, as defined above, is described in European patent application N ° EP-0 721 016 in the name of Affymax technologies NV or in American patent N ° US 5,202,231 in the name of Drmanac.
  • the subject of the invention is therefore a method for the specific detection of the presence of a paramyxovirus belonging to the RSVA, RSVB or PIV3 type in a biological sample, characterized in that it comprises the following steps: a) contacting d an oligonucleotide probe according to the invention, specific for RSVA, RSVB or PIV3, or a mixture of probes according to the invention each probe of which is specific for a paramyxovirus chosen from RSVA, RSVB and PIV3, with a biological sample, the nucleic acid contained in the biological sample having, where appropriate, previously made accessible to hybridization, under conditions allowing hybridization of the polynucleotide to the nucleic acid of a paramyxovirus of the RSVA, RSVB or PIV3 type ; b) detection of the hybrid formed between the polynucleotide and the nucleic acid contained in the biological sample.
  • Another object of the present invention consists in a method for the specific detection of the presence of a paramyxovirus belonging to the RSVA, RSVB or PIV3 type in a biological sample, characterized in that it comprises the following steps: a) contact of a first oligonucleotide probe according to the invention, specific to RSVA, RSVB or PIV3, or of a mixture of probes according to the invention each probe of which is specific for a paramyxovirus chosen from RSVA, RSVB and PIV3, immobilized on a support, with a biological sample, the nucleic acid of the sample having, where appropriate, previously been made accessible for hybridization, under conditions allowing hybridization of the polynucleotide to the nucleic acid of a paramyxovirus of the RSVA, RSVB or PIV3 type; b) bringing the hybrid formed into contact between the first probe or the mixture of the first probes immobilized on a support and the nucleic acid contained in the biological sample, if
  • PIV3 above is characterized in that, before step a), the DNA of the biological sample, or the cDNA obtained by reverse transcription of the RNA of the biological sample, is amplified with help from a couple of primers.
  • the pair of primers used prior to step a) is not specific for a paramyxovirus of a given type.
  • This pair of primers is on the contrary capable of amplifying the corresponding nucleic acid of several types of paramyxovirus, in particular at the same time RSVA, RSVB and PIV3.
  • said pair of primers is capable of amplifying a nucleic acid of a virus of the RSVA and RSVB type or also a nucleic acid of a virus of the RSVA and PIV3 type.
  • pairs of primers are used: a) pair of primers for the amplification of the nucleic acid of both RSVA and RSVB:
  • the present invention also relates to a kit or necessary for the specific detection of the presence of a paramyxovirus belonging to the RSVA type,
  • RSVB or PIV3 in a biological sample characterized in that it comprises the following elements: a) an oligonucleotide probe according to the invention, specific for a paramyxovirus of a given type chosen from RSVA, RSVB and PIV3 or a mixture of probes according to the invention, each probe of which is specific for a paramyxovirus chosen from RSVA,
  • a pair of non-specific primers of a given type of paramyxovirus chosen from:
  • a pair of primers allowing the amplification of a nucleic acid of a virus of the RSVA and PIV3 type; or a mixture of one or more of these three pairs of primers, as well as the reagents necessary for the amplification of a nucleic acid.
  • the invention also relates to a kit or kit for the specific detection of the presence of a paramyxovirus belonging to the RSVA, RSVB or PIV3 type in a biological sample, characterized in that it comprises the following elements: a) a polynucleotide, known as capture polynucleotide, consisting of a first oligonucleotide probe according to the invention, specific for a paramyxovirus of a given type chosen from RSVA, RSVB and PIV3 and immobilized on a support, covalently or non-covalently; alternatively, a mixture of probes according to the invention, each probe of which is specific for a paramyxovirus chosen from RSVA, RSVB and PIV3; b) a polynucleotide, called a revelation polynucleotide, consisting of a second oligonucleotide probe according to the invention, specific for a paramyxovirus of a given type chosen from RSVA,
  • a pair of primers allowing the amplification of a nucleic acid of a virus of the RSVA and PI V3 type; or a mixture of one or more of these three pairs of primers, as well as the reagents necessary for the amplification of a nucleic acid.
  • Figure 1 Consensus sequence deduced from the alignment of the functional motifs A and C of the L gene of the RSVA, PIV3, Sendai, PIV2, measles (MEAS), mumps (MUMP), simian 5 (SV5) and Newcastle disease (NDV).
  • Upper line amino acid sequence of the motifs (upper case: conserved residues; lower case: variable residues).
  • the corresponding nucleotide sequences are aligned using the consensus sequence as a reference.
  • a dash corresponds to a base identical to the base of the consensus sequence (CONS) located at the same position.
  • CONS consensus sequence located at the same position.
  • the bases indicated for each of the sequences corresponding to a particular viral type are the bases differing from the corresponding base of the consensus sequence.
  • the position of the 5 ′ end (on the left) and of the 5 ′ end (on the right) of each nucleotide sequence is given by taking as reference the first base of the initiation codon of the sequence coding for the L protein of each viral type (] ATG).
  • the structure of the P3 probe is given by taking as a reference the sequence of the P2 probe.
  • Figure 2 Multiple alignment of the nucleotide sequences of the region amplified by the P1 / P2 (or P1 / P3) primer set from clinical isolates and strains RSVA, RSVB and PIV3 prototypes. The sequences are compared with respect to a consensus sequence of RSV (ConsRSV) or with respect to a consensus sequence of PIV3 (ConsPIV3). The positions of the primers PI and P2 are indicated respectively on the 5 'side and on the 3' side of the sequence alignment. The window of 260 nucleotides in length used for phylogenetic analysis is delimited by the two vertical lines.
  • the sequences corresponding to the probes or to the cleavage sites of the restriction enzymes Avall, BglII and PvuII are underlined.
  • the dashes represent the conserved nucleotides relative to the consensus sequences. Points represent parts of a region that have not been sequenced.
  • the asterisk marks represent the nucleotide identities between the two consensus sequences.
  • the mark (.) Represents the gap of three nucleotides in the sequences of PIV3.
  • Figure 3 Phylogenetic tree of clinical isolates and prototype layers of RSVA, RSVB and PIV3. The tree is calculated using a window with a length of 260 nucleotides using the nearest neighbor method (“Neighbor Joining”), as described in the Materials and Methods section.
  • the length of the horizontal lines reflects the genetic distance between several groups.
  • the vertical lines have been represented for the sake of clarity, these do not provide any additional information.
  • Figure 4 Map of the plasmid prepared from the vector pUC18 and containing an insert of sequence SEQ ID No. 1 (RSVB) at the SmaI site.
  • the box represents the insertion level of the sequence SEQ ID N ° 1.
  • Figure 5 Representation of the degree of amino acid conservation of the large (L) subunit of the polymerase, after alignment of the amino acid sequences of the following viruses: PIV2, SV5, Mumps, ndv, Measles, Senda ⁇ , PIV3 and RSVA.
  • Figure 6 Alignment of the amino acid sequences of the large subunit (L) of the polymerase of different respiratory paramyxoviruses.
  • Upper line identification of domains I to V (initially defined by Poch et al., 1990).
  • Bottom row asterisks mark the amino acid positions of perfect identity between the sequences; the dots mark the positions of strong identity between the sequences.
  • Figure 7 Alignment of the nucleotide sequences coding for domains I (1) to V (5) of the large polymerase subunit. Line between the PIV3 sequences and
  • RSVA the “+” symbols mark the positions for which there is identity between the PIV3 sequences and the RSVA sequences.
  • the regions containing the strongest identity are the preferred regions within which the pairs of primers according to the invention have been defined.
  • Lower line indication of the corresponding amino acids when these are strongly conserved (cf. Figure 6).
  • RSVA is numbered and serves as a common reference point for the numbering of the sequences according to the invention, it being understood that the following convention is adopted: the nucleotide in position 1 corresponds to the base A of the ATG codon of the L gene of the RSVA type virus , strain RSVA S2 ts 1C, accessible in particular on the Genbank database under the number RSU39661.
  • IF A immunofluorescence
  • VIT Viral isolation technique
  • RSVA Long Strain
  • RSVB Long Strain 9320 reference strains
  • the reference strains PIV2 and PIV3 were obtained from the company Diagnostics Pasteur (Marnes-la Coquette, France) and the strains of Sendai virus and Newcastle disease virus (NDV) were obtained from M. le Professor Lebon (Saint-Vincent de Paul Hospital, Paris). Fifty-one wild human isolates were isolated from nasal aspirates of children hospitalized in the pediatric department of the university hospital of Caen, France.
  • RSV type viruses cultures of the human embryonic pulmonary fibroblast line MRC-5 (ATCC No. CCL 171) are carried out in 25 cm 2 culture flasks.
  • cultures of the line NCI-H292 (ATCC N ° CRL 1848) of human pulmonary mucoepidermoid cells are produced in 48-well microplates for tissue cultures.
  • Cultures of MDCK cells are carried out for the isolation of influenza viruses.
  • MRC-5 line When the cells have a cytopathogenic effect (MRC-5 line), or after an incubation period of 5 days (NCI-H292 and MDCK cells), these cells are collected by scraping off the culture medium and then centrifuging. The cell pellet is resuspended, then deposited on a microscope slide and fixed with acetone. The virus is then identified by immunofluorescence (IF A). The different monoclonal antibodies used in the immunofluorescence experiments are described below.
  • the antibodies used for the identification of RSV viruses of subgroups A and B are produced respectively by the hybridoma clones B90 and 7858 (Freymuth et al., 1991) and used as described by Freymuth et al., 1982
  • the monoclonal antibodies used to identify PIV viruses and influenza viruses are marketed by Imagen (Kit Imagen TM, Respiratory Syncitial® Dako; Kit Imagen TM Virus Parainfluenza® Dako) and the monoclonal antibodies which have enabled the identification of measles and mumps are marketed by Ar relie Biosoft, France.
  • the samples stored at -70 ° C. are subjected to digestion by the conventional proteinase K method.
  • the digestion is carried out by adding 2 ⁇ l of proteinase K (10 mg / ml), 10 ⁇ l. from SDS to
  • primers have been defined by sequence alignment of the most conserved region of the genome, ie the A and C motifs of the L polymerase gene. (Tordo et al., 1988; Tordo et al., 1992).
  • a forward primer (+) PI and two return primers (-) P2 and P3 were synthesized according to the phosphoramidite technique (Sonveaux et al., 1986; Urdea et al., 1983; Caruthers et al.), Of which the nucleotide sequences are presented below:
  • oligonucleotides, probes or primers according to the invention were synthesized according to the method of Sonveaux et al., 1986.
  • each of the pairs of primers P1 / P2 and P1 / P3 were used separately in an RT-PCR type reaction. The two primers of each pair of primers are therefore present during the reverse transcription and PCR amplification steps.
  • the cDNA synthesis is carried out at 42 ° C for 60 min in a reaction volume of 25 ⁇ l of RT-buffer (Gibco Brl, USA) containing 5 ⁇ l of nucleic acid extract, 200 U of M-MLV reverse transcriptase (Gibco Brl, USA), 20 U of Rnase inhibitor (RNAsine TM, Promega, France), 40 pmol of each of the primers, ImM of each of the dATP, dCTP, dGTP, dTTP, 10 mM DTT (Gibco Brl, USA ).
  • the reaction volume is adjusted to 100 ⁇ l using a PCR buffer (Perkin Elmer Cetus, USA), 1.5 mM MgCl 2 and 2.5 U of Taq polymerase (Perkin Elmer Cetus, USA).
  • Amplification is carried out using an Omnigene themocycler device (Hybaid) in the following manner: 30 amplification cycles are carried out, each cycle of which comprises a denaturation step of 30 sec at 94 ° C, a step of 1.5 min priming hybridization at 45 ° C and a 1.5 min primer extension step at 72 ° C.
  • the products resulting from the amplification are then analyzed by electrophoresis in 1.2% agarose gel.
  • the fragments separated by electrophoresis are then stained with ethidium bromide (BET) and visualized by exposure of the electrophoresis gel to ultraviolet radiation.
  • BET ethidium bromide
  • Microspin type columns (Pharmacia, Uppsala, Sweden) are used for the purification of the amplified fragments (amplicons) from the mixtures resulting from the PCR amplification.
  • Amplicon sequencing is carried out using a Delta Taq Cycle sequencing kit (Pharmacia, Uppsala, Sweden) following the manufacturer's instructions.
  • the purified fragments are then sequenced according to the automatic sequencing method using the Ref XXX fluorescence (Pharmacia, Uppsala, Sweden). Multiple alignment of the sequences is carried out using the Clustal-W software (Higgins, 1989).
  • the phylogenetic analysis of the aligned sequences is carried out according to the “Neighbor Joining (NJ)” method.
  • the validity of the phylogenetic tree was verified by a technique called "Bootstrapping" on 100 replicas.
  • the trees were built using Treetool software (Version 1.0, Maciukenas). Sites recognized by the restriction endonucleases Avall, BglII and PvuII were chosen after analysis of the multiple alignment of sequences.
  • PCR amplification products (5 ⁇ l) are subjected to the action of restriction endonucleases according to the manufacturer's instructions (Bethesda Research Laboratories) and analyzed by agarose gel electrophoresis followed by staining with ethidium bromide .
  • EIA Hybridization and immunoenzymatic test
  • Genomic probes (strand minus) specific to the L gene amplification products are selected from the results of the multiple alignment of sequences described above. Other probes were selected from sequences accessible on the Genbank database. These probes are as follows: - RSVA probe:
  • the position of the nucleotides at the ends of the above probes is given with reference to the initiation codon of each L protein (] ATG).
  • the probes are synthesized according to conventional methods and then biotinylated at their 5 'end.
  • the single-stranded DNA probes are immobilized on the surface of a microtiter plate previously coated with streptavidin.
  • the products resulting from the PCR amplification are then placed in the presence of the immobilized probes under conditions allowing their hybridization to the latter, then the hybrids formed are visualized by an immunoenzymatic test (marketed by Gen-ETI-K DEIA TM, Sorin, France) produced according to the manufacturer's instructions.
  • the optimal concentration of each of the RSVA, RSVB and PIV3 probes is respectively 0, 1 ng / ⁇ l, 1 ng / ⁇ l and 0.5 ng / ⁇ l.
  • RNA polymerases and reverse transcriptases RNA-dependent polymerases
  • the conserved Block III sequences of different paramyxoviruses such as RSVA, PIV3, Sendai, PIV2, measles, mumps, simian virus 5 (SV5) and Newcastle disease virus (NDV), were first aligned.
  • the primers were chosen from the conserved motifs A and C of Block III in order to specifically detect RSV and PIV3 ( Figure 1).
  • the sequence of each of the primers corresponds to a consensus type sequence which has been defined so as to ensure complementarity acceptable to. paramyxovirus genomic sequences to be detected and / or amplified.
  • a single forward primer (strand +) was constructed so as to contain only two consecutive bases which are not complementary to the genomic sequences of the paramyxovirus RSVA and PIV3 to be detected and / or amplified, and at least three bases which are not complementary to the other paramyxovirus sequences ( Figure 1).
  • Two return primers (strand minus), primers P2 and P3, are necessary, to take into account the variability of the sequences between PIV3 and RSVA.
  • the primers P2 and P3 differ by a single nucleotide at position 17 of said primers (ie at position -3 from the first incorporated nucleotide).
  • the primer P2 contains a base which is not complementary to the genome of RSVA and two bases which are not complementary to the genome of PIV3.
  • the primer P3 contains a nucleotide which is not complementary to the genome of PIV3 and two nucelotides which are not complementary to the genome of RSVA.
  • the two primers are less complementary to the genomes of the other paramyxoviruses, with the exception of the genome of the murine Sendai virus (a non-complementary nucleotide of P2, two non-complementary nucleotides of P3, as for RSVA).
  • the two primer sets, P1 / P2 and P1 / P3 are capable of amplifying DNA segments of the L gene, 355 bp long for RSVA and a length of 352 bp for PIV3 and the Sendai virus.
  • the primers were deliberately chosen to hybridize with a region of the L gene located at the ends of a variable region of this paramyxovirus gene, which enabled the inventors to construct probes specific for these variable regions for each type of paramyxovirus, or to choose restriction endonucleases having a cleavage site within this variable region in order to differentiate the different types of paramyxovirus by the profile of the electrophoresis bands in restriction fragment length polymorphism experiments (RFLP).
  • RFLP restriction fragment length polymorphism experiments
  • Example 2 Analysis of products from viral isolates amplified by PCR, by gel electrophoresis.
  • IFA immunofluorescence test
  • the expected size amplicon is observed only with the primer set P1 / P2 (strain 9320 and for 12 of the 13 clinical isolates).
  • the DNA of one of the 13 clinical isolates of RSVB (no. 9401891) is amplified with both P1 / P2 and P1 / P3, that is to say like the DNA of the RSVA and Sendai viruses.
  • PIV3 virus samples have an intermediate profile.
  • the prototype strain and 6 (46%) of the 13 clinical PIV3 isolates have DNA amplified by the P1 / P2 primer set, while all of the PIV3 viruses in the study have DNA amplified by the P1 primer set / P3.
  • the sensitivity of the RT-PCR test was determined by analyzing successive ten-fold dilutions of culture lysates of MRC5 cells inoculated with RSVA (Long strain) or RSVB (strain 9320), at a titer of 10 3 / ml and 10 4 / ml TCID 50 .
  • the products resulting from the amplification reaction are visualized both on an agarose gel for a dilution of the cellular lysates of RSVA and RSVB of 10 " 1 and 10 " 2 respectively and by hybridization for a dilution of the cellular lysates of RSVA and RSVB of 10 2 and 10 respectively 3.
  • the amount of viral DNA detected by RT-PCR is approximately 10 TCID50.
  • Example 3 Analysis of sequences and phylogeny.
  • an analysis of the sequences of the amplicons generated by the PCR amplification was carried out from 11 clinical isolates of RSVA, 6 clinical isolates of RSVB and 10 isolates. of PIV3 (9 clinical samples and the strain of the Institut Pasteur PIV3 JS)), using an automated method. This method made it possible to define a consensus genomic sequence for each of the samples, which corresponds to a compromise between the individual viruses of the viral population (quasi-species) and the isolate considered.
  • Figure 2 A multiple alignment of the amplicon sequence is shown in Figure 2, which also includes the corresponding sequences of the RSVA2 and PIV3JS strains accessible in the databases.
  • Figure 3 represents the phylogenetic tree calculated according to the “neighbor joining” method using a window 260 nucleotide long calculation cell (underlined in Figure 2).
  • the RSVA, RSVB and PIV3 viruses are grouped separately in three main branches.
  • the RSVA and RSVB groups are fairly close (85% similarity in the region considered) and are both distant from the PIV3 group (43% similarity with RSVA and RSVB in the region considered). Furthermore, the variability within each main branch is very low.
  • the sequence of two clinical isolates made it possible to classify the latter into groups different from the groups into which these isolates are classified from an immunological point of view by immunofluorescence (EFA).
  • EFA immunofluorescence
  • it is the isolate identified as belonging to the RSVA group in the immunofluorescence test (isolate n ° 9400504) and which however unequivocally belongs to the RSVB group, as it results from the phylogenetic analysis .
  • the isolate identified as belonging to the RSVB group in the immunofluorescence test isolate n ° 9301891, not shown in Figure 2 and which belongs unambiguously to the RSVA group if l 'We consider the analysis of its partial sequence.
  • Example 4 Typing of viruses by analysis of the restriction fragment length polymorphism (RFLP).
  • RFLP restriction fragment length polymorphism
  • the enzymes Avall and PvuII exclusively cut the amplicons derived from the DNA of the RSV and PIV3 viruses.
  • the Avall enzyme cuts the 355 bp amplicon of RSV into two fragments with a length of 263 bp and 92 bp respectively.
  • the PvuII enzyme cuts the 352 bp amplicon of PIV3 into two fragments with a length of 295 bp and 57 bp respectively.
  • the cleavage by the enzyme BglII makes it possible to differentiate between the RSVA and RSVB groups and does not cut the amplicon generated by PIV3 (with the exception of the PI primer, accounting for the fact that a 6 bp fragment is systematically eliminated from all amplicons).
  • All amplicons from RSVB are cleaved by BglII into two fragments with a length of 283 bp and 66 bp respectively.
  • 79% of the RSVA isolates are not cleaved by BglII, while, for the 3 other viral samples (2 clinical isolates and the Long prototype strain), the 355 bp amplicon is cut into two fragments with a length of 177 bp and 172 bp respectively.
  • isolate n ° 9400504 presents an RFLP profile of type RSVB and isolate n ° 9401981 presents an RFLP profile of RSVA type.
  • the RFLP restriction profile analysis data makes it possible to simply distinguish the RSV and PIV amplicons on the basis of the respective exclusive presence of the Avall (RSV) and PvuII (PIV) restriction sites.
  • RSV Avall
  • PV PvuII
  • the analysis of the length of the fragment obtained by digestion with the enzyme BglII is necessary.
  • the BglII enzyme cuts the amplicon from RSVB group viruses into two fragments with a length of 283 bp and 66 bp respectively.
  • Example 5 Typing of viruses by specific hybridization and by enzyme immunoassay.
  • the probes for specifically distinguishing viruses from the RSVA and RSVB groups were selected in the region located between the nucleotide at position 159 and the nucleotide at position 200 of the amplicon, that is to say in one of the regions in which the sequences of RSVA and RSVB are the most divergent ( Figure 2).
  • the PIV3 specific probe was selected in the region delimited by the nucleotide at position 77 and the nucleotide at position 118 of the amplicon, that is to say in a region in which the PIV and RSV sequences exhibit a large divergence. (approximately 50% divergence between said sequences), this region of strong divergence comprising in particular a single long "gap" of three nucleotides.
  • the specific probes for RSVA, RSVB and PIV3 were tested on most clinical samples and prototype strains, for their specific typing capacity for each of the virus groups, in a molecular hybridization test and in an enzyme immunoassay, respectively.
  • the hybridization tests were carried out using the GEN-ETIK® DEIA detection kit (DNA Enzyme Immunoassay), marketed by Sorin Biomedica, Antony, France), the actual hybridization step having been carried out at 50 ° C for 60 minutes.
  • the specificity of the test was previously established between each of the probes and the amplicon of a homologous or heterologous prototype strain, namely the amplicons generated respectively from RSVA (Long strain), RSVB (Strain 9320), PIV3 and the virus.
  • Table 1 Analysis of RSVA, RSVB and PIV3 strains by Immunofluorescence (IF A), polymerase chain reaction (PCR), restriction fragment length polymorphism (RFLP) and specific hybridization.
  • IF A Immunofluorescence
  • PCR polymerase chain reaction
  • RFLP restriction fragment length polymorphism
  • Example 6 Detection of viruses in clinical samples by RT-PCT and by EIA.
  • RT-PCR-EIA technique Nasal aspirates collected from 261 hospitalized children with bronchiolitis were tested simultaneously by the conventional techniques (EFA, VIT) and by the RT-PCR technique using simultaneously the primers PI, P2, P; the EIA revelation technique by hybridization was carried out using simultaneously the three specific probes of RSVA, RSVB and PIV3 respectively (RT-PCR-EIA technique).
  • the comparative results of the PCR tests with the IFA and VIT techniques are summarized in Table 2.
  • the RT-PCR-EIA technique made it possible to detect RSV-type viral sequences in 103 samples (39.4%); the IF A-VIT technique made it possible to detect RSV type viruses in 109 samples (41.7%). Seven samples (2.6%) are positively selected after IF A-VIT but are not selected by PCR. A single sample (0.4%) is positive for the RT-PCR-EIA technique and not visualized by the IF A-VIT technique.
  • the RT-PCR-EIA and EFA-VIT techniques have a comparable level of sensitivity.
  • the use of the detection of amplified products by hybridization of an internal oligonucleotide probe makes it possible to obtain a sensitivity 10 times greater than when visualizing the amplified products on agarose gel.
  • the inventors have developed a molecular technique allowing the detection in one step then the typing of the main paramyxoviruses responsible for infections of the lower respiratory tract: RSVA, RSVB and PIV3. Only the detection of viruses of the PIV1 and PIV2 type would require the construction of suitable sets of primers, but these two types of virus are frequently associated in upper respiratory tract infections and are consequently more rarely isolated in hospitalized patients.
  • the molecular techniques which are the subject of the present invention constitute an effective and very competitive alternative to the techniques for detecting a viral antigen, in particular in that the techniques of the invention significantly improve the sensitivity of detection of viruses in a sample. organic.
  • the rapidity of the differential diagnosis method of the invention makes it a particularly suitable tool for the early diagnosis of infections by RSVA, PIV3 and RSVB, so as to make possible the administration to patients of therapy targeted at the viral type involved and likely to ensure effective treatment as a result, as soon as the disease is declared.

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Abstract

L'invention concerne un polynucléotide codant pour la grande sous-unité (L) de la polymérase des paramyxovirus de type RSVB ainsi que le polypeptide codé par ledit polynucléotide. L'invention a aussi pour objet un procédé de diagnostic des virus de type RSVB dans un échantillon biologique mettant en oeuvre tout ou partie du polypeptide de la grande sous-unité (L) de la polymérase des paramyxovirus de type RSVB ou des anticorps reconnaissant un tel polypeptide. L'invention concerne également des polynucléotides dérivés des gènes codant pour la grande sous-unité de la polymérase (L) de la famille de Paramyxovidridae, utiles en tant que sonde et/ou amorces nucléotidiques pour la détection spécifique et/ou différentielle de ces virus, en particulier des Paramyxovidridae de type RSVA, RSVB et PIV3 ainsi qu'une trousse de détection contenant ces derniers.

Description

POLYNUCLEOTIDES CODANT POUR LA GRANDE SOUS-UNITE DE LA POLYMERASE DES PARAMYXOVIRUS RSVB
La présente invention concerne un polynucleotide comprenant tout ou partie de la séquence codant pour la grande sous-unité (L) de la polymerase des paramyxovirus de
5 type RSVB ainsi que le polypeptide codé par ledit polynucleotide. L'invention a aussi pour objet un procédé de diagnostic des virus de type RSVB dans un échantillon biologique mettant en oeuvre tout ou partie du polypeptide de la grande sous-unité (L) de la polymerase des paramyxovirus de type RSVB ou des anticorps reconnaissant un tel polypeptide. L'invention concerne également des polynucléotides dérivés des gènes
10 codant pour la grande sous-unité de la polymerase (L) de la famille des Paramyxoviridae, utiles en tant que sondes et/ou amorces nucléotidiques pour la détection spécifique de ces virus, en particulier des Paramyxoviridae de type RSVA, RSVB et PIV3. L'invention a enfin pour objet un procédé de diagnostic différentiel des paramyxovirus de type RSVA, RSVB et PIV3 mettant en oeuvre lesdits polynucléotides,
15 ainsi qu'une trousse de détection contenant ces derniers.
Parmi les virus présentant un tropisme pour les organes du système respiratoire, les virus appartenant à la famille des Paramyxoviridae sont d'un grand intérêt médical. Les virus Parainfluenza de type 1 et 2 (PIV1, PIV2) sont plus généralement associés à des infections des voies respiratoires supérieures ou à la laryngo-trachéite. Les virus
20 respiratoires syncitiaux, RSV des sous-groupes A et B (RSVA, RSVB) et les virus parainfluenza de type 3 (PIV3) sont la cause prépondérante des maladies virales aiguës des voies respiratoires inférieures telles que les bronchiolites et les pneumonies (Falsey et al., 1992 ; Freymuth et al., 1983 ; Frey uth et al., 1987 ; Martin et al., 1978 ; Welliver,
1982). Ces infections présentent un caractère de gravité exceptionnel et nécessitent très
25 souvent une hospitalisation des patients infectés, plus particulièrement des enfants (Murphy et al., 1988).
Les infections virales respiratoires causées par les virus RSVA, RSVB et PIV3 sont en conséquence une préoccupation importante de Santé Publique et il existe un besoin croissant de systèmes de dépistage précoce de telles infections virales qui doivent
30 être caractérisés à la fois par leur spécificité, leur sensibilité ainsi que par leur rapidité et leur facilité de mise en oeuvre. En particulier, le diagnostic différentiel précoce des infections par les virus de type RSV (RSVA, RSVB) et PIV3 est nécessaire en vue de suivre le développement de l'infection chez les patients, plus particulièrement chez les enfants, et en vue d'administrer une thérapie antivirale adaptée : ribavirine ou* immunoglobulines spécifiques (Hall, C. B. et al., 1985, J. Am. Med. Ass., 254, 3047- 3051) ainsi que pour la prévention d'une dissémination de nature nosocomiale.
Les tests d'immunofluorescence (LFA) des antigènes viraux dans les aspirats nasaux sont aujourd'hui utilisés pour le diagnostic d'infections par les virus RSV et PIV,
5 car ces tests sont plus rapides et plus sensibles que les techniques antérieures d'isolement du virus (Freymuth et al., 1986 ; Takimoto et al., 1991 ; Wendt et al., 1992). L'immunodétection mettant en oeuvre des anticorps monoclonaux anti-nucléocapsides ou anti-glycoprotéines est aujourd'hui le moyen le plus couramment employé pour la détection des Pramyxoviridae (RSVA, RSVB et PIV3) associés aux maladies des voies
10 respiratoires inférieures (bronchiolite et pneumonie) chez les enfants hospitalisés (Downham et al., 1979 ; Freymuth et al., 1980 ; Freymuth et al., 1986). Le test d'immunofluorescence est rapide et moins onéreux que la technique de référence consistant à l'isolement du virus à partir de cellules en culture. Dans certains cas cependant, la quantité de virus présents dans l'échantillon biologique n'est pas suffisante
15 pour une détection directe par immunofluorescence et une étape d'amplification de la quantité de virus sur des cultures de cellules (VIT) est nécessaire pour la détection et le typage des virus. L'étape d'amplification (VIT) est onéreuse et peut nécessiter plusieurs semaines de culture avant que le diagnostic puisse être réalisé.
L'utilisation de la réaction d'amplification en chaîne d'acide nucléique à l'aide de
20 la polymerase, précédée d'une réaction de transcription inverse du matériel génétique présent dans les échantillons biologiques (réaction dite « RT-PCR » pour « Reverse Transcription-Polymerase-Chain Reaction »), commence peu à peu à se développer comme alternative aux tests d'immunofluorescence afin d'améliorer la sensibilité de la détection des virus RSV et PIV. Cette technique a récemment été mise en oeuvre pour la
25 détection de certaines séquences de RSV et PIV3 dans les aspirats nasaux d'enfants infectés (Cubie et al., 1992 ; Freymuth et al., 1995 ; Karron et al., 1994 ; Milaan et al., 1993 ; Paton et al., 1992 ; Sullender et al., 1993 ; Gilbert et al., 1996 ; Cane et al., 1991). Le génome des virus RSV et PIV est constitué d'un ARN à brin négatif non segmenté qui est transcrit de manière polaire (de l'extrémité 3' vers l'extrémité 5'), et en cascade,
30 en ARN messagers de quantité de plus en plus faible. Le gène N, qui est codé par une région de l'extrémité 3' du génome viral, est transcrit de manière plus intense (Banerjee, 1987 ; Tordo et al.. 1988-a) que les autres gènes, en particulier que le gène L qui est codé par une région localisée à l'extrémité 5' du génome viral. En conséquence, le gène N a constitué la cible principale pour la détection des RSV et PIV par amplification RT-
35 PCR, du fait de la grande quantité de transcrits qui était susceptible d'assurer une grande sensibilité de détection . et du fait de la grande conservation de ce gène au sein des Paramyxoviridae, qui était susceptible d'assurer une grande spécificité des tests. En effet, on a observé une similarité de l'ordre de 90 %, au niveau des séquences nucléiques, entre les gènes N des virus de type RSVA et RSVB (Johnson et al., 1989). Les amorces pour RSV définies par Cane et al. en 1991 ont été utilisées par Cubie et al. comme amorces externes dans une réaction d'amplification de type « Nested PCR », et par Freymuth et al. en 1995 dans une réaction de type RT-PCR dans laquelle une séquence interne avait été définie et utilisée comme sonde dans un test d'hybridation non radioactif. Van Milaan et al., en 1993, a tenté de définir des séquences cibles pour amplifier et hybrider des régions flanquantes du gène N situées à proximité de l'extrémité du gène 1B proximal. Cependant, toutes les études de l'art antérieur confirment la meilleure sensibilité des tests ayant comme cible le gène N par rapport aux tests ayant comme cible d'autres gènes, tels que les gènes F et G, par exemple (Paton et al., 1992 ; Sullender et al., 1993). Un test de détection de PIV3 par RT-PCR a été décrit par Karron et al. en 1994, qui a utilisé des amorces hybridant une région hautement conservée du gène de l'hémagglutinine-neuraminidase (FIN). Un travail semblable est décrit dans la demande PCT N° WO 97/16570 (Henrickson).
Sullender a décrit, en 1993, l'utilisation de sondes oligonucléotidiques synthétiques complémentaires de l'ARN messager de la glycoprotéine G d'attachement des RSV, reconnue pour porter le plus grand nombre de différences immunologiques entre les deux sous-groupes RSVA et RSVB. Plus particulièrement, Sullender a synthétisé deux sondes nucléiques, l'une d'entre elles étant complémentaire de l'ARN messager de la glycoprotéine G des virus RSV de type A, en se basant sur les séquences correspondantes des souches RSVA « A2 » et « Long », la seconde sonde nucléique étant complémentaire de l'ARN messager de la glycoprotéine G des virus de type B, en se basant sur les séquences correspondantes de la souche RSVB « 8/60 ». Le test de détection par hybridation des sondes marquées décrit par Sullender est effectué sur des cellules fixées, après inoculation d'une culture cellulaire respectivement par des isolats de laboratoire de RSVA et RSVB, sans réaction d'amplification préalable de l'ARN viral. Ce test a permis de différencier efficacement les cellules fixées préalablement infectées avec un isolât de RSVB ou de RSVA sans que les sondes ne présentent de réaction d'hybridation croisée.
D'autres auteurs ont choisi une stratégie consistant à amplifier spécifiquement une région du génome de RSVA et/ou RSVB et PIV3 par une réaction d'amplification de type RT-PCR afin de détecter la présence de ces virus dans un échantillon biologique. Les couples d'amorces synthétisés par ces auteurs sont principalement complémentaires de différentes régions du gène de la nucléocapside (N) de ces virus.
Ainsi, Gilbert et al., en 1996, ont synthétisé un couple d'amorces nucléotidiques spécifique d'une région du gène N de la nucléocapside des virus RSV (RSVA et RSVB) et un couple d'amorces nucléotidiques spécifique d'une région du gène F des virus de type PIV3. Ces deux couples d'amorces ont permis de générer des amplicons spécifiques respectivement des virus RSV et des virus PIV3 avec peu de réactivité croisée, à partir de lysats de cellules cultivées en présence d'échantillons cliniques de patients infectés. La stratégie mise en oeuvre par Gilbert et al. nécessite l'utilisation de deux couples d'oligonucléotides, le but ici étant la mise au point d'un diagnostic différentiel des RSV et des virus Paraiηfluenza. Par ailleurs, le couple d'amorces spécifique des RSV ne permet pas de différencier selon que l'ARN présent dans l'échantillon biologique, en l'occurrence un lavage naso-pharyngique, provient d'un virus RSVA ou d'un virus RSVB. Cane et al., en 1991, ont utilisé, pour le diagnostic des virus RSV, plusieurs couples d'amorces complémentaires du gène N ou du gène codant pour des petites protéines hydrophobes (protéines SH). Les couples d'amorces ainsi définis permettent l'obtention d'amplicons qui sont ensuite soumis à l'action d'enzymes de restriction, dans le but de différencier les virus RSVA des virus RSVB de l'échantillon biologique. L'amplicon généré à l'aide du couple d'amorces complémentaires d'une région du gène N des RSV présente plusieurs profils de restriction, respectivement trois profils de restriction différents pour les virus RSV de type A et deux profils de restriction différents pour les virus RSV de type B. Le test mis au point par Cane et al. nécessite donc une analyse assez complexe pour la détermination du type de RSV présent dans l'échantillon. Paton et al., en 1992, a synthétisé un couple d'amorces spécifique d'une région du gène de la sous-unité FI de la glycoprotéine de fusion F des virus RSV. Cette technique a permis à Paton d'amplifier spécifiquement, par une réaction de RT-PCR, l'ARN des RSV présents dans les cultures de lignées cellulaires inoculées avec des fractions aliquotes d'aspirats nasaux de patients infectés, sans toutefois pouvoir différencier les RSV de type A et de type B.
Cubie et al., en 1992, ont synthétisé un couple d'amorces complémentaires d'une région du gène N des RSV afin d'amplifier spécifiquement l'ARN de ces derniers, sans que le test mis au point ne permette de différencier entre les virus de type A et de type B.
Freymuth et al., en 1995, ont eux-mêmes synthétisé un couple d'amorces complémentaires d'une région du gène N des RSV, qui a permis d'amplifier, par RT- PCR, avec une grande sensibilité et sélectivité l'ARN des RSV présents dans des aspirats nasaux d'enfants hospitalisés, sans toutefois distinguer les RSV de type A et les RSV de type B.
L'inconvénient de chacun des protocoles décrits ci-dessus est que la détection est limitée à un seul type de virus et que le test doit être répété pour chaque type viral (RSVA, RSVB, PIV3, etc.) sur un échantillon donné.
Tordo et al. ont, lors du Congrès de juillet 1995 organisé par la revue FEMS en Turquie, décrit un couple d'amorces génériques, respectivement complémentaires des motifs A et C du gène de la grande sous-unité (L) de la polymerase des virus RSVA et PIV3. Le gène L de PIV3 est notamment décrit dans la demande PCT N° WO 97/20468 (St Louis Univ.).
La polymerase des virus à ARN à brin négatif non segmenté est unique en ce qu'elle ne reconnaît le génome viral que lorsqu'il est associé à la protéine de la nucléocapside (N). Cette polymerase est constituée d'une phospho-protéine (la protéine P ou NS) et d'une grande protéine (L), qui constituent les différentes sous-unités de l'assemblage catalytiquement actif. La grande sous-unité (L), d'un poids moléculaire de 220 kD, est considérée comme le support de l'activité de transcription et de réplication virale, même si la protéine P semble indispensable à l'expression de l'activité enzymatique. L'alignement des séquences peptidiques de la protéine L de cinq virus à ARN choisis parmi les rhabdovirus (virus de la stomatite vésiculaire, et virus de la rage) et les paramyxovirus (virus de Sendaï, virus de la maladie de Newcastle, et virus de la rougeole) a permis de distinguer, dans la protéine L, six régions particulières bien conservées entre les différents types viraux et numérotées de I à VI (Poch et al., 1990).
Les couples d'amorces définis récemment par Tordo et al. sont localisés dans la région du gène L codant pour la région III de la protéine. Ces couples d'amorces se sont avérés capables de générer, par une réaction de type RT-PCR, un amplicon de 350 pb à partir de souches prototypes et d'isolats cliniques de virus de type RSVA, PIV3 et RSVB. Ces auteurs ont pu montrer que l'action des enzymes de restriction Avall, BglII et PvuII sur les amplicons générés conduisait à des profils de restriction caractéristiques de chacun des trois types de paramyxovirus respiratoires. La technique mise au point par Tordo et al. se limite à la génération d'un amplicon dans une région étroite du gène L de la polymerase de RSVA et PIV3, respectivement entre les motifs A et C de la région III. A l'époque, la séquence du gène L des virus de type RSVB n'était pas connue, ce qui ne permettait pas à l'homme du métier d'identifier d'autres séquences consensus pour définir des couples d'amorces génériques capables d'amplifier à la fois l'ARN des virus de type RSVA, PIV3 et RSVB. Par ailleurs, l'examen des profils de restriction de chaque amplicon afin de caractériser le type de virus présent dans un échantillon biologique, s'il apparaît sélectif, constitue une technique longue, complexe et onéreuse et donc peu adaptée à une utilisation en routine en milieu hospitalier ou dans un laboratoire d'analyses médicales.
De plus, à l'époque à laquelle Tordo et al. ont défini deux couples d'amorces génériques capables d'amplifier une partie de la région III du gène L des virus RSVA, PIV3 et RSVB, un fort préjugé technique existait quant à la fiabilité et la sensibilité d'un tel test, en raison du faible niveau d'expression du gène L. De manière surprenante, les présents inventeurs ont démontré que la sensibilité de la technique consistant à amplifier, par une réaction de type RT-PCR, l'ADNc obtenu à partir de la transcription inverse de l'ARN génomique du gène N n'est pas inférieure à la sensibilité d'autres techniques de l'art antérieur, telles que Pimmunofluorescence et l'isolement du virus par culture de cellules. Afin de définir des polynucléotides utiles en tant que sondes et/ou amorces utilisables dans un procédé de diagnostic différentiel des virus de type RSVA, PIV3 et RSVB, les inventeurs se sont attachés à isoler la région du génome du virus RSVB codant pour la grande sous-unité (L) de la polymerase et à séquencer la région III de cette dernière. Le séquençage de la région III du gène L de RSVB a permis aux inventeurs de construire des polynucléotides présentant différentes caractéristiques d'hybridation avec ladite séquence du gène L de RSVB, mais aussi, après une analyse comparative, avec les séquences respectives correspondantes du gène L des virus RSVA et PIV3.
Les inventeurs ont ainsi séquence la région III du gène codant pour la grande sous-unité (L) de la polymerase des virus de type RSVB. La séquence du polypeptide correspondant à la région III leur a permis de définir précisément, par comparaison avec les séquences des polypeptides codés par le gène L des virus de type RSVA et PIV3, puis analyse des régions conservées, des couples d'amorces génériques, différents de ceux décrits ci-dessus par Tordo et al., capables d'amplifier à la fois l'ARN correspondant à des régions particulières du gène L des trois types de paramyxovirus respiratoires considérés.
Selon un autre aspect de l'invention, l'identification de la séquence de la région III du gène L du virus RSVB a rendu possible, après analyse comparative des régions les moins bien conservées du polypeptide correspondant, la synthèse de couples d'amorces spécifiques d'un type de paramyxovirus respiratoire donné, choisi parmi RSVA, RSVB et PIV3, qui ne présentent pas de réaction d'amplification croisée avec un acide nucléique provenant d'un virus d'un autre type.
L'isolement et la caractérisation de la séquence du gène L du virus RSVB a aussi permis aux inventeurs de définir des sondes oligonucléotidiques hybridant spécifiquement avec l'ARN d'un type donné de paramyxovirus respiratoire choisi parmi RSVA, RSVB et PIV3, ainsi que des sondes génériques hybridant indifféremment avec l'un ou l'autre type de paramyxovirus respiratoire, ces dernières étant utiles notamment comme témoins internes dans un test de détection par hybridation d'un acide nucléique présent dans un échantillon biologique issu d'un patient suspecté d'être infecté par un paramyxovirus respiratoire.
Ainsi, la présente invention a pour objet un polynucleotide de 355 paires de bases correspondant à la région III du gène L des virus de type RSVB.
Plus particulièrement, l'invention concerne un polynucleotide caractérisé en ce qu'il est choisi parmi : a) un polynucleotide comprenant au moins 12 nucleotides consécutifs de l'enchaînement de nucleotides suivant (SEQ ID N° 1) :
ACAACAGATCTCAGCAAATTCAATCAAGCATTTAGATATGAAACATCATGTA TCTGCAGTGATGTATTAGATGAACTGCATGGGGTACAATCTCTGTTCTCTTG GTTGCATTTAACAATACCTCTTGTCACAATAATATGTACATATAGACATGCAC CTCCTTTCATAAAGGATCATGTTGTCAATCTTAATGAAGTTGATGAACAAAG TGGATTATACAGATATCATATGGGTGGTATTGAGGGCTGGTGTCAAAAACTG TGGACCATTGAAGCTATATCATTATTAGATCTAATATCTCTTAAAGGTAAATT CTCCATCACAGCTCTGATAAATGGTGACAATCAAGCAATAG ; b) un polynucleotide dont la séquence est complémentaire de la séquence du polynucleotide défini en a) ; c) un polynucleotide hybridant dans des conditions de forte stringence avec le polynucleotide défini en a) ou avec le polynucleotide défini en b).
Les séquences soulignées correspondent respectivement à la séquence de l'amorce oligonucléotidique PI (SEQ JD N° 7) et à la région d'hybridation de l'amorce oligonucléotidique P2 (SEQ ID N° 8).
La séquence SEQ ID N° 1 peut être alignée avec les séquences correspondantes du gène L d'autres types de paramyxovirus. En particulier, la séquence SEQ ID N° 1 peut être alignée avec la séquence correspondante du gène L de la souche RSVA S2 ts
1C accessible sur la base de données Genbank sous le numéro RSU39661. Dans ce cas, la base (A) en 3' de la séquence SEQ ID N° 1 correspond au nucléotide en position 2092 du gène L de cet isolât de RSVA et la base (G) en 5' de la séquence SEQ ID N° 1 correspond au nucléotide en position 2446 du gène L de cet isolât de RSVA, étant entendu que la numérotation des nucleotides du gène L dudit isolât de RSVA est réalisée en prenant comme repère la base A du codon ATG de début de traduction, numérotée n° 1.
On entend par polynucleotide ou acide nucléique, selon la présente invention, aussi bien un ARN double brin, un ARN simple brin, un ADN simple brin ou double brin correspondant au produit de transcription inverse desdits ARNs que des produits de transcription desdits ARNs ou ADNs. Des fragments particuliers du polynucleotide de séquence SEQ ID N° 1 peuvent être obtenus en faisant agir les enzymes de restriction appropriées selon la méthode décrite dans l'ouvrage de Sambrook de 1989, l'homme du métier étant guidé, pour le choix des enzymes de restriction à utiliser, par la carte de restriction de la séquence SEQ
ID N° 1 figurant au paragraphe Annexe I. Par polynucleotide de séquence complémentaire, on entend tout ARN ou ADN dont les nucleotides sont complémentaires de ceux de la SEQ ID N° 1 ou d'une partie de la SEQ ID N° 1, et dont l'orientation est inversée.
Une hybridation dans des conditions de forte stringence signifie que les conditions de température et de force ionique sont choisies de telle manière qu'elles permettent le maintien de l'hybridation entre deux fragments d'acide nucléique complémentaires.
A titre illustratif, des conditions de stringence de l'étape d'hybridation aux fins de définir les polynucléotides selon l'invention, sont avantageusement les suivantes : l'hybridation est réalisée à une température préférentielle de 65°C. en présence de tampon 6 x SSC, 5 x de solution de Denhardt, 0,5 % SDS et 100 μg/ml d'ADN de sperme de saumon.
Une solution de 1 x SSC correspond à 0,15 M NaCl et 0,05 M citrate de Na et une solution de 1 x Denhardt correspond à 0,02 % Ficoll, 0,02 % de polyvinyl- pyrrolidone et 0,02 % de sérum albumine bovine. Les étapes de lavage sont avantageusement les suivantes :
- deux lavages de 5 min, préférentiellement à 65°C, dans un tampon 2 x SSC et 0, 1 % SDS ;
- un lavage de 30 min, préférentiellement à 65°C, dans un tampon 2 x SSC et 0,1 % SDS ; - un lavage de 10 min, préférentiellement à 65°C, dans un tampon de 0,1 x SSC et 0,1 % SDS.
Selon une modalité avantageuse de la présente invention, ledit polynucleotide défini ci-dessus comprend le polynucleotide de séquence SEQ ED N° 1 et les fragments de celui-ci, ainsi que les séquences qui présentent au moins 90 % d'homologie avec ledit polynucleotide ou lesdits fragments. Par pourcentage d'homologie au sens de la présente invention, on entend un pourcentage d'identité entre les bases des deux polynucléotides homologues, ce pourcentage étant purement statistique et les différences entre les deux polynucléotides étant réparties au hasard et sur toute leur longueur. En séquençant les régions amplifiées du gène L de différents isolats viraux de type RSVB puis en comparant les séquences nucléotidiques obtenues, les inventeurs ont pu déterminer que la variabilité des séquences dans ce groupe précis de paramyxovirus respiratoires était très faible, plus spécifiquement d'environ 1 % pour l'ensemble des isolats étudiés. De manière générale, l'invention a également pour objet un fragment nucleotidique caractérisé en ce qu'il est capable de s'hybrider dans des conditions de forte stringence avec une séquence telle que définie ci-dessus.
Les polynucléotides tels que définis précédemment sont susceptibles de constituer des sondes oligonucléotidiques pour la détection spécifique d'un paramyxovirus de type RSVB.
Préférentiellement, de telles sondes comprennent un enchaînement d'au moins 12 nucleotides consécutifs du polynucleotide de séquence SEQ ID N° 1, d'un polynucleotide dont la séquence est complémentaire de la séquence du polynucleotide de SEQ ID N° 1 ou encore d'un polynucleotide hybridant dans des conditions de forte stringence avec ces derniers.
De manière préférée, les enchaînements nucléotidiques caractérisant les sondes spécifiques de RSVB selon l'invention sont choisies dans des régions du gène L du virus de RSVB qui sont particulièrement conservées entre différents isolats de ce virus et qui sont divergentes avec les séquences correspondantes des autres paramyxovirus (Figure 2).
A titre illustratif, une sonde oligonucléotidique hybridant spécifiquement avec la séquence SEQ ID N° 1 selon l'invention est avantageusement l'oligonucléotide caractérisé par l'enchaînement nucleotidique suivant : SEQ ID N° 2 : 5' -AACTTCATTAAGATTGACAACATGATCCTTTATGAAAGGA- 3', étant entendu que le polynucleotide de séquence complémentaire à la séquence SEQ ID N° 2 constitue également une sonde selon l'invention. D'autres sondes oligo- nucléotidiques spécifiques du virus de type RSVB sont les polynucléotides de séquences SEQ ID N° 14 à 16 décrits plus loin dans le présent mémoire descriptif, ainsi que les polynucléotides de séquences complémentaires à SEQ ID N° 14 à 16.
Les polynucléotides et sondes oligonucléotidiques selon la présente invention sont avantageusement marqués par un composé radioactif ou un composé non radioactif, ou encore par un oligonucléotide non apparenté lié covalamment à ceux-ci et utile comme moyen de marquage (par exemple par hybridation avec des oligonucléotides complémentaires eux-mêmes marqués par une enzyme, un composé fluorophore ou un composé radioactif).
Selon un mode de mise en oeuvre particulier des polynucléotides et sondes oligonucléotidiques selon l'invention, ceux-ci sont immobilisés sur un support, de manière covalente ou de manière non-covalente. L'invention a encore pour objet des amorces nucléotidiques pour l'amplification spécifique d'un polynucleotide du génome et/ou d'un ADN complémentaire correspondant à l'ARN messager d'un paramyxovirus de type RSVB, caractérisées en ce qu'elles comprennent un enchaînement d'au moins 12 nucleotides consécutifs d'un polynucleotide de séquence SEQ ID N° 1, d'un polynucleotide dont la séquence est complémentaire de la séquence du polynucleotide de SEQ ID N° 1 ou encore d'un polynucleotide hybridant dans des conditions de forte stringence avec ces derniers.
De manière préférée, les enchaînements nucléotidiques caractérisant les amorces spécifiques de RSVB selon l'invention sont choisis dans des régions du gène L du virus de RSVB qui sont particulièrement conservées entre différents isolats de ce virus et qui sont divergentes avec les séquences correspondantes des autres paramyxovirus (Figure 2). Plus particulièrement, on s'attachera à ce que les trois dernières bases de l'extrémité 3 ' desdites amorces soient parfaitement complémentaires de la séquence correspondante du gène L de RSVB et conduisent à des mésappariements vis-à-vis des séquences correspondantes des autres paramyxovirus. En particulier, l'invention concerne des amorces nucléotidiques spécifiques pour l'amplification d'un acide nucléique d'un paramyxovirus de type RSVB, caractérisées en ce qu'elles comprennent une séquence nucléique répondant à l'un des enchaînements de nucleotides suivants : SEQ ID N° 3 (amorce aller) : 5'-CTCTTGGTTGCATTTAACAATA-3' ; SEQ ID N° 4 (amorce aller) : 5'-GTTGTCAATCTTAATGAA-3 ' ; SEQ ID N° 5 (amorce retour) : 5'-TATCAGAGCTGTGATG-3'.
L'invention a aussi pour objet un couple d'amorces nucléotidiques spécifique pour l'amplification d'un acide nucléique d'un paramyxovirus de type RSVB, caractérisé en ce qu'il s'agit de l'un des couples d'amorces suivants : a) SEQ ID N° 3 et SEQ ID N° 5 (générant un amplicon d'environ 210 paires de bases) ; b) SEQ ID N° 4 et SEQ ID N° 5 (générant un amplicon d'environ 150 paires de bases).
Les polynucléotides ayant une séquence exactement complémentaire des séquences SEQ ID N° 3 à 5 peuvent également être mis en oeuvre en tant qu'amorces spécifiques d'un virus de type RSVB et font donc également partie de l'invention. Un autre but de la présente invention consiste en un procédé pour la détection spécifique de la présence d'un paramyxovirus appartenant au type RSVB dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) mise en contact de l'échantillon biologique avec un couple d'amorces spécifique du paramyxovirus RSVB selon l'invention, l'acide nucléique contenu dans l'échantillon ayant été, le cas échéant, préalablement rendu accessible à l'hybridation, dans des conditions permettant une hybridation des amorces à l'acide nucléique du virus de type RSVB ; b) amplification de l'acide nucléique du virus de type RSVB ; c) mise en évidence de l'amplification de fragments d'acide nucléique correspondant au fragment encadré par les amorces, par exemple par électrophorèse sur gel ou au moyen d'une sonde oligonucléotidique spécifique de RSVB selon l'invention, ou encore d'une sonde consensus selon l'invention hybridant avec différents paramyxovirus, lesdites sondes étant le cas échéant marquées radioactivement ou non radioactivement. L'invention concerne aussi une trousse ou nécessaire pour la détection spécifique de la présence d'un paramyxovirus appartenant au type RSVB dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les éléments suivants : a) un couple d'amorces nucléotidiques spécifique du virus RSVB selon l'invention ; b) les réactifs nécessaires pour effectuer une réaction d'amplification d'un acide nucléique ; c) le cas échéant, un composant permettant de détecter le fragment d'acide nucléique amplifié, de préférence une sonde oligonucléotidique spécifique de RSVB selon l'invention, ou encore d'une sonde consensus selon l'invention hybridant avec différents paramyxovirus, lesdites sondes étant le cas échéant marquées radioactivement ou non radioactivement. La présente invention a également pour objet un polypeptide correspondant à la région III de la grande sous-unité (L) de la polymerase des virus de type RSVB, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi : a) un polypeptide dont la séquence comprend l'enchaînement d'acides aminés SEQ ID N° 6 suivant :
NH2-TTDLSKFNQAFRYETSCICSDVLDELHGVQSLFSWLHLTIPLVTIICTYRHAP PFIKDHVVNLNEVDEQSGLYRYHMGGIEGWCQKLWTIEAISLLDLISLKGKFSIT ALINGDNQAI-COOH ; b) un fragment d'au moins 10 acides aminés du polypeptide défini en a), ledit fragment étant capable d'être reconnu par des anticorps dirigés contre la région III de la grande sous-unité (L) de la polymerase des virus de type RSVB ; c) un polypeptide comportant, par rapport au polypeptide défini en a) ou b), au moins une modification par délétion, addition ou substitution d'un acide aminé, ledit polypeptide modifié, également dénommé dérivé peptidique dans la présente description, étant capable d'être reconnu par des anticorps dirigés contre le polypeptide correspondant à la région III de la grande sous-unité (L) de la polymerase des virus de type RSVB.
La séquence SEQ ID N° 6 est représentée selon le code international à une lettre. La correspondance avec le code à trois lettres peut être aisément retrouvée, par exemple dans l'ouvrage de Stryer, Biochemistry, Third Ed. (1988). Par ailleurs, la correspondance entre la séquence d'acide nucléique SEQ ID N° 1 et la séquence d'acides aminés SEQ ID N° 6 est représentée au paragraphe Annexe 2.
Un tel polypeptide, tel que défini précédemment, est susceptible d'être reconnu spécifiquement par les anticorps présents dans le sérum de patients infectés par un paramyxovirus respiratoire de type RSVB.
Selon un autre aspect de l'invention, le polypeptide de séquence SEQ ID N° 6, ses fragments et ses dérivés modifiés sont susceptibles d'induire in vivo des anticorps capables de reconnaître le polypeptide correspondant à la région III de la grande sous- unité (L) de la polymerase des virus de type RSVB. Font également partie de l'invention les polypeptides homologues au polypeptide de séquence SEQ ID N° 6 ainsi que les fragments de tels polypeptides homologues. Par polypeptide homologue aux fins de la présente invention, on entend un polypeptide comprenant une ou plusieurs délétions et/ou substitutions d'acides aminés dans la séquence SEQ ID N° 6. Dans le cas d'une substitution, un ou plusieurs acides aminés -consécutifs ou non consécutifs- sont remplacés par des acides aminés « équivalents ». L'expression acide aminé « équivalent » vise ici à désigner tout acide aminé susceptible d'être substitué à l'un des acides aminés de la structure de base sans cependant modifier essentiellement les propriétés immunogènes des peptides correspondants. En d'autres termes, les acides aminés équivalents seront ceux qui permettent l'obtention d'un polypeptide de séquence modifiée qui permet l'induction in vivo d'anticorps capables de reconnaître le polypeptide de séquence SEQ ID N° 6 ou l'un de ses fragments ci-dessus définis. Les polypeptides homologues font partie des dérivés peptidiques dans la présente description.
Ces aminoacyles équivalents peuvent être déterminés soit en s'appuyant sur leur homologie de structure avec les aminoacyles auxquels ils se substituent, soit sur les résultats des essais d'immunogénicité croisée auxquels les différents peptides sont susceptibles de donner lieu.
A titre d'exemple, on mentionnera les possibilités de substitutions susceptibles d'être effectuées sans qu'il en résulte une modification approfondie de l'immunogénicité des peptides modifiés correspondants, les remplacements, par exemple, de la leucine par la valine ou l'isoleucine, de l'acide aspartique par l'acide glutamique, de la glutamine par l'asparagine, de l'arginine par la lysine etc., les substitutions inverses étant naturellement envisageables dans les mêmes conditions.
Pour la détermination des substitutions préférées d'un ou plusieurs acides aminés consécutifs ou non consécutifs du polypeptide de séquence SEQ ID N° 6, sans modifier significativement la structure tridimensionnelle et/ou l'immunogénicité du polypeptide résultant, par rapport au polypeptide initial, on pourra se référer avantageusement également aux travaux de Bowie et al. (1990).
La présente invention a également pour objet une famille de vecteurs recombinés, caractérisés en ce qu'ils contiennent au moins une séquence nucleotidique conforme à l'invention. Selon un mode de réalisation avantageux dudit vecteur, il comprend la séquence nucleotidique SEQ ID N° 1 ou un fragment de celle-ci. Selon une disposition préférée dudit mode de réalisation, ledit vecteur est un plasmide, ce plasmide comprenant ladite séquence associée à un vecteur de type pUC. Un tel plasmide répondant à la définition ci-dessus est le plasmide pUCl8 dans lequel a été insérée la séquence SEQ ID N° 1 au niveau du site de restriction Smal, situé entre un site Kpnl du côté 5' de la SEQ ID N° 1 et un site BamHI du côté 3' de la SEQ ID N° 1, ledit plasmide étant contenu dans une souche de E. coli déposée à la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes) le 20 juin 1997 sous le numéro d'accès 1-1880. La carte de restriction de ce plasmide est représentée à la Figure 4. 14
Un autre objet de la présente invention est donc un vecteur approprié pour le clonage et/ou l'expression et ou l'insertion d'une séquence, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence nucleotidique ci-dessus décrite en un site non essentiel pour sa réplication, le cas échéant sous le contrôle d'éléments de régulation susceptibles d'intervenir dans l'expression du polypeptide correspondant à la région III de la grande sous-unité (L) de la polymerase des virus de type RSVB, chez un hôte déterminé.
Les régions promotrices de l'expression de la SEQ ID N° 1 ou d'un fragment de cette séquence sont choisies en fonction de l'hôte cellulaire dans lequel l'expression du polynucleotide d'intérêt est désirée. Des promoteurs bactériens préférés pour l'expression des polynucléotides selon l'invention sont les promoteurs lad, lacZ, les promoteurs de l'ARN polymerase du bactériophage T3 ou T7, le promoteur de la polyédrine ou de la protéine plO du baculovirus (kit Novagen) (Smith et al., 1983 ; O'Reilly et al., 1992), le promoteur lambda PR ou encore le promoteur trc. Des promoteurs préférés pour l'expression des polynucléotides selon l'invention dans des hôtes cellulaires eucaryotes sont le promoteur précoce de CMV, le promoteur de la thymidine kinase du virus de l'Herpès simplex, le promoteur précoce ou le promoteur tardif du virus SV40, les régions LTR de certains rétrovirus ou encore le promoteur de la métallothionéine I de souris.
Le choix d'un promoteur spécifique parmi les promoteurs énumérés ci-dessus est à la portée de l'homme du métier, guidé par ses connaissances générales techniques dans le domaine de la recombinaison génétique, en s'appuyant, par exemple, sur l'ouvrage de Sambrook de 1989 ou encore selon les protocoles décrits par Fuller et al. en 1996.
Des vecteurs particuliers sont par exemple des plasmides, des phages, des cosmides, des phagemides, des YAC. A titre illustratif, les vecteurs suivants sont utilisés pour une expression du polypeptide selon l'invention dans un hôte cellulaire particulier : a) vecteurs pour bactéries : pBs, phagescript, PsiX174, pBluescript SK, pNH8a, pHNlόa, pNH18a, pNH46a, commercialisés par la société Stratagene; pTrc99A, pKK223-3, pDR540, pRIT5, commercialisés par la société Pharmacia, vecteur de transfert de type baculovirus pNL1392/1393 (Pharmingen) ; pQE-30, commercialisé par 0 la société QIAexpress ; b) vecteurs pour cellules eucaryotes : pWLneo, pSV2cat, pOG44, pXTl, pSG, commercialisés par la société Stratagene ; pSVK3, pBPV, pMSG, pSVL, commercialisés par la société Pharmacia.
Ces vecteurs sont utiles pour transformer ou transfecter des hôtes cellulaires afin 5 de cloner ou d'exprimer les séquences nucléotidiques de l'invention. Un hôte cellulaire recombinant selon l'invention est caractérisé en ce qu'il est modifié par une séquence nucleotidique ou un vecteur ci-dessus décrits.
A titre illustratif des hôtes cellulaires utilisés pour l'expression du polypeptide selon l'invention, les hôtes cellulaires suivants sont mis en oeuvre : a) hôtes procaryotes : Souches de Escherichia coli (p. ex. la souche DH5-α) ou de Bacillus subtilis ; b) hôtes eucaryotes : Cellules HeLa (ATCC N° CCL 2 ; N° CCL 2.1 ; N° CCL 2.2), cellules Cv-1 (ATCC N° CCL70), cellules COS (ATCC N° CRL1650 ; N° CRU 651), cellules Sf-9 (ATCC N° CRL1711). De préférence, l'hôte cellulaire est modifié par la séquence SEQ ID N° 1, ou par une séquence qui en est dérivée, dans des conditions permettant l'expression de la région III de la protéine L de la polymerase de RSVB fonctionnel, s'agissant de sa reconnaissance par des anticorps le reconnaissant spécifiquement. Les techniques de biologie moléculaire nécessaires à la préparation des vecteurs recombinants sont décrites dans l'ouvrage de Sambrook et al. de 1989.
Un hôte cellulaire recombiné particulier contenant le polynucleotide de séquence SEQ ID N° 1 est le clone de E. coli ASC.3 déposé à la CNCM le 20 juin 1997 sous le numéro d'accès 1-1880.
L'invention vise aussi un polypeptide recombinant caractérisé en ce qu'il est obtenu à partir d'un hôte cellulaire recombinant tel que défini ci-dessus, et de préférence obtenu selon le procédé décrit ci-après.
Il est aujourd'hui facile de produire des protéines en quantité relativement importante par génie génétique en utilisant comme vecteurs d'expression des plasmides, des phages, des phagemides. Le polynucleotide de séquence SEQ ID N° 1 peut être inséré dans un vecteur d'expression approprié pour produire in vitro un polypeptide correspondant à la région III de la protéine L de la polymerase de RSVB. Ce polypeptide pourra être fixé sur une microplaque pour développer un test sérologique destiné à rechercher, dans un but de diagnostic, les anticorps spécifiques chez les patients infectés par le virus RSVB. Ainsi, la présente invention concerne plus particulièrement un procédé de préparation d'un polypeptide de l'invention comprenant les étapes suivantes : a) le cas échéant, l'amplification préalable suivant la technique PCR de la quantité de polynucleotide codant pour ledit polypeptide à l'aide de deux amorces nucléotidiques choisies de manière à ce que l'une de ces amorces soit identique aux 10 à 25 premiers nucleotides du polynucleotide codant pour ledit polypeptide, tandis que l'autre amorce est complémentaire des 10 à 25 derniers nucleotides (ou s'hybride avec ces 10 à 25 derniers nucleotides) dudit polynucleotide, ou inversement de manière à ce que l'une de ces amorces soit identique aux 10 à 25 derniers nucleotides dudit polynucleotide, tandis que l'autre amorce est complémentaire des 10 à 25 premiers nucleotides (ou s'hybride avec les 10 à 25 premiers nucleotides) dudit polynucleotide, suivie de l'introduction dudit polynucleotide ainsi amplifié dans un vecteur approprié, par exemple l'un des vecteurs décrits ci-dessus, ledit polynucleotide étant placé sous le contrôle de signaux de régulation et/ou d'expression reconnus par un hôte cellulaire eucaryote ou procaryote ; b) la mise en culture, dans un milieu de culture approprié, d'un hôte cellulaire préalablement transformé par un vecteur approprié contenant un acide nucléique selon l'invention comprenant la séquence nucleotidique codant pour ledit polypeptide, et c) la séparation, à partir du susdit milieu de culture, dudit polypeptide produit par ledit hôte cellulaire transformé. Les polypeptides selon l'invention peuvent également être préparés par les techniques classiques, dans le domaine de la synthèse des peptides. Cette synthèse peut être réalisée en solution homogène ou en phase solide.
Par exemple, on aura recours à la technique de synthèse en solution homogène décrite par Houbenweyl en 1974, ou encore la technique décrite par Merrifield en 1963. Le polypeptide de séquence SEQ ID N° 6, ses fragments et ses dérivés peptidiques peuvent avantageusement être mis en oeuvre dans un procédé de détection in vitro d'anticorps dirigés contre la grande sous-unité de la polymerase des virus de type RSVB dans un échantillon biologique (tissu ou fluide biologique) susceptible de les contenir, ce procédé comprenant la mise en contact de l'échantillon biologique avec un polypeptide selon l'invention dans des conditions permettant une réaction immunologique in vitro entre ledit polypeptide et les anticorps éventuellement présents dans l'échantillon biologique, et la détection in vitro des complexes antigène-anticorps éventuellement formés.
De préférence, l'échantillon biologique est constitué par un fluide, par exemple un sérum de patient.
Toute procédure classique peut être mise en oeuvre pour réaliser une telle détection.
A titre d'exemple, une méthode préférée met en jeu des processus immunoenzymatiques selon la technique ELISA, ou immunofluorescents, ou radioimmunologiques (RIA) ou équivalents. Ainsi, l'invention concerne également le polypeptide de séquence SEQ ID N° 6 selon l'invention, ou tout fragment ou dérivé peptidique tel que décrit ci-dessus, marqué à l'aide d'un marqueur adéquat de type enzymatique, fluorescent, radioactif, etc..
De telles méthodes comprennent par exemple les étapes suivantes : - dépôt de quantités déterminées d'une composition polypeptidique selon l'invention dans les puits d'une plaque de microtitration,
- introduction dans lesdits puits de dilutions croissantes du sérum devant être analysé,
- incubation de la microplaque,
- introduction dans les puits de la plaque de microtitration d'anticorps marqués dirigés contre des immunoglobulines humaines ou animales, le marquage de ces anticorps ayant été réalisé à l'aide d'une enzyme sélectionnée parmi celles qui sont capables d'hydrolyser un substrat en modifiant l'absorption des radiations de ce dernier, au moins à une longueur d'onde déterminée, par exemple à 550 nm,
- détection, en comparaison avec un témoin de contrôle, de la quantité de substrat hydrolyse.
L'invention concerne également une trousse ou un nécessaire pour le diagnostic in vitro d'une infection par un virus de type RSVB, comprenant :
- le polypeptide de séquence SEQ ID N° 6, un de ses fragments, un de leurs dérivés peptidiques ou un polypeptide recombinant selon l'invention, - les réactifs pour la constitution du milieu propice à la réaction immunologique,
- les réactifs permettant la détection des complexes antigène-anticorps produits par la réaction immunologique, ces réactifs peuvent également porter un marqueur, ou être susceptibles d'être reconnus à leur tour par un réactif marqué, plus particulièrement dans le cas où le polypeptide de séquence SEQ ID N° 6, un de ses fragments, un de leurs dérivés peptidiques ou un polypeptide recombinant selon l'invention, n'est pas marqué,
- le cas échéant, un échantillon biologique de référence (témoin négatif) dépourvu d'anticorps reconnus par le polypeptide de séquence SEQ ID N° 6, par un de ses fragments, par un de leurs dérivés peptidiques ou par un polypeptide recombinant selon l'invention, - le cas échéant, un échantillon biologique de référence (témoin positif) contenant une quantité prédéterminée d'anticorps reconnus par le polypeptide de séquence SEQ ID N° 6, par un de ses fragments, par un de leurs dérivés peptidiques ou par un polypeptide recombinant selon l'invention.
Les polypeptides selon l'invention permettent de préparer des anticorps monoclonaux ou polyclonaux caractérisés en ce qu'ils reconnaissent spécifiquement lesdits polypeptides. Les anticorps monoclonaux pourront avantageusement être préparés à partir d'hybridomes selon la technique décrite par Kohler et Milstein en 1975. Les anticorps polyclonaux pourront être préparés, par exemple par immunisation d'un animal, en particulier une souris, avec un polypeptide selon l'invention associé à un adjuvant de la réponse immunitaire, puis purification des anticorps spécifiques contenus dans le sérum des animaux immunisés sur une colonne d'affinité sur laquelle a préalablement été fixé le polypeptide ayant servi d'antigène. Les anticorps polyclonaux selon l'invention peuvent aussi être préparés par purification sur une colonne d'affinité, sur laquelle a préalablement été immobilisé un polypeptide selon l'invention, des anticorps contenus dans le sérum de patients infectés par un paramyxovirus de type RSVB.
L'invention vise en conséquence un procédé pour la détection spécifique de la présence d'un antigène d'un virus de type RSVB dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) mise en contact de l'échantillon biologique (tissu ou fluide biologique) prélevé chez un individu avec un anticorps dirigé contre un polypeptide selon l'invention, dans des conditions permettant une réaction immunologique in vitro entre ledit anticorps et ledit polypeptide présent dans l'échantillon biologique ; b) mise en évidence du complexe antigène-anticorps formé.
Entre également dans le cadre de l'invention, une trousse ou un nécessaire pour le diagnostic in vitro sur un échantillon biologique, de la présence de virus de type RSVB dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend : a) un anticorps polyclonal ou monoclonal selon l'invention ; b) le cas échéant, les moyens nécessaires à la détection du complexe antigène- anticorps formé.
Fait aussi partie de l'invention une trousse ou nécessaire pour le diagnostic spécifique de la présence d'un paramyxovirus de type RSVB dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend : a) un anticorps polyclonal ou monoclonal selon l'invention ; b) le cas échéant, un réactif pour la constitution du milieu propice à la réalisation de la réaction immunologique ; c) un réactif permettant la détection des complexes antigène-anticorps produits par la réaction immunologique, ledit réactif pouvant porter un marqueur, ou être susceptible d'être reconnu à son tour par un réactif marqué, plus particulièrement dans le cas où ledit anticorps monoclonal ou polyclonal n'est pas marqué ; d) le cas échéant, des réactifs pour effectuer la lyse des cellules de l'échantillon testé. Les anticorps polyclonaux ainsi que les anticorps monoclonaux et les hybridomes produisant de tels anticorps monoclonaux constituent un objet de la présente invention. L'invention a également pour objet une composition immunogène caractérisée en ce qu'elle comprend un ou plusieurs polypeptides selon l'invention, le cas échéant en présence d'un adjuvant de l'immunité tel que l'adjuvant complet de Freund, l'adjuvant incomplet de Freund ou un composé de la famille des muramyl peptides. Le(s) polypeptide(s) contenu(s) dans une composition immunogène selon la présente invention peut(vent) être couplé(s) à des agents immunogènes, tels que la KLH (Keyhole lympet Hemocyanin), l'ovalbubine, le sérum albumine bovine ou humaine, l'anatoxine tétanique (tetanus toxoid), etc., par l'intermédiaire d'un agent de couplage tel que le glutaraldéhyde ou le carbodiimide. Selon un mode de réalisation avantageux de la composition immunogène de la présente invention, le(s) polypeptide(s) contenu(s) dans la composition est (sont) conjugué(s) à l'ovalbumine (Calbiochem) à l'aide du protocole à benzidine-bis-diazotée décrit par Gregory et al. en 1967, le rapport du nombre de molécules de polypeptide(s) au nombre de molécules d'ovalbumine étant de 5: 1. Le(s) polypeptide(s), conjugué(s) ou non conjugué(s), est (sont) ensuite injecté(s) à l'animal, par exemple au lapin ou à la souris, de préférence par injection intradermique multi-points; généralement, dix points d'injection sont effectués.
Dans le cas de lapins injectés avec undit polypeptide conjugué à l'ovalbumine, l'injection au temps 0 est réalisée avec 1 mg dudit polypeptide conjugué. Deux mois après la première injection, les animaux sont injectés avec 0,5 mg du même polypeptide conjugué et une troisième injection de 0,5 mg dudit polypeptide conjugué est effectuée de deux à quatre mois après la seconde injection. L'antisérum est recueilli entre deux et quatre semaines après la troisième injection dudit polypeptide conjugué et est, le cas échéant, purifié sur une colonne de chromatographie d'affinité sur laquelle a été préalablement immobilisé le polypeptide ayant servi d'antigène. Une technique de préparation d'une telle colonne de chromatographie d'affinité est par exemple décrite par Bird et al. en 1984.
L'invention concerne aussi des polynucléotides caractérisés en ce qu'ils codent pour un polypeptide selon l'invention. Un alignement multiple des séquences en acides aminés du gène L des virus de type RSVA, PIV3 et RSVB a permis aux inventeurs de définir des régions de grande conservation entre les virus. Sur la base des séquences nucléotidiques codant ces régions peptidiques bien conservées, plusieurs couples d'amorces consensus ou génériques ont été synthétisés, caractérisés en ce qu'il peuvent être mis en oeuvre dans une réaction d'amplification d'un acide nucléique cible pour amplifier indifféremment l'ARN provenant de l'un ou l'autre des paramyxovirus respiratoires de type RSVA, PIV3 ou RSVB.
En particulier, les inventeurs ont suivi une démarche originale consistant tout d'abord à aligner les séquences d'acides aminés de la grande sous-unité de la polymerase (L) de différents paramyxovirus, incluant PIV3 et RSVA, et à repérer les régions de grande conservation en acides aminés (Figure 5 ; Figure 6), à la fois dans les domaines I à V de cette polymerase. Les domaines I à V ont été définis par Poch et al. en 1990.
Des analyses des inventeurs représentées dans les Figures 5 et 6, il ressort que des motifs conservés en acides aminés sont principalement localisés dans les domaines I, II et III, tels que définis par Poch en 1990.
A partir des données d'alignements en acides aminés, les inventeurs ont construit les alignements nucléotidiques correspondants et se sont attachés à définir les régions pour lesquelles les séquences nucléotidiques de RSVA et PIV3 présentent une très grande conservation (identifiées par « + » sur la Figure 7).
A partir des données d'alignements nucléotidiques représentées à la figure 7, les inventeurs ont identifié des petites régions localisées dans les domaines I, II et III du gène de la polymerase dans lesquelles des amorces nucléotidiques génériques ou consensus (capable d'amplifier indifféremment les régions correspondantes du génome de RSVA, PIV3 et RSVB) ont été définies.
Pour la définition des amorces, la dégénérescence du code génétique (« wooble ») a été pris en compte. Ainsi, les acides aminés codés par un nombre peu important de codons (exemple : W) ont été préférés de manière à limiter la probabilité de variabilité de séquence entre la séquence des amorces et la séquence de l'acide nucléique cible et en conséquence limiter la probabilité de mésappariements entre l'amorce et l'acide nucléique cible.
Dans le domaine I, les amorces génériques selon l'invention sont définies dans trois régions de très forte conservation : - la région allant du nucléotide en position nt 1261 au nucléotide en position nt 1295 (Numérotation RSVA de la Figure 7) ; - la région allant du nucléotide en position nt 1402 au nucléotide en position nt 1443 de la Figure 7 ;
- la région allant du nucléotide en position nt 1603 au nucléotide en position nt 1631 de la Figure 7. Plus particulièrement, une amorce aller préférée comprendra l'enchaînement nucleotidique suivant :
SEQ ID N° 27 : 5'-1279-AGAATATTTGGACATCC-1295-3'.
L'amorce de SEQ ID N° 27 possède un mésappariement avec le génome de
RSVA (T/C) et possède deux mésappariements avec le génome de PIV3 (A G et T/C). Dans le domaine II, les amorces génériques selon l'invention sont définies dans deux régions de très forte conservation :
- la région allant du nucléotide en position nt 1733 au nucléotide en position nt 1775 de la Figure 7 ;
- la région allant du nucléotide en position nt 1855 au nucléotide en position nt 1891 de la Figure 7.
Plus particulièrement, une amorce aller préférée comprendra l'enchaînement nucleotidique suivant : SEQ ID N° 23 : 5 875 -AGGTAGATGTTTGCAA-1891-3'.
L'amorce de SEQ ID N° 23 possède un mésappariement avec le génome de RSVA (C/A) et possède un mésappariement avec le génome de PIV3 (G/C).
La séquence complémentaire de la SEQ ED N° 23 est avantageusement utilisée comme amorec retour ; il s'agit du polynucleotide comprenant au moins 12 nucleotides consécutifs de l'enchaînement suivant :
SEQ ID N° 24 : 5'-1891-TTGCAAACAGTCTACCT-1875-3'. Dans le domaine III, les amorces génériques selon l'invention sont définies dans deux régions de très forte conservation :
- la région allant du nucléotide en position nt 2323 au nucléotide en position nt 2357 de la Figure 7 ;
- la région allant du nucléotide en position nt 2552 au nucléotide en position nt 2579 de la Figure 7.
Plus particulièrement, une amorce aller préférée comprendra l'enchaînement nucleotidique suivant : SEQ ID N° 25 : 5'-2341-TGTCAAAAACTATGGAC-2357-3'. L'amorce de SEQ ID N° 25 possède un mésappariement avec le génome de RSVA (A/G) et possède un mésappariement avec le génome de PIV3 (C/T). Cette amorce a une séquence parfaitement complémentaire avec le génome de RSVB.
La séquence complémentaire de la SEQ ED N° 25 est avantageusement utilisée comme amorce retour ; il s'agit du polynucleotide comprenant au moins 12 nucleotides consécutifs de l'enchaînement suivant : SEQ ID N° 26 : 5'-2357-GTCCATAGTTTTTGACA-2341-3'.
En conséquence, la présente invention a aussi pour objet une amorce nucleotidique pour l'amplification d'un polynucleotide du génome et/ou d'un ADN complémentaire correspondant à l'ARN messager d'un paramyxovirus de type RSV et PIV, caractérisée en ce qu'elle comprend un enchaînement nucleotidique inclus dans les régions nucléotidiques du gène L de RSV ou PIV telles que définies ci-dessus, et plus particulièrement les polynucléotides définis ci-dessus comprenant tout ou partie des enchaînements nucléotidiques de séquences SEQ EDN° 23 à 26. La présente invention concerne également un couple d'amorces nucléotidiques pour l'amplification d'un polynucleotide du génome et/ou d'un ADN complémentaire correspondant à l'ARN messager d'un paramyxovirus de type RSV et PIV, caractérisée en ce qu'elle comprend une combinaison d'enchaînements nucléotidiques inclus dans des régions nucléotidiques du gène L de RSV ou PIV très fortement conservées entre les virus de types différents.
Dans le but d'éviter un faible rendement de l'étape d'amplification, les amorces ont été choisies de manière à hybrider avec des séquences assez proches sur le génome.
Plus particulièrement, un couple d'amorces nucléotidiques répondant à la définition ci-dessus est caractérisé en ce qu'il s'agit de l'un des couples d'amorces suivants :
- SEQ ID N° 27 et SEQ ID N° 24 ;
- SEQ ID N° 27 et SEQ ID N° 26 ;
- SEQ ID N° 27 et SEQ ID N° 8 ;
- SEQ ID N° 27 et SEQ ID N° 9 ; - SEQ ID N° 23 et SEQ ID N° 26 ;
- SEQ ID N° 23 et SEQ ID N° 8
- SEQ ID N° 23 et SEQ ID N° 9
- SEQ ID N° 7 et SEQ ID N° 26
- SEQ ID N° 7 et SEQ ID N° 8 ; - SEQ ID N° 7 et SEQ ID N° 9. Selon un mode particulièrement avantageux de mise en oeuvre du procédé de diagnostic différentiel selon la présente invention, les différents couples d'amorces génériques définis sont utilisés en combinaison dans le mélange réactionnel nécessaire à la réaction d'amplification. L'invention concerne encore un procédé pour la détection spécifique de la présence d'un paramyxovirus appartenant au type RSVA, RSVB ou PIV3 dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) l'ADN de l'échantillon biologique, ou l'ADNc obtenu par transcription inverse de l'ARN de l'échantillon biologique, est amplifié à l'aide d'un couple d'amorces tel que défini ci-dessus, l'acide nucléique contenu dans l'échantillon biologique ayant, le cas échéant, préalablement été rendu accessible à l'hybridation, dans des conditions permettant l'hybridation des amorces nucléotidiques à l'acide nucléique d'un paramyxovirus de type RSVA, RSVB ou PIV3 ; b) mise en contact d'un polynucleotide ou d'un mélange de sondes spécifiques d'un paramyxovirus d'un type donné avec l'acide nucléique résultant de l'amplification de l'étape a) ; dans un mode particulièrement préféré dudit procédé de détection spécifique, les sondes spécifiques sont les polynucléotides de séquences SEQ ID N° 10 à SEQ ID N° 18 et SEQ ID N° 2 selon l'invention ; c) détection de l'hybride formé entre le polynucleotide ou le mélange de polynucléotides et l'acide nucléique amplifié.
La présente invention a également pour objet une trousse ou nécessaire pour la détection spécifique de la présence d'un paramyxovirus appartenant au type RSV ou PIV dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend : a) au moins un couple d'amorces nucléotidiques tel que défini ci-dessus ; b) les réactifs nécessaires à la mise en oeuvre d'une réaction d'amplification d'un acide nucléique cible.
Avantageusement, ladite trousse ou nécessaire de détection est caractérisée en ce qu'elle comprend au moins deux couples d'amorces selon l'invention.
De manière préférée, ladite trousse ou nécessaire de détection est caractérisée en ce qu'elle comprend en outre au moin une sonde oligonucléotidique spécifique du gène L d'un paramyxovirus donné, et de manière tout a à fait préférée la sonde olignucléotidique est choisie parmi les polynucléotides de séquences SEQ ID N° 10 à SEQ ID N° 18 et
SEQ ID N° 2.
Enfin, ladite trousse ou nécessaire de détection, comme de manière générale l'ensemble des trousses ou nécessaires de détection selon l'invention, peut comprendre en outre, une sonde oligonucléotidique générique, comme par exemple une sonde de séquence SEQ ID N° 19, SEQ ID N° 20, SEQ ID N° 21 ou SEQ ID N° 22.
Les couples d'amorces consensus ou génériques selon l'invention peuvent être avantageusement mis en oeuvre dans un procédé de diagnostic différentiel des virus RSVA, RSVB et PIV3, dans lequel l'étape de diagnostic différentiel proprement dite est constituée soit d'une analyse du profil de restriction caractéristique des amplicons générés à l'aide du couple d'amorces considéré, soit d'une détection spécifique de l'amplicon généré à l'aide de sondes spécifiques selon l'invention, hybridant spécifiquement avec l'amplicon correspondant d'un virus de type RSVA, PIV3 ou RSVB, soit encore de toute autre technique conventionnelle de caractérisation d'un amplicon bien connue de l'homme du métier.
En général, les couples d'amorces spécifiques de RSVB ou les couples d'amorces génériques selon l'invention peuvent être mis en oeuvre dans différents types de réaction d'amplification d'un acide nucléique cible, le cas échéant après transformation de l'ARN présent dans l'échantillon biologique en son ADNc en faisant agir une enzyme ayant une activité transcriptase inverse.
La technique PCR nécessite le choix de paires d'oligonucléotides encadrant le fragment qui doit être amplifié. La technique dite PCR ou réaction d'amplification en chaîne à l'aide de la polymerase, qui a été décrite pour la première fois en 1985 par Saiki et al. et qui fait l'objet des brevets européens EP 201 184 et EP 200 362 ou encore dans les travaux de Erlich (1989), Innis (1990) ou Rolfs (1991).
Les amorces oligodésoxyribonucléotidiques ou oligoribonucléotidiques selon l'invention ont avantageusement une longueur d'au moins 12 nucleotides. L'une des deux amorces est complémentaire du brin (+) [amorce aller] de la matrice et l'autre amorce est complémentaire du brin (-) [amorce retour]. Il est important que les amorces ne possèdent pas de structure secondaire ou de séquence complémentaire l'une de l'autre. D'autre part, la longueur et la séquence de chaque amorce doivent être choisies de manière à ce que les amorces ne s'hybrident pas avec d'autres acides nucléiques provenant de virus ou de cellules procaryotes ou eucaryotes, en particulier avec les acides nucléiques provenant de paramyxovirus n'appartenant pas aux types RSVA, PIV3 ou RSVB, ni avec l'ADN ou l'ARN humain pouvant éventuellement contaminer l'échantillon biologique.
Les fragments amplifiés peuvent être identifiés par une électrophorèse en gel d'agarose ou de polyacrylamide, ou par une électrophorèse capillaire, ou encore par une technique chromatographique (filtration sur gel, chromatographie hydrophobe ou chromatographie échangeuse d'ions), le cas échéant après avoir fait agir une ou plusieurs endonucléases de restriction appropriées, ou encore par toute autre technique de visualisation des fragments d'acide nucléique amplifiés bien connue de l'homme du métier.
L'invention vise également les fragments nucléotidiques obtenus par amplification du polynucleotide de séquence SEQ ID N° 1 à l'aide d'un couple d'amorces selon l'invention, plus particulièrement à l'aide de l'un quelconque des couples d'amorces spécifiques du paramyxovirus de type RSVB ou des couples d'amorces génériques définis ci-dessus.
Ainsi, font également partie de l'invention les fragments nucléotidiques amplifiés (« amplicons ») définis ci-dessus.
D'autres techniques d'amplification de l'acide nucléique cible peuvent être avantageusement employées comme alternatives à la PCR. La technique SDA (Strand Displacement Amplification) ou technique d'amplification à déplacement de brin (Walker et al., 1992) est une technique d'amplification isotherme dont le principe est fondé sur la capacité d'une enzyme de restriction de couper l'un des deux brins de son site de reconnaissance qui se trouve sous une forme hémiphosphorothioate et sur la propriété d'une ADN polymerase d'initier la synthèse d'un nouveau brin d'ADN à partir de l'extrémité 3 'OH créée par l'enzyme de restriction et de déplacer le brin préalablement synthétisé qui se trouve en aval. La méthode comprend deux étapes principales : a) synthèse, en présence de dCTP-alpha-S, de molécules d'ADN flanquées par des sites de restriction qui peuvent être coupés par une enzyme appropriée ; b) amplification exponentielle de ces molécules d'ADN ainsi modifiées, par coupure enzymatique, déplacement de brin et copiage des brins déplacés. Les étapes de coupure, de déplacement et de copiage sont répétées un nombre suffisant de fois afin d'obtenir une bonne sensibilité.
Ainsi, le protocole de la technique SDA est simple : l'ADN cible présent dans l'échantillon à analyser est dénaturé par la chaleur en présence de tous les réactifs exceptées les enzymes (enzyme de restriction et polymerase) qui sont ajoutées au milieu réactionnel après l'étape de dénaturation.
Initialement réalisée avec l'enzyme de restriction HincII (Walker et al., 1992), cette technique est désormais mise en oeuvre avec une endonucléase de restriction isolée à partir de Bacillus stearothermophilus (BsoBÏ), et un fragment sans activité exonucléase 5' → 3' d'une ADN polymerase isolée de Bacillus cladotenax (exo'Bca) [= exo-moins-5c ]. Ces deux enzymes peuvent opérer à 60°C et le système est désormais optimisé pour permettre l'utilisation de dUTP et la décontamination par l'UDG.
Lors de la mise en oeuvre de cette technique, comme décrit par Spargo et al. en 1996, le temps de doublement de l'ADN cible est de 26 secondes et son taux d'amplification atteint 10 après 15 minutes d'incubation à 60°C.
La technique SDA est plus simple à réaliser que la PCR (un bain marie est suffisant) et elle est plus rapide que les autres techniques d'amplification.
Un autre objet de la présente invention est donc la mise en oeuvre des amorces oligonucléotidiques spécifiques selon l'invention dans un procédé d'amplification d'ADN ou d'ARN selon la technique SDA ci-dessus. La méthode d'amplification par SDA repose sur l'utilisation d'amorces oligonucléotidiques modifiées en 5' par l'addition d'une séquence d'ADN reconnue par une enzyme de restriction, par exemple l'enzyme HincII. Le processus requiert la formation d'un site de restriction thiolé par incorporation de déoxyadénosine thriphosphate soufré, et les actions alternées de ladite enzyme de restriction (par exemploe HincII) qui hydrolyse partiellement (sur un seul brin), ledit site de restriction, et de l'ADN polymerase qui synthétise à partir du point d'hydrolyse un nouveau brin, avec déplacement simultané de la séquence nucléique précédemment coupée, sans que la dénaturation soit nécessaire. L'hybridation des amorces modifiées sur la cible nécessite seulement une première étape de dénaturation de l'ADN. La réaction se fait ensuite à 37°C et simultanément sur les deux brins d'ADN cible, ce qui conduit à une augmentation exponentielle du nombre de copies en fonction du temps de réaction. La méthode permet une amplification moyenne de la cible de η l'ordre d'au moins 10 . A titre illustratif de la mise la mise en oeuvre de la technique SDA dans le cadre de la présente invention, deux couples d'amorces sont utilisés : un couple d'amorces externes (Bl, B2) constituées d'une séquence hybridant avec la SEQ ID N° 1 ou de leur séquence complémentaire, et un couple d'amorces internes (SI, S2) constituées d'un oligonucléotide de fusion entre une séquence spécifique de la SEQ ID N° 1 ou de leur séquence complémentaire fusionnée à une séquence nucleotidique contenant un site reconnu par une endonucléase de restriction, par exemple l'enzyme iîsoBI.
Selon un autre aspect de la présente invention, les couples d'amorces utilisés pour la réalisation d'une réaction d'amplification de type SDA sont les couples d'amorces consensus ou génériques selon l'invention. A titre d'exemple de la mise en oeuvre des amorces génériques selon l'invention dans un procédé d'amplification de type SDA, on peut, pour réaliser une amorce utilisable dans une réaction SDA, ajouter, à l'extrémité 5' de la région de l'amorce de séquence SEQ ID N° 3 selon l'invention, une séquence non spécifique du gène L de la grande sous-unité de la polymerase des paramyxovirus, en particulier des virus RSVA, PIV3 ou RSVB, contenant un site de restriction, et plus particulièrement un site de restriction reconnu par l'endonucléase HincII ou i?soBI.
Une telle séquence additionnelle contenant le site de restriction reconnu par l'endonucléase JBSOBI est avantageusement la séquence de nucleotides GCATCGAATGCATGTCTCGGGT, les nucleotides représentés en caractères gras correspondant au site de reconnaissance de l'enzyme BsoBl.
A titre illustratif, une amorce selon l'invention utilisable dans le cadre d'une amplification de type SDA peut être réalisée à partir de la séquence de l'amorce choisie et sera constituée de la séquence : GCATCGAATGCATGTCTCGGGTCTCTTGGTTGCATTTAACAATA (contenant la SEQ ID N° 3), dans laquelle les nucleotides représentés en caractères gras correspondant au site de reconnaissance de l'enzyme .BsoBI et les nucleotides soulignés correspondent à la séquence spécifique de l'ADN cible. Un second jeu d'amorces, amplifiant l'autre extrémité de l'acide nucléique cible, sera réalisé comme décrit ci-dessus. La sonde de détection sera choisie de telle manière à ce qu'elle hybride avec l'amplicon généré.
Des amorces similaires, utilisables dans une technique d'amplification de type SDA peuvent être réalisées à partir de l'une quelconque des amorces selon l'invention et plus particulièrement avec l'une quelconque des amorces de séquences SEQ ID N° 3, 4, 5, 7, 8, 9 selon l'invention.
L'invention a donc également pour objet des amorces nucléotidiques conformes aux amorces décrites ci-dessus pour la mise en oeuvre d'une technique d'amplification d'ADN par déplacement de brin (SDA).
De manière préférentielle, lorsque l'on utilise des amorces contenant un site reconnu par l'endonucléase HincII, les réactions SDA HincII/exo"Klenow [= HincII/exo- moins-Klenow] sont réalisées dans un volume de 50μl en présence de concentrations finales de 7,7 M MgCl2, 0,2 mM de chaque dGTP, dCTP, dATP-alpha-S, 0,5 mM dUTP, 100 μg/ml de sérum albumine bovine acétylée, 10 ng/μl d'ADN de placenta humain, 50 mM K2HPO4, pH 7,6, 10 % (v/v) diméthylsulfoxyde, 5 % (v/v) glycerol, 0,5 μM de chacune des deux amorces SI, S2, 0,05 μM de chacune des amorces Bl, B2, 3 unités/μl de HincII, 0,04 U/μl de exo'Klenow et des quantités variées de l'ADN cible. Préalablement à l'addition de HincII, de exo'Klenow et de MgC_2, les réactions incomplètes (40 μl) sont chauffées à 95°C pendant 2 min afin de dénaturer l'ADN cible, puis sont placées à la température de 40°C pendant 2 min afin d'hybrider les amorces. Après l'addition de 10 μl du mélange d'enzymes constitué de 5 μl de MgCl2 à 77 mM, 0,2 μl de exo'Klenow (10 U/μl), 2 μl HincII (75 U/μl) et de 2,8μl de glycérol à 50 %, le mélange réactionnel est incubé à 40°C pendant 2 h. Des fractions aliquotes de chaque échantillon sont ajoutées directement à 5 μl de tampon non-dénaturant (20 % Ficoll, 0,25 % de bleu de bromophénol). L'analyse est ensuite effectuée par électrophorèse sur gel de polyacrylamide à 10 % non dénaturant suivie d'une coloration au bromure d'éthidium et d'une visualisation des bandes par illumination du gel d' électrophorèse aux rayons ultra- violet.
De manière avantageuse, lorsque l'on utilise des amorces contenant un site reconnu par l'endonucléase 2?soBI, les réactions SDA ifaoBI/exo'Bca [= BsoBl/exo- moins-Bca] sont réalisées dans un volume de 50 μl en présence de concentrations finales de 6 mM MgCl2, 0,2mM de chacun des dGTP, dATP, 0,5 mM dUTP, 1,4 mM dCTP- alpha-S, 100 ng/μl de sérum albumine bovine acétylée, 10 ng/μl d'ADN de placenta humain, 35 mM K2HPO4 pH 7,6, 10 % (v/v) de glycérol, 0,5 μM de chacune des amorces SI et S2, 0,05 μM de chacune des amorces Bl et B2, 3,2 U/μl Bso l, 0, 16 U/μl de exo'Bca et des quantités variées d'ADN cible. Préalablement à l'addition de BsoBl, de exo'Bca et de MgCl2, les réactions incomplètes (40 μl) sont chauffées à 95°C pendant 2 min afin de dénaturer l'ADN cible puis sont placées à 56°C pendant 2 min afin d'hybrider les amorces. Après l'addition de 10 μl du mélange enzymatique constitué de 5 μl de MgCl2 60 mM, 0,8 μl exo'Bca (10 U/μl), 1 μl £soBI (160 U/μl) et 3,2 μl de tampon de dilution (10 mM Tris HCl, 10 mM MgCl2, 50 mM NaCl, 1 mM DTT), les réactions sont incubées à 56°C pendant 20 min. Des fractions aliquotes de 10 μl de chacun des échantillons sont ajoutées directement à 5 μl de tampon non dénaturant et analysé comme décrit ci-dessus.
Les polynucléotides de séquence SEQ ID N° 1 et leurs fragments nucléotidiques, utiles comme amorces spécifiques des paramyxovirus de type RSVB ci-dessus décrits, ainsi que l'ensemble des amorces génériques selon l'invention, peuvent également être mis en oeuvre dans d'autres procédés d'amplification d'un acide nucléique cible, tels que : - la technique d'amplification par déplacement de brin décrite dans la demande de brevet français N° FR-9508945 (Bio Mérieux) ; - la technique TAS (Transcription-based Amplification System), décrite par Kwoh et al. en 1989 ;
- la technique 3SR (Self-Sustained Séquence Replication), décrite par Guatelli et al. en 1990 ; - la technique NASBA (Nucleic Acid Séquence Based Amplification), décrite par Kievitis et al. en 1991 ;
- la technique TMA (Transcription Mediated Amplification).
Les polynucléotides de séquence SEQ ID N° 1 ainsi que leurs fragments oligonucléotidiques, utiles comme amorces spécifiques des paramyxovirus de type RSVB, et les amorces nucléotidiques selon l'invention peuvent aussi être employés dans des techniques d'amplification ou de modification de l'acide nucléique servant de sonde, telles que :
- la technique LCR (Ligase Chain Reaction), décrite par Landegren et al. en 1988 et perfectionnée par Barany et al. en 1991, qui emploie une ligase thermostable ; - la technique de RCR (Repair Chain Reaction), décrite par Segev en 1992 ;
- la technique CPR (Cycling Probe Reaction), décrite par Duck et al. en 1990 ;
- la technique d'amplification à la Q-beta-réplicase, décrite par Miele et al. en 1983 et perfectionnée notamment par Chu et al. en 1986, Lizardi et al. en 1988, puis par Burg et al. ainsi que par Stone et al. en 1996. Selon un autre aspect de l'invention, un alignement multiple des séquences en acides aminés connues du gène L de souches prototypes (souches de laboratoire) et d' isolats cliniques provenant de virus de type RSVA, PIV3 et de la séquence nouvelle de la région III du gène N du virus RSVB a permis aux inventeurs de définir des régions de faible conservation entre ces différents virus. Sur la base des séquences nucléotidiques codant ces régions peptidiques peu conservées, des oligonucléotides spécifiques ont été synthétisés dont la séquence a été définie de telle manière à ce qu'un oligonucléotide particulier n'hybride, dans des conditions d'hybridation fortement stringentes, qu'à un acide nucléique d'un paramyxovirus d'un type donné choisi parmi RSVA, RSVB et PIV3, à l'exclusion de tout autre type de paramyxovirus. Dans le but de mettre au point un outil de typage utilisable en diagnostic de routine dans les laboratoires d'analyse, les inventeurs ont recherché des sondes oligonucléotidiques dans des régions de l'amplicon spécifiques de chaque groupe de virus.
Dans un mode de réalisation particulier, des sondes selon l'invention utiles pour distinguer spécifiquement les virus des groupes RSVA et RSVB ont été sélectionnées dans la région située entre le nucléotide en position 159 et le nucléotide en position 200 de l'amplicon, c'est-à-dire dans l'une des régions dans lesquelles les séquences de RSVA et RSVB sont les plus divergentes (Figure 2). Par exemple, la sonde spécifique de PIV3 de séquence SEQ ID N° 17 a été sélectionnée dans la région délimitée par le nucléotide en position 77 et le nucléotide en position 118 de l'amplicon, c'est-à-diie dans une région dans laquelle les séquences PIV et RSV présentent une grande divergence (environ 50 % de divergence entre lesdites séquences), cette région de forte divergence comprenant notamment un long « gap » unique de trois nucleotides.
Les inventeurs ont mis au point un test de détection différentiel par hybridation qui met en oeuvre trois sondes oligonucléotidiques internes à un amplicon déterminé, la séquence de chaque sonde étant choisie de manière à ce que cette dernière soit spécifique de chaque type de virus et non spécifique des autres types viraux dont le génome est amplifié grâce aux amorces génériques.
Le test décrit dans l'Exemple 5 a permis de démontrer une corrélation de 97,5 % entre les résultats obtenus à l'aide des sondes spécifiques selon l'invention et les données du séquençage des amplicons détectés avec ces sondes. Le test est en effet positif avec une sonde homologue (valeur d'indice très supérieure à 1), et systématiquement négatif avec une sonde hétérologue (valeur d'indice inférieure à 1). Les résultats obtenus par les inventeurs à l'Exemple 5 indiquent clairement l'absence d'hybridation croisée des sondes spécifiques selon l'invention avec des amplicons dérivés de génomes hétérologues.
Les sondes spécifiques de RSVA, RSVB et PIV3 ont été testées sur la plupart des échantillons cliniques et des souches prototypes, pour leur capacité de typage spécifique de chacun des groupes de virus, respectivement dans un test d'hybridation moléculaire et dans un test immunoenzymatique. La spécificité du test a été préalablement établie entre chacune des sondes et l'amplicon d'une souche prototype homologue ou hétérologue, à savoir les amplicons générés respectivement à partir de RSVA (Souche Long), RSVB (Souche 9320), PIV3 et le virus de Sendaï (Tableau 1).
En conséquence, un autre objet de l'invention concerne un polynucleotide d'une longueur d'au moins 12 nucleotides, caractérisé en ce qu'il est capable de s'hybrider spécifiquement, dans des conditions de forte stringence, à un premier acide nucléique codant pour la grande sous-unité (L) de la polymerase d'un virus de la famille des Paramyxoviridae d'un type donné, choisi parmi les virus de type RSVA, RSVB ou PIV3 ou à un second acide nucléique dont la séquence est complémentaire du premier acide nucléique. Selon un mode de réalisation préféré des sondes oligonucléotidiques spécifiques d'un type donné de paramyxovirus selon l'invention, ces dernières sont choisies à partir d'une région du gène L d'un type de paramyxovirus donné qui est très conservée au sein des différents isolats du type de paramyxovirus respiratoire avec l'acide nucléique duquel ladite sonde doit s'hybrider spécifiquement et assez divergente entre les paramyxovirus respiratoires de types différents.
Avantageusement, les sondes hybridant spécifiquement respectivement avec des paramyxovirus d'un type différent présenteront au maximum 77 % d'identité entre elles du point de vue de leur séquence nucleotidique, de telle manière à éviter toute réaction d'hybridation croisée dans les conditions d'hybridation stringente définies ci-avant dans le présent mémoire descriptif.
Plus spécifiquement, le polynucleotide ci-dessus est caractérisé en ce qu'il s'hybride avec l'acide nucléique codant pour la région III de la grande sous-unité (L) de la polymerase d'un virus de la famille des Paramyxoviridae d'un type donné ou de l'acide nucléique de séquence complémentaire.
Un tel polynucleotide hybride spécifiquement avec l'acide nucléique correspondant d'un type donné de virus PIV, notamment PIV1, PIV2 et PIV3, ou RSV, et plus particulièrement d'un type donné choisi parmi les paramyxovirus PIV3, RSVA ou RSVB. Avantageusement, la séquence d'une sonde spécifique selon l'invention est définie de telle manière que cette sonde hybride, dans des conditions de forte stringence, avec un amplicon généré dans une réaction d'amplification d'acide nucléique cible, à l'aide d'un couple d'amorces consensus ou générique selon l'invention, ou encore hybride avec l'amplicon obtenu en faisant agir l'un des couples d'amorces génériques décrits par Tordo et al. en 1995.
De telles sondes oligonucléotidiques spécifiques selon la présente invention sont, par exemple, les oligonucléotides suivants : a) sondes spécifiques de RSVA : SEQ ID N° 10 : 5'-TACATTGTTAGGATCTACAGTATGATCTCCTATATAGGGG- 3' ;
SEQ ID N l :
5 '-2289-TACATTGTTAGGATCTACAGTATGATCTCCTATATAGGGG-2250-3 ' ; SEQ ID N° 12 : 5'-2216-TGAGGAATAGTTAAATGTAACCAGGAAAAT-2187- 3' ; SEQ ID N° 13 : 5,-2424-AATTAAAGCAGTAATT-2409-31 ; b) sondes spécifiques de RSVB :
SEQ ID N° 14 : 5'-AACTTCATTAAGATTGACAACATGATCCTTTATGAAAGGA- 3' •
SEQ ID N° 2 : 5'-AACTTCATTAAGATTGACAACATGATCCTTTATGAAAGGA- 3' ;
SEQ ID N° 15 : 5'-AGAGGTATTGTTAAATGCAACCAAGAGAAC-3' ; SEQ ID N° 16 : 5'-TATCAGAGCTGTGATG-3' ;
c) sondes spécifiques de PIV3 : SEQ ID N° 17 : 5'-GAGGGTGTAACCAATTAAACAATTTATTTAATCCAAATA- 3' •
SEQ ID N018 :
5'-2095-GAGGGTGTAACCAATTAAACAATTTATTTAATCCAAATAT-2056-3' (définie à partir de la séquence de la souche Hu PIV3, souche JS).
Les polynucléotides ci-dessus peuvent être marqués par un composé radioactif ou par un composé non radioactif.
Dans un mode de réalisation avantageux ces polynucléotides ci-dessus décrits, ces derniers sont immobilisés sur un support, de manière covalente ou non-covalente. Un autre objet de la présente invention consiste en des oligonucléotides comprenant une séquence de type consensus, capables de s'hybrider, dans des conditions fortement stringentes, à un acide nucléique provenant indifféremment d'un paramyxovirus de type RSVA, RSVB ou PIV3, à l'exclusion de tout autre paramyxovirus. Ces sondes oligonucléotidiques sont utiles notamment comme témoins internes dans une réaction de détection d'acides nucléiques cibles provenant de paramyxovirus dans un échantillon biologique. En particulier, ces sondes oligonucléotidiques consensus ou génériques permettent de quantifier l'acide nucléique cible et de corroborer ainsi les données quantitatives apportées par la réaction d'hybridation d'une sonde spécifique selon l'invention. Dans l'hypothèse où un échantillon biologique à tester contiendrait un isolât de paramyxovirus de type RSVA, RSVB ou PIV3 dont la séquence génomique aurait considérablement varié dans les régions dans lesquelles les séquences des sondes spécifiques selon l'invention ont été définies, ou encore dans l'hypothèse où l'échantillon biologique contiendrait plusieurs types de paramyxovirus parmi les types RSVA, RSVB ou PIV3, l'utilisation de la sonde consensus ou générique selon l'invention permet à l'expérimentateur d'observer une différence dans l'intensité de marquage du matériel génétique provenant de l'échantillon biologique due à l'hybridation de la sonde spécifique et de la sonde générique.
De telles sondes consensus ou génériques, telles que définies ci-dessus, sont choisies dans des régions du gène L pour lesquelles les séquences nucléotidiques des différents types de paramyxovius respiratoires, en particulier RSVA, RSVB et PIV3, sont très conservées.
De manière particulièrement avantageuse, de telles sondes consensus ou génériques seront sélectionnées de telle manière que la région du gène L avec laquelle elles hybrident présente au sein des différents paramyxovirus respiratoires, et tout particulièrement RSVA, RSVB et PIV3, une séquence nucleotidique présentant un degré d'identité d'au moins 80 % entre les différents types de virus.
Par ailleurs, et de manière tout a fait préférée, la sonde détection sélectionnée aura une séquence présentant un degré d'identité avec les séquences cibles (ou avec les séquences consensus représentées à la Figure 2) des différents paramyxovirus respiratoires d'au moins 85 %, et avantageusement d'au moins 88 %.
Des sondes consensus ou génériques selon l'invention sont, par exemple, les oligonucléotides comprenant au moins 12 nucleotides consécutifs de l'un des enchaînements nucléotidiques suivants :
SEQ ID N° 19 : 5'-GGIGGTATAGAAGGCTGGTGTCAAAAATTATGGAC-3' SEQ ID N° 20 : 5 '-GGGGGTAT AGAAGGCTGGTGTC AAAAAÇTATGGAC-3 ' , étant entendu que les oligonucléotides de séquence exactement complémentaire des séquences ci-dessus constituent également des sondes consensus ou génériques selon la présente invention ; il s'agit des oligonucléotides comprenant les enchaînements de séquences suivants : SEQ ID N° 21 : 5'-GTCCATAATTTTTGACACCAGCCTTCTATACCACC-3'
SEQ ID N° 22 : 5'-GTCCATAGTTTTTGACACCAGCCTTCTATACCÇCC-3'.
Les oligonucléotides de séquences SEQ ID N° 19 à 22 hybrident avec la séquence comprise entre le nucléotide situé en position 2357 et le nucléotide situé en position 2323 du gène L de RSVA, et avec la séquence comprise entre le nucléotide situé en position 2166 et le nucléotide situé en position 2132 du gène L de PIV3. Les positions de nucleotides mentionnées ci-avant sont toutes calculées en prenant comme repère commun la base A du codon ATG de début de traduction du gène L du virus correspondant, numérotée n° 1.
Il va sans dire que le degré de complémentarité des sondes génériques selon l'invention est suceptible d'être accru par la synthèse de sondes dégénérées. C'est le cas notamment pour les séquences SEQ ED N° 19 à 22 où les bases dégénérées sont soulignées.
Les sondes consensus ou génériques de séquences SEQ ID N° 19 à 22 hybrident avec une région du gène L codant pour le motif B de la grande sous-unité de l'ARN polymerase. En effet, le motif B a été déterminé par les inventeurs comme étant une région d'acides aminés particulièrement conservée entre les différentes séquences d'acides aminés caractérisant le gène L des paramyxovirus de type RSVA, RSVB et PIV3. De manière inattendue, la grande conservation des séquences d'acides aminés du motif B de la grande sous-unité de l'ARN polymerase s'est révélée correspondre à une région du gène où les séquences nucléotidiques correspondantes présentent un très fort degré d'identité, comme illustré ci-après :
ConsRSVB 5 ' -GGTGGTATTGAGGGCTGGTGTCAAAAACTGTGGAC- 3 ' ******** ** ** ************** ***** 31/35 = 88,5 % de similarité
ConsRSVA 5' -2323-GGTGGTATCGAAGGGTGGTGTCAAAAACTATGGAC-2357- 3'
** ***** ***** * ********* *******
29/35 = 82,9 % de similarité
ConsPIV3 5' -2132-GGGGGTATAGAAGGATTTTGTCAAAAATTATGGAC-2166- 3'
ConsRSVB, ConsRSVA et ConsPIV3 représentant la partie correspondante des séquences consensus de chacun des types viraux établies par les inventeurs et représentées à la Figure 2.
Les sondes oligonucléotidiques de séquences SEQ ID N° 19 et SEQ ID N° 20 ont été conçues à partir des comparaisons de séquences ci-dessus et leur degré d'identité avec les séquences consensus de chacun des types viraux PIV3, RSVA et RSVB est représenté ci-après, les astérisques représentant les bases conservées :
** *********** * ***************** i 3 88 5% ******** ***** ************ ******* RSVA 91 5%
******** ** *************** * ***** RSVB 88 5% SEQID N°19 GGTGGTATAGAAGGCTGGTGTCAAAAATTATGGAC
************** * ********* ******* p 3 88 5% ** ***** ***** ******************** RS A 91 5%
** ***** ** ***************** ***** RSVB 88 5% SEQID N°20 GGGGGTATAGAAGGCTGGTGTCAAAAACTATGGAC Les oligonucléotides non marqués peuvent être utilisés directement comme sondes, cependant les séquences sont généralement marquées par un élément radioactif
( 32 P, 35 S, 3 H, 125 I) ou par une molécule non radioactive (biotine, acétylaminofluorène, digoxigénine, 5-bromo-désoxyuridine, fluorescéine) pour obtenir des sondes utilisables pour de nombreuses applications.
De manière avantageuse, les sondes spécifiques ou les sondes génériques selon l'invention sont mises en contact avec un acide nucléique cible qui aura été préalablement amplifié.
Des exemples de marquages non radioactifs de sondes sont décrits, par exemple, dans le brevet français N° 78.10975 ou par Urdea et al. ou par Sanchez-Pescador et al. en 1988.
Dans ce dernier cas, on pourra aussi utiliser l'une des méthodes de marquage décrites dans les brevets FR 2 422 956 et FR 2 518 755. La technique d'hybridation peut être réalisée de manières diverses (Matthews et al., 1988). La méthode la plus générale consiste à immobiliser l'acide nucléique extrait de l'échantillon biologique (salive ou cellules en cultures inoculées avec de la salive d'un patient) sur un support (nitrocellulose, Nylon™, polystyrène, ...) et à incuber, dans des conditions bien définies, l'acide nucléique cible immobilisé avec la sonde. Après l'hybridation, l'excès de sonde est éliminé et les molécules hybrides formées sont détectées par la méthode appropriée (mesure de la radioactivité, de la fluorescence ou de l'activité enzymatique liée à la sonde).
Avantageusement, les sondes nucléotidiques marquées selon l'invention peuvent avoir une structure telle qu'elles rendent possible une amplification du signal radioactif ou non radioactif. Un système d'amplification répondant à la définition ci-dessus comprendra des sondes de détection sous la forme d'un ADN ramifié, branché (« branched DNA ») telles que celles décrites par Urdea et al. en 1991. Selon cette technique, on utilisera avantageusement plusieurs types de sondes notamment une sonde de capture, afin d'immobiliser l'ADN ou l'ARN cible sur un support, et une sonde de détection. La sonde de détection lie un ADN « branché » présentant une structure ramifiée. L'ADN branché, à son tour, est capable de fixer des sondes oligonucléotidiques qui sont elles-mêmes couplées à des molécules de phosphatase alcaline. Puis l'activité de cette enzyme est mise en évidence grâce à un substrat chimioluminescent, par exemple un dérivé du dioxétane-phosphate.
Selon un autre mode avantageux de mise en oeuvre des sondes nucléiques selon l'invention, ces dernières peuvent être utilisées comme sondes de capture. Dans ce cas, une sonde, dite « sonde de capture », est immobilisée sur un support et sert à capturer par hybridation spécifique l'acide nucléique cible obtenu à partir de l'échantillon biologique à tester. Si nécessaire, le support solide est séparé de l'échantillon et le duplex formé entre la sonde de capture et l'acide nucléique cible est ensuite détecté grâce à une seconde sonde, dite « sonde de détection », marquée par un élément facilement détectable.
Les fragments oligonucléotidiques peuvent être obtenus à partir des séquences selon l'invention, par coupure avec des enzymes de restriction comme décrit par
Sambrook et al. en 1989, ou par synthèse chimique selon les méthodes classiques, par exemple selon la méthode décrite dans le brevet européen N° EP-0 305 929 (Millipore
Corporation) ou encore par d'autres procédés.
Un mode de préparation approprié des acides nucléiques de l'invention comportant au maximum 200 nucleotides (ou 200 pb s'il s'agit d'acides nucléiques bicaténaires) comprend les étapes suivantes : a) la synthèse d'ADN en utilisant la méthode automatisée des béta- cyanéthylphosphoramidite décrite par Sonveaux en 1986, b) le clonage des acides nucléiques ainsi obtenus dans un vecteur approprié et la récupération de l'acide nucléique par hybridation avec une sonde appropriée.
Un autre mode de préparation, par voie chimique, d'acides nucléiques selon l'invention de longueur supérieure à 200 nucleotides (ou 200 pb lorsqu'il s'agit d'acides nucléiques bicaténaires) comprend les étapes suivantes : a) l'assemblage d'oligonucléotides synthétisés chimiquement, pourvus à leur extrémité de sites de restrictions différents, dont les séquences sont compatibles avec l'enchaînement en acides aminés du polypeptide naturel selon le principe décrit par Urdea et al. en 1983, b) le clonage des acides nucléiques ainsi obtenus dans un vecteur approprié et la récupération de l'acide nucléique recherché par hybridation avec une sonde appropriée.
Les sondes oligonucléotidiques selon l'invention peuvent être mises en oeuvre au sein d'un dispositif de détection comprenant une banque matricielle d'oligonucléotides. Un exemple de réalisation d'une telle banque matricielle peut consister en une matrice d'oligonuléotides sondes fixés sur un support, chacune des sondes de l'arrangement matriciel étant ainsi complémentaire d'une séquence distincte de l'ADN ou l'ARN cible à détecter et chaque sonde de séquence connue étant fixée en une position prédéterminée du support. La séquence cible à détecter peut être avantageusement marquée radioactivement ou non radioactivement. Lorsque la séquence cible marquée est mise en contact avec le dispositif matriciel, celle-ci forme des hybrides avec les sondes de séquences complémentaires. Un traitement à la nucléase, suivi d'un lavage, permet d'éliminer les hybrides sondes-séquence cible qui ne sont pas parfaitement complémentaires. Du fait de la connaissance précise de la séquence d'une sonde à une position déterminée de la matrice, il est alors possible de déduire la séquence nucleotidique de la séquence d'ADN ou d'ARN cible.
Une alternative à l'utilisation d'une séquence cible marquée peut consister en l'utilisation d'un support permettant une détection « bioélectronique » de l'hybridation de la séquence cible sur les sondes du support matrice, lorsque ledit support est constitué ou comprend un matériau capable d'agir, par exemple, en tant que donneur d'électrons aux positions de la matrice auxquelles un hybride a été formé. Un tel matériau donneur d'électrons est par exemple de l'or. La détection de la séquence nucleotidique de l'ADN ou ARN cible est alors déterminée par un dispositif électronique. Un exemple de réalisation d'un biocapteur, tel que défini ci-dessus, est décrit dans la demande de brevet européen N° EP-0 721 016 au nom de Affymax technologies N.V. ou encore dans le brevet américain N° US 5,202,231 au nom de Drmanac.
L'invention a donc pour objet un procédé pour la détection spécifique de la présence d'un paramyxovirus appartenant au type RSVA, RSVB ou PIV3 dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) mise en contact d'une sonde oligonucléotidique selon l'invention, spécifique de RSVA, RSVB ou PIV3, ou d'un mélange de sondes selon l'invention dont chaque sonde est spécifique d'un paramyxovirus choisi parmi RSVA, RSVB et PIV3, avec un échantillon biologique, l'acide nucléique contenu dans l'échantillon biologique ayant, le cas échéant, préalablement été rendu accessible à l'hybridation, dans des conditions permettant l'hybridation du polynucleotide à l'acide nucléique d'un paramyxovirus de type RSVA, RSVB ou PIV3 ; b) détection de l'hybride formé entre le polynucleotide et l'acide nucléique contenu dans l'échantillon biologique. Un autre but de la présente invention consiste en un procédé pour la détection spécifique de la présence d'un paramyxovirus appartenant au type RSVA, RSVB ou PIV3 dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) mise en contact d'une première sonde oligonucléotidique selon l'invention, spécifique de RSVA, RSVB ou PIV3, ou d'un mélange de sondes selon l'invention dont chaque sonde est spécifique d'un paramyxovirus choisi parmi RSVA, RSVB et PIV3, immobilisée sur un support, avec un échantillon biologique, l'acide nucléique de l'échantillon ayant, le cas échéant, préalablement été rendu accessible à l'hybridation, dans des conditions permettant l'hybridation du polynucleotide à l'acide nucléique d'un paramyxovirus de type RSVA, RSVB ou PIV3 ; b) mise en contact de l'hybride formé entre la première sonde ou le mélange des premières sondes immobilisées sur un support et l'acide nucléique contenu dans l'échantillon biologique, le cas échéant après élimination de l'acide nucléique de l'échantillon biologique n'ayant pas hybride avec le polynucleotide, avec une seconde sonde oligonucléotidique selon l'invention, spécifique de RSVA, RSVB ou PIV3 ou un mélange de secondes sondes selon l'invention dont chaque sonde est spécifique d'un paramyxovirus choisi parmi RSVA, RSVB et PIV3, étant entendu que ladite seconde sonde oligonucléotidique possède une séquence ne recouvrant pas la séquence de la première sonde oligonucléotidique de l'étape a). Un mode particulier de réalisation des procédés de détection de RSVA, RSVB et
PIV3 ci-dessus est caractérisé en ce que, préalablement à l'étape a), l'ADN de l'échantillon biologique, ou l'ADNc obtenu par transcription inverse de l'ARN de l'échantillon biologique, est amplifié à l'aide d'un couple d'amorces.
Dans un mode de réalisation préférentiel des procédés de détection ci-dessus, le couple d'amorces mis en oeuvre prélablement à l'étape a) n'est pas spécifique d'un paramyxovirus d'un type donné. Ce couple d'amorces est au contraire capable d'amplifier l'acide nucléique correspondant de plusieurs types de paramyxovirus, en particulier à la fois RSVA, RSVB et PIV3. Alternativement, ledit couple d'amorces est capable d'amplifier un acide nucléique d'un virus de type RSVA et RSVB ou encore un acide nucléique d'un virus de type RSVA et PIV3.
De manière avantageuse les couples d'amorces suivants sont mis en oeuvre : a) couple d'amorces pour l'amplification de l'acide nucléique à la fois de RSVA et de RSVB :
- PI (SEQ ID N° 7) 5'-ACAACAGATCTCAGCAAAT-3' ; - P2 (SEQ ID N° 8) 5'-CTATTGCTTGATTGTCACC-3' ; b) couple d'amorces pour l'amplification de l'acide nucléique de RSVA et PIV3 :
- P1 (SEQ ID N° 7) 5'-ACAACAGATCTCAGCAAAT-3' ;
- P3 (SEQ ID N° 9) 5'-CTATTGCTTGATTGTCTC-3'. La présente invention a encore pour objet une trousse ou nécessaire pour la détection spécifique de la présence d'un paramyxovirus appartenant au type RSVA,
RSVB ou PIV3 dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les éléments suivants : a) une sonde oligonucléotidique selon l'invention, spécifique d'un paramyxovirus d'un type donné choisi parmi RSVA, RSVB et PIV3 ou un mélange de sondes selon l'invention dont chaque sonde est spécifique d'un paramyxovirus choisi parmi RSVA,
RSVB et PIV3 ; b) les réactifs nécessaires à la mise en oeuvre d'une réaction d'hybridation ; c) le cas échéant, un couple d'amorces non spécifique d'un type de paramyxovirus donné, choisi parmi :
- un couple d'amorces permettant l'amplification d'un acide nucléique d'un virus de type RSVA, RSVB et PIV3 ;
- un couple d'amorces permettant l'amplification d'un acide nucléique d'un virus de type RSVA et RSVB ;
- un couple d'amorces permettant l'amplification d'un acide nucléique d'un virus de type RSVA et PIV3 ; ou un mélange d'un ou plusieurs de ces trois couples d'amorces, ainsi que les réactifs nécessaires à l'amplification d'un acide nucléique. L'invention vise aussi une trousse ou nécessaire pour la détection spécifique de la présence d'un paramyxovirus appartenant au type RSVA, RSVB ou PIV3 dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les éléments suivants : a) un polynucleotide, dit polynucleotide de capture, consistant en une première sonde oligonucléotidique selon l'invention, spécifique d'un paramyxovirus d'un type donné choisi parmi RSVA, RSVB et PIV3 et immobilisée sur un support, de manière covalente ou non-covalente ; alternativement, un mélange de sondes selon l'invention dont chaque sonde est spécifique d'un paramyxovirus choisi parmi RSVA, RSVB et PIV3 ; b) un polynucleotide, dit polynucleotide de révélation, consistant en une seconde sonde oligonucléotidique selon l'invention, spécifique d'un paramyxovirus d'un type donné choisi parmi RSVA, RSVB et PIV3, non immobilisée sur un support et, le cas échéant marquée radioactivement ou non radioactivement, étant entendu que ladite seconde sonde oligonucléotidique possède une séquence ne recouvrant pas la séquence de la première sonde oligonucléotidique de l'étape a); Alternativement, un mélange de sondes de révélation selon l'invention dont chaque sonde est spécifique d'un paramyxovirus choisi parmi RSVA, RSVB et PIV3 ; c) le cas échéant, un couple d'amorces non spécifique d'un type de paramyxovirus donné, choisi parmi : - un couple d'amorces permettant l'amplification d'un acide nucléique d'un virus de type RSVA, RSVB et PIV3 ;
- un couple d'amorces permettant l'amplification d'un acide nucléique d'un virus de type RSVA et RSVB ;
- un couple d'amorces permettant l'amplification d'un acide nucléique d'un virus de type RSVA et PI V3 ; ou un mélange d'un ou plusieurs de ces trois couples d'amorces, ainsi que les réactifs nécessaires à l'amplification d'un acide nucléique.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaissent dans les exemples et les figures suivants, sans pour autant limiter la portée de l'invention à leur mise en oeuvre particulière :
FIGURES
Figure 1 : Séquence consensus déduite de l'alignement des motifs fonctionnels A et C du gène L des virus RSVA, PIV3, de Sendaï, PIV2, de la rougeole (MEAS), des oreillons (MUMP), virus simien 5 (SV5) et de la maladie de Newcastle (NDV). Ligne supérieure : séquence d'acides aminés des motifs (majuscules : résidus conservés ; minuscules : résidus variables). Les séquences nucléotidiques correspondantes sont alignées en prenant comme référence la séquence consensus. Un tiret correspond à une base identique à la base de la séquence consensus (CONS) située à la même position. Les bases indiquées pour chacune des séquences correspondant à un type viral particulier sont les bases différant par rapport à la base correspondante de la séquence consensus. La position de l'extrémité 5' (à gauche) et de l'extrémité 5' (à droite) de chaque séquence nucleotidique est donnée en prenant comme référence la première base du codon d'initiation de la séquence codant pour la protéine L de chaque type viral (]ATG). La structure de la sonde P3 est donnée en prenant comme référence la séquence de la sonde P2.
Figure 2 : Alignement multiple des séquences nucléotidiques de la région amplifiée par le jeu d'amorces P1/P2 (ou P1/P3) à partir des isolats cliniques et des souches prototypes de RSVA, RSVB et PIV3. Les séquences sont comparées par rapport à une séquence consensus de RSV (ConsRSV) ou par rapport à une séquence consensus de PIV3 (ConsPIV3). La position des amorces PI et P2 est indiquée respectivement du côté 5' et du côté 3' de l'alignement de séquences. La fenêtre d'une longueur de 260 nucleotides utilisée pour l'analyse phylogénétique est délimitée par les deux lignes verticales. Les séquences correspondant aux sondes ou aux sites de coupure des enzymes de restriction Avall, BglII et PvuII sont soulignées. Les tirets représentent les nucleotides conservés par rapport aux séquences consensus. Les points représentent des parties d'une région qui n'ont pas été séquencées. Les marques astérisques représentent les identités de nucleotides entre les deux séquences consensus. La marque (.) représente le gap de trois nucleotides dans les séquences de PIV3.
Figure 3 : Arbre phylogénétique des isolats cliniques et des couches prototypes de RSVA, RSVB et PIV3. L'arbre est calculé en utilisant une fenêtre d'une longueur de 260 nucleotides en utilisant la méthode du plus proche voisin («Neighbour Joining »), comme décrit dans la rubrique Matériels et Méthodes. La longueur des lignes horizontales reflète la distance génétique entre plusieurs groupes. Les lignes verticales ont été représentées par simple souci de clarté, celles-ci n'apportant pas d'information supplémentaire.
Figure 4 : Carte du plasmide préparé à partir du vecteur pUC18 et contenant un insert de séquence SEQ ID N° 1 (RSVB) au niveau du site Smal. La boîte représente le niveau d'insertion de la séquence SEQ ID N° 1.
Figure 5 : Représentation du degré de conservation en acides aminés de la grande sous- unité (L) de la polymerase, après alignement des séquences d'acides aminés des virus suivants : PIV2, SV5, Mumps, ndv, Measles, Sendaï, PIV3 et RSVA. Plus le degré de conservation entre les différentes séquences est élevé, plus l'indice de similarité (en ordonnées) sera élevé. En abscisse : numérotation des aminoacides des séquences alignées, l'acide aminé N°l correspondant à l'acide aminé de l'extrémité N-terminale de la grande sous-unité de la polymerase.
Figure 6 : Alignement des séquences d'acides aminés de la grande sous-unité (L) de la polymerase de différents paramyxovirus respiratoires. Ligne supérieure : identification des domaines I à V (définis initialement par Poch et al., 1990). Ligne inférieure : les astérisques marquent les positions d'acides aminés de parfaite identité entre les séquences ; les points marquent les positions de forte identité entre les séquences.
Figure 7 : Alignement des séquences nucléotidiques codant pour les domaines I (1) à V (5) de la grande sous-unité de la polymerase. Ligne située entre les séquences de PIV3 et
RSVA : les symboles « + » marquent les positions pour lesquelles il y a identité entre les séquences de PIV3 et les séquences de RSVA. Les régions contenant la plus forte identité sont les régions préférentielles au sein desquelles ont été définis les couples d'amorces selon l'invention. Ligne inférieure : indication des acides aminés correspondants lorque ceux-ci sont fortement conservés (cf. Figure 6). La séquence de
RSVA est numérotée et sert de point de référence commun pour la numérotation des séquences selon l'invention, étant entendu que la convention suivante est adoptée : le nucléotide en position 1 correspond à la base A du codon ATG du gène L du virus de type RSVA, souche RSVA S2 ts 1C, accessible notamment sur la base de données Genbank sous le numéro RSU39661.
Matériels et méthodes
A. Isolement et identification des souches de virus par immunofluorescence (IF A) et Technique d'isolement viral (VIT).
Les souches de références RSVA (Souche Long) et RSVB (Souche 9320) ont été obtenues auprès de l'American Type Culture Collection sous les numéros respectifs ATCC VR-26 et ATCC VR-955. Les souches de références PIV2 et PIV3 ont été obtenues auprès de la société Diagnostics Pasteur (Marnes-la Coquette, France) et les souches du virus de Sendaï et du virus de la maladie de Newcastle (NDV) ont été obtenues auprès de M. le Professeur Lebon (Hôpital Saint- Vincent de Paul, Paris). Cinquante et un isolats sauvages humains ont été isolés à partir d'aspirats nasaux d'enfants hospitalisés dans le service pédiatrique de l'hôpital universitaire de Caen, France. Il s'agit des isolats de RSVA (n=14), RSVB (n=13), PIV1 (n=4), PIV2 (n=3), Virus influenza de type A (n=l) et B (n=l). Les isolats des virus de la rougeole et des oreillons (Freymuth et al., 1991).
261 aspirats nasaux provenant d'enfants hospitalisés au sein de l'Unité Pédiatrique de l'Hôpital Universitaire de Caen ont été recueillis durant la période allant d'octobre 1995 à mars 1996, dans un volume de 5 ml du milieu de transport décrit ci- dessous. Les aspirats nasaux sont remis en suspension dans 5 ml de milieu de culture MEM (Eagle's Minimum Essential Médium, Sigma Chemicals, Saint-Louis, Missouri, USA ; tampon Hepès, Eurobio, France ; albumine bovine ; pénicilline ; gentamicine) et conservés à - 70°C. Pour les expériences décrites dans les Exemples ci-après, 0,2 ml des spécimens conservés comme décrits ci-dessus (souches prototypes et aspirats nasaux) sont inoculés sur différentes lignées cellulaires en culture. Pour l'isolement des virus de type RSV, on réalise des cultures de la lignée de fibroblastes pulmonaires embryonnaires humains MRC-5 (ATCC N° CCL 171) dans des flacons de culture de 25 cm2. Pour l'isolement des virus PIV, ainsi que des virus de la rougeole ou des oreillons, des cultures de la lignée NCI-H292 (ATCC N° CRL 1848) de cellules muco-épidermoïdes pulmonaires humaines sont réalisées dans des microplaques de 48 puits pour cultures de tissu. Des cultures de cellules MDCK (Madin-Darby Canine Kidney, ATCC N° CCL34) sont effectuées pour l'isolement des virus influenza. Lorsque les cellules présentent un effet cytopathogène (lignée MRC-5), ou après une période d'incubation de 5 jours (cellules NCI-H292 et MDCK), ces cellules sont recueillies par grattage du support de culture puis centrifugation. Le culot cellulaire est remis en suspension, puis déposé sur une lame de microscope et fixé par l'acétone. Le virus est ensuite identifié par immunofluorescence (IF A). Les différents anticorps monoclonaux mis en ouvre dans les expériences d'immunofluorescence sont décrits ci-après. Les anticorps utilisés pour l'identification des virus RSV des sous-groupes A et B sont produits respectivement par les clones d'hybridome B90 et 7858 (Freymuth et al., 1991) et mis en oeuvre comme décrit par Freymuth et al., 1982. Les anticorps monoclonaux utilisés pour identifier les virus PIV et les virus influenza sont commercialisés par Imagen (Kit Imagen™, Virus Respiratoire Syncitial® Dako ; Kit Imagen™ Virus Parainfluenza® Dako) et les anticorps monoclonaux ayant permis l'identification des virus de la rougeole et des oreillons sont commercialisés par Argène Biosoft, France.
B. Extraction de l'acide nucléique
Après décongélation, lOOμl des échantillons conservés à - 70°C sont soumis à une digestion par la méthode classique à la protéinase K. Selon cette méthode, la digestion est réalisée par addition de 2μl de protéinase K (10 mg/ml), 10 μl de SDS à
10 %, 1.2 μl de tampon Tris-HCl 1M. (pH 7,6) et en incubant les échantillons ainsi traités à 56°C pendant 1 h. Les acides nucléiques sont extraits à l'aide d'une solution de phénol: chloroforme (1 :1) et de chloroforme:isoamylalcool (24:1). Les acides nucléiques totaux sont alors précipités dans de l'éthanol à 66 % et 0,3 M d'acétate de sodium à pH 5,6 à - 20°C pendant une nuit, recueillis par centrifugation, soumis à un lavage dans de l'éthanol à 70 %, puis remis en suspension dans 20μl de H2O contenant 20 U d'inhibiteur de RNAase (Boehringer Mannheim Biochemica).
C. Amorces
Du fait que les virus d'intérêt RSV et PIV sont génétiquement distants, des amorces ont été définies par alignement de séquence de la région la plus conservée du génome, c'est-à-dire les motifs A et C du gène de L polymerase (Tordo et al., 1988 ; Tordo et al., 1992).
En particulier, une amorce aller (+) PI et deux amorces retour (-) P2 et P3 ont été synthétisées selon la technique des phosphoramidites (Sonveaux et al., 1986 ; Urdea et al., 1983 ; Caruthers et al.), dont les séquences nucléotidiques sont présentées ci- après :
- P 1 5 '-AC AACAGATCTCAGC AAAT-3 ' ( 19-mer) ;
- P2 5 '-CTATTGCTTGATTGTCACC-3 ' ( 19-mer) ; - P3 5'-CTATTGCTTGATTGTCTC-3' (19-mer).
La position de chacune des amorces sur le génome des virus RSVA, PIV3, Sendaï (SEND), PIV2, virus de la rougeole (MEAS), virus des oreillons (MUMP), virus simien SV5 et le virus de la maladie de Newcastle (NDV) est représentée sur la Figure 1.
Les oligonucléotides, sondes ou amorces selon l'invention, ont été synthétisés selon la méthode de Sonveaux et al., 1986.
D. Transcription inverse et réaction PCR
Pour chacun des échantillons à tester, chacun des couples d'amorces P1/P2 et P1/P3 ont été mis en oeuvre séparément dans une réaction de type RT-PCR. Les deux amorces de chaque couple d'amorces sont donc présentes durant les étapes de transcription inverse et d'amplification PCR. La synthèse d'ADNc est réalisée à 42°C pendant 60 min dans un volume reactionnel de 25 μl de tampon-RT (Gibco Brl, USA) contenant 5 μl d'extrait d'acide nucléiques, 200 U de transcriptase inverse M-MLV (Gibco Brl, USA), 20 U d'inhibiteur de Rnase (RNAsine™, Promega, France), 40 pmol de chacune des amorces, ImM de chacun des dATP, dCTP, dGTP, dTTP, 10 mM DTT (Gibco Brl, USA). Pour l'étape d'amplification PCR, le volume reactionnel est ajusté à 100 μl à l'aide d'un tampon PCR (Perkin Elmer Cetus, USA), 1,5 mM MgCl2 et 2,5 U de polymerase Taq (Perkin Elmer Cetus, USA). L'amplification est réalisée à l'aide d'un appareil Omnigene themocycler (Hybaid) de la manière suivante : on effectue 30 cycles d'amplification dont chaque cycle comprend une étape de dénaturation de 30 sec à 94°C, une étape d'hybridation des amorces de 1,5 min à 45°C et une étape d'extension d'amorce de 1,5 min à 72°C. Les produits résultant de l'amplification sont ensuite analysés par électrophorèse en gel d'agarose à 1,2 %. Les fragments séparés par électrophorèse sont alors colorés par le bromure d'ethidium (BET) et visualisés par exposition du gel d' électrophorèse à un rayonnement ultra-violet.
E. Analyse et typage des séquences par polymorphisme de longueur des fragments de restriction (RFLP).
Des colonnes de type Microspin (Pharmacia, Uppsala, Suède) sont utilisées pour la purification des fragments amplifiés (amplicons) à partir des mélanges résultant de l'amplification par PCR. Le séquençage des amplicons est réalisé à l'aide d'une trousse de séquençage Delta Taq Cycle (Pharmacia, Uppsala, Suède) en suivant les indications du constructeur. Les fragments purifiés sont alors séquences selon la méthode de séquençage automatique utilisant la fluorescence Ref XXX (Pharmacia, Uppsala, Suède). L'alignement multiple des séquences est réalisé à l'aide du logiciel Clustal-W (Higgins, 1989). L'analyse phylogénétique des séquences alignées est réalisée selon la méthode « Neighbour Joining (NJ) ». La validité de l'arbre phylogénétique a été vérifiée par une technique dénommée « Bootstrapping » sur 100 répliques. Les arbres ont été construits à l'aide du logiciel Treetool (Version 1.0, Maciukenas). Des sites reconnus par les endonucléases de restriction Avall, BglII et PvuII ont été choisis après analyse de l'alignement multiple de séquences. Les produits d'amplification PCR (5 μl) sont soumis à l'action des endonucléases de restriction selon les instructions du fabricant (Bethesda Research Laboratories) et analysés par électrophorèse en gel d'agarose suivie d'une coloration par le bromure d'ethidium.
F. Hybridation et test immunoenzymatique (EIA).
Des sondes génomiques (brin moins) spécifiques internes aux produits d'amplification du gène L sont sélectionnées à partir des résultats de l'alignement multiple de séquences décrit ci-dessus. D'autres sondes ont été sélectionnées à partir de séquences accessibles sur la base de données Genbank. Ces sondes sont les suivantes : - Sonde RSVA :
5 '-2289-TACATTGTTAGGATCTACAGTATGATCTCCTATATAGGGG-2250-3 ' ;
- Sonde RSVB :
5 '-2289-AACTTCATTAAGATTGACAACATGATCCTTTATGAAAGGA-2250-3 ' ; - Sonde PIV3 :
5'-2095-GAGGGTGTAACCAATTAAACAATTTATTTAATCCAAATAT-2056-3'.
La position des nucleotides aux extrémités des sondes ci-dessus est donnée par référence au codon d'initiation de chaque protéine L (]ATG). Les sondes sont synthétisées selon les méthodes classiques puis biotinylées à leur extrémité 5'. Les sondes d'ADN simple brin sont immobilisées sur la surface d'une plaque de microtitration préalablement recouverte de streptavidine. Les produits résultant de l'amplification par PCR sont alors mis en présence des sondes immobilisées dans des conditions permettant leur hybridation à ces dernières, puis les hybrides formés sont visualisés par un test immunoenzymatique (commercialisé par Gen-ETI-K DEIA™, Sorin, France) réalisé selon les instructions du fabricant. La concentration optimale de chacune des sondes RSVA, RSVB et PIV3 est respectivement de 0, 1 ng/μl, 1 ng/μl et 0,5 ng/μl.
Exemples
Exemple 1 : Choix des amorces
Les inventeurs ont recherché des amorces capables d'amplifier deux types de virus distants génétiquement, à savoir les virus de type RSV et les virus de type PIV 3. En conséquence les amorces ont été choisies dans la région génomique la mieux conservée des Paramyxoviridae. Des comparaisons entre les séquences en acides aminés des protéines L des virus à ARN à brin négatif faites antérieurement avaient mis en évidence l'existence de 6 blocs de séquences fortement conservées, séparés par des régions variables. Le Bloc III, qui correspond au domaine catalytique pour la polymérisation, contient 4 à 5 motifs hautement conservés au sein des polymérases ARN dépendantes (ARN polymérases et transcriptases inverses) (Poch et al., 1990 ; Tordo et al., 1992). Les séquences du Bloc III conservé de différents paramyxovirus, tels que RSVA, PIV3, Sendaï, PIV2, rougeole, oreillons, virus simien 5 (SV5) et virus de la maladie de Newcastle (NDV), ont tout d'abord été alignées. Les amorces ont été choisies au sien des motifs conservés A et C du Bloc III afin de détecter spécifiquement RSV et PIV3 (Figure 1). La séquence de chacune des amorces correspond à une séquence de type consensus qui a été définie de manière à assurer une complémentarité acceptable vis-à-vis des. séquences génomiques des paramyxovirus à détecter et/ou amplifier. Une amorce aller (brin +) unique a été construite de manière à ne contenir que deux bases consécutives non complémentaires des séquences génomiques des paramyxovirus RSVA et PIV3 à détecter et/ou amplifier, et au moins trois bases non complémentaires des autres séquences de paramyxovirus (Figure 1). Deux amorces retour (brin moins), les amorces P2 et P3, sont nécessaires, pour tenir compte de la variabilité des séquences entre PIV3 et RSVA. Les amorces P2 et P3 diffèrent par un nucléotide unique à la position 17 desdites amorces (c.à.d. en position -3 à partir du premier nucléotide incorporé). L'amorce P2 contient une base non complémentaire du génome de RSVA et deux bases non complémentaires du génome de PIV3. Inversement, l'amorce P3 contient un nucléotide non complémentaire du génome de PIV3 et deux nucélotides non complémentaires du génome de RSVA. Les deux amorces sont moins complémentaires des génomes des autres paramyxovirus, à l'exception du génome du virus de Sendaï murin (un nucléotide non complémentaire de P2, deux nucleotides non complémentaires de P3, comme pour RSVA). Selon les données de l'étude, les deux jeux d'amorces, P1/P2 et P1/P3, sont capables d'amplifier des segments d'ADN du gène L, d'une longueur de 355 pb pour RSVA et d'une longueur de 352 bp pour PIV3 et le virus de Sendaï. Les amorces ont été volontairement choisies pour hybrider avec une région du gène L situées aux extrémités d'une région variable de ce gène des paramyxovirus, ce qui a permis aux inventeurs de construire des sondes spécifiques de ces régions variables pour chaque type de paramyxovirus, ou de choisir des endonucléases de restriction ayant un site de coupure au sein de cette région variable afin de différencier les différents types de paramyxovirus par le profil des bandes d' électrophorèse dans des expériences de polymorphisme de longueur des fragments de restriction (RFLP).
Exemple 2 : Analyse des produits issus des isolats viraux amplifiés par PCR, par électrophorèse sur gel.
La spécificité des jeux d'amorces P1/P2 et P1/P3 a été déterminée sur des souches prototypes ainsi que sur une série de 51 isolats cliniques. Les résultats sont représentés sur le Tableau 1.
Un test d'immunofluorescence (IFA) a permis d'identifier ces isolats comme appartenant respectivement aux types suivants : RSVA (n=14), RSVB (n=13), PIV1 (n=4), PIV2 (n=3), PIV3 (n=13), virus des oreillons (n=l), virus de la rougeole (n=l), virus influenza A -H3N2- (n=l) et virus influenza B (n=l). Deux types de virus ont généré un amplicon de la taille attendue sur un gel d' électrophorèse d'agarose coloré par le BET, à la fois avec P1/P2 et P1/P3 : RSVA (la souche Long et les 14 isolats cliniques) ainsi que le virus e Sendaï. Pour le type RSVB, l'amplicon de taille attendue n'est observé qu'avec le jeu d'amorce P1/P2 (souche 9320 et pour 12 des 13 isolats cliniques). L'ADN de l'un des 13 isolats cliniques de RSVB (n° 9401891) est amplifié à la fois avec P1/P2 et P1/P3, c'est-à-dire comme l'ADN des virus RSVA et Sendaï. Les échantillons de virus de type PIV3 présentent un profil intermédiaire. La souche prototype et 6 (46 %) des 13 isolats cliniques de PIV3 ont un ADN amplifié par le jeu d'amorces P1/P2, tandis que tous les virus PIV3 de l'étude ont un ADN amplifié par le jeu d'amorces P1/P3. Un tel résultat est en accord avec le fait que l'amorce P3 présente une meilleure complémentarité que l'amorce P2 avec le génome de PIV3 (Figure 1). Pour les autres paramyxovirus (4 PIV1, 3 PIV2, 1 virus de la rougeole, 1 virus des oreillons) ou pour les orthomyxovirus (1 virus influenza A, 1 virus influenza B) ainsi que pour les extraits cellulaires non infectés utilisés comme témoins négatifs, aucune amplification n'a été observée, quel que soit le jeu d'amorces P1/P2 ou P1/P3 utilisé. La sensibilité du test RT-PCR a été déterminée en analysant des dilutions successives de dix fois des lysats de cultures de cellules MRC5 inoculées avec RSVA (souche Long) ou RSVB (souche 9320), à un titre de 103/ml et 104/ml TCID50. Les produits résultant de la réaction d'amplification sont visualisés à la fois sur un gel d'agarose pour une dilution des lysats cellulaires de RSVA et RSVB respectivement de 10" 1 et 10" 2 et par hybridation pour une dilution des lysats cellulaires de RSVA et RSVB respectivement de 10 2 et 10 3. La quantité d'ADN viral détecté par RT-PCR est d'environ 10 TCID50.
Exemple 3 : Analyse des séquences et phylogénie. Afin d'évaluer la variabilité entre les différents isolats et leur liaison avec les souches prototypes, on a réalisé une analyse des séquences des amplicons générés par l'amplification PCR à partir de 11 isolats cliniques de RSVA, 6 isolats cliniques de RSVB et 10 isolats de PIV3 (9 échantillons cliniques et la souche de l'Institut Pasteur PIV3 JS)), à l'aide d'une méthode automatisée. Cette méthode a permis de définir une séquence génomique consensus pour chacun des échantillons, qui correspond à un compromis entre les virus individuels de la population virale (quasi-espèces) et l'isolât considéré. Un alignement multiple de la séquence des amplicons est représenté sur la Figure 2, qui inclut également les séquences correspondantes des souches RSVA2 et PIV3JS accessibles dans les bases de données. La Figure 3 représente l'arbre phylogénétique calculé selon la méthode de « neighbour joining » en utilisant une fenêtre de calcul d'une longueur de 260 nucleotides (soulignée sur la Figure 2). Les virus RSVA, RSVB et PIV3 sont regroupés de manière distincte dans trois principales branches. Les groupes RSVA et RSVB sont assez proches (85 % de similarité dans la région considérée) et sont tous les deux distants du groupe PIV3 (43 % de similarité avec RSVA et RSVB dans la région considérée). Par ailleurs la variabilité au sein de chaque branche principale est très faible. Cette variabilité intrinsèque est plus importante au sein des groupes de RSV (1,53 % dans le groupe RSVA et 1,17 % dans le groupe RSVB) que dans le groupe de PIV3 (0,4 %). Il n'a pas été possible de regrouper de manière statistiquement significative les différents isolats au sein de chaque groupe, que ce soit au regard de la date ou de la localisation géographique de leur isolement. Dans le groupe de RSVA, la souche prototype A2 est regroupée avec les isolats cliniques. La même situation est observée pour la souche prototype JS de PIV3 mais la souche PIV3 de Pasteur est clairement distincte. Deux isolats cliniques RSVA (n° 9400961 et n° 9346219) et deux isolats cliniques RSVB (n° 9344256 et n° 9400215) ont été seulement partiellement séquences et ne figurent donc pas dans l'arbre phylogénétique de la Figure 2. Néanmoins, leur séquence partielle permet de les placer sans ambiguïté au sein de leurs groupes respectifs.
De manière surprenante, la séquence de deux isolats cliniques a permis de classer ces derniers dans des groupes différents des groupes dans lesquels ces isolats sont classés d'un point de vue immunologique par immunofluorescence (EFA). Il s'agit, d'une part, de l'isolât identifié comme appartenant au groupe RSVA dans le test d'immunofluorescence (isolât n° 9400504) et qui appartient pourtant sans équivoque au groupe RSVB, comme il résulte de l'analyse phylogénétique. Il s'agit, d'autre part, de l'isolât identifié comme appartenant au groupe RSVB dans le test d'immunofluorescence (isolât n° 9301891, non représenté sur la Figure 2) et qui appartient sans ambiguïté au groupe de RSVA si l'on considère l'analyse de sa séquence partielle.
Exemple 4 : Typage des virus par analyse du polymorphisme de longueur des fragments de restriction (RFLP). Afin de différencier les trois groupes de virus générant des amplicons de taille identique avec les jeux d'amorces selon l'invention, les inventeurs ont recherché sur les séquences des amplicons de chacun des trois groupes des sites de restrictions particuliers, très conservés au sein des trois groupes mais localisés à des positions différentes de la séquence des amplicons générés dans chacun des trois groupes. Sur la base des résultats d'alignement des séquences de la Figure 2, les sites de coupure par les endonucléases de restriction Avall, BglII et PvuII ont été retenus. Ces enzymes de restriction ont été utilisées pour une analyse systématique des isolats cliniques et des souches prototypes par RFLP (Tableau 1). Les enzymes Avall et PvuII coupent exclusivement les amplicons issus de l'ADN des virus RSV et PIV3. L'enzyme Avall coupe l'amplicon de 355 pb de RSV en deux fragments d'une longueur respective de 263 pb et 92 pb. L'enzyme PvuII coupe l'amplicon de 352 pb de PIV3 en deux fragments d'une longueur respective de 295 pb et 57 pb. La coupure par l'enzyme BglII permet de différencier entre les groupes RSVA et RSVB et ne coupe pas l'amplicon généré par PIV3 (à l'exception de l'amorce PI, rendant compte du fait qu'un fragment de 6 pb soit systématiquement éliminé de tous les amplicons). Tous les amplicons issus de RSVB sont clivés par BglII en deux fragments d'une longueur respective 283 pb et 66 pb. Par ailleurs, 79 % des isolats de RSVA (représentant 11 isolats cliniques) ne sont pas clivés par BglII, alors que, pour les 3 autres échantillons viraux (2 isolats cliniques et la souche prototype Long), l'amplicon de 355 pb est coupé en deux fragments d'une longueur respective de 177 pb et 172 pb.
En ce qui concerne les deux isolats pour lesquels les données d'immunofluorescence et de typage génétique ne sont pas en accord, on observe un profil de restriction qui permet de la classer conformément aux données d'analyse phylogénétique de leurs séquences. Ainsi, l'isolât n° 9400504 présente un profil RFLP de typa RSVB et l'isolât n° 9401981 présente un profil RFLP de type RSVA.
Les données d'analyse des profils de restriction RFLP permet de distinguer simplement les amplicons RSV et PIV sur la base de la présence exclusive respective des sites de restriction Avall (RSV) et PvuII (PIV). Afin de différencier, au sein du groupe RSV, les isolats appartenant respectivement au groupe RSVA ou RSVB, l'analyse de longueur du fragment obtenu par digestion avec l'enzyme BglII est nécessaire. L'enzyme BglII coupe l'amplicon issu des virus du groupe RSVB en deux fragments d'une longueur respective de 283 pb et 66 pb. L'analyse de la longueur des fragments issus de la coupure par BglII des amplicons issus des virus du groupe RSVA fait apparaître un certain polymorphisme, en accord avec leur hétérogénéité génétique (Figure 3) : la majorité des amplicons issus des virus RSVA (78 %) ne sont pas coupés par BGIII ; une faible proportion est coupée de manière distincte, générant des fragments dont les plus longs sont d'une longueur respective de 177 pb et 172 bp.
Exemple 5 : Typage des virus par hybridation spécifique et par test immunoenzymatique. Dans le but de mettre au point un outil de typage utilisable en diagnostic de routine dans les laboratoires d'analyse, les inventeurs ont recherché des sondes oligonucléotidiques dans des régions de l'amplicon spécifiques de chaque groupe de virus. Les sondes pour distinguer spécifiquement les virus des groupes RSVA et RSVB ont été sélectionnées dans la région située entre le nucléotide en position 159 et le nucléotide en position 200 de l'amplicon, c'est-à-dire dans l'une des régions dans lesquelles les séquences de RSVA et RSVB sont les plus divergentes (Figure 2). La sonde spécifique de PIV3 a été sélectionnée dans la région délimitée par le nucléotide en position 77 et le nucléotide en position 118 de l'amplicon, c'est-à-dire dans une région dans laquelle les séquences PIV et RSV présentent une grande divergence (environ 50 % de divergence entre lesdites séquences), cette région de forte divergence comprenant notamment un long « gap » unique de trois nucleotides.
Les sondes spécifiques de RSVA, RSVB et PIV3 ont été testées sur la plupart des échantillons cliniques et des souches prototypes, pour leur capacité de typage spécifique de chacun des groupes de virus, respectivement dans un test d'hybridation moléculaire et dans un test immunoenzymatique. Les tests d'hybridation on été réalisés à l'aide du kit de détection GEN-ETIK® DEIA (DNA Enzyme Immunoassay), commercialisé par Sorin Biomedica, Antony, France), l'étape d'hybridation proprement dite ayant été réalisée à 50°C pendant 60 minutes. La spécificité du test a été préalablement établie entre chacune des sondes et l'amplicon d'une souche prototype homologue ou hétérologue, à savoir les amplicons générés respectivement à partir de RSVA (Souche Long), RSVB (Souche 9320), PIV3 et le virus de Sendaï (Tableau 1). Le test est considéré comme positif lorsque la valeur de l'indice « D.O. de l'échantillon/D.O. seuil (D.O. seuil = Valeur de D.O. du contrôle négatif + 0,15 D.O.) est supérieure à 1. Pour chacune des trois sondes, les résultats d'hybridation sont positifs avec l'ADN de la souche prototype homologue, les valeurs d'indices étant fortes, en général supérieures à 10. En revanche, les résultats d'hybridation de chacune des trois sondes avec l'ADN des souches prototypes hétérologues sont systématiquement négatifs, les valeurs d'indice étant inférieures à 1. Ces résultats démontrent clairement l'absence d'hybridation croisée d'une sonde spécifique sélectionnée selon l'invention avec les amplicons issus des différentes souches virales prototypes. De plus, 97,5 % des amplicons obtenus à partir des isolats cliniques ne donnent des résultats positifs qu'avec la sonde homologue, montrant ainsi une excellente corrélation avec les données moléculaires. Néanmoins, on peut noter que pour l'un des 13 isolats de RSVB, tel que typé à l'aide du test immunoenzymatique, la souche n° 9401891, il a été observé une hybridation croisée avec la sonde spécifique de RSVA (Valeur d'indice = 2) et la sonde spécifique de RSVB (Valeur d'indice = 2,4).
Tableau 1 : Analyse des souches RSVA, RSVB et PIV3 par Immunofluorescence (IF A), amplification en chaîne à la polymerase (PCR), polymorphisme de longueur des fragments de restriction (RFLP) et hybridation spécifique.
Echant. IFA(l) PCR(2) RFLP(3) ID Hybridation (4) Séqu(5)
N° P1/P2 P1/P3 Avall BglII PvuII
Paires de bases (355) (355) (263/92) (177/172)
Long RSVA + + + + 10 0,6 0,2 ND(5)
9345839 RSVA + + + - 8,4 0,2 0,1 ND
9343012 RSVA + + + - 9,5 0,1 0,4 RSVA
9346219 RSVA + + + - 10,5 0,4 0,2 RSVA
9344506 RSVA + + + - 1,5 0,1 0,2 ND
9400961 RSVA + + + - 10,9 0, 1 0,2 RSVA
9404584 RSVA + + + - 10 0,2 0,1 ND
9402928 RSVA + + + + 9,6 0,3 0, 1 RSVA
9401927 RSVA + + + + 8 0,2 0,1 RSVA
9344539 RSVA + + + - 11,3 0,2 0,2 RSVA
9400220 RSVA + + + - 1,3 0,2 0,3 RSVA
9400932 RSVA + + + - 2,6 0,03 0,2 RSVA
9401887 RSVA + + + - 8,3 0,04 0,3 RSVA
9400972 RSVA + + + 6,7 0,2 0,3 RSVA
(283/66)
9400504 RSVA + + + - 0,2 5,3 0,1 RSVB Tableau 1 (suite 1)
Echant. IFA(l) PCR(2) RFLP(3) ID : Hybridation (4) 1 Séqu(5)
N° P1/P2 P1/P3 Avall BglII PvuII
Paires de bases (355) (355) (263/92) (283/66)
9320 RSVB + - + + 0,3 10,3 0,3 ND
9400906 RSVB + - + + 0,3 10,3 0,3 ND
9342557 RSVB + - + + 0,2 11,7 0,1 ND
9346188 RSVB + - + + 0,3 11,4 0,2 ND
9346000 RSVB + - + + 0,4 12,9 0,1 RSVB
9401761 RSVB + - + + 0,3 7,7 0,2 ND
9346417 RSVB + - + + 0,7 5,5 0,1 RSVB
9401990 RSVB + - + + 0,2 4,3 0,2 ND
9402975 RSVB + - + + 0,4 9,2 0,1 ND
9400215 RSVB + - + + 0,5 10,5 0,2 RSVB
9344256 RSVB + - + + 0,2 8,6 0,2 ND
9401023 RSVB + - 4- + 0.7 8,8 0,1 RSVB
9338709 RSVB + - + + 0,3 9,3 0,2 RSVB
9401891 RSVB + + + - 2,0 2,4 0,2 RSVA
Tableau 1 (suite 2)
Ecliant. IFA(l) PCR(2) RFLP(3) ID Hybridation (4) Séqu(5)
N° P1/P2 P1/P3 Avall BglII PvuII
Paires de bases (352) (352) (295/57)
Pasteur PIV3 + + + 0,5 0,3 12,3 PIV3
9441219 PIV3 + + + 0,2 0, 1 11,1 PIV3
9439318 PIV3 + + + 0,1 0,3 11,4 PIV3
9439389 PIV3 + + + 0,4 0,2 13,0 ND
9426479 PIV3 - + + 0.2 0,4 10,3 PIV3
9426019 PIV3 + + + 0,2 0.4 5,8 PIV3
9426354 PIV3 - + + 0,2 0,2 9,4 PIV3
9431422 PIV3 - + + 0,2 0,2 10,5 ND
9504839 PIV3 + + + 0.3 0,3 8,4 PIV3
9511637 PIV3 - + + 0,2 0,2 6,4 PIV3
9436203 PIV3 - + + ND ND ND PIV3
9509919 PIV3 + + + ND ND ND PIV3
9438367 PIV3 - + + ND ND ND ND
9419101 PIV3 _ + + ND
Tableau 1 ( suite 3)
Echant. IFA(l) PCR(2) RFLP(3) ID Hybridation (4) Séqu(5) P1/P2 P1/P3 Avall BglII PvuII
Paires de bases (263/92) (295/57) Sendaï 0,5 0,25 0,25 Sendaï
PIV1 (n=4)
PIV2 (n=3)
Roug. (n=l)
Oreill. (n=l) A (n≈l) B (n≈l) (1) : Test d'immunofluorescence (IF A)
(2) : Produits amplification résultant de la réaction de RT-PCR de la taille attendue, obtenus avec les jeux de sondes Pl/p2 ou P1/P3 et visualisés sur un gel d'électrophorèse.
(3) : Coupure par les endonucléases de restriction Avall, PvuII et BglII et tailles des fragments obtenus.
(4) : Valeur de l'indice d'hybridation, calculé de la manière suivante : D.O. de l'échantillon/D.O. seuil (D.O. seuil = Valeur de D.O. du contrôle négatif + 0, 15 D.O.. L'indice d'hybridation est considéré comme positif si sa valeur est supérieure à 1.
(5) : Type de séquence (6) : Séquençage non effectué.
Exemple 6 : Détection des virus dans des échantillons cliniques par RT-PCT et par EIA.
Des aspirats nasaux recueillis chez 261 enfants hospitalisés atteints de bronchiolite ont été testés simultanément par les techniques classiques (EFA, VIT) et par la technique RT-PCR en utilisant simultanément les amorces PI, P2, P ; la technique de révélation EIA par hybridation a été réalisée en utilisant simultanément les trois sondes spécifiques respectivement de RSVA, RSVB et PIV3 (technique RT-PCR-EIA). Les résultats comparatifs des tests PCR avec les techniques de IFA et VIT sont résumés dans le Tableau 2. La technique RT-PCR-EIA a permis de détecter des séquences virales de type RSV dans 103 échantillons (39,4 %); la technique IF A- VIT a permis de détecter des virus de type RSV dans 109 échantillons (41,7 %). Sept échantillons (2,6 %) sont sélectionnés positivement après IF A- VIT mais ne sont pas sélectionnés par PCR. Un seul échantillon (0,4 %) est positif pour la technique RT-PCR-EIA et non visualisé par la technique IF A- VIT.
La totalité des 63 échantillons typés RSVA, mais seulement 17 échantillons sur les 21 échantillons typés RSVB sont identifiés à la fois par la technique IF A- VIT et par la technique RT-PCR-EIA. Parmi ceux-ci, 4 échantillons ont généré un signal positif avec la sonde RSVA. Pour 25 infections par RSV (9,5 %), il n'a pas été possible de définir l'appartenance au type A ou au type B en utilisant les anticorps monoclonaux (IF A- VIT), et la moitié d'entre eux ont été identifiés comme appartenant au type RSVA par la technique RT-PCR-EIA. Quinze échantillons positifs pour PIV3 sont détectés par la technique IF A- VIT, la technique RT-PCR-EIA détectant des séquences PIV3 pour 14 d'entre eux. Tableau 2 : Comparaison des techniques IFA-VIT et RT-PCR-EIA pour la détection de RSV (RSVA ou RSVB) dans 261 aspirats nasaux d'enfants hospitalisés.
Figure imgf000058_0001
Les résultats obtenus par les inventeurs dans les différents Exemples ci-dessus démontrent clairement la sensibilité, la sélectivité et la reproductibilité du test de diagnostic différentiel mis au point, en particulier lorsque des sondes spécifiques sont mises en oeuvre à la suite de l'étape d'amplification à l'aide des amorces génériques, ainsi que l'excellente corrélation entre les résultats issus du diagnostic par RFLP, du diagnostic avec les sondes spécifiques et les données du séquençage des amplicons. L'isolât RSVB n° 94001891 identifié par immunofluorescence (EFA) présente une hybridation croisée avec deux sondes respectivement spécifiques de RSVA et RSVB, alors que les données de séquençage indiquent clairement que cet isolât appartient au type RSVA. Le résultat de typage par les sondes spécifiques (EIA) pourrait être expliqué par la présence simultanée de virus de type A et de virus de type B dans le même échantillon biologique. Sur l'analyse de l'alignement de séquences de la Figure 2, une région très conservée (aux environs des positions 240-280) dans le motif fonctionnel B au sein de la région catalytique III de la protéine L, dans laquelle il a été possible de définir une sonde générique adaptée à la détection simultanée des trois types de virus RSVA, RSVB et PIV3.
Sur les 261 échantillons cliniques issus du prélèvement des aspirats nasaux, les observations effectuées sur les isolats cliniques isolés par VIT ont été confirmés et généralisés. Les tests IFA-VIT et RT-PCR-EIA ont permis d'obtenir des résultats concordants pour les échantillons infectés par RSV (96,9 %) et pour les échantillons infectés par PIV3 (93,3 %). Ces observations indiquent que la méthode RT-PCR-EIA selon l'invention est une alternative avantageuse, extrêmement fiable et beaucoup plus rapide que les techniques de l'art antérieur. Cependant, 1 échantillon, parmi les 14 échantillons positifs pour PIV3 par la technique IFA-VIT a été visualisé comme négatif par la technique RT-PCR-EIA. Par ailleurs, 7 échantillons parmi les 109 échantillons positifs pour RSV par la technique IFA-VIT sont négatifs par la technique RT-PCR-EIA, et dans 6 cas supplémentaires, le produit amplifié n'a pas pu être amplifié par RT-PCR-EIA. L'ensemble de ces résultats suggère que la technique de RT-PCR-EIA est beaucoup plus efficace que la technique IFA-VIT pour différencier les échantillons contenant RSVB des échantillons contenant RSVA. En effet, la technique RT-PCR-EIA n'a pas permis de détecter RSV dans des isolats cliniques ou aspirats nasaux que dans 3,7 à 5,8 % des cas, alors que la technique IFA-VIT n'a pas permis de détecter RSV dans les mêmes échantillons pour plus de 23 % des cas. On peut aussi noter que les deux méthodes donnent des résultats en total désaccord (RSVA/RSVB) dans 3,7 à 4,7 % des cas.
En dépit des différences d'efficacité évoquées ci-dessus, les techniques RT-PCR- EIA et EFA- VIT ont un niveau de sensibilité comparable. Cependant, l'utilisation de la détection des produits amplifiés par hybridation d'une sonde oligonucléotidique interne permet d'obtenir une sensibilité 10 fois plus grande que lors d'une visualisation des produits amplifiés sur gel d'agarose.
Freymuth et al. (1995) avaient observé que l'application de la technique RT- PCR-EIA à l'amplification du gène N donnait des résultats meilleurs que la mise en oeuvre de la technique IFA-VIT sur les mêmes échantillons. La technique RT-PCR-EIA appliquée à l'amplification du gène N a été réalisée sur les 261 échantillons cliniques (résultats non représentés). Dans cette expérience, 56 % des échantillons testés ont été visualisés comme étant positifs pour RSV, contre 39,4 % des mêmes échantillons lorsque la technique RT-PCR-EIA appliquée au gène L selon l'invention est mise en oeuvre. Les raisons d'une telle différence dans les résultats obtenus selon les deux techniques pourraient être dues à la meilleure conservation des amorces utilisées selon l'invention, qui ne contiennent que deux mésappariements de bases, favorisant ainsi la reconnaissance des brins matrices. Cette différence pourrait également être expliquée par la taille plus faible du fragment amplifié (278 pb contre 355 pb selon la technique de l'invention), résultant en un nombre plus grand de copies de l'amplicon. Au vu de ces dernières observations expérimentales, il apparaît clairement que la mise en oeuvre de la technique RT-PCR au niveau du gène L est beaucoup plus fiable que lorsque cette technique est mise en oeuvre au niveau du gène N.
En conclusion, les inventeurs ont développé une technique moléculaire permettant la détection en une étape puis le typage des principaux paramyxovirus responsables des infections des voies respiratoires inférieures : RSVA, RSVB et PIV3. Seule la détection des virus de type PIV1 et PIV2 nécessiterait la construction de jeux d'amorces adaptées, mais ces deux types de virus sont fréquemment associés dans les infections des voies respiratoires supérieures et sont en conséquence plus rarement isolés chez les patients hospitalisés. Les techniques moléculaires objet de la présente invention constituent une alternative efficace et très compétitive aux techniques de détection d'un antigène viral, en particulier en ce que les techniques de l'invention améliorent de manière importante la sensibilité de la détection des virus dans un échantillon biologique. Il est, en effet, important de souligner que les techniques d'immunofluorescence ou de multiplication (amplification) du virus sur cultures de cellules avant isolement conduisent à l'observation d'une proportion significative de résultats faussement négatifs chez des patients ayant une infection des voies respiratoires inférieures (Wendt et al., 1992). Les techniques moléculaires selon la présente invention sont testées sur des isolats viraux multipliés sur des cultures cellulaires (cf. Exemples) et sont particulièrement adaptées pour une mise en oeuvre directe sur les échantillons biologiques, plus particulièrement sur des aspirats nasaux pendant le développement d'une épidémie. De plus, la rapidité du procédé de diagnostic différentiel de l'invention en fait un outil particulièrement adapté à un diagnostic précoce des infections par RSVA, PIV3 et RSVB, de nature à rendre possible l'administration aux patients d'une thérapie ciblée sur le type viral en cause et de nature à assurer en conséquence un traitement efficace, dès la déclaration de la maladie.
Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite, elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention. Annexe I
Carte de restriction du polynucleotide de séquence SEQ ED N°l
Dde I Sau3A I Mbo I Dpn II Tsp Dpn I Sfc I BstY I Tsp509 I Pst I
10 Bgl II Apo I Nia III Nia III
15 ACAACAGATCTCAGCAAATTCAATCAAGCATTTAGATATGAAACATCATGTATCTGCAGTGATGTATTAGATGAACTGC A 80
TGTTGTCTAGAGTCGTTTAAGTTAGTTCGTAAATCTATACTTTGTAGTACATAGACGTCACTACATAATCTACTTGACG
20 T 1°
16 47 25 79 17 54 54 55
30
10
Rsa I
Rsa I Tsp45 I Csp6 I
35 Csp6 I Mse I Mae III BsrG I Nia III
TGGGGTACAATCTCTGTTCTCTTGGTTGCATTTAACAATACCTCTTGTCACAATAATATGTACATATAGACATGCACCT
40 C 160
ACCCCATGTTAGAGACAAGAGAACCAACGTAAATTGTTATGGAGAACAGTGTTATTATACATGTATATCÏGTACGTGGA G
45
85 .12 127 139 151 85 127 140
140
50 Nia III Sau3A I Mbo I Nde I Dpn II Msl I
55 Dpn I Mse I EcoR V
CTTTCATAAAGGATCATGTTGTCAATCTTAATGAAGTTGATGAACAAAGTGGATTATACAGATATCATATGGGTGGTAT T 240
60
GAAAGTATTTCCTAGTACAACAGTTAGAATTACTTCAACTACTTGTTTCACCTAATATGTCTATAGTATACCCACCATA A 172 188 221 172 226 172 226 172
175
Sau3A I
Mbo I
Dpn II
Dpn I
Ξau96 I BstY I Tsp509 I
Ava II Alu I Bgl II Mse I Apo I
GAGGGCTGGTGTCAAAAACTGTGGACCATTGAAGCTATATCATTATTAGATCTAATATCTCTTAAAGGTAAATTCTCCA T 320
CTCCCGACCACAGTTTTTGACACCTGGTAACTTCGATATAGTAATAATCTAGATTATAGAGAATTTCCATTTAAGAGGT A
263 273 288 302 310 263 288 311 289 289 289 289
Tsp45 I
Alu I - Mae -I I I
CACAGCTCTGATAAATGGTGACAATCAAGCAATAG 355 GTGTCGAGACTATTTACCACTGTTAGTTCGTTATC
| o | o o
324 338
338
SITES DE RESTRICTION
Ava II g/gwcc 1 262 263 ( 93 2
BsrG I t/gtaca 1 138 139 (217 1
Dde I c/tnag 1 9 10 (346 1
EcoR V gat/atc 1 220 221 (135 2
Msl I caynn/nnrtg 1 225 226 (130 2
Nde I ca/tatg 1 225 226 (130 2
Pst I ctgca/g 1 53 54 (302 1
Sau96 I g/gncc 1 262 263 ( 93 2
Sfc I c/tryag 1 53 54 (302 1
TspR I nncagtgnn/ 1 54 55 (301 1
Alu I ag/ct 2 272 273 ( 51 2 324( 32) 3
Apo I r/aatty 2 15 16 (294 1 310 ( 46) 2
Bgl II a/gatct 2 5 6 (282 1 288( 68) 2
BstY I r/gatcy 2 5 6 (282 1 238( 68) 2
Csp6 I g/tac 2 84 85 ( 55 3 140 (216) 1
Mae III /gtnac 2 126 127 (211 1 338( 18) 3
Rsa I gt/ac 2 84 85 ( 55 3 140 (216) 1
Tsp45 I /gtsac 2 126 127 (211 1 338( 18) 3
Tsp509 I /aatt 2 16 17 (294 1 311( 45) 2
Dpn I ga/tc 3 6 7 (165 1 172 (117) 2 289( 67) 3
Dpn II /gatc 3 6 7 (165 1 172 (117) 2 2891 67) 3
Mbo I /gatc 3 6 7 (165 1 172 (117) 2 289( 67) 3
Mse I t/taa 3 111 112 ( 76 3 188 (114) 1 302( 54) 4
Sau3A I /gatc 3 6 7 (165 1 172 (117) 2 289( 67) 3
Nia III catg/ K 46) 3 47( 32) 4 79( 72) 2 151 ( 24) 5
175 (181) 1
47 sites retrouvés
Annexe II
Correspondance entre bases nucléiques de la SEQ ID N° 1 et acides aminés de la SEQ ID N° 6.
1/1 31/11
ACA ACA GAT CTC AGC AAA TTC AAT CAA GCA TTT AGA TAT GAA ACA TCA TGT ATC TGC AGT T T D S K F N Q A F R Y E T S C I C S
Figure imgf000064_0001
GAT GTA TTA GAT GAA CTG CAT GGG GTA CAA TCT CTG TTC TCT TGG TTG CAT TTA ACA ATA
D V L D E H G V Q S F S W L H T I
Figure imgf000064_0002
CCT CTT GTC ACA ATA ATA TGT ACA TAT AGA CAT GCA CCT CCT TTC ATA AAG GAT CAT GTT P V T I I C T Y R H A P P F I K D H V
181/61 211/71
GTC AAT CTT AAT GAA GTT GAT GAA CAA AGT GGA TTA TAC AGA TAT CAT ATG GGT GGT ATT
V N L N E V D E Q S G L Y R Y H M G G I
Figure imgf000064_0003
GAG GGC TGG TGT CAA AAA CTG TGG ACC ATT GAA GCT ATA TCA TTA TTA GAT CTA ATA TCT
E G W C Q K L W T I E A I S L L D L I S
301/101 331/111
CTT AAA GGT AAA TTC TCC ATC ACA GCT CTG ATA AAT GGT GAC AAT CAA GCA ATA G
L K G K F S I T A L I N G D N Q A I
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Claims

Revendications
1. Polynucleotide caractérisé en ce qu'il est choisi parmi : a) un polynucleotide comprenant au moins 12 nucleotides consécutifs de l'enchaînement de nucleotides suivant (SEQ ID N° 1) :
ACAACAGATCTCAGCAAATTCAATCAAGCATTTAGATATGAAACATCATGTA TCTGCAGTGATGTATTAGATGAACTGCATGGGGTACAATCTCTGTTCTCTTG GTTGCATTTAACAATACCTCTTGTCACAATAATATGTACATATAGACATGCAC CTCCTTTCATAAAGGATCATGTTGTCAATCTTAATGAAGTTGATGAACAAAG TGGATT AT AC AGAT ATC AT ATGGGTGGT ATTGAGGGCTGGTGTC AAAAACTG TGGACCATTGAAGCTATATCATTATTAGATCTAATATCTCTTAAAGGTAAATT CTCCATCACAGCTCTGATAAATGGTGACAATCAAGCAATAG ; b) un polynucleotide dont la séquence est complémentaire de la séquence du polynucleotide défini en a) ; c) un polynucleotide hybridant dans des conditions de forte stringence avec le polynucleotide défini en a) ou avec le polynucleotide défini en b).
2. Polynucleotide selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il code pour la région III de la grande sous-unité (L) de la polymerase des paramyxovirus de type RSVB.
3. Sonde oligonucléotidique pour la détection spécifique d'un paramyxovirus de type RSVB, caractérisée en ce qu'elle comprend un enchaînement d'au moins 12 nucleotides consécutifs d'un polynucleotide selon l'une des revendications 1 et 2.
4. Sonde oligonucléotidique selon la revendication 3, caractérisée en ce qu'elle est sélectionnée parmi les oligonucléotides suivants :
SEQ ID N° 14 : 5'-AACTTCATTAAGATTGACAACATGATCCTTTATGAAAGGA-
3' ;
SEQ ID N° 2 : 5'-AACTTCATTAAGATTGACAACATGATCCTTTATGAAAGGA- 3' ;
SEQ ID N° 15 : 5'-AGAGGTATTGTTAAATGCAACCAAGAGAAC-3' ;
SEQ ID N° 16 : 5'-TATCAGAGCTGTGATG-3'.
5. Polynucleotide selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il" est marqué.
6. Polynucleotide selon L'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que celui-ci est immobilisé sur un support, de manière covalente ou non covalente.
7. Amorce nucleotidique pour l'amplification spécifique d'un polynucleotide selon l'une des revendications 1 ou 2.
8. Amorce nucleotidique pour l'amplification spécifique d'un polynucleotide du génome et/ou d'un ADN complémentaire correspondant à l'ARN messager d'un paramyxovirus de type RSVB, caractérisée en ce qu'elle comprend un enchaînement d'au moins 12 nucleotides consécutifs d'un polynucleotide selon l'une des revendications 1 ou 2.
9. Amorce nucleotidique selon l'une quelconque des revendications 7 à 8, caractérisée en ce qu'elle comprend une séquence nucléique répondant à l'un des enchaînements de nucleotides suivants : SEQ ID N° 3 (amorce aller): 5'-CTCTTGGTTGCATTTAACAATA-3* ; SEQ ID N° 4 (amorce aller) : 5'-GTTGTCAATCTTAATGAA-3' ; SEQ ID N° 5 (amorce retour) : 5'-TATCAGAGCTGTGATG-3'.
10. Couple d'amorces nucléotidiques, caractérisé en ce qu'il est constitué de deux amorces selon l'une des revendications 7 à 9.
11. Couple d'amorces selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les couples d'amorces suivants :
Couple a) : SEQ ID N° 3 et SEQ ID N° 5 ; Couple b) : SEQ ID N° 4 et SEQ ID N0 5.
12. Polypeptide correspondant à la région III de la grande sous-unité (L) de la polymerase d'un virus de type RSVB, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi : a) un polypeptide dont la séquence comprend l'enchaînement d'acides aminés SEQ ID N° 6 suivant :
NH2-TTDLSKFNQAFRYETSCICSDVLDELHGVQSLFSWLHLTIPLVTIICTYRHAP PFKDHVVNLNEVDEQSGLYRYHMGGIEGWCQKLWTIEAISLLDLISLKGKFSIT ALINGDNQAI-COOH ; b) un fragment d'au moins 10 acides aminés du polypeptide défini en a), ledit fragment étant capable d'être reconnu par des anticorps dirigés contre la région III de la grande sous-unité (L) de la polymerase des virus de type RSVB ; c) un polypeptide comportant, par rapport au polypeptide défini en a) ou b), au moins une modification par délétion, addition ou substitution d'un acide aminé, ledit polypeptide modifié étant capable d'être reconnu par des anticorps dirigés contre le polypeptide correspondant à la région III de la grande sous-unité (L) de la polymerase des virus de type RSVB.
13. Polynucleotide caractérisé en ce qu'il code pour un polypeptide selon la revendication 12.
14. Vecteur recombinant de clonage et/ou d'expression et ou d'insertion caractérisé en ce qu'il contient un polynucleotide selon l'une des revendications 1, 2 et 13.
15. Vecteur recombinant selon la revendication 14, caractérisé en ce qu'il s'agit du plasmide contenu dans le clone de E. coli ASC.3, déposé à la CNCM le 20 juin 1997 sous le numéro d'accès 1-1880.
16. Hôte cellulaire recombinant caractérisé en ce qu'il contient un polynucleotide selon l'une des revendications 1, 2 et 13 ou un vecteur recombinant selon la revendication 14.
17. Hôte cellulaire recombinant selon la revendication 16, caractérisé en ce qu'il s'agit du clone de E. coli ASC.3 déposé à la CNCM le 20 juin 1997 sous le numéro 1-1880.
18. Polypeptide recombinant caractérisé en ce qu'il est obtenu à partir d'un hôte cellulaire recombinant selon l'une des revendications 16 et 17.
19. Anticorps polyclonal ou monoclonal caractérisé en ce qu'il reconnaît spécifiquement un polypeptide selon l'une des revendications 12 et 18.
20. Anticorps selon la revendication 19 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un anticorps marqué.
21. Composition immunogène caractérisée en ce qu'elle comprend un ou plusieurs polypeptides selon l'une quelconque des revendications 12 et 18.
22. Polynucleotide ayant une longueur d'au moins 12 nucleotides, caractérisé en ce qu'il est capable de s'hybrider spécifiquement, dans des conditions de forte stringence, à un premier acide nucléique codant pour la grande sous-unité (L) de la polymerase d'un virus de la famille des Paramyxoviridae d'un type donné ou à un second acide nucléique dont la séquence est complémentaire du premier acide nucléique.
23. Polynucleotide selon la revendication 22, caractérisé en ce qu'il s'hybride spécifiquement avec l'acide nucléique codant pour la région III de la grande sous-unité (L) de la polymerase d'un virus de la famille des Paramyxoviridae d'un type donné ou de l'acide nucléique de séquence complémentaire.
24. Polynucleotide selon l'une quelconque des revendications 22 et 23, caractérisé en ce que le virus de la famille des Paramyxoviridae est choisi parmi les virus parainfluenza (PIV) et les virus respiratoires syncitiaux (RSV).
25. Polynucleotide selon la revendication 24, caractérisé en ce que les virus parainfluenza sont sélectionnés parmi les virus PIV1, PIV2 et PIV3.
26. Polynucleotide selon la revendication 24, caractérisé en ce que les virus respiratoires syncitiaux sont sélectionnés parmi les virus RSVA ou RSVB.
27. Polynucleotide selon la revendication 25, caractérisé en ce qu'il s'hybride spécifiquement à un acide nucléique codant pour le gène L du virus de type PIV3 et en ce qu'il comprend l'enchaînement de nucleotides suivant :
SEQ ED N° 17 :
5 '-GAGGGTGTAACCAATT AAAC AATTTATTT AATCC AAAT A-3 ' ; SEQ ID N° 18 :
5'-2095-GAGGGTGTAACCAATTAAACAATTTATTTAATCCAAATAT-2056-3'.
28. Polynucleotide selon la revendication 26, caractérisé en ce qu'il s'hybride spécifiquement à un acide nucléique codant pour le gène L du virus de type RSVA et en ce qu'il est choisi parmi les enchaînements de nucleotides suivants : SEQ ID N O :
5'-TACATTGTTAGGATCTACAGTATGATCTCCTATATAGGGG-3' ; SEQ ID N° 11 :
5 '-2289-TACATTGTTAGGATCTACAGTATGATCTCCTATATAGGGG-2250-3 ' ; SEQ ED N° 12 :
5'-2216-TGAGGAATAGTTAAATGTAACCAGGAAAAT-2187- 3' ; SEQ ID N° 13 : 5'-2424-AATTAAAGCAGTAATT-2409-3'.
29. Polynucleotide selon la revendication 26, caractérisé en ce qu'il s'hybride spécifiquement à un acide nucléique codant pour le gène L du virus de type RSVB et en ce qu'il est choisi parmi les enchaînements de nucleotides suivants :
SEQ ID N° 14 :
5 '-AACTTC ATTAAGATTGAC AAC ATGATCCTTTATGAAAGGA-3 ' ;
SEQ ID N° 2 : 5'-AACTTCATTAAGATTGACAACATGATCCTTTATGAAAGGA-3' ;
SEQ ID N0 15 :
5,-AGAGGTATTGTTAAATGCAACCAAGAGAAC-3' ;
SEQ ID N° 16 : 5'-TATCAGAGCTGTGATG-3'.
30. Polynucleotide selon l'une quelconque des revendications 22 à 29, caractérisé en ce qu'il est marqué.
31. Polynucleotide selon l'une des revendications 22 à 29, caractérisé en ce que celui-ci est immobilisé sur un support, de manière covalente ou non-covalente.
32. Procédé pour la détection spécifique de la présence d'un paramyxovirus appartenant au type RSVB dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) mise en contact de l'échantillon biologique avec un couple d'amorces selon l'une des revendications 7 à 11, l'acide nucléique contenu dans l'échantillon ayant été, le cas échéant, préalablement rendu accessible à l'hybridation, dans des conditions permettant une hybridation des amorces à l'acide nucléique du virus de type RSVB ; b) amplification de l'acide nucléique du virus de type RSVB ; c) mise en évidence de l'amplification de fragments d'acide nucléique correspondant au fragment encadré par les amorces, par exemple par électrophorèse sur gel ou au moyen d'une sonde oligonucléotidique marquée selon l'une quelconque des revendications 3 et 4.
33. Procédé pour la détection spécifique de la présence d'un paramyxovirus appartenant au type RSVA, RSVB ou PIV3 dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) mise en contact d'un polynucleotide ou d'un mélange de polynucléotides selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 et 22 à 30 avec un échantillon biologique, l'acide nucléique contenu dans l'échantillon biologique ayant, le cas échéant, préalablement été rendu accessible à l'hybridation, dans des conditions permettant l'hybridation du polynucleotide ou du mélange de polynucléotides à l'acide nucléique d'un paramyxovirus de type RSVA, RSVB ou PIV3 ; b) détection de l'hybride formé entre le polynucleotide ou le mélange de polynucléotides et l'acide nucléique contenu dans l'échantillon biologique.
34. Procédé pour la détection spécifique de la présence d'un paramyxovirus appartenant au type RSVA, RSVB ou PIV3 dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) mise en contact d'un polynucleotide ou d'un mélange de polynucléotides immobilisé sur un support selon la revendication 31 avec un échantillon biologique, l'acide nucléique de l'échantillon ayant, le cas échéant, préalablement été rendu accessible à l'hybridation, dans des conditions permettant l'hybridation du polynucleotide ou du mélange du polynucleotide à l'acide nucléique d'un paramyxovirus de type RSVA, RSVB ou PIV3 ; b) mise en contact de l'hybride formé entre le polynucleotide ou le mélange de polynucléotides immobilisé sur un support et l'acide nucléique contenu dans l'échantillon biologique, le cas échéant après élimination de l'acide nucléique de l'échantillon biologique n'ayant pas hybride avec le polynucleotide, avec un polynucleotide ou un mélange de polynucléotides marqué selon la revendication 30, étant entendu que ledit polynucleotide marqué possède une séquence ne recouvrant pas la séquence du polynucleotide de l'étape a).
35. Procédé selon l'une quelconque des revendications 33 et 34, caractérisé en ce que, préalablement à l'étape a), l'ADN de l'échantillon biologique, ou l'ADNc obtenu par transcription inverse de l'ARN de l'échantillon biologique, est amplifié à l'aide d'un couple d'amorces.
36. Procédé selon la revendication 35, caractérisé en ce que le couple d'amorces n'est pas spécifique d'un paramyxovirus d'un type donné.
37. Procédé selon la revendication 36, caractérisé en ce que le couple d'amorces permet l'amplification d'un acide nucléique d'un virus de type RSVA, RSVB et PIV3.
38. Procédé selon la revendication 36, caractérisé en ce que le couple d'amorces permet l'amplification d'un acide nucléique d'un virus de type RSVA et RSVB.
39. Procédé selon la revendication 36, caractérisé en ce que le couple d'amorces permet l'amplification d'un acide nucléique d'un virus de type RSVA et PIV3.
40. Procédé selon la revendication 38, caractérisé en ce que le couple d'amorces est le suivant : - PI (SEQ ID N° 7) : 5'-ACAACAGATCTCAGCAAAT-3' ;
- P2 (SEQ ED N° 8) : 5'-CTATTGCTTGATTGTCACC-3'.
41. Procédé selon la revendication 39, caractérisé en ce que le couple d'amorces est le suivant : - PI ( SEQ ID N° 7) : 5'-ACAACAGATCTCAGCAAAT-3' ;
- P3 (SEQ ED N° 9) : 5'-CTATTGCTTGATTGTCTC-3'.
42. Procédé pour la détection spécifique de la présence d'un antigène d'un paramyxovirus de type RSVB dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) mise en contact de l'échantillon biologique avec un anticorps selon l'une des revendications 19 et 20 ; b) mise en évidence du complexe antigène-anticorps formé.
43. Procédé pour la _ détection spécifique de la présence d'un anticorps d'un paramyxovirus de type RSVB dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) mise en contact de l'échantillon biologique avec un polypeptide selon l'une des revendications 12 et 18 ; b) mise en évidence du complexe antigène-anticorps éventuellement formé.
44. Procédé de préparation d'un polypeptide selon la revendication 18, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) insertion d'un polynucleotide selon l'une des revendications 1, 2 et 13 dans un vecteur d'expression, ledit polynucleotide étant placé sous le contrôle de signaux de régulation et/ou d'expression reconnus par un hôte cellulaire eucaryote ou procaryote ; b) transformation de l'hôte cellulaire par le vecteur d'expression obtenu à l'étape a) ; c) mise en culture, dans un milieu de culture approprié, de l'hôte cellulaire transformé à l'étape b) ; d) séparation, à partir du milieu de culture, du polypeptide produit par l'hôte cellulaire transformé qui constitue le produit d'expression dudit polynucleotide porté par le vecteur recombinant.
45. Trousse ou nécessaire pour la détection spécifique de la présence d'un paramyxovirus appartenant au type RSVA, RSVB ou PIV3 dans un échantillon biologique, caractérisée en ce qu'elle comprend les éléments suivants : a) un polynucleotide selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 et 22 à 30 ; b) les réactifs nécessaires à la mise en oeuvre d'une réaction d'hybridation ; c) le cas échéant, un couple d'amorces non spécifique d'un type de paramyxovirus donné, choisi parmi :
- un couple d'amorces permettant l'amplification d'un acide nucléique d'un virus de type RSVA, RSVB et PIV3 ;
- un couple d'amorces permettant l'amplification d'un acide nucléique d'un virus de type RSVA et RSVB ;
- un couple d'amorces permettant l'amplification d'un acide nucléique d'un virus de type RSVA et PIV3 ; ou un mélange d'un ou plusieurs de ces trois couples d'amorces, ainsi que les réactifs nécessaires à l'amplification d'un acide nucléique.
46. Trousse ou nécessaire pour la détection spécifique de la présence d'un paramyxovirus appartenant au type RSVA, RSVB ou PIV3 dans un échantillon biologique, caractérisée en ce qu'elle comprend les éléments suivants : a) un polynucleotide, dit polynucleotide de capture, selon la revendication 31 ; b) un polynucleotide, dit polynucleotide de révélation, selon l'une des revendications
1 à 4 et 22 à 30 ; c) le cas échéant, un couple d'amorces non spécifique d'un type de paramyxovirus donné, choisi parmi :
- un couple d'amorces permettant l'amplification d'un acide nucléique d'un virus de type RSVA, RSVB et PIV3 ;
- un couple d'amorces permettant l'amplification d'un acide nucléique d'un virus de type RSVA et RSVB ;
- un couple d'amorces permettant l'amplification d'un acide nucléique d'un virus de type RSVA et PIV3 ; ou un mélange d'un ou plusieurs de ces trois couples d'amorces, ainsi que les réactifs nécessaires à l'amplification d'un acide nucléique.
47. Trousse ou nécessaire pour la détection spécifique de la présence d'un paramyxovirus appartenant au type RSVB dans un échantillon biologique, caractérisée en ce qu'elle comprend les éléments suivants : a) un couple d'amorces nucléotidiques selon l'une des revendications 7 à 11 ; b) les réactifs nécessaires pour effectuer une réaction d'amplification d'un acide nucléique ; c) le cas échéant, un composant permettant de détecter le fragment d'acide nucléique amplifié, de préférence une sonde oligonucléotidique spécifique de RSVB selon l'une des revendications 3 et 4, ou encore une sonde consensus hybridant avec différents paramyxovirus, lesdites sondes consensus étant choisies parmi la SEQ ED N° 19, la SEQ ED N° 20, la SEQ ID N° 21 ou la SEQ ID N° 22, le cas échéant marquées.
48. Trousse ou nécessaire pour la détection de la présence d'un paramyxovirus de type RSVB dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'elle comprend les éléments suivants : a) un anticorps polyclonal ou monoclonal selon l'une des revendications 19 et 20 ; b) le cas échéant, les moyens nécessaires à la détection du complexe antigène-anticorps formé.
49. Trousse ou nécessaire pour la détection de la présence d'un paramyxovirus de type RSVB dans un échantillon biologique, caractérisée en ce qu'elle comprend les éléments suivants : a) un polypeptide selon l'une des revendications 11 et 18 ; b) le cas échéant, les moyens nécessaires à la détection du complexe antigène-anticorps formé.
50. Amorce nucleotidique pour l'amplification d'un polynucleotide du génome et/ou d'un ADN complémentaire correspondant à l'ARN messager d'un paramyxovirus de type RSV et PIV, caractérisée en ce qu'elle comprend un enchaînement nucleotidique inclus dans les régions nucléotidiques du gène L de RSV ou PIV correspondant aux positions suivantes sur le gène L du virus RSVA :
- la région allant du nucléotide en position ntl261 au nucléotide en position nt 1295 (Numérotation RSVA de la Figure 7) ; - la région allant du nucléotide en position ntl402 au nucléotide en position ntl443 de la Figure 7 ;
- la région allant du nucléotide en position ntl603 au nucléotide en position nt 1631 de la Figure 7 ;
- la région allant du nucléotide en position ntl733 au nucléotide en position ntl775 de la Figure 7 ;
- la région allant du nucléotide en position ntl855 au nucléotide en position ntl891 de la Figure 7 ;
- la région allant du nucléotide en position nt2323 au nucléotide en position nt2357 de la Figure 7 ; - la région allant du nucléotide en position nt2552 au nucléotide en position nt2579 de la Figure 7.
51. Amorce nucleotidique selon la revendication 50, caractérisée en ce qu'elle comprend un enchaînement nucleotidique choisi parmi les enchaînements de nucleotides suivants : SEQ ED N° 23 : 5'-1875-AGGTAGATGTTTGCAA-1891-3' ;
SEQ K> N° 24 : 5'-1891-TTGCAAACAGTCTACCT-1875-3' ;
SEQ ED N° 25 : 5'-2341-TGTCAAAAACTATGGAC-2357-3' ;
SEQ ED N° 26 : 5'-2357-GTCCATAGTTTTTGACA-2341-3' ;
SEQ ID N° 27 : 5'-1279-AGAATATTTGGACATCC-1295-3'.
52. Couple d'amorces, nucléotidiques pour l'amplification d'un polynucleotide du génome et/ou d'un ADN complémentaire correspondant à l'ARN messager d'un paramyxovirus de type RSV et PIV, caractérisé en ce qu'il comprend une combinaison d'enchaînements nucléotidiques inclus dans les régions nucléotidiques du gène L de RSV ou PIV correspondant aux positions suivantes sur le gène L du virus RSVA, étant entendu qu'une combinaison particulière d'enchaînement nucleotidique comprend une amorce aller et une amorce retour :
- la région allant du nucléotide en position ntl402 au nucléotide en position ntl443 de la Figure 7 ; - la région allant du nucléotide en position ntl603 au nucléotide en position nt 1631 de la Figure 7 ;
- la région allant du nucléotide en position ntl733 au nucléotide en position ntl775 de la Figure 7 ;
- la région allant du nucléotide en position ntl 855 au nucléotide en position ntl891 de la Figure 7 ;
- la région allant du nucléotide en position nt2323 au nucléotide en position nt2357 de la Figure 7 ;
- la région allant du nucléotide en position nt2552 au nucléotide en position nt2579 de la Figure 7.
53. Couple d'amorces nucléotidiques selon la revendication 52, caractérisé en ce qu'il s'agit de l'un des couples d'amorces suivants :
- SEQ ID N° 27 et SEQ ID N° 24 ;
- SEQ ED N° 27 et SEQ ED N° 26 ; - SEQ ID N° 27 et SEQ ID N° 8 ;
- SEQ ID N° 27 et SEQ ID N° 9 ;
- SEQ ID N° 23 et SEQ ID N° 26 ;
- SEQ ID N° 23 et SEQ ID N° 8
- SEQ ID N° 23 et SEQ ED N° 9 - SEQ ED N° 7 et SEQ ED N° 26
- SEQ ID N° 7 et SEQ ED N° 8 ;
- SEQ ID N° 7 et SEQ ID N° 9.
54. Procédé pour la détection spécifique de la présence d'un paramyxovirus appartenant au type RSVA, RSVB ou PIV3 dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) l'ADN de l'échantillon biologique, ou l'ADNc obtenu par transcription inverse de l'ARN de l'échantillon biologique, est amplifié à l'aide d'un couple d'amorces selon l'une des revendications 52 et 53, l'acide nucléique contenu dans l'échantillon biologique ayant, le cas échéant, préalablement été rendu accessible à l'hybridation, dans des conditions permettant l'hybridation des amorces nucléotidiques à l'acide nucléique d'un paramyxovirus de type RSVA, RSVB ou PIV3 ; b) mise en contact d'un polynucleotide ou d'un mélange de polynucléotides selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 et 22 à 30 avec l'acide nucléique résultant de l'amplification de l'étape a) ; c) détection de l'hybride formé entre le polynucleotide ou le mélange de polynucléotides et l'acide nucléique amplifié.
55. Trousse ou nécessaire pour la détection spécifique de la présence d'un paramyxovirus appartenant au type RSV ou PIV dans un échantillon biologique, caractérisée en ce qu'elle comprend : a) au moins un couple d'amorces nucléotidiques selon l'une des revendications 52 et 53 ; b) les réactifs nécessaires à la mise en oeuvre d'une réaction d'amplification d'un acide nucléique cible.
56. Trousse ou nécessaire de détection selon la revendication 55, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins deux couples d'amorces selon l'une des revendications 52 et 53.
57. Trousse ou nécessaire de détection selon l'une des revendications 55 et 56, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre un polynucleotide selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 et 22 à 30.
58. Polynucleotide capable d'hybrider, dans des conditions stringentes d'hybridation, à un acide nucléique codant pour la grande sous-unité (L) de la polymerase d'un paramyxovirus de type RSVA, RSVB et PIV3, caractérisé en ce qu'il a une longueur d'au moins 12 nucleotides, en ce qu'il est sélectionné de telle manière que la région du gène L avec laquelle il s'hybride présente au sein des différents paramyxovirus respiratoires, et tout .particulièrement RSVA, RSVB et PIV3, une séquence nucleotidique présentant un degré d'identité d'au moins 80 % entre les différents types de virus et en ce qu'il est sélectionné de telle manière que sa séquence présenté un degré d'identité avec les séquences cibles des différents paramyxovirus respiratoires d'au moins 85 %, et avantageusement d'au moins 88 %.
59. Polynucleotide selon la revendication 58, caractérisé en ce qu'il a une longueur d'au moins 12 nucleotides consécutifs de l'un des enchaînements nucléotidiques suivants : SEQ ÏÏ) N° 19 : 5'-GGTGGTATAGAAGGCTGGTGTCAAAAATTATGGAC-3' ; SEQ ID N° 20 : 5 '-GGGGGTATAGAAGGCTGGTGTC AAAAAÇ ATGGAC-3 ' ; SEQ ED N° 21 : 5'-GTCCATAATTTTTGACACCAGCCTTCTATACCACC-3' ; SEQ ID N° 22 : 5'-GTCCATAGTTTTTGACACCAGCCTTCTATACCÇ_CC-3' ; ou de la séquence complémentaire des séquences SEQ ED N° 19 à SEQ ID N° 22.
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