WO1998053098A1 - Verfahren und kit zur detektion von mutationen in dna's mit hilfe von restriktionsenzymen - Google Patents

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WO1998053098A1
WO1998053098A1 PCT/EP1997/004955 EP9704955W WO9853098A1 WO 1998053098 A1 WO1998053098 A1 WO 1998053098A1 EP 9704955 W EP9704955 W EP 9704955W WO 9853098 A1 WO9853098 A1 WO 9853098A1
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primer
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mutation
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Ursula Bilitewski
Dirk Kuhlmeier
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GESELLSCHAFT FüR BIOTECHNOLOGISCHE FORSCHUNG MBH (GBF)
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
    • C12Q1/683—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism involving restriction enzymes, e.g. restriction fragment length polymorphism [RFLP]

Definitions

  • the present invention relates to a method for the detection of mutations of DNAs, a DNA being amplified by means of a PCR and the amplicons being cut and detected with one or more restriction enzymes, characterized in that two labeled primers are used, the labeling of the first Primer for binding the amplicons to one or more carriers and the marking of the second primer is used for detection.
  • the present invention further relates to a kit for carrying out the method described above, which is characterized in that it comprises two labeled primers.
  • Restriction enzymes are used here, which recognize double-stranded DNA in a sequence-specific manner and can cut at the appropriate place. Approximately 500 different restriction enzymes with over 100 different interfaces are currently characterized. This high specificity is used to detect the defects. Because a mutation that triggers a pathological change often lies in the region of such an enzyme interface. The mutation changes the interface so that the strand to be examined is not cut. In other cases, a mutation first creates a possible interface for an enzyme that was not previously available.
  • PCR polymerase chain reaction
  • primers sequence pieces, which define the beginning and the end of the amplified piece of DNA.
  • a thermal cycler is also required, a device that realizes the required temperature profile for a PCR reaction.
  • the above-mentioned degradation takes place with the aid of the restriction enzyme. Depending on the mutation, this cuts the DNA in a sequence-specific manner under defined conditions or there is no cut. Depending on the concentration of the enzyme, this process can take a few hours.
  • agarose gel electrophoresis has been used to analyze the product: an agarose polymer is dissolved in a buffer solution by heating and after a cooling phase, the gelling polysaccharide is poured into a device in which the electrophoresis is to be carried out. When the gel has cooled completely, the samples are applied and the size-dependent migration of the DNA fragments in the agarose gel occurs with the application of a potential difference.
  • the fragments can be visualized e.g. with the addition of fluorescent intercalates, substances that are embedded in the DNA and are visible under UV light.
  • a mutation can be diagnosed if a specific change in the restriction pattern becomes apparent in the gel.
  • the invention is therefore based on the object of developing a method and a kit with which the mutation forms described above can be detected simply, reproducibly and with a high sample throughput, the disadvantages of gel electrophoresis being avoided.
  • This object is achieved by a method for the detection of mutations of DNAs, wherein a DNA is amplified by means of a PCR and the amplicons are cut and detected (analyzed) with one or more restriction enzymes, which method is characterized in that two marked primers are used and the marking of the first primer is used to bind the amplicons (duplicated DNA segments) to one or more supports and the marking of the second primer is for detection (analysis).
  • the PCR used in this method can be carried out as usual, the primers described above being used as primers.
  • Carriers that have an activated surface such as, for example, have proven to be particularly advantageous the appropriately treated surface of the reaction vessel or a microtiter plate.
  • the first primers are partially or completely fixed to the supports before, during or after the PCR, while the second primers are preferably bound free or not to the support and are optionally present in excess in the reaction solution.
  • the primers can be added to the reaction solution simultaneously or in succession.
  • the second primers should preferably have labels that can be easily detected by conventional methods when they are detected.
  • one or more restriction enzymes can be added before, during or after the binding of the DNA segments (amplicons from the PCR) to the carrier, the addition after the binding being preferred.
  • the restriction enzymes can be incubated with the amplicons.
  • restriction enzymes can be used as restriction enzymes, it of course depending on the sequence to be cut which enzyme (s) are used in the specific case.
  • the amplicons After the amplicons have been bound to suitable supports by means of the first primers and before and / or after cutting, preferably after cutting the amplicons with one or more of the restriction enzymes described above, the amplicons can be washed with a suitable dishwashing detergent, such as, for example, tem or distilled water, the optional additives such as
  • the detection methods are selected so that the respectively selected marking (the label) of the second primer can be detected.
  • the detection can be carried out directly or indirectly according to the marking of the second primer.
  • the DNA is first amplified and the amplicon is then bound to a suitable support, the label on the first primer serving as the coupling mediator. If necessary, the first primers can also have several corresponding labels.
  • the first primers are first bound to a suitable support such as the support surface of the vessel in which the PCR reaction takes place.
  • a coupling method must be selected that meets the constraints of the PCR, such as temperature stability.
  • the reaction then proceeds according to Standard conditions, wherein the second primer is not bound to the support and is preferably present in excess in relation to the first primer.
  • the desired DNA segment is formed in the solution, but hybridization and amplification also take place on the surface of the support, initiated by the bound primer.
  • the desired products are obtained which are bound directly to the support. Excess PCR starting materials (e.g. free nucleotides etc.) and unbound products are removed in a rinsing step.
  • the segment is then cleaved by the enzyme, optionally a further rinsing step and the detection as described above.
  • step 3 of this scheme the coupling to the support, for example a microtiter plate, could then be carried out via a biotin-binding protein, for example via streptavidin or avidin, which would be adsorbed or covalently bound, for example on the surface of the wells the microtiter plate.
  • a biotin-binding protein for example via streptavidin or avidin, which would be adsorbed or covalently bound, for example on the surface of the wells the microtiter plate.
  • streptavidin or avidin which would be adsorbed or covalently bound, for example on the surface of the wells the microtiter plate.
  • Microtiter plates coated with streptavidin are commercially available (Boehringer Mannheim).
  • a covalent coupling to the support could be provided for primer 1, for example on a microtiter plate.
  • phosphorylated primers are suitable, for example, which could react in a carbodiimide reaction with appropriately activated carriers.
  • An example of suitable functional groups of the support, for example the microtiter plates, would be amino groups. Such microtiter plates are also commercially available.
  • primer 2 can be used in scheme 1 and in scheme 2.
  • examples of these are fluorescein, fluorescein derivatives, rhodamine, rhodamine derivatives, Cy5 (fluorescent dye), Cy3 (fluorescent dye) or compounds which can be detected indirectly.
  • Fluorescent dyes These primers can then be directly detected using a suitable fluorimeter.
  • Digoxin indirect detection can be performed by adding an (enzyme-labeled) antibody.
  • Biotin Indirect detection can be performed by adding an avidin / enzyme conjugate, for example by adding avidin or streptavidin.
  • the binding of the respective recognition protein can either be detected, as is customary in other microtiter plate assays, by adding suitable enzyme substrates, with peroxidase or alkaline phosphatase being suitable enzymes (enzyme reaction provides colored products), or else it can then be followed directly if the coupling is not made on microtiter plates, but on suitable sensors.
  • suitable sensors can be, for example, planar waveguides, as are known from biosensor technology, and on which the same coupling reactions can be carried out with the aid of primer 1 as have been described above for microtitre plates.
  • the DNA to be examined can have an interface as a wild type or as a mutant.
  • the interface is removed in the selected example.
  • a point mutation is sufficient to prevent the enzyme from specifically recognizing and cutting the segment.
  • the restriction enzyme, PCR starting materials and, if appropriate, separated PCR products which contain the detectable label can be removed by a rinsing step before the actual detection.
  • the detection step analyzes whether the label is present or not. If there is a mutation, the detectable label is present and a reaction is obtained depending on the selected label. In the case of enzyme labeling one would e.g. observe a catalyzed color reaction. If there is no mutation, the enzyme can cut specifically and the label is removed. There is no detectable signal.
  • the interface is created in the selected example.
  • a point mutation can be sufficient for the enzyme to specifically recognize and cut the segment.
  • PCR reactants and any separated PCR products that contain the detectable La ⁇ bel be removed.
  • the detection step analyzes whether the label is present or not. If there is a mutation, the detectable label is not present and no reaction is obtained. If there is no mutation, the enzyme cannot cut and the label is not removed. A detectable signal is obtained.
  • Scheme 1 illustrates the sequence of the first assay setup according to the invention.
  • Fig. 1 shows the amplification of the target using the labeled primers.
  • the PCR is carried out in suitable containers.
  • Figure 2 shows the PCR reaction products labeled with labein.
  • One end of the reaction products has a label that is used for later binding to a support surface and the label at the other end is used for detection.
  • the searched sequence which can contain a potential mutation, is within the amplified segments.
  • FIG. 3 shows the binding of the segments made possible by the first marking; in Fig. 4 it is examined by the action of a restriction enzyme whether the interface of this enzyme has been removed by a mutation or not. If a mutation is present, as shown in FIG. 5, the interface is omitted and the detectable labels are not removed. If there is no mutation, the enzyme can cut. The separated segment is removed by a simple washing step and consequently no signal is obtained at the bound part of the segment.
  • Scheme 2 demonstrates the second structure of the assay according to the invention. 1 shows that part of the first primer, which is used for binding to the support surface, is already bound before the start of the PCR. The second primer, which can be detected, is in excess in the solution.
  • FIG. 2 indicates that after the PCR reaction has ended, the amplicon, which contains the sequence to be examined, is surface-fixed. Subsequently, the same restriction enzyme is added (FIG. 3), which, as described above, cuts the wild type, but not the mutation sequence. The result of the assay carried out is illustrated in FIG. 4. After a washing step (not shown), the detectable label is still present on the fixed segment in the event of a mutation. In the wild type, however, no signal is obtained since the enzyme cuts due to the existing interface and, as a result, the separated, labeled segment can be removed by a washing step.
  • a kit for carrying out the methods disclosed above is provided, which is characterized in that it comprises two labeled primers, it preferably additionally containing free nucleotides and a polymerase.
  • the first primer is suitable for binding PCR reaction products to one or more supports and the second primer is used for detection, the support preferably comprising an activated surface.
  • the method according to the invention and the kit according to the invention have the following advantages over the prior art: -
  • the described embodiments enable time savings compared to gel electrophoretic detection.
  • the second embodiment in particular has advantages since the PCR and the analysis of the products take place in one container. Repipetting is no longer necessary; the handling of the samples is simplified and the associated sources of error are eliminated.
  • the mutation is detected immediately after cleavage by the enzyme and not only after gel electrophoresis.
  • the mutation in protein factor V is held responsible for an increased risk of thrombosis, since it inhibits the breakdown of glycoprotein factor V by the serine protease APC (activated protein C).
  • Human factor V is a 330 kDa glycoprotein that interacts with APC and normally cleaved by APC at a very specific point in the sequence: in the human protein behind Arg 506 (arginine as the 506th amino acid in the protein).
  • Arg 506 arginine as the 506th amino acid in the protein.
  • This mutation means that the Arg 506 (product of the nucleotide sequence CGA) in the protein is replaced by glutamine (gin as the product of the nucleotide sequence CAA) and the cleavage by the protease described above therefore no longer takes place.
  • primers are used which are used to amplify a region of the gene which comprises the corresponding nucleotide sequence by means of a PCR reaction. For example, fragments of 267 base pairs in length were obtained.

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Abstract

Es wird ein Verfahren beschrieben, das die Möglichkeit bietet, Mutationen in DNA's mit Hilfe von Restriktionsenzymen zu detektieren. Dabei ist Vorraussetzung, daß sich durch die Mutation das Schneideverhalten des gewählten Restriktionsenzyms verändert. Das relevante DNA-Segment im Genom, das die Mutation enthält, wird mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) vervielfältigt, wobei die verwendeten Primer jeweils gelabelt eingesetzt werden. Der erste Primer ermöglicht die Bindung des Segments an eine Trägeroberfläche; das Label des zweiten Primers wird genutzt, um die Detektion zu ermöglichen. Ein Restriktionsenzym wird mit dem PCR-Amplikon inkubiert, wobei das mutierte Segment nicht geschnitten wird, wenn durch die Mutation die Schnittstelle entfällt. Nach der Bindung der Segmente an eine Trägeroberfläche erfolgt eine Detektionsreaktion, wobei der Markierungslabel des zweiten Primers beim Wildtyp entfernt ist, während man ihn bei der Mutante nachweisen kann. Dabei ist eine Vielzahl von Labeln möglich, die eine direkte oder indirekte Detektion erlauben. Damit steht ein schnelles Verfahren zum Nachweis von bestimmten Mutationen im Genom zur Verfügung, ohne auf aufwendige herkömmliche Methoden zurückgreifen zu müssen.

Description

Verfahren und Kit zur Detektion von Mutationen in DNA' s mit Hilfe von Restriktionsenzymen
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Detektion von Mutationen von DNA's, wobei eine DNA mittels einer PCR ampli- fiziert und die Amplikons mit einem oder mehreren Restriktionsenzymen geschnitten und detektiert werden, dadurch gekennzeichnet, daß zwei markierte Primer eingesetzt werden, wobei die Markierung der ersten Primer zur Bindung der Amplikons an einen oder mehrere Träger und die Markierung der zweiten Primer zur Detektion dient. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung einen Kit zur Durchführung des vorstehend bezeichneten Verfahrens, der dadurch gekennzeichnet ist, daß er zwei markierte Primer umfaßt. Im Zuge der Aufklärung des menschlichen Genoms zeigt sich die Bedeutung von Gendefekten bei der Entstehung einer Vielzahl von Erkrankungen. So liegen z.B. bei vielen Arten von Krebs, Mukoviszi- dose, Alzheimer und bei der Entwicklung von Thrombosen Veränderungen in der genetischen Information vor, die u.U. eine Krankheitsentstehung erst ermöglichen. In der medizinischen Diagnostik gewinnt deshalb die Detektion dieser Mutationen immer mehr an Gewicht .
Mutationen werden zur Zeit häufig mit Hilfe der Restriktionsanalyse detektiert. Dabei macht man sich Restriktionsenzyme zunutze, die doppelsträngige DNA sequenzspezifisch erkennen und an entsprechender Stelle schneiden können. Derzeit sind ca. 500 verschiedene Restriktionsenzyme mit über 100 unterschiedlichen Schnittstellen charakterisiert. Diese hohe Spezifität nutzt man zur Detektion der Defekte. Denn häufig liegt eine Mutation, die eine krankhafte Veränderung auslöst, im Bereich einer solchen Schnittstelle eines Enzyms. Durch die Mutation wird die Schnittstelle so verändert, daß der zu untersuchende Strang nicht geschnitten wird. In anderen Fällen entsteht durch eine Mutation erst eine mögliche Schnittstelle für ein Enzym, die vorher nicht vorhanden war .
Zur Standardanalyse wird die zu untersuchende genomische DNA einer Polymerase Kettenreaktion (PCR) unterworfen, mit deren Hilfe ein gewünschtes Stück DNA, auf dem die Mutation liegt, vervielfältigt werden kann. Dazu nutzt man sog. Primer, Sequenzstücke, die den Anfang und das Ende des amplifizierten Stückes DNA festlegen. Des weiteren benötigt man freie Nucleotide, Bausteine der DNA, und die Polymerase, ein Enzym, das die Bildung der zu unter- suchenden und zu vervielfältigenden DNA-Segmente katalysiert. Zum
Ablauf der PCR wird des weiteren ein Thermocycler benötigt, ein Gerät, das das benötigte Temperaturprofil für eine PCR-Reaktion verwirklicht .
Im Anschluß an die Vervielfältigung des zu untersuchenden Segmentes erfolgt der oben erwähnte Abbau mit Hilfe des Restriktionsen- zyms . Dieses schneidet die DNA je nach Mutation unter definierten Bedingungen sequenzspezifisch auf oder es kommt zu keinem Schnitt. Dieser Prozeß kann, je nach Konzentration des Enzyms, einige Stunden in Anspruch nehmen.
Zur Analyse des Produktes verwendet man bisher die Agarose-Gel- elektrophorese : In einer Pufferlösung wird dazu ein Agarosepoly- mer durch Erhitzen gelöst und nach einer Abkühlphase wird das gelierende Polysaccharid in eine Vorrichtung gegossen, in der die Elektrophorese durchgeführt werden soll . Ist das Gel vollständig abgekühlt, werden die Proben aufgetragen und unter Anlegen einer Potentialdifferenz kommt es zur größenabhängigen Wanderung der DNA-Fragmente in dem Agarosegel .
Die Sichtbarmachung der Fragmente gelingt z.B. unter Zugabe von fluoreszierenden Intercalaten, Substanzen, die sich in die DNA einlagern und unter UV-Licht sichtbar sind. Eine Mutation kann diagnostiziert werden, wenn im Gel eine spezifische Änderung des Restriktionsmusters erkennbar wird.
Zur Detektion einer Mutation dient daher neben der Vervielfältigung des relevanten DNA-Abschnitts eine aufwendige Durchführung von elektrophoretischen Methoden, verknüpft mit der Anfertigung von Gelen, Auftragen von Proben und entsprechender Wartezeit beim
Verlauf der Gelelektrophorese.
Diese Verfahren sind sehr zeitaufwendig, umständlich und damit teuer .
Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren und einen Kit zu entwickeln, mit dem (denen) die vorstehend beschriebenen Mutationsformen einfach, reproduzierbar und mit hohem Probendurchsatz nachgewiesen werden können, wobei die Nachteile einer Gelelektrophorese vermieden werden.
Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren zur Detektion von Mutationen von DNA' s gelöst, wobei eine DNA mittels einer PCR amplifi- ziert und die Amplikons mit einem oder mehreren Restriktionsen- zymen geschnitten und detektiert (analysiert) werden, welches Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, daß zwei markierte Primer eingesetzt werden und die Markierung der ersten Primer zur Bindung der Amplikons (vervielfältigte DNA-Segmente) an einen oder mehrere Träger und die Markierung der zweiten Primer zur Detektion (Analyse) dient.
Die bei diesem Verfahren eingesetzte PCR kann wie üblich durchgeführt werden, wobei als Primer die vorstehend bezeichneten Primer verwendet werden.
Vorzugsweise werden erfindungsgemäß solche Träger verwendet, die auch unter den Bedingungen einer PCR eine Bindung der ersten Primer ermöglichen. Als besonders vorteilhaft haben sich dabei Träger erwiesen, die eine aktivierte Oberfläche aufweisen, wie z.B. die entsprechend behandelte Oberfläche des Reaktionsgefäßes oder eine Mikrotiterplatte .
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren werden die ersten Primer vor, während oder nach der PCR teilweise oder vollständig an den Trägern fixiert, während die zweiten Primer vorzugsweise frei bzw. nicht an den Träger gebunden und gegebenenfalls im Überschuß in der Reaktionslösung vorliegen. Die Primer können der Reaktionslösung gleichzeitig oder nacheinander zugesetzt werden.
Die zweiten Primer sollen vorzugsweise Label aufweisen, die bei einer Detektion leicht durch übliche Verfahren nachgewiesen werden können .
Erfindungsgemäß können ein oder mehrere Restriktionsenzyme vor, während oder nach der Bindung der DNA-Segmente (Amplikons aus der PCR) an die Träger zugesetzt werden, wobei die Zugabe nach der Bindung bevorzugt wird. Erfindungsgemäß können die Restriktions- enzyme mit den Amplikons inkubiert werden.
Als Restriktionsenzyme können alle bekannten Restriktionsenzyme eingesetzt werden, wobei es natürlich von der zu schneidenden Sequenz abhängt, welche (s) Enzym (e) im konkreten Fall verwendet wird (werden) .
Nach der Bindung der Amplikons mittels der ersten Primer an geeignete Träger und vor und/oder nach dem Schneiden, bevorzugt nach dem Schneiden der Amplikons mit einem oder mehreren der vorstehend bezeichneten Restriktionsenzyme können die Amplikons mit einem geeigneten Spülmittel, wie z.B. gegebenenfalls entionisier- tem oder destilliertem Wasser, das gegebenenfalls Additive wie
Puffer enthält, gespült werden. Bei dem nach dem Schneiden erfolgenden Spülen werden geschnittene, nicht fixierte Segmente entfernt .
Erfindungsgemäß werden die Detektionsverfahren so ausgewählt, daß die jeweils gewählte Markierung (der Label) der zweiten Primer detektiert werden kann. Dabei kann die Detektion entsprechend der Markierung der zweiten Primer direkt oder indirekt erfolgen.
Es gibt eine Vielzahl von möglichen Verfahren der biochemischen Analytik, die aus der praktischen Anwendung bekannt sind:
1. Kopplung mit spektroskopisch direkt nachweisbaren Substanzen.
2. Markierung mit Enzymlabeln, die ihr Substrat in photochemisch detektierbare Substanzen umwandeln. Von Vorteil ist dabei die damit verbundene Verstärkung des Meßsignals.
Gemäß einer ersten Ausführungsform (s. Schema 1) wird zunächst eine Ampli izierung der DNA vorgenommen und die Amplikons dann an einen geeigneten Träger gebunden, wobei das Label am ersten Primer als Kopplungsmediator dient. Gegebenenfalls können die ersten Primer auch mehrere entsprechende Label aufweisen.
Gemäß einer zweiten Ausführungsform (s. Schema 2) der vorliegenden Erfindung werden die ersten Primer zunächst an einen geeigneten Träger wie an die Trägeroberfläche des Gefäßes gebunden, in dem die PCR-Reaktion abläuft. Dabei ist eine Kopplungsmethode zu wählen, die den Randbedingungen der PCR, wie z.B. der Temperaturstabilität, genügt. Die Reaktion läuft anschließend nach Stan- dardbedingungen, wobei der zweite Primer nicht an den Träger gebunden ist und im Verhältnis zum ersten Primer vorzugsweise im Überschuß vorliegt.
Während der Reaktion wird das gewünschte DNA-Segment in der Lösung gebildet, jedoch findet Hybridisierung und Amplifikation auch an der Oberfläche des Trägers statt, initiiert durch den gebundenen Primer. Man erhält nach Ende der PCR die gewünschten Produkte, die direkt am Träger gebunden sind. In einem Spül- schritt werden überschüssige PCR-Edukte (z.B. freie Nucleotide etc.) und nicht gebundene Produkte entfernt. Anschließend erfolgt die Spaltung des Segments durch das Enzym, gegebenenfalls ein weiterer Spülschritt und die wie vorstehend beschriebene Detektion .
Beispielsweise kann man beim Schema 1 mit Biotin labein. Im Schritt 3 dieses Schemas könnte man dann die Kopplung an den Träger, beispielsweise eine Mikrotiterplatte , über ein Biotin-bin- dendes Protein vornehmen, beispielsweise über Streptavidin oder Avidin, das auf der Trägeroberfläche adsorbiert oder kovalent gebunden würde, beispielsweise auf der Oberfläche der Wells der Miktrotiterplatte . Mit Streptavidin gecoatete Mikrotiterplatten sind im Handel erhältlich (Boehringer Mannheim) .
Bei Schema 2 könnte für Primer 1 eine kovalente Kopplung an den Träger vorgesehen werden, beispielsweise an einer Mikrotiterplatte. Dazu sind beispielsweise phosphorylierte Primer geeignet, die in einer Carbodiimid-Reaktion mit entsprechend aktivierten Trägern reagieren könnten. Ein Beispiel für geeignete funktioneile Gruppen des Trägers, beispielsweise der Mikrotiterplatten, wären Aminogruppen. Auch derartige Mikrotiterplatten sind im Handel erhältlich.
Bei Schema 1 und bei Schema 2 können die gleichen Label für Primer 2 verwendet werden. Beispiele dafür sind Fluorescein, Fluore- scein-Derivate , Rhodamin, Rhodamin-Derviate , Cy5 (Fluoreszenzfarbstoff) , Cy3 (Fluoreszenzfarbstoff) oder Verbindungen, die indirekt nachweisbar sind.
Fluoreszenzfarbstoffe: bei diesen Primern kann ein direkter anschließender Nachweis mit einem geeigneten Fluorimeter durchgeführt werden.
Digoxin: der indirekte Nachweis kann durch Zugabe eines (enzymmarkierten) Antikörpers geführt werden. Biotin: der indirekte Nachweis kann durch Zugabe eines Avi- din/Enzym-Konjugates geführt werden, beispielsweise durch Zugabe von Avidin bzw. Streptavidin.
Die Bindung des jeweiligen Erkennungsproteins (Antikörper bzw. (Strept) Avidin) kann entweder wie bei sonstigen Mikrotiterplat- ten-Assays üblich, über Zugabe geeigneter Enzymsubstrate nachgewiesen werden, wobei Peroxidase oder alkalische Phosphatase geeignete Enzyme darstellen (Enzymreaktion liefert farbige Produkte) , oder aber sie kann dann, wenn die Kopplung nicht an Mikrotiterplatten, sondern auf geeignete Meßfühler erfolgt, direkt verfolgt werden. Als geeignete Meßfühler können beispielsweise planare Wellenleiter genannt werden, wie sie aus der Biosensorik bekannt sind, und an denen die gleichen Kopplungsreaktionen mit Hilfe von Primer 1 durchgeführt werden können, wie sie vorstehend für Miktrotiterplatten beschrieben worden sind. Erfindungsgemäß kann die zu untersuchende DNA als Wildtyp oder als Mutante eine Schnittstelle aufweisen.
a) Die Schnittstelle liegt bei intakter DNA (Wildtyp) vor:
Tritt eine Mutation in dem relevanten Bereich der DNA auf, wird die Schnittstelle in dem gewählten Beispiel entfernt. Eine Punktmutation reicht dabei aus, um zu verhindern, daß das Enzym das Segment spezifisch erkennt und schneidet . Durch einen Spülschritt können vor der eigentlichen Detektion das Restriktionsenzym, PCR- Edukte und gegebenenfalls abgetrennte PCR-Produkte, die das nachweisbare Label enthalten, entfernt werden.
Im Detektionsschritt wird analysiert, ob das Label vorhanden ist oder nicht. Liegt eine Mutation vor, ist das detektierbare Label vorhanden und man erhält je nach gewählter Markierung eine Reaktion. Im Falle einer Enzymmarkierung würde man z.B. eine katalysierte Farbreaktion beobachten. Liegt keine Mutation vor, kann das Enzym spezifisch schneiden und das Label wird entfernt. Man erhält kein detektierbares Signal.
b) Die Schnittstelle liegt bei mutierter DNA vor:
Tritt eine Mutation in dem relevanten Bereich der DNA auf, wird die Schnittstelle in dem gewählten Beispiel erzeugt. Eine Punkt - mutation kann dabei ausreichen, daß das Enzym das Segment spezifisch erkennt und schneidet. Durch einen Spülschritt können vor der eigentlichen Detektion das Restriktionsenzym, PCR-Edukte und gegebenenfalls abgetrennte PCR-Produkte, die das nachweisbare La¬ bel enthalten, entfernt werden. Im Detektionsschritt wird analysiert, ob das Label vorhanden ist oder nicht. Liegt eine Mutation vor, ist das detektierbare Label nicht vorhanden und man erhält keine Reaktion. Liegt keine Mutation vor, kann das Enzym nicht schneiden und das Label wird auch nicht entfernt. Man erhält ein detektierbares Signal.
Die Erfindung wird nachfolgend anhand der Abbildungen für den Fall a) erläutert :
Schema 1 verdeutlicht den Ablauf des ersten, erfindungsgemäßen Assayaufbaus . Fig. 1 zeigt die Amplifizierung des Targets mit Hilfe der markierten Primer. Die PCR wird in dafür geeigneten Behältnissen durchgeführt. Fig. 2 zeigt die PCR-Reaktionsprodukte, die mit Labein markiert sind. Das eine Ende der Reaktionsprodukte weist eine Markierung auf, die der späteren Bindung an eine Trägeroberfläche dient und das Label an dem anderen Ende dient der Detektion. Die gesuchte Sequenz, die eine potentielle Mutation enthalten kann, befindet sich innerhalb der amplifizierten Segmente .
Fig. 3 zeigt die Bindung der Segmente, ermöglicht durch die erste Markierung; in Fig. 4 wird durch Einwirkung eines Restriktionsenzyms untersucht, ob die Schnittstelle dieses Enzyms durch eine Mutation entfernt wurde oder nicht. Ist eine Mutation vorhanden, wie in Fig. 5 dargestellt, entfällt die Schnittstelle und die de- tektierbaren Label werden nicht entfernt. Liegt keine Mutation vor, kann das Enzym schneiden. Durch einen einfachen Waschschritt wird das abgetrennte Segment entfernt und man erhält folglich kein Signal am gebundenen Teil des Segments. Schema 2 demonstriert den zweiten, erfindungsgemäßen Aufbau des Assays. Fig. 1 zeigt, daß ein Teil des ersten Primers, der zur Bindung an die Trägeroberfläche dient, bereits vor Beginn der PCR gebunden vorliegt. Der zweite Primer, der detektierbar ist, liegt in der Lösung im Überschuß vor. Fig. 2 deutet an, daß nach beendeter PCR-Reaktion das Amplikon, das die zu untersuchende Sequenz enthält, oberflächenfixiert vorliegt. Anschließend wird in dasselbe Restriktionsenzym addiert (Fig. 3), welches, wie oben beschrieben, den Wildtyp schneidet, die Mutationssequenz jedoch nicht. In Fig. 4 ist das Ergebnis des durchgeführten Assays verdeutlicht. Nach einem Waschschritt (nicht gezeigt) ist das detek- tierbare Label im Falle einer Mutation noch am fixierten Segment vorhanden. Beim Wildtyp erhält man jedoch kein Signal, da das Enzym aufgrund der vorhandenen Schnittstelle schneiden und als Folge dessen das abgetrennte, gelabelte Segment durch einen Waschschritt entfernt werden kann.
Erfindungsgemäß wird ein Kit zur Durchführung der vorstehend offenbarten Verfahren bereitgestellt, der dadurch gekennzeichnet ist, daß er zwei markierte Primer umfaßt, wobei er vorzugsweise zusätzlich freie Nukleotide und eine Polymerase enthält.
Dabei ist der erste Primer zur Bindung von PCR-Reaktionsprodukten an einen oder mehrere Träger geeignet und dient der zweite Primer der Detektion, wobei der Träger vorzugsweise eine aktivierte Oberfläche umfaßt .
Das erfindungsgemäße Verfahren und der erfindungsgemäße Kit weisen folgende Vorzüge gegenüber dem Stand der Technik auf : - die beschriebenen Ausführungsformen ermöglichen eine Zeitersparnis gegenüber der gelelektrophoretischen Detektion. Besonders die zweite Ausführungsform weist Vorteile auf, da die PCR und die Analyse der Produkte in einem Behälter ablaufen. Damit ist kein Umpipettieren mehr nötig; die Handhabung der Proben wird vereinfacht und damit verknüpfte Fehlerquellen ausgeschaltet.
- Je nach Wahl des nachzuweisenden Labels erfolgt die Detektion der Mutation sofort nach der Spaltung durch das Enzym und nicht erst nach erfolgter Gelelektrophorese .
- In der klinischen Anwendung von Testverfahren hat man es häufig mit einem hohen Probenaufkommen zu tun. Der Aufwand zur Durchführung von Gelelektrophoresen zur Bewältigung der Probenmenge ist entsprechend groß. Da die neue Methode gänzlich im Mikrotiter- plattenformat durchführbar ist, können in vorteilhafter Weise z.B. 96 bzw. 384 Proben parallel vermessen werden.
- Bei der Gelelektrophorese arbeitet man mit toxischen DNA-Einlagerungsverbindungen, auf die bei der neuen Methode gänzlich verzichtet werden kann.
Beispiel 1
Die Mutation im Protein Faktor V wird für ein erhöhtes Thrombose- Risiko verantwortlich gemacht, da sie den Abbau des Glykoproteins Faktor V durch die Serinprotease APC (aktiviertes Protein C) inhibiert. Der menschliche Faktor V ist ein Glykoprotein von 330 kDa, das mit APC spezifische Wechselwirkungen eingeht und normalerweise von APC an einer ganz bestimmten Stelle in der Sequenz gespalten wird: beim menschlichen Protein hinter Arg 506 (Arginin als 506. Aminosäure im Protein) . Bei Sequenzuntersuchungen im zugehörigen Gen wurde gefunden, daß in der Nukleotidse- quenz der Austausch von 1,691 G (G = Guanin) gegen A (Adenin) mit einem erhöhten Thrombose-Risiko korreliert. Diese Mutation führt dazu, daß in dem Protein das Arg 506 (Produkt der Nukeotidsequenz CGA) durch Glutamin (Gin als Produkt der Nukleotidsequenz CAA) ersetzt ist und damit die oben beschriebene Spaltung durch die Protease nicht mehr stattfindet. Zum Nachweis dieser Mutation werden Primer verwendet, mit denen über eine PCR-Reaktion ein Bereich des Gens vervielfältigt wird, der die entsprechende Nukleotidsequenz umfaßt. Dabei wurden zum Beispiel Fragmente von 267 Basenpaaren Länge erhalten. Durch Behandlung mit dem Restriktionsenzym Mnl l entstehen daraus 3 Fragmente mit von 67, 37 und 163 Basenpaaren (bp) , wenn an der Stelle 1,691 Guanin vorliegt, da das Enzym aufgrund seiner Sequenzspezifität an 2 Stellen eine Spaltung des Genfragmentes durchführen kann (nach 67 bp und nach weiteren 37 bp) . Bei Vorliegen der Mutation zu Adenin entfällt die zweite Spaltstelle, so daß nur noch zwei Spaltprodukte beobachtet werden (67 bp und 200 bp Länge) , da durch die Mutation sich die Sequenz so geändert hat, daß das verwendete Enzym nicht mehr wirken kann. Der Nachweis der verschiedenen Fragmente erfolgt mit Hilfe der Gelelektrophorese. Diese Informationen wurden im wesentlichen der Publikation von R.M. Bertina et al . , Mutation in blood coagulation factor V associated with resistance to acti- vated protein C, Nature, 369, 1994, 64-67 entnommen.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Detektion von Mutationen von DNA_s , wobei eine DNA mittels einer PCR amplifiziert und die Amplikons mit einem oder mehreren Restriktionsenzymen geschnitten und detektiert werden, dadurch gekennzeichnet, daß zwei markierte Primer eingesetzt werden, wobei die Markierung der ersten Primer zur Bindung der Amplikons an einen oder mehrere Träger und die Markierung der zweiten Primer zur Detektion dient.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Träger verwendet werden, an die die ersten Primer auch unter den Bedingungen einer PCR gebunden werden können.
3. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Träger eine aktivierte Oberfläche aufweisen.
4. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die ersten Primer vor, während oder nach der PCR teilweise oder vollständig an den Trägern fixiert werden und die zweiten Primer gegebenenfalls frei in der Reaktionslösung vorliegen.
5. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß ein oder mehrere Restriktionsenzyme vor, während oder nach der Bindung der Amplikons an die Träger zugesetzt werden.
6. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Restriktionsenzyme mit den Amplikons inkubiert werden.
7. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß nach dem Schneiden mit den Restriktionsenzymen gegebenenfalls gespült wird und die Markierungen der zweiten Primer detektiert werden.
8. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Detektionsverfahren entsprechend der Markierung der zweiten Primer ausgewählt wird.
9. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß zunächst eine Amplifizierung und dann eine Bindung der Amplikons an einen geeigneten Träger durchgeführt wird.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß zunächst die ersten Primer an einen geeigneten Träger gebunden und dann mit dem zweiten Primer eine Amplifizierung der DNA durchgeführt wird.
11. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Detektion entsprechend der Markierung der zweiten Primer direkt oder indirekt erfolgen kann.
12. Kit zur Durchführung eines Verfahrens nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß er zwei markierte Primer umfaßt .
13. Kit nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß er zusätzlich freie Nukleotide, eine Polymerase und mindestens ein Restriktionsenzym umfaßt.
14. Kit nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die ersten Primer zur Bindung von PCR-Reaktionsprodukten an einen oder mehrere Träger geeignet sind und die zweiten Primer der Detektion dienen.
15. Kit nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß er einen geeigneten Träger, vorzugsweise mit einer aktivierten Oberfläche umfaßt.
16. Verwendung eines Kits nach einem der Ansprüche 11 bis 15 zur Detektion von Mutationen.
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