WO1998045472A1 - Technique de criblage d'inhibiteurs de l'activite d'une enzyme de deamination - Google Patents

Technique de criblage d'inhibiteurs de l'activite d'une enzyme de deamination Download PDF

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WO1998045472A1
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Itzik Harosh
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
    • C12Q1/52—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase involving transaminase

Definitions

  • the present invention relates to a technique for detecting the deamination of a cytidine in an RNA or a DNA (for example a single-stranded mRNA, or double-stranded viral RNA, etc.).
  • This technique is based on knowledge of the local sequence of RNA or DNA containing the deaminated site.
  • This sequence is used to create a primer oligonucleotide (DNA or RNA) just 3 'from the deaminated site (stopping 3' from the deaminated site at a site such that the intermediate sequence contains only one, two or three types of nucleotides).
  • This primer is marked for example at or near the 5 ′ end, in particular by incorporation of modified nucleotides (biotinilized, radiolabelled, fluorescent, etc.), or by chemical modification of this end, so that said end can be detected, either by chemical, biochemical or other reaction, in particular with a substrate, or by detection of fluorescence, radioactivity, etc.
  • modified nucleotides biotinilized, radiolabelled, fluorescent, etc.
  • An example of such a detection system is given by the SPA® system (Scintillation Proximity Assay) coupled to DNA primers, marketed by Amersham.
  • This primer is hybridized with the RNA or DNA to be studied in the presence of Reverse Transcriptase (in the case of RNA / DNA hybridization), of RNA polymerase (in the case of RNA / RNA hybridization) or of DNA polymerase ( DNA / DNA hybridization) and modified adenine.
  • Reverse Transcriptase in the case of RNA / DNA hybridization
  • RNA polymerase in the case of RNA / RNA hybridization
  • DNA polymerase DNA / DNA hybridization
  • modified guanine for example biotinilated, radiolabelled, fluorescent, etc.
  • An exemplary embodiment of such a system will consist of a primer containing one or more digoxygenated nucleotide (s) at or near its 5 ′ end, and in which the incorporated nucleotide will be biotinilated.
  • the primer + incorporated nucleotide assembly extended primer
  • streptavidin which will be rinsed to remove the non-extended primers, and revealed by a standard ELISA technique (see FIG. 1).
  • the symmetrical system, where the incorporated nucleotide is digoxygenated, and the 5 'biotinilated end will also be used advantageously. It will also be possible, instead of marking, for example, the 5 ′ end of the primer used, to mark the DNA or the RNA studied containing the nucleotide capable of being deaminated (see FIG. 2).
  • the present invention also relates to a technique allowing the detection of the deamination of methylated cytidine (5 mC) in RNA or DNA.
  • This technique is based on knowledge of the local sequence of RNA or DNA containing the deaminized site. This sequence is used to create a primer oligonucleotide (DNA or RNA) just 3 'from the deaminated site (stopping at 3 '' from the deaminated site to a site such that the intermediate sequence does has only one, two or three types of nucleotides) (see Figure 1).
  • This primer is marked, for example, at or near the 5 'end, in particular by incorporating one to three modified nucleotide (s) (biotinilized, radiolabelled, fluorescent, etc.), or by chemical modification of this end. , so that said end can be detected, either by chemical, biochemical or other reaction, in particular with a substrate, or by detection of fluorescence, radioactivity, etc.
  • s modified nucleotide
  • An example of such a detection system has already been cited above.
  • This primer is hybridized with the RNA or DNA to be studied in the presence of Reverse Transcriptase (in the case of RNA / DNA hybridization), of RNA polymerase (in the case of RNA / RNA hybridization) or of DNA polymerase ( DNA / DNA hybridization) and modified adenine.
  • Reverse Transcriptase in the case of RNA / DNA hybridization
  • RNA polymerase in the case of RNA / RNA hybridization
  • DNA polymerase DNA / DNA hybridization
  • modified guanine for example biotinilated, radiolabelled, fluorescent, etc.
  • the reaction products are brought into the presence of the revelation system, either modified nucleotides to be incorporated, or primer ends, in order to detect and / or quantify the incorporation of the modified nucleotides.
  • An exemplary embodiment of such a system will consist of a primer containing one or more digoxygenated nucleotide (s) at or near its 5 ′ end, and in which the incorporated nucleotide will be biotinilated. After incorporation, the incorporated primer + nucleotide assembly (extended primer) will be trapped in a well treated with streptavidin, which will be rinsed to remove the non-extended primers, and revealed by a standard ELISA technique.
  • the symmetrical system where the incorporated nucleotide is digoxygenated, and the 5 'biotinilated end will also be used advantageously. It will also be possible, instead of marking, for example, the 5 ′ end of the primer used, marking the DNA or RNA studied containing the nucleotide capable of being deaminated.
  • This invention relates to a kit for detecting the deamination of an RNA or a DNA containing at least one of the following elements: a) a labeled RNA or DNA primer, b) one to three labeled nucleotides, c) the reagents and media necessary for the extension of the primer, d) a system for detecting the incorporation of the labeled nucleotides.
  • the present invention describes a rapid method for screening for molecules having an inhibitory influence on the deaminase activity of an enzyme acting on a specific RNA (respectively on a DNA) and a device making it possible to implement it.
  • This method (see Figures 1 and 2) consists in the use of an RNA (respectively DNA) substrate containing the minimum sequence around the deaminated cytosine necessary for the observation of normal activity of the enzyme. deaminase.
  • DNA (or RNA) primers allowing the implementation of the technique described above for detecting the deamination of a cytidine in an RNA (respectively in a DNA) for the cytosine studied, and modified nucleotides (adenine for the detection of deamination, guanine for that of a non-deamination), plus one or more molecules or products whose inhibitory influence is to be tested.
  • the present invention also relates to all the molecules or products having an inhibitory influence on the activity of said enzyme or of the associated proteins, discovered by one of the techniques described in this invention.
  • This invention is particularly applicable to the screening of molecules inhibiting the deamination activity of apobec-1, or the activity of associated proteins (Shah RR et al (1991) J. Biol. Chem., 16301-16304, Davies MS et al (1989) J. Biol. Chem., 13395-13398), susceptible of therapeutic use in the case of atherosclerosis and obesity, and other diseases characterized in particular by a level of chylomicrons and / or of VLDL in the plasma higher than normal (hyperlipidemia, such as for example hypercholesterolemia, hypertriglyceridemia, etc.) and / or by hyperglicemia.
  • hyperlipidemia such as for example hypercholesterolemia, hypertriglyceridemia, etc.
  • the deamined cytidine studied is here cytidine at position 6666 of the apoB mRNA, the RNA sequence used as substrate containing the anchoring zone of apobec-1 or associated proteins is as described in the literature ( Shah RR et al (1991) J. Biol. Chem., 16301-16304, Davies MS et al (1989) J. Biol. Chem., 13395-13398) (noted AR-Nm anchoring sequence of apoB), and the protein extracts used may come from rat liver or other sources.
  • sequence used as a primer in the implementation of the technique contains a number of nucleotides complementary to the 3 'sequence of the 6666 site of the apoB mRNA sufficient for correct hybridization (at least equal to 14 nucleotides).
  • This invention therefore relates to a technique for detecting the deamination of cytidine at position 6666 of apoB mRNA as previously described, and to a kit for detecting deamination of an RNA comprising the anchoring sequence of the ApoB mRNA, containing at least one of the following: a) a labeled RNA or DNA primer, b) one to three labeled nucleotides, c) the reagents and media necessary for the extension of the primer, d) a system for detecting the incorporation of the labeled nucleotides.
  • the present invention also describes a rapid technique for screening for molecules having an inhibitory influence on the deaminase activity of apobec-1 which is based on the technique for detecting the specific deamination of an RNA described above, in which an RNA substrate containing the ApoB mRNA anchor sequence.
  • DNA (or RNA) primers allowing the implementation of the technique described above for detecting deamination of a cytidine in a RNA for the cytidine studied, and modified nucleotides (adenine for the detection of deamination, guanine for that of non-deamination), plus one or more molecules or products whose inhibitory influence on activity is to be tested apobec-1 deaminase.
  • the present invention relates to all molecules or products having an inhibitory influence on the deaminase activity of apobec-1, or associated proteins, discovered by one or more of the techniques described in this invention.
  • Figure 1 Screening for inhibitors of the deaminase activity of an enzyme using a deamination detection technique.
  • the technique involves a synthetic RNA sequence containing the anchor sequence (approximately 50 nucleotides in the case of apobec-1). After incubation with the inhibitors tested in the presence of the enzyme in the necessary medium, a primer complementary to the sequence 3 'to the deaminated site of the RNA is added, the 5' end of which is for example labeled with 1 using one or more modified (for example digoxygenated) nucleotides under hybridization conditions.
  • modified (for example digoxygenated) nucleotides under hybridization conditions.
  • the enzyme Reverse Transcriptase and modified nucleotides are then added, for example biotinilized (only biot-dGTP in the illustrated example).
  • biotinilized only biot-dGTP in the illustrated example.
  • no incorporation takes place.
  • activity of the inhibitor no deamination
  • the incorporation of a biotinilated nucleotide takes place. It is therefore possible to trap the elongated primers of a biotinilated nucleotide on a support covered with streptavidin, and to reveal the presence of digoxygenin by an anti-digoxygenin system followed by an ELISA reaction.
  • Figure 2 Screening for inhibitors of the deaminase activity of an enzyme using a deamination detection technique.
  • the technique involves a synthetic RNA sequence containing the anchoring sequence (approximately 50 nucleotides in the case of apobec-1) coupled to a SPA® bead.
  • a primer complementary to the sequence 3 'to the deaminated site of the RNA is added under hybridization conditions.
  • the enzyme Reverse Transcriptase and radiolabeled nucleotides are then added (only d 3 HGTP in the example shown).
  • no incorporation takes place and the detected signal is indistinguishable from the background noise.
  • inhibitor activity no deamination
  • the incorporation of a radiolabelled nucleotide takes place, and a signal is detected.
  • Example 1 technique for screening molecules capable of inhibiting the deaminase activity of apobec- 1 using a colored ELISA development system.
  • the example uses a synthetic RNA sequence containing the apobec anchor sequence 1 (approximately 50 nucleotides (Shah RR et al (1991) J. Biol. Chem., 16301-16304, Davies MS et al (1989 ) J. Biol. Chem., 13395-13398)) arranged in a 96-well plate.
  • a primer complementary to the sequence 3 'to the deaminated site of the RNA is added, the 5' end of which is for example previously labeled with using one (or more) digoxygenated nucleotide (s) (dig 1 1-dUTP, sold by the company Boehringer Mannheim) under hybridization conditions.
  • the enzyme Reverse Transcriptase and modified nucleotides are then added, for example biotinilized (biot-dGTP, in the example illustrated in FIG. 1) available either commercially, or achievable without difficulty using biotinilation kits (marketed by example by the company Sigma).
  • the revelation of the presence of digoxygenine is then carried out using an anti-digoxygenine antibody system followed by an ELISA reaction, for example antidig-alkaline-phosphatase revealed by reaction with nitroblue tetrazolium salts (NBT ).
  • NBT nitroblue tetrazolium salts
  • the digoxygenin systems and corresponding antibodies are sold, for example, by the company Boehringer Mannheim.
  • Example 2 technique for screening molecules capable of inhibiting the deaminase activity of apobec- 1 using the SPA® system.
  • the example uses a synthetic RNA sequence containing the apobec anchor sequence 1 (approximately 50 nucleotides (Shah RR et al (1991) J. Biol. Chem., 16301-16304, Davies MS et al (1989 ) J. Biol. Chem., 13395-13398)) coupled to a SPA® bead (system marketed by the company Amersham) placed in a 96-well plate.
  • a synthetic RNA sequence containing the apobec anchor sequence 1 approximately 50 nucleotides (Shah RR et al (1991) J. Biol. Chem., 16301-16304, Davies MS et al (1989 ) J. Biol. Chem., 13395-13398)
  • a SPA® bead system marketed by the company Amersham
  • a primer complementary to the sequence 3 'to the deaminated site of the RNA is added in hybridization conditions (Maniatis T et al (1982) Molecular Cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor, NY).
  • a reverse transcriptase enzyme and radiolabeled nucleotides are then added (only from HGTP in the example illustrated in FIG. 2). In this case, it would also be possible to use additional HTTP.
  • deamination that is to say a normal activity of the apobec-1 enzyme, no incorporation takes place and the detected signal, due to the proximity scintillation of the SPA beads, is not distinguished from the noise background.
  • the deamination activity by apobec-1 is reduced, making it possible to incorporate a radiolabelled nucleotide (or two if d 3 HTTP is also used) at the 3 ′ end part of the hybridized primers.
  • a scintillation signal can be detected which differs from the background noise.

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Abstract

La présente invention concerne une technique permettant le criblage sensible, efficace et rapide de molécules susceptibles d'inhiber l'activité déaminase d'une enzyme au niveau d'une cytidine ou d'une cytidine méthylée en position 5 dans un ARN ou un ADN (schéma).

Description

Technique de criblage d'inhibiteurs de l'activité d'une enzyme de déamination.
La présente invention concerne une technique de détection de la déamination d'une cytidine dans un ARN ou un ADN (par exemple un ARNm simple brin, ou ARN viral double brin, etc.). Cette technique repose sur la connaissance de la séquence locale de l'ARN ou de l'ADN contenant le site déaminé. Cette séquence est utilisée pour créer un oligonucléotide amorce (ADN ou ARN) juste en 3' du site déaminé (s'arrêtant en 3' du site déaminé à un site tel que la séquence intermédiaire ne comporte qu'un, deux ou trois types de nucléotides). Cette amorce est marquée par exemple à l'extrémité 5' ou à proximité, notamment par incorporation de nucléotides modifiés (biotinilés, radiomarqués, fluorescents, etc.), ou par modification chimique de cette extrémité, de façon à ce que ladite extrémité puisse être détectée, soit par réaction chimique, biochimique ou autre, notamment avec un substrat, soit par détection de fluorescence, radioactivité, etc. Un exemple d'un tel système de détection est donné par le système SPA® (Scintillation Proximity Assay) couplé à des amorces d'ADN, commercialisé par Amersham.
Cette amorce est hybridée avec l'ARN ou l'ADN à étudier en présence de Reverse Transcriptase (cas d'une hybridation ARN/ ADN), d'ARN polymérase (cas d'une hybridation ARN/ ARN) ou d'ADN polymérase (cas d'une hybridation ADN/ADN) et d'adénine modifiée. Dans le cas où le site étudié est déaminé (cas normal: non déaminé), un à trois nucléotides seront ajoutés à chaque amorce hybridée à un ARN ou ADN déaminé. Inversement, pour détecter l'absence de déamination d'un site (cas normal: déaminé), on utilisera de la guanine modifiée (par exemple biotinilée, radiomarquée, fluorescente, etc.).
Après extension des amorces, celles-ci seront dénaturées et mises en présence du système de révélation, soit des nucléotides modifiés à incorporer, soit des extrémités d'amorce, afin de détecter et/ou quantifier l'incorporation des nucléotides modifiés.
Un exemple de réalisation d'un tel système consistera en une amorce contenant un ou plusieurs nucléotide(s) digoxygéné(s) à son extrémité 5' ou à proximité, et dans lequel le nucléotide incorporé sera biotinilé. Après incorporation, l'ensemble amorce+nucléotide incorporé (amorce étendue) sera piégé dans un puits traité à la streptavidine, qui sera rincé pour éliminer les amorces non-étendues, et révélé par une technique standard d'ELISA (voir figure 1). Le système symétrique, où le nucléotide incorporé est digoxygéné, et l'extrémité 5 ' biotinilée sera utilisé aussi avantageusement. On pourra également, au lieu de marquer par exemple l'extrémité 5' de l'amorce utilisée, marquer l'ADN ou l'ARN étudié contenant le nucléotide susceptible d'être déaminé (voir figure 2).
La présente invention concerne aussi une technique permettant la détection de la déamination de cytidine méthylée (5mC) dans un ARN ou un ADN. Cette technique repose sur la connaissance de la séquence locale de l'ARN ou de l'ADN contenant le site déaminé Cette séquence est utilisée pour créer un oligonucléotide amorce (ADN ou ARN) juste en 3' du site déaminé (s'arrêtant en 3' du site déaminé à un site tel que la séquence intermédiaire ne comporte qu'un, deux ou trois types de nucléotides) (voir figure 1). Cette amorce est marquée par exemple à l'extrémité 5' ou à proximité, notamment par incorporation d'un à trois nucléotide(s) modifié(s) (biotinilé, radiomarqué, fluorescent, etc.), ou par modification chimique de cette extrémité, de façon à ce que ladite extrémité puisse être détectée, soit par réaction chimique, biochimique ou autre, notamment avec un substrat, soit par détection de fluorescence, radioactivité, etc. Un exemple d'un tel système de détection a déjà été cité précédemment.
Cette amorce est hybridée avec l'ARN ou l'ADN à étudier en présence de Reverse Transcriptase (cas d'une hybridation ARN/ADN), d'ARN polymérase (cas d'une hybridation ARN/ARN) ou d'ADN polymérase (cas d'une hybridation ADN/ADN) et d'adénine modifiée. Dans le cas où le site étudié est déaminé (cas normal: non déaminé), un nucléotide (au moins) sera ajouté à chaque amorce hybridée. Inversement, pour détecter l'absence de déamination d'un site (cas normal: déaminé), on utilisera de la guanine modifiée (par exemple biotinilée, radiomarquée, fluorescente, etc.).
Après extension des amorces, les produits de la réaction sont mis en présence du système de révélation, soit des nucléotides modifiés à incorporer, soit des extrémités d'amorce, afin de détecter et/ou quantifier l'incorporation des nucléotides modifiés.
Un exemple de réalisation d'un tel système consistera en une amorce contenant un ou plusieurs nucléotide(s) digoxygéné(s) à son extrémité 5' ou à proximité, et dans lequel le nucléotide incorporé sera biotinilé. Après incorporation, l'ensemble amorce+nucléotide incorporé (amorce étendue) sera piégé dans un puits traité à la streptavidine, qui sera rincé pour éliminer les amorces non-étendues, et révélé par une technique standard d'ELISA. Le système symétrique, où le nucléotide incorporé est digoxygéné, et l'extrémité 5' biotinilée sera utilisé aussi avantageusement. On pourra également, au lieu de marquer par exemple l'extrémité 5' de l'amorce utilisée, marquer l'ADN ou l'ARN étudié contenant le nucléotide susceptible d'être déaminé.
Cette invention porte sur un kit de détection de déamination d'un ARN ou d'un ADN contenant l'un au moins des éléments suivants: a) une amorce ARN ou ADN marquée, b) un à trois nucléotides marqués, c) les réactifs et milieux nécessaires à l'extension de l'amorce, d) un système de détection de l'incorporation des nucléotides marqués.
La présente invention décrit une méthode rapide de criblage de molécules ayant une influence inhibitrice sur l'activité déaminase d'une enzyme agissant sur un ARN (respectivement sur un ADN) spécifique et un dispositif permettant de la mettre en œuvre. Cette méthode (voir figures 1 et 2) consiste en l'utilisation d'un substrat d'ARN (respectivement d'ADN) contenant la séquence minimale autour de la cytosine déaminée nécessaire à l'observation d'une activité normale de l'enzyme déaminase. A ce substrat est ajouté un extrait brut de protéines de cellules dans lesquelles a lieu cette activité, des amorces d'ADN (ou d'ARN) permettant la mise en œuvre de la technique décrite précédemment de détection de déamination d'une cytidine dans un ARN (respectivement dans un ADN) pour la cytosine étudiée, et des nucléotides modifiés (adénine pour la détection d'une déamination, guanine pour celle d'une non-déamination), plus une ou plusieurs molécules ou produits dont on veut tester l'influence inhibitrice.
La présente invention concerne également toutes les molécules ou produits ayant une influence inhibitrice sur l'activité de ladite enzyme ou des protéines associées, découverts par une des techniques décrites dans cette invention.
Cette invention s'applique notamment au criblage de molécules inhibitrices de l'activité de déamination d'apobec-1, ou de l'activité des protéines associées (Shah RR et al (1991) J . Biol. Chem., 16301-16304, Davies MS et al (1989) J. Biol. Chem., 13395-13398), susceptibles d'usage thérapeutique dans le cas de l'athérosclérose et de l'obésité, et autres maladies caractérisées notamment par un niveau de chylomicrons et/ou de VLDL dans le plasma supérieur à la normale (hyperlipidémies, comme par exemple hypercholestérolémie, hypertriglycéridémie, etc) et/ou par une hyperglicémie.
La cytidine déaminée étudiée est ici la cytidine en position 6666 de l'ARNm d'apoB, la séquence d'ARN utilisée comme substrat contenant la zone d'ancrage d'apobec-1 ou des protéines associées est telle que décrit dans la littérature (Shah RR et al (1991) J. Biol. Chem., 16301-16304, Davies MS et al (1989) J. Biol. Chem., 13395-13398) (notée séquence d'ancrage de l'AR-Nm d'apoB), et les extraits de protéines utilisés pourront provenir de foie de rat ou d'autres sources. La séquence utilisée comme amorce dans la mise en œuvre de la technique contient un nombre de nucléotides complémentaires de la séquence en 3' du site 6666 de l'ARNm d'apoB suffisant pour une hybridation correcte (au moins égal à 14 nucléotides).
Cette invention porte donc sur une technique de détection de la déamination de la cytidine en position 6666 de l'ARNm d'apoB comme précédemment décrit, et sur un kit de détection de déamination d'un ARN comportant la séquence d'ancrage de l'ARNm d'apoB, contenant l'un au moins des éléments suivants: a) une amorce ARN ou ADN marquée, b) un à trois nucléotides marqués, c) les réactifs et milieux nécessaires à l'extension de l'amorce, d) un système de détection de l'incorporation des nucléotides marqués.
La présente invention décrit aussi une technique rapide de criblage de molécules ayant une influence inhibitrice sur l'activité déaminase d'apobec-1 qui repose sur la technique de détection de la déamination spécifique d'un ARN décrite précédemment, dans laquelle on utilise un substrat d'ARN contenant la séquence d'ancrage de l'ARNm d'ApoB. A ce substrat est ajouté un extrait brut de protéines de cellules dans lesquelles a lieu cette activité, des amorces d'ADN (ou d'ARN) permettant la mise en œuvre de la technique décrite précédemment de détection de déamination d'une cytidine dans un ARN pour la cytidine étudiée, et des nucléotides modifiés (adénine pour la détection d'une déamination, guanine pour celle d'une non-déamination), plus une ou plusieurs molécules ou produits dont on veut tester l'influence inhibitrice sur l'activité déaminase d'apobec-1.
La présente invention concerne toutes les molécules ou produits ayant une influence inhibitrice sur l'activité déaminase d'apobec-1, ou des protéines associées, découverts par une ou plusieurs des techniques décrites dans cette invention.
LEGENDES DES FIGURES:
Figure 1 : Criblage d'inhibiteurs de l'activité déaminase d'une enzyme à l'aide d'une technique de détection d'une déamination. Exemple d'apobec-1 et technique utilisant un sytème d'ELISA. La technique met en jeu une séquence d'ARN synthétique contenant la séquence d'ancrage (environ 50 nucléotides dans le cas d'apobec-1). Après l'incubation avec les inhibiteurs testés en présence de l'enzyme dans le milieu nécessaire, on ajoute une amorce complémentaire de la séquence en 3' du site déaminé de l'ARN, dont l'extrémité 5' est par exemple marquée à l'aide d'un ou plusieurs nucléotides modifiés (par exemple digoxygénés) dans des conditions d'hybridation. On ajoute alors l'enzyme Reverse Transcriptase et des nucléotides modifiés, par exemple biotinilés (uniquement biot-dGTP dans l'exemple figuré). En cas de déamination, aucune incorporation n'a lieu. En cas d'activité de l'inhibiteur (pas de déamination), l'incorporation d'un nucléotide biotinilé a lieu. Il est donc possible de piéger les amorces allongées d'un nucléotide biotinilé sur un support couvert de streptavidine, et de révéler la présence de digoxygénine par un sytème d'anti-digoxygénine suivi d'une réaction ELISA.
Figure 2: Criblage d'inhibiteurs de l'activité déaminase d'une enzyme à l'aide d'une technique de détection d'une déamination. Exemple d'apobec-1 et technique utilisant le système SPA®. La technique met en jeu une séquence d'ARN synthétique contenant la séquence d'ancrage (environ 50 nucléotides dans le cas d'apobec-1) couplée à une bille SPA®. Après l'incubation avec les inhibiteurs testés en présence de l'enzyme dans le milieu nécessaire, on ajoute une amorce complémentaire de la séquence en 3' du site déaminé de l'ARN dans des conditions d'hybridation. On ajoute alors l'enzyme Reverse Transcriptase et des nucléotides radiomarqués (uniquement d3HGTP dans l'exemple figuré). En cas de déamination, aucune incorporation n'a lieu et le signal détecté ne se distingue pas du bruit de fond. En cas d'activité de l'inhibiteur (pas de déamination), l'incorporation d'un nucléotide radiomarqué a lieu, et un signal est détecté.
EXEMPLES:
Exemple 1 : technique de criblage de molécules susceptibles d'inhiber l'activité déaminase d'apobec- 1 à l'aide d'un système de révélation ELISA coloré.
L'exemple utilise une séquence d'ARN synthétique contenant la séquence d'ancrage d'apobec- 1 (environ 50 nucléotides (Shah RR et al (1991) J. Biol. Chem., 16301-16304, Davies MS et al (1989) J. Biol. Chem., 13395-13398)) disposée dans une plaque de 96 puits. Après l'incubation avec les inhibiteurs testés en présence de l'enzyme dans le milieu nécessaire, on ajoute une amorce complémentaire de la séquence en 3' du site déaminé de l'ARN, dont l'extrémité 5' est par exemple préalablement marquée à l'aide d'un (ou plusieurs) nucléotide(s) digoxygéné(s) (dig 1 1-dUTP, commercialisé par la société Boehringer Mannheim) dans des conditions d'hybridation. On ajoute alors l'enzyme Reverse Transcriptase et des nucléotides modifiés, par exemple biotinilés (biot-dGTP, dans l'exemple illustré sur la figure 1) disponibles soit commercialement, soit réalisables sans difficulté à l'aide de kits de biotinilation (commercialisé par exemple par la société Sigma). En cas de déamination, c'est-à-dire d'activité non inhibée de l'enzyme apobec-1, aucune incorporation de nucléotide biotinilé n'a lieu. En cas d'activité de l'inhibiteur (pas de déamination), l'incorporation d'un nucléotide biotinilé peut avoir lieu. A l'issue de cette réaction, il est donc possible de piéger les amorces allongées d'un nucléotide biotinilé sur les parois couvertes de streptavidine de la plaque de 96 puits utilisée, et de se débarrasser des amorces non étendues par lavage. La révélation de la présence de digoxygénine s'effectue alors à l'aide d'un système d'anticorps anti-digoxygénine suivi d'une réaction ELISA, par exemple antidig-alkaline-phosphatase révélé par réaction avec des sels de nitroblue tetrazolium (NBT). Les systèmes digoxygénine et anticorps correspondants sont commercialisés par exemple par la société Boehringer Mannheim.
Exemple 2: technique de criblage de molécules susceptibles d'inhiber l'activité déaminase d'apobec- 1 à l'aide du système SPA®.
L'exemple utilise une séquence d'ARN synthétique contenant la séquence d'ancrage d'apobec- 1 (environ 50 nucléotides (Shah RR et al (1991) J. Biol. Chem., 16301-16304, Davies MS et al (1989) J. Biol. Chem., 13395-13398)) couplée à une bille SPA® (système commercialisé par la société Amersham) disposée dans une plaque de 96 puits. Après l'incubation avec les inhibiteurs testés en présence de l'enzyme dans le milieu et avec les réactifs nécessaires, on ajoute une amorce complémentaire de la séquence en 3' du site déaminé de l'ARN dans des conditions d'hybridation (Maniatis T et al (1982) Molecular Cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor, NY). On ajoute alors une enzyme Reverse Transcriptase et des nucléotides radiomarqués (uniquement d HGTP dans l'exemple illustré sur la figure 2). Dans le cas présent, il serait également possible d'utiliser d HTTP en plus. En cas de déamination, c'est-à-dire une activité normale de l'enzyme apobec-1, aucune incorporation n'a lieu et le signal détecté, dû à la scintillation de proximité des billes SPA, ne se distingue pas du bruit de fond. En cas d'activité de l'inhibiteur, l'activité de déamination par apobec-1 est diminuée, rendant possible l'incoφoration d'un nucléotide radiomarqué (ou deux si d3HTTP est également utilisé) à l'extrémité 3' d'une partie des amorces hybridées. Dans ce cas, un signal de scintillation peut être détecté qui se distingue du bruit de fond.

Claims

REVENDICATIONS
1. Technique de détection de la déamination d'une cytidine ou d'une 5-méthyl cytidine dans un ARN ou un ADN, caractérisée en ce que l'on utilise une amorce d'ARN ou d'ADN d'au moins 14 nucléotides.
2. Technique selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'on utilise un ARN ou un ADN modifié et de un à trois nucléotides marqués pour l'extension de l'amorce.
3. Technique selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'on utilise une amorce ARN ou ADN marquée et un à trois nucléotides marqués différemment de l'amorce.
4. Technique selon les revendications 1 à 3, caractérisée en ce que l'on utilise un ARN comprenant la séquence d'ancrage de l'ARNm du gène apoB.
5. Kit de détection de déamination d'un ARN ou d'un ADN contenant l'un au moins des éléments suivants: a) une amorce ARN ou ADN marquée, b) un à trois nucléotides marqués, c) les réactifs et milieux nécessaires à l'extension de l'amorce, d) un système de détection de l'incoφoration des nucléotides marqués, utilisé suivant l'une des revendications 1 à 4.
6. Technique de criblage de molécules ayant une influence inhibitrice sur l'activité déaminase d'une enzyme, caractérisée en ce qu'elle utilise l'une des techniques selon les revendications 1 à 5.
7. Dispositif de criblage de molécules ayant une influence inhibitrice sur l'activité déaminase d'une enzyme, contenant l'un au moins des éléments suivants: a) réactifs et milieux nécessaires à l'activité de l'enzyme, b) kit de détection de déamination d'un ARN ou d'un ADN suivant l'une des revendications 1 à 6.
8. Molécule ou produit ayant une influence inhibitrice sur l'activité déaminase d'une enzyme, caractérisé en ce qu'il a a été détecté grâce à un des procédés décrits dans les revendications 1 à 7.
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999035257A1 (fr) * 1997-12-30 1999-07-15 Itzik Harosh Cible de traitement de l'atherosclerose, de l'obesite et du diabete de type ii
WO2001068806A2 (fr) * 2000-03-10 2001-09-20 Millennium Pharmaceuticals, Inc. 26934, nouvelle molecule de type cytidine deaminase et ses utilisations
EP1263986A1 (fr) * 2000-02-25 2002-12-11 Montclair Group Plate-forme destinee a la decouverte de genes bacteriens impliques dans la modification d'arn

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2870855A1 (fr) * 2004-05-27 2005-12-02 Obe Therapy Biotechnology Soc Procede de criblage a haut debit pour l'identification de molecules inhibitrices de l'activite d'enzymes d'edition
DE102004054729A1 (de) * 2004-11-12 2006-05-18 Bayer Technology Services Gmbh Verfahren zum Nachweis methylierter Cytosine

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5434058A (en) * 1993-02-09 1995-07-18 Arch Development Corporation Apolipoprotein B MRNA editing protein compositions and methods

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BIOLOGICAL ABSTRACTS, vol. 102, no. 10, 1996, Philadelphia, PA, US; abstract no. 146673, XP002051489 *
M.S. DAVIES ET AL.: "Sequence requirements for apolipoprotein B RNA editing in transfected rat hepatoma cells", JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 264, no. 23, 15 August 1989 (1989-08-15), BETHESDA MD USA, pages 13995 - 13398, XP002051488 *
R.R. SHAH ET AL: "Sequence requirements for the editing of apolipoprotein B in mRNA", JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 266, no. 25, 5 September 1991 (1991-09-05), BETHESDA MD USA, pages 16301 - 16304, XP002051487 *
S. VINCENZETTI ET AL.: "Recombinant human cytidine deaminase: expression, purification and characterization.", PROTEIN EXPRESSION AND PURIFICATION, vol. 8, no. 2, 1996, WASHINGTON DC USA, pages 247 - 253 *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999035257A1 (fr) * 1997-12-30 1999-07-15 Itzik Harosh Cible de traitement de l'atherosclerose, de l'obesite et du diabete de type ii
US6942967B1 (en) 1997-12-30 2005-09-13 Obe Therapy Biotechnology Target for treating athersclerosis, obesity and type II diabetes
EP1263986A1 (fr) * 2000-02-25 2002-12-11 Montclair Group Plate-forme destinee a la decouverte de genes bacteriens impliques dans la modification d'arn
EP1263986A4 (fr) * 2000-02-25 2005-02-23 Tao Biosciences Llc Plate-forme destinee a la decouverte de genes bacteriens impliques dans la modification d'arn
WO2001068806A2 (fr) * 2000-03-10 2001-09-20 Millennium Pharmaceuticals, Inc. 26934, nouvelle molecule de type cytidine deaminase et ses utilisations
WO2001068806A3 (fr) * 2000-03-10 2002-05-16 Millennium Pharm Inc 26934, nouvelle molecule de type cytidine deaminase et ses utilisations
US6723533B2 (en) 2000-03-10 2004-04-20 Millennium Pharmaceuticals, Inc. 26934, a novel cytidine deaminase-like molecule and uses thereof

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