WO1998040742A1 - Verfahren zur bestimmung von schilddrüsen-autoantikörpern - Google Patents

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WO1998040742A1 PCT/EP1998/001401 EP9801401W WO9840742A1 WO 1998040742 A1 WO1998040742 A1 WO 1998040742A1 EP 9801401 W EP9801401 W EP 9801401W WO 9840742 A1 WO9840742 A1 WO 9840742A1
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Definitions

  • thyroid autoantibodies which are directed against thyroid autoantigens and which are hereinafter referred to briefly as "thyroid autoantibodies”.
  • autoimmune diseases include atrophic autoimmune thyroiditis, primary myxedema, asymptomatic thyroiditis, postpartum thyroiditis and neonatal hypothyroidism, with different names being used for the same or similar diseases, depending on the clinical picture.
  • the differential diagnostic evidence that the observed Thyroid disease is one of the autoimmune diseases is caused by the fact that autoantibodies are detected in the patient.
  • the detection of these autoantibodies thus allows in many cases the differential diagnosis of autoimmune diseases from other thyroid diseases (see Pfannenstiel, P. & Salier, B. in "Thyroid Diseases - Diagnosis and Therapy", Berlin Medical Publishing House, 1993; or Ziegler, R., Pickardt , CR, Willig, R.-P. in "Rationalelle Diagnostik in der Endokrinologie", Georg Thieme Verlag, 1993).
  • the known autoantibodies occurring in thyroid autoimmune diseases belong to three different types, which differ in the thyroid proteins which act as autoantigens.
  • the three thyroid autoantigens are the TSH receptor, the thyroid peroxidase (TPO, identical to the former so-called microsomal antigen) and thyroglobulin (Tg) (Dawe, K., Hutchings, P., Champion, B., Cooke, A., Roitt, I., "Autoantigen in Thyroid diseases", Springer Semin. Immunopathol. 14, 285-307, 1993).
  • TSH receptor thyroid peroxidase
  • TPO thyroid peroxidase
  • Tg thyroglobulin
  • Autoantibodies against the TSH receptor occur specifically in Graves' disease, but not in other autoimmune diseases of the thyroid (Pfannenstiel & Salier, op. Cit.).
  • autoantibodies against the other two autoantigens ie against TPO and Tg
  • the detection of autoantibodies against TPO and / or Tg does not play an important role in view of the relevance and specificity of the detection of autoantibodies against the TSH receptor.
  • Anti-TPO autoantibodies and anti-Tg autoantibodies are determined in particular if autoimmune thyroiditis is suspected. Hashimoto's autoimmune thyroiditis and atrophic autoimmune thyroiditis very often contain anti-TPO autoantibodies, but no autoantibodies against the TSH receptor. Anti-TPO autoantibodies are often accompanied by anti-Tg autoantibodies, but there are cases where only anti-Tg autoantibodies, but not anti-TPO autoantibodies are detectable (Meng, W. in "thyroid disease", Gustav Fischer Verlag, 1992; Pfannenstiel & Salier, op. cit.; Ziegler et al., op. cit.).
  • thyroid disease While there are other types of thyroid disease besides Hashimoto's autoimmune thyroiditis, which are autoimmune diseases and in which anti-TPO or anti-Tg autoantibodies may be elevated (primary myxedema, asymptomatic thyroiditis, postpartum thyroiditis, neonatal hypothyroidism only) , in which anti-TPO autoantibodies do not appear alongside anti-Tg autoantibodies and are recommended for measurement, namely thyroid carcinoma (Feldt-Rasmussen, loc. cit.). In thyroid carcinoma, large amounts of thyroglobulin are released from the thyroid cells, which can lead to the formation of autoantibodies against Tg. Therefore, thyroglobulin (Tg) is usually determined to detect thyroid cancer.
  • Tg thyroglobulin
  • the Tg determination can be disturbed by the presence of anti-Tg autoantibodies, which is why a so-called recovery measurement must be carried out to ensure the measurement results of the Tg determination.
  • a so-called recovery measurement must be carried out to ensure the measurement results of the Tg determination.
  • the antigen TPO is used as an assay component in a form in which not all of the epitopes recognized by autoantibodies may be present, and in particular conformational epitopes may be missing. This can be the case if a genetically engineered recombinant antigen is used, if the antigen has been purified and thereby conformationally stressed, if the antigen is immobilized directly on a solid phase and / or if the antigen is labeled under rigid conditions. Depending on the assay design, certain significant anti-TPO autoantibodies may not be detected (Mariotti, S.
  • Claim 6 defines the indications more precisely, in which, if there is a corresponding suspicion, it is advantageous to carry out the method according to the invention.
  • the invention was based on the idea of systematically examining the extent to which a parallel detection of the two types of autoantibodies mentioned offers demonstrable advantages over a single determination of only one type of autoantibody, and then determining whether it is possible to use two different types of autoantibodies, namely anti -To detect TPO autoantibodies and anti-Tg autoantibodies in biological samples, in particular serum samples from patients, simultaneously in a single determination and without differentiating between the two types of autoantibodies.
  • two different types of autoantibodies namely anti -To detect TPO autoantibodies and anti-Tg autoantibodies in biological samples, in particular serum samples from patients, simultaneously in a single determination and without differentiating between the two types of autoantibodies.
  • diagnostic sensitivity and specificity such a summary determination has in comparison with isolated determinations of anti-TPO and anti-Tg autoantibodies.
  • the basic procedure is such that the immunodiagnostic determination method used has at least one method step in which a possibly diluted liquid sample is reacted with at least two selective reagents, one of which is selective binding with anti-TPO Autoantibodies and the other enters into selective binding with anti-Tg autoantibodies, the at least two selective reagents either for selectively separating the anti-TPO autoantibodies and the anti-Tg autoantibodies from the rest of the liquid sample or for their selective labeling or after their separation from the liquid phase.
  • Both tests designed for the individual determinations of anti-Tg autoantibodies and anti-TPO autoantibodies work with a protein A suspension as a solid phase.
  • the antibodies present in the sample are bound non-specifically to the protein A suspension.
  • the autoantibodies sought are then selectively radioactively labeled with specific tracers, using radioactively labeled Tg for labeling anti-Tg autoantibodies, while anti-TPO autoantibodies are used using a crude thyroid membrane extract which contains native TPO, which is selectively affinity-labeled with the aid of a radio-labeled Fab fragment of a monoclonal anti-TPO antibody.
  • a combination test was carried out which was intended to provide a summary determination of anti-TPO autoantibodies and anti-Tg autoantibodies and which only delivers a single measurement signal.
  • 50 ⁇ l of the sample which was prediluted according to the work instructions of the above tests, was mixed with 50 ⁇ l protein A suspension.
  • 50 ⁇ l of the tracer for the detection of anti-TPO autoantibodies was added, and after 15 min 50 ⁇ l of tracer for the anti-Tg autoantibody detection were added to the same sample.
  • the mixture was incubated for 1 h at room temperature, made up with 1 ml of buffer, and then the suspended solid phase was separated from the test liquid by centrifugation and the radioactivity bound to the solid phase was measured.
  • Table 2 shows the results of the measurements of the radioactivities bound to the separated solid phase, given in cpm, and the autoantibody concentrations (U / ml) calculated therefrom.
  • Table 2 also contains the total autoantibody concentrations calculated from the sums of the individual determinations (column Total aTPO + aTg).
  • the signals obtained during the joint determination in the combination test (COMBI column) according to the example described were based on the calculated sums of the individual determinations. Hatched are those determinations that are clinically assessed as autoantibody positive if the cutoff values of 100 U / ml are used for the individual determinations and a cutoff corresponding to a radioactivity signal of 2900 cpm is used for the combination test.
  • a combinatorial assay with immobilized antigens can also be implemented.
  • the antigens Tg and TPO would be immobilized directly or via suitable pre-immobilized anti-Tg and anti-TPO antibodies on a solid phase.
  • the anti-Tg and anti-TPO autoantibodies bound after the reaction with the patient sample can be detected to obtain a summary measurement signal, for example with labeled protein A or labeled anti-human IgG.
  • a combinatorial assay is also conceivable which takes advantage of the bivalence of the antibodies to be measured.
  • the antigens Tg and TPO could be immobilized on a solid phase directly or via suitable pre-immobilized selective anti-Tg and anti-TPO antibodies.
  • the anti-Tg and anti-TPO autoantibodies bound after the reaction with the patient sample can then be detected by a tracer mixture which contains both radioactively labeled Tg and radioactively labeled TPO.
  • a tracer mixture which contains both radioactively labeled Tg and radioactively labeled TPO.
  • portions of Tg present in the TPO preparations could be separated off using the known chromatographic methods mentioned above.
  • the reagents used as tracers contain the same labeling component, so that a summary single measurement signal can be obtained.
  • this does not rule out the possibility that at least one of the reagents may contain a further labeling component, which makes it possible to measure one of the autoantibodies to be determined in addition to the summary determination using the same measurement solution.
  • the tracers have different labeling components, it is generally not possible to obtain a summary measurement signal.
  • such assays can, however, have the advantage over the conventional two separate measurements that only one pipette is required to prepare the measurement solution and two measurement results can be obtained with a single batch.

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Abstract

Verfahren zur Bestimmung von Schilddrüsen-Autoantikörpern in einer aus einem Patienten gewonnenen biologischen Probe im Rahmen der Differentialdiagnostik von Erkrankungen, die mit Veränderungen der Schilddrüse und/oder Störungen der normalen Schilddrüsenfunktion verbunden sind, wobei die Bestimmung der Anwesenheit und/oder Menge der Schilddrüsen-Autoantikörper in der Probe unter Anwendung eines immundiagnostischen Bestimmungsverfahrens erfolgt, bei dem man pro Bestimmung ein Meßsignal gewinnt, das summarisch die Anwesenheit und Menge von mindestens zwei Antikörpern, zu denen anti-TPO-Autoantikörper und anti-Tg-Autoantikörper gehören, in der Probe repräsentiert. Das Verfahren erhöht, bei einer Verminderung des erforderlichen Aufwands, die Selektivität und Sensitivität der Erfassung der für bestimmte Autoimmunerkrankungen typischen Autoantikörper.

Description

Verfahren zur Bestimmung von Schilddrüsen-Autoantikörpern
Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Bestimmung von Autoantikörpern, die gegen Schilddrüsen-Autoantigene gerichtet sind und die im folgenden kurz als "Schilddrüsen-Autoantikörper" bezeichnet werden.
Unter den Erkrankungen, bei denen es zu Störungen der normalen Funktion und/oder zu mikroskopisch oder optisch wahrnehmbaren Veränderungen der Schilddrüse kommt, nehmen solche, die den Charakter von Autoimmunerkrankungen aufweisen, eine wichtige Rolle ein. Die bekanntesten Erkrankungen der Schilddrüse, die zu den Autoimmunerkrankungen gerechnet werden müssen, sind insbesondere der orbus Basedow (englisch: Grave's disease) , die Hashimoto-Thyreoiditis, und die primäre Hypothyreose . Als weitere derartige Erkrankungen sind zu nennen die atrophische Autoimmunthyreoiditis, das primäre Myxödem, die asymptomatische Thyreoiditis, die postpartale Thyreoiditis und die neonatale Hypothyreose, wobei, je nach dem klinischen Bild, unterschiedliche Bezeichnungen für gleiche oder gleichartige Erkrankungen verwendet werden.
Der differentialdiagnostische Nachweis, daß die beobachtete Schilddrüsenerkrankung zu den Autoimmunerkrankungen gehört, wird dadurch geführt, daß man bei dem Patienten Autoantikörper nachweist. Der Nachweis dieser Autoantikörper gestattet somit in vielen Fällen die differentialdiagnostische Abgrenzung von Autoimmunerkrankungen gegenüberanderen Schilddrüsenkrankheiten (vgl. Pfannenstiel, P. & Salier, B. in "Schilddrüsenkrankheiten - Diagnose und Therapie", Berliner Medizinische Verlagsanstalt, 1993; oder Ziegler, R., Pickardt, C.R., Willig, R.-P. in "Rationelle Diagnostik in der Endokrinologie" , Georg Thieme Verlag, 1993). Die bei Schilddrüsen-Autoimmunerkrankungen auftretenden bekannten Autoantikörper gehören drei unterschiedlichen Typen an, die sich durch die als Autoantigene fungierenden Schilddrüsen-Proteine unterscheiden. Die drei Schilddrüsen-Autoantigene sind der TSH-Rezeptor , die thyreoida- le Peroxidase (TPO, identisch mit dem früheren sogenannten mikrosomalen Antigen) und Thyreoglobulin (Tg) (Dawe, K. , Hutchings, P., Champion, B., Cooke, A. , Roitt, I., "Auto- antigens in Thyroid diseases", Springer Semin. Immunopathol . 14, 285-307, 1993). Autoantikörper gegen den TSH-Rezeptor treten dabei spezifisch beim Morbus Basedow auf, nicht jedoch bei anderen Autoimmunerkrankungen der Schilddrüse (Pfannenstiel & Salier, a.a.O.) . Daneben sind beim Morbus Basedow in vielen Fällen auch Autoantikörper gegen die beiden anderen Auto- antigene, d.h. gegen TPO und Tg, mit relativ geringer Sensiti- vität nachweisbar. Für die Diagnose auf Morbus Basedow spielt der Nachweis von Autoantikörpern gegen TPO und/oder Tg jedoch angesichts der Relevanz und Spezifität des Nachweises von Autoantikörpern gegen den TSH-Rezeptor keine wesentliche Rolle.
Eine Bestimmung von anti-TPO-Autoantikörpern und anti-Tg- Autoantikörpern erfolgt insbesondere bei einem Verdacht auf eine Autoimmunthyreoiditis. Bei der Autoimmunthyreoiditis vom Typ Hashimoto und der atrophischen Autoimmunthyreoiditis finden sich sehr häufig anti-TPO-Autoantikörper , jedoch keine Autoantikörper gegen den TSH-Rezeptor. Häufig wird das Auftreten von anti-TPO-Autoantikörpern durch anti-Tg-Auto- antikörper begleitet, wobei es jedoch Fälle gibt, bei denen ausschließlich anti-Tg-Autoantikörper, nicht jedoch anti-TPO- Autoantikörper nachweisbar sind (Meng, W. in "Schilddrüsenerkrankungen", Gustav Fischer Verlag, 1992; Pfannenstiel & Salier, a.a.O; Ziegler et al . , a.a.O.). Da es somit Fälle einer Autoimmunthyreoiditis gibt, bei denen keine anti-TPO-Auto- antikörper nachweisbar sind, wird die Bestimmung von anti-Tg- Autoantikörpern zusätzlich zur Bestimmung von anti-TPO- Autoantikörpern empfohlen (Feldt-Rasmussen, U. "Analytical and clinical Performance goals for testing autoantibodies to thyro- peroxidase, thyroglobulin, and thyrotropin receptor" , Clinical Chemistry 42:1, 160-163, 1996). Während es neben der Autoimmunthyreoiditis vom Typ Hashimoto weitere Schilddrüsenkrankheitsbilder gibt, die Autoimmunkrankheiten darstellen und bei denen anti-TPO- oder anti-Tg-Autoantikörper erhöht sein können (primäres Myxödem, asymptomatische Thyreoiditis, postpartale Thyreoiditis, neonatale Hypothyreose) , gibt es nur eine Indikation, bei der anti-TPO-Autoantikörper nicht neben anti-Tg-Autoantikörpern auftreten und zur Messung empfohlen werden, nämlich das Schilddrüsenkarzinom (Feldt-Rasmussen, a.a.O.) . Beim Schilddrüsenkarzinom werden große Mengen Thyreoglobulin aus den Schilddrüsenzellen freigesetzt, was dazu führen kann, daß sich Autoantikörper gegen Tg bilden. Normalerweise wird zum Nachweis eines Schilddrüsenkarzinoms daher Thyreoglobulin (Tg) bestimmt. Die Tg-Bestimmung kann jedoch durch die Anwesenheit von anti-Tg-Autoantikörpern gestört werden, weshalb zur Absicherung der Meßergebnisse der Tg- Bestimmung eine sogenannte Wiederfindungsmessung durchgeführt werden muß. Zur Absicherung der Befunde bei einem gestörten Tg- Nachweis kann es in Einzelfällen interessant sein, die entsprechende biologische Probe auf eine Anwesenheit von anti- Tg-Autoantikörpern zu prüfen.
Das dominierende Verfahren zur Bestimmung von Autoantikörpern bei Verdacht auf eine Autoimmunthyreoiditis ist die Bestimmung von anti-TPO-Autoantikörpern. Die Verläßlichkeit derartiger Bestimmungen im Hinblick auf ihre diagnostische Sensitivität wird jedoch diskutiert (Haagen, U. & Bergmann, A. , "Besondere Aspekte der Qualitätssicherung der Komponente Autoantigen bei Fertigreagenzien für die Schilddrüsenautoimmundiagnostik" , Abstract von der "Jahrestagung der Sektion Schilddrüse der Deutschen Gesellschaft für Endokrinologie, 23.-25.11.1995, Hannover, S. 15-22): Bei bestimmten immunologischen Bestimmungsverfahren für anti-TPO-Autoantikörper wird das Antigen TPO als Assaykomponente in einer Form eingesetzt, bei der möglicherweise nicht mehr alle von Autoantikörpern erkannten Epitope vorhanden sind, wobei insbesondere konformationelle Epitope fehlen können. Das kann der Fall sein, wenn ein gentechnisch erzeugtes rekombinantes Antigen verwendet wird, wenn das Antigen gereinigt und dabei konformationell gestreßt worden ist, wenn das Antigen direkt auf einer Festphase immobilisiert wird und/oder wenn das Antigen unter rigiden Bedingungen markiert wird. Auch abhängig vom Assaydesign kann es vorkommen, daß bestimmte signifikante anti-TPO-Autoantikörper nicht nachgewiesen werden (Mariotti, S. et al . , "False negative results observed in anti-thyroid peroxidase autoantibody determination by competitive radioimmunoassays using monoclonal antibodies", Eur. J. Endocrinol . 130, 552-558, 1994).
Nachdem somit Fälle bekannt sind, bei denen die alleinige Bestimmung von anti-TPO-Autoantikörpern ein unrichtiges negatives Ergebnis liefert, wird empfohlen, zur diagnostischen Absicherung eine zusätzliche zweite Bestimmung, nämlich von anti-Tg-Autoantikörpern, durchzuführen.
Trotz der Vorteile, die eine zusätzliche anti-Tg-Bestimmung erbringt, wird angesichts des zunehmenden Kostendrucks im Gesundheitswesen diskutiert, bei der Diagnose der Hashimoto- Thyreoiditis auf eine zusätzliche anti-Tg-Bestimmung zu verzichten, obwohl anerkannt wird, daß dadurch die Gefahr von Fehldiagnosen erhöht wird (Nordyke, R.A. et al . , "The superiority of antimicrosomal over antithyroglobulin antibodies for detecting Hashimoto' s thyroiditis" , Arch. Intern. Med. 153, 862-865, 1993) . Unter diesen Umständen ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Bestimmung von Schilddrüsen-Autoantikörpern im Rahmen der Differentialdiagnostik von Schilddrüsen-Erkrankungen zu schaffen, das einerseits nur den relativ geringen Aufwand einer Einzelbestimmung erfordert, jedoch eine diagnostische Sensitivität aufweist, die wenigstens gegenüber der Bestimmung nur einer Sorte von Autoantikörpern das Risiko unrichtiger negativer Ergebnisse vermindert, sowie ferner mindestens eine Möglichkeit für die erfolgreiche technische Durchführung eines solchen Verfahrens aufzuzeigen.
Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren gemäß Oberbegriff von Patentanspruch 1 gelöst, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man ein immundiagnostisches Bestimmungsverfahren anwendet, bei dem pro Bestimmung ein Meßsignal gewonnen wird, das summarisch die Anwesenheit und Menge von mindestens zwei Antikörpern, zu denen anti-TPO-Auto-antikörper und anti-Tg-Autoantikörper gehören, in der Probe repräsentiert.
Zum gegenwärtigen Zeitpunkt bevorzugte technische Ausführungs- formen eines solchen Verfahrens sind in den Unteransprüchen 2 bis 5 näher definiert. Anspruch 6 definiert die Indikationen genauer, bei denen, wenn ein entsprechender Verdacht besteht, eine Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens vorteilhaft ist.
Der Erfindung lag die Idee zugrunde, systematisch zu prüfen, inwieweit eine parallele Erfassung der beiden genannten Arten von Autoantikörpern nachweisbare Vorteile gegenüber einer Einzelbestimmung nur einer Art von Autoantikörpern bietet, und dann festzustellen, ob es möglich ist, zwei unterschiedliche Arten von Autoantikörpern, nämlich anti-TPO-Autoantikörper und anti-Tg-Autoantikörper, in biologischen Proben, insbesondere Serumproben von Patienten, im Rahmen einer einzigen Bestimmung gleichzeitig und ohne zwischen den beiden Arten von Autoantikörpern zu differenzieren zu erfassen. Im Falle der Möglichkeit einer zuverlässigen summarischen Bestimmung beider Autoantikörper war dann ferner festzustellen, welche diagnostische Sensitivität und Spezifität eine solche summarische Bestimmung im Vergleich mit isolierten Bestimmungen von anti- TPO- und anti-Tg-Autoantikörpern hat.
Zur Prüfung der obigen Idee wurde ein klinische Untersuchung durchgeführt, bei der jeweils nebeneinander die Konzentrationen von anti-TPO-Autoantikörpern und anti-Tg-Autoantikörpern in Serumproben verschiedener Gruppen von Patienten, die an Schilddrüsenerkrankungen litten, auf herkömmliche Weise unter Verwendung der handelsüblichen Tests DYNOtest® anti-TPOn und DYNOtest® anti-Tgn der Anmelderin B.R.A.H.M.S Diagnostica GmbH bestimmt wurden. Die Ergebnisse der Paare von Einzelmessungen wurden dazu verwendet, zu ermitteln, welche Konzentrationen an Autoantikörpern erhalten werden, wenn man die ermittelten Konzentrationen rechnerisch summiert. (Für die rechnerische Auswertung wurde eine direkte Aufsummierung gewählt, wobei grundsätzlich jedoch auch eine geeignete Umkalibrierung der Meßwerte möglich ist.) Die handelsüblichen Tests DYNOtest® anti-TPOn und DYNOtest® anti-Tgn geben jeweils Grenzwerte
(Cutoff-Werte) für die erhaltenen Meßergebnisse an, deren Überschreiten eine untersuchte Probe als Autoantikörper positiv kennzeichnet. Für die Bestimmung von anti-TPO-Autoantikörpern und von anti-Tg-Autoantikörpern wird dabei jeweils ein Wert von 60 mU/1 angegeben. Für eine gleichzeitige Berücksichtigung der Anwesenheit beider Arten von Autoantikörpern muß ein neuer Cutoff -Wert festgelegt werden, der im Rahmen der Untersuchung 73 mU/1 betrug.
Bei der genannten gemeinsamen rechnerischen Auswertung der
Ergebnisse der Einzelbestimmungen der anti-TPO-Autoantikörper und anti-Tg-Autoantikörper ergab sich überraschend, daß sich durch eine rechnerische Kombination der Einzelmessungen eine höhere diagnostische Sensitivität für die relevanten Patienten- gruppen erreichen läßt, als bei isolierten Bestimmungen von anti-TPO-Autoantikörpern oder anti-Tg-Autoantikörpern. Bei der gemeinsamen rechnerischen Auswertung der Ergebnisse der Einzel- messungen wurde festgestellt, daß im wesentlichen alle Proben, die in Einzelbestimmungen entweder anti-TPO-Autoantikörper- positiv oder anti-Tg-Autoantikörper-positiv gemessen wurden, auch bei einer summarischen Auswertung in jedem der Fälle positiv gemessen wurden. Ferner zeigte sich, daß die Meßergebnisse auch bei einer gemeinsamen Auswertung spezifisch waren, d.h. es wurden keine fehlerhaften Ergebnisse für das Normalkollektiv erhalten. Die Ergebnisse für die verschiedenen Patientengruppen sind in Tabelle 1 zusammengefaßt. In der Tabelle 1 enthält die Spalte SUMME die Ergebnisse einer summarischen Auswertung der paarweisen Einzelmessungen.
Bei einer gemeinsamen Erfassung der anti-TPO-Autoantikörper- Konzentrationen und der anti-Tg-Autoantikörper-Konzentrationen wird somit eine diagnostische Sensitivität erhalten, die besser ist als die von isolierten Messungen einer der genannten Konzentrationen, während gleichzeitig die Spezifität unbeein- trächtigt bleibt.
Tabelle 1
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Aus den Ergebnissen der rechnerischen Auswertung der beschriebenen Versuchsreihen wurde der Schluß gezogen, daß es nicht erforderlich ist, zur Gewinnung zuverlässiger Meßergeb- nisse zwei Einzelbestimmungen durchzuführen, sondern daß dann, wenn es technisch möglich ist, eine einzige summarische Bestimmung beider Parameter (Konzentrationen der anti-TPO- Autoantikörper und anti-Tg-Autoantikörper) durchzuführen, summarische Meßergebnisse erhalten werden müßten, die Einzel - messungen bezüglich der diagnostischen Sensitivität überlegen sind, während gleichzeitig die Spezifität unbeeinträchtigt bleibt . Unter Kostenaspekten und auch Handhabungsaspekten sind die Vorteile einer summarischen Einzelmessung eklatant: Es müssen nicht zwei Tests durchgeführt werden, sondern es genügt ein einziger. Das senkt erheblich die Kosten bei Material, Personal, Erstattung, führt zu einer besseren Handhabbarkeit und, wegen der Verminderung der Anzahl der durchzuführenden Messungen und dem damit verminderten Anfall an zu entsorgenden Meßlösungen, zu einer umweltfreundlicheren Bestimmung. Eine Durchsicht der Literatur hat bestätigt, daß keine Indikation von diagnostischer oder therapeutischer Bedeutung bekannt ist, die es erfordert, zu differenzieren, ob anti-TPO-Autoantikörper oder anti-Tg-Autoantikörper erhöht sind. Die summarische Bestimmung führt somit gegenüber der bisherigen Praxis zu keinem Informationsverlust.
Zur Prüfung der Frage, ob die aus einer gemeinsamen rechnerischen Auswertung von Einzelbestimmungen gezogenen Schlüsse auch dann richtig sind, wenn man versucht, beide Parameter summarisch im Rahmen einer einzigen Bestimmung zu erfassen, d.h. um sicher zu stellen, daß es nicht zu einer wechselseitigen Störung der Bestimmungen der zwei Arten von Autoantikörpern kommt und daß ein summarisches Meßsignal gewonnen werden kann, das die gesamte Autoantikörperkonzentration repräsentiert und die gewünschte Selektivität und Sensitivität des Tests garantiert, wurde der im nachfolgenden Beispiel beschriebene summarische Test durchgeführt. Bei Verfahren zur summarischen Bestimmung beider Arten von Autoantikörpern wird grundsätzlich so vorgegangen, daß das angewandte immundiagnostische Bestimmungsverfahren wenigstens einen Verfahrensschritt aufweist, bei dem eine ggf. verdünnte flüssige Probe mit wenigstens zwei selektiven Reagenzien umgesetzt wird, von denen eines eine selektive Bindung mit anti-TPO-Autoantikörpern und das andere eine selektive Bindung mit anti-Tg-Autoantikörpern eingeht, wobei die wenigstens zwei selektiven Reagenzien entweder zur selektiven Abtrennung der anti-TPO-Autoantikörper und der anti-Tg-Autoantikörper vom Rest der flüssigen Probe oder zu deren selektiver Markierung vor oder nach ihrer Abtrennung von der flüssigen Phase eingesetzt werden.
Das im Beispiel angewandte Verfahren läßt sich in allgemeiner Form beschreiben als Verfahren, das die Schritte umfaßt:
- Binden der in der flüssigen Probe vorhandenen Antikörper, einschließlich der zu bestimmenden Autoantikörper, mittels eines festphasengebundenen unspezifischen Binders an eine feste Phase,
- gemeinsame oder sequenzielle Zugabe von zwei verschiedenen Tracer-Reagenzien, die den gleichen Markierungsbestandteil enthalten, wobei eines der Tracer-Reagenzien spezifisch alle gebundenen anti-TPO-Autoantikörper markiert und das andere der Tracer-Reagenzien spezifisch alle gebundenen anti-Tg-Autoantikörper markiert,
- Abtrennen der festen Phase von der flüssigen Reaktionsmischung und
- Messung der an die feste Phase gebundenen Markierung und Gewinnung eines Meßsignals, das die Summe der Mengen der anti- TPO-Autoantikörper und anti-Tg-Autoantikörper in der Probe repräsentiert .
Als Tracer-Reagens zur Markierung von anti-TPO-Autoantikörpern verwendet man, wie im Patent DE 41 20 412 beschrieben, einen cruden Extrakt aus humanen Schilddrüsen, der humane TPO in nativer, undenaturierter Form enthält, und in dem die humane TPO mittels markierter Antikörperfragmente selektiv markiert ist oder markiert werden kann, ohne daß ihre Bindungsfähigkeit gegenüber anti-TPO-Autoantikörpern beeinträchtigt ist.
Beispiel für die summarische Bestimmung von anti-Tg- und anti- TPO-Autoantikörpern
Es wurde ein neues Testsystem geschaffen, bei dem die Komponenten zweier kommerzieller Immunprazipitationstests der Anmelderin, der Firma B.R.A.H.M.S Diagnostica GmbH, verwendet wurden (HENNINGtest® anti-Tg und HENNINGtest® anti-TPO) .
Beide für die Einzelbestimmungen von anti-Tg-Autoantikörpern und anti-TPO-Autoantikörpern ausgelegten Tests arbeiten mit einer Protein A-Suspension als Festphase. Die in der Probe vorhandenen Antikörper werden unspezifisch an die Protein A- Suspension gebunden. Bei den Einzelbestimmungen werden dann die gesuchten Autoantikörper mit spezifischen Tracern selektiv radioaktiv markiert, wobei zur Markierung von anti-Tg-Auto- antikörpern mit radioaktiv markiertem Tg gearbeitet wird, während anti-TPO-Autoantikörper unter Verwendung eines kruden Schilddrüsenmembranextrakts, der natives TPO enthält, das mit Hilfe eines radioaktiv markierten Fab-Fragments eines monoklo- nalen anti-TPO-Antikörpers selektiv affinitätsmarkiert ist, nachgewiesen werden.
Im Rahmen der Untersuchung wurden 130 verschiedene Patientenseren mit verschiedenen Konzentrationen an anti-TPO-Autoantikörpern und anti-Tg-Autoantikörpern in Einzelbestimmungen gemäß den Arbeitseinleitungen der beiden genannten handelsüblichen Tests vermessen.
Zusätzlich wurde ein Kombinationstest durchgeführt, der einer summarischen Bestimmung von anti-TPO-Autoantikörpern und anti- Tg-Autoantikörpern dienen sollte und der nur ein einziges Meßsignal liefert. Dazu wurden jeweils 50 μl der Probe, die gemäß den Arbeitseinleitungen der obigen Tests vorverdünnt war, mit 50 μl Protein A-Suspension versetzt. Anschließend wurden 50 μl des Tracers zum Nachweis von anti-TPO-Autoantikörpern zugesetzt, und nach 15 min wurden der gleichen Probe 50 μl Tracer zum anti-Tg- Autoantikörpernachweis zugesetzt. Nach Zugabe der beiden Tracer wurde 1 h bei Raumtemperatur inkubiert, mit 1 ml Puffer aufgefüllt, und anschließend wurde die suspendierte Festphase durch Zentrifugation von der Testflüssigkeit getrennt, und es wurde die an die Festphase gebundene Radioaktivität gemessen.
Die erhaltenen Meßergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengestellt. In der Tabelle 2 sind Ergebnisse der Messungen der an die abgetrennte Festphase gebundenen Radioaktivitäten, angegeben in cpm, und die daraus errechneten Autoantikörperkonzentrationen (U/ml) angegeben. Ferner enthält Tabelle 2 die aus den Summen der Einzelbestimmungen errechneten Gesamt -Autoantikörperkonzentrationen (Spalte Summe aTPO+aTg) . Die bei der gemeinsamen Bestimmung im Kombinationstest (Spalte COMBI) gemäß dem beschriebenen Beispiel erhaltenen Signale wurden auf die errechneten Summen der Einzelbestimmungen bezogen. Schraffiert sind diejenigen Bestimmungen, die klinisch als Autoantikörperpositiv bewertet werden, wenn für die Einzelbestimmungen jeweils die angegebenen Cutoff-Werte von 100 U/ml zugrunde gelegt werden, und für den Kombinationstest ein Cutoff entsprechend einem Radioaktivitätssignal von 2900 cpm zugrunde gelegt wird.
Die Auswertung zeigt, daß im Kombinationstest für die einzelnen Proben annähernd ideal diejenigen Radioaktivitätssignale gemessen wurden, wie sie sich rechnerisch ergeben, wenn man die Radioaktivitätssignale separater anti-TPO- und anti-Tg- Bestimmungen addiert. Dieses Ergebnis beweist, daß eine summarische Messung von anti-Tg- und anti-TPO-Autoantikörpern technisch möglich ist. P> tr d>
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Mittelwert = 83% 89%
Die beschriebene summarische Messung unter Verwendung der Komponenten der bekannten Immunprazipitationstests stellt nur eine Möglichkeit der technischen Umsetzung der summarischen Bestimmung der beiden Arten von Autoantikörpern dar. Die Kombination anderer Assaydesigns erscheint in ähnlicher Weise möglich, und Tests, die nach anderen Assayprinzipien arbeiten, sollen von dem erfindungsgemäßen Verfahren ebenfalls umfaßt werden. Insbesondere sind dabei zu nennen:
Ein kombinatorischer Assay zur summarischen Bestimmung von anti-TPO- und anti-Tg-Autoantikörpern nach dem kompetitiven Prinzip, wie es beschrieben ist z.B. in dem Patent DE 41 20 412. Dabei kann man mit einer gemischten Festphase arbeiten, an die sowohl selektive anti-TPO-Antikörper als auch anti-Tg-Antikörper gebunden sind. Wenn man mit einem Tracergemisch arbeitet, das sowohl radioaktiv markiertes Tg als auch TPO enthält, äußert sich die Anwesenheit der gesuchten Autoantikörper in der Probe im Vergleich mit einer Autoantikörper- freien Probe als Verminderung der an die Festphase gebundenen Tracermenge. Gegebenenfalls müßte man dann, wenn in den verwendeten TPO-Präparationen Tg vorhanden ist, dieses durch bekannte Methoden, wie z.B. Affinitätschromatographie oder andere chromatographische Methoden, abtrennen. Die gewünschte technische Sensitivität läßt sich über geeignete Mengen an Festphasenantikörpern und Tracer einstellen, und die Zuverlässigkeit der Meßergebnisse wird durch geeignete Kalibrierungsmaßnahmen gewährleistet .
Auch ein kombinatorischer Assay mit immobilisierten Antigenen ist realisierbar. Dabei würden die Antigene Tg und TPO direkt oder über geeignete vorimmobilisierte anti-Tg- und anti-TPO- Antikörper an eine Festphase immobilisiert. Die nach Umsetzung mit der Patientenprobe gebundenen anti-Tg- und anti-TPO- Autoantikörper können zur Gewinnung eines summarischen Meßsignals z.B. mit markiertem Protein A oder markiertem anti- human-IgG nachgewiesen werden. Ferner ist ein kombinatorischer Assay denkbar, der sich die Bivalenz der zu messenden Antikörper zunutze macht. Dazu könnten die Antigene Tg und TPO direkt oder über geeignete vorimmobilisierte selektive anti-Tg- und anti-TPO-Antikörper an eine Festphase immobilisiert werden. Die nach der Umsetzung mit der Patientenprobe gebundenen anti-Tg- und anti-TPO- Autoantikörper können dann durch ein Tracergemisch nachgewiesen werden, das sowohl radioaktiv markiertes Tg als auch radioaktiv markiertes TPO enthält. Auch in diesem Falle könnten in den TPO-Präparationen vorhandene Anteile an Tg durch die oben erwähnten bekannten chromatographischen Methoden abgetrennt werden .
Weitere an sich bekannte Assaydesigns sind denkbar. Die oben aufgezählten Assayvarianten wurden deshalb hervorgehoben, da sie gegenwärtig für die routinemäßige Bestimmung von anti-Tg- Autoantikörpern und anti-TPO-Autoantikörpern von besonderer Bedeutung sind.
Bei den oben beschriebenen Assayvarianten wurde ferner davon ausgegangen, daß die als Tracer verwendeten Reagenzien den gleichen Markierungsanteil enthalten, damit ein summarisches einziges Meßsignal erhalten werden kann. Das schließt es jedoch nicht aus, daß mindestens eines der Reagenzien evtl. noch einen weiteren Markierungsbestandteil enthält, der es ermöglicht, unter Verwendung der gleichen Meßlösung einen der zu bestimmenden Autoantikörper neben der summarischen Bestimmung auch einzeln zu messen. Bei einem Assaysystem, bei dem die Tracer unterschiedliche Markierungsbestandteile aufweisen, ist es in der Regel nicht möglich, ein summarisches Meßsignal zu erhalten. Solche Assays können, bei einer geeigneten Tracerwahl, gegenüber den herkömmlichen zwei getrennen Messungen jedoch noch den Vorteil aufweisen, daß zur Herstellung der Meßlösung nur einmal pipettiert werden muß und zwei Meßergeb- nisse mit einem einzigen Ansatz gewonnen werden können.
In der vorliegenden Beschreibung wird nur die gemeinsame Erfassung von zwei bestimmten Autoantikörpern, nämlich anti- TPO-Autoantikörpern und anti-Tg-Autoantikörpern, in näheren Einzelheiten beschrieben. Es liegt jedoch im Bereich der vorliegenden Erfindung, das Verfahren auf Fälle auszudehnen, bei denen im Rahmen der summarischen Messung ein oder mehrere weitere Antikörper miterfaßt werden, seien es Autoantikörper, deren zusätzliche Erfassung diagnostisch wertvoll ist, oder seien es irgendwelche zugesetzten Antikörper, deren Anwesenheit in den Meßlösungen zu einem konstanten Basissignal führt, das eine Gegenkontrolle der Korrektheit der Messungen ermöglicht oder den Meßbereich verschiebt .

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Bestimmung von Schilddrüsen-Autoantikörpern in einer aus einem Patienten gewonnenen biologischen Probe im Rahmen der Differentialdiagnostik von Erkrankungen, die mit Veränderungen der Schilddrüse und/oder Störungen der normalen Schilddrüsenfunktion verbunden sind, wobei die Bestimmung der Anwesenheit und/oder Menge der Schilddrüsen-Autoantikörper in der Probe unter Anwendung eines immundiagnostischen Bestimmungsverfahrens erfolgt, dadurch gekennzeichnet, daß man ein immundiagnostisches Be- stimmungsverfahren anwendet, bei dem ein Meßsignal gewonnen wird, das summarisch die Anwesenheit und Menge von mindestens zwei Antikörpern, zu denen anti-TPO-Autoantikörper und anti-Tg- Autoantikörper gehören, in der Probe repräsentiert.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß das immundiagnostische Bestimmungsverfahren den Schritt einer Umsetzung einer ggf. verdünnten flüssigen Probe mit wenigstens zwei selektiven Reagenzien umfaßt, von denen eines eine selektive Bindung mit anti-TPO-Autoantikörpern und das andere eine selektive Bindung mit anti-Tg-Autoantikörpern eingeht, wobei die wenigstens zwei selektiven Reagenzien entweder zur selektiven Abtrennung der anti-TPO-Autoantikörper und der anti-Tg- Autoantikörper vom Rest der flüssigen Probe oder zu deren selektiver Markierung vor oder nach ihrer Abtrennung von der flüssigen Phase eingesetzt werden.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das immundiagnostische Bestimmungsverfahren die Schritte umfaßt: - Binden der in der flüssigen Probe vorhandenen Antikörper, einschließlich der zu bestimmenden Autoantikörper, mittels eines festphasengebundenen unspezifischen Binders an eine feste Phase, - gemeinsame oder sequenzielle Zugabe von zwei verschiedenen Tracer-Reagenzien, die den gleichen Markierungsbestandteil enthalten, wobei eines der Tracer-Reagenzien spezifisch, alle gebundenen anti-TPO-Autoantikörper markiert und das andere der Tracer-Reagenzien spezifisch alle gebundenen anti-Tg-Autoantikörper markiert,
- Abtrennen der festen Phase von der flüssigen Reaktionsmischung und
- Messung der an die feste Phase gebundenen Markierung und Gewinnung eines Meßsignals, das die Summe der Mengen der anti- TPO-Autoantikörper und anti-Tg-Autoantikörper in der Probe repräsentiert .
4. Verfahren nach Anspruch 3, daß man als Tracer-Reagens zur Markierung von anti-TPO-Autoantikörpern einen cruden Extrakt aus humanen Schilddrüsen verwendet, der humane TPO in nativer, undenaturierter Form enthält, und in dem die humane TPO mittels markierter Antikorperfragmente selektiv markiert ist oder markiert werden kann, ohne daß ihre Bindungsfähigkeit gegenüber anti-TPO-Autoantikörpern beeinträchtigt ist.
5. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das immundiagnostische Bestimmungsverfahren ein immunometrisches Sandwichverfahren, ein kompetitives Bestimmungsverfahren oder ein Verfahren ist, bei dem zur Trennung und/oder Markierung eine Doppelantikörpertechnik angewandt wird.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man anhand eines durch Auswertung des Meßsignals erhaltenen positiven Meßergebnisses in Kombination mit der Krankheitsgeschichte und/oder den klinischen Symptomen des jeweiligen Patienten auf das Vorliegen einer Autoimmunthyreoiditis vom Typ Hashimoto, einer atrophischen Autoimmunthyreoiditis, eines primären Myxödems, einer asymptomatischen Thy- reoiditis, einer postpartalen Thyreoiditis bzw. einer neona- talen Hypothyreose schließt.
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