WO1998026055A1 - Immobilized esterases from crude extract and their use - Google Patents

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WO1998026055A1
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    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/62—Carboxylic acid esters

Definitions

  • the present invention relates to immobilized proteins from crude extract and their use for fermentation in bioreactors.
  • Important enzymes that are used in biochemical or biotechnological conversions in fermenters or bioreactors are esterases.
  • Carboxylesterases are very common in nature. They catalyze the hydrolysis of carboxylic acid esters to free acid anions and alcohols.
  • esterases can be immobilized directly from the crude extract of tissues and cells of animals or plants without prior isolation and purification by binding to resins.
  • Suitable resins for this are, for example, epoxy resins.
  • the present invention therefore relates to esterases covalently bound and thus immobilized on resins from crude extracts of animal or plant cells and animal or plant tissue.
  • the present invention thus relates in particular to resin-bound esterase from the crude extract of pork liver.
  • a suitable resin for this is, for example, the epoxy resin Eupergit C.
  • the resin-bound pork liver crude extract esterase can be used to cleave carboxylic acid esters to free acid anions and alcohols in bioreactors with high yield and high activity.
  • the immobilized esterase according to the invention can preferably be used for the cleavage of nitroisophthalic acid dimethyl ester (NIPA-DME) to nitroisophthalic acid monomethyl ester (NIPA-MME), the undesired reaction to nitroisophthalic acid (NIPA) not taking place.
  • NIPA-DME nitroisophthalic acid dimethyl ester
  • NIPA-MME nitroisophthalic acid monomethyl ester
  • NIPA nitroisophthalic acid
  • the immobilized esterase according to the invention can preferably be used for the saponification of 2-fluoro-ara-adenine triacetate to 2-F-ara-adenine (F-araA), a precursor of Fludara.
  • a further preferred use of the immobilized esterase according to the invention is the use in partial saponification from the ReichsteinS-17.21 diacetate to the ReichsteinS-17 monoacetate
  • the immobilized esterase according to the invention made it possible to achieve a high yield of the end product in the fermentation. This was not predictable, since it is generally known that isolated and purified enzymes are used in enzymatic reactions in order to achieve the greatest possible conversion or high yield. Contamination of the enzyme is generally considered to inhibit activity. Furthermore, it can generally be assumed that further enzymes present in the crude extract interfere with the reaction or even catalyze further enzymatic reactions.
  • Fig. 2 shows the structure required for the fermentation
  • Fig. 3a shows the specific loss of activity of the immobilized at
  • 3b shows the normalized loss of activity of the immobilizate during long-term use.
  • Fresh pork liver is digested with potassium phosphate buffer at pH 7.5 in a mass ratio of 1: 4 at room temperature for 3 minutes in a homogenizer. The homogenate is centrifuged. The supernatant is decanted off. The sediment is discarded. The amount of supernatant corresponds to the buffer used. The supernatant obtained in this way is the raw pig liver extract, which has a high catalytic activity. 66 mg of total protein / ml of extract were obtained.
  • the volume activity of the esterase is approximately 6.5 U / ml, the specific activity is approximately 0.1 U / mg.
  • the quaternary structure of the pig liver esterase is in most cases a trimeric protein with three identical subunits and each with an active center with a molecular weight of approx. 60 kd. Therefore, only one band at 60 kd may occur in gel electrophoresis.
  • a pig liver extract which was prepared as described in Example 1, was therefore applied in various dilutions to an SDS gel in addition to commercially available pig liver esterase and marker proteins. The result of the gel electrophoresis is shown in FIG. 1.
  • isolated and purified pig liver esterase is treated for comparison.
  • the immobilisates of the crude extracts from Example 3 are placed in the reactor.
  • the product can be suctioned off with a filter without completely emptying the reactor.
  • the reactor can then be reloaded with substrates. This process can be repeated until the enzyme has lost its activity. It has been shown in practice that the process can be repeated more than 100 times without loss of activity.
  • the stability of the immobilized enzyme when used repeatedly is decisive for the use of the immobilized product on an industrial scale.
  • the liver was disrupted 1: 4 with 1 M phosphate buffer (pH 7.5).
  • the activity of the immobilizate for the swollen state is 8.94 U / g, based on the wet weight.
  • a long-term study was carried out with this immobilizate, the use of NIPA-DME per batch being 10 g / l.
  • the reaction was carried out at 38 ° C and pH 7.5 for 24 hours. As a result, the immobilizate was separated from the solution and renewed
  • the immobilisate Use of the immobilisate.
  • the decrease in time of the specific activity and the normalized activity of the enzyme is shown in Fig. 3a and Fig. 3b.
  • the immobilized esterase from the raw pig liver extract still has 65% residual activity.
  • the half-life of the immobilized product is approximately 250 hours, making it ideal for technical use in the fermenter. If the immobilizate is loaded with 10 g / l NIPA-DME for 10 hours, at least 100 batches can be run with an average reaction time of 5 hours.
  • the controlled fermentation was carried out in a Biostat ED fermenter in accordance with the arrangement shown in FIG. 2.

Abstract

The invention relates to immobilized proteins from crude extracts and their use for fermentation in bioreactors.

Description

IMMOBILISIERTE ESTERASEN AUS ROHEXTRAKT UND DEREN VERWENDUNG IMMOBILIZED ESTERASES FROM RAW EXTRACT AND THEIR USE
Die vorliegende Erfindung betrifft immobilisierte Proteine aus Rohextrakt und deren Verwendung für die Fermentation in Bioreaktoren.The present invention relates to immobilized proteins from crude extract and their use for fermentation in bioreactors.
Bei biochemischen und biotechnologischen Verfahren laufen sehr häufig mehrere Reaktionen gleichzeitig ab, von denen in der Regel nur eine das gewünschte Produkt liefert. Alle dabei ablaufenden Reaktionen werden als Simultanreaktionen bezeichnet (z. B. Folge- und Parallelreaktionen), in der Produktion, die im technischen Maßstab erfolgt, kommt es darauf an, eine möglichst hohe Ausbeute an Endprodukten bei gleichzeitig hoher Reinheit und geringen Kosten zu erhalten.In biochemical and biotechnological processes, it is very common for several reactions to take place at the same time, of which usually only one delivers the desired product. All of the reactions taking place are referred to as simultaneous reactions (e.g. follow-up and parallel reactions). In production, which takes place on an industrial scale, it is important to obtain the highest possible yield of end products with high purity and low costs.
Wichtige Enzyme, die bei biochemischen bzw. biotechnologischen Umsetzungen in Fermentern bzw. Bioreaktoren zur Anwendung kommen, sind Esterasen.Important enzymes that are used in biochemical or biotechnological conversions in fermenters or bioreactors are esterases.
Carboxylesterasen sind in der Natur sehr weit verbreitet. Sie katalysieren die Hydrolyse von Carbonsäureestern zu freien Säureanionen und Alkoholen.Carboxylesterases are very common in nature. They catalyze the hydrolysis of carboxylic acid esters to free acid anions and alcohols.
Es ist bereits ein Verfahren zur Herstellung von Benzodicarbonsäuremono- meren und deren Derivaten unter Verwendung von Schweineleber- Carboxyesterase bekannt (J P 2- 199616) .A process for the preparation of benzodicarboxylic acid monomers and their derivatives using pig liver carboxyesterase is already known (J P 2- 199616).
Es ist ferner bekannt, daß für die Fermentation geeignete Enzyme immobilisiert werden können.It is also known that enzymes suitable for fermentation can be immobilized.
Die Immobilisierung wird jedoch immer mit den isolierten und gereinigten Enzymen durchgeführt.However, the immobilization is always carried out with the isolated and purified enzymes.
Es wäre deshalb wünschenswert, für eine Fermentation eine Immobilisierung der Enzyme derart durchzuführen, daß die Enzyme vorher weder isoliert noch gereinigt werden müssen, was Kosten einspart und was zu erheblich weniger Aktivitätsverlusten und damit zu einer besseren Ausbeute an Produkten führt. Es wurde nun gefunden, daß Esterasen direkt aus dem Rohextrakt von Geweben und Zeilen von Tieren oder Pflanzen ohne vorherige Isolierung und Reinigung durch Anbindung an Harze immobilisiert werden können.It would therefore be desirable to immobilize the enzymes for fermentation in such a way that the enzymes do not have to be isolated or purified beforehand, which saves costs and which leads to considerably less activity losses and thus to a better yield of products. It has now been found that esterases can be immobilized directly from the crude extract of tissues and cells of animals or plants without prior isolation and purification by binding to resins.
Geeignete Harze hierfür sind zum Beispiel Epoxidharze.Suitable resins for this are, for example, epoxy resins.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind deshalb an Harze kovalent gebundene und damit immobilisierte Esterasen aus Rohextrakten von tierischen oder pflanzlichen Zellen und tierischem oder pflanzlichem Gewebe.The present invention therefore relates to esterases covalently bound and thus immobilized on resins from crude extracts of animal or plant cells and animal or plant tissue.
Als besonders wertvoll hat sich Esterase aus Schweineleber - Rohextrakt erwiesen.Esterase from pig liver raw extract has proven to be particularly valuable.
Gegenstand der Vorliegenden Erfindung ist somit insbesondere an Harze gebundene Esterase aus dem Rohextrakt der Schweineleber.The present invention thus relates in particular to resin-bound esterase from the crude extract of pork liver.
Ein hierfür geeignetes Harz ist zum Beispiel das Epoxidharz Eupergit C.A suitable resin for this is, for example, the epoxy resin Eupergit C.
Die an Harze gebundene Esterase aus Schweineleber-Rohextrakt kann zur Spaltung von Carbonsäureestern zu freien Säureanionen und Alkoholen in Bioreaktoren mit hoher Ausbeute und hoher Aktivität verwendet werden.The resin-bound pork liver crude extract esterase can be used to cleave carboxylic acid esters to free acid anions and alcohols in bioreactors with high yield and high activity.
Die erfindungsgemäße immobilisierte Esterase kann vorzugsweise zur Spaltung von Nitroisophthalsäuredimethylester (NIPA-DME) zu Nitroisophthalsäuremono- methylester (NIPA-MME) verwendet werden, wobei die unerwünschte Reaktion zu Nitroisophthalsäure (NIPA) nicht stattfindet.The immobilized esterase according to the invention can preferably be used for the cleavage of nitroisophthalic acid dimethyl ester (NIPA-DME) to nitroisophthalic acid monomethyl ester (NIPA-MME), the undesired reaction to nitroisophthalic acid (NIPA) not taking place.
Ferner kann die erfindungsgemäße immobilisierte Esterase vorzugsweise zur Verseifung von 2-Fluor-Ara-adenin-triacetat zum 2-F-ara-Adenin (F-araA), einer Vorstufe von Fludara, verwendet werden.Furthermore, the immobilized esterase according to the invention can preferably be used for the saponification of 2-fluoro-ara-adenine triacetate to 2-F-ara-adenine (F-araA), a precursor of Fludara.
Eine weitere vorzugsweise Verwendung der erfindungsgemäßen immobilisierten Esterase ist die Verwendung bei der Partialverseifung vom ReichsteinS-17,21 -Diacetat zum ReichsteinS-17-MonoacetatA further preferred use of the immobilized esterase according to the invention is the use in partial saponification from the ReichsteinS-17.21 diacetate to the ReichsteinS-17 monoacetate
Überraschend konnte mit der erfindungsgemäßen immobilisierten Esterase bei der Fermentation eine hohe Ausbeute an Endprodukt erzielt werden. Dies war nicht vorhersehbar, da allgemein bekannt ist, daß man bei enzymatischen Reaktionen isolierte und gereinigte Enzyme verwendet um einen möglichst großen Umsatz bzw. große Ausbeute zu erzielen. Eine Verunreinigung des Enzyms gilt allgemein als aktivitätshemmend. Ferner ist allgemein davon auszugehen, daß weitere im Rohextrakt vorliegende Enzyme die Umsetzung stören oder sogar weitere enzymatische Reaktionen katalysieren. Surprisingly, the immobilized esterase according to the invention made it possible to achieve a high yield of the end product in the fermentation. This was not predictable, since it is generally known that isolated and purified enzymes are used in enzymatic reactions in order to achieve the greatest possible conversion or high yield. Contamination of the enzyme is generally considered to inhibit activity. Furthermore, it can generally be assumed that further enzymes present in the crude extract interfere with the reaction or even catalyze further enzymatic reactions.
Beschreibung der AbbildungenDescription of the pictures
Fig. 1 zeigt die SDS-Gelelektrophorese (12,5%iges Acrylamidgel) mit gereinigter Esterase aus Schweineleber und Schweineleberesterase aus dem Rohextrakt.1 shows SDS gel electrophoresis (12.5% acrylamide gel) with purified esterase from pig liver and pig liver esterase from the crude extract.
Es bedeuten: 1 ,7 Markerproteine (26,6 kd Triosephosphatisomerase,It means: 1, 7 marker proteins (26.6 kd triose phosphate isomerase,
55,56 kd Glutamatdehydrogenase) 2,3 gereinigte Schweineleberesterase 4-6, 8-9 Schweineleber-Rohextrakt in verschiedenen55.56 kd glutamate dehydrogenase) 2.3 purified pork liver esterase 4-6, 8-9 raw pork liver extract in various
VerdünnungenDilutions
Fig. 2 zeigt den für die Fermentation benötigten AufbauFig. 2 shows the structure required for the fermentation
In der Abbildung bedeuten: PC = ComputerIn the figure mean: PC = computer
NH3 = wässrige AmmoniaklösungNH3 = aqueous ammonia solution
718Stat Titrino = Titrationsgerät T = Temperatur, gemessen über718Stat Titrino = titration device T = temperature, measured via
TemperaturfühlerTemperature sensor
Fig. 3a zeigt den spezifischen Aktivitätsverlust des Imobilisats beimFig. 3a shows the specific loss of activity of the immobilized at
Langzeiteinsatz.Long-term use.
Fig. 3b zeigt den normierten Aktivitätsverlust des Immobilisats beim Langzeiteinsatz. 3b shows the normalized loss of activity of the immobilizate during long-term use.
Die nachfolgenden Ausführungsbeispiele erläutern die Erfindung ohne diese auf die Beispiele zu beschränken.The following exemplary embodiments explain the invention without restricting it to the examples.
Beispiel 1example 1
Extraktion der Esterase aus SchweineleberExtraction of the esterase from pig liver
Frische Schweineleber wird mit Kaliumphosphat-Puffer bei pH 7,5 im Massen- Verhältnis 1 :4 bei Raumtemperatur 3 Minuten in einem Homogenisator aufgeschlossen. Das Homogenisat wird zentrifugiert. Der Überstand wird abdekantiert. Das Sediment wird verworfen. Die Menge an Überstand entspricht dem eingesetzten Puffer. Der so gewonnene Überstand ist der Schweineleberrohextrakt, der eine hohe katalytische Aktivität besitzt. Es wurden 66 mg Gesamtprotein/ ml Extrakt erhalten.Fresh pork liver is digested with potassium phosphate buffer at pH 7.5 in a mass ratio of 1: 4 at room temperature for 3 minutes in a homogenizer. The homogenate is centrifuged. The supernatant is decanted off. The sediment is discarded. The amount of supernatant corresponds to the buffer used. The supernatant obtained in this way is the raw pig liver extract, which has a high catalytic activity. 66 mg of total protein / ml of extract were obtained.
Die Volumenaktivität der Esterase beträgt ca. 6,5 U/ ml, die spezifische Aktivität beträgt ca. 0,1 U/ mg.The volume activity of the esterase is approximately 6.5 U / ml, the specific activity is approximately 0.1 U / mg.
Beispiel 2Example 2
Untersuchung der Esterase aus SchweineleberExamination of pig liver esterase
Die Quartäre Struktur der Esterase aus Schweineleber ist in den meisten Fällen ein trimeres Protein mit drei identischen Untereinheiten und jeweils einem aktiven Zentrum mit einem Molekulargewicht von ca. 60 kd. Bei der Gelelektrophorese darf deshalb nur eine Bande bei 60 kd auftreten. Zur Untersuchung der Esterase wurde deshalb ein Schwein eleberextrakt, der wie im Beispiel 1 beschrieben hergestellt wurde, in verschiedenen Verdünnungen auf ein SDS-Gel neben käuflicher Schweineleberesterase und Markerproteinen aufgetragen. Das Ergebnis der Gelelektrophorese ist in der Fig. 1 dargestellt.The quaternary structure of the pig liver esterase is in most cases a trimeric protein with three identical subunits and each with an active center with a molecular weight of approx. 60 kd. Therefore, only one band at 60 kd may occur in gel electrophoresis. To investigate the esterase, a pig liver extract, which was prepared as described in Example 1, was therefore applied in various dilutions to an SDS gel in addition to commercially available pig liver esterase and marker proteins. The result of the gel electrophoresis is shown in FIG. 1.
Beispiel 3Example 3
Hersteilung der immobilisierten Esterase aus Schweineleber-Rohextrakt Zu 10 ml des in Beispiel 1 erhaltenen Rohextraktes werden 1 g Eupergit C Harz gegeben und bei Raumtemperatur 72 Stunden langsam geschüttelt. Die an Eupergit C immobilisierte Rohextrakt-Esterase wird über eine Filtemutsche von Schleim und Blut getrennt und dreimal mit jeweils 20 ml 0,1 M Kaliumphosphat- Puffer gewaschen. Die immobilisierte Rohextrakt-Esterase wird mit 0,1 M Kaliumphosphat-Puffer im Verhältnis 1 :1 gelagert. 1 g Eupergit C bindet ca. 0,7g Protein kovalent. Die Volumenaktivität der immobilisierten Esterase beträgt ca. 8,5 U/ g mit NIPA-DME als Substrat.Preparation of the immobilized esterase from raw pig liver extract 1 g of Eupergit C resin is added to 10 ml of the crude extract obtained in Example 1 and slowly shaken at room temperature for 72 hours. The crude extract esterase immobilized on Eupergit C is separated from mucus and blood via a filter slide and washed three times with 20 ml 0.1 M potassium phosphate buffer each. The immobilized crude extract esterase is stored in a 1: 1 ratio with 0.1 M potassium phosphate buffer. 1 g of Eupergit C covalently binds about 0.7 g of protein. The volume activity of the immobilized esterase is approximately 8.5 U / g with NIPA-DME as the substrate.
In analoger Verfahrensweise wird isolierte und gereinigte Schweineleberesterase zum Vergleich behandelt.In an analogous procedure, isolated and purified pig liver esterase is treated for comparison.
Beispiel 4Example 4
Durchführung der Fermentation im ReaktorCarrying out the fermentation in the reactor
Die Immobilisate der Rohextrakte aus Beispiel 3 werden im Reaktor vorgelegt. Das Produkt kann ohne den Reaktor vollständig zu entleeren mit einem Filter abgesaugt werden. Anschließend kann der Reaktor wieder mit Substraten neu beschickt werden. Dieser Vorgang kann so lange wiederholt werden, bis das Enzym seine Aktivität verloren hat. Es hat sich in der Praxis gezeigt, daß das Verfahren mehr als 100 mal ohne Aktivitätsverlust wiederholt werden kann.The immobilisates of the crude extracts from Example 3 are placed in the reactor. The product can be suctioned off with a filter without completely emptying the reactor. The reactor can then be reloaded with substrates. This process can be repeated until the enzyme has lost its activity. It has been shown in practice that the process can be repeated more than 100 times without loss of activity.
4.1 Ergebnisse der Kinetikstudien am Immobilisat4.1 Results of the kinetics studies on the immobilisate
Für das Immobilisat wurden Kinetikstudien mit 10 g/ 1 und 50 g/ 1 NIPA-DME Anfangskonzentration durchgeführt. Die kinetischen Untersuchungen zeigen, daß die Kinetikparameter für die Substrataffinität und der Inhibitionskonstante für Methanol der freien Esterase mit denen der immobilisierten Esterase übereinstimmen. Damit verhält sich das gebundene Enzym in seinen kinetischen Eigenschaften wie das freie Enzym. Die spezifische Aktivität der feuchten immobilisierten Esterase beträgt ca. 8,5 U/ g bzw. 0,51 mol Substrat/Stunde und kg Immobilisat. Die Gesamtaktivität des Immobilisats gegenüber der des eingesetzten Schweineleberextraktes ist durch den Immobilisierungsprozeß auf ca. 50 % reduziert.Kinetics studies with 10 g / 1 and 50 g / 1 NIPA-DME initial concentration were carried out for the immobilizate. The kinetic studies show that the kinetic parameters for the substrate affinity and the inhibition constant for methanol of the free esterase agree with those of the immobilized esterase. The bound enzyme thus behaves like the free enzyme in its kinetic properties. The specific activity of the moist immobilized esterase is approximately 8.5 U / g or 0.51 mol substrate / hour and kg immobilizate. The total activity of the immobilizate compared to that of the pig liver extract used is reduced to approximately 50% by the immobilization process.
4.2 Langzeitstabilitätsuntersuchung der immobilisierten Esterase an Eupergit4.2 Long-term stability study of the immobilized esterase on Eupergit
Entscheidend für den Einsatz des Immobilisates im technischen Maßstab ist die Stabilität des immobilisierten Enzyms beim mehrmaligen Einsatz. Zur Immobilisierung wurde die Leber im Verhältnis 1 :4 mit 1 M Phosphatpuffer (pH 7,5) aufgeschlossen.The stability of the immobilized enzyme when used repeatedly is decisive for the use of the immobilized product on an industrial scale. For immobilization, the liver was disrupted 1: 4 with 1 M phosphate buffer (pH 7.5).
Auf 500 ml Schweineleberrohextrakt mit einer spezifischen Aktivität von 6,5 U/ ml und einer Gesamtaktivität von 3250 U wurden 50 g Eupergit eingesetzt und 80 h bei 25°C geschüttelt. Nach dem Abtrennen des Eupergits vom Extrakt wurde eine spezifische Aktivität des Immobilisats von 35,75 U/ g, bezogen auf das Trockengewicht, festgestellt. Dies entspricht einer Gesamtaktivität von 1787,5 U und einem Aktivitätsverlust durch die Immobilisierung von 45%. Das Immobilisat quillt während der Immobilisierung auf ca. den 4fachen Wert gegenüber der Trockenmasse (200 g). Da das Immobilisat im feuchten Zustand gelagert und eingesetzt wird, ist die Aktivität des Immobilisats für den gequollenen Zustand 8,94 U/ g, bezogen auf das Feuchtgewicht. Mit diesem Immobilisat wurde eine Langzeitstudie durchgeführt, wobei der Einsatz von NIPA-DME pro Ansatz 10 g/ 1 betrug. Die Reaktion wurde bei 38°C und einem pH-Wert von 7,5 über einen Zeitraum von 24 Stunden durchgeführt. Dadurch erfolgte die Abtrennung des Immobilisats von der Lösung und der erneute50 g of Eupergit were used on 500 ml of raw pork liver extract with a specific activity of 6.5 U / ml and a total activity of 3250 U and shaken at 25 ° C. for 80 h. After the separation of the eupergite from the extract, a specific activity of the immobilizate of 35.75 U / g, based on the dry weight, was found. This corresponds to a total activity of 1787.5 U and a loss of activity due to immobilization of 45%. The immobilizate swells during immobilization to about 4 times the dry mass (200 g). Since the immobilizate is stored and used in the moist state, the activity of the immobilizate for the swollen state is 8.94 U / g, based on the wet weight. A long-term study was carried out with this immobilizate, the use of NIPA-DME per batch being 10 g / l. The reaction was carried out at 38 ° C and pH 7.5 for 24 hours. As a result, the immobilizate was separated from the solution and renewed
Einsatz des Immobilisats. Die zeitliche Abnahme der spezifischen Aktivität und der normierten Aktivität des Enzyms ist in Fig. 3a und Fig. 3b dargestellt. Nach etwa 200 Betriebsstunden besitzt die immobilisierte Esterase aus dem Schweineleber-Rohextrakt noch 65% Restaktivität. Die Halbwertzeit des Immobilisats beträgt etwa 250 h und ist damit hervorragend für den technischen Einsatz im Fermenter geeignet. Bei einer Einsatzdauer von 500 h lassen sich bei 10 %iger Beladung des Immobilisats mit 10 g/l NIPA-DME mindestens 100 Batches mit einer mittleren Reaktionszeit von 5 Stunden fahren. Beispiel 5Use of the immobilisate. The decrease in time of the specific activity and the normalized activity of the enzyme is shown in Fig. 3a and Fig. 3b. After about 200 hours of operation, the immobilized esterase from the raw pig liver extract still has 65% residual activity. The half-life of the immobilized product is approximately 250 hours, making it ideal for technical use in the fermenter. If the immobilizate is loaded with 10 g / l NIPA-DME for 10 hours, at least 100 batches can be run with an average reaction time of 5 hours. Example 5
Vergleich der Aktivität von isolierter und gereinigter Esterase mit Esterase aus Schweineleber - Rohextrakt im FermentationsprozeßComparison of the activity of isolated and purified esterase with pork liver crude extract esterase in the fermentation process
Die Durchführung der kontrollierten Fermentation erfolgte in einem Biostat ED Fermenter gemäß der in Fig. 2 dargestellten Anordnung.The controlled fermentation was carried out in a Biostat ED fermenter in accordance with the arrangement shown in FIG. 2.
Der Vergleich wurde mit 10 g NIPA-DME/ 1 durchgeführt.The comparison was carried out with 10 g of NIPA-DME / 1.
Es wurde käufliche gereinigte Schweineleber-Esterase (103 U/ mg Protein) und Esterase aus Schweineleberrohextrakt in analoger Weise behandelt. Es wurde zunächst jeweils die enzymatische Aktivität der ungebundenen Esterasen (gereinigt und aus Rohextrakt) untersucht. Anschließend wurden die gereinigte Esterase und der Rohextrakt, der die ungereinigte Esterase enthält, gemäß Beispiel 3 mit Eupergit C umgesetzt.Commercial purified pig liver esterase (103 U / mg protein) and ester pig raw crude extract were treated in an analogous manner. The enzymatic activity of the unbound esterases (purified and from crude extract) was examined first. The purified esterase and the crude extract containing the unpurified esterase were then reacted with Eupergit C according to Example 3.
5.1 Vergleich der Aktivitäten der ungebundenen Esterasen5.1 Comparison of the activities of the unbound esterases
Beim Vergleich der ungebundenen Schweineleber-Esterasen ergibt sich, daß für einen vergleichbaren Umsatz im Gegensatz zur gereinigten Esterase nur ca. 1/30 der Menge an immobilisiertem Rohextrakt verwendet werden muß. Hierbei entsprechen 2 g Proteinrohextrakt etwa 70 mg gereinigter käuflicher Esterase.A comparison of the unbound pork liver esterases shows that, in contrast to the purified esterase, only about 1/30 of the amount of immobilized crude extract has to be used for a comparable conversion. 2 g of crude protein extract correspond to about 70 mg of purified commercially available esterase.
5.2 Vergleich der Aktivitäten der an Eupergit C gebundenen Esterasen5.2 Comparison of the activities of the esterases bound to Eupergit C.
Beim Vergleich der an Eupergit C gebundenen Schweineleberesterasen ergibt sich, daß zur Erzielung vergleichbarer Resultate im Gegensatz zur gereinigten Esterase nur etwa 1/5 der Menge an immobilisiertem Rohextrakt aufgebracht werden muß.A comparison of the pig liver esterases bound to Eupergit C shows that, in order to achieve comparable results, in contrast to the purified esterase, only about 1/5 of the amount of immobilized crude extract has to be applied.
Hierbei entsprechen 4 g immobilisierter Rohextrakt etwa 0,75 g immobilisierter gereinigter Esterase.4 g of immobilized crude extract correspond to approximately 0.75 g of immobilized purified esterase.
Aus den Ergebnissen ist zu erkennen, daß das Immobilisat aus dem Rohextrakt der Schweineleber wesentlich aktiver ist, als das Immobilisat mit käuflicher Schweineleber - Esterase. Neben der wesentlich höheren Aktivität ist das Immobilisat aus dem Rohextrakt gegenüber dem Immobilisat aus gereinigter Esterase auch weitaus billiger in der Herstellung, da die vorgeschalteten aufwendigen Reinigungsverfahren entfallen. It can be seen from the results that the immobilizate from the crude extract of the pig liver is considerably more active than the immobilisate with commercially available pig liver esterase. In addition to the much higher activity that is Immobilisate from the crude extract is also much cheaper to produce than the immobilisate from purified esterase, since the upstream, complex cleaning processes are eliminated.

Claims

Patentansprüche claims
An Harze kovalent gebundene nicht isolierte und gereinigte Esterasen aus Rohextrakten von tierischen oder pflanzlichen Zellen und tierischem oder pflanzlichem Gewebe zur Fermentation in Bioreaktoren.Uninsulated and purified esterases from crude extracts of animal or vegetable cells and animal or vegetable tissue covalently bound to resins for fermentation in bioreactors.
2. An Harze gebundene Esterase gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß die Esterase aus dem Rohextrakt der2. Resin bound esterase according to claim 1, characterized in that the esterase from the crude extract
Schweineleber gewonnen wird.Pork liver is obtained.
3. An Harze gebundene Esterase gemäß den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Harz ein Epoxidharz ist.3. Resin bound esterase according to claims 1 and 2, characterized in that the resin is an epoxy resin.
4. Verwendung der Esterasen gemäß den Ansprüchen 1 - 3 zur Spaltung von Carbonsäureestern zu freien Säureanionen und Alkoholen.4. Use of the esterases according to claims 1-3 for the cleavage of carboxylic acid esters to free acid anions and alcohols.
Verwendung der Esterasen gemäß den Ansprüchen 1 - 3 zur Spaltung von Carbonsäureestern zu freien Säureanionen und Alkoholen in Bioreaktoren.Use of the esterases according to claims 1-3 for the cleavage of carboxylic acid esters to free acid anions and alcohols in bioreactors.
Verwendung der Esterasen gemäß den Ansprüchen 1 - 3 zur Spaltung von Nitroisophthalsäuredimethylester (NIPA-DME) zu Nitroisophthalsäuremono-methylester (NIPA-MME).Use of the esterases according to claims 1-3 for the cleavage of nitroisophthalic acid dimethyl ester (NIPA-DME) to nitroisophthalic acid mono-methyl ester (NIPA-MME).
7. Verwendung der Esterasen gemäß den Ansprüchen 1 - 3 zur Verseifung von 2-Fluoro-Ara-triacetat zum 2-F-ara-Adenin.7. Use of the esterases according to claims 1-3 for the saponification of 2-fluoro-ara-triacetate to 2-F-ara-adenine.
8. Verwendung der Esterasen gemäß den Ansprüchen 1 - 3 zur Partialverseifung von ReichsteinS-17,21 -diacetat zu ReichsteinS-17- monoacetat. 8. Use of the esterases according to claims 1-3 for partial saponification of ReichsteinS-17,21-diacetate to ReichsteinS-17-monoacetate.
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