【発明の詳細な説明】
粗製抽出物からの固定化された
エステラーゼおよびその使用
本発明は、粗製抽出物からの固定化されたプロテインおよびバイオリアクター
中の発酵へのその使用に関する。
生化学および生物工学の方法において、しばしば複数の反応を同時に実施し、
これから一般に１つの所望の生成物のみを生じる。この場合に進行するすべての
反応は同時反応（例えば連続反応および並行反応）と呼ばれる。技術的規模で行
われる製造において、最終生成物のできるだけ高い収率を獲得し、同時に高い純
度および少ない費用を得ることが重要である。
発酵装置もしくはバイオリアクター中の生化学もしくは生物工学反応に使用さ
れる重要な酵素はエステラーゼである。
カルボキシルエステラーゼは天然にきわめて広く分布している。これはカルボ
ン酸エステルの加水分解に触媒活性に作用し、遊離酸アニオンおよびアルコール
を生じる。
豚肝臓カルボキシエステラーゼを使用してベンゾジカルボン酸モノマーおよび
その誘導体を製造する方法はすでに公知である（特開平２−１９９６１６号）。
更に発酵に適した酵素を固定化できることが知られている。
しかしながら固定化は常に単離し、精製した酵素を用いて実施される。
従って、発酵のために、酵素を予め単離せず、また精製しなくてよいように酵
素の固定化を実施することが好ましく、これは費用を節約し、かなり低い活性損
失およびそれと共に改良された生成物の収率を生じる。
樹脂に結合することにより、エステラーゼを予め単離および精製せずに動物ま
たは植物の組織および細胞の粗製抽出物から直接固定化できることが判明した。
このための適当な樹脂は、例えばエポキシ樹脂である。
従って、本発明の対象は、樹脂に共有結合され、これにより固定化された、動
物または植物の細胞および動物または植物の組織の粗製抽出物からのエステラー
ゼである。
豚肝臓の粗製抽出物からのエステラーゼが特に価値があることが示された。
従って、本発明の対象は、特に樹脂に結合された豚肝臓の粗製抽出物からのエ
ステラーゼである。
このために適当な樹脂は、例えばエポキシ樹脂ユーペルジット（Ｅｕｐｅｒｇ
ｉｔ）Ｃである。
樹脂に結合された豚肝臓の粗製抽出物からのエステ
ラーゼは、高い収率および高い活性を有して、バイオリアクター中でカルボン酸
エステルを分解して遊離酸アニオンおよびアルコールを生じるために使用するこ
とができる。
本発明の固定化されたエステラーゼは、有利にはニトロイソフタル酸ジメチル
エステル（ＮＩＰＡ−ＤＭＥ）を分解してニトロイソフタル酸モノメチルエステ
ル（ＮＩＰＡ−ＭＭＥ）を生じるために使用することができ、その際ニトロイソ
フタル酸（ＮＩＰＡ）を生じる好ましくない反応が起きない。
更に本発明の固定化されたエステラーゼは、有利には２−フルオロ−Ａｒａ−
アデニン−トリアセテートをけん化し、２−Ｆ−ａｒａ−アデニン（Ｆ−ａｒａ
Ａ）、フルダラ（Ｆｌｕｄａｒａ）の前駆物質を製造するために使用することが
できる。
本発明の固定化されたエステラーゼの他の有利な使用は、ライヒシュタインＳ
−１７、２１−ジアセテートからライヒシュタインＳ−１７−モノアセテートを
生じる部分的けん化の際の使用である。
意想外にも、本発明の固定化されたエステラーゼを用いて発酵の際に最終生成
物の高い収率を達成することができた。
酵素反応の際に、単離し、精製した酵素を使用してできるだけ高い変換率もし
くは高い収率を達成することが一般に知られていたので、これは予測されなかっ
たことである。酵素の不純化は一般に活性を阻害するとみなされる。更に一般に
、粗製抽出物中に存在する他の酵素が反応を妨害するかまたは更にほかの酵素反
応に触媒活性に作用することに由来する。
図面の説明
図１は豚肝臓からの精製したエステラーゼおよび粗製抽出物からの豚肝臓エス
テラーゼを用いるＳＤＳゲル電気泳動（１２.５％アクリルアミドゲル）の結果
を示す。
図面において１、７は標識プロテイン（トリオースホスフェートイソメラーゼ
２６.６ｋｄ、グルタメートデヒドロゲナーゼ５５.５６ｋｄ）を表し、２、３は
精製した豚肝臓エステラーゼを表し、４〜６、８〜９は種々の希釈度の豚肝臓粗
製抽出物を表す。
図２は発酵に必要な構成を示し、図面において、ＰＣはコンピューターを表し
、ＮＨ３はアンモニア水溶液を表し、７１８Ｓｔａｔ Ｔｉｔｒｉｎｏは滴定装
置を表し、Ｔは熱電対により測定した温度を表す。
図３ａは長時間使用する場合の固定化生成物の比活性損失を示し、
図３ｂは長時間使用する場合の固定化生成物の標準化された活性損失を示す。
本発明を以下の実施例により詳細に説明する。本発明は実施例に限定されない
。
例１
豚肝臓からのエステラーゼの抽出
新鮮な豚肝臓を、ホモジェナイザー中で燐酸カリウム緩衝液を用いてｐＨ７.
５で質量比１：４で、室温で３分間溶解する。均質物を遠心分離する。上澄液を
取る。沈殿物を捨てる。上澄液の量は使用される緩衝液に相当する。こうして得
られた上澄液は高い触媒活性を有する豚肝臓粗製抽出物である。抽出物１ｍｌ当
たり全プロテイン６６ｍｇが得られた。
エステラーゼの容積活性は約６.５Ｕ／ｍｌであり、比活性は約０.１Ｕ／ｍｇ
である。
例２
豚肝臓からのエステラーゼの試験
豚肝臓からのエステラーゼの四次構造は、多くの場合に分子量約６０ｋｄを有
し、３個の同一の構成単位およびそれぞれ１つの活性中心を有する三量体のプロ
テインである。従ってゲル電気泳動の際に６０ｋｄで１つの帯域が現れるはずで
ある。従ってエステラーゼの試験のために、例１に記載のように製造した豚肝臓
抽出物を、種々の希釈度で、市販される豚肝臓エステラーゼおよび標識プロテイ
ンと共にＳＤＳゲルに配置した。
ゲル電気泳動の結果を図１に示す。
例３
豚肝臓粗製抽出物からの固定化されたエステラーゼの製造
例１で得られた粗製抽出物１０ｍｌに、ユーペルジットＣ樹脂１ｇを添加し、
室温で７２時間緩慢に振とうする。ユーペルジットＣに固定化された粗製抽出物
−エステラーゼをブフナー漏斗により粘液および血液から分離し、それぞれ０.
１モルリン酸カリウム緩衝液２０ｍｌで３回洗浄する。固定化された粗製抽出物
−エステラーゼを０.１モルリン酸カリウム緩衝液と共に１：１の比で配置する
。ユーペルジットＣ１ｇがプロテイン約０.７ｇと共有結合する。固定化された
エステラーゼの容積活性は、基質としてＮＩＰＡ−ＤＭＥを用いて約８.５Ｕ／
ｇである。
同様の方法で、単離し、精製した豚肝臓エステラーゼを比較のために処理する
。
例４
反応装置中の発酵の実施
例３で製造した粗製抽出物の固定化生成物を反応装置に装入する。反応装置を
完全にからにせずに生成物をフィルターで吸引濾過することができる。引き続き
反応装置に再び基質を装填することができる。酵素が活性を失うまでこの方法を
繰り返すことができる。実際にはこの方法を活性損失を生じることなく１００回
以上繰り返すことができることが示された。
４.１固定化生成物での動力学研究の結果
固定化生成物に関してＮＩＰＡ−ＤＭＥ開始濃度１０ｇ／ｌおよび５０ｇ／ｌ
で動力学研究を実施した。
動力学試験により、遊離エステラーゼのメタノールに関する基質親和性および阻
害定数の動力学変数が固定化されたエステラーゼの動力学変数に一致することが
示される。従って、結合した酵素はその動力学特性において遊離酵素と同様の特
性を示す。
湿った固定化されたエステラーゼの比活性は約８.５Ｕ／ｇもしくは固定化生
成物１ｋｇおよび１時間当たり基質０.５１モルである。
使用される豚肝臓抽出物の全活性に対する固定化生成物の全活性は固定化処理
により約５０％に減少する。
４.２ユーペルジット上の固定化されたエステラーゼの長時間安定性の試験
２回以上使用する場合の固定化酵素の安定性が技術的規模の固定化生成物の使
用に決定的である。
固定化のために前記の肝臓を１モルリン酸塩緩衝液（ｐＨ７.５）と共に１：
４の比で溶解した。
比活性６.５Ｕ／ｍｌおよび全活性３２５０Ｕを有する豚肝臓粗製抽出物５０
０ｍｌにユーペルジット５０ｇを導入し、２５℃で８０時間振った。抽出物から
ユーペルジットを分離後、乾燥重量に対して３５.７５Ｕ／ｇの固定化生成物の
比活性を決定した。これは全活性１７８７.５Ｕおよび固定化による活性損失４
５％に相当する。固定化中に固定化生成物は乾燥質量（２００ｇ）に対して約４
倍の値に膨潤する。湿った
状態で固定化生成物を保存し、使用するので、膨潤した状態に関する固定化生成
物の活性は水分含有重量に対して８.９４Ｕ／ｇである。この固定化生成物を用
いて長時間研究を実施し、その際出発物質当たりのＮＩＰＡ−ＤＭＥの装入量は
１０ｇ／ｌであった。反応を３８℃およびｐＨ値７.５で２４時間にわたり実施
した。これにより溶液から固定化生成物を分離し、固定化生成物を再び装入した
。酵素の比活性および標準化された活性の時間的減少を図３ａおよび図３ｂに示
す。作動時間約２００時間後に豚肝臓−粗製抽出物からの固定化されたエステラ
ーゼはなお残存活性６５％を有する。固定化生成物の半減期は約２５０時間であ
り、これにより発酵装置中の技術的使用にきわめて適している。使用時間５００
時間で固定化生成物を１０％装填してＮＩＰＡ−ＤＭＥ１０ｇ／ｌを用いて少な
くとも１００回のバッチを平均反応時間５時間で実施することができる。
例５
単離し、精製したエステラーゼの活性と発酵工程での豚肝臓−粗製抽出物から
のエステラーゼの活性の比較
図２に示される装置によりバイオスタット（Ｂｉｏｓｔａｔ）ＥＤ発酵装置中
で調節された発酵を実施した。
ＮＩＰＡ−ＤＭＥ１０ｇ／ｌを用いて比較した。
市販の精製した豚肝臓−エステラーゼ（プロテイン１０３Ｕ／ｍｇ）および豚
肝臓粗製抽出物からのエステラーゼを同様の方法で処理した。最初に結合してい
ない（精製した、粗製抽出物からの）エステラーゼの酵素活性をそれぞれ検査し
た。
引き続き例３に記載された精製したエステラーゼおよび精製していないエステ
ラーゼを含有する粗製抽出物を、ユーペルジットＣと反応させた。
５.１結合していないエステラーゼの活性の比較
結合していない豚肝臓−エステラーゼの比較の際に、精製したエステラーゼに
対して比較できる変換率のために、約１／３０の量の固定化された粗製抽出物を
使用することのみが必要であることが示される。この場合にプロテイン粗製抽出
物２ｇは精製した市販のエステラーゼ約７０ｍｇに相当する。
５.２ユーペルジットＣに結合したエステラーゼの活性の比較
ユーペルジットＣに結合した豚肝臓エステラーゼの比較の際に、精製したエス
テラーゼに対して比較できる結果を達成するために、約１／５の量の固定化され
た粗製抽出物を用意することのみが必要であることが示される。この場合に固定
化された粗製抽出物４ｇは固定化され、精製したエステラーゼ約０.７５ｇに相
当する。
結果から、豚肝臓の粗製抽出物からの固定化生成物
が市販の豚肝臓エステラーゼの固定化生成物よりかなり活性であることが認めら
れる。粗製抽出物からの固定化生成物は、かなり高い活性のほかに、前方接続し
た費用のかかる精製法を省くことができるので、精製したエステラーゼからの固
定化生成物に比べてはるかに安く製造できる。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Immobilized from crude extract
Esterase and its use
The present invention relates to immobilized proteins and bioreactors from crude extracts.
It relates to its use in fermentation during.
In biochemical and biotechnological methods, often multiple reactions are performed simultaneously,
This generally results in only one desired product. All proceed in this case
The reactions are referred to as simultaneous (eg, continuous and parallel). Rows on a technical scale
Production yields the highest possible yield of the final product and at the same time
It is important to get the degree and low cost.
Used for biochemical or biotechnological reactions in fermenters or bioreactors
An important enzyme that is involved is esterase.
Carboxylesterases are extremely widely distributed in nature. This is Carbo
Acts catalytically on the hydrolysis of acid esters, free acid anions and alcohols
Is generated.
Benzodicarboxylic acid monomer using pig liver carboxylesterase and
A method for producing the derivative is already known (JP-A-2-199616).
It is also known that enzymes suitable for fermentation can be immobilized.
However, immobilization is always performed with isolated and purified enzymes.
Therefore, for fermentation, the enzyme must be isolated and not purified in advance.
Preferably, elemental immobilization is carried out, which saves costs and has a considerably lower activation loss.
Loss and, consequently, improved product yields.
By binding to the resin, the esterase can be isolated from the animal without prior isolation and purification.
Or from plant extracts and crude extracts of cells.
Suitable resins for this are, for example, epoxy resins.
Thus, the subject of the present invention is a dynamic, covalently bonded, thereby immobilized resin.
From crude extracts of products or plant cells and animal or plant tissues
It is Ze.
Esterase from crude extracts of pig liver has been shown to be particularly valuable.
The subject of the present invention is therefore, in particular, an extract from a crude extract of pig liver bound to resin.
It is a sterase.
Suitable resins for this purpose are, for example, epoxy resins Eupergit.
it) C.
Estes from crude extracts of pig liver bound to resin
Lase has high yield and high activity,
Used to decompose esters to form free acid anions and alcohols.
Can be.
The immobilized esterase of the present invention is advantageously dimethyl nitroisophthalate.
Decomposes ester (NIPA-DME) to give monomethyl nitroisophthalate
(NIPA-MME) can be used to produce
No undesired reactions occur which result in phthalic acid (NIPA).
Further, the immobilized esterase of the present invention is preferably 2-fluoro-Ara-
Adenine-triacetate is saponified to give 2-F-ara-adenine (F-ara).
A), which can be used to produce a precursor of Fludara
it can.
Another advantageous use of the immobilized esterases of the invention is that of Reichstein S.
-17,21-diacetate to Reichstein S-17-monoacetate
Use in the event of partial saponification.
Surprisingly, the final production during fermentation using the immobilized esterase of the invention
A high yield of product could be achieved.
During the enzymatic reaction, use the isolated and purified enzyme for the highest possible conversion.
This was not expected since it was generally known to achieve high yields.
That is. Impurity of the enzyme is generally considered to inhibit activity. More generally
Other enzymes present in the crude extract interfere with the reaction or
It is derived from acting on the catalytic activity accordingly.
Description of the drawings
Figure 1 shows purified esterase from pig liver and pig liver S from crude extract.
Results of SDS gel electrophoresis (12.5% acrylamide gel) using Terase
Is shown.
In the drawings, reference numerals 1 and 7 denote labeled proteins (triose phosphate isomerase).
26.6 kd, glutamate dehydrogenase 55.56 kd).
Represents purified pig liver esterase, 4-6, 8-9 are various dilutions of pig liver crude
Represents an extract made by the company.
FIG. 2 shows a configuration required for fermentation, in which PC represents a computer.
, NH3 represents an aqueous ammonia solution, and 718Stat Titino is a titrator.
And T represents the temperature measured by the thermocouple.
FIG. 3a shows the specific activity loss of the immobilized product when used for a long time,
FIG. 3b shows the normalized activity loss of the immobilized product when used for a long time.
The present invention will be described in detail by the following examples. The invention is not limited to the examples
.
Example 1
Extraction of esterase from pig liver
Fresh pork liver is pH 7.0 using potassium phosphate buffer in a homogenizer.
Dissolve in a 1: 4 mass ratio at room temperature for 3 minutes at room temperature. Centrifuge the homogenate. The supernatant
take. Discard the sediment. The volume of the supernatant corresponds to the buffer used. Thus obtained
The supernatant obtained is a crude extract of pig liver with high catalytic activity. 1 ml of extract
As a result, 66 mg of total protein was obtained.
The esterase has a volume activity of about 6.5 U / ml and a specific activity of about 0.1 U / mg.
It is.
Example 2
Testing of esterase from pig liver
The quaternary structure of esterase from pig liver often has a molecular weight of about 60 kd.
And a trimeric pro-form having three identical building blocks and one active center each.
Thein. Therefore, one band should appear at 60 kd during gel electrophoresis.
is there. Thus, pig liver prepared as described in Example 1 for esterase testing
The extract was prepared at various dilutions using commercially available porcine liver esterase and labeled protein.
And placed on an SDS gel.
FIG. 1 shows the results of the gel electrophoresis.
Example 3
Production of immobilized esterase from pig liver crude extract
To 10 ml of the crude extract obtained in Example 1 was added 1 g of Eupergit C resin,
Shake gently at room temperature for 72 hours. Crude extract immobilized on Eupergit C
-Esterase is separated from mucus and blood by a Buchner funnel,
Wash three times with 20 ml of 1 molar potassium phosphate buffer. Immobilized crude extract
-Esterase is arranged in a 1: 1 ratio with 0.1M potassium phosphate buffer
. Eupergit C1g is covalently linked to about 0.7g of protein. Immobilized
The volume activity of the esterase was about 8.5 U / using NIPA-DME as substrate.
g.
In a similar manner, isolated and purified porcine liver esterase is processed for comparison
.
Example 4
Perform fermentation in the reactor
The immobilized product of the crude extract prepared in Example 3 is charged to the reactor. Reactor
The product can be filtered off with suction through the filter without complete emptiness. Continue
The reactor can be reloaded with substrate. Do this until the enzyme loses activity.
Can be repeated. Practically, this method is performed 100 times without loss of activity.
It was shown that the above can be repeated.
4.1 Results of kinetic studies on immobilized products
NIPA-DME starting concentrations 10 g / l and 50 g / l for immobilized product
Kinetic studies were performed.
Kinetic studies indicate the substrate affinity and inhibition of free esterase for methanol.
The kinetic variables of the harm constants may match the kinetic variables of the immobilized esterase
Is shown. Thus, the bound enzyme has similar kinetic properties to the free enzyme.
Shows sex.
The specific activity of the wet immobilized esterase is about 8.5 U / g or immobilized esterase.
0.51 mole of substrate per kg of product and hour.
The total activity of the immobilized product relative to the total activity of the used pig liver extract is immobilized
To about 50%.
4.2 Long-term stability test of immobilized esterase on Eupergit
The stability of the immobilized enzyme when used more than once indicates the use of technical-scale immobilized products.
Definitive for use.
For fixation, the liver was mixed with 1 molar phosphate buffer (pH 7.5):
Dissolved in a ratio of 4.
Porcine liver crude extract 50 having a specific activity of 6.5 U / ml and a total activity of 3250 U
50 g of Eupergit was introduced into 0 ml and shaken at 25 ° C. for 80 hours. From the extract
After separation of Eupergit, 35.75 U / g of immobilized product based on dry weight
The specific activity was determined. This is a total activity of 1787.5 U and a loss of activity due to immobilization of 4
Equivalent to 5%. During the immobilization, the immobilized product was about 4% of the dry mass (200 g).
Swell to double the value. Moist
Since the immobilized product is stored and used in a state, the immobilized product in the swollen state is generated
The activity of the product is 8.94 U / g relative to the water content weight. Use this immobilized product
And carried out long-term studies, where the charge of NIPA-DME per starting material was
It was 10 g / l. The reaction is carried out at 38 ° C. and pH 7.5 for 24 hours
did. This separated the immobilized product from the solution and recharged the immobilized product
. The time course of the specific activity and the normalized activity of the enzyme is shown in FIGS. 3a and 3b.
You. Immobilized Estella from pig liver-crude extract after about 200 hours of working time
It still has 65% residual activity. The half-life of the immobilized product is about 250 hours.
This makes it very suitable for technical use in fermenters. Usage time 500
After loading 10% of the immobilized product over time, use 10 g / l of NIPA-DME to reduce
At least 100 batches can be carried out with an average reaction time of 5 hours.
Example 5
Isolated and purified esterase activity and pig liver from fermentation process-from crude extract
Of Esterase Activity in Rice
In the Biostat ED fermentation apparatus using the apparatus shown in FIG.
A controlled fermentation was performed.
Comparison was made using 10 g / l of NIPA-DME.
Commercially Purified Porcine Liver-Esterase (Protein 103 U / mg) and Porcine
Esterase from liver crude extract was treated in a similar manner. First joined
Each of the esterases (from purified, crude extract) was tested for enzymatic activity.
Was.
The purified esterase and the unpurified esterase described in Example 3
The crude extract containing the enzyme was reacted with Eupergit C.
5.1 Comparison of unbound esterase activity
For comparison of unbound pig liver-esterase, the purified esterase
For a comparable conversion rate, about 1/30 of the amount of immobilized crude extract was used.
It indicates that only use is necessary. In this case the crude protein extraction
2 g of product corresponds to about 70 mg of purified commercial esterase.
5.2 Comparison of the activity of esterase bound to Eupergit C
When comparing pig liver esterase bound to Eupergit C, the purified ES
To achieve comparable results for Terase, about 1/5 of the immobilized
This indicates that it is only necessary to prepare a crude extract. Fixed in this case
4 g of the immobilized crude extract was immobilized and corresponded to about 0.75 g of purified esterase.
Hit.
The results show that the immobilized product from the crude extract of pig liver
Was found to be significantly more active than the immobilized product of commercially available pig liver esterase
It is. The immobilized product from the crude extract, in addition to the significantly higher activity,
Costly purification methods can be omitted, and the
Can be manufactured much cheaper than the stabilization products.
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(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，
ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ
Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ
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ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，Ｍ
Ｗ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ
，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ
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