WO1998024817A1 - Nouvel adn, nouvelle proteine et nouvel anticorps - Google Patents

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WO1998024817A1
WO1998024817A1 PCT/JP1997/004470 JP9704470W WO9824817A1 WO 1998024817 A1 WO1998024817 A1 WO 1998024817A1 JP 9704470 W JP9704470 W JP 9704470W WO 9824817 A1 WO9824817 A1 WO 9824817A1
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protein
dna
cell
cells
protein according
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PCT/JP1997/004470
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English (en)
French (fr)
Inventor
Hajime Yoshisue
Akiko Saito
Satoshi Nakagawa
Tetsuro Kuga
Akeo Shinkai
Masamichi Koike
Tatsunari Nishi
Original Assignee
Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
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    • C07K14/521—Chemokines
    • C07K14/523—Beta-chemokines, e.g. RANTES, I-309/TCA-3, MIP-1alpha, MIP-1beta/ACT-2/LD78/SCIF, MCP-1/MCAF, MCP-2, MCP-3, LDCF-1, LDCF-2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to a protein having an ability to activate eosinophils, a DNA or an oligonucleotide encoding the protein, a recombinant vector containing the DNA, a transformant containing the recombinant vector, A method for producing a protein using the transformant, a cell that specifically acts on the protein, a cell membrane or receptor that specifically binds to the protein, an agonist or antagonist of the protein, The present invention relates to antibodies that bind and therapeutic or diagnostic methods for allergic inflammation, eosinophilic pneumonia, idiopathic eosinophilia, autoimmune diseases, malignant tumors or parasitic infections using the same. Background art
  • Vascular endothelial cells are cells that make up the innermost part of blood vessels and can come into direct contact with blood cells. In the case of inflammation, the force of leukocytes to adhere and accumulate on the blood vessel wall and infiltrate the tissue over time. Endothelial cells play a major role in causing leukocyte adhesion by expressing the adhesion molecule ⁇ chemokine. I have. In addition, it has been reported that the expression of chemokines, adhesion molecules of vascular endothelial cells, is promoted or suppressed by cytokines secreted by leukocytes.
  • ⁇ ⁇ F- ⁇ tumor necros is factor ⁇
  • E-selectin an adhesion molecule
  • IL-8 interleukin-1 8
  • cytokines are involved in inflammation, including interleukin-14 (IL-4), which is secreted from activated T cells and mast cells.
  • IL-4 was first reported as a B cell growth / differentiation factor, but subsequent studies have reported that it exerts a versatile effect on various cells, especially in the blood cell system.
  • IL— 4 From the observation of knockout mice, the effect in vivo was to differentiate T cells into type 2 T-cells and to convert cytokines from type 2 helper T cells to IL-4, IL-5, IL-6, etc.
  • IL- 4 is One involved deeply in the infiltration of the eosinophilic Has been reported. For example, when cancer cells that express IL-4 were transplanted into mice, eosinophils and macrophages accumulated in the transplanted area and the cancer cells died [Cel, 57, 503 (1989)].
  • eosinophils and mast cells accumulated in the eyelid of IL-4 expressing transgenic mice and caused allergic inflammation [Cell, 62, 457 (1990)], and expressed lung-specifically
  • eosinophils and mast cells accumulated in the lungs and showed asthma-like symptoms such as epithelial cell thickening [Proc. Natl. Acad. Sc, 93, 7821 (1996)
  • monkeys receiving continuous subcutaneous administration of IL-14 reported inflammation of blood vessels associated with eosinophil infiltration [Toxicologic Payhology, 19, 251 (1991)] or IL-4 gene knockout.
  • mice In mice, the number of eosinophils infiltrating due to allergic reactions due to antigen sensitization is low. There is a report that which was then [Nature, 362, 245 (1993)]. Therefore, it is expected that among molecules whose expression is induced by IL_4 in vascular endothelial cells, there are molecules related to allergic inflammatory diseases and eosinophil infiltration. We believe that adhesion molecules involved in eosinophil adhesion to endothelial cells and chemokines involved in eosinophil activation and migration play an important role in eosinophil infiltration into allergic inflammatory sites.
  • VCAM-1 vascular cell adhesion molecule-1
  • L-selectin ligand L-selectin ligand
  • P-selectin P-selectin
  • Chemokines are molecules that have the activity of causing leukocytes to migrate toward higher chemokine concentrations via receptors, and play an important role in leukocyte infiltration. It is also known that binding of chemokines to receptors increases intracellular calcium concentration. In addition, chemokines not only have a chemotactic activity but also have the effect of activating white blood cells.For example, they have been reported to cause the activation of the adhesion molecule integrin and the promotion of degranulation and proliferation of white blood cells. [Nature, 361, 79 (1993), Journal of Leukocyte Biology, 59, 81 (1996)].
  • chemokines are not only used for inflammation as described above, but also for leukocytes such as atherosclerosis where foamed macrophages accumulate in the vascular smooth muscle layer through vascular endothelial cells, and autoimmune diseases where activated lymphocytes attack themselves. It is thought to be a molecule that is deeply involved in diseases that are thought to be involved in the activation and migration of the disease. In addition, some chemokines have the effect of inhibiting proliferation of hematopoietic stem cells [Nature, 344, 442 (1990)].
  • CXCR4 chemokine receptor 4
  • CC chemokines act on monocytes among leukocytes
  • CXC chemokines act on neutrophils in many cases.However, the types of chemokines that act on them and the intensity of their effects differ depending on the type of chemokine. Regulation of chemokine gene expression is also different for each chemokine. Thus, the secretion of chemodynamic proteins may depend on cells and tissues or the stimuli they receive.
  • Eotaxin eotaxin
  • RANTES RANTES
  • MCP-3 MCP-4
  • eotaxin-2 have been reported as chemokines that act on eosinophils.
  • eotaxin has an eosinophil-specific action
  • antigen Attention has been paid to the increased expression in animal allergy models due to sensitization.
  • eotaxin gene knockout mice eotaxin is normally involved in maintaining the number of peripheral eosinophils, and eotaxin infiltration of pathological eosinophils during allergic inflammation was suggested to be involved only in the early stage, and that chemokines other than eotaxin were also involved in the early stage [J. Exp. Med., 185, 785 (1997)].
  • chemokines can be used to activate activated eosinophils at sites of malignancy and parasite infection. If they can accumulate, these diseases can be treated It is thought that it can come. Disclosure of the invention
  • the present invention relates to the following (1) to (35).
  • a protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13, or an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence, and capable of activating eosinophils (Hereinafter, also referred to as the protein of the present invention).
  • DNA a DNA encoding the protein of (1), or a DNA that hybridizes with the DNA under stringent conditions and encodes a protein capable of activating eosinophils (hereinafter referred to as “DNA”); , Also referred to as the DNA of the present invention).
  • a recombinant vector containing the DNA according to (2) (hereinafter, also referred to as the recombinant vector of the present invention).
  • a transformant obtained by introducing the recombinant vector according to (3) into a host cell (hereinafter, also referred to as a transformant of the present invention).
  • a method for producing a protein comprising culturing the transformant according to (4) in a medium, producing and accumulating the protein in a culture, and collecting the protein from the culture (hereinafter referred to as the present method). Also referred to as a method for producing the protein of the invention).
  • a therapeutic agent for malignant tumor or parasitic infection comprising the protein according to (1).
  • a method for treating a malignant tumor or a parasitic infection which comprises administering an effective amount of the protein according to (1).
  • a method for detecting a cell on which the protein specifically acts, or a cell membrane or receptor specifically binding to the protein which comprises contacting the protein according to (1) with a test sample. .
  • Corrected form (Rule 91) (10) Contacting the protein according to (1) with a test sample to obtain a cell on which the protein specifically acts, or a cell membrane or a receptor that specifically binds to the protein. Method.
  • a method for diagnosing allergic inflammation, eosinophilic pneumonia, idiopathic eosinophilia or an autoimmune disease comprising using the antibody according to (14).
  • a diagnostic agent for allergic inflammation, eosinophilic pneumonia, idiopathic eosinophilia or an autoimmune disease comprising the antibody according to (14).
  • a therapeutic agent for allergic inflammation, eosinophilic pneumonia, idiopathic eosinophilia or autoimmune disease comprising the antibody according to (14).
  • (21) A method for treating allergic inflammation, eosinophilic pneumonia, idiopathic eosinophilia or an autoimmune disease, comprising administering an effective amount of the antibody according to (14).
  • (26) A method for detecting mRNA encoding the protein according to (1), comprising using the DNA according to (22) or (23) or the oligonucleotide according to (24) or (25). .
  • a medicament comprising the DNA according to (23) or the oligonucleotide according to (25).
  • a therapeutic agent for allergic inflammation, eosinophilic pneumonia, idiopathic eosinophilia or an autoimmune disease which comprises the DNA according to (23) or the oligonucleotide according to (25).
  • a vector for gene therapy of a disease, a malignant tumor or a parasitic infection (hereinafter, also referred to as a gene therapy vector of the present invention).
  • "having the ability to activate eosinophils” means that the ability to act on eosinophils to promote or enhance the intracellular calcium concentration, intracellular signal transduction system or cell response system. Means to have.
  • the protein of the present invention may be a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13 or one or more amino acids deleted in the amino acid sequence as long as the protein has an ability to activate eosinophils. It may be a protein consisting of a substituted or added amino acid sequence. Amino acid deletion, substitution or addition can be performed by the method described in Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982), Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 79, 6409 (1982), Gene, 34, 315 ( 1985), Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985), Proc. Natl. Acad.Sci USA, 82, 488 (1985), and the like.
  • the number of amino acids to be deleted, substituted or added is not particularly limited, it may be one to several tens, particularly one or several amino acids, and may be deleted, substituted or added by site-directed mutagenesis. Preferred above.
  • the protein of the present invention in order for the protein of the present invention to have an ability to activate eosinophils, at least 60% or more, usually 80% or more, particularly 95% or more of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 13 It is preferred that they have homology.
  • the protein of the present invention to be a chemokine protein, four Cys residues and their positions in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 13 are substituted, inserted or deleted so as to be conserved. Protein is preferred.
  • Examples of the DNA of the present invention include a DNA encoding the protein of the present invention, for example, a DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 14 as a DNA encoding the protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13. .
  • a DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 14 as a DNA encoding the protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13.
  • SEQ ID NO: 13 a DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 14 as a DNA encoding the protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13.
  • a DNA having a nucleotide sequence different from that of SEQ ID NO: 14 may encode a protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 13.
  • it is included in the DNA of the present invention.
  • a DNA encoding the protein of the present invention and a DNA that hybridizes under stringent conditions are DNAs encoding the protein of the present invention, for example, a DNA having a base sequence represented by SEQ ID NO: 14. This refers to DNA obtained by using a colony hybridization method, a plaque hybridization method, a southern blot hybridization method, or the like.
  • a hybridization solution having the following composition and containing a 32 P-labeled DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 14 as a probe
  • 6 XSSC [0.9 M NaCl, 90 mM sodium citrate; n XSSC: 1 Represents n-fold concentration of XSSC (150 mM NaCK 15 mM sodium citrate)]
  • 5 X Denhardt's solution (0.1% Pseudoserum albumin, 0.1% phycoal, 0.1% polyvinylpyrrolidone), 0.5 % Sodium dodecyl sulfate (SDS), denatured DNA obtained by sonicating 20 g / ml salmon sperm DNA, heating in a boiling water bath for 5 minutes, and quenching in ice.
  • the DNA of the present invention can be obtained by the following method.
  • a cDNA fragment of the protein of the present invention can be obtained.
  • the DNA of the present invention can be cloned by screening the vascular endothelial cell cDNA library using this cDNA fragment as a probe. The method for preparing the DNA of the present invention will be described below.
  • eosinophils play an important role in allergic inflammatory diseases. Since IL_4 is deeply involved in the infiltration of eosinophils, blood vessels were obtained using the differential 'display method [Science, 257, 967 (1992), FEBS Letters, 351, 231 (1994)]. By analyzing genes whose mRNA expression levels fluctuate between when endothelial cells are stimulated with IL-4 and before, the DNAs involved in eosinophil infiltration are prepared. That is, total RNA is prepared from vascular endothelial cells stimulated with IL-4 and vascular endothelial cells not stimulated with IL-14.
  • Methods for preparing total RNA include guanidine thiocyanate-cesium trifluoroacetate method [Methods in Enzymo 1 ogy, 154, 3 (1987)], guanidine acid thiocyanate 'phenol', and closed mouth form (AGPC) method [Analytical Biochemistry , 162, 156 (1987)].
  • the cDNA fragment is amplified by polymerase chain reaction (hereinafter, referred to as PCR) using an anchor primer and an arbitrary primer for each of these cDNAs.
  • Anchor primer is a primer in which an adenine, guanine or cytosine oligonucleotide excluding thymidine is added to the 3 'end of an oligo dT sequence associated with the 3' end poly A sequence of mRNA.
  • the oligonucleotide having the nucleotide sequence shown in 4 can be mentioned.
  • Optional primers are oligonucleotides that can amplify many types of cDNAs and can obtain a large number of amplified cDNA fragments in a single reaction.
  • Operon Technologies 0PA-1 to 20; 0PB-1 to 20; 0PC-1 to 20;
  • the optional primer preferably has a length of about 10 to 20 bases.
  • the reaction mixture is electrophoresed with polyacrylamide gel, and the cDNA fragment in the gel is fluorescently stained with a DNA-specific fluorescent stain such as Cyber Green I.
  • the amount of fluorescence of each fragment can be measured using a fluoroimager, and can be visualized as a light and shade band pattern.
  • the fluorescence amount of the amplified fragment can be measured immediately after electrophoresis without fluorescent staining. Fluorescent labeling of the 5 'end of the primer can be carried out by a conventional method using fluorescein lithothioate.
  • a portion of the excised gel is transformed into a ⁇ form to amplify the cDNA fragment in the gel by PCR, and the amplified fragment is used as it is, or after blunting the end with Pfu DNA polymerase, etc., and Integrate into vector and clone.
  • Examples of the vector incorporating the amplified cDNA fragment include pT7Blue T-Vector [Novagen], pDIRECT [Clontech, Nucleic Acids Research 18, 6069 (1990)], pCR- Script Amp [manufactured by Stratagene], pCR2.1 [manufactured by Invitrogen], pCR-TRAP [manufactured by GenHunter], pTA (manufactured by Nitsubon Gene) and the like can be mentioned.
  • the nucleotide sequence of the cloned cDNA fragment was determined by the didoxy method of Sanger et al. [Proc. Natl. Acad. ScI. USA, 74, 5463 (1977)] or Parkin- Determined using a DNA sequencer such as Elkin (Pharmacia) or Perkin Elmer.
  • the novelty of the nucleotide sequence determined in this way can be determined by searching a nucleotide sequence database such as GenBank, EMBL and DDBJ using a homology search program such as BLAST. This can be confirmed by the absence of a nucleotide sequence having a clear homology that is considered to be identical.
  • DNA having the novel nucleotide sequence obtained as described above examples include DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3.
  • the DNA having the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 3 was obtained from a band in which the expression level was increased in vascular endothelial cells stimulated with IL-14 as compared to the case without stimulation with IL-4
  • DNA was obtained by amplifying a part of cDNA encoding the HVC002 protein, which is a protein of the present invention, whose expression level increases in vascular endothelial cells stimulated with IL-14. It turns out to be something.
  • the DNA of the invention can be obtained.
  • MRNA is prepared as poly (A) + RNA from total RNA of vascular endothelial cells stimulated with IL-14 obtained by the above method.
  • preparation method include a method using oligo (dT) cellulose [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)] and the like.
  • mRNA can be directly prepared from vascular endothelial cells stimulated with IL-14 using a kit such as Fast Track mRNA Isolation Kit [Invitrogen] or Quick Prep mRNA Purification Kit [Pharmacia]. This mRNA is converted into cDNA, integrated into an appropriate vector, and introduced into a host cell to prepare a cDNA library.
  • a cloning vector for preparing a cDNA library any phage vector, plasmid vector, etc. can be used as long as it can replicate autonomously in E.
  • coli K12 strain Specifically, ZAP Express [manufactured by Stratagene], pBluescript II SK (+) [Nucleic Acids Research, 17, 9494 (1989)], Lambda ZAP II (manufactured by Stratagene), gtlO, ⁇ gtll [DNA Cloning, A Practical Approach, II, 49 (1985)], A TriplEx (Clontech), AExCell (Pharmacia), pT7T318U (Pharmacia), pcD2 [Mol. Cell. Biol., 3, 280] (1983)].
  • any microorganism that belongs to Escherichia coli can be used. Specifically, Escherichia coli XLl-Blue MRF '[Stratagene]. Escherichia coli C600 [Genetics, 39, 440 (1954)], Escherichia coli Y1088 [Science, 222, 778 (1983)], Escherichia coli Y1090 [Science, 222, 778 (1983)], Escherichia coli bandits 522 [J. Mol. Biol., 166, 1 (1983)], Escherichia coli K802 [J. Mol.
  • Tightened paper (Rule 91) It can be used labeled with the 32 p or the like.
  • the nucleotide sequence of the obtained cDNA can be determined using the above-described nucleotide sequence determination method.
  • Examples of the DNA encoding the protein of the present invention obtained by the above method include a DNA having the base sequence shown in SEQ ID NO: 14.
  • cDNA at the 5 'end from the amplified fragment can be obtained [Pnx: Natl. Acad. Sci. USA, 85, 8998 (1988)].
  • cDNA of IL-14-stimulated vascular endothelial cells is synthesized by the same method as SCREENJ of the cDNA library, adapters are added to both ends of the cDNA, the nucleotide sequence of this adapter and the amplified fragment PCR is performed with primers based on the nucleotide sequence of the above, and the wide fragment is cloned into a vector in the same manner as described above, so that the cDNA at the end of the amplified fragment obtained from Differential Display is 5, can get.
  • the nucleotide sequence of the obtained cDNA can be confirmed by the same method as the screening of the cDNA library. Based on this base sequence, the obtained cDNA and the amplified fragment obtained by Differential Display are joined together to obtain cDNA which is considered to be full length.
  • a primer based on the nucleotide sequence of the cDNA was prepared, and the primer was prepared from vascular endothelial cells stimulated with IL-4.
  • the DNA of the present invention can also be prepared by chemical synthesis using a DNA synthesizer.
  • a DNA synthesizer examples include a DNA synthesizer model 392 (manufactured by Perkin Elma Inc.) using the phosphoramidite method.
  • Antisense having a partial nucleotide sequence of the DNA of the present invention by the DNA synthesizer -The oligonucleotide can be chemically synthesized.
  • a derivative of the nucleotide can also be used, and examples thereof include a methyl derivative of the nucleotide and a phosphorothioate derivative.
  • the recombinant vector of the present invention is constructed by introducing the DNA of the present invention downstream of an appropriate expression vector promoter, and the recombinant vector is introduced into a host cell.
  • the transformant of the present invention can be obtained.
  • any cell that can express the gene of interest such as bacteria, yeast, animal cells, and insect cells
  • the expression vector those which are capable of autonomous replication in the above-mentioned host cell or capable of being integrated into a chromosome, and which contain a promoter at a position where the DNA of the present invention can be transcribed are used.
  • a prokaryote such as a bacterium
  • the recombinant vector of the present invention is capable of autonomous replication in a prokaryote, and at the same time, is composed of a promoter, a ribosome binding sequence, a DNA of the present invention, and a transcription termination sequence.
  • it is configured. It may contain a gene that controls the promoter.
  • expression vectors include pKK233-2 (Pharmacia), pSE280 (Invitrogen), pGEMEX-1 (Promega), pQE-8 (QIAGEN), pKYPIO (Special 58-110600), pKYP200 [Agricul tural Biological Chemistry, 48, 669 (1984)], pLSAl [Agric. Biol. Chem., 53, 277 (1989)], pGELl [Pro Natl. Acad. Sc i USA, 82, 4306 (1985)], pBluescript II SK (-) (Stratagene), pGEX (Pharmacia), pET-3 (Novagen) and the like.
  • an expression vector a vector in which the distance between the Shine-Dalgarno sequence, which is a ribosome binding sequence, and the initiation codon is adjusted to an appropriate distance (for example, 6 to 18 bases) is used. Preferably.
  • Any promoter can be used as long as it can be expressed in a host cell such as Escherichia coli.
  • ⁇ promoter one P trp
  • lac promoter one p L promoter
  • p R promoters such as T7 promoter, promoter, First and the like derived from Escherichia coli or phage, or the like.
  • the promoter one obtained by two series P t "(P trp X 2 ), promoter mono-, lacT7 promoter primary, artificially designed and modified promoters like the let I promoter one or the like can be used.
  • a transcription termination sequence is not necessarily required for expression of the DNA of the present invention, but it is preferable to arrange a transcription termination sequence immediately below a structural gene.
  • host cells include microorganisms belonging to the genera Escherichia, Bacillus, Corynebacterium, Brevibacterium, Pseudomonas, Serratia, etc., for example, Escherichia-colli XL1-Blue MRr ', Escherichia col i DHK Escherichia col ⁇ Door 09, Escherichia col i HB101, Bac i 1 lus subt i 1 is, Bac i 1 lus amylol iquefac ines, Brevibacterium immariophi lum ATCC 14068, Brevibacterium saccharolyt icum ATCC 14066, Corynebacterium g ace ut um um um ut um um um cer um um cerum um um um um germ um um um germ ATum I can give it.
  • Any method for introducing a recombinant vector can be used as long as it is a method for introducing DNA into the above host cells.
  • the calcium chloride method [Pro Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 ( 1972)]
  • the protoplast method Japanese Patent Application Laid-Open No. 63-2483942
  • the electroreaction method and the like.
  • YEpl3 ATCC37115
  • YEp24 ATCC37051
  • YCp50 ATCC37419
  • Any promoter can be used as long as it can be expressed in yeast strains.
  • promoters for glycolytic genes such as hexose kinase can be used.
  • uncle cells include aaccharomyces cerevis ⁇ Schizosaccharomvces pombe Kluvveromyces lact is Trichosporon pul lulatis, Schwann iomvces alluvius and the like.
  • any method can be used as long as it is a method for introducing DNA into yeast.
  • electroporation Methods. Enzymol., 194, 182 (1990)]
  • Sufiplus Natl. Acad. Sci. USA 81, 4889 (1984)
  • the lithium acetate method Journal of Bacteriology, 153, 163 (1983)].
  • expression vectors include, for example, pAGE107 [JP-A-3-22979, Cytotechnology, 3, 133, (1990)], pAS3-3 (JP-A-2-227075), pCD8 [ Nature, 329, 840, (1987)], pcDNAI / Amp (Invitrogen), pREP4 (Invitrogen), pAGE103 [Journal of Biochemistry, 101, 1307 (1987)] and the like.
  • Any promoter can be used as long as it can be expressed in animal cells.
  • the enhancer of the IE gene of human CMV may be used together with the promoter.
  • Examples of the host cell include Namalwa cell, a human cell, COS cell, a monkey cell, CH0 cell, a Chinese hamster cell, and HBT5637 (JP-A-63-299).
  • any method for introducing DNA into animal cells can be used.
  • the electroporation method [Cytotechnology, 3, 133 (1990)]
  • the calcium phosphate method Japanese Patent Laid-Open No. 2-227075
  • the lipofection method [Pro Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)] and the like.
  • Proteins can be expressed according to the method described in Bio / Technology, 6, 47 (1988) and the like.
  • the recombinant vector of the present invention (hereinafter, also referred to as the recombinant gene transfer vector of the present invention) and baculovirus were co-transfected into insect cells to obtain a recombinant virus in the insect cell culture supernatant. Later, insect cells can be further infected with the recombinant virus to express the protein.
  • Examples of the gene transfer vector used in the method include pVL1392, pVL1393, pBlueBacIII (all manufactured by Invitrogen) and the like.
  • Baculoviruses include, for example, autographa calli fornica nuclear polynedros is virus, a virus that infects insects of the night roth moth family, such as autographa, californica and nuclei. .
  • Sf9 and Sf21 which are ovarian cells of Spodoptera frugiperda [Baculovirus Express Ion ectors, A Laboratory Manual, New York (1992)], and High 5 which is an ovarian cell of Trichoplus ia ni (manufactured by Invitrogen) Etc. are used ⁇ t.
  • a method for co-introducing the recombinant gene transfer vector of the present invention into insect cells and the above baculovirus to prepare a recombinant virus includes, for example, the calcium phosphate method (Japanese Patent Application Laid-Open No. 2-227075). Acad. Sci. USA, 84. 7413 (1987)], and the like.
  • sugar or sugar chain-added protein When expressed by yeast, animal cells or insect cells, a sugar or sugar chain-added protein can be obtained.
  • the protein of the present invention can be produced by culturing the transformant of the present invention in a medium, producing and accumulating the protein of the present invention in the culture, and collecting from the culture.
  • the method for culturing the transformant of the present invention in a medium can be performed according to a usual method used for culturing a host.
  • a culture medium for culturing a transformant obtained by using a prokaryote such as Escherichia coli or a eukaryote such as yeast as a host contains a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, and the like which can be used by the organism. Either a natural medium or a synthetic medium can be used as long as the medium can efficiently culture the cells.
  • the carbon source may be any one that can be assimilated by the organism, such as glucose, fructose, sucrose, molasses containing these, carbohydrates such as starch or starch hydrolysate, and organic acids such as acetic acid and propionic acid. Acids, alcohols such as ethanol and propanol, and the like can be used.
  • nitrogen source examples include ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate, ammonium phosphate, and other ammonium or inorganic salts of organic acids, and other nitrogen-containing compounds, as well as peptone, meat extract, yeast extract, and corn starch. 1. Casein hydrolyzate, soybean meal and soybean meal hydrolyzate, various fermented cells, digested products thereof, and the like can be used.
  • Potassium phosphate, potassium phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous sulfate, manganese sulfate, copper sulfate, calcium carbonate, etc. are used as inorganic substances. be able to.
  • the culture is usually performed under aerobic conditions such as shaking culture or deep aeration stirring culture.
  • the cultivation temperature is 15 to 4 (TC is good, the cultivation period is usually 16 to 96 hours.
  • the pH is maintained at 3.0 to 9.0.
  • the pH is adjusted by using inorganic or organic acids, Alkaline solution, urea, charcoal Perform using calcium acid, ammonia, etc. If necessary, an antibiotic such as ampicillin-tetracycline may be added to the medium during the culture period.
  • an Indianer When culturing a microorganism transformed with an expression vector using an inducible promoter as a promoter, an Indianer may be added to the medium as necessary.
  • an Indianer When culturing a microorganism transformed with an expression vector using a promoter, isopropyl-1-D-thiogalactopyranoside or the like is used.
  • indole atari When culturing a microorganism transformed with an expression vector using a tr ° mouth motor, indole atari is used. Luic acid or the like may be added to the medium.
  • RPMI1640 medium As a medium for culturing a transformant obtained using animal cells as a host, RPMI1640 medium, Eagle's MEM medium, or a medium obtained by adding fetal calf serum or the like to such a medium is used.
  • Culturing is carried out under conditions such as normal 5% C 0 2 presence.
  • the culture temperature is preferably 35 to 37, and the culture time is usually 3 to 7 days.
  • antibiotics such as kanamycin and penicillin may be added to the medium during the culture.
  • Culture media for transformants obtained using insect cells as a host include TNM-FH medium (Pharmingen), Sf-900II SFM medium (Life's Technologies), ExCel l400 And ExCel 140 (both manufactured by JRH Biosciences).
  • the cultivation temperature is preferably 25-30, and the cultivation period is usually 1-4 days. If necessary, an antibiotic such as gentamicin may be added to the medium during the culture period.
  • a normal protein isolation and purification method may be used.
  • the protein of the present invention when expressed in a lysed state in cells, after the culture is completed, the cells are collected by centrifugation, suspended in an aqueous buffer, and then sonicated with a sonicator, french press, manntone. Cells are disrupted using a Gaulin homogenizer, Dynomill, etc. Obtain a cell-free extract.
  • a normal protein isolation and purification method that is, a solvent extraction method, a salting-out method with ammonium sulfate, a desalting method, a precipitation with an organic solvent, Method, getylaminoethyl (DEAE)-Sepharose, DIAION HPA-75 (manufactured by Mitsubishi Kasei Co., Ltd.) using resin such as anion exchange chromatography, S- Sepharose FF (manufactured by Pharmacia) Cation exchange chromatography used, hydrophobic chromatography using resins such as butyl sepharose and phenylsepharose, gel filtration using molecular sieves, affinity chromatography, and chromatofocusing
  • a purified sample can be obtained by using a method such as electrophoresis such as isoelectric focusing or isoelectric focusing alone or in combination.
  • the cells are similarly recovered, crushed, and recovered from the precipitate fraction obtained by centrifugation in a usual manner. After that, the insoluble form of the protein is solubilized with a protein denaturant. After diluting or dialyzing the solubilized solution to a solution containing no protein denaturing agent or diluting the concentration of the protein denaturing agent so that the protein is not denatured, the protein is restored to a normal three-dimensional structure.
  • a purified sample can be obtained by the same isolation and purification method as described above.
  • the protein of the present invention or a derivative such as a modified sugar thereof is secreted extracellularly
  • the protein or a derivative such as a sugar chain adduct thereof can be recovered in the culture supernatant. That is, a soluble fraction is obtained by treating the culture by a method such as centrifugation as described above, and a purification standard is obtained from the soluble fraction by using the same isolation and purification method as described above. Goods can be obtained.
  • the protein of the present invention can also be produced by a chemical synthesis method such as the Fmoc method (fluorenylmethyloxycarbonyl method) and the tBoc method (t-butyloxycarbonyl method).
  • a chemical synthesis method such as the Fmoc method (fluorenylmethyloxycarbonyl method) and the tBoc method (t-butyloxycarbonyl method).
  • peptide synthesizers manufactured by Advanced ChemTech, Perkin's Elma, Pharmacia, and Protein 'Technology, Synthesizer -Vega (Synthecel-Vega), PerSeptive, Shimadzu, etc.] can be used for chemical synthesis.
  • the structural analysis of the purified protein of the present invention is performed by a method generally used in protein chemistry, for example, a method described in Protein Structural Analysis for Gene Cloning (Hisashi Hirano, published by Tokyo Chemical Dojin, 1993). Can be implemented.
  • the protein of the present invention releases various mediators having cell killing activity or parasiticidal activity, such as proteins and active oxygen in eosinophil granules, from eosinophils. It can accumulate eosinophils, and it can be used for parasite infections such as filamentous worms, schistosomes, lung flukes, hookworms, ciliates, lung nematodes, jaw and mouth insects, tapeworms, ascoma, etc. It can be used as a therapeutic agent for tumors and the like.
  • compositions comprising the protein of the present invention, also there is a force to be administered in protein alone as a therapeutic agent?, Usually with a carrier on one or even more than is allowed the protein pharmacological It is desirable to mix and provide as a pharmaceutical preparation manufactured by any method well known in the pharmaceutical arts.
  • an aseptic solution dissolved in water or an aqueous carrier such as an aqueous solution of salt, glycine, glucose, human albumin or the like is used.
  • pharmacologically acceptable additives such as buffering agents and tonicity agents for bringing the formulation solution closer to physiological conditions, for example, sodium acetate, sodium chloride, sodium lactate , Potassium chloride, sodium citrate and the like can also be added. It can also be lyophilized for storage and dissolved in a suitable solvent before use.
  • a parenteral route such as a subcutaneous, intramuscular, intravenous, or respiratory route is used.
  • the therapeutic agent containing the protein of the present invention may be mixed with one or more carriers which are usually pharmacologically acceptable, such that the compound can be administered alone as a therapeutic agent. It is desirable to provide as a pharmaceutical preparation manufactured by any method well known in the pharmaceutical art.
  • Corrected form (Rule 91) It is desirable to use the most effective route for treatment.Use oral or parenteral, such as buccal, respiratory, rectal, subcutaneous, intramuscular, and intravenous administration. Can be. Dosage forms include sprays, capsules, tablets, granules, syrups, emulsions, suppositories, injections, ointments, tapes and the like.
  • Formulations suitable for oral administration include emulsions, syrups, capsules, tablets, powders, granules and the like.
  • liquid preparations such as emulsions and syrups include water, sugars such as sucrose, sorbitol and fructose, glycols such as polyethylene glycol and propylene glycol, oils such as sesame oil, olive oil and soybean oil, p — It can be manufactured using preservatives such as hydroxybenzoic acid esters, flavors such as bevel flavor and peppermint as additives.
  • excipients such as lactose, glucose, sucrose, mannitol, disintegrants such as starch, sodium alginate, lubricants such as magnesium stearate, talc, poly It can be produced using a binder such as vinyl alcohol, hydroxypropylcellulose, and gelatin, a surfactant such as a fatty acid ester, and a plasticizer such as glycerin as additives.
  • Formulations suitable for parenteral administration include injections, suppositories, sprays and the like.
  • an injection is prepared using a carrier comprising a salt solution, a glucose solution, or a mixture of both.
  • Suppositories are prepared using carriers such as cocoa butter, hydrogenated fats or carboxylic acids.
  • Sprays are prepared using the compound itself or a carrier which does not irritate the oral and respiratory mucosa of the recipient and which disperses the compound as fine particles to facilitate absorption.
  • Specific examples of the carrier include lactose, glycerin and the like.
  • Formulations such as aerosols and dry powders are possible depending on the properties of the compound and the carrier used.
  • the components exemplified as additives for oral preparations can also be added.
  • the dose or frequency of administration varies depending on the desired therapeutic effect, administration method, treatment period, age, body weight, etc., and is usually 10 g / kg to 8 mg / kg per day for an adult.
  • a method such as a method for measuring intracellular calcium concentration, a chemotaxis assay, a receptor binding assay, or the like, a cell on which the protein of the present invention specifically acts, or Cell membranes or receptors that specifically bind to the protein of the invention can be detected or obtained.
  • the test sample includes, for example, cells or tissues on which the protein of the present invention specifically acts, or cell membranes or receptors specifically binding to the protein of the present invention.
  • Cells on which the protein of the present invention specifically acts include, for example, leukocytes.
  • white blood cells include B cells, T cells, lymphocytes such as large granular lymphocytes, mononuclear phagocytes, phagocytic cells such as neutrophils and eosinophils, basophils, mast cells, platelets, etc.
  • Eosinophils which can be used as auxiliary cells, are preferably used.
  • the cells may be in any form such as a single cell, a cell clump, or a tissue.
  • the cell membrane or receptor that specifically binds to the protein of the present invention include cell membranes prepared from the above cells, or receptors isolated and purified from the cells.
  • the calcium concentration in the cells can be reduced. Detect changes. It can be determined that the protein of the present invention acts on cells whose intracellular calcium concentration increases transiently.
  • test sample e.g., eosinophils
  • protein solution of the present invention into the lower chamber, and let it stand for an appropriate time.
  • labeling the protein of the present invention with a radioactive isotope and the like Using a method such as to be added to 125 1 with Bo 1 ton-Hunter reagent Tyr residue of the protein of the present invention, labeling the protein of the present invention with a radioactive isotope and the like.
  • the labeled protein and the membrane fraction prepared from the cells are mixed and reacted at 4 ° C to 37 for 20 minutes to 24 hours.
  • the mixture is filtered through a glass filter or the like, washed, and the amount of radioactivity in the membrane fraction isolated on the filter is measured to determine the total amount of binding.
  • a cell showing specific binding between the protein of the present invention and the receptor in this assay system is determined to be a cell having a receptor that specifically binds to the protein of the present invention.
  • test compound examples include low molecular weight compounds, peptides, proteins, and antibodies.
  • increase in calcium concentration is measured by adding a test compound, and the protein of the present invention is measured.
  • a substance that causes a smaller increase in calcium concentration than when only a buffer and a buffer solution are added can be selected as an antagonist.
  • the amount of specific binding to the receptor that specifically binds to the protein of the present invention is measured, and a substance whose specific binding amount is reduced as compared with the case where no protein is added is selected as the substance that binds to the receptor.
  • a test compound alone is added in place of the protein of the present invention in this system, those exhibiting the same action as the protein of the present invention can be determined as agonists, and those exhibiting the antagonistic action can be determined as antagonists.
  • the agonist of the present invention has the ability to activate eosinophils like the protein of the present invention, it can be used as a therapeutic agent for parasitic infections or malignant tumors.
  • the antagonist of the present invention antagonizes the protein of the present invention and suppresses infiltration of eosinophils activated by the protein of the present invention, whereby diseases involving infiltration of eosinophils, such as asthma, Remedies for allergic conjunctivitis, allergic rhinitis, atopic dermatitis, allergic inflammatory diseases such as allergic bronchopulmonary aspergillosis, eosinophilic pneumonia or idiopathic eosinophilia (hypereos inophilic syndrome) It can be used as When the antagonist of the present invention is a chemokine protein antagonist, it can be used as a therapeutic drug for autoimmune deficiency diseases such as autoimmune hemolytic anemia, primary biliary cirrhosis, and progressive erythematodes.
  • a medicament containing the agonist or antagonist of the present invention is prepared or administered using the same method as the medicament containing the protein of the present invention except that the agonist or antagonist of the present invention is used
  • the antibody of the present invention may be any of polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, etc., as long as they can specifically bind to the protein of the present invention.
  • Polyclonal antibodies can be prepared by separating and purifying serum obtained from animals immunized with the antigen.
  • Monoclonal antibodies are prepared by fusing antibody-producing cells obtained from animals immunized with the antigen with myeloma cells to produce hybridomas, culturing the hybridomas, and administering the animals to animals to ascites cancer. And said It can be prepared by separating and purifying a culture solution or ascites.
  • the antigen is expressed by isolating and purifying the protein of the present invention from various human cultured cells or introducing the recombinant vector of the present invention into a non-human host such as Escherichia coli, yeast, animal cells, insect cells, etc., and expressing the protein. It can be prepared by separating and purifying the protein of the present invention thus obtained.
  • the antigen can also be prepared by synthesizing a polypeptide having a partial sequence of the protein of the present invention using an amino acid synthesizer.
  • the antigen may be directly administered subcutaneously, intravenously or intraperitoneally to a non-human mammal such as a rabbit, a goat or a rat, mouse or hamster of 3 to 20 weeks old.
  • a non-human mammal such as a rabbit, a goat or a rat, mouse or hamster of 3 to 20 weeks old.
  • Antigens can be administered by binding antigens to carrier proteins with high antigenicity, such as keyhole limpet mosquito, keyhole limpet hemocyanin, bovine serum albumin, bovine thyroglobulin, etc., or Complete Freund's Adjuvant. ), Aluminum hydroxide gel, pertussis vaccine, etc., preferably with an appropriate adjuvant.
  • the administration of the antigen is performed 3 to 10 times every 1 to 2 weeks after the first administration.
  • Blood is collected from the fundus venous plexus 3 to 7 days after each administration, and an enzyme immunoassay is performed to determine whether the serum reacts with the antigen used for immunization (Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988) Investigate by measuring the antibody titer according to the above.
  • a non-human mammal whose serum shows a sufficient antibody titer against the antigen used for immunization is used as a source of serum or antibody-producing cells.
  • a polyclonal antibody can be prepared by separating and purifying the serum.
  • a monoclonal antibody is prepared by fusing the antibody-producing cells with myeloma cells derived from a non-human mammal to produce a hybridoma, and administering the hybridoma to a cultivated animal to cause ascites carcinoma of the animal. It can be prepared by separating and purifying the culture solution or ascites.
  • Antibody producing cells include spleen cells, lymph nodes, antibody producing cells in peripheral blood, especially spleen Cells are preferably used.
  • Myeloma cells include 8-azaguanine-resistant mouse (derived from BALB / c) myeloma cell line P3-X63Ag8-Ul (P3-U1) [Current Topics in Microbiology and Immunology, 18, 1-7 (1978 )], P3-NSl / l-Ag41 (NS-1) strain [European J. Immunology, 6, 511-519 (1976)], SP2 / 0-Agl4 (SP-2) strain [Nature, 276, 269- 270 (1978)], P3-X63-Ag8653 (653) strain [J. Immunology, 123, 1548-1550 (1979)], P3-X63-Ag8 (X63) strain [Nature, 256, 495-497 (1975)] And the like. Cell lines derived from mice are preferably used.
  • Hybridoma cells can be prepared by the following method.
  • the antibody-producing cells and myeloma cells are mixed, suspended in HAT medium [medium containing hypoxanthine, thymidine and aminopterin in normal medium], and cultured for 7 to 14 days. After cultivation, a portion of the culture supernatant is removed, and those that react with the antigen but do not react with the protein containing no antigen are selected by enzyme immunoassay or the like. Then, the cells are cloned by the limiting dilution method, and those having a stable and high antibody titer determined by the enzyme immunoassay are selected as monoclonal antibody-producing hybridoma cells.
  • HAT medium medium containing hypoxanthine, thymidine and aminopterin in normal medium
  • the monoclonal antibody is obtained by separating and purifying a culture solution obtained by culturing the hybridoma cells, or ascites obtained by intraperitoneally administering the hybridoma cells to the animal and causing the animal to develop ascites cancer. Can be prepared.
  • Methods for separating and purifying polyclonal or monoclonal antibodies include centrifugation, ammonium sulfate precipitation, caprylic acid precipitation, or DEAE-Sepharose column, anion exchange column, protein A or G-column, or gel filtration column. Chromatography, etc., used alone or in combination.
  • the antibody of the present invention specifically reacts with the protein of the present invention, it inhibits the infiltration of eosinophils activated by the protein of the present invention, and thus is involved in diseases involving infiltration of eosinophils. For example, allergic inflammatory disease, eosinophilic pneumonia or idiopathic eosinophilia It can be used as a remedy for diseases and the like.
  • the antibody of the present invention specifically reacts with a chemokine protein, it can be used as a therapeutic drug for an autoimmune deficiency disease.
  • the medicament containing the antibody of the present invention is prepared or administered using the same method as the medicament containing the protein of the present invention except that the antibody of the present invention is used instead of the protein of the present invention.
  • the protein of the present invention can be immunologically detected or quantified by using the antibody of the present invention.
  • Examples of the method for immunological detection include ELISA using a microtiter plate, fluorescent antibody, western blotting, and immunohistological staining.
  • This as a method for immunologically quantifying the Sanditsuchi ELISA method Epitopu were used two different monoclonal antibodies of the antibodies that react with the protein of the present invention in the liquid phase, labeled with a radioisotope such as 125 1
  • the radioimmunoassay method using the protein of the present invention and an antibody recognizing the protein of the present invention can be exemplified. It can also be used for immunohistological staining using pathological tissue sections.
  • the protein of the present invention present in cells or tissues of healthy subjects and subjects is immunologically detected or quantified, and the amount is compared between healthy subjects and subjects.
  • the antibody of the present invention can be used as a diagnostic agent for allergic inflammation, eosinophilic pneumonia, idiopathic eosinophilia or autoimmune disease.
  • the sense DNA and antisense DNA of the DNA of the present invention can be used as they are, or as oligonucleotides each containing a part of their base sequence, as northern blot hybridization, southern blot hybridization, in situ hybridization. It can be used as a probe such as a probe or a primer for PCR, RT-PCR and the like.
  • Oligonucleotides having a partial base sequence of the base sequence of the present invention include DNAs of the present invention, for example, DNA having a base sequence represented by SEQ ID NO: 12; Oligonucleotides having a base sequence of 10 to 50 residues can be mentioned.
  • Oligonucleotides include DNA, RNA or derivatives thereof, for example, the methyl-phosphorothioate form.
  • the DNA of the present invention can be obtained by using a Northern blot hybridization method, an RT-PCR method, or the like by using the DNA containing the DNA of the sense DNA or antisense DNA or a part of the base sequence of the DNA.
  • the mRNA encoding the protein of the present invention can be detected and quantified.
  • RNA isolated from tissues or cells into cDNA using oligo (dT) primers and reverse transcriptase, and then combining a set of oligonucleotides corresponding to the mRNA to be detected with the primers.
  • dT oligo primers and reverse transcriptase
  • Oligonucleotide primers include a sense primer corresponding to the base sequence at the 5 'end and an antisense primer corresponding to the base sequence at the 3' end in the partial base sequence of the mRNA to be detected.
  • the base corresponding to peracyl in mRNA is thymidine in oligo nucleotide primers.
  • the number of bases is preferably 5 to 100 bases, particularly preferably 10 to 50 bases.o
  • the nucleotide sequence portion to be amplified using the oligo nucleotide primer may be any nucleotide sequence region of mRNA, but the nucleotide sequence length is 50 bp to 2 kbp, and the repeat sequence or GC (guanine cytosine) nucleotide A base sequence region that does not contain a sequence rich in oxygen is preferred.
  • the antisense DNA of the present invention [Chemistry, 681 (1991), Biotechnology 9, 358 (1992)] is used to suppress the transcription of DNA or the translation of mRNA, thereby achieving autoimmunity. It can also be used to treat diseases. Suppression of chemokine protein production using the antisense DNA technology is based on a partial nucleotide sequence of DNA encoding the protein of the present invention, preferably a nucleotide sequence of 10 to 50 nucleotides in the translation initiation region. This can be done by designing and preparing an oligonucleotide in such a manner and then administering it to a living body.
  • the nucleotide sequence of the synthetic oligonucleotide is a nucleotide sequence that matches a part of the nucleotide sequence of the antisense strand of the DNA of the present invention, or is modified within a range that does not lose the activity of suppressing the expression of the activity of the protein. Can be used.
  • the protein of the present invention expressed in cells or tissues of healthy subjects and subjects is coded.
  • MRNA is detected or quantified by the Northern hybridization method, PCR method, etc., and the amount is compared between healthy subjects and subjects to determine whether the expression level is increased. Diagnosis of sexual inflammation, eosinophilic pneumonia, idiopathic eosinophilia, autoimmune disease, malignancy or parasitic infection can be diagnosed.
  • the sense DNA of the DNA of the present invention can be used as a diagnostic agent for allergic inflammation, eosinophilic pneumonia, idiopathic eosinophilia, autoimmune disease, malignant tumor or parasitic infection.
  • the oligonucleotide of the present invention containing a part of the nucleotide sequence of the sense DNA or antisense DNA of the DNA is also useful as a reagent for gene research.
  • the antisense DNA of the DNA of the present invention and the oligonucleotide containing a part of the nucleotide sequence thereof can suppress the transcription or translation of the mRNA of the present invention. Therefore, by suppressing the infiltration of eosinophils activated by the protein of the present invention, diseases associated with eosinophil infiltration, such as allergic inflammatory disease, eosinophilic pneumonia or It can be used as a treatment for idiopathic eosinophilia and autoimmune diseases.
  • the antisense DNA of DNA of the present invention and a drug containing an oligonucleotide containing a part of the nucleotide sequence thereof are replaced with the antisense DNA of DNA of the present invention and a part of the nucleotide sequence in place of the protein of the present invention.
  • the preparation or administration is carried out using the same method as for the drug containing the protein of the present invention except that an oligonucleotide containing is used.
  • the sense DNA or antisense DNA of the DNA of the present invention or an oligonucleotide containing a part of these nucleotide sequences may be incorporated as a single strand or a double strand into a virus vector such as a retrovirus or adenovirus, or other vectors. It can be used for gene therapy as a vector for gene therapy.
  • FIG. 1 is a diagram showing the structure of plasmid pHVC002.
  • SVpA Simian virus 40 (SV40) early gene poly
  • a additional signal SV3 'sp 3' splicing signal of the early gene of SV40 lacZ: / 9 galactosidase gene of Escherichia coli
  • T7 T7 promoter recognized by T7 phage RNA polymerase.
  • Con5 'sp Consensus 5' splicing signal.
  • HVC002 HVC002 c D N A
  • T3 T3 promoter recognized by R3 phage RNA polymerase
  • Plac a promoter of the lactose gene of Escherichia coli
  • Pcmv A promoter for the immediate early gene of cytomegalovirus (cytomegalovi rus)
  • ColEl ori origin of replication of Col El factor in E. coli
  • TKpA Nan noyana of herpes s im l ex vi rus
  • Neomycin Neomycin, kanamycin resistance gene
  • SV40 ori SV40 replication starting point
  • FIG. 2 is a diagram showing a comparison of the amino acid sequences of the HVC002 protein and other human CC chemokines, excluding the signal peptide, of the mature protein.
  • CC chemokines compared to HVC002 are MIP-1a, MIP-1 ⁇ , RANTES, MCP-2, MCP-3, MCP-4, eotaxin and eotaxin-2.
  • the same amino acid as the HVC002 protein is shown in inverted black and white.
  • the homology in amino acid sequence with HVC002 protein is shown in%.
  • FIG. 3 is a graph showing the results of dust blotting performed on thioredoxin-HVC002 fusion protein expressed in E. coli using mouse antiserum and monoclonal antibody KM1885.
  • KM1885 Western blotting using monoclonal antibody KM1885
  • Escherichia coli contaminating protein (supersonic crushed supernatant of Escherichia coli AD494 (DE3) pLysS containing pET32a (+)) 5 g
  • FIG. 4 shows the results of 15% SDS-PAGE of HVC002 protein purified after expression in insect cells. 0.5 ng of purified HVC002 protein was electrophoresed on the right and a molecular weight marker was electrophoresed on the left, followed by silver staining. Arrows indicate the position of HVC002 protein.
  • FIG. 5 shows the results of calcium mobilization of HVC002 protein on human peripheral eosinophils and HL-60 (clonel5) differentiated into eosinophil-like cells by treatment with 0.5 mM butyric acid.
  • A is the result of using human peripheral eosinophils
  • B is the result of using HL-60 (clonel5)
  • the horizontal axis is the time
  • the vertical axis is the specific fluorescence intensity (fluorescence intensity when excited at 340 nm, excitation at 380 nm) (Intensity of fluorescence when performed).
  • the specific fluorescence intensity is proportional to the intracellular calcium concentration.
  • the arrows indicate the time points at which the HVC002 protein or buffer was added, respectively.
  • HUVEC umbilical vein vascular endothelial cells, manufactured by Kurabo Industries
  • HUVEC is composed of heparin sodium, Endothelial cell growth supplement (Becton-Dickinson), 10% fetal serum (Bio Tech. International Co., Ltd.) , With 1% penicillin (5,000units Zml) 'scan streptomycin (5MgZml) solution (Gibco BRL) and 0.15% NaHC0 3 F-12K medium containing (Sigma) (manufactured by Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) The cells were cultured under the condition of 5% CO 2 , 37.
  • HUVEC stimulated with IL-4 5 X10 100 units of Zml human IL-4 (Zymodin) was added to a medium containing 6 cells, and after culturing for 17 hours, cells (hereinafter referred to as HUVEC stimulated with IL-4) were collected. did.
  • LOmgZml human TNF- ⁇ manufactured by Zymodin was added to a medium containing 5 X 10 6 cells, and the cells were cultured for 17 hours. After culturing for 17 hours without adding anything to a medium containing 5 ⁇ 10 6 cells, the cells (hereinafter referred to as unstimulated HUVECs) were collected.
  • RNA was obtained by the AGPC method [Experimental Medicine_ £, 1937, (1991)]. That is, 5 ml of D solution (4 M guanidinium thiosinate, 25 mM sodium citrate, 0.5% n-lauryl sarcosine, 0.1 M 2-mercaptoethanol) was added to the recovered cells, and the cells were lysed. After that, 0.7 ml of 2 M sodium acetate (pH 4.0) was added.
  • D solution 4 M guanidinium thiosinate, 25 mM sodium citrate, 0.5% n-lauryl sarcosine, 0.1 M 2-mercaptoethanol
  • RNA was precipitated by centrifugation at 000 ⁇ g for 10 minutes. The supernatant was removed, and the precipitate was washed with 75% ethanol and dried under reduced pressure. The precipitate was dissolved in 3001 of distilled water, 3001 of 4M LiCl was added, mixed well, left on ice for 1 hour, and centrifuged at 15,000Xg for 10 minutes at 4 to precipitate RNA. . The supernatant was removed, and the precipitate was washed with 75% ethanol, dried, and dissolved in distilled water 221. 36 g of HUVEC stimulated with IL-4, 64 g of HUVEC stimulated with TNF- ", and total RNA from unstimulated HUVEC were obtained. (2) Fluorescent differential display using HUVEC total RNA
  • HUVE stimulated with IL-4 TNF-For total RNA of HUVEC stimulated and unstimulated HUVEC add distilled water to each 2.5 RN of each RN to 2.5 lbs.
  • Anchor-primer-FAH the nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 4; 50 M, manufactured by Saddy I
  • FITC olescein isothiocyanate
  • reaction solution 5 X reverse transcriptase reaction buffer [250mM Tris-HCl (pH8.3) , 275mM KCU 15m M gCl 2] 4 1, lOOmM Jichiosurei Torr (DTT) 2 1, 10mM dNTP (dATP, dGTP, ( ⁇ and dCTP) 1 ⁇ 1, distilled water 1 mu 1, reverse transcriptase SUPERSCRIPT ⁇ II RNAse
  • H-Reverse Transcriptase (Life 'Technologies, Inc.) 1 1 (200 units), mix, allow to stand at room temperature for 10 minutes, react at 42 with 50 minutes to synthesize cDNA, The reaction was stopped by heating for minutes.
  • a TE buffer (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), lmM ethylenediaminetetraacetate sodium (EDTA) ( ⁇ . ⁇ )] 401 was added to the reaction solution to prepare a cDNA solution.
  • the DNA was reacted at 72 ° C. for 5 minutes to amplify the DNA fragment.
  • a solution for electrophoresis sample (95% formamide, 0.1% xylenesanol, 0.1% bromphenol) to reaction solution 41, heat at 95C for 2 minutes, and immediately cool with ice. Electrophoresis was performed on a 6% acrylamide gel. 89 mM Tris (hydroxymethyl) aminoaminomethane, 89 mM boric acid as electrophoresis buffer , 2 mM EDTA was used.
  • MC Bioproducts stained with ethidium mouth, and amplified DNA fragments were cut out.
  • the DNA fragment was heated at 65 for 15 minutes to melt the agarose, extracted with phenol-chloroform, extracted with chloroform-isoamyl alcohol, precipitated with ethanol, and dissolved in TE buffer 101.
  • DNA fragment solution 1 1 and PCR fragment cloning vector pT7Blue T-Vector

Description

明 細 書 新規 D N A、 新規蛋白質および新規抗体
技術分野
本発明は、 好酸球を活性化する能力を有する蛋白質、 該蛋白質をコードする D N Aまたはオリゴヌクレオチド、 該 D N Aを含有してなる組換え体べクタ一、 該 組換えベクターを含む形質転換体、 該形質転換体を用いた蛋白質の製造方法、 該 蛋白質と特異的に作用する細胞、 該蛋白質と特異的に結合する細胞膜またはリセ プター、 該蛋白質のァゴニス トまたはアンタゴニス ト、 該蛋白質と特異的に結合 する抗体、 およびこれらを用いたアレルギー性炎症、 好酸球性肺炎、 突発性好酸 球増多症、 自己免疫疾患、 悪性腫瘍または寄生虫感染症の治療薬または診断法に 関する。 背景技術
血管内皮細胞は血管の最内側を構成し、 血球と直接接触し得る細胞である。 炎 症時には白血球が血管壁に接着，集積し、 やがて組織に浸潤してゆく力 、 血管内 皮細胞は接着分子ゃケモカインを発現することにより、 白血球の接着を引き起こ すのに大きな役割を果たしている。 また、 血管内皮細胞の接着分子ゃケモカイン の発現は、 白血球が分泌するサイ トカインにより促進あるいは抑制されることが 報告されている。 たとえば腫瘍壊死因子 （tumor necros i s factor α、 以下 Τ Ν F - αと称す） により、 接着分子である E—セレクチンおよびケモカインである インターロイキン一 8 ( I L - 8 ) の発現が上昇することが報告されている [Sc ience, 243, 1160 (1989)、 EMBO Journal , 13, 843 (1994) ] 。
炎症には多数のサイ トカインが関与しており、 活性化 T細胞やマスト細胞から 分泌されるインターロイキン一 4 ( I L - 4 ) もその一つと考えられている。 I L— 4は最初は B細胞の増殖分化因子として報告されたが、 その後の研究で血球 系を中心とした種々の細胞に多彩な作用を示すことが報告されている。 I L— 4 ノックァゥ トマウスの観察から、 生体内での作用としては、 T細胞をタイプ 2へ ルパ一 T細胞へと分化させ、 タイプ 2ヘルパー T細胞から I L— 4、 I L— 5、 I L— 6などのサイ トカインを産生させることにより免疫系を液性免疫応答側に 傾ける作用や、 B細胞の抗体産生のクラススィツチに関与し IgEや IgGlの産生を 促す作用があげられている。 [Blood, 77, 1859 (1991)、 Sc ience, 254, 707 (1 991)、 Nature, 362, 245 (1993) ] 。
また、 喘息等のアレルギー性の炎症疾患では好酸球の浸潤が症状の進行に主に 関与していることが知られている力 ?、 この好酸球の浸潤に I L— 4は深く関わつ ていることが報告されている。 たとえば、 I L— 4を発現させるようにしたガン 細胞をマウスに移植した場合、 移植部に好酸球とマクロファージが集積してガン 細胞が死んだという報告 [Celし 57, 503 (1989) ] 、 I L— 4発現トランスジェ ニックマウスで眼瞼に好酸球とマスト細胞が集積し、 アレルギー性炎症を引き起 こしたという報告 [Cel l , 62, 457 (1990) ] 、 肺特異的に発現させたトランスジ エニックマウスでは、 肺に好酸球とマスト細胞が集積し、 上皮細胞の肥厚等の喘 息様の症状を示したという報告 [Proc. Nat l . Acad. Sc ， 93, 7821 (1996) ] 、 I L一 4を皮下に連続投与したサルで、 好酸球の浸潤を伴う血管の炎症が見ら れたという報告 [Toxicologic Payhology, 19, 251 (1991) ] あるいは、 I L— 4遺伝子ノ ックァゥ トマウスでは、 抗原感作によるアレルギー反応で浸潤する好 酸球の数が低下していたという報告がある [Nature, 362, 245 (1993) ] 。 した がって、 血管内皮細胞において I L _ 4により発現が誘導されるような分子の中 には、 アレルギー性の炎症疾患や好酸球の浸潤に関連する分子が存在することが 予想される。 アレルギー性の炎症部位への好酸球の浸潤において、 内皮細胞への 好酸球の接着に関与する接着分子や好酸球の活性化や遊走に関与するケモカイン が重要な役割を果たしていると考えられるが、 血管内皮細胞を I L一 4で刺激す ることにより、 接着分子である VCAM-1 (vascular cel l adhes ion molecule- 1)、 L—セレクチンリガン ド、 P—セレクチンの発現が上昇することが報告されてい る [J. Immunol . , 148, 1086 (1992)、 J . Cel l Biol . , 125， 1417 (1994)、 J . Ex p. Med. , 184. 81 (1996) ] 。 また、 同様に血管内皮細胞を I L— 4で刺激した 際に、 ケモカインの一つである MCP-1 (monocyte chemoattractant protein - 1) が m R N Aレベルで誘導を受けるという報告がある [American Journal of Path ology, 138, 1315 (1991) ] 。
ケモカインとは、 リセプタ一を介して、 白血球をケモカイン濃度の高い方向に 遊走させる活性を有する分子であり、 白血球の浸潤の際に重要な役割を果たして いる。 また、 ケモカインがリセプターに結合することにより、 細胞内カルシウム 濃度が上昇することが知られている。 さらに、 ケモカインには、 遊走活性だけで なく白血球細胞を活性化する作用もあり、 たとえば接着分子であるイ ンテグリ ン の活性化を引き起こしたり、 白血球細胞の脱顆粒および増殖を促進する作用等が 報告されている [Nature, 361, 79 (1993)、 Journal of Leukocyte Biology, 59 , 81 (1996) ] 。 これらのことから、 ケモカインは、 上述の炎症だけでなく泡沫 化マクロファージが血管内皮細胞を通して血管平滑筋層集積が見られる動脈硬化 や、 活性化リ ンパ球が自己を攻撃する自己免疫疾患等、 白血球の活性化と遊走が 症状の進行に関与していると考えられる疾患に深く関わっている分子であると考 えられている。 また、 ケモカインの中には、 造血幹細胞に対して増殖阻害を示す 作用を持つものもある [Nature, 344, 442 (1990) ] 。 また、 これらとは別に RAN TES、 MIP-1 a (macrophage inf lammatory protein- 1 ひ） 、 MIP— 1 /3の 3種類の ケモカインカ ¾IV (human immunodef ic iency vi rus) の感染を阻害したという報 告 [Sc ience, 270, 1811 (1995) ] がなされたことから、 HIVの感染との関係が調 ベられ、 単球指向性 （M-tropic) の HIVに対してケモカインリセプター CCR5が細 胞上の CD4とともに感染のコ · リセプタ一として働いているという報告がなされ た [Nature, 381, 661 (1996)、 ibid. , 381, 667， (1996) Sc ience, 272, 1955 (1996) ] 。 また、 別のケモカインリセプターである CXCR4が、 T細胞指向性 （T-t ropic) な HIVに対して同様にコ ' リセプタ一として働いているという報告がなさ れている [Science, 272, 872 (1996)、 Nature, 382, 829 (1996)、 Nature, 382 ， 833 (1996) ] 。 現在までケモカインとして多数の種類が報告されている力;、、 そ のアミノ酸配列上の大きな特徴は 4個の Cys残基の位置が保存されている点にあ る。 この点から、 Cysのジスルフィ ド結合様式が高次構造の形成とケモカイン活 性の保持に重要な役割を果たしていることが推察される。 ケモカインには、 その アミノ酸配列から、 分子中に CysCys配列を持つ CCケモカインおよび分子中に CysX aaCys配列 （Xaaは任意のアミノ酸を表わす） を持つ CXCケモカインの二つのグル —プが知られている。 CCケモカイ ンは白血球のうちの単球に作用するもの、 CXC ケモカインは好中球に作用するものが多いが、 ケモカインの種類によりその作用 する細胞の種類および作用の強弱は異なっており、 また、 ケモカイン遺伝子発現 の制御についてもそれぞれのケモカインにより異なっている。 したがって、 ケモ 力イ ンの分泌は、 細胞および組織、 もしくはそれらが受ける刺激によって異なる と考えられる。
好酸球に作用するケモカインとしてェォタキシン （eotaxin) 、 RANTES、 MCP-3 、 MCP- 4、 eotaxin- 2等が報告されているが、 この中でもェォタキシンは、 作用が 好酸球特異的なこと、 抗原感作による動物アレルギーモデルで発現の上昇が見ら れることから注目されている。 し力、し、 ェォタキシン遺伝子ノックァゥ トマウス の解析から、 ェォタキシンは、 通常時の末梢好酸球の数の維持には関与している 力'、 アレルギー性炎症時等の病的な好酸球の浸潤にはその初期にしか関与してい ないこと、 初期においてもェォタキシン以外のケモカインも関与していることが 示唆された [J . Exp. Med. , 185, 785 (1997) ] 。
種々の寄生虫感染により、 血中の好酸球数が上昇することが報告されている。 ——方、好酸球は、活' Ιϊィ匕により、maj or bas ic prote irueos mophi 1 cat ionic proteiru eos inophi l peroxidase等の顆粒中の蛋白や活性酸素などの種々のメデイエ一タ 一を遊離する。 これらのメディエーターは殺細胞活性や殺寄生虫活性を有し、 好 酸球の組織障害や寄生虫からの生体防御に関与していると考えられる。 [ Eos inophi ls : Biological and Ci inicai Aspects, eai ted by H. Makino and T. Fukuda, CRC Press, (1993) ] したがって、 ケモカインによ り、 悪性腫瘍や寄生 虫感染部位に活性化好酸球を集積させることができれば、 これら疾病の治療がで きると考えられる。 発明の開示
本発明は、 以下の（1)〜（35)に関するものである。
(1) 配列番号 1 3で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質、 または該アミノ酸 配列において 1以上のァミノ酸が欠失、 置換もしくは付加されたァミノ酸配列か らなりかつ好酸球を活性化する能力を有する蛋白質 （以下、 本発明の蛋白質とも いう） 。
(2) (1)記載の蛋白質をコードする D N A、 または該 D N Aとス ト リ ンジヱン ト な条件下でハイブリダィズし、 かつ好酸球を活性化する能力を有する蛋白質をコ —ドする D N A (以下、 本発明の D N Aともいう） 。
(3) (2)記載の D N Aを含有してなる組換えべクタ一 （以下、 本発明の組換えべ クタ一ともいう） 。
(4) (3)記載の組換えベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換体 （以下、 本発明の形質転換体ともいう） 。
(5) (4)記載の形質転換体を培地に培養し、 培養物中に上記蛋白質を生成蓄積さ せ、 該培養物から該蛋白質を採取することを特徴とする蛋白質の製造方法 （以下 本発明の蛋白質の製造方法ともいう） 。
(6) (1)記載の蛋白質を含有する医薬。
(7) (1)記載の蛋白質を含有する悪性腫瘍または寄生虫感染症の治療薬。
(8) (1)記載の蛋白質の有効量を投与することからなる悪性腫瘍または寄生虫感 染症の治療方法。
(9) (1)記載の蛋白質と被験試料とを接触させることを特徴とする、 該蛋白質が 特異的に作用する細胞、 または該蛋白質と特異的に結合する細胞膜もしくはリセ プタ一を検出する方法。
訂正された用紙 （規則 91) (10) (1)記載の蛋白質と被験試料とを接触させること.を特徴とする、 該蛋白質 が特異的に作用する細胞、 または該蛋白質と特異的に結合する細胞膜もしくはリ セプタ一を取得する方法。
(11) (10)記載の方法により得られる細胞、 細胞膜またはリセプター。
(12) ( a ) ( 1) 記載の蛋白質と（11)記載の細胞、 細胞膜またはリセプタ一を接 触させた場合と （b ) ( 1)記載の蛋白質と（11)記載の細胞、 細胞膜またはリセプ ターおよび試験化合物を接触させた場合との比較を行うことを特徴とする、 （1) 記載の蛋白質のァゴニス トまたはアンタゴニス トを取得する方法。
(13) (12)記載の方法により得られるァゴニス トまたはアンタゴニス ト （以下、 本発明のァゴニス トまたはアンタゴニス ト ともいう） 。
(14) (1)記載の蛋白質と特異的に反応する抗体 （以下、 本発明の抗体ともいう
(15) ハイプリ ドーマ KM1885。
(16) (14)記載の抗体を用いて（1)記載の蛋白質を免疫学的に検出または定量す る方法。
(17) (14)記載の抗体を用いることを特徴とする、 アレルギー性炎症、 好酸球性 肺炎、 突発性好酸球増多症または自己免疫疾患の診断方法。
(18) (14)記載の抗体を含有するアレルギー性炎症、 好酸球性肺炎、 突発性好酸 球増多症または自己免疫疾患の診断薬。
(19) (14)記載の抗体を含有する医薬。
(20) (14)記載の抗体を含有するアレルギー性炎症、 好酸球性肺炎、 突発性好酸 球增多症または自己免疫疾患の治療薬。
(21) (14)記載の抗体の有効量を投与することからなるアレルギー性炎症、 好酸 球性肺炎、 突発性好酸球増多症または自己免疫疾患の治療方法。
(22) (2)記載のセンス D N A。
(23) (2)記載のアンチセンス D N A。 (24) (22)記載の D N Aの塩基配列の一部を含むォリゴヌクレオチド。
(25) (23)記載の D N Aの塩基配列の一部を含むオリゴヌクレオチド。
(26) (22)もしくは（23)記載の D N Aまたは（24)もしくは（25)記載のオリゴヌク レオチドを用いることを特徴とする、 （1)記載の蛋白質をコ一ドする m R N Aを 検出する方法。
(27) (22)もしくは（23)記載の D N Aまたは（24)もしくは（25)記載のオリゴヌク レオチドを用いることを特徴とする、 アレルギー性炎症、 好酸球性肺炎、 突発性 好酸球增多症、 自己免疫疾患、 悪性腫瘍または寄生虫感染症の診断方法。
(28) (22)もしくは（23)記載の D N Aまたは（24)もしくは（25)記載のオリゴヌク レオチドを含有するアレルギー性炎症、 好酸球性肺炎、 突発性好酸球增多症、 自 己免疫疾患、 悪性腫瘍または寄生虫感染症の診断薬。
(29) (23)記載の D N Aまたは（25)記載のオリゴヌクレオチドを用いて（1)記載 の蛋白質の発現を抑制する方法。
(30) (23)記載の D N Aまたは（25)記載のオリゴヌクレオチドを含有する医薬。
(31) (23)記載の D N Aまたは（25)記載のオリゴヌクレオチドを含有するアレル ギ—性炎症、 好酸球性肺炎、 突発性好酸球増多症または自己免疫疾患の治療薬。
(32) (23)記載の D N Aまたは（25)記載のオリゴヌクレオチドの有効量を投与す ることからなるアレルギー性炎症、 好酸球性肺炎、 突発性好酸球増多症または自 己免疫疾患の治療方法。
(33) (22)もしくは（23)記載の D N Aまたは（24)もしくは（25)記載のオリゴヌク レオチドを含有するアレルギー性炎症、 好酸球性肺炎、 突発性好酸球増多症、 自 己免疫疾患、 悪性腫瘍または寄生虫感染症の遺伝子治療用べクタ一 （以下、 本発 明の遺伝子治療用べクターともいう） 。
(34) (33)記載の遺伝子治療用べクタ一を用いることを特徴するアレルギー性炎 症、 好酸球性肺炎、 突発性好酸球増多症、 自己免疫疾患、 悪性腫瘍または寄生虫 感染症の治療方法。 (35) I L - 4で刺激したヒ ト血管内皮細胞より、 ディファレンシャル .デイス プレイ法を用いてケモカイ ン蛋白質をコ一ドする D N Aを取得する方法。
以下に、 本発明を詳細に説明する。
本発明において 「好酸球を活性化する能力を有する」 とは、 好酸球に作用して、 細胞内カルシウム濃度、 細胞内情報伝達系または細胞の応答系を、 促進または增 大させる能力を有することを意味する。
本発明の蛋白質は、 配列番号 1 3で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質の他、 好酸球を活性化する能力を有しさえすれば、 該アミノ酸配列において 1以上のァ ミノ酸が欠失、 置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなる蛋白質であっても よい。 ァミノ酸の欠失、置換もしくは付加は、 Nuc leic Ac ids Research, 10, 6487 (1982)、 Proc. Nat l . Acad. Sc i . , USA, 79, 6409 (1982)、 Gene, 34, 315 (1985)、 Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985)、 Proc. Nat l . Acad. Sc i USA, 82, 488 (1985) 等に記載の部位特異的変異導入法を用いて配列番号 1 3記載のアミノ酸配列から なる蛋白質をコードする D N Aに部位特異的変異を導入することにより行うこと ができる。 欠失、 置換もしくは付加されるアミノ酸の数は特に限定されないが、 1個から数十個、 特に 1 もしくは数個のアミノ酸であること力、 部位特異的変異 誘発法により欠失、 置換もしくは付加する上で好ましい。 また、 本発明の蛋白質 が好酸球を活性化する能力を有するためには、 配列番号 1 3記載のアミノ酸配列 と少なく とも 6 0 %以上、 通常は 8 0 %以上、 特に 9 5 %以上の相同性を有して いることが好ましい。 さらに、 本発明の蛋白質がケモカイン蛋白質であるために は、 配列番号 1 3に示されるアミノ酸配列のうち、 4個の Cys残基およびその位 置は保存されるように置換、 挿入もしくは欠失された蛋白質であることが好まし レ、
本発明の D N Aは、 本発明の蛋白質をコードする D N A、 例えば配列番号 1 3 に示されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコ一ドする D N Aとして配列番号 1 4 に示される塩基配列を有する D N Aがあげられる。 しかし、 一般に 1つのアミノ 酸に対して複数種の遺伝暗号が存在するため、 配列番号 1 4とは異なる塩基配列 を有する DN Aであっても配列番号 1 3に示されるアミノ酸配列を有する蛋白質 をコ一ドしていれば本発明の DN Aに含まれる。
本発明の蛋白質をコードする DN Aとストリンジェントな条件下でハイプリダ ィズする DN Aとは、 本発明の蛋白質をコードする DNA、 例えば配列番号 1 4 で示される塩基配列を有する DN Aとして、 コロニー ·ハイプリダイゼーション 法、 プラーク ·ノヽィブリダイゼーション法あるいはサザンブロッ トハイブリダイ ゼーション法等を用いることにより得られる DN Aを意味する。 具体的には、 32 P標識した配列番号 1 4で示される塩基配列を有する DN Aをプローブとして含 む以下の組成のハイブリダィズ溶液 〔6 XSSC [0.9M NaCl、 90mM クェン酸ナト リウム ； n XSSCは 1 XSSC (150mM NaCK 15mM クェン酸ナ ト リ ウム） の n倍濃 度を表わす] 、 5 Xデンハルト溶液 （0.1% ゥシ血清アルブミ ン、 0.1%フィ コ —ル、 0.1%ポリビニルピロリ ドン） 、 0.5% ドデシル硫酸ナトリウム （SDS) 、 20 g/mlのサケ精子 DN Aを超音波処理した後に沸騰水浴で 5分間加熱後氷中 で急冷して得られる変成 DN A〕 中でコロニーあるいはプラーク由来の DN Aを 固定化したフィルターを 65°Cでー晚ハイプリダイゼーションを行った後、 2 XSSC 中で 65°C15分間振とうする洗浄を 2回繰り返し、 さらに 0.1% 505を含む2 55じ 中で 65°C30分間振とうする洗浄、 0.1% SDSを含む 0.1XSSC中で 65°C10分間振と うして洗浄を行った後に該プローブとハイブリダィズしている D N Aをあげるこ とができる。
本発明の DN Aは、 以下の方法により取得することができる。
I L一 4で刺激したヒ ト血管内皮細胞、 例えばヒ ト臍帯静脈血管内皮細胞で、 刺激していないときと比較して mRN Aの発現量が変動する遺伝子の解析をディ ファレンシャル · ディスプレイ法により行うことにより、 本発明の蛋白質の c D N A断片を取得することができる。 この c DN A断片をプローブとして、 血管内 皮細胞 c DN Aライブラリ一をスク リーニングすることにより、 本発明の DNA をクローン化することができる。 本発明の DNAの調製方法を、 以下に説明する。
アレルギー性炎症疾患において好酸球が重要な役割を果たしていることが明ら かになつてきている。 この好酸球の浸潤に I L _ 4が深く関与していることから 、ディ ファレンシャル'ディスプレイ法 [Science, 257, 967 (1992)、 FEBS Letters, 351, 231 (1994)] を用いて、 血管内皮細胞を I L— 4で刺激した時と刺激する 前とで mRN Aの発現量が変動する遺伝子の解析を行うことにより、 好酸球の浸 潤に関与する遺伝子の DN Aを調製する。 すなわち、 I L— 4で刺激した血管内皮細胞および I L一 4で刺激していない 血管内皮細胞から全 RNAを調製する。 全 RNAを調製する方法としては、 チォ シアン酸グァニジン一 トリフルォロ酢酸セシウム法 [Methods i n Enzymo 1 ogy , 154, 3 (1987)] 、 酸性チォシアン酸グァニジン ' フエノール ' クロ口ホルム （AGPC) 法 [Analytical Biochemistry, 162, 156 (1987)] 等があげられる。
血管内皮細胞より抽出した上記各々の RN Aから、 アンカ一プライマーを用い て Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition,し old Spring Harbor Laboratory Press (1989)、 Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1-38， John Wiley & Sons (1987-1997)、 DNA Cloning 1： Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University Press (1995)等に 己 載の方法で逆転写酵素の反応を行い、 RNA中の mRNAから c DNAを合成す > o
次に、 これら各々の c DN Aに対してアンカープライマーと任意のプライマ一 を用いてポリメラーゼ · チェーン · リアクショ ン （Polymerase Chain Reaction ：以下、 PCRという） 法を用いて c DN A断片を増幅する。 アンカープライマ —とは、 mRNAの 3'末端ポリ A配列に会合するオリゴ dT配列の 3'末端に、 チミ ジンを除くアデニン、 グァニンあるいはシトシンのオリゴヌクレオチドを付加し たプライマーであり、 例えば、 配列番号 4に示す塩基配列のォリゴヌクレオチド をあげることができる。
10
ΐ丁正された用紙 （規則 91) 任意プライマーとは、 多種類の c D N Aを増幅することができ、 かつ一度の反 応で多数の c D N A増幅断片を得ることができるォリゴヌクレオチドのことであ り、 オペロン ' テクノロジーズ （Operon Technologies)社製の 0PA- 1 〜20、 0PB - 1 〜20、 0PC- 1 〜20、 0PD- 1〜20等をあげることができる。 任意プライマ一は 10 〜20塩基程度の長さのものが好ましい。
P C R法を用いて c D N A断片を増幅した後、 反応液をポリアクリルァミ ドゲ ルで電気泳動した後、 ゲル中の c D N A断片をサイバーグリーン Iなどの D N A 特異的な蛍光染色剤で蛍光染色する。 各断片の蛍光量はフルォロイメージャーを 用いて測定でき、 濃淡のバン ドのパターンとして視覚化することができる。 また 、 アンカ一プライマ一として、 5'端を蛍光標識したものを P C R法に用いれば、 蛍光染色無しに電気泳動後すぐ増幅断片の蛍光量を測定できる。 プライマーの 5' 端の蛍光標識はフルォレセィン · ィソチオシァネ一トを用いて常法により行うこ とができる。 I L— 4で刺激した血管内皮細胞および I L一 4で刺激していない 血管内皮細胞からそれぞれ調製した R N Aを増幅して得られる c D N A断片を電 気泳動した後、 それぞれのバン ドの蛍光量を測定し、 蛍光量の変動しているバン ドの位置に相当するところのゲルを切り出す。
切り出したゲルの一部を铸型にして P C R法を用いてゲル中の c D N A断片を 増幅し、 この増幅断片をそのまま、 あるいは Pfu D N Aポリメラ一ゼ等により末 端を平滑化後、 常法によりべクタ一に組み込み、 クローン化する。 該増幅 c D N A断片を組み込むベクタ一としては、 pT7Blue T- Vector [ノバジェン （Novagen ) 社製] 、 pDIRECT [クローンテック （Clontech) 社製、 Nucle ic Ac ids Research 18, 6069 (1990) ] 、 pCR - Script Amp [ス トラタジーン （Stratagene) 社製] 、 pCR2. 1 [イ ンビトロジヱン社製] 、 pCR- TRAP [ゲンハンター（GenHunter)社製] 、 pTA (二ツボンジーン社製） などをあげることができる。
クローン化された c D N A断片の塩基配列を、 サンガ一 （Sanger) らのジデォ キシ法 [Proc. Nat l . Acad. Sc i . USA, 74， 5463 (1977) ] あるいはパーキン - エルマ一 （Perkin Elmer) 社、 フアルマシア （Pharmacia) 社等の DNAシーク ェンサ一を用いて決定する。このようにして決定された塩基配列の新規性は、 BLAST 等の相同性検索プログラムを用いて、 GenBank、 EMBLおよび DDBJなどの塩基配列 データべ一スを検索することにより、 データベース中の塩基配列と一致すると考 えられるような明らかな相同性を示す塩基配列がないことにより確認できる。 上記のようにして取得された新規な塩基配列をもつ DNAとして、 例えば、 配 列番号 3に記載の塩基配列を有する DN Aをあげることができる。 この配列番号 3に記載の塩基配列を有する DN Aは、 I L— 4で刺激していないときと比較し て I L一 4で刺激した血管内皮細胞で発現量が上昇していたバンドから得られた DNAであり、 以下に示す解析の結果、 I L一 4で刺激した血管内皮細胞で発現 量が上昇する本発明の蛋白質である HVC002蛋白質をコードする c DN Aの一部が 増幅されて得られたものであることがわかる。
上述の方法で得られた配列番号 3に記載の塩基配列を有する増幅断片 D N Aを 利用して、 c DNAライブラリーのスクリーニング、 または R AC E (Rapid Amplification of cDNA Ends)法を行うことにより、 本発明の DNAを得ること ができる。
上記の方法で取得した I L一 4で刺激した血管内皮細胞の全 RN Aからポリ（A) + RNAとして mRNAを調製する。 調製法としては、 オリゴ（dT)セルロースを用 レ、る方法 [Molecular Cloning, A Laboratory Manual , Second Edit ion, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)] 等があげられる。 あるいは、 Fast Track mRNA Isolation Kit [インビトロジェン社製] 、 Quick Prep mRNA Purification Kit [ファルマシア社製] などのキッ トを用いて I L一 4で刺激した血管内皮細胞か ら直接 mRNAを調製することもできる。 この mRNAを c DN Aに変換し、 適 当なベクタ一に組み込み、 宿主細胞に導入することにより c DNAライブラリー を作製する。具体的な c DNAライブラリ一作製法としては、 Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Εαι t ion, (1989)、 し urrent Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38 (1987-1997)、 DNA Cloning 1： Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition (1995)等に記載された方法、 あるいは市 販のキッ ト、 例 ば Superscript Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning (ライフ ' テクノロジ一ズ社製） や ZAP- cDNA Synthesis Kit [ストラタ ジーン社製] を用いる方法などがあげられる。 c DNAライブラリ一を作製する ためのクローニングべクターとしては、 大腸菌 K12株中で自立複製できるもので あれば、 ファージベクタ一、 プラスミ ドベクター等いずれでも使用できる。 具体 的には、 ZAP Express [ス トラタジーン社製] 、 pBluescript II SK (+) [Nucleic Acids Research, 17, 9494 (1989)] 、 Lambda ZAP II (ストラタジーン社製） 、 ス gtlO、 λ gtll [DNA Cloning, A Practical Approach,丄， 49 (1985)] 、 A TriplEx (クローンテック社製） 、 AExCell (フアルマシア社製） 、 pT7T318U (フアルマ シァ社製） 、 pcD2 [Mol. Cell. Biol. , 3, 280 (1983)] 等をあげることができ る。
宿主微生物としては、 大腸菌 Escherichia col iに属する微生物であればいずれ も用いることができる。 具体的には、 Escherichia coli XLl-Blue MRF' [ストラ タジ一ン社製] .Escherichia coli C600 [Genet ics, 39, 440 (1954)]、 Escherichia coli Y1088 [Science, 222, 778 (1983)] 、 Escherichia coli Y1090 [Science, 222, 778 (1983)] 、 Escherichia coli 匪 522 [J. Mol. Biol. , 166, 1 (1983) ] 、 Escherichia coli K802 [J. Mol. Biol. , 16, 118 (1966)] および Escherichia coli JM105 [Gene, 38. 275 (1985)] 等が用いられる。 以上のように調製した c DNAライブラリ一に対してコロニーハイブリダイゼ一シヨ ンあるいはプラーク ノヽィブリタ セーション [Molecular Cloning, A Laboratory Manual , Second Edi t ion (1989)、 Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1-38 (1987-1997) 、 DNA Cloning 1： Core Techniques, A Practical Approach, Second Edi t ion (1995) ] を行うことにより本発明の蛋白質をコ一ドする c DN Aクローンを得ることが できる。 プローブとしては、 配列番号 3に示される塩基配列からなる DNA断片
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汀正された用紙 （規則 91) を32 p等で標識したものを用いることができる。
得られた c DN Aの塩基配列は、 上記の塩基配列の決定方法を用いて決定する ことができる。
以上の方法により得られた本発明の蛋白質をコ一ドする DN Aとして、 例えば 、 配列番号 1 4に示される塩基配列を有する DN Aをあげることができる。 また、 RAC E法を用いることにより、 増幅断片より 5'端側の c DNAが得ら れる [Pnx:.Natl.Acad.Sci. USA, 85, 8998 (1988)] 。 すなわち、 c DNAライ ブラリーのスクリ一ユングと同様な方法により、 I L一 4刺激血管内皮細胞の c DNAを合成し、 この c DN Aの両端にアダプターを付加し、 このアダプターの 塩基配列と増幅断片の塩基配列に基づいたプライマーで P C Rを行い、 增幅断片 を上記と同様な方法によりベクターにクローン化することによりディファレンシ ャル · ディスプレイで得られた増幅断片より 5，端側の c DN Aが得られる。 得ら れた c DNAの塩基配列は、 c DNAライブラリ一のスクリ一ニングと同様な方 法により確認することができる。 この塩基配列をもとにして、 得られた c DNA とディファレンシャル . ディスプレイで得られた増幅断片とをつなぎあわせるこ とにより全長と考えられる c DN Aを取得することもできる。
また、 以上のようにして本発明の DNAの塩基配列が明らかになった後は、 該 c DN Aの塩基配列に基づいたプライマ一を調製し、 I L— 4で刺激した血管内 皮細胞から上記と同様な方法により調製した c DNAあるいは c DNAライブラ リーを铸型として、 P C R [PCR, A practical Approach (1991)] を行うことに より、 本発明の蛋白質をコードする DN Aを取得することができる。
決定された DN Aの塩基配列に基づいて、 DN A合成機で化学合成することに よって本発明の DNAを調製することもできる。 DNA合成機としては、 フォス フォアミダイ ト法を利用した DN A合成機 model 392(パーキン 'エルマ一社製） 等をあげることができる。
DN A合成機により、 本発明の DN Aの一部の塩基配列を有するアンチセンス - オリゴヌクレオチドを化学合成することができる。 また、 本発明においては、 該ヌク レオチドの誘導体も用いることができ、 例えば、 該ヌク レオチドのメチル 体ゃフォスフォロチォェ一ト体をあげることができる。
上記の方法により取得した本発明の D N Aを宿主細胞中で発現させるためには 、 Molecularし loning, A Laboratory Manual , 2nd Ed. (1989)や Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1-38, (1987- 1997)等に記載された方法を用 いることができる。
すなわち、 本発明の D N Aを適当な発現べクターのプロモータ一下流に揷入す ることにより本発明の組換えべクタ一を造成し、 該組換えべクタ一を宿主細胞に 導入することにより、 本発明の形質転換体を得ることができる。
宿主細胞としては、 細菌、 酵母、 動物細胞、 昆虫細胞等、 目的とする遺伝子を 発現できるものであればいずれも用いることができる。 発現べクタ一としては、 上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組込が可能で、 本発明 の D N Aを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。 細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合は、 本発明の組換えべクタ一は 原核生物中で自立複製可能であると同時に、 プロモータ一、 リボソーム結合配列 、 本発明の D N A、 転写終結配列により構成されていることが好ましい。 プロモ —ターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
発現ベクターとしては、 例えば、 pKK233- 2 (フアルマシア社製） 、 pSE280 (ィ ンビトロジェン社製）、pGEMEX- 1 [プロメガ（Promega)社]、 pQE- 8 [キァゲン（QIAGEN) 社製]、 pKYPIO (特開昭 58- 110600)、pKYP200 [Agricul tural Biological Chemi stry, 48, 669 (1984) ] 、 pLSAl [Agric. Biol . Chem. , 53, 277 (1989) ] 、 pGELl [Pro Nat l . Acad. Sc i . USA, 82, 4306 (1985) ] 、 pBluescript II SK (-) (ス トラタ ジーン社製） 、 pGEX (フアルマシア社製） 、 pET- 3 (ノバジェン社製） 等があげ られる 。 発現べクタ一としては、 リボソーム結合配列である Shine-Dalgarno配 列と開始コ ドンとの間を適当な距離 （例えば 6〜18塩基） に調節したものを用い ることが好ましい。
プロモーターとしては、 大腸菌等の宿主細胞中で発現できるものであればいか なるものを用いてもよい。 例えば、 ^プロモータ一 （Ptrp) 、 lacプロモータ一、 pLプロモーター、 pRプロモーター、 T7プロモーター等の、 大腸菌やファージ等に 由来するプロモータ一等があげられる。 また、 Pt„を 2つ直列させたプロモータ一 (Ptrp X 2 ) 、 プロモータ一、 lacT7プロモータ一、 let Iプロモータ一のよう に人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
本発明の組換えべクターにおいては、 本発明の D N Aの発現には転写終結配列 は必ずしも必要ではないが、 構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが 好ましい。
宿主細胞としては、 ェシエリヒア属、 バチルス属、 コリネバクテリウム属、 ブ レビバクテリウム属、 シユードモナス属、 セラチア属、 等に属する微生物、 例え は、 Escherichia— col i XL1 - Blue MRr '、 Escherichia col i DHK Escherichia col ι 扉 09、 Escherichia col i HB101、 Bac i 1 lus subt i 1 i s、 Bac i 1 lus amylol iquefac ines 、 Brevibacterium immariophi lum ATCC14068, Brevibacterium saccharolyt icum ATCC14066、 Corynebacterium g utamicum ATCC13032、 Corvnebacterium ace oacidophi lum ATCC13870等をあげることができる。
組換えべクターの導入方法としては、 上記宿主細胞へ D N Aを導入する方法で あればいずれも用いることができ、例えば、塩化カルシウム法 [Pro Nat l . Acad. Sc i . USA, 69, 2110 (1972) ] 、 プロトプラス ト法 （特開昭 63- 2483942) 、 エレ ク トロボレ一シヨ ン法等をあげることができる。
酵母菌株を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、 YEpl3 (ATCC37115) 、 YEp24 (ATCC37051) 、 YCp50 (ATCC37419) 等を用いることがで きる。
プロモーターとしては、 酵母菌株中で発現できるものであればいずれのものを 用いてもよく、 例えば、 へキソースキナーゼ等の解糖系の遺伝子のプロモータ一 、 gal 1プロモーター、 gal 10プロモータ一、 ヒートショックポリぺプチドプロ モータ一 、 MFal プロモーター、 CUP 1プロモーター等のプロモータ一等があげ られる。
伯主細胞としては、 aaccharomyces cerevis^ Schizosaccharomvces pombe Kluvveromyces lact is Tr ichosporon pul lulatis、 Schwann iomvces alluvius等 をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、 酵母に DN Aを導入する方法であればい ずれも用いることができ、例えば、エレク ト口ポレーション法 [Methods. Enzymol. , 194, 182 (1990)] 、 スフエロプラス ト法 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 4889 (1984)] 、 酢酸リチウム法 [Journal of Bacteriology, 153, 163 (1983)] 等が あげられる。
動物細胞を宿主として用いる場合には、発現べクターとして、例えば、 pAGE107 [特開平 3- 22979、 Cytotechnology, 3, 133, (1990)] 、 pAS3 - 3 (特開平 2- 227075 ) 、 pCD 8 [Nature, 329, 840, (1987)] 、 pc DN AI/Amp (インビトロジェン 社製） 、 pREP4 (インビトロジェン社製） 、 pAGE103 [Journal of Biochemistry, 101, 1307 (1987)] 等が用いられる。
プロモータ一としては、 動物細胞中で発現できるものであればいずれも用いる ことができ、 例えば、 サイ トメガロウィルス （C V) の IE (immediate early) 遺 伝子のプロモータ一、 SV40の初期プロモーターあるレ、はメタロチォネイ ンのプロ モータ一等があげられる。 また、 ヒ ト CMVの IE遺伝子のェンハンサーをプロモー ターとともに用いてもよい。
宿主細胞としては、 ヒ トの細胞であるナマルバ （Namalwa) 細胞、 サルの細胞 である COS細胞、 チャイニーズ ·ハムスターの細胞である CH0細胞、 HBT5637 (特 開昭 63-299) 等があげられる。
組換えベクターの導入方法としては、 動物細胞に DN Aを導入する方法であれ ばいずれも用いることができ、例えば、エレク トロポレ一シヨン法 [Cytotechnology, 3, 133 (1990) ] 、 リ ン酸カルシウム法 （特開平 2- 227075) 、 リポフエクシヨ ン 法 [Pro Nat l . Acad. Sc i . USA, 84, 7413 (1987) ] 等があげられる。
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、例えば、 Baculovi rus Express ion Vectors, A Laboratory Manual , W. H. Freeman and Company, New York (1992)、 Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1-38, (1987-1997)、
Bio/Technology, 6, 47 (1988)等に記載された方法に従って、 タンパク質を発現 することができる。
すなわち、 本発明の組換えべクタ一 （以下、 本発明の組換え遺伝子導入べクタ —ともいう） およびバキュロウィルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清 中に組換えウィルスを得た後、 さらに組換えウィルスを昆虫細胞に感染させ、 タ ンパク質を発現させることができる。
該方法において用いられる遺伝子導入ベクターとしては、 例えば、 pVL1392、 pVL1393、 pBlueBacIII (ともにインビトロジヱン社製） 等があげられる。
バキュロウィルスとしては、 例えば、 夜盗蛾科昆虫に感染するウィルスである アウ トグラファ ·カリフォルニ力 ·ヌクレア一'ポリへドロシス'ウイルス（Autographa cal l fornica nuclear polynedros i s vi rus) 等など力、用レ、られる。
昆虫細胞としては、例えば、 Spodoptera frugiperdaの卵巣細胞である Sf9、 Sf21 [Baculovi rus Express ion ectors, A Laboratory Manual , New York (1992) ] 、 Trichoplus ia niの卵巣細胞である High 5 (インビトロジェン社製） 等が用い られ <t 。
組換えゥィルスを調製するために昆虫細胞への本発明の組換え遺伝子導入べク 夕一と上記バキュロウィルスを共導入する方法としては、 例えば、 リン酸カルシ ゥム法 （特開平 2-227075号） 、 リポフエクシヨ ン法 [Pro Nat l . Acad. Sc i . USA, 84. 7413 (1987) ] 等があげられる。
遺伝子の発現方法としては、直接発現以外に、 Molecular Cloning, A Laboratory Manual , Second Edi t ion (1989)に記載されている方法等に準じて、 分泌生産、 融合タンパク質発現等を行うことができる。
酵母、 動物細胞または昆虫細胞により発現させた場合には、 糖あるいは糖鎖が 付加された蛋白質を得ることができる。
本発明の形質転換体を培地に培養し、 培養物中に本発明の蛋白質を生成蓄積さ せ、 該培養物から採取することによ り、 本発明の蛋白質を製造することができる 。 本発明の形質転換体を培地に培養する方法は、 宿主の培養に用いられる通常の 方法に従って行うことができる。
大腸菌等の原核生物あるいは酵母等の真核生物を宿主として得られた形質転換 体を培養する培地としては、 該生物が資化し得る炭素源、 窒素源、 無機塩類等を 含有し、 形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、 合成培地の いずれを用いてもよい。
炭素源としては、 該生物が資化し得るものであればよく、 グルコース、 フラク ト一ス、 スクロース、 これらを含有する糖蜜、 デンプンあるいはデンプン加水分 解物等の炭水化物、 酢酸、 プロピオン酸等の有機酸、 エタノール、 プロパノール などのアルコール類等を用いることができる。
窒素源としては、 アンモニア、 塩化アンモニゥム、 硫酸アンモニゥム、 酢酸ァ ンモニゥム、 リン酸アンモニゥム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニゥム塩、 その他の含窒素化合物、 並びに、 ペプトン、 肉エキス、 酵母エキス、 コーンスチ —プリカ一、 カゼイン加水分解物、 大豆粕および大豆粕加水分解物、 各種発酵菌 体、 およびその消化物等を用いることができる。
無機物としては、 リ ン酸第一カリウム、 リ ン酸第二カリ ウム、 リ ン酸マグネシ ゥム、 硫酸マグネシウム、 塩化ナ ト リウム、 硫酸第一鉄、 硫酸マンガン、 硫酸銅 、 炭酸カルシウム等を用いることができる。
培養は、 通常振盪培養または深部通気攪拌培養などの好気的条件下で行う。 培 養温度は 15〜4(TCがよく、 培養期間は、 通常 16〜96時間である。 培養中 pHは 3. 0 〜9. 0に保持する。 pHの調整は、 無機または有機の酸、 アルカリ溶液、 尿素、 炭 酸カルシウム、 アンモニアなどを用いて行う。 必要に応じて、 培養期間中にアン ピシリンゃテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモータ一として誘導性のプロモータ一を用いた発現べクターで形質転換し た微生物を培養するときには、 必要に応じてィンデユーザーを培地に添加しても よい。 例えば、 プロモータ一を用いた発現ベクターで形質転換した微生物を 培養するときにはィソプロピル一 —D—チォガラク トピラノシド等を、 tr ° 口モータ一を用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイン ドールアタリル酸等を培地に添加してもよい。
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、 RPMI1640 培地、 Eagleの MEM培地またはこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等が用い られる。
培養は、 通常 5 % C 0 2存在下等の条件下で行う。 培養温度は 35〜37でがよく 、 培養時間は、 通常 3〜 7日間である。
また、 培養中必要に応じて、 カナマイシン、 ペニシリ ン等の抗生物質を培地に 添加してもよレ、。
昆虫細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、 TNM - FH培 地 [ファーミ ンジェン （Pharmingen) 社製] 、 Sf- 900 II SFM培地 （ライフ ' テ クノロジーズ社製） 、 ExCel l400、 ExCel l405 [いずれも JRHバイオサイエンシー ズ （JRH Biosciences) 社製] 等が用いられる。
培養温度は 25〜30でがよく、 培養期間は、 通常 1 〜 4日間である。 必要に応じ て、 培養期間中にゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
上記形質転換体の培養液から、 上記方法により発現させた蛋白質を単離精製す るためには、 通常の蛋白質の単離、 精製法を用いればよい。
例えば、 本発明の蛋白質が、 細胞内に溶解状態で発現した場合には、 培養終了 後、 細胞を遠心分離により回収し水系緩衝液にけん濁後、 超音波破砕機、 フレン チプレス、 マン ト ンガウリンホモゲナイザ一、 ダイノミル等により細胞を破砕し 、 無細胞抽出液を得る。 該無細胞抽出液を遠心分離することによ り得られた上清 から、 通常の蛋白質の単離精製法、 即ち、 溶媒抽出法、 硫安等による塩析法、 脱 塩法、 有機溶媒による沈殿法、 ジェチルアミ ノエチル （DEAE) —セファロ一ス、 DIAION HPA-75 (三菱化成社製） 等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラ フィ一法、 S- Sepharose FF (フアルマシア社製） 等のレジンを用いた陽イオン交 換クロマ トグラフィー法、 ブチルセファロース、 フエ二ルセファロ一ス等のレジ ンを用いた疎水性クロマ トグラフィー法、 分子篩を用いたゲルろ過法、 ァフィ二 ティークロマトグラフィー法、 クロマトフォーカシング法、 等電点電気泳動等の 電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、 精製標品を得ることがで きる。
また、 該蛋白質が細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、 同様に細胞を回 収した後に破砕し、 遠心分離して得られる沈殿画分より、 通常の方法により該蛋 白質を回収した後、 該蛋白質の不溶体を蛋白質変性剤で可溶化する。 該可溶化液 を、 蛋白質変性剤を含まないか、 または蛋白質変性剤の濃度が蛋白質が変性しな い程度に希薄な溶液に希釈または透析し、 該蛋白質を正常な立体構造に復元させ た後、 上記と同様の単離精製法により精製標品を得ることができる。
本発明の蛋白質あるいはその糖修飾体等の誘導体が細胞外に分泌された場合に は、 培養上清に該蛋白質あるいはその糖鎖付加体等の誘導体を回収することがで きる。 即ち、 該培養物を上記と同様の遠心分離等の手法により処理することによ り可溶性画分を取得し、 該可溶性画分から、 上記と同様の単離精製法を用いるこ とにより、 精製標品を得ることができる。
また、 本発明の蛋白質は、 Fmoc法 （フルォレニルメチルォキシカルボニル法） 、 tBoc法 （ t —ブチルォキシカルボニル法） 等の化学合成法によっても製造する ことができる。また、ぺプチド合成機 [ァドバンスト.ケムテック（Advanced ChemTech ) 社製、 パーキン 'エルマ一社製、 フアルマシア社製、 プロテイン ' テクノロジ 一 · インス ト ウルメ ン ト （Protein Technology Instrument) 社製、 シンセセル -ベガ （Synthecel l- Vega) 社製、 パ一セプティブ （PerSept ive) 社製、 島津製 作所製等] を利用して化学合成することもできる。
精製した本発明の蛋白質の構造解析は、 蛋白質化学で通常用いられる方法、 例 えば遺伝子クローニングのためのタンパク質構造解析 （平野久著、 東京化学同人 発行、 1 9 9 3年） に記載の方法により実施することができる。
本発明の蛋白質は好酸球を活性化させることにより、 好酸球の顆粒中の蛋白や 活性酸素等、 殺細胞活性または殺寄生虫活性を有する種々のメデイエ一ターを好 酸球から遊離させたり好酸球を集積させることができるため、 糸状虫、 住血吸虫 、 肺吸虫、 鉤虫、 繊毛虫、 肺線虫、 顎口虫、 条虫、 蛔虫等による寄生虫感染症、 固形癌等の悪性腫瘍等の治療薬として用いることができる。
本発明の蛋白質を含有する医薬は、 治療薬として該蛋白質単独で投与すること も可能ではある力 ?、 通常は該蛋白質を薬理学的に許容される一つあるいはそれ以 上の担体と一緒に混合し、 製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法に より製造した医薬製剤として提供するのが望ましい。 好ましくは水、 あるいは食 塩、 グリシン、 グルコース、 ヒ トアルブミ ン等の水溶液等の水性担体に溶解した 無菌的な溶液が用いられる。 また、 製剤溶液を生理的条件に近づけるための緩衝 化剤や等張化剤のような、 薬理学的に許容される添加剤、 例えば、 酢酸ナトリウ ム、 塩化ナ ト リ ウム、 乳酸ナ ト リ ウム、 塩化カリウム、 クェン酸ナト リ ウム等を 添加することもできる。 また、 貯蔵のため凍結乾燥し、 使用時に適当な溶媒に溶 解させて用いることもできる。
投与経路は、 治療に際し最も効果的なものを使用するのが望ましく、 通常は非 経口経路、 例えば皮下、 筋肉内、 静脈内、 気道内等の投与経路が用いられる。 本発明の蛋白質を含有する治療薬は、 治療薬として該化合物単独で投与するこ とも可能ではある力'、 通常は薬理学的に許容される一つあるいはそれ以上の担体 と一緒に混合し、 製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造 した医薬製剤として提供するのが望ましい。
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訂正された用紙 （規則 91 ) 投与経路は、 治療に際し最も効果的なものを使用するのが望ましく、 経口投与ま たは、 口腔内、 気道内、 直腸内、 皮下、 筋肉内および静脈内等の非経口投与をあ げることができる。 投与形態としては、 噴霧剤、 カプセル剤、 錠剤、 顆粒剤、 シ ロップ剤、 乳剤、 座剤、 注射剤、 軟膏、 テープ剤等があげられる。
経口投与に適当な製剤としては、 乳剤、 シロップ剤、 カプセル剤、 錠剤、 散剤 、 顆粒剤等があげられる。 例えば乳剤およびシロップ剤のような液体調製物は、 水、 ショ糖、 ソルビトール、 果糖等の糖類、 ポリエチレングリコール、 プロピレ ングリ コール等のグリ コール類、 ごま油、 ォリーブ油、 大豆油などの油類、 p— ヒ ドロキシ安息香酸エステル類等の防腐剤、 ス ト口ベリ一フレーバー、 ペパーミ ン ト等のフレーバー類等を添加剤として用いて製造できる。 カプセル剤、 錠剤、 散剤、 顆粒剤等は、 乳糖、 ブドウ糖、 ショ糖、 マンニトール等の賦形剤、 デンプ ン、 アルギン酸ナト リウム等の崩壊剤、 ステアリ ン酸マグネシウム、 タルク等の 滑沢剤、 ポリ ビニルアルコール、 ヒ ドロキシプロピルセルロース、 ゼラチン等の 結合剤、 脂肪酸エステル等の界面活性剤、 グリセリ ン等の可塑剤等を添加剤とし て用いて製造できる。
非経口投与に適当な製剤としては、 注射剤、 座剤、 噴霧剤等があげられる。 例 えば、 注射剤は、 塩溶液、 ブドウ糖溶液、 あるいは両者の混合物からなる担体等 を用いて調製する。 座剤はカカオ脂、 水素化脂肪またはカルボン酸等の担体を用 いて調製される。 また、 噴霧剤は該化合物そのもの、 ないしは受容者の口腔およ び気道粘膜を刺激せず、 かつ該化合物を微細な粒子として分散させ吸収を容易に させる担体等を用いて調製する。 担体として具体的には乳糖、 グリセリ ン等が例 示される。 該化合物および用いる担体の性質により、 エアロゾル、 ドライバウダ 一等の製剤が可能である。 また、 これらの非経口剤においても経口剤で添加剤と して例示した成分を添加することもできる。
投与量または投与回数は、 目的とする治療効果、 投与方法、 治療期間、 年齢、 体重等により異なる力?、 通常成人 1 日当たり 10 g /kg〜 8 mg/kgである。 本発明の蛋白質と被験試料を、 例えば、 細胞内カルシウム濃度測定法、 ケモタ キシスアツセィ法、 リセプター結合ァッセィ法等の方法により接触させることに より、 本発明の蛋白質が特異的に作用する細胞、 または本発明の蛋白質と特異的 に結合する細胞膜もしくはリセプターを検出または取得することができる。 被験試料としては、 例えば、 本発明の蛋白質が特異的に作用する細胞もしくは 組織、 または本発明の蛋白質と特異的に結合する細胞膜もしくはリセプターがあ げられる。
本発明の蛋白質が特異的に作用する細胞としては、 例えば白血球細胞があげら れる。 白血球細胞としては、 B細胞、 T細胞、 大型顆粒リ ンパ球等のリ ンパ球、 単核性食細胞、 好中球、 好酸球等の食細胞、 好塩基球、 マス ト細胞、 血小板等の 補助細胞等があげられる力'、 好酸球が好適に用いられる。 なお、 本発明において 、 細胞は、 単細胞、 細胞集塊または組織等、 いずれの形態のものであってもよい 。 本発明の蛋白質と特異的に結合する細胞膜もしくはリセプターとしては、 上記 細胞から調製した細胞膜、 または該細胞から単離、 精製したリセプターがあげら れる。
細胞内カルシウム濃度測定法、 ケモタキシスアツセィ法、 リセプター結合アツ セィ法について、 それぞれ以下に説明する。
[細胞内カルシウム濃度測定法]
被験試料、 例えば好酸球に対して f ura- 2等の蛍光カルシウム指示薬を取り込ま せ、 本発明の蛋白質を添加した前後での蛍光を継時的に測定することにより、 細 胞内カルシウム濃度の変化を検出する。 細胞内カルシウム濃度が一過的に上昇す る細胞に本発明の蛋白質が作用すると判定できる。
[ケモタキシスアツセィ法]
ボイデンチャンバーを用いて、 メ ンブランフィルターで仕切られた上のチャン バーに被験試料、 例えば好酸球を入れ、 下のチャンバ一に本発明の蛋白質溶液を 入れ、 適当な時間静置した後、 フィルターを通って下部に移動した細胞を計数す る。 本発明の蛋白質を含まないバッファーを用いた場合と比べて多くの細胞が下 のチャンバ一に移動した場合は、 本発明の蛋白質がこの細胞に対し走化性作用を 示すと判定できる。
[リセプタ一結合ァッセィ法]
本発明の蛋白質の Tyr残基に Bo 1 ton-Hunter試薬を用いて 1251を付加させる等 の方法を用いて、 本発明の蛋白質を放射性同位元素等で標識する。 標識した蛋白 質と細胞から調製した膜画分とを 4 °C〜37でで 20分間〜 24時間混合して反応さ せる。 反応後、 混合物をグラスフィルタ一等でろ過した後に洗浄し、 フィルタ一 上に単離された膜画分の放射能量を測定し、 全結合量とする。 同じ反応系で、 標 識した蛋白質とともに標識していない蛋白質を大過剰量添加した後に膜画分と反 応させて得られる混合物の放射能量を測定し、 非特異的結合量とする。 全結合量 から非特異的結合量を差し引くことにより、 本発明の蛋白質とリセプターとの特 異的な結合量を算出することができる。 この測定系で本発明の蛋白質とリセプタ 一との特異的な結合を示す細胞を、 本発明の蛋白質と特異的に結合するリセプタ —を有する細胞であると判定する。
本発明の蛋白質と上記方法で得られた細胞、 細胞膜またはリセプターを接触さ せた場合と、 本発明の蛋白質と上記方法で得られた細胞、 細胞膜またはリセプタ 一および試験化合物を接触させた場合との比較を行うことにより、 ァゴニストま たはアンタゴニストを検出または取得することができる。
試験化合物としては、 低分子化合物、 ペプチド、 蛋白質、 抗体等があげられる 例えば、 細胞内カルシウム濃度測定法を用いた系では、 試験化合物を添加して カルシウム濃度の上昇を測定し、 本発明の蛋白質と緩衝液のみを添加した場合と 比較してカルシウム濃度の上昇が小さくなる物質をアンタゴニストとして選択す ることができる。
例えば、 リセプター結合アツセィ法を用いた系では、 試験化合物を添加して本 発明の蛋白質と特異的に結合するリセプターとの特異的な結合量を測定し、 添加 しない場合と比較して特異的な結合量が低下する物質をリセプターと結合する物 質として選択する。 この系で本発明の蛋白質の代わりに試験化合物を単独で添加 した場合、 本発明の蛋白質と同様の作用を示すものをァゴニス ト、 拮抗作用を示 すものをアンタゴニストであると判定できる。
本発明のァゴニス トは、 本発明の蛋白質と同様好酸球を活性化させることによ り能力を有するため、 寄生虫感染症または悪性腫瘍等の治療薬として用いること ができる。
本発明のアンタゴニストは、 本発明の蛋白質と拮抗して本発明の蛋白質により 活性化される好酸球の浸潤を抑制することにより、 好酸球の浸潤が関与している 疾患、 例えば、 喘息、 アレルギー性結膜炎、 アレルギー性鼻炎、 アトピー性皮膚 炎、 アレルギー性気管支肺ァスペルギルス症等のアレルギー性炎症疾患、 好酸球 性肺炎または突発性好酸球增多症 （hypereos inophi l ic syndrome) 等の治療薬と して用いることができる。 また、 本発明のアンタゴニストがケモカイン蛋白質の アンタゴニス トである場合は、 自己免疫性溶血性貧血、 原発性胆汁性肝硬変、 漸 進性ェリテマト一デス等の自己免疫不全疾患の治療薬として用いることができる 本発明のァゴニス トまたはアンタゴニストを含有する医薬は、 本発明の蛋白質 に代えて本発明のァゴニストまたはアンタゴニストを用いる以外は、 本発明の蛋 白質を含有する医薬と同様な方法を用いて調製または投与される。
本発明の抗体としては、 本発明の蛋白質に特異的に結合できるものであれば、 ポリクローナル抗体、 モノクローナル抗体等、 いずれのものであってもよレ、。 ポリクローナル抗体は、 抗原を免疫した動物から得られる血清を分離、 精製す ることにより調製することができる。 モノクローナル抗体は、 抗原を免疫した動 物から得られる抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを融合させてハイプリ ドーマを作製 し、 該ハイプリ ドーマを培養する力、、 動物に投与して該動物を腹水癌化させ、 該 培養液または腹水を分離、 精製することにより調製することができる。
抗原は、 各種ヒ ト培養細胞から本発明の蛋白質を分離、 精製するか、 本発明の 組換えベクターを大腸菌、 酵母、 動物細胞、 昆虫細胞等の非ヒ ト宿主に導入して、 蛋白質を発現させて得られる本発明の蛋白質を分離、 精製することにより調製で きる。 また、 抗原は、 本発明の蛋白質の部分配列を有するポリペプチドをァミノ 酸合成機を用いて合成することによっても調製できる。
免疫する方法としては、 抗原をゥサギ、 ャギまたは 3〜 2 0週令のラッ ト、 マ ウスもしくはハムスター等、 非ヒ ト哺乳動物の皮下、 静脈内または腹腔内にその まま投与してもよい力？、 抗原をスカシガイへモシァニン、 キーホールリ ンぺッ ト へモシァニン、 牛血清アルブミ ン、 牛チログロブリ ン等、 抗原性の高いキャリア タンパク質とを結合させて投与したり、フロインドの完全アジュバント（Complete Freund' s Adjuvant) 、 水酸化アルミニウムゲル、 百日咳菌ワクチン等、 適当な アジュバントとともに投与することが好ましい。
抗原の投与は、 1回目の投与の後 1 〜 2週間おきに 3 〜 1 0回行う。 各投与後 3〜 7日目に眼底静脈叢より採血し、 該血清が免疫に用いた抗原と反応するか否 かを酵素免疫測定法 (Ant ibodies - A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Laboratory, 1988) 等に従い、 抗体価を測定することによ り調べる。 免疫に用い た抗原に対し、 その血清が十分な抗体価を示す非ヒ トほ乳動物を、 血清または抗 体産生細胞の供給源とする。
ポリクローナル抗体は、 該血清を分離、 精製することにより調製することがで きる。
モノクローナル抗体は、 該抗体産生細胞と非ヒ トほ乳動物由来の骨髄腫細胞と を融合させてハイプリ ドーマを作製し、 該ハイプリ ドーマを培養するカヽ 動物に 投与して該動物を腹水癌化させ、 該培養液または腹水を分離、 精製することによ り調製することができる。
抗体産生細胞としては、 脾細胞、 リンパ節、 末梢血中の抗体産生細胞、 特に脾 細胞が好適に用いられる。
骨髄腫細胞としては、 8—ァザグァニン耐性マウス （BALB/c由来） 骨髄腫細胞 株であ る P3- X63Ag8-Ul (P3- U1)株 [ Current Topics in Microbiology and Immunology, 18, 1-7 (1978) ] 、P3- NSl/l-Ag41 (NS- 1)株 [European J. Immunology, 6, 511-519 (1976) ] 、SP2/0- Agl4 (SP-2)株 [Nature, 276, 269-270 (1978) ] 、 P3-X63- Ag8653 (653)株 [J . Immunology, 123, 1548-1550 (1979) ]、P3-X63-Ag8 (X63) 株 [Nature, 256, 495-497 (1975) ] 等、 マウス由来の株化細胞が好適に用いら れる。
ハイプリ ドーマ細胞は、 以下の方法により作製できる。
抗体産生細胞と骨髄腫細胞を混合し、 H A T培地 [正常培地にヒポキサンチン、 チミジンおよびアミノプテリンを加えた培地] に懸濁したのち、 7〜 1 4 日間培 養する。 培養後、 培養上清の一部をとり酵素免疫測定法などにより、 抗原に反応 し、 抗原を含まない蛋白質には反応しないものを選択する。 ついで、 限界希釈法 によりクロ一ニングを行い、 酵素免疫測定法により安定して高い抗体価の認めら れたものをモノクロ一ナル抗体産生ハイプリ ドーマ細胞として選択する。
モノクローナル抗体は、 ハイプリ ドーマ細胞を培養して得られる培養液、 また はハイプリ ドーマ細胞を動物の腹腔内に投与して該動物を腹水癌化させて得られ る腹水をから分離、 精製することにより調製できる。
ポリクローナル抗体またはモノクロ一ナル抗体を分離、 精製する方法としては、 遠心分離、 硫安沈殿、 力プリル酸沈殿、 または DEAE—セファロースカラム、 陰ィ オン交換カラム、 プロテイン Aまたは G—カラムあるいはゲル濾過カラム等を用 いるクロマトグラフィー等を、 単独または組み合わせて処理する方法があげられ
Ό
本発明の抗体は本発明の蛋白質と特異的に反応するため、 本発明の蛋白質によ り活性化される好酸球の浸潤を抑制することにより、 好酸球の浸潤が関与してい る疾患、 例えば、 アレルギー性炎症疾患、 好酸球性肺炎または突発性好酸球増多 症等の治療薬として用いることができる。 また、 本発明の抗体がケモカイン蛋白 質と特異的に反応する場合は、 自己免疫不全疾患の治療薬として用いることがで きる。 本発明の抗体を含有する医薬は、 本発明の蛋白質に代えて本発明の抗体を 用いる以外は、 本発明の蛋白質を含有する医薬と同様な方法を用いて調製または 投与される。
本発明の抗体を用いることにより、 本発明の蛋白質を免疫学的に検出または定 量することができる。
免疫学的に検出する方法としては、 マイクロタイタープレートを用いる E L I S A法、 蛍光抗体法、 ウェスタンプロッ ト法、 免疫組織染色法等があげられる。 免疫学的に定量する方法としては、 液相中で本発明の蛋白質と反応する抗体の うちェピトープが異なる 2種類のモノクローナル抗体を用いたサンドィツチ E L I S A法、 1251 等の放射性同位体で標識した本発明の蛋白質と本発明の蛋白質を 認識する抗体を用いるラジオィムノアツセィ法等があげられる。 また、 病理組織 切片を用いた免疫組織染色にも利用できる。
本発明の抗体を用い、 健常者および被験者の細胞または組織に存在する本発明 の蛋白質を免疫学的に検出または定量し、 その量を健常者と被験者とで比較し、 発現量が上昇しているかどうかを調べることにより、 被験者がァレルギー性炎症 疾患、 好酸球性肺炎、 突発性好酸球増多症または自己免疫疾患に罹病しているか 否かを診断することができる。 また、 本発明の抗体はアレルギー性炎症、 好酸球 性肺炎、 突発性好酸球増多症または自己免疫疾患の診断薬として用いることがで きる。
本発明の D N Aのセンス D N Aおよびアンチセンス D N Aは、 そのまま、 また はそれぞれその塩基配列の一部を含むオリゴヌクレオチドとして、 ノ一ザンブロ ッ トノヽィブリダイゼーション、サザンブロッ トノヽィブリダイゼ一シヨン、 i n s i t uハイブリダィゼーシヨン等のプローブ、 または P C R、 R T— P C R等の プライマーとして用いることができる。
29
訂正された用紙 （規則 91) 本発明の塩基配列の一部の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとしては、 本 発明の DNA、 例えば配列番号 1 2で示される塩基配列を有する DN Aのうち、 連続した 5〜100残基、 好ましくは 10〜50残基の塩基配列を有するォリゴヌクレ ォチドをあげることができる。
オリゴヌクレオチドとしては、 DNA、 RNAまたはその誘導体たとえばメチ ル体ゃフォスフォロチォェ一ト体があげられる。
本発明の D NAのセンス DNA、 アンチセンス DNAまたはこれら DN Aの塩 基配列の一部を含むオリゴヌクレオチドを用いて、 ノ一ザンブロッ トハイブリダ ィゼ一ション法、 R T— P C R法等を用いることにより、 本発明の蛋白質をコー ドする mRNAの検出およぴ定量をすることができる。
本発明の DNAの塩基配列の一部を含むオリゴヌクレオチドを用いてケモカイ ン蛋白質の mRNAを検出する方法としては、 ノーザンハイプリダイゼ一ション 法 [Molecular Cloning, A laboratory manual Second edition, し old spring Harbor Laboratory Press (1989) ] , P C R法 [PCR プロトコールズ（PCR Protocols), ァカデミック · プレス (Academic Press) (1990)] 、 RT (Reverse Transcription )- P C R法 [PCR プロトコ一ルズ（PCRProtocols)，ァカデミック 'プレス（Academic Press) (1990)] などがあげられる。 RT— P C R法は、 組織や細胞から単離し た RNAを、 オリゴ（dT)プライマ一と逆転写酵素を用いて c DNAに変換した後、 検出したい mRNAに対応する一組のオリゴヌクレオチドをプライマ一を用いて PCR反応を行い、 増幅断片を検出する方法であり、 ノーザンハイブリダィゼ一 シヨ ン法より も簡便であるため、 疾患の診断等に適した方法である。
ォリゴヌクレオチドプライマ一としては、 検出したい mRNAの一部の塩基配 列において、 5， 末端側の塩基配列に相当するセンスプライマーおよび 3， 末端 側の塩基配列に相当するアンチセンスプライマーがあげられる。 ただし、 mRN Aにおいてゥラシルに相当する塩基は、 ォリゴヌクレオチドプライマ一において チミジンとなる。
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訂正された用紙 （規則 91) センスプライマーおよびアンチセンスプライマ一としては、 両者の融解温度 （
T m )および塩基数が極端に変わることのないオリゴヌクレオチドを用いるのが 好ましい。 塩基数としては、 5〜100塩基、 特に 10〜50塩基であることが好まし い o
ォリゴヌクレオチドプライマ一を用いて増幅させる塩基配列部分としては、 m RN Aのいかなる塩基配列領域でもよいが、 塩基配列の長さが 50bpから 2kbpで あり、 反復配列あるいは GC (グァニン ' シトシン） 塩基に富む配列を含まぬ塩 基配列領域が好ましい。
また、 本発明のアンチセンス DN A [化学 ， 681 (1991) 、 バイオテクノロ ジ一（Biotechnology) 9, 358 (1992) ] を用いて、 D N Aの転写もしくは m R N Aの翻訳を抑制することにより自己免疫疾患の治療に利用することもできる。 アンチセンス DN A技術を用いたケモカイン蛋白質の生産の抑制は、 本発明の 該蛋白質をコ一ドする DNAの一部の塩基配列、 好ましくは翻訳開始領域にある 10〜50塩基の塩基配列を基にしてオリゴヌクレオチドを設計 ·調製し、 生体内に 投与するにことによ り行うことができる。 合成オリ ゴヌクレオチドの塩基配列と しては、 本発明の DNAのアンチセンス鎖の塩基配列の一部と一致するもの、 あ るいは該蛋白質の活性発現を抑制する活性を失わない範囲内で改変したものを利 用できる。
本発明の DNAのセンス DNA、 アンチセンス DNAまたはこれらの塩基配列 の一部を含むオリゴヌクレオチドを用いて、 健常者および被験者の細胞または組 織中で発現している本発明の蛋白質をコ一ドする mRNAをノーザンハイプリダ ィゼーシヨ ン法、 P C R法等により検出または定量し、 その量を健常者と被験者 とで比較し、 発現量が上昇しているかどうかを調べることにより、 被験者がァレ ルギ—性炎症、 好酸球性肺炎、 突発性好酸球増多症、 自己免疫疾患、 悪性腫瘍ま たは寄生虫感染症に罹病しているか否かを診断することができる。 また、 本発明 の DNAのセンス DNA、 アンチセンス DNAまたはこれらの塩基配列の一部を 含むオリゴヌクレオチドは、 アレルギー性炎症、 好酸球性肺炎、 突発性好酸球増 多症、 自己免疫疾患、 悪性腫瘍または寄生虫感染症の診断薬として用いることが できる。 さらに、 本発明の DN Aのセンス DN Aまたはアンチセンス DN Aの塩 基配列の一部を含むオリゴヌクレオチドは、 遺伝子研究用試薬としても有用であ る。
本発明の DNAのアンチセンス DNAおよびその塩基配列の一部を含むオリゴ ヌクレオチドは本発明の DN Aの転写もしくは mRNAの翻訳を抑制することが できる。 このため、 本発明の蛋白質により活性化される好酸球の浸潤を抑制する ことによ り、 好酸球の浸潤が関与している疾患、 例えば、 アレルギー性炎症疾患、 好酸球性肺炎または突発性好酸球增多症、 自己免疫疾患の治療薬として用いるこ とができる。 本発明の DN Aのアンチセンス DNAおよびその塩基配列の一部を 含むォリゴヌクレオチドを含有する医薬は、 本発明の蛋白質に代えて本発明の D NAのアンチセンス DNAおよびその塩基配列の一部を含むオリゴヌクレオチド を用いる以外は、 本発明の蛋白質を含有する医薬と同様な方法を用いて調製また は投与される。
本発明の DNAのセンス DNA、 アンチセンス DNAまたはこれらの塩基配列 の一部を含むオリゴヌクレオチドは一本鎖または二本鎖としてレトロウイルス、 アデノゥィルス等のウイルスべクタ一、 その他のべクターに組み込んで遺伝子治 療用ベクターとし、 遺伝子治療に用いることができる。 図面の簡単な説明
第 1図は、 プラスミ ド pHVC002の構造を示した図である。
(図中の略号）
fl(-) ： flファージの複製開始点
SVpA ： シミアンウィルス（simian virus)40(SV40)の初期遺伝子のポリ
A付加シグナル SV3 ' sp ： SV40の初期遺伝子の 3 'スプライシングシグナル lacZ ：大腸菌の /9ガラク トシダ一ゼ遺伝子
T7 ： T7ファージ R N Aポリメラ一ゼで認識される T7プロモータ一 con5 ' sp ： コンセンサスな 5 'スプライシングシグナル
HVC002 ： HVC002 c D N A
T3 ： Τ3ファージ R N Aポリメラ一ゼで認識される T3プロモータ一
Plac ：大腸菌のラク トース遺伝子のプロモータ一
Pcmv ： サイ トメガ'ロウィ レス (cytomegalovi rus)の最初期 (immediate early)遺伝子のプロモータ一
ColEl ori ：大腸菌の Col El因子の複製開始点
TKpA ： 単糸屯へノレぺスウイ ノレス (herpes s im l ex vi rus)のナ ン ノヤナ
一ゼ遺伝子のポリ A付加シグナル
Neo/Kan ： ネオマイシン、 カナマイシン耐性遺伝子
SV40 ori ： SV40の複製開始点
kb ： キロ塩基対 (ki lobase pairs)
Notl ：制限酵素 Not I認識部位
EcoRI ：制限酵素 EcoR I認識部位
第 2図は、 HVC002蛋白質と他のヒ ト CCケモカインの、 シグナルべプチドを除 いた成熟蛋白質のアミノ酸配列の比較を示す図である。 HVC002と比較した CCケ モカインは MIP- 1 a、 MIP-1 β、 RANTES、 MCP- 2、 MCP- 3、 MCP- 4、 eotaxin, eotaxin-2 である。 HVC002蛋白質と同一のァミノ酸を白黒反転させて示した。右端に HVC002 蛋白質とのアミノ酸配列での相同性を％で示す。
第 3図は、大腸菌で発現させたチォレドキシン一 HVC002融合蛋白質に対しマウ ス抗血清およびモノクロ一ナル抗体 KM1885を用いて行ったゥヱスタンブロッテ ィングの結果を示す図である。
(図中の略号） AB ： アミ ドブラック染色
NS ： マウス正常血清を用いたゥエスタンブロッティング
AS ： マウス抗血清を用いたゥエスタンブロッティング
KM1885： モノクローナル抗体 KM1885を用いたウェスタンブロッテイング
1 ：分子量マーカー
2 ：大腸菌夾雑蛋白質 （pET32a(+)を含む大腸菌 AD494(DE3)pLysSの超音波 破砕上清） 5 g
3 ：粗精製チォレドキシン- HVC002融合蛋白質 1 μ g
矢印 ：チォレドキシン- HVC002融合蛋白質の位置を示す。
第 4図は、 昆虫細胞で発現後、 精製した HVC002蛋白質の 15%SDS- PAGEの結果 を示す図である。 右に 0.5ngの精製 HVC002蛋白質、 左に分子量マ一カーを電気 泳動後、 銀染色した。 矢印は HVC002蛋白質の位置を示す。
第 5図は、 ヒ ト末梢好酸球および 0.5mM酪酸処理により好酸球様細胞に分化 させた HL- 60 (clonel5) に対する HVC002蛋白質のカルシウム動員アツセィの結 果を示す図である。 （A) がヒ ト末梢好酸球、 （B) が HL-60 (clonel5) を用い た結果で、 横軸は時間、 縦軸は比蛍光強度 （340nmで励起したときの蛍光強度 Z 380nm励起したときの蛍光強度） を示す。 比蛍光強度は細胞内カルシウム濃度に 比例する。 矢印はそれぞれ HVC002蛋白質あるいは緩衝液を添加した時点を示す。
発明を実施するための最良の形態
実施例 1 新規遺伝子 （HVC002) の c DNA断片のクローン化
( 1 ) HUVECからの全 RN Aの取得
HUVEC (臍帯静脈血管内皮細胞、 クラボウ社製） は、 へパリンナトリウム、 内 皮細胞成長培養助剤 （Endothelial cell growth supplement) (べク トン—ディ キンソン社製） 、 10%ゥシ胎児血清 （バイオテック . インターナショナル社製） 、 1 %ペニシリ ン （5,000units Zml) 'ス ト レプトマイシン （5mgZml) 溶液 (ギブコ BRL社製） および 0.15%NaHC03 (シグマ社製） を含む F-12K培地 （大日本 製薬社製） を用い、 5%C02、 37での条件下で培養した。 5 X106個の細胞を含 む培地中に 100単位 Zmlヒ ト I L— 4 (ザィモジヱン社製） を添加し、 17時間培 養した後に細胞 （以下、 I L— 4で刺激した HUVECという） を回収した。 5 X106 個の細胞を含む培地中に lOmgZmlヒ ト TNF—《 (ザィモジヱン社製） を添加し 、 17時間培養した後に細胞 （以下、 TNF— "で刺激した HUVECという） を回収 した。 また、 5 X106個の細胞を含む培地中に何も添加せずに、 17時間培養した後 に細胞 （以下、 未刺激の HUVECという） を回収した。
回収した細胞を PBSで洗浄後、 AGPC法 [実験医学 _£、 1937、 (1991)] で全 R NAを取得した。 すなわち D溶液 （4Mグァニジニゥムチオシァネート、 25mMク ェン酸ナト リウム、 0.5% n—ラウリルサルコシン、 0.1M 2—メルカプトエタ ノール） 5mlを回収した細胞に添加して、 細胞を溶解させた後、 0.7mlの 2 M酢 酸ナトリウム （pH4.0) を添加した。 7 mlの水飽和フエノール、 1.4mlのクロロホ ルム一イソアミルアルコール （49:1) を添加して激しく振とう し、 氷上で 15分間 静置した後 4でで ΙΟ,ΟΟΟΧ g、 20分間遠心分離した。 水層に 5.6mlのイソプロパ ノールを加えて混合し、 - 20でで 1時間静置した後、 41Cで 10，000X g、 20分間 遠心分離し RNAを沈殿させた。 上清を除き、 沈殿物に 0.5mlの D溶液を加えて RN Aを溶解させた後、 0.5mlのィソプロパノールを加えて- 20でで 1時間静置し て、 4 °Cで 10，000X g、 10分間遠心分離し RNAを沈殿させた。 上清を除き、 沈 殿物を 75%エタノールで洗浄した後減圧下で乾燥させた。 沈殿物を 300 1の蒸留 水に溶解させ、 300 1の 4M LiClを加えてよく混合し、 氷上で 1時間静置した 後、 4でで 15,000X g、 10分間遠心分離し RNAを沈殿させた。 上清を除き、 沈 殿物を 75%エタノールで洗浄した後乾燥させ、 蒸留水 22 1に溶解させた。 I L ― 4で刺激した HUVECから 36 g、 T N F— "で刺激した HUVECから 64 g、 未刺激 の HUVECから の全 RNAが得られた。 ( 2 ) HUVECの全 R N Aを用いた蛍光デフエレンシアル ' ディスプレイ
I L— 4で刺激した HUVE T N F—ひで刺激した HUVECおよび未刺激の HUVEC の全 RNA について、 それぞれの全 RN八2.5 £に蒸留水を全体が 9 1になる ように添加し、 5'端をフルォレセインイソチオシァネート （以下、 FITCと称す ) で蛍光標識したアンカ一プライマ一 FAH (塩基配列は配列番号 4に示す：サヮ ディ一社製 50 M) 1 1を加えて 70°Cで 5分間加熱後、 すぐ水冷した。 反応液 に 5 X逆転写酵素反応用緩衝液 [250mM Tris-HCl (pH8.3) 、 275mM KCU 15m M gCl2] 4 1、 lOOmMジチオスレィ トール （DTT) 2 1、 10mM dNTP (dATP、 dGTP 、 （ΓΓΤΡおよび dCTP) 1 μ 1、 蒸留水 1 μ 1、 逆転写酵素 SUPERSCRIPT^ II RNAse
H— Reverse Transcriptase (ライフ ' テクノロジーズ社製） 1 1 (200単位） を添加して混合し、 室温で 10分間静置後、 42でで 50分間反応させて c DN Aを合 成し、 90 5分間加熱して反応を停止させた。 該反応液に TE緩衝液 [10mM Tris- HCl (pH8.0) 、 lmMエチレンジァミ ン四酢酸ニナト リ ウム （EDTA) (ρΗδ.Ο) ] 4 0 1を添加して、 c DNA溶液とした。
c DNA溶液l / lに、 蒸留水 14.7 l、 10X P C R用緩衝液 [lOOmM Tris-HCl
(pH8.8) 、 500mM KCU 15mM MgCl2、 1 %トライ ト ン X—100] 2 ^ K 2.5m dN TP 0.8 1、 蛍光標識アンカ一プライマ一 FAH 0.3 1、 任意プライマ一 0PC -10 (5'- TGTCTGGGTG - 3' ： オペロン社製 10/ M) 1 μ K DN Αポリメラーゼ Gen e Taq (二ツボンジーン社製、 5単位/ 1) 0.2 1を添加した後、 サ一マルサイ クラ一を用いて、 94 で 3分間、 40Gで 5分間、 72でで 5分間反応させた後、 95 °Cで 15秒間、 40°Cで 2分間、 72°Cで 1分間からなる工程を 1サイクルとして 27サ ィクル反応を行い、 最後に 72°Cで 5分間反応させて DN A断片を増幅させた。 反応終了後、 反応液 4 1に電気泳動サンプル用溶液 （95%ホルムアミ ド、 0.1 %キシレンシァノール、 0.1%ブロムフエノールブル一） 3 1を添加し、 95Cで 2分間加熱後すぐ氷冷し、 6 %アクリルアミ ドゲルで電気泳動を行った。 電気泳 動用緩衝液と しては 89mMト リス （ヒ ドロキシメチル） ァミノメ タン、 89mMホゥ酸 、 2mM EDTAを用いた。 フルォロイメージャー （モレキュラー ' ダイナミ ックス 社製） を用いて電気泳動した後にゲルの蛍光を測定し、 各反応液のバン ドパ夕一 ンを比較した。 その結果、 未刺激の HUVECおよび TN F— «で刺激した HUVECの c
DN Aをそれぞれ増幅したものには見られず、 I L一 4で刺激した HUVECを増幅 したものだけに見られる約 300bpのバン ドの部分をゲルから切りだした。
切り出したゲルの約 1/4に蒸留水 38 し 10X P C R用緩衝液 5 1、 2.5mM dN
TP 4 1、 アンカ一プライマー NA (塩基配列は配列番号 4に示す。 蛍光標識なし
：サヮディ一社製 0.6// 1、 ΙΟ^Μ 任意プライマ— 0PC-10 2 μ \, DN A ポリメラ一ゼ Gene Taq 0.5 1を添加し、 94でで 3分間加熱後、 95でで 15秒間、 4
0°Cで 2分間、 72 で 1分間からなる工程を 1サイクルとして 30サイクル反応を 行い、 最後に 72でで 5分間反応させて DN A断片を再増幅させた。 反応終了後、 反応液をフエノール一クロ口ホルム （ 1 ： 1 ) 抽出し、 さらにクロ口ホルム一ィ ソァミルアルコール （24 : 1 ) 抽出後、 エタノール沈殿をした。 沈殿物を溶解さ せた後、 1.5%低融点ァガロースゲル [シ一プラーク GTG (SEA PLAQUE GTG) ； F
MC バイオプロダクツ社製] で電気泳動してェチジゥムブ口マイ ド染色をし、 増 幅した DN A断片を切り出した。 DN A断片を 65でで 15分間加熱してァガロース を融解させ、 フエノールークロロホルム抽出し、 さらにクロ口ホルム一イソアミ ルアルコール抽出後エタノール沈殿をし、 TE緩衝液 10 1に溶解させた。
DN A断片溶液 1 1と P C R断片クロ一ニング用ベクタ一 pT7Blue T - Vector
(ノバジェン社製） 1 1とを混合し、 DN Aライゲーシヨンキッ ト ver. l (宝 酒造社製） を用いて、 キッ トの指示に従い、 プラスミ ドに DNA断片を組み込ん だ。 大腸菌 DH5« (ライフ ' テクノロジ一ズ社製） を形質転換し、 アンピシリ ン 耐性株を得た。 該形質転換株から公知の方法に従ってプラスミ ド DNAを単離し た。 該プラスミ ド 0.3ngを蒸留水 19 1に溶解させ、 10X P C R法用緩衝液 2.5〃
1、 2.5mM dNTP 2 1、 34 M アンカープライマー NA 0.3 し 任意プライ マー OPC-10 1 μ K DNAポリメラ一ゼ Gene Taq 0.5 1を添加し、 DNA断片 を再増幅と同じ条件で再増幅させたところ約 300bpの断片が増幅されたことから

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 配列番号 1 3で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質、 または該アミ ノ酸配列において 1以上のァミノ酸が欠失、 置換もしくは付加されたアミノ酸配 列からなりかつ好酸球を活性化する能力を有する蛋白質。
2 . 配列番号 2で示されるアミノ酸配列からなる請求の範囲 1記載の蛋白 質。
3 . 配列番号 1 3で示されるアミノ酸配列と 6 0 %以上の相同性を有する ァミノ酸配列を含んでなる請求の範囲 1記載の蛋白質。
4 . 請求の範囲 1 〜 3のいずれか記載のケモカイン蛋白質。
5 . 請求の範囲 1 〜 4のいずれか記載の蛋白質をコ一ドする D N A。
6 . 配列番号 1、 1 2または 1 4で示される塩基配列からなる請求の範囲 5記載の D N A。
7 . 請求の範囲 5または 6記載の D N Aとストリンジヱントな条件下でハ ィブリダィズし、 かつ好酸球を活性化する能力を有する蛋白質をコードする D N A。
8 . 請求の範囲 5〜 7のいずれか記載の D N Aを含有してなる組換えべク ター。
9 . 請求の範囲 8記載の組換えベクターを宿主細胞に導入して得られる形 質転換体。
1 0 . 請求の範囲 9記載の形質転換体を培地に培養し、 培養物中に請求の範 囲 1 〜 4のいずれか記載の蛋白質を生成蓄積させ、 該培養物から該蛋白質を採取 することを特徴とする蛋白質の製造方法。
1 1 . 請求の範囲 1 〜 4のいずれか記載の蛋白質を含有する医薬。
1 2 . 請求の範囲 1 〜 4のいずれか記載の蛋白質を含有する悪性腫瘍または 寄生虫感染症の治療薬。
71
1 3 . 請求の範囲 1 〜 4のいずれかに記載の蛋白質の有効量を投与すること からなる悪性腫瘍または寄生虫感染症の治療方法。
1 4 . 請求の範囲 1〜 4のいずれか記載の蛋白質と被験試料とを接触させる ことを特徴とする、 請求の範囲 1 〜 4のいずれか記載の蛋白質が特異的に作用す る細胞を検出する方法。
1 5 . 被験試料が細胞または細胞膜である請求の範囲 1 4記載の方法。
1 6 . 蛋白質と細胞とを接触させた後、 細胞内のカルシウムの濃度の変化を 検出する請求の範囲 1 5記載の方法。
1 7 . 請求の範囲 4記載の蛋白質の白血球細胞に対する走化性を検出するこ とを特徴とする、 請求の範囲 4記載のケモカイン蛋白質が特異的に作用する細胞 を検出する方法。
1 8 . 請求の範囲 1 〜 4のいずれか記載の蛋白質と被験試料とを接触させる ことを特徴とする、 請求の範囲 1 〜 4のいずれか記載の蛋白質と特異的に作用す る細胞を取得する方法。
1 9 . 被験試料が細胞または細胞膜である請求の範囲 1 8記載の方法。
2 0 . 蛋白質と細胞とを接触させた後、 細胞内のカルシウムの濃度の変化を 検出する請求の範囲 1 8記載の方法。
2 1 . 請求の範囲 4記載の蛋白質の白血球細胞に対する走化性を検出するこ とを特徴とする、 請求の範囲 4記載のケモカイン蛋白質が特異的に作用する細胞 を取得する方法。
2 2 . 請求の範囲 1 8〜 2 1のいずれか記載の方法により得られる細胞。 2 3 . 請求の範囲 1 〜 4のいずれか記載の蛋白質と被験試料とを接触させる ことを特徴とする、 請求の範囲 1 〜 4のいずれか記載の蛋白質が特異的に結合す る細胞膜またはリセプターを取得する方法。
2 4 . 被験試料が細胞、 細胞膜またはリセプターである請求の範囲 2 3記載の 方法。
72
訂正された用紙 （規則 91)
2 5 . 蛋白質と細胞とを接触させ、 細胞内のカルシウムの濃度の変化を検出 した後、 変化が検出された細胞から細胞膜またはリセプターを単離する請求の範 囲 2 4記載の方法。
2 6 . 請求の範囲 4記載の蛋白質の白血球細胞に対する走化性が検出された 細胞から細胞膜またはリセプターを単離することを特徴とする、 請求の範囲 4記 載のケモカイン蛋白質が特異的に結合する細胞膜またはリセプターを取得する方 法。
2 7 . 細胞が好酸球細胞である請求の範囲 2 3〜 2 6のいずれか記載の方法 c 2 8 . 請求の範囲 2 3 〜 2 7のいずれか記載の方法により得られる細胞膜ま たはリセプター。
2 9 . ( a ) 請求の範囲 1 〜 4のいずれか記載の蛋白質と請求の範囲 2 2記 載の細胞を接触させた場合と （b ) 請求の範囲 1 〜 4のいずれか記載の蛋白質と 請求の範囲 2 2記載の細胞および試験化合物を接触させた場合との比較を行うこ とを特徴とする、 請求の範囲 1 〜 4のいずれか記載の蛋白質のァゴニス トまたは アンタゴニス トを取得する方法。
3 0 . ( a ) 請求の範囲 1 〜 4のいずれか記載の蛋白質と請求の範囲 2 8記 載のの細胞膜またはリセプターを接触させた場合と （b ) 請求の範囲 1 〜 4のい ずれか記載の蛋白質と請求の範囲 2 8記載の細胞膜またはリセプターおよび試験 化合物を接触させた場合との比較を行うことを特徴とする、 請求の範囲 1 〜 4の いずれか記載の蛋白質のァゴニストまたはアンタゴニス トを取得する方法。
3 1 . 請求の範囲 2 9または 3 0記載の方法により得られるァゴニストまた はアンタゴニス ト。
3 2 . 請求の範囲 1 〜 4のいずれかに記載の蛋白質と特異的に反応する抗体 c 3 3 . 請求の範囲 1 〜 4のいずれかに記載の蛋白質と特異的に反応するポリ クロ一ナル抗体。
3 4 . 請求の範囲 1 〜 4のいずれかに記載の蛋白質と特異的に反応するモノ
73
汀正された用紙 （規則 91 ) クローナル抗体。
3 5 . 配列番号 9で示されるアミノ酸配列をェピトープとして認識する請求 の範囲 3 4記載のモノクロ一ナル抗体。
3 6 . ハイプリ ドーマ KM1885 (FERM BP-6177) が生産する請求の範囲 3 5記 載のモノクローナル抗体 KM1885。
3 7 . 請求の範囲 3 6記載のモノクローナル抗体を生産するハイプリ ドーマ
3 8 . 請求の範囲 3 2〜 3 6のいずれか記載の抗体を用いて請求の範囲 1 〜 4のいずれか記載の蛋白質を免疫学的に検出する方法。
3 9 . 請求の範囲 3 2〜 3 6のいずれか記載の抗体を用いることを特徴とす る、 アレルギー性炎症、 好酸球性肺炎、 突発性好酸球増多症または自己免疫疾患 の診断方法。
4 0 . 請求の範囲 3 2〜 3 6のいずれか記載の抗体を含有するアレルギー性 炎症、 好酸球性肺炎、 突発性好酸球増多症または自己免疫疾患の診断薬。
4 1 . 請求の範囲 3 2〜 3 6のいずれか記載の抗体を含有する医薬。
4 2 . 請求の範囲 3 2〜 3 6のいずれか記載の抗体を含有するアレルギー性 炎症、 好酸球性肺炎、 突発性好酸球増多症または自己免疫疾患の治療薬。
4 3 . 請求の範囲 3 2〜 3 6のいずれか記載の抗体の有効量を投与すること からなるアレルギー性炎症、 好酸球性肺炎、 突発性好酸球增多症または自己免疫 疾患の治療方法。
4 4 . 請求の範囲 5または 6記載のセンス D N A。
4 5 請求の範囲 5または 6記載のアンチセンス D N A。
4 6 請求の範囲 4 4記載の D N Aの塩基配列の一部を含むオリゴヌクレオ チド。
4 7 請求の範囲 4 5記載の D N Aの塩基配列の一部を含むオリゴヌクレオ チド。
74
訂正された用紙 （規則 91 )
4 8 . 請求の範囲 4 4 もしくは 4 5記載の D N Aまたは請求の範囲 4 6 もし くは 4 7記載のオリゴヌクレオチドを用いることを特徴とする、 請求の範囲 1 〜 4のいずれか記載の蛋白質をコードする m R N Aを検出する方法。
4 9 . 請求の範囲 4 4 もしくは 4 5記載の D N Aまたは請求の範囲 4 6 もし くは 4 7記載のオリゴヌクレオチドを用いることを特徴とする、 アレルギー性炎 症、 好酸球性肺炎、 突発性好酸球增多症、 自己免疫疾患、 悪性腫瘍または寄生虫 感染症の診断する方法。
5 0 . 請求の範囲 4 4 もしくは 4 5記載の D N Aまたは請求の範囲 4 6 もし くは 4 7記載のオリゴヌクレオチドを含有するアレルギー性炎症、 好酸球性肺炎、 突発性好酸球増多症、 自己免疫疾患、 悪性腫瘍または寄生虫感染症の診断薬。
5 1 . 請求の範囲 4 5記載の D N Aまたは請求の範囲 4 7記載のオリゴヌク レオチドを用いて請求の範囲 1 〜 4のいずれか記載の蛋白質の発現を抑制する方 法。
5 2 . 請求の範囲 4 5記載の D N Aまたは請求の範囲 4 7記載のオリゴヌク レオチドを含有する医薬。
5 3 . 請求の範囲 4 5記載の D N Aまたは請求の範囲 4 7記載のオリゴヌク レオチドを含有するアレルギー性炎症、 好酸球性肺炎、 突発性好酸球増多症また は自己免疫疾患の治療薬。
5 4 . 請求の範囲 4 5記載の D N Aまたは請求の範囲 4 7記載のオリゴヌク レオチドの有効量を投与することからなるアレルギー性炎症、 好酸球性肺炎、 突 発性好酸球増多症または自己免疫疾患の治療方法。
5 5 . 請求の範囲 4 4 もしくは 4 5記載の D N Aまたは請求の範囲 4 6もし くは 4 7記載のオリゴヌク レオチドを含有するアレルギー性炎症、 好酸球性肺炎、 突発性好酸球増多症、 自己免疫疾患、 悪性腫瘍または寄生虫感染症の遺伝子治療 用べクタ一。
5 6 . 請求の範囲 5 5記載の遺伝子治療用べクタ一を用いることを特徴する
75 アレルギー性炎症、 好酸球性肺炎、 突発性好酸球増多症、 自己免疫疾患、 悪性腫 瘍または寄生虫感染症の治療方法。
5 7 . I L _ 4で刺激したヒ ト血管内皮細胞よ り、 ディ ファレンシャル . デ イスプレイ法を用いてケモカイン蛋白質をコードする D N Aを取得する方法。
5 8 . ケモカイン蛋白質が請求の範囲 4記載の蛋白質である請求の範囲 5 7 記載の方法。
76
訂正された用紙 （規則 91) 図 1
Figure imgf000079_0001
1Z5 9/3
Figure imgf000080_0001
eaotxi2nl
eaotxin
MCP4-
MCP3
MCP2
REANTS
Figure imgf000080_0002
ム 0/厶 6df/I J Lmz OAV
Figure imgf000081_0001
Figure imgf000082_0001
図 5
(A)好酸球 (B) HL60(clone 15)細胞
Figure imgf000083_0001
个 个 个 002 緩衝液 0.2 μΜ HVC002 緩衝液
5/5 出願人又は代理人の書類記号 国際出願番号
1027 PGT/ JP 07/04470 寄託された微生物に関する表示
〔PCT規則 13の 2〕
A. 以下に示される表示は、 明細書中に言及されている微生物に関するものである
^ 百、 I 行
B. 寄託の表示 他の寄託が別紙に記載されている I ~ ] 寄託機関の名称
通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所 寄託機関のあて名 （郵便番号及び国名を含む） 日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番 3号 （郵便番号 305) 寄託の日付 受託番号
20. 1 1. 97 FERM B P - 6 177
C. 追加の表示 （該当しない場合には記載しない） .の情報は別紙に続いている ョ一ロッパ特許が求められているそれぞれの指定国については、寄託微生物の標本の分譲は欧州特許 を付与する旨の告示が公表されるまで、又は欧州特許出願が拒絶され、取下げられ若しくは取下げら れたとみなされる日まで標本の請求人により指名された専門家に分譲することによつてのみ可能であ る （Rule 28 (4) EPC )„
D. この表示を行うための指定国 （すべての指定国のために行わない場合）
E. 追加事項の表示の提出 （該当しない場合には記載しない）
下記の表示は後に国際事務局に届け出る予定である。 （例えば 「受託番号」 のように表示事項を明記する）
Figure imgf000084_0001
出願人又は代理人の書類記号
1027 国際出願番号 PGT/JP97/G4470 寄託された微生物に関する表示
〔？〇丁規則13の 2〕
A. 以下に示される表示は、 明細書中に言及されている微生物に関するものである。
4 4 百、 1 6
B. 寄託の表示 他の寄託が別紙に記載されている 寄託機関の名称
通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所 寄託機関のあて名 （郵便番号及び国名を含む） 日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番 3号 （郵便番号 305) 寄託の曰付 受託番号
17. 07. 96 FERM B P- 5585
C. 追加の表示 （該当しない場合には記載しない） この情報は別紙に続いている ヨーロッパ特許が求められているそれぞれの指定国については、寄託微生物の標本の分讓は欧州特許 を付与する旨の告示が公表されるまで、又は欧州特許出願が拒絶され、取下げられ若しくは取下げら れたとみなされる日まで標本の請求人により指名された専門家に分譲することによってのみ可能であ る （Rule 28 (4) EPC )。
D. この表示を行うための指定国 （すべての指定国のために行わない場合）
E. 追加事項の表示の提出 （該当しない場合には記載しない）
下記の表示は後に国際事務局に届け出る予定である。 （例えば「受託番号」 のように表示事項を明記する）
Figure imgf000085_0001
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