WO1998017808A1

WO1998017808A1 - Acide nucleique codant une proteine kinase du type recepteur

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Publication number: WO1998017808A1
Application number: PCT/JP1997/003667
Authority: WO
Inventors: Shohei Yokota
Original assignee: Takara Shuzo Co., Ltd.
Priority date: 1996-10-18
Filing date: 1997-10-13
Publication date: 1998-04-30
Also published as: JP3607704B2; EP0959132A2; EP0959132A4; EP0959132B1; DE69736564D1; ES2270469T3; PT959132E; ATE337402T1; DK0959132T3; AU4472497A; DE69736564T2; DE69736564C5

Description

明細書レセプター型プロティンキナーゼをコ一ドする核酸技術分野

本発明は、膜近傍部位の塩基配列に縦列重複を有する、レセプター型プロティンキナーゼをコードする核酸、ポリペプチド、該核酸の検出方法及び検出キットなどに関する。背景技術

細胞の増殖や分化、さらに種々の刺激に対する細胞側の応答は、種々の増殖因子によって厳密に制御されている。これらの増殖因子は該増殖因子に特異的なレセプターを介して作用することが知られている（Nicola, N. A. Annu. Rev. Biochem. 58, 45, 1989 ; Lowenberg, B. Blood 81, 281, 1991) 。それらのレセプターの中で、チロシンキナーゼドメインを含むレセプタ一は、レセプター型チロシンキナーゼ ( R T K s ) として分類される。

R T K sは、細胞膜外領域、細胞膜貫通領域、並びに、チロシンキナーゼドメイン及び細胞膜貫通領域とチロシンキナーゼドメイン間に存在する膜近傍部位を含む細胞膜内領域よりなり、更に構造上の特徴、アミノ酸配列の相同性から 4つの型に大別される。

I型レセプターは単量体の構造を有し、細胞膜外領域にはシスティンに富んだ繰り返し配列が 2 力所あり、 EGF レセプター、 HER2/neu等が例示される。

I I型レセプ夕一は S-S 結合によって結ばれた、 8各 2個のサブュニットからなる構造で、ひ鎖がシスティンに富んだ繰り返し配列を 1つ含む細胞膜外領域であり、 ^鎖に細胞膜貫通領域、膜近傍部位、チロシンキナーゼドメインを有する。インスリンレセプター、 IGF- 1 レセプター等が例示される。 III 型レセプターは、細胞膜外領域にィムノグロブリン様のシスティンに富んだ配列を 5個含み、細胞膜内領域にキナーゼィンサートで隔てられた 2個のチロシンキナーゼドメインを含む単量体構造を有する。 PDGFレセプ夕一、 f ms (CSF- 1 レセプター）、 k i t (SLFレセプ夕一）等が例示される。

IV型レセプ夕一は、 ΠΙ 型レセプ夕一と類似しているが、ィムノグロブリン様の繰り返し配列は 3個であり、 FGFレセプター等が例示される。

白血病細胞等で発現している f ms様チロシンキナーゼ 3 (以下、 FLT 3と略す、 Matthews, W. Cell 65,1143, 1991; Rosnet, 0. Genomics 9, 380 1991)、 Fetal liver kinase 2 (FLK 2) または STK— 1とも呼ばれるチロシンキナーゼは、 III 型レセプ夕一として知られている（Small, D. Proc. Natl. Acad. S ci, USA 91, 459 1993; Lyman, S. D. Oncogene 8, 815 1993; Rosnet, 0. Bloo d 82, 1110 1993; Agnes, F. Gene 145, 283 1994)。

これらのレセプター型チロシンキナーゼは、増殖因子等のリガンドが該細胞膜外領域に結合すると 2量体化という凝集がおこり、これによりキナーゼの活性化がおこる。これらは、リガンドが先に発見され、ついでそのレセプターが発見されている場合が多いが、未だリガンドが不明なレセプターも存在する。

造血幹細胞や白血病の増殖機構で注目されている F L T 3に関しては、 F L T 3の発見の後、 FLT 3のリガンドが発見された（Lyman, S.D. Cell 75, 1157 1 993; Hannum, C. Nature 368, 643 1994) 。 F L T 3のリガンドはほとんど全ての白血病細胞に発現されており、白血病においてはオートクライン（autocrine) 刺激によるメカニズムで細胞が増殖することが考えられている（Meierhoff, G. L eukemia 9, 1368 1995) 。また FLT3mRNAは、リンパ性白血病細胞及び骨髄性白血病細胞において発現していることが報告されている（Birg, F. Blood 80 , 2584 1994; Da Silva N. Leukemia 8, 885 1994; Brasel, K, Leukemia 9, 121 2 1995; Drexler.H. G. Leukemia 10, 588 1996)が、 FLT3mRNAの発現とリンパ性白血病及び骨髄性白血病の病態との関連は不明である。ヒト F L T 3の c D N Aはクローニングされ、 c D N Aの塩基配列及び F L T 3タンパクのアミノ酸配列が決定されている [O. Rosnet et al. Blood, Vol. 82(4) , 1110-1119(1993) ] 。しかしながら、造血幹細胞の分化や白血病細胞への癌化の過程で、 F L T 3の構造と機能については十分に解析されていないのが現状であ

発明の開示

従って、本発明の第 1の目的は、膜近傍部位の塩基配列に新規な縦列重複を有する、白血病の診断に有用なレセプター型プロテインキナーゼをコ一ドする核酸

、および該膜近傍部位をコードする核酸を提供することにある。本発明の第 2の目的は、前記核酸によりコードされるポリペプチドを提供することにある。本発明の第 3の目的は、膜近傍部位の塩基配列に生じた縦列重複を有する核酸によりコードされる部位に特異的に結合する抗体を提供することにある。本発明の第 4 の目的は、膜近傍部位の塩基配列に生じた縦列重複を有する核酸に特異的に結合する核酸を提供することにある。本発明の第 5の目的は、該レセプター型プロテインキナ一ゼをコ一ドする核酸の検出方法及びそのキットを提供することにある従来、 F L T 3に関しては、細胞の種類、分化に関係なく同一のレセプ夕一型プロテインキナーゼが発現しているとされていた [O. Rosnet et al. Blood, Vol. 8 2(4), 1110-1119(1993) ] 。しかし、本発明者らは、白血病細胞での F L T 3の発現を詳細に検討し鋭意研究を重ねた結果、驚くべきことに、膜近傍部位に新規な縦列重複を有する、レセプ夕一型プロテインキナーゼ遣伝子を発見し、さらに該縦列重複は体細胞性であり、かつ該縦列重複を有する F L T 3の発現が白血病の悪性度、予後の悪さに関連することを見い出し、本発明を完成するに至った。即ち、本発明の要旨は、

( 1 ) 膜近傍部位（juxtamembrane)の塩基配列に縦列重複（tandem duplicati on) を有する、レセプター型プロテインキナーゼをコードする核酸、

(2) レセプター型プロティンキナーゼがレセプター型チロシンキナーゼである前記（ 1 ) 記載の核酸、

(3) レセプター型チロシンキナーゼが FMS様チロシンキナーゼ 3 (FLT 3) である前記（2) 記載の核酸、

(4) 膜近傍部位に配列表の配列番号： 1〜5いずれかに記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む、前記（ 1 ) 〜（3) いずれか記載の核酸、

( 5 ) 膜近傍部位に配列表の配列番号： 6〜 1 5いずれかに記載の塩基配列を含む、前記（ 1 ) 〜（ 3) いずれか記載の核酸、

(6) 配列表の配列番号： 1 6〜20いずれかに記載の FLT3の縦列重複変異体をコードする核酸、

(7) 配列表の配列番号： 2 1〜25いずれかに記載の FLT 3の縦列重複変異体をコードする塩基配列からなる核酸、又は該核酸とストリンジントな条件下でハイプリダイズする、膜近傍部位をコードする塩基配列に縦列重複を有する核酸、

(8) 配列表の配列番号： 1〜5いずれかに記載のアミノ酸配列をコードする縦列重複を含む核酸、

(9) 配列表の配列番号： 6〜1 5いずれかに記載の核酸、又は該核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、縦列重複を含む核酸、

( 1 0) 前記（ 1) 〜（9) いずれかに記載の核酸によりコードされるポリべプチド、

( 1 1 ) 配列表の配列番号： 1〜5、 1 6〜20いずれかに記載のアミノ酸配列からなるポリべプチド、

( 1 2) 配列表の配列番号： 1〜5、 1 6〜20いずれかに記載のアミノ酸配列において、 1又は 2以上のアミノ酸残基の欠失、置換又は付加の少なくとも 1 つを生じさせ、かつ膜近傍部位の塩基配列に縦列重複を有する核酸によりコードされるポリべプチド、

(1 3) レセプター型プロテインキナーゼの膜近傍部位の塩基配列に生じた縦列重複を有する核酸によりコードされる部位に特異的に結合する抗体、

(1 4) レセプター型プロテインキナーゼの膜近傍部位の塩基配列に生じた縦列重複を有する核酸に特異的に結合する核酸、

(1 5) 工程 (a) ：ヒトの核酸試料を得る工程、

工程 (b) ：工程 (a) にて得られた核酸試料を遺伝子増幅反応に付して、レセプ夕

—型プロテインキナーゼをコ一ドする核酸に存在しうる膜近傍部位の縦列重複を含む領域が増幅された核酸断片を得る工程、及び

工程 (c) ：工程 (b) の核酸断片について縦列重複の存在を調べる工程、を含む膜近傍部位の塩基配列に縦列重複を有するレセプター型プロティンキナーゼをコードする核酸の検出方法、

(1 6) 急性骨髄性白血病の FAB (French- American-British)分類において、 M2、 M 4又は M 5の診断に供することを特徴とする、前記（1 5)記載の検出方法、

(1 7) 膜近傍部位の塩基配列に縦列重複を有するレセプター型プロテインキナーゼをコードする核酸を検出するためのキットであって、レセプター型プロテインキナーゼ遺伝子に存在しうる縦列重複を含む領域を増幅するためのプライマ一を含むことを特徴とするキット、

(1 8) 急性骨髄性白血病の FAB (French-American-British)分類において、 M2、 M 4又は M 5の診断に供されることを特徴とする、前記（17)記載のキッ卜、

(1 9) 膜近傍部位の塩基配列に縦列重複を有するレセプター型プロテインキナーゼをコードする核酸を検出するための、前記（1)〜（9) いずれかに記載の核酸の使用、に関するものである。図面の簡単な説明

第 1図は、 AML患者由来の白血病細胞より得た RNAを铸型とし、 RT - P CRを行った際のァガロースゲル電気泳動を示す図である。図中、レーン 1〜5 は、それぞれ、 FAB分類において IVH、 Μ2、 Μ3、 1^4及び1^15 (Μ 34患者）に属する患者についての結果を示し、レーン 6〜9は、それぞれ、 Ml、 Μ 2 (Ml 55患者）、 ^13及び1^4 (Ml 62患者）についての結果を示す。第 2図は、 M34、 M 1 55. M1 62、 M8 1 0、 M 839についてのェクソン 1 1及び 1 2部位での縦列重複を示す模式図である。発明を実施するための最良の形態

以下、本発明を説明する。

本発明のレセプター型プロテインキナーゼをコードする核酸は、膜近傍部位（ juxtamembrane)をコードする領域に縦列重複 (tandem duplication) を有する。本発明のプロティンキナーゼをコ一ドする核酸は、チロシンキナーゼ又はセリン •スレオニンキナーゼのいずれをコ一ドする核酸でも構わないが、白血病の診断にはレセプター型チロシンキナーゼをコ一ドする核酸が好ましく、 F MS様チロシンキナーゼ 3 (FLT3) をコードする核酸が好適に用いられる。

本発明において、膜近傍部位とは、レセプター型プロテインキナーゼの細胞膜貫通領域とキナーゼドメイン間に存在し、キナーゼドメインと共に細胞膜内領域を構成する（O.Rosnet，et al. , Blood, Vol.82(4), 1110-1119(1993))。

本発明における縦列重複とは、膜近傍部位をコードする核酸の全部又は一部が同方向に 1以上繰り返された塩基配列をいう。該繰り返し塩基配列は、直接並んでいてもよいし、繰り返し塩基配列間に任意の塩基配列を含んでいても構わない。また、重複する塩基の数は特に限定されない。さらに、対応する縦列重複間の塩基配列の部分に 1又は 2以上の塩基の欠失、置換又は付加の変異があっても構わないが、本発明の縦列重複においては、該縦列重複が鎖長変異として検出されればよい。例えば、膜近傍部位をコードする核酸として、配列番号： 6〜1 0の塩基配列を有する cDNA、及び配列番号： 1 1〜1 5の塩基配列を有するゲノム DN A中に縦列重複が含まれている。

FLT3の膜近傍部位の塩基配列に新規に発見された縦列重複を含む核酸（ c DNA、ゲノム DNA) を、 M34 (配列番号： 6, 1 1) 、 Ml 55 (配列番号： 7, 1 2) . Ml 62 (配列番号： 8 , 1 3 ) 、 M 8 1 0 (配列番号： 9 , 1 4) 及び M 8 39 (配列番号： 1 0, 1 5) と命名し、それらの模式図を図 2 に示す。尚、本発明における縦列重複は、イン ·フレームで起こることが望ましく、前記配列番号： 6〜1 0からコードされるアミノ酸配列を、配列番号： 1〜 5に示す。

本発明の核酸は、前記のような縦列重複を膜近傍部位の塩基配列に有するレセプター型プロティンキナーゼをコ一ドする核酸に係わるものであり、なかでも縦列重複を膜近傍部位の塩基配列に有する F M S様チロシンキナーゼ 3 (FLT3 ) 変異体の核酸に係わる。この縦列重複を有する膜近傍部位のアミノ酸配列は、例えば前記のように配列番号： 1〜5に記載されており、本発明の核酸は、これらのァミノ酸配列をコードする塩基配列を含むものである。具体的には例えば配列番号： 6〜1 5に記載の塩基配列を含むものである。より詳しくは、膜近傍部位の核酸を含む FLT 3の縦列重複変異体の核酸として、例えば配列番号： 1 6 〜20に記載の FLT 3の縦列重複変異体をコ一ドする核酸、さらに具体的には配列番号： 2 1〜25に記載の FLT 3の縦列重複変異体をコードする塩基配列からなる核酸が挙げられる。また、この核酸とストリンジ Xントな条件下でハイプリダイズし、かつ膜近傍部位をコードする塩基配列に縦列重複を有する核酸で i>つ C"ちょレ、o

さらに、本発明の核酸は、縦列重複を含む膜近傍部位をコードする核酸に係わり、例えば配列番号： 1〜5に記載のアミノ酸配列をコードする縦列重複を含む核酸、具体的には配列番号： 6〜1 5に記載の核酸、又はこの核酸とストリンジン卜な条件下でハイブリダィズする、縦列重複を含む核酸が挙げられる。ここで、ストリンジヱントな条件下でハイブリダィズするとは、例えば、核酸を固定したメンブレンを 0. 5%SDS、 0. 1 %ゥシ血清アルブミン（BSA ) 、 0. 1 %ポリビニルピロリドン、 0. 1 %フイコール 4 0 0、 0. 0 1 %変性サケ精子 DNAを含む 6 xSSC ( 1 xSSCは 0. 1 5M Na C K 0. 0 1 5 Mクェン酸ナトリウム、 pH7. 0を示す）中で、 50°Cにて 1 2〜20 時間ィンキュベ一トすることにより、該核酸にハイプリダイズすることをいうが、この条件に限定されるものではない。

本発明の核酸は、例えば以下の方法で得ることができる。

まず、種々の病理細胞、特に白血病細胞から精製した RNA を铸型とし逆転写酵素により c DNAを合成した後、目的とするレセプター型プロティンキナーゼの膜近傍部位をコードする領域を夕ーゲットとしたプライマ一を用いた DNA増幅反応を行い、電気泳動法により増幅 DNA断片の長さを比較することにより、鎖長変異を起こしている細胞を検出する。更に、得られた増幅 DNA断片の塩基配列を決定することにより、変異が縦列重複であるか否かを同定することができる ο

次いで、縦列重複を起こしている細胞より得た RNAを铸型とし、逆転写酵素により cDNAを合成した後、目的とするレセプター型プロテインキナーゼの c DN Aを特異的に増幅させるプライマ一を用いた DN A増幅反応を行なう事により、本発明の新規な縦列重複を有する、レセプター型プロテインキナーゼをコ一ドする c DN Aを得ることができる。

また、本発明の核酸は、病理細胞から精製したゲノム DNAを鐯型として用いて、得ることも可能である。

本発明では、病理細胞として白血病細胞を選択し、レセプター型プロテインキナ一ゼは、好ましくは FLT3を対象とする。

FLT 3遺伝子は 2 1のェクソンよりなるが、膜近傍部位はェクソン 1 0の 3 ' 側 1 8 b p及びェクソン 1 1の 5' 側 1 1 7 b pにコードされている（O.Rosn et.et al. , Oncogene, Vol, 6, 1641-1650(1991)) 。 DNA増幅反応に使用するブライマ一は、ェクソン 1 1及びェクソン 1 2領域をカバーするプライマ一を選択すれぱよく、その塩基配列の例として配列番号： 26及び 27に示す。なお、ェクソン 1 1の 3' 側 1 6 b ρとェクソン 1 2はチロシンキナーゼドメインの一部をコードしている。

DN A増幅反応の铸型として RN Aを使用した場合、配列番号： 6〜1 0で示される DNA増幅断片を、ゲノム DNAを使用した場合、配列番号： 1 1〜1 5 で示される DNA増幅断片を得る。その結果、これらの断片は、ェクソン 1 1内又はェクソン 1 1〜1 2にかけてのイン · フレーム縦列重複を有することが確認される。

一方、前記イン · フレーム縦列重複を有する FLT3全長をコードした cDN Aの塩基配列を配列番号： 2 1〜25に示す。

本発明のポリペプチドは、前記核酸からコードされるポリペプチドである。具体的には、配列番号： 1〜5のアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列番号： 1 6〜20で表わされる FLT 3の縦列重複変異体が例示される。

本発明のポリべプチドは、該ボリべプチドを発現している細胞より精製して得ることが可能であるが、通常の遺伝子工学的手法を用いることにより得ることもできる。例えば、前記核酸を適当な発現ベクターに組み込み、適当な宿主中で発現させることにより FLT 3の縦列重複変異体が得られる。また、膜近傍部位のみをコードする DNA断片を前記発現べクタ一に組み込むことにより、本発明のレセプ夕一型プロティンキナーゼの膜近傍部位のみのポリべプチドを得ることもできる。

さらに、本発明のポリペプチドは、融合タンパクとして発現させることも可能である。例えば、目的タンパク質の発現量を増加させるために N末端に他のタンパク質由来の N末端べプチド鎖を付加したり、目的タンパク質の N末端又は C末端に適当なぺプチド鎖を付加して発現させ、このべプチド鎖に親和性を持つ担体を使用することにより目的夕ンパク質の精製を容易にすることなどを行うことができる。

本発明のポリペプチドのアミノ酸配列、例えば配列表の配列番号： 1〜5、 1 6〜 2 0に記載のァミノ酸配列において、 1又は 2以上のァミノ酸残基の欠失、置換又は付加の少なくとも 1つを生じさせ、かつ膜近傍部位の塩基配列に縦列重複を有する核酸によりコードされるポリべプチドも本発明のポリべプチドに含まれる。即ち、縦列重複した核酸によりコードされる部分にはアミノ酸配列の変異はなく、その他のアミノ酸配列においてアミノ酸残基の欠失、置換又は付加がある場合であつてもよく、また縦列重複した核酸によりコードされる部分にァミノ酸残基の欠失、置換又は付加がある場合であってもよい。前記アミノ酸残基の欠失、置換又は付加の導入は、制限酵素、ヌクレア一ゼ等を用いる方法や部位特異的変異導入方法 (W. I to. et al. , Gene, Vol. 102, 67- 70(1991))等により、所望の核酸配列に変異を導入し、発現ベクターに組み込んで適当な宿主で発現させることにより、容易に実施される。

本発明において、抗体とは、レセプター型プロテインキナーゼの膜近傍部位の塩基配列に生じた縦列重複を有する核酸によりコードされる部位に特異的に結合する抗体である。該抗体を得るためには、例えば、常法により、配列番号： 1〜 5のァミノ酸配列を有するぺプチドをアジュバントと共に動物に免疫することにより、抗血清として得られる。また、 G. Galfare. et al. , Nature. Vol. 266, 550-55 2(1977) に記載の方法により、モノクローナル抗体として得ることも可能である ο

本発明において、レセプ夕一型プロティンキナーゼの膜近傍部位の塩基配列に生じた縦列重複を有する核酸に特異的に結合する核酸とは、特に限定されないが、例えば、該縦列重複を有する二本鎖 D N Aのアンチセンス鎖の D N A又はアンチセンス鎖の D N Aに対応する R N A等が例示される。本発明の核酸の検出方法とは、以下の工程を含む。

工程 (a) ：ヒトの核酸試料を得る工程、

工程 (b) ：工程 (a) にて得られた核酸試料を遺伝子増幅反応に付して、レセプタ一型プロテインキナーゼをコ一ドする核酸に存在しうる膜近傍部位の縦列重複を含む領域が増幅された核酸断片を得る工程、及び

工程 (c) ：工程 (b) の核酸断片について縦列重複の存在を調べる工程。

第 1に、工程（a) について述べる。本発明に用いられるヒトの核酸試料としては、膜近傍部位の塩基配列に縦列重複を有するレセプター型プロテインキナーゼをコードする核酸であれば特に限定されるものではなく、ゲノム DNA、 cD NA、 mRNA等が挙げられる。ヒトの核酸試料の調製は、通常行われる公知の方法、例えば、モレキュラークローニングァラボラトリ一マニュアル、第 2版（T. マニアティス他著、コールドスプリングハーバ一ラボラトリ一社、 1 9 8 9年発行）に記載の方法により行うことができる。

第 2に、工程（b) について述べる。工程（a) で得られた核酸試料及び適当なプライマーを用いて、目的とするレセプター型プロティンキナーゼの膜近傍部位に存在しうる変異部位を含む領域をコードする核酸が増幅され、所望の核酸断片を得ることができる。本工程で用いられる DNA増幅反応の方法としては、該領域を増幅できる方法であれば特に限定されないが、 RT - PCR法、 PCR法、 RN Aポリメラ一ゼを利用した核酸増幅法（特開平 2— 5 8 64号公報、特開平 7 - 203 9 9 9号公報）や鎖置換増幅法（特公平 7 - 1 1 4 7 1 8号公報、特開平 7— 8 8242号公報）のような核酸増幅法を利用することができる。なかでも RT— PC R法又は PC R法が好ましく用いられる。

増幅の対象となる、膜近傍部位の縦列重複を含むを領域としては、例えば FL T 3の場合、ェクソン 1 0の 3 ' 側 1 8 b pからェクソン 1 1の 5 ' 側 1 1 7 b pにかけての領域の全部又は一部を含む領域が挙げられるが、ェクソン 1 1部位が含まれていれば特に限定されない。 RT— P CR法又は P C R法で用いるプライマーとしては、上記の変異部位を含む DNA断片を増幅できるものであれば、特に限定されない。具体的には、配列表の配列番号： 26及び 27に示した塩基配列を有するプライマー対が例示される。また、 PCRの条件も特に限定されず、通常行われる公知の条件で PC R 反応が行われる。

第 3に、工程（c) について述べる。本工程において、工程（b) で得られる核酸断片について縦列重複の存在が調べられる。縦列重複変異の存在の検出方法としては特に限定されないが、ァガロースゲル電気泳動法による増幅 DNA断片長を比較する方法が好ましく用いられる。

また、本工程に使用される変異の検出方法として、単鎖高次構造多型（SSC P) を調べる方法を使用することもできる。該方法は、一本鎖 DNAが分子内の相互作用により形成する塩基配列に依存した高次構造の違いを、電気泳動での移動速度の差として調べる方法である（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:2766〜 2770、 1989)。工程（b) で得られる核酸断片を前記の文献に記載の条件で電気泳動に付し、その移動速度を正常レセプター型プロティンキナーゼ由来の核酸断片のものと比較することにより、変異の有無を検出することができる。

他の検出法としては、前記工程（c) をその他の変異検出方法に変更した方法がある。変異の検出には、例えば変異部位を含む適当な DNA断片をプローブに用いるハイプリダイゼーシヨン法や、 DGGE法（Val C. Sheffield et al.,Pro c. Natl. Acad. Sci.USA Vol.86, 232-236(1989)) のような公知の変異検出方法が使用できる。また、 Mu t Sタンパク質を用いる変異の検出方法が知られている（特開平 7 - 327698号公報）。

前記の方法により鎖長変異が確認された DNA断片について、その塩基配列の決定を行うことにより、変異の同定を行うことができる。塩基配列の決定には、通常使用される方法を用いることができ、例えば、増幅 DNA断片を適当なべク夕一にクローニングして塩基配列を決定する方法や、あるいは増幅断片そのものを铸型としてその塩基配列を決定する方法がある。

このように、本発明は膜近傍部位の塩基配列に縦列重複を有するレセプター型プロティンキナーゼをコ一ドする核酸を検出するための、前記の本発明の核酸の使用を提供するものである。

本発明の核酸の検出方法は、急性骨髄性白血病（AML) の FAB (French-A merican-British)分類において、 M2、 M 4及び M 5の診断に供することができる。 FAB (French- American-British)分類では、 AMLの病型を、 Ml (骨髄芽球性（成熟能なし））、 M2 (骨髄芽球性（成熟能あり））、 M3 (前骨髄球性）、 M4 (骨髄単球性）、 M5 (単球性）及び M6 (赤白血病）の 6つに分類している（新臨床検査技師講座、 1 0、血液学、第 75頁、医学書院）。

本発明の縦列重複をもつ FLT 3遺伝子を有する患者は、前記 M2、 M4及び M5に属し、一旦症状が寛解したにもかかわらず、再発し死に至ることがわかり、その予後は悪い結果となることが示唆される。従って、本発明の検出方法により A M Lの病理学的判断に有用な検査方法が提供される。

なお、前記患者のうち、症状が寛解された時点で入手できた患者の骨髄細胞のゲノム D N Aを用いた変異の検出を行つたところ、膜近傍部位での縦列重複は認められない。従って、この変異は体細胞性変異であると推定される。

また、縦列重複を有する本発明の核酸は、 FAB分類における AMLの他、白血病の前段階である骨髄異形成症候群（MDS: Myelodysplastic Syndrome)や異形成を伴う AML (AML with dysplasia) 等のマーカ一となる。従って、本発明の検出方法は、これらの疾患の病理学的判断に有用な検査方法となる。

前記の検出方法を利用することにより、本発明の核酸を検出するためのキットを提供することができる。具体的には、前記記載の検出方法により膜近傍部位の塩基配列に縦列重複を有するレセプ夕一型プロティンキナーゼをコードする核酸を検出するためのキットであって、レセプター型プロテインキナーゼ遺伝子に存在しうる縦列重複を含む領域を増幅するためのプライマ一を含有することを特徴とするものである。

かかるキットを用いることにより、前記 AM L等の診断が容易に実施できる。本発明では、さらに前記のような縦列重複を有する核酸によりコードされるポリぺプチドを次のような工程により検出することができる。

工程 1 ：ヒトの蛋白質試料を得る工程、

工程 2 ：工程 1にて得られたタンパク試料の膜近傍部位の塩基配列について縦列重複の存在を調べる工程、である。

第 1に、工程 1について述べる。ヒトの蛋白質試料の調製は、本発明のポリべプチドが発現していると考えられる細胞（例えば、 F L T 3の場合白血病細胞）より膜蛋白質を調製する事により実施できる。

第 2に、工程 2について述べる。縦列重複変異の検出方法としては特に限定されないが、縦列重複変異を含む核酸によりコードされる膜近傍部位と特異的に結合する標識抗体を用いることにより実施できる。

本工程は、例えば、工程 1で得られた蛋白質試料の S D S— P A G Eによる夕ンパク分離、続いてィムノブロッティング法による目的タンパク質の検出からなる方法より実施することが出来る。

本発明の別の態様において、前記核酸もしくはポリペプチド又はこれらに特異的に結合する核酸もしくは抗体を使用して、白血病細胞、造血幹細胞等の増殖、免疫応答ならびにシグナル情報伝達の制御を行う方法が提供される。

中でもその好ましい実施態様としては腫瘍免疫療法への応用がある。従来から癌細胞に特異的に発現される蛋白質の癌特有なペプチドは、癌細胞に対する T細胞免疫応答の標的となることが知られており、その実施方法としては例えば以下の報告に述べられている技術が利用できる。すなわち、ヒト T 細胞において第 1 2番ァミノ酸グリシンを他のァミノ酸に置換した ras ぺプチドに特異的に反応し、 HLA- DRの拘束性を有する CD 4 +T細胞が分離され（Jung, S. J. Exp. Med. 173 ， 273 1991) 、 6 1番アミノ酸に変異をもつ ras 蛋白質を産生できる組み替えヮクシニアウイルスで免疫されたマウスから、その変異部位を含む 8アミノ酸からなるペプチドに対する CTLCcytotoxic T lymphocyte) を誘導できる（Skipper, J.

J. Exp. Med. 177. 1493 1993) 。さらに、遺伝子組み替えで作製した可溶性変異 ras 蛋白質で免疫したマウスでは、同一変異を持った癌細胞の in vivo での増殖が抑制され（Fenton, R. G. J. Natl. Cancer Inst. 85, 1294 1993) 、変異 ra s ペプチドで感作した脾臓細胞から、同一の変異 ras を発現している癌細胞に細胞障害活性を示す CTL が得られる（Peace, D. J. J. Exp. Med. 179, 473 1994) 。一方、慢性骨髄性白血病によく検出される bcr-abl キメラ蛋白質は、高いチロシンキナーゼ活性を有し、白血病の発症や白血病細胞の増殖に重要な役割を演じている。この融合蛋白質の融合部位近傍のペプチドで免疫することにより、本融合蛋白質に反応性の T細胞が得られる（Chen, W. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89,

1468 1992) 。さらに、本融合遺伝子に対するアンチセンス D NA又は R NAは、 in vivoで本遺伝子発現腫瘍の増殖を抑制することができる（Skorski, T. Pro c. Nat l. Acad. Sci. USA 91 4504 1994) 。

従って、膜近傍部位の塩基配列に生じた縦列重複を有する核酸からコードされる本発明のぺプチドで免疫することにより、該ぺプチドを含むレセプター型プロティンキナーゼに反応性の T細胞が得られ、該キナーゼを発現している細胞の増殖を制御することが可能となる。

また、本発明の縦列重複を有することが細胞増殖制御に関与している場合、該遺伝子に対するアンチセンス D N A又は R N Aによりシグナル伝達機構を調節し、細胞増殖の制御をすることができる。

レセプ夕一型プロテインキナーゼは、細胞膜外領域にリガンドが結合すると、コンフオメーシヨンが変化して二量体を形成し、細胞膜内領域のキナーゼドメインの活性が上昇する。それにより、自己リン酸化が起こったり、該キナーゼの基質をリン酸化する。そこにさまざまなシグナル伝達分子が関与し、細胞内へ伝達された情報は細胞形態変化、細胞運動、形態形成、細胞増殖、癌化、分化、アポトーシスなどさまざまな生物学的現象を引き起こす。悪性度の高い急性骨髄性白血病細胞は、 FLT 3リガンドと強い親和性を有し、細胞増殖が促進されることが報告されており（Piacibello, W. Blood 86, 4105 1995; Lisovsky, . Blood 86, 22a 1995; McKenna, H. J. Exp. Hematol. 24, 378 1996; Dehmel, U. Leuk emia 10， 261 1996)、本発明の F L T 3縦列重複変異体発現細胞では、 FLT 3 リガンドからのシグナル伝達システムが非常に活性化されていることが予想される。従って、該変異体発現造血幹細胞は、強力な増殖能をもつ造血幹細胞の供給源として提供され、正常の FLT3発現細胞と比較することにより、種々の薬剤のスクリーニングに適した材料と方法を提供することができる。

こうして、本発明の方法を利用することにより、血液細胞疾患、造血幹細胞疾患等の検査や治療への応用も可能である。以下、実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定されるものではない。実施例 1

1 ) FLT 3遺伝子発現パターンの解析

急性白血病患者 8 0例（小児 ALL50症例、成人 AML30症例）について、 FLT3遺伝子の発現解析を RT- PCR法により行った。使用したプライマーは、配列表の配列番号： 2 6及び 27に示される塩基配列を有し、細胞膜貫通領域から膜近傍部位を完全にカバーし増幅できるように設計した。前記プライマー対を用いると、正常な FLT 3が転写されていた場合、増幅 DNA産物は 366bp長となる。

前記患者の末梢血または骨髄細胞から、全 RNA を Trizol試薬（LifeTech社製）を用いて抽出し、 RT-PCRキット（宝酒造社製）及び Thermal Cycler (宝酒造社製 ) を用いて、以下の条件で DNA増幅反応を行った。全 RNA より逆転写酵素を用いて cDNAを合成し、 1 μΛ の cDNA (40ngの全 RNA に相当）， 200 の dNTP混合物， lxPCR緩衝液， 2Uの Taq DNA ポリメラーゼ，及び各 20pmolの前記プライマーを含む 50 1 の反応液中、 94で 5分で該反応液を加熱後、 64°C30秒、 72 で 4 5秒、 94°C30秒の温度サイクルを 35回繰り返し、最後に 72°C5分間処理した。尚、 RNA の品質をチェックするため、 /S—ァクチンをターゲットとして、配列表の配列番号： 28及び 29に示すプライマー対を用い、同様に RT- PCR を行った。こうして得られた増幅 DNA産物を臭化工チジゥムを含む 2〜3%ァガロースゲル（FMC社製）にて電気泳動を行い、 UV下検出した。図 1に電気泳動パターンの 1例を示し、結果を表 1に示す。表 1

表 1より、 ALL50症例中 39症例（78% ) に、また AML30症例中 22症例 (73%) に FLT 3遺伝子の転写産物が認められた。このうち、 FLT3陽性の AML 22症例中 5 症例（23% ) において予想された 366bp よりも長い増幅 D N A産物が検出され、 FLT 3遺伝子の鎖長変異が観察された。尚、 4症例（M34, M155，M810, M839) では予想された 366bp のバンドとそれより長いバンドが検出され、 1症例 (M162)では 366bp のバンドは検出されず、それより長いバンドのみが検出された。

2 ) FLT3遺伝子の鎖長変異産物の塩基配列の解析

前記 5症例における遺伝子の鎖長変異をさらに詳細に検討するため、ァガロースゲルより増幅 D N A産物を精製し、ェクソン 1 1及び 1 2領域の塩基配列を決定した。その結果、これらの鎖長変異は、膜近傍部位の塩基配列における縦列重複に起因していることが確認された。すなわち、症例 M34. M162. M839 ではェクソン 1 1内での 39bpまたは 60bpの縦列重複が認められ、症例 M810では 4 bp(GGCA)の揷入を含む 26bpの縦列重複が認められた。さらに、症例 M155ではェクソン 1 1の直後にェクソン 1 2の最初の 16bp、 1個のシトシン残基の揷入、更にェクソン 1 1の後半 46bpからなる 63bpの縦列重複が確認された。得られた塩基配列を配列表の配列番号： 6〜 1 0に示し、これらの縦列重複の模式図を図 2に示す。

特徴的なことは、これらの縦列重複がイン ·フレームで起こっていることであり、実際に発現されているポリペプチドにこれらの変異が反映される。これらの塩基配列からコードされるアミノ酸配列を、配列表の配列番号： 1〜5に示す。

3 ) ゲノム D N Aの塩基配列の解析

前記 5症例患者の骨髄細胞由来の F L T 3ゲノム D N Aを铸型とした PCR法による増幅 D N A産物を解析した。増幅条件は、 50ngのゲノム D N A、、 200 M の dNTP混合液及び 20pmolのプライマーを含む PCR緩衝液に、 2Uの Taq DNA ポリメラ一ゼ（宝酒造社）を加えて全量 50 1 とし、 PCR 反応を行った。ェクソン 1 0 からェクソン 1 9までを、各ェクソン毎に個別に増幅 DNA反応を行ったところ、配列表の配列番号 3 0、 3 1及び 32、 3 3のプライマ一を対にして用い、ェクソン 1 1及びェクソン 1 2を増幅した場合に、 mRNAを解析した時と同様に鎖長変異が認められた。 PCR 産物は QIAEXIKQIAGEN社）で精製し、 pCRII ベクター（ Invitrogen社）にクローニングし、塩基配列の解析を行ったところ、 cDNAの塩基配列（配列番号： 2 1〜2 5) と同様な結果が得られた。これらをまとめて図 2 に示す。実施例 2

レセプター型プロテインキナーゼ膜近傍部位の変異と病理学的関係の解析

レセプター型プロテインキナーゼ膜近傍部位の変異と病理学的関係を解析するために、症状の病理学的分類と FLT 3遺伝子との関係を表 1に示した。膜近傍部位の塩基配列に縦列重複の認められた 5例は、 FAB分類における M2 (骨髄芽球性（成熟能あり））、 M4 (骨髄単球性）又は M5 (単球性）に属し、いずれの症例も一旦完全寛解を認めたものの再発し、死亡した症例であつた。

なお、チロシンキナーゼドメインをコードするェクソン領域の塩基配列の解析も行ったが、これらの領域には、変異は認められなかった。

従って、 FLT 3の膜近傍部位をコードする遣伝子領域のイン · フレーム縦列重複と、単球の増殖を伴う AMLとの関連が示唆された。

また、完全寛解した時点での 3例（M34.M162.M810)の骨髄細胞からの DNA 試料においては、このような鎖長変異が検出されなかったことから、本発明の縦列重複は体細胞性変異であった。産業上の利用可能性

本発明により、膜近傍部位の塩基配列に縦列重複変異を有する新規レセプター型プロテインキナーゼ、およびその塩基配列、アミノ酸配列情報が提供される。また、本発明を利用した白血病などの病理学的診断、検査方法、及びそれに関するキット、検査試薬が提供される。さらに、本発明を利用した造血幹細胞や白血病細胞に代表される細胞の増殖分化、癌化、免疫応答、シグナル伝達の状態を制御、解析する方法およびそれに関するキット、試薬を提供できる。

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トポロジー：直鎖状

配列の種類：ぺプチド

配列：

Gin Phe Arg Tyr Glu Ser Gin Leu Gin Met Val Gin Val Thr Gly

1 5 10 15

Ser Ser Asp Asn Glu Tyr Phe Tyr Val Asp Phe Arg Glu Tyr Glu

20 25 30

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35 40 45

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50 55 60

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65 70 75

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80 85 90

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95 100 配列番号： 3

配列の長さ： 92

配列の型：アミノ酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ぺプチド

配列： Gin Phe Arg Tyr Glu Ser Gin Leu Gin Met Val Gin Val Thr Gly 1 5 10 15

Ser Ser Asp Asn Glu Tyr Phe Tyr Val Asp Phe Arg Glu Tyr Glu

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80 85 90

Leu Lys

92 配列番号： 4

配列の長さ： 89

配列の型：アミノ酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ぺプチド

配列：

Gin Phe Arg Tyr Glu Ser Gin Leu Gin Met Val Gin Val Thr Gly

1 5 10 15

Ser Ser Asp Asn Glu Tyr Phe Tyr Val Asp Phe Arg Glu Tyr Glu

20 25 30 Tyr Asp Leu Lys Trp Glu Phe Pro Arg Glu Asn Trp His Lys Trp

35 40 45

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65 70 75

Lys Thr Gly Val Ser l ie Gin Val Ala Val Lys Met Leu Lys

80 85 89 配列番号： 5

配列の長さ： 92

配列の型：アミノ酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ぺプチド

配列：

Gin Phe Arg Tyr Glu Ser Gin Leu Gin Met Val Gin Val Thr Gly 1 5 10 15

Ser Ser Asp Asn Glu Tyr Phe Tyr Val Asp Phe Arg Gly Ser Ser

20 25 30

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50 55 60

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80 85 90 し en lys

92 配列番号： 6

配列の長さ： 296

配列の型：核酸

鎖の数：二本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類： cDNA to mRNA

配列：

CAATTTAGGT ATGAAAGCCA GCTACAGATG GTACAGGTGA CCGGCTCCTC AGATAATGAG 60 TACTTCTACG TTGAAAGCCA GCTACAGATG GTACAGGTGA CCGGCTCCTC AGATAGTGAG 120 TACTTCTACG TTGATTTCAG AGAATATGAA TATGATCTCA AATGGGAGTT TCCAAGAGAA 180 AATTTAGAGT TTGGGAAGGT ACTAGGATCA GGTGCTTTTG GAAAAGTGAT GAACGCAACA 240 GCTTTGGAAT TAGCAAAACA GGAGTCTCAA TCCAGGTTGC CGTCAAAATG CTGAAA 296 配列番号： 7

配列の長さ： 300

配列の型：核酸

鎖の数：二本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類： cDNA to mRNA

配列：

CAATTTAGGT ATGAAAGCCA GCTACAGATG GTACAGGTGA CCGGCTCCTC AGATAATGAG 60

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GGTGCTTTTG GAAAAGTGAT GAACGCAACA GCTTATGGAA TTAGCAAAAC AGGAGTCTCA 240

ATCCAGGTTG CCGTCAAAAT GCTGAAA 267 配列番号： 1 0

配列の長さ： 276

配列の型：核酸

鎖の数：二本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類： cDNA to mRNA

配列：

CAATTTAGGT ATGAAAGCCA GCTACAGATG GTACAGGTGA CCGGCTCCTC AGATAATGAG 60 TACTTCTACG TTGATTTCAG AGGCTCCTCA GATAATGAGT ACTTCTACGT TGATTTCAGA 120 GAATATGAAT ATGATCTCAA ATGGGAGTTT CCAAGAGAAA ATTTAGAGTT TGGGAAGGTA 180 CTAGGATCAG GTGCTTTTGG AAAAGTGATG AACGCAACAG CTTATGGAAT TAGCAAAACA 240 GGAGTCTCAA TCCAGGTTGC CGTCAAAATG CTGAAA 276 配列番号： 1 1

配列の長さ： 386

配列の型：核酸

鎖の数：二本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類： Genomic DNA

配列：

CAATTTAGGT ATGAAAGCCA GCTACAGATG GTACAGGTGA CCGGCTCCTC AGATAATGAG 60

鎖の数：二本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類： Genomic DNA

配列：

CAATTTAGGT ATGAAAGCCA GCTACAGATG GTACAGGTGA CCGGCTCCTC AGATAATGAG 60 TACTTCTACG TTGATTTCAG AGAATATGAA TATGATCTCA AATGGGAGTT TGATTTCAGA 120 GAATATGAAT ATGATCTCAA ATGGGAGTTT CCAAGAGAAA ATTTAGAGTT TGGTAAGAAT 180

GGAATGTGCC AAATGTTTCT GCAGCATTTC TTTTCCATTG GAAAATCTTT AAAATGCACG 240

TACTCACCAT TTGTCTTTGC AGGGAAGGTA CTAGGATCAG GTGCTTTTGG AAAAGTGATG 300

AACGCAACAG CTTATGGAAT TAGCAAAACA GGAGTCTCAA TCCAGGTTGC CGTCAAAATG 360

CTGAAA 366 配列番号： 1 4

配列の長さ： 357

配列の型：核酸

鎖の数：二本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類： Genomic DNA

配列：

CAATTTAGGT ATGAAAGCCA GCTACAGATG GTACAGGTGA CCGGCTCCTC AGATAATGAG 60 TACTTCTACG TTGATTTCAG AGAATATGAA TATGATCTCA AATGGGAGTT TCCAAGAGAA 120 AATTGGCACA AATGGGAGTT TCCAAGAGAA AATTTAGAGT TTGGTAAGAA TGGAATGTGC 180 CAAACGTTTC TGCAGCATTT CTTTTCCATT GGAAAATCTT TAAAATGCAC GTACTCACCA 240 TTTGTCTTTG CAGGGAAGGT ACTAGGATCA GGTGCTTTTG GAAAAGTGAT GAACGCAACA 300 GCTTATGGAA TTAGCAAAAC AGGAGTCTCA ATCCAGGTTG CCGTCAAAAT GCTGAAA 357

2 g 配列番号： 1 5

配列の長さ： 366

配列の型：核酸

鎖の数：二本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類： Genomic DNA

配列：

CAATTTAGGT ATGAAAGCCA GCTACAGATG GTACAGGTGA CCGGCTCCTC AGATAATGAG 60 TACTTCTACG TTGATTTCAG AGGCTCCTCA GATAATGAGT ACTTCTACGT TGATTTCAGA 120 GAATATGAAT ATGATCTCAA ATGGGAGTTT CCAAGAGAAA ATTTAGAGTT TGGTAAGAAT 180 GGAATGTGCC AAATGTTTCT GCAGCATTTC TTTTCCATTG GAAAATCTTT AAAATGCACG 240 TACTCACCAT TTGTCTTTGC AGGGAAGGTA CTAGGATCAG GTGCTTTTGG AAAAGTGATG 300 AACGCAACAG CTTATGGAAT TAGCAAAACA GGAGTCTCAA TCCAGGTTGC CGTCAAAATG 360 CTGAAA 366 配列番号： 1 6

配列の長さ： 665

配列の型：アミノ酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ぺプチド

配列：

Met Pro Ala Leu Ala Arg Asp Ala Gly Thr Val Pro Leu Leu Val

1 5 10 15

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Leu Pro Ser Lys Cys

665 配列番号： 1 Ί

配列の長さ： 994

配列の型：アミノ酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ペプチド

配列：

Met Pro Ala Leu Ala Arg Asp Ala Gly Thr Val Pro Leu Leu Val

1 5 10 15

Val Phe Ser Ala Met He Phe Gly Thr l ie Thr Asn Gin Asp Leu

20 25 30

Pro Val l ie Lys Cys Val Leu l ie Asn His Lys Asn Asn Asp Ser

35 40 45

Ser Val Gly Lys Ser Ser Ser Tyr Pro Met Val Ser Glu Ser Pro

50 55 60

Glu Asp Leu Gly Cys Ala Leu Arg Pro Gin Ser Ser Gly Thr Val

65 70 75 s ε

OLZ 992 09S

911 dJi na OJJ A19 Ι¾Λ s n8 aqj nsq uio o^d ⁿ J¾

92 092 9^2

•nil UTO OJd JMl UIO usy naq dsy \ 3JV sAQ

0 S2 0 Z

nio 3JV ^IO na nio usv 8JV BIV SAQ SAQ Say ail dsy J¾ Aio

923 022 9T3

9Md naq nio SIH naq 八 s sAq sAq ¾iv 0

012 302 002

J8S "ΐθ nio sXi SAO J9S nio Aio UIQ s dsv sAQ n8q I¾ dJi

96 ΐ 06 ΐ 98 ΐ

nio 1¾Λ 3ΐΙ OJd ni OJd Ι¾Λ "10 s d\\ SAQ Ι¾Λ ηθ ¾ΐν

08 ΐ 9 I ΟΖΐ

dsy uio usv nio s 8jy 91^ i O ^ Say Say naq jqi JAI

991 09 ΐ SSI

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091 0Π

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9ST 081 m

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02ΐ 9Ιΐ 0Π

naq dsy aqd SIH OJJ uig sXo usy naq jas J8S SIH sA oqd ι¾Λ

90 ΐ 00 ΐ 96

dJl Π9Π s J9S 311 usv ^IO OJd BIV dsy \U n91 uio ^η9Ί

06 98 08

3Π s BIV J3S 八 dsy 八 ni Ι¾Λ ¾IV ¾1V ¾1V nio JAl ,6df/XDd 808 /86 OAV 9 ε 0 9 ^

s Ί djj, J¾ dJi jas OJJ naq OJJ i A Q dsy Jas 3Md SAQ Jas

OS o

BIV UIO J3S BIV J3S BIV nio ¾IV Π3Ί Ι¾Λ "100Jd sA 3jy 3 V

SS 0

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Z ^l 0\

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S0 00 968

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06S 98S 08S

9Md s sAq 8JV J8S 9i]d jqi dJi J¾ 3jy 3Π u 0Jd JAI

9 S O S 99S

BIV sA dm Say ΐ¾Λ 8Md SAQ nio "10 丄 «10 dsy 911

098 998 OSS

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9^8 Ot^S 98S

911 J 八 naq BIV "10 J^S QJd STH sXq JOS J9S

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sAQ jqi JAj, i Ai JMl dsy usy 3JV ¾IV Ι¾Λ J3S ΐ¾Λ 9 d

9ΐδ 0Ϊ8 SOS

BIV 9Md ^N 911 3JV 911 3JV usy J¾ Jas 1 ^JM1 ^J9S

008 962 063

nio 9Md J usv ^ΐθ "10 "10 ¾1V sAq usy n na nio

982 082 913

d l Jll na Aio 8Md io siH usy 八 SIH ΐ¾Λ ^iv sA s 3JV

L99£0IL6dr/lDd 808LT/86 OAV L ε

099 999 099

911 s 八 Ai sAq s an i\ ¾iv eiv usy i3fV

9^9 0^9 989

sAl ϊθ ^Md BIV i9 J9S XIO n^i sA A 19 aqj n naq

089 929 029

usv nio 3JV OJd 9Md sAq na dsy JAi nio Αΐθ naq

919 019 909

Λ sx Aio 8Md nio na usy 3JV OJd si sA na

009 969 069

dsv ^J nio J nio 3^JV QMd dsy 1¾Λ ^J ^ d J nio usv dsy

383 089 9Z3

J3S S ^ UIO Ι¾Λ UIO naq uio s nio J 3JV

0 9 999 099

QMd uio sAq sAq J sA SIH s d\ ] n9q naq J¾ na 八八

939 099 9^9

91 1 9Md naq ngq sAQ Ι¾Λ ^IO ΘΙ Ι JMl ¾1V J ^ d s an usy

0^9 9S9 OSS

dsv "10 911 9Md OJd aqd ojj Aio o^d お S usv nsq ΘΠ J¾

939 023 9Ϊ9

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019 gog 009

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96^ 06^ 98^

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08^ S OLV

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998 098 9^8

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0^8 9S8 0S8

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928 028 9Ϊ8

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0Ϊ8 908 008

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96A 06 98Z

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0 L OLL

J9S usy ^io STH naq Aio J9S 3Π uio dsy J3S dsv OJJ SIH 811

99A 09 99Z

uio ΪΒΛ nio 3JV 人 13 ojd J8S J9S usy OJJ SIH Jas "10

09 Gt' L

9Md J¾ oJd J i 9jd J9S aqj usy SIH sA d an nio

8 08 92

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02 9ΪΖ 01

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90Z OO 969

J9S naq J¾ s BIV Aio na naq usy Ι¾Λ ^Q \ usy nio SIH J3S

069 989 089

人 13 na UIO ^J 1 sX na jy naq ¾iv v

9A9 0A9 999

nio J3S s dsy ¾1V sXq nio sAq na ΙΘ^ sAq Ι¾Λ ¾1V ΐ¾Λ "10 6Jf Al d 808Z.T/86 OAV Asp l ie Met Ser Asp Ser Asn Tyr Val Val Arg Gly Asn Ala Arg

860 865 870

Leu Pro Val Lys Trp Met Ala Pro Glu Ser Leu Phe Glu Gly l ie

875 880 885

Tyr Thr l ie Lys Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly l ie Leu Leu Trp

890 895 900

Glu l ie Phe Ser Leu Gly Val Asn Pro Tyr Pro Gly l ie Pro Val

905 910 915

Asp Ala Asn Phe Tyr Lys Leu l ie Gin Asn Gly Phe Lys Met Asp

920 925 930

Gin Pro Phe Tyr Ala Thr Glu Glu l ie Tyr l ie l ie Met Gin Ser

935 940 945

Cys Trp Ala Phe Asp Ser Arg Lys Arg Pro Ser Phe Pro Asn Leu

950 955 960

Thr Ser Phe Leu Gly Cys Gin Leu Ala Asp Ala Glu Glu Ala Met

965 970 975

Tyr Gin Asn Val Asp Gly Arg Val Ser Glu Cys Pro His Thr Tyr

980 985 990

Gin Asn Arg Arg

994 配列番号： 1 8

配列の長さ： 986

配列の型：アミノ酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状 0

08 ΐ 9 ΐ 02. ΐ

dsv UIO usv ηΐθ 3JV 9Md J OJJ Sjy SJV naq J J

99 ΐ 091 99 ΐ

Π9Ί na J¾ usy 3JV 9Π s J¾ d na 9Π J¾ J usv

09 ΐ 9^ΐ OH

BIV nio -I9S «10 911 9Md nai na JAJ, nio ^10 ^IV "10 J 1

SST 081 93 ΐ

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02 ΐ 9ΐΐ 0Π

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90ΐ 00 ΐ 96

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06 98 08

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9Z O 99

\n H S s uio 0Jd SJV ns ¾iv s naq dsy

09 99 09

o J9S nio J3S OJJ i J9S J3S J9S sAq λιο 1¾Λ

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J9S dsy usv usv sA STH usy an 八 s sA an Λ OJ^ OS 92 03

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9ΐ Οΐ 9 ΐ

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L99£0IL6drilDd 808厶 1/86 OAV ΐ

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09S 99S 098

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9^8 0 9δδ

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91S OIS 90S

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0Z2 992 092

911 dJi na ojj nio A19 八 sA na si uio o^jd naq J¾

3 092 9^2

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0 982 082

nio 3JV ^ΐθ "si "ΐθ usv 3JV BIV SAQ s 3jy 911 dsv ^10

923 0 9Ϊ3

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0\Z 902 002

S nio nio sA SAQ S nio ^IO ^u dsy SAQ Ι¾Λ 丄

96 ΐ 061 98 ΐ

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L99£QIL6d£/13d 808IT/86 OAV 0i,9 999 099

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999 099 9^9

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89 0S9

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nio sAQ J9S JMl λΐθ

usy J j, BJV SXQ s sXq Ϊ¾Λ na 019 909 003

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d uio ^IO s^l 3JV usy BIV sAi 8JV usy d Λ ^IO 08 S L

nio 311 nio "ΐθ ^J SAQ USV OJd J9S sAq dsy J8S SAQ sA 99^ 09^ 99^

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BIV UIO J3S BIV s BlV nio BIV na Ι¾Λ UIO 。 sAq SJV 3JV

SS OS^ S

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90^ 00^ 968

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068 388 08S

9Md J9S sA 8JV J9S 9Md J 1 dJl JM1 s 8jy 911 uio OJd i Jf/IDd 808ム 1/86 O . ε

99 09 99

91 1 uiO dsv J9S dsy Jd S IH 9] 1 ui "10

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09Z S L

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98Z ΟδΖ 93Z

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OZL 9U OU

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90A 00丄 969

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069 989 089

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naq nio ^J9S WW naq ¾iv n|Q 3jy ni ^J9S ^J9S dsy ¾1V sA nio 099 999 099

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J3S 3^9 0^9 9S9

911 ^ΐθ ¾IV JMl BIV usv Λ s XiO 9Md ¾IV ^ΐθ J9S 0S9 329 029

人 Π9Ί Ι¾Λ sAq λιο aqd nio "91 usv "ΐθ 3JV OJd aqj nio ^ά 9ΐ9 0ΐ9 909

sAq ηθ dsv J nio ^J人 1 "10 3jy 9Md dsy 9Md nig djj, sAq na

009 969 069

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989 089 9 9

J9S s Xio JMJ, uio 1¾Λ j¾ ui Μ' J9$ ^NI0

L99£0/L6a£/13d 謹" /86 OAV 096 996 996

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9^6 Οί^6 986

s 3JV J8S dsy 9Md BIV dJi SAQ J8S iqj) an 8Π JXI an

0S6 326 026

nio nio J¾ ¾IV 1 9Md OJJ UIQ dsy s^l 9Md 人 13 usy UIQ

916 016 906

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006 968 068

usy 人 13 n9l J9S 9i 9i i niO ^{d n} n\ 3 J i J8S

988 088

dJl \U dsy J9S sAq an JMl JAl an Αΐθ 9i na Jas ni

0 8 998 098

o-id ¾IV dj sAq Ι¾Λ oJd naq 8jy ¾1V usv ^10 8jy Ι¾Λ Ι¾Λ

G98 098 8

JAI usy dsy -I3S 1⁹W 911 dsv 3JV ¾IV na Aio 9i)d dsy SXQ

0 8 9S8 088

3Ϊ Ι sAq Ι¾Λ ΙΒΛ sA Aio S IH JMl ΐ¾Λ naq ΐ¾Λ usv 3jy ¾IV ¾IV

928 028 9Ϊ8

Π9Π dsy 3JV S IH Ι¾Λ SAQ J8S s and na 9リ d nio 3

0Ϊ8 908 008

s ¾ιν Ι¾Λ UI9 ^J BIV 3Md S iQ ^{n n} dsy d J¾ naq

96 06 98Z

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021 9Z OLL

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L99ZQIL6i£ll d 808"/86 OAV 9

90 ΐ 001 96

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06 98 08

JiU an J9S BIV J3S dsy ΙΒΛ nio Ι¾Λ ¾IV ¾1V ¾1V n 丄

9Z OZ 99

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09 99 09

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Οϊ^ 38

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OS 93 02

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S86：圆

6 ΐ ：

986 086

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Λ 3JV ^IO dsv \n usv uio ^J BIV nio niO ¾IV dsy ¾IV

L99£0/L6drilDd 808"/86 OAV 9

008 963 062

nio 3 d 1 usv ^IO "10 ⁿ10 ¾IV sA usy na

982 082 913

¾ na 人 aqj Aio SIH usy ΐ¾Λ SIH Ι¾Λ ¾IV sAq s Sjy

02,2 392 092

9ii ^dJ>L naq OJJ nio ^IO ΐ¾Λ sA nsq aqj naq uio ^0Jd ⁿ

992 033 9^

JM1 uio OJd J¾ uio usv naq dsv 911 J¾ 9 d na 3JV 丄 s

0 3δ2 0δ2

nio 8JV ^10 "31 "ΐθ usy 3 V ¾IV S Q S 3JV an dsy JMl Aio 22 022 9Ϊ2

9Md ηθ nig SIH na 八 sXq sAq sAq Ι¾Λ 1¾Λ ¾IV OJd

OIZ 902 003

J9S niO ⁿI0 sAi J9S A191119 s dsy naq Ι¾Λ d

96 ΐ 061 981

niO U 3Π OJd nio OJd n s nio s 9Π s na ¾iv

081 3 Ϊ O l

dsv uiO usv nio δλη 3jy aqd J OJJ 3JV 3JV na Ji]i JAJ,

99 ΐ 09 ΐ 99 ΐ

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09 ΐ 9^ΐ OH

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naq dsy aqd SIH 0 uig SAQ usy na «195 jas STH sA si Ι¾Λ f ALCW 808"/% OAV L i

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0 S

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311 usv "31 3Md s jqi si uio ¾IV dsy dsy usy nio

0 S Οΐί'

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90^ OOl^ 968

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06S 988 088

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9 8 OZS 998

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09S 99S 098

niO J dsv nio s usy JMl ¾1V usv 9113Md ^ΐθ δλ Ai

S S 0 98S

i J l U n9l ¾IV s uio s OJJ SIH sAi Jas J9S s

OSS 928 028

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9ΐδ 018 908

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069 989 089

Biv lO Π9ΐ nan usv 1¾Λ 311 usv nio S|H J8S Aio naq u]Q J¾

9Z9 0 9 999

sAq na nig jas na B]y ^ηΐ98jy nio dd dsy

099 999 099

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9^9 0^9 989

JiU sAq J8S an Αΐ9 J ¾IV J ¾IV usv WW s λιο

0S9 9 029

BIV ^ΐθ J9S ^IO η9Ί ΙΒΛ s λιο 9qa nio neq usy ni V 。

9ΐ9 0Ϊ9 909

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009 969 063

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989 089 9Z9

J9S S ^10 JM1 UIO ΙΒΛ ui9 nan UIO S "ΐθ 丄

0Z9 999 099

3Md «10 SA1 sA JAi sAq STH s 3H na na J¾ na 八 Ι¾Λ

999 099 9^9

911 9Md Π8ΐ naq SAQ Ϊ¾Λ IQ 9]i jqi ¾iv J^i aqd J8S ΘΠ usy

0 S 989 0S9

dsv UIO 9Ϊ Ι 9Md oJd aqd ojj Aio OJJ jas usy na na an jqj,

929 02S 919

nio sAo J3S JM1 ^10 na J9S usy -IAJ, ¾iv SAQ S sA Ι¾Λ naq

019 90S 009

9iid Aio sAq 9ii ¾IV ⁿI3 s usy na J¾ s J9S S \n df/X3d[ 808.T/86 OAV 6 t

988 088 9Z8

J3S dJX Ι¾Λ dsv J3S SA 311 J 1 311 13 nio 3 d

08 998 098

n9l J9S niO OJd ¾iv 19N ^d sXq Ι¾Λ OJJ na Sjy ¾iv usy Aio

998 098 9^8

3JV 八 ΙΒΛ J usy J3S dsy ^J9S l^W θΐΐ dsy 3JV ¾IV na

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Phe Pro Asn Leu Thr Ser Phe Leu Gly Cys Gin Leu Ala Asp Ala

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Glu Glu Ala Met Tyr Gin Asn Val Asp Gly Arg Val Ser Glu Cys

965 970 975

Pro His Thr Tyr Gin Asn Arg Arg

980 983 配列番号： 2 0

配列の長さ： 986

配列の型：アミノ酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ぺプチド

配列：

Met Pro Ala Leu Ala Arg Asp Ala Gly Thr Val Pro Leu Leu Val

1 5 10 15

Val Phe Ser Ala Met l ie Phe Gly Thr l ie Thr Asn Gin Asp Leu

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配列の長さ： 2982

配列の型：核酸

鎖の数：二本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類： cDNA to mRNA

配列：

ATGCCGGCGT TGGCGCGCGA CGCGGGCACC GTGCCGCTGC TCGTTGTTTT TTCTGCAATG 60

ATATTTGGGA CTATTACAAA TCAAGATCTG CCTGTGATCA AGTGTGTTTT AATCAATCAT 120

AAGAACAATG ATTCATCAGT GGGGAAGTCA TCATCATATC CCATGGTATC AGAATCCCCG 180

GAAGACCTCG GGTGTGCGTT GAGACCCCAG AGCTCAGGGA CAGTGTACGA AGCTGCCGCT 240

GTGGAAGTGG ATGTATCTGC TTCCATCACA CTGCAAGTGC TGGTCGATGC CCCAGGGAAC 300

ATTTCCTGTC TCTGGGTCTT TAAGCACAGC TCCCTGAATT GCCAGCCACA TTTTGATTTA 360

CAAAACAGAG GAGTTGTTTC CATGGTCATT TTGAAAATGA CAGAAACCCA AGCTGGAGAA 420

TACCTACTTT TTATTCAGAG TGAAGCTACC AATTACACAA TATTGTTTAC AGTGAGTATA 480

AGAAATACCC TGCTTTACAC ATTAAGAAGA CCTTACTTTA GAAAAATGGA AAACCAGGAC 540

GCCCTGGTCT GCATATCTGA GAGCGTTCCA GAGCCGATCG TGGAATGGGT GCTTTGCGAT 600

TCACAGGGGG AAAGCTGTAA AGAAGAAAGT CCAGCTGTTG TTAAAAAGGA GGAAAAAGTG 660

CTTCATGAAT TATTTGGGAC GGACATAAGG TGCTGTGCCA GAAATGAACT GGGCAGGGAA 720

TGCACCAGGC TGTTCACAAT AGATCTAAAT CAAACTCCTC AGACCACATT GCCACAATTA 780

TTTCTTAAAG TAGGGGAACC CTTATGGATA AGGTGCAAAG CTGTTCATGT GAACCATGGA 840

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配列の長さ： 2949

配列の型：核酸

鎖の数：二本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類： cDNA to mRNA

配列：

ATGCCGGCGT TGGCGCGCGA CGCGGGCACC GTGCCGCTGC TCGTTGTTTT TTCTGCAATG 60 ATATTTGGGA CTATTACAAA TCAAGATCTG CCTGTGATCA AGTGTGTTTT AATCAATCAT 120 10VS S0VJJSVLV3ILV JVV3V0VVV

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配列の長さ： 21

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸（合成 DNA)

配列：

TGTCGAGCAG TACTCTAAAC A 21 配列番号： 2 7

配列の長さ： 22

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸（合成 DNA)

配列：

ATCCTAGTAC CTTCCCAAAC TC 22 配列番号： 2 8

配列の長さ： 18

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成 DNA)

配列：

CTTCCTGGGC ATGGAGTC 18 配列番号： 2 9

配列の長さ： 20

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸（合成 DNA)

配列：

CGCTCAGGAG GAGCAATGAT 20 配列番号： 3 0

配列の長さ： 19

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸（合成 DNA)

配列：

CAATTTAGGT ATGAAAGCC 19 配列番号： 3 1

配列の長さ： 19

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸（合成 DNA)

配列：

CAAACTCTAA ATTTTCTCT 19 配列番号： 3 2

配列の長さ： 21

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸（合成 DNA)

配列：

TGTCTTTGCA GGGAAGGTTA C 21 配列番号： 3 3

配列の長さ： 20

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸（合成 DNA)

配列：

GTACCTTTCA GCATTTTGAC 20

Claims

請求の範囲

1. 膜近傍部位（juxtamembrane)の塩基配列に縦列重複（tandem duplication ) を有する、レセプ夕一型プロテインキナーゼをコードする核酸。

2. レセプ夕一型プロティンキナーゼがレセプター型チロシンキナーゼである請求項 1記載の核酸。

3. レセプター型チロシンキナーゼが FMS様チロシンキナーゼ 3 (FLT 3 ) である請求項 2記載の核酸。

4. 膜近傍部位に配列表の配列番号： 1〜 5いずれかに記載のァミノ酸配列をコードする塩基配列を含む、請求項 1〜 3いずれか記載の核酸。

5. 膜近傍部位に配列表の配列番号： 6〜 1 5いずれかに記載の塩基配列を含む、請求項 1〜 3いずれか記載の核酸。

6. 配列表の配列番号： 1 6〜20いずれかに記載の FLT 3の縦列重複変異体をコ一ドする核酸。

7. 配列表の配列番号： 2 1〜25いずれかに記載の FLT 3の縦列重複変異体をコ一ドする塩基配列からなる核酸、又は該核酸とストリンジン卜な条件下でハイプリダイズする、膜近傍部位をコードする塩基配列に縦列重複を有する核酸。

8. 配列表の配列番号： 1〜5いずれかに記のアミノ酸配列をコードする縦列重複を含む核酸。

9 . 配列表の配列番号： 6〜1 5いずれかに記載の核酸、又は該核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、縦列重複を含む核酸。

1 0 . 請求項 1〜9いずれかに記載の核酸によりコードされるポリペプチド。

1 1 . 配列表の配列番号： 1〜5、 1 6〜2 0いずれかに記載のアミノ酸配列からなるポリべプチド。

1 2 . 配列表の配列番号： 1〜5、 1 6〜2 0いずれかに記載のアミノ酸配列において、 1又は 2以上のァミノ酸残基の欠失、置換又は付加の少なくとも 1つを生じさせ、かつ膜近傍部位の塩基配列に縦列重複を有する核酸によりコードされるポリべプチド。

1 3 . レセプター型プロテインキナーゼの膜近傍部位の塩基配列に生じた縦列重複を有する核酸によりコードされる部位に特異的に結合する抗体。

1 4 . レセプター型プロテインキナーゼの膜近傍部位の塩基配列に生じた縦列重複を有する核酸に特異的に結合する核酸。

1 5 . 工程 (a) ：ヒトの核酸試料を得る工程、

工程 (b) ：工程 (a) にて得られた核酸試料を遺伝子増幅反応に付して、レセプ夕一型プロティンキナーゼをコ一ドする核酸に存在しうる膜近傍部位の縦列重複を含む領域が増幅された核酸断片を得る工程、及び

工程 (c) ：工程 (b) の核酸断片について縦列重複の存在を調べる工程、を含む膜近傍部位の塩基配列に縦列重複を有するレセプター型プロティンキナーゼをコ一ドする核酸の検出方法。

1 6 . 急性骨髄性白血病の F A B (French-American-British)分類において、 M 2、 M 4又は M 5の診断に供することを特徴とする、請求項 1 5記載の検出方法。

1 7 . 膜近傍部位の塩基配列に縦列重複を有するレセプター型プロテインキナーゼをコードする核酸を検出するためのキットであって、レセプ夕一型プロティンキナーゼ遺伝子に存在しうる縦列重複を含む領域を増幅するためのプライマーを含むことを特徴とするキット。

1 8 . 急性骨髄性白血病の F A B (French-American-British)分類において、 M 2、 M 4又は M 5の診断に供されることを特徴とする、請求項 1 7記載のキッ h o

1 9 . 膜近傍部位の塩基配列に縦列重複を有するレセプター型プロテインキナーゼをコ一ドする核酸を検出するための、請求項 1〜 9いずれかに記載の核酸の使用。