WO1997033172A1 - Procedimiento de evaluacion de la capacidad global de una orina para formar calculos renales calcicos y su correspondiente kit - Google Patents

Procedimiento de evaluacion de la capacidad global de una orina para formar calculos renales calcicos y su correspondiente kit Download PDF

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Feliciano Grases Freixedas
Antonia Costa Bauza
Laura Garcia Ferragut
Juan Gabriel March Isern
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Universidad De Las Islas Baleares
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Definitions

  • PROCEDURE FOR EVALUATING THE GLOBAL CAPACITY OF A URINE TO FORM CALCIC RENAL CALCULATIONS AND ITS CORRESPONDING KIT TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION The present invention is inserted in the field of the study of the risk of calcium renal lithiasis, specifying in the development of a type system kit that allows to evaluate the capacity of formation of calcium crystals in a urine sample of any individual. STATE OF THE PRIOR ART OF THE INVENTION
  • kidney stones as is known, is due in almost all cases to the unfortunate combination of several factors. These factors can be classified into two large groups: I) factors inherent in the composition of urine. II) factors related to renal morphoanatomy.
  • Urine is a metastable medium in which various substances that can crystallize normally coexist forming stones (substances that are in a state of supersaturation). The crystallizing these substances depends on the degree of supersaturation, the presence of promoting substances (nucleating heterogé ⁇ seeded) and the presence of inhibitors cristaliza ⁇ tion. The presence of cavities with low urodynamic efficacy and, therefore, keep urine retained for prolonged times, and alterations of the epithelium that covers the renal papilla (reduced or eliminated glycosaminoglycan layer, necrosis ...) are factors linked to the renal structure that favor the formation of kidney stones.
  • kidney stones Normally, the existence of factors belonging to both groups is necessary for kidney stones to be generated.
  • the test presented allows you to evaluate precisely the ability of a urine determined to crystallize calcium salts, such that the urine of a healthy individual would not lead to the growth of calcium salt crystals, while urine with a tendency to form kidney stones (very supersaturated and / or with significant deficit of inhibition and / or abundant heterogeneous nucleating) would generate crystals of calcium salts.
  • the said method essentially comprises the following operations: (a) introducing the urine sample into a container that includes a substrate or flat solid surface initiating crystallization, at 37se for approximately 5-6 hours; (b) removing the substrate contenien ⁇ do crystals and dissolve in acidic medium; (c) evaluate the amount of calcium contained in said crystals.
  • the kit used to carry out this method comprises (1) a small container container of a substrate (2); (3) a container of the urine to be analyzed; (4) a container where the other container (1) is inserted; (5) a container, type test tube, in which dissolution of the crystals deposited in the substrate (2) occurs.
  • the applicant has continued researching on this method and this kit, getting both perfected, in order to achieve a kit of easy industrial distribution and simplified use by the user himself at his home, facing the need to carry out the analysis in laboratories specialized.
  • DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION refers to a procedure for assessing the overall ability of a urine to form calcium kidney stones and its corresponding kit.
  • All solutions should be kept between 2 and 8se. They should be brought to room temperature (20 to 30SC) 30 minutes before use.
  • the solutions of hydrochloric acid and arsenazo III are stable during the 90 days following their preparation when they are stored between 2 and 89C.
  • the sodium acetate solution is stable for 30 days when stored between 2 and 8SC.
  • the reaction units should be kept closed and at room temperature (from 20 to 309C).
  • the sample will be collected in a sterile 100 mL bottle. Urine should be emitted on an empty stomach, if possible, the first morning urination will be used and, failing that, the next one, always collected on an empty stomach. No additives or preservatives should be added to the collected sample.
  • the analysis procedure of the invention involves a series of steps that are schematized in Figure 2 and detailed below. l.- Label the reaction unit with the patient's identification.
  • the negative control is prepared on the well of a new reaction unit to which the previous protocol will be applied from step 6.
  • a positive, lithogenic urine will show a bluish color whose hue may vary from violet to blue.
  • a urine with a lithogenic risk close to the cut-off that is, at the limit of sensitivity of the test, will show a pink color with a slight bluish tone.
  • the clinical analysis laboratory can proceed to a quantitative interpretation of the results obtained. For this, it is sufficient to determine the absorbance of the colored solution at 650 nm against a target of double-distilled water using cuvettes of 1 cm of optical path. In this case the result will be expressed in calcium concentration (ug / mL and will be calculated according to the following equation:
  • [Calcium] B A B x [Calcium] std / A std where: [Calcium] is the calcium concentration of the sample.
  • A_ is the absorbance of the sample.
  • [Calcium] 8td is the calcium concentration of a standard solution.
  • a std is the absorbance of a standard solution.
  • the concentration of calcium in the colored solution can also be determined directly by atomic absorption spectrometry (AAS) or atomic emission spectrometry with inductively coupled plasma (ICP-AES). * For a non-lithogenic urine the concentration of calcium in the colored solution will be between 0 and 2 ⁇ g / mL.
  • the concentration of calcium in the colored solution will be between 2 and 3 ⁇ g / mL.
  • the lithogenic activity of an individual is not the same during every day of the year. There are times, such as during the summer, especially suitable for the development of kidney stones, and the influence of cycles should also be considered, such as the menstrual cycle that affects the elimination of citrate. It is therefore evident that for a lithiasic individual there may be seasons whose urine does not have lithiasic activity and others with activity. The application of the test will undoubtedly detect these periods.
  • the proposed trial allows a global assessment of urinary risk to form calcium stones. If the result is positive, it will indicate a clear predisposition of the urine to the form ⁇ tion of calcium stones, so that if you want to know more accurately the altered urinary factor or factors (hypercalciuria, hypocitraturia ...) it will be necessary ⁇ He laughed a more complete analytical study of urine. If the test result is negative and calcium stones are generated in the absence of urinary tract infection, it is a clear indication that the alteration that produces them basically lies in the renal morphoanatomic factors.
  • Figure 1 Represents the kit of the present invention, in which (1) corresponds to the container containing thymol, (2) corresponds to the well and (3) corresponds to the reaction substrate.
  • Figure 2 Represents an illustrative scheme of the test method of the present invention.
  • EXAMPLE 1 40mL of freshly emitted urine was taken and placed on the container plate, checking that the well was filled, covered and allowed to stand for 6 hours at 37SC.
  • the plate was carefully washed with 50mL of double-distilled water, being careful not to pour it directly on the reaction well, it was gently shaken for 5 seconds and the water was discarded.
  • EXAMPLE 2 The procedure described in Example 1 was repeated, using freshly emitted urine from another subject, which was kept in contact with the substrate for 12 h at room temperature. The coloration at the end of all the phases of the process was blue, indicative of a lithogenic urine.

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Abstract

El procedimiento comprende a) verter la orina recién emitida en una placa contenedora provista de un sustrato de reacción y dejarla en reposo durante: (i) 6h a 37 °C; o (ii) 12h a temperatura ambiente; o (iii) 24h a temperatura ambiente; b) desechar el contenido de la placa y lavar con agua bidestilada; c) dispensar el sustrato HC1 diluído, acetato sódico acuoso y una solución indicadora de arsenazo III y evaluar la reacción coloreada que se produce. El kit comprende una placa contenedora (1) conteniendo timol como esterilizante provista de una tapadera y en cuyo interior se encuentra un pocillo (2) conteniendo el sustrato de reacción (3). Aplicación en medicina para evaluar la capacidad de una orina para formar cálculos renales cálcicos.

Description

PROCEDIMIENTO DE EVALUACIÓN DE LA CAPACIDAD GLOBAL DE UNA ORINA PARA FORMAR CÁLCULOS RENALES CALCICOS Y SU CORRESPONDIENTE KIT CAMPO TÉCNICO DE LA INVENCIÓN La presente invención se inserta en el campo del estudio del riesgo de la litiasis renal calcica, concretándose en el desarrollo de un sistema tipo kit que permite evaluar la capacidad de formación de cristales calcicos en una muestra de orina de cualquier individuo. ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR A LA INVENCIÓN
La formación de cálculos renales, como es sabido, obedece prácticamente en todos los casos a la desafortunada combinación de varios factores. Estos factores pueden clasificarse en dos grandes grupos: I) factores inherentes a la composición de la orina. II) factores relacionados con la morfoanatomia renal.
La orina es un medio metaestable en el que normalmente coexisten diversas sustancias que pueden cristalizar formando cálculos (sustancias que se encuentran en estado de sobresaturación) . El que estas sustancias cristalicen depende del grado de sobresaturación, de la presencia de sustancias promotoras (nucleantes heterogé¬ neos) y de la presencia de inhibidores de la cristaliza¬ ción. La presencia de cavidades con baja eficacia urodinámica y que, por tanto mantienen retenida la orina durante tiempos prolongados, y las alteraciones del epitelio que recubre la papila renal (capa de glicosamino- glicanos reducida o eliminada, necrosis...) son factores ligados a la estructura renal que favorecen la formación de cálculos renales.
Normalmente, es necesaria la existencia de factores pertenecientes a ambos grupos para que se generen cálculos renales . El test que se presenta permite evaluar precisamente de forma muy simple la capacidad que posee una orina determinada para cristalizar sales calcicas, de tal manera que la orina de un individuo sano no daría lugar al crecimiento de cristales de sales calcicas, mientras que la orina con tendencia a la formación de cálculos renales (muy sobresaturada y/o con importante déficit de inhibición y/o abundantes nucleantes heterogéneos) generaría cristales de sales calcicas.
Como referencias bibliográficas estrechamente relacionadas con el objeto de la presente invención pueden mencionarse las siguientes: J.M. Baumann. How reliable are the measurements of crystallization conditions in uriñe?. Urol. Res. 16, 133-135 (1988); J.M. Baumann. How to measure crystallization conditions in uriñe: A comparasion of 7 methods. Report from a workshop held on November 28, 1987 in Basle. Urol. Res 16, 137-142 (1988); F. Grases, 0. Sóhnel. Mechanism of oxalocalcic renal calculi generation, Int. Urol. Nephrol. 25,209-214 (1993); F. Grases, A. Costa- Bauza, J.G. March, 0. Sóhnel, Artificial simulation of renal stone formation. Influence of some urinary compo- nents. Nephron 65, 77-81 (1993); F. Grases, A. Costa- Bauza, J.G. March. Artificial simulation of the early stages of renal stone formation. Brit. J. Urol. 74, 298- 301 (1994).
En la solicitud de patente principal N0- 9401455 se proponía un método para la determinación de la capacidad inhibidora de la cristalización en muestras de orina humana y su correspondiente kit.
El referido método comprende esencialmente las siguientes operaciones: (a) introducir la muestra de orina en un contenedor que incluye un sustrato o superficie sólida plana iniciadora de la cristalización, a 37se durante 5- 6 horas aproximadamente; (b) retirar el sustrato contenien¬ do los cristales y disolverlos en medio ácido; (c) evaluar la cantidad de calcio contenida en dichos cristales. El kit empleado para llevar a cabo este método comprende (1) un pequeño recipiente contenedor de un sustrato (2); (3) un contenedor de la orina a analizar; (4) un contenedor donde se encuentra introducido el otro contenedor (1); (5) un recipiente, tipo tubo de ensayo, en el que se produce la disolución de los cristales deposita¬ dos en el sustrato (2).
El solicitante ha continuado investigando sobre este método y este kit, consiguiendo perfeccionar ambos, para llegar a conseguir un kit de fácil distribución industrial y empleo simplificado por parte del propio usuario en su domicilio, frente a la necesidad de llevar a cabo el análisis en laboratorios especializados. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención, tal y como se indica en su enunciado se refiere a un procedimiento de evaluación de la capacidad global de una orina para formar cálculos renales calcicos y a su correspondiente kit.
Cuando una superficie no protegida y no renovada entra en contacto con una orina, más tarde o más temprano acaban cristalizando sobre ella aquellas sustan¬ cias que se encuentran sobresaturadas y cuya inhibición es más deficitaria. La facilidad con la que se produce esta cristalización depende de lo favorable que sea la combina- ción de factores que la impulsan. Así, utilizando una superficie adecuada es posible calcular un tiempo para el que una orina con una composición normal no cristalice, mientras que una orina litógena dé lugar al crecimiento de sales calcicas sobre la misma. La detección del calcio generado en estas condiciones se efectúa utilizando una reacción colorimétrica. En resumen, son dos las reacciones que participan en el procedimiento: una reacción de precipitación y una reacción de complejación.
R. de precipitación: Ca2+Oxalato/Fosfato > Oxalato/Fostato calcico R. de complejación: Ca(II) redisuelto + arsenazo iil→-Complejo azul PH=4,3 Para llevar a cabo el procedimiento de la presente invención se ha diseñado un kit que está represen¬ tado en la Figura 1 y que consta esencialmente de un recipiente contenedor conteniendo timol como esterilizante (1), dentro del cual se dispone un pocilio de reacción (2) en el que se encuentra situado el sustrato de reacción (3). Para la realización del test se precisan los siguientes reactivos (preparados en agua bidestilada con reactivos de máxima pureza):
- Unidades de reacción
- Solución acuosa de ácido clorhídrico 2,3 N. - Solución acuosa de acetato sódico anhidro 5% (p/v) .
- Solución acuosa de arsenazo III 0,1% (p/v).
Todas las soluciones deben conservarse entre 2 y 8se. Deben llevarse a temperatura ambiente (20 a 30SC) 30 minutos antes de su uso. Las soluciones de ácido clorhídrico y arsenazo III son estables durante los 90 días siguientes a su preparación cuando se conservan entre 2 y 89C. La solución de acetato sódico es estable durante 30 días cuando se conserva entre 2 y 8SC.
Las unidades de reacción deben mantenerse cerradas y a temperatura ambiente (de 20 a 309C) .
La recogida de la muestra se realizará en un frasco estéril de 100 mL. La orina debe emitirse en ayunas, a ser posible se utilizará la primera micción matutina y en su defecto la siguiente, recogida siempre en ayunas. No se deben añadir aditivos o preservativos a la muestra recogida.
Es fundamental que el ensayo se inicie con la orina recién emitida y aún caliente para evitar que se produzcan reacciones de precipitación debidas al enfria- miento de la orina. No deben utilizarse nunca muestras refrigeradas o congeladas.
El procedimiento de análisis de la invención conlleva una serie de etapas que se esquematizan en la Figura 2 y se detallan a continuación. l.- Rotular la unidad de reacción con la identificación del paciente.
2.- Verter 40 mL de orina recién emitida en la placa. Comprobar que el pocilio de reacción se llena de orina. Tapar. 3.- Dejar reposar durante: a) 6 h a 379C o l2 h a temperatura ambiente
(20 a 309C) b) 24 h a temperatura ambiente (20 a 30SC) 4.- Desechar el contenido de la placa contené¬ dora,
5.- Lavar cuidadosamente la placa con 50 mL de agua bidestilada. No verter el agua directamente sobre el pocilio de reacción. Agitar 5 segundos con un movimiento rotacional suave. Desechar el agua. 6.- Dispensar 400 μh de la disolución de ácido en el pocilio de reacción.
7.- Extender la solución por toda la superfi¬ cie mediante un movimiento suave pero continuo con una espátula de plástico. Prolongar esta operación durante unos 2 minutos.
8.- Dispensar 2,8 mL de la disolución de acetato en el pocilio de reacción.
9.- Dispensar 150 μL de la disolución del indicador en el pocilio de reacción. 10.- Mezclar con la espátula mientras se completa la reacción (aproximadamente 15 s).
11.- Interpretar el resultado cualitativa y/o cuantitativamente.
Se recomienda montar un control negativo diariamente como contraste para validar el resultado del test. El control negativo se prepara sobre el pocilio de una unidad de reacción nueva a la que se aplicará el protocolo anterior a partir del paso 6.
Una vez finalizado el ensayo se obtiene una solución coloreada. En función del color se evalúa el resultado cualitativamente como positivo o negativo.
* Una orina no litógena, negativa, mostrará un color rosa similar al del control negativo.
* Una orina litógena, positiva, mostrará un color azulado cuya tonalidad puede variar del violeta al azul .
* Una orina con un riesgo litógeno cercano al cut-off, es decir, al límite de sensibilidad del ensayo, mostrará un color rosa con un ligero tono azulado. En aquellos casos que se crea conveniente, el laboratorio de análisis clínico puede proceder a una interpretación cuantitativa de los resultados obtenidos. Para ello basta determinar la absorbancia de la solución coloreada a 650 nm frente a un blanco de agua bidestilada utilizando cubetas de 1 cm de camino óptico. En este caso el resultado se expresará en concentración de calcio (ug/mL y se calculará de acuerdo con la siguiente ecuación:
[Calcio]B = ABx [Calcio]std / Astd donde: [Calcio] es la concentración de calcio de la muestra.
A_ es la absorbancia de la muestra. [Calcio]8td es la concentración de calcio de una solución estándar.
Astd es la absorbancia de una solución están- dar.
También se puede determinar directamente la concentración de calcio en la disolución coloreada mediante espectrometría de absorción atómica (AAS) o espectrometría de emisión atómica con plasma acoplado inductivamente (ICP- AES). * Para una orina no litógena la concentración de calcio en la solución coloreada estará comprendida entre 0 y 2 μg/mL.
* Para una orina litógena la concentración de calcio en la solución coloreada estará comprendida entre 3 y 30 μg/mL. Raramente se han obtenido cristalizaciones por encima de 30 μg/mL.
* Para una orina con un riesgo litógeno cercano al cut-off, es decir, al límite de sensibilidad del ensayo, la concentración de calcio en la solución coloreada estará comprendida entre 2 y 3 μg/mL.
Los resultados obtenidos con la aplicación del ensayo muestran una excelente discriminación entre el grupo de individuos sanos y el grupo de pacientes con importante actividad litiásica y orinas alteradas, lo que demuestra la utilidad del ensayo para evidenciar la existencia de alteraciones urinarias que pueden conducir a la formación de cálculos renales. Es evidente que si se desea detectar de forma específica alguna alteración concreta, será preciso efectuar un estudio analítico más detallado de la orina.
Es importante resaltar que puede darse el caso de que una orina claramente litógena pertenezca a un individuo que nunca ha formado cálculos renales, debido a que los factores morfoanatómicos del riñon están especial¬ mente orientados a evitar el desarrollo de concreciones sólidas, por ejemplo, como consecuencia de la existencia de una capa de glicosaminoglicanoε (capa antiadherente) particularmente bien desarrollada. Puede darse también el caso contrario, en el que, una orina totalmente normal desde un punto de vista litógeno, pertenezca a un individuo claramente litiásico, lo que debe atribuirse a una situa¬ ción en la que los factores morfoanatómicos renales están claramente alterados, por ejemplo, por la presencia de una importante necrosis papilar, que favorecería la formación de cálculos renales. Debe considerarse también que la actividad litógena de un individuo no es la misma durante todos los días del año. Existen épocas, como por ejemplo durante el verano, especialmente adecuadas para el desarro- lio de cálculos renales, y también debe considerarse la influencia de ciclos, como el ciclo menstrual que afecta a la eliminación de citrato. Es por tanto evidente que para un individuo litiásico pueden existir temporadas cuya orina no presenta actividad litiásica y otras con actividad. La aplicación del ensayo permitirá detectar indudablemente dichos períodos .
En conclusión el ensayo propuesto permite efectuar una evaluación global del riesgo urinario para formar cálculos calcicos. Si el resultado es positivo, indicará una clara predisposición de la orina a la forma¬ ción de cálculos calcicos, de tal manera que si se desea conocer con más exactitud el factor o factores urinarios alterados (hipercalciuria, hipocitraturia... ) será necesa¬ rio un estudio analítico de la orina más completo. Si el resultado del test es negativo y se generan cálculos calcicos en ausencia de infección urinaria, es un claro indicio de que la alteración que los produce radica básicamente en los factores morfoanatómicos renales.
Por tanto la aplicación del ensayo presentará un especial interés para:
1) Mueεtreo rápido de pacientes con litiasis calcica con el fin de detectar aquellos individuos que presentan una orina alterada y que deben ser sometidos a un estudio urinario más completo. 2) Identificación de predisposición a la formación de cálculos renales calcicos en individuos con un importante factor de riesgo litógeno (por ejemplo, en casos de existencia de antecedentes familiares directos).
3) Evaluación de la eficacia de una determina- da terapia correctora del riesgo litógeno urinario. 4) Detección de períodos con actividad litógena acentuada.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1: Representa el kit de la presente invención, en la que (1) corresponde al contenedor conte¬ niendo timol, (2) corresponde al pocilio y (3) corresponde al sustrato de reacción.
Figura 2: Representa un esquema ilustrativo del método de ensayo de la presente invención. MODOS DE REALIZACIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención se ilustra adicionalmen- te, mediante los siguientes Ejemplos los cuales no preten¬ den ser limitativos de su alcance.
EJEMPLO 1 Se tomaron 40mL de orina recién emitida y se depositaron a la placa contenedora comprobando que se llenaba el pocilio, se tapó y se dejó reposar durante 6h a 37SC.
Transcurrido este tiempo se lavó cuidadosamen- te la placa con 50mL de agua bidestilada con precaución de no verterla directamente sobre el pocilio de reacción, se agitó suavemente durante 5 segundos y se desechó el agua.
Seguidamente se dispensaron 400 μh de una solución acuosa de ácido clorhídrico 2,3 N que se extendió cuidadosamente con espátula de plástico durante 2 minutos .
Después de ello se dispensaron 2,8 mL de una disolución acuosa de acetato sódico anhidro al 5% (p/v) y 150 μL del indicador. Se mezcló con la espátula durante 15 segundos y se observó formación de color rosa, indicativo de orina no litógena.
EJEMPLO 2 Se repitió el procedimiento descrito en el Ejemplo 1, empleando orina recién emitida de otro sujeto, la cual se mantuvo en contacto con el sustrato durante 12 h a temperatura ambiente. La coloración al final de todas las fases del proceso fue azul, indicativa de una orina litógena.

Claims

REIVINDICACIONES
1.- Procedimiento de evaluación de la capaci¬ dad global de una orina para formar cálculos renales calcicos, caracterizado porque comprende las siguientes operaciones: a) verter 40 mL de orina recién emitida en una placa contenedora, asegurando que se llene un pocilllo en su interior y que contiene el sustrato de reacción, tapar y dejar reposar durante: (i) 6h a 37SC; o (ii) 12 h a temperatura ambiente; o (iii) 24 h a temperatura ambiente; b) desechar el contenido de la placa, lavar con 50 mL de agua bidestilada y desechar el agua; c) dispensar 400 μL de una solución acuosa de HC1 diluida (2,3 N) y extenderla por toda la superficie del sustrato, seguidamente dispensar 150 μL de una solución acuosa de acetato sódico (5%, p/v) y 150 μL de una solución indicadora de arsenazo III (0,1%, p/v) y mezclar durante 15 segundos, tras lo cual se producirá una reacción coloreada que puede evaluarse cualitativa y/o cuantitativamente.
2. Kit para llevar a cabo el procedimiento de evaluación de la capacidad global de una orina para formar cálculos renales calcicos, descrito en la reivindicación 1, caracterizado porque comprende una placa contenedora conteniendo timol como esterilizante (1) provista de tapadera, en cuyo interior se encuentra un pocilio (2) conteniendo el sustrato de reacción (3).
PCT/ES1996/000237 1996-03-08 1996-12-11 Procedimiento de evaluacion de la capacidad global de una orina para formar calculos renales calcicos y su correspondiente kit WO1997033172A1 (es)

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