WO1996036880A1 - Procede de detection et/ou de quantification de ligands specifiques d'une pathologie liee a une reaction allergique ou auto-immune ou du cancer du poumon - Google Patents

Procede de detection et/ou de quantification de ligands specifiques d'une pathologie liee a une reaction allergique ou auto-immune ou du cancer du poumon Download PDF

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WO1996036880A1
WO1996036880A1 PCT/BE1996/000052 BE9600052W WO9636880A1 WO 1996036880 A1 WO1996036880 A1 WO 1996036880A1 BE 9600052 W BE9600052 W BE 9600052W WO 9636880 A1 WO9636880 A1 WO 9636880A1
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WO
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allergic
ligands
major
antigen
allergen
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PCT/BE1996/000052
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Jean Duchateau
Georges Casimir
Geneviève SERVAIS
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Universite Libre De Bruxelles
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/564—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for pre-existing immune complex or autoimmune disease, i.e. systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, rheumatoid factors or complement components C1-C9
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    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting and / or quantifying specific ligands of a pathology linked to an allergic or autoimmune reaction or of lung cancer, an immunoreactive complex, one or more epitopes of an allergen, the antibody directed against said immunoreactive complex or against said epitopes, a detection device and / or a pharmaceutical, cosmetic and / or food composition containing said immunoreactive complex, said epitopes and / or said antibody.
  • the present invention also relates to the use of said complex, said epitopes and said antibody for the prevention and / or therapy of pathologies linked to an allergic or autoimmune reaction or of lung cancer. Technological background and state of the art underlying the invention.
  • Allergy is a hypersensitivity reaction caused by contact with an allergen. Allergy in humans is dependent on genetic predispositions, but various environmental factors can influence the development of allergic manifestations.
  • Respiratory allergic manifestations (asthma, hay fever, ...) or cutaneous (hives, eczema, ...) or digestive, nervous, renovesical, cardiac, articular, ocular manifestations can be due to absorption or in contact with the handling of products of animal origin (hair), plants (wood dust, textile fibers, pollen, %) or chemicals (antibiotics, neuroleptics, ).
  • the immune reaction to certain allergies is one of the forms of allergy including immediate hypersensitivity.
  • the allergic immune reaction involves class E immunoglobulins (IgE).
  • the complex formed between specific allergens and IgEs fixed on basophil cells induces the release of molecules such as histamine, serotonin, heparin, etc., which can in particular cause prolonged constriction of the muscle cells of the bronchi ( Hood et al., Immunology, second edition, of Benjamin / Cumming Publishing Corporation, Inc. (1984)).
  • class of immunoglobulins such as IgM, IgA and IgG.
  • class G immunoglobulins are, unlike class E immunoglobulins, present in greater amounts in a patient, especially in young children.
  • Class G immunoglobulin pools (characterized by a long half-life) can therefore be more easily detected.
  • the present invention aims to develop a new method and a new device for detecting and / or quantifying ligands specific for a pathology linked to an allergic or autoimmune reaction or to lung cancer.
  • a particular aim of the present invention is to develop said method and said device which could be used in the diagnosis of patients who may presently have low productions of class E immunoglobulins.
  • the present invention also aims to provide a pharmaceutical, cosmetic and / or food composition intended to modify the immune response of a patient vis-à-vis an allergen and / or for the treatment and / or prevention of linked syndromes.
  • immune pathology especially allergies, autoimmune diseases and / or lung cancer.
  • a further aim of the present invention is to use said composition prophylactically and / or therapeutically to modify the humoral and / or cellular immune response of a patient vis-à-vis an allergen, in particular if the patient is a new born.
  • i ; i g m " "nt; a characteristics of the invention.
  • the present invention relates to a new method for detecting and / or quantifying ligands specific for a pathology chosen from the group consisting of pathologies linked to an allergic or autoimmune reaction and lung cancer, said ligands being present in a body fluid of a patient (such as serum or cerebrospinal fluid), said method comprising the following steps: - a sample of the patient's body fluid is taken, the ligands present in l are reacted in a competition test sample with other ligands discriminable with respect to the ligands present in the sample, said ligands discriminable reacting with at least one antigenic structure (preferably fixed on a solid support) specific for said pathology, and detecting and / or quantifying l inhibition of the reaction between the discriminable ligands and the specific antigenic structure of the pathology, by the es ligands present in the sample.
  • a body fluid of a patient such as serum or cerebrospinal fluid
  • pathologies linked to an allergic or autoimmune reaction means immediate or delayed type hypersensitivity reactions caused by contact with an allergen. This reaction can be immediate and specific (anaphylaxis, hives, ...) or delayed over time.
  • This pathology also includes autoimmune diseases and / or infections leading to a disorder of the immune system.
  • Autoimmunity is a state of immunization of a subject against its own constituents.
  • the production by an organism of antibodies directed against its own constituents has been observed in a certain number of pathologies, such as infections linked to SLE (Systemic Lupus Erythematosus disease), Gougerot-Sjôgren syndrome (or Sjôgren pathology), polyarthritis rheumatoid, etc.
  • diseases having these characteristics are also pathologies such as sarcoidosis and osteopenia, spondylarthritis, scleroderma, multiple sclerosis, amyotrophic lateral sclerosis, hyperthyroidism, Addison's disease, autoimmune haemolytic anaemia, Crohn's disease, Goddpasture syndrome , Graves' disease, Hashimoto's thyroiditis, idiopathic purpura haemorrhagica, insulin-dependent diabetes, myasthenia, pemphigus vulgaris, pernicious anaemia, poststreptococcal glomerulonephritis, psoriasis and spontaneous sterility.
  • pathologies such as sarcoidosis and osteopenia, spondylarthritis, scleroderma, multiple sclerosis, amyotrophic lateral sclerosis, hyperthyroidism, Addison's disease, autoimmune haemolytic anaemia, Crohn'
  • This pathology can also be a hyperproliferation syndrome, in particular lung cancer.
  • the ligands are chosen from the group consisting of APC cells (Antigen Presenting Cell_ such as macrophages, dendritic cells), receptors of APC cells, antibodies (monoclonal or polyclonal) as well as their fragments (Fab portions antibodies) and / or a mixture of them.
  • APC cells Antigen Presenting Cell_ such as macrophages, dendritic cells
  • receptors of APC cells antibodies (monoclonal or polyclonal) as well as their fragments (Fab portions antibodies) and / or a mixture of them.
  • the ligands according to the invention are class G immunoglobulins.
  • ligands discriminable with respect to the ligands present in the sample means ligands different from those present in the sample and which are capable of being identified and / or selectively quantified by different chemical or physical means. Such means can for example be a marking of said ligands using a radioactive, enzymatic, chemoluminescent, bioluminescent, or biochemical (biotin) marker. Said ligands can also be ligands specific for an animal species.
  • the ligands according to the invention are class G immunoglobulins.
  • the ligands are class Y immunoglobulins purified from chicken egg yolk.
  • the detection and / or quantification method according to the invention using discriminable ligands (chicken egg yolk IgY) which are reacted on an antigenic structure (for example an allergen ) fixed on a solid support specific for said pathology, said IgY saturating the antigenic structure.
  • the ligands present in the sample are then reacted in a competition test, for example a serum from a sick patient or from a healthy patient, comprising in particular immunoglobulins with said IgY extracted from chicken egg.
  • the test serum it is also possible to add additional IgY immunoglobulins extracted from chicken egg to the test serum. Then, the inhibition of the cross-reaction between the discriminable ligands, that is to say the IgY extracted from the chicken egg, and the specific antigenic structure of the pathology (for example a allergen tested), by the ligands present in the sample (i.e. the immunoglobulins present in the serum of the patient tested).
  • the antigenic structure is an allergen chosen from the group consisting of major allergens present in cow's milk, in particular bovine ⁇ -lactoglobulin (BLG), the major antigens involved in allergic phenomena vis-à-vis plants, (in particular pollen allergens), animals (in particular allergens present in animal hair, allergens from animal venoms, the mite antigen present in household dust, the antigens responsible for the mite allergy, staphylococcal enterotoxin B, or several epitopes of these allergens and / or a mixture of them as described in the publication ISBN 91-970475-5-4 Pharmacia AB incorporated herein by reference.
  • BLG bovine ⁇ -lactoglobulin
  • the antigenic structure is an antigenic complex specific for an autoimmune disease.
  • this antigenic structure is a specific marker for lupus (SLE) or Sjôgren's pathology, in particular the plasma membrane or a portion of this membrane containing DNA membrane and having a weight greater than 100 KD, as described in particular in patent application PCT / BE95 / 00100, the filing number of which is incorporated by reference.
  • This antigenic structure can also be an allergen presented at the level of a mucosa used according to the invention in the diagnosis of lung cancer.
  • the present invention also relates to an immunoreactive complex comprising at least one allergen linked to a ligand, optionally labeled, which reacts specifically against this allergen.
  • immunosorbent complex means a specific bond between the allergens or the antigenic complexes specific to a pathology linked to an autoimmune reaction, and the specific ligands previously described, capable of being used in a detection device and / or quantification of specific ligands of the pathology linked to an allergic response.
  • Another aspect of the present invention relates to allergenic epitopes specific for a syndrome linked to an allergic response, in particular the allergenic epitopes of the bovine ⁇ -lactoglobulin antigen.
  • BSG allergenic epitopes of the DRP1 antigen (Major Mite Fecal lergene) and the allergenic epitopes of the major LolPl antigen of Lolium Perenne as described in FIGS. 34 and 35 respectively .
  • the present invention relates. also the antibody (monoclonal or polyclonal) directed against said immunoreactive complex or said allergenic epitopes according to the invention.
  • Another aspect of the invention relates to the device for detecting and / or quantifying a ligand specific for said pathologies, comprising said complex, said epitopes and / or said antibody according to the invention.
  • the device according to the present invention further comprises reagents intended for the detection and / or quantification of said ligands by a method chosen from the group consisting of recognition by antibodies labeled, isotopically or non-isotopically, on a filter , on solid support, on gel, in solution, in “sandwich”, by double immunodiffusion, by counter-immunoelectrophoresis, by hemagglutination and / or a mixture of them.
  • the present invention also relates to a pharmaceutical, cosmetic and / or food composition intended to modify the humoral and / or cellular immune response of a patient with respect to an allergen, comprising said allergen, one or more epitopes of said allergen, the immunoreactive complex according to the invention, the antibody directs against this complex and / or a mixture of them.
  • modification of the humoral and / or cellular immune response of a patient vis-à-vis an allergen means the modification of the pool of antibodies reacting specifically against certain allergic epitopes, c that is, the ability for a patient to have an antibody production comparable to that of a healthy subject as diagnosed in the examples of the description.
  • the patient is a newborn and the composition is administered to the mother before and / or during pregnancy or breastfeeding.
  • a final aspect of the present invention relates to the use of said pharmaceutical composition for the preparation of a medicament intended to modify the humoral and / or cellular immune response of a patient towards an allergen and / or for the treatment and / or prevention of pathologies linked to an allergic response, in particular the treatment and / or prevention of allergies and / or cancers.
  • the patient is a newborn and the composition is administered to the mother before or during pregnancy or breastfeeding.
  • the composition is administered to the mother before or during pregnancy or breastfeeding.
  • Figures 1 to 7 show the influence of oral administration of a milk hydrolyzate on the immune response of an adult individual to ⁇ -lactoglobulin.
  • FIGS. 8 and 9 represent the modulation of the anti- ⁇ -lactoglobulin antibody response in newborns as a function of their mother's milk supply.
  • FIGS. 10 to 12 represent the measurement of the inhibition of a pool of IgG immunoglobulins labeled by the serum of healthy patients and intolerant to a particular allergen.
  • FIG. 13 represents the measurement of the inhibition of a monoclonal antibody labeled by the serum of a healthy patient and intolerant to an allergen.
  • FIGS. 14 to 16 represent the specific recognition of certain linear epitopes of the allergen BLG by pools of immunoglobulins of serum from healthy patients suffering from allergy or from lung cancer,
  • FIGS. 17 to 31 represent the measurement of the inhibition of a pool of IgG immunoglobulins labeled by the serum of healthy patients and intolerant to a particular allergen (SEB antigen of staphylococcal enterotoxin, DPT antigen specific for mite allergy, Gl and LolP1 antigens specific for pollen allergy from J ⁇ ntoxanthum odoratum and Lolium Perenne and major wasp venom antigen).
  • SEB antigen of staphylococcal enterotoxin DPT antigen specific for mite allergy
  • Gl and LolP1 antigens specific for pollen allergy from J ⁇ ntoxanthum odoratum and Lolium Perenne and major wasp venom antigen SEB antigen of staphylococcal enterotoxin, DPT antigen specific for mite allergy, Gl and LolP1 antigens specific for pollen allergy from J ⁇ ntoxanthum odoratum and Lolium Perenne and major wasp ve
  • FIG. 32 represents the measurement of the inhibition of a pool of IgG obtained from a healthy individual fixed on a specific antigenic complex of lupus and possibly of Sjôgren by different sera from patients suffering from the pathology of lupus, from pathology of Sjôgren and healthy patients at different dilutions of sera.
  • FIG. 33 represents the measurement of the inhibition of a pool of IgG from patients suffering from the symptoms of lupus fixed on a specific antigenic complex of lupus and / or Sjôgren by sera from patients suffering from the symptoms of lupus, symptoms of Sjôgren or healthy patients at different dilutions of serum.
  • FIG. 34 and 35 represent the specific recognition of certain linear epitopes of the allergens DRP1 and LolP1 by pools of serum immunoglobulins from healthy patients or from allergic patients.
  • FIG. 36 represents the inhibition of the binding of discriminable antibodies (IgY purified from chicken egg yolk) to the BLG antigen complex by IgG antibodies of different sera.
  • anti-BLG IgG response (and IgA) is directed against epitopes which differ partially between symptomatic allergic subjects and cured or healthy subjects.
  • mice of three distinct strains one domestic, the other BalbC and C57B1 fed without milk for at least 5 generations and 6 weeks old were divided into equal groups of 8 animals and subjected to different diets (see figure 1).
  • the IgG and IgM antibodies are measured on day 0 (start of whole milk at 1/3) and 30 days later against ⁇ -lactoglobulin (BLG) as a representative of the allergenicity of milk, by a method of ELISA, using intact BLG (n-BLG in its native state) and peptides obtained by pepsin digestion of BLG (d-BLG) (see figs. 2 to 7).
  • mice to the milk hydrolyzate clearly influences the IgM and IgG response vis-à-vis the ⁇ -lactoglobulin; this depends on the selected strain and therefore indicates genetic determinism; finally, the specificity of the antibodies is thus modifiable since the titers measured on n-BLG and d-BLG do not vary in parallel, thus indicating a different modulation according to the category or the type of epitopes (here, conformational; versus structural) ; this is observed for IgM (short half-life) (see figs. 2 and 3) but already observable also for IgG (see figs. 5 and 6).
  • mice Modulation of the anti-BLG antibody response of young mice at weaning depending on their mother's milk supply. In this same model, whole milk is administered at the concentration of l / l or 1/30 in drinking milk to mice of reproductive age and belonging to the domestic strain. Antibodies of mice are measured at 4 weeks of age, taking into account the time between the start of the maternal diet and the date of birth (and therefore conception) (see figs. 8 and 9).
  • cow's milk ⁇ -lactoglobulin used as an allergen is fixed on a solid support.
  • Groups of individuals are identified by a competition test between labeled immunoglobulins (these immunoglobulins are fixed to biotin and revealed by the reaction of a peroxidase enzyme linked to polystreptavidin) and patient sera (ELISA test) .
  • the serum of 44 healthy individuals (tolerant CM) and 44 individuals with intolerance to cow's milk (intolerant CM) was analyzed.
  • a competition test was also carried out using competition between monoclonal antibodies from M7 mice labeled as above and sera from patients.
  • Figure 13 gives the result of this competition test which identifies healthy individuals (44 tolerant CM and 65 blood donors (BD)) and the 44 individuals with intolerance to cow's milk (intolerant CM).
  • the Applicant has sought to identify the specific linear epitopes of the BLG allergen capable of reacting with immunoglobulins G present in the serum of cancer patients.
  • Octapeptides composing a successive sequence of 8 amino acids are synthesized on a solid phase. the order of the primary structure of the BLG.
  • peptides are revealed which have made it possible to fix biotinated immunoglobulins G and originating from a pool of 12 subjects, who are either allergic to milk, or normal, or suffering from lung cancer.
  • FIGS. 13 to 15 The binding of the antibodies is revealed by streptavidin coupled to ⁇ -galactosidase (see FIGS. 13 to 15).
  • streptavidin coupled to ⁇ -galactosidase see FIGS. 13 to 15.
  • certain particular epitopes are identified which are recognized only by pools of immunoglobulins from a serum of patients suffering from lung cancer or only recognized by the immunoglobulins present in the serum of a patient allergic to milk.
  • FIG. 30 shows that allergic subjects (in danger) are distinguished from healthy subjects and from desensitized subjects by their ability to better inhibit IgG from allergics.
  • the subjects who presented only local syrriptomes are similar to the control subjects.
  • SLE systemic lupus erythematosus
  • FIG. 33 shows that normal subjects inhibit antibody binding better than sick subjects (SLE and Sjôgren vs normal: p ⁇ 0.05: anova + Scheffe) although they have titers of significantly lower antibodies.
  • the method according to the invention also makes it possible to discern with fine specificity the recognition of particular epitopes on membrane DNA molecules by autoantibodies as a function of the clinical state (patients or not).
  • FIG. 36 represents the inhibition of the binding of IgY obtained from chicken egg yolk to the BLG antigenic complex by IgGs originating from different sera
  • the IgYs which can be discriminated specifically against human antibodies are extracted and purified from the egg yolk of hens, said hens being either normal without having been fed with milk (egg type I), or having been immunized per os with milk by administration of milk (egg type II).
  • the cosmetic composition according to the invention can be applied in the form of a cream directly to the patient's skin.
  • Certain derivatives according to the invention can also be incorporated in the oily phase of the cosmetic composition instead of being dissolved in the aqueous composition.
  • the specifically allergic epitopes obtained from the primary structure of the BLG is added to a yoghurt drink with lactic ferments, a skimmed milk substitute as well as fat obtained after pasteurization in a plate heat exchanger and after incubation in vats at 45 ° C for about 4 hours under brewing.
  • composition comprising the epitopes or the immunoreactive complex according to the invention.
  • the epitopes or the immunoreactive complex according to the invention The epitopes or the immunoreactive complex according to
  • a pharmaceutical vehicle suitable for oral administration for example in the form of tablets, coated or not, pills, capsules, solution, essential oil and / or syrup.
  • a pharmaceutical vehicle suitable for oral administration for example in the form of tablets, coated or not, pills, capsules, solution, essential oil and / or syrup.
  • other pharmaceutical vehicles can be used depending on the mode of administration chosen.
  • composition according to the invention is prepared according to the methods generally used by those skilled in the art, in particular by pharmacists, and can comprise any pharmaceutically suitable vehicle or adjuvant, solid or liquid and non-toxic.
  • the incorporation of the epitopes or of the immunoreactive complex according to the invention in a galenical medium can also be envisaged.
  • the percentage of active product in the pharmaceutical vehicle can vary according to very wide ranges, only limited by the tolerance or the level of acceptance of the product by the patient. The limits are generally determined by the frequency of administration and the method of administration to the patient (intravenous, oral, etc.).

Abstract

La présente invention concerne un procédé de détection et/ou de quantification de ligands spécifiques d'une pathologie choisie parmi le groupe constitué par les pathologies liées à une réaction allergique ou auto-immune et le cancer du poumon, et présents dans un fluide corporel d'un patient, caractérisé en ce que: on prélève un échantillon du fluide corporel du patient, on fait réagir dans un test de compétition les ligands présents dans l'échantillon avec d'autres ligands discriminables, lesdits ligands discriminables réagissant avec au moins une structure antigénique spécifique de ladite pathologie, et on détecte et/ou quantifie l'inhibition de la réaction entre les ligands discriminables et la structure antigénique spécifique de la pathologie, par les ligands présents dans l'échantillon.

Description

PROCÉDÉ DE DÉTECTION ET/OU DE QUANTIFICATION DE LIGANDS SPÉCIFIQUES D'UNE PATHOLOGIE LIÉE A UNE RÉACTION ALLERGIQUE OU AϋTO-IMMONE OU DTJ CANCER DU POUMON
Obiet de l'invention.
La présente invention concerne un procédé de détection et/ou de quantification de ligands spécifiques d'une pathologie liée à une réaction allergique ou auto- immune ou du cancer du poumon, un complexe immunoreactif, un ou plusieurs épitopes d'un allergène, l'anticorps dirigé contre ledit complexe immunoreactif ou contre lesdits épitopes, un dispositif de détection et/ou une composition pharmaceutique, cosmétique et/ou alimentaire contenant ledit complexe immunoreactif, lesdits épitopes et/ou ledit anticorps.
La présente invention concerne également l'utilisation dudit complexe, desdits épitopes et dudit anticorps pour la prévention et/ou la thérapie de pathologies liées à une réaction allergique ou auto-immune ou du cancer du poumon. Arrière-plan technologique et état de la technique à la base de l'invention.
L'allergie est une réaction d'hypersensibilité provoquée par le contact avec un allergène. L'allergie chez les êtres humains est dépendante de prédispositions génétiques, mais différents facteurs environnementaux peuvent influencer le développement des manifestations allergiques.
Les manifestations allergiques respiratoires (asthme, rhume des foins, ...) ou cutanées (urticaire, eczéma, ...) ou des manifestations allergiques digestives, nerveuse, réno-vésicales, cardiaques, articulaires, oculaires peuvent être dues à l'absorption ou au contact par manipulation de produits d'origine animale (poils) , végétale (poussière de bois, fibres textiles, pollen, ...) ou de produits chimiques (antibiotiques, neuroleptiques, ...).
En outre, de nombreuses études cliniques ont suggéré une relation entre la réaction d'hypersensibilité et le cancer, en particulier entre l'atopie respiratoire et le cancer des surfaces mucosales (Meers P. D., Allergy and Cancer, Lancet 1983, 1, pp. 884 - 885).
La réaction immunitaire vis-à-vis de certaines allergies telles que l' naphylaxie ou l'atopie, est une des formes d'allergie incluant une hypersensibilité immédiate. La réaction immunitaire allergique implique les immunoglobulines de classe E (IgE) .
Le complexe formé entre les allergènes spécifiques et les IgE fixés sur des cellules basophiles induit la libération de molécules telles que l'histamine, la sérotonine, l'héparine, ... , qui peuvent notamment provoquer la constriction prolongée des cellules musculaires des bronches (Hood et al., Immunology, deuxième édition, de Benjamin/Cumming Publishing Corporation, Inc. (1984)).
Différentes techniques ont été proposées pour diagnostiquer la présence d'anticorps de type IgE à 1'encontre de certains allergenes spécifiques (allergenes impliquée dans la réaction allergique vis-à-vis des pollens, des poils de chat et de chien, ...) (Pharmacia - Cap System ®, Phadebas RJIST ®, Phadezym RAST ®, ...).
Cependant, il apparaît que d'autres classes d'anticorps réagissent également spécifiquement vis-à-vis de certains allergenes (classe d'immunoglobulines de type IgM, IgA et IgG) .
En outre, il est à noter que les immunoglobulines de classe G sont, contrairement aux immunoglobulines de classe E, présentes en plus grande quantité chez un patient, en particulier chez les enfants en bas âge.
Les pools d'immunoglobulines de classe G (caractérisés par une demi-vie de longue durée) peuvent donc être plus facilement détectés.
De nombreux travaux ont été également effectués sur les allergenes et sur des épitopes particuliers de ceux-ci. Ainsi, des travaux ont été réalisés sur les allergenes présents dans le lait de vache.
En particulier, il a été reconnu qu'il était possible d'obtenir une tolérance des enfants en bas âge vis- à-vis du lait en utilisant à titre de produit diététique des extraits d'un hydrolysat de protéines du lait de vache.
Dans la demande de brevet EP-0 629 350, on décrit l'utilisation d'un hydrolysat de protéines de lait pour la préparation d'une composition diététique permettant l'induction d'une tolérance au lait de vache pour des enfants susceptibles de développer une allergie au lait de vache. Cet hydrolysat de lait dépourvu de protéines allergeniques est obtenu en soumettant les allergenes à un traitement par trypsine et chymiotrypsine en présence d'une élastase. Selon ce document, on démontre que les enfants traités seraient devenus tolérants vis-à-vis du lait de vache par le fait qu'ils présenteraient une réaction immunitaire cellulaire atténuée.
Buts de l'invention.
La présente invention vise à mettre au point un nouveau procédé et un nouveau dispositif de détection et/ou de quantification de ligands spécifiques d'une pathologie liée à une réaction allergique ou auto-immune ou du cancer du poumon.
Un but particulier de la présente invention vise à mettre au point ledit procédé et ledit dispositif qui pourraient être utilisés dans le diagnostic de patients qui présenteraient éventuellement de faibles productions en immunoglobulines de classe E.
La présente invention vise également à fournir une composition pharmaceutique, cosmétique et/ou alimentaire destinée à modifier- la réponse immunitaire d'un patient vis- à-vis d'un allergène et/ou pour le traitement et/ou la prévention de syndromes liés à une pathologie immunitaire, en particulier les allergies, les maladies auto-immunes et/ou le cancer du poumon.
Un but complémentaire de la présente invention vise à utiliser ladite composition de manière prophylactique et/ou thérapeutique pour modifier la réponse immunitaire humorale et/ou cellulaire d'un patient vis-à-vis d'un allergène, en particulier si le patient est un nouveau-né. i;igm«=»nt;a caractéristiques de l'invention.
La présente invention concerne un nouveau procédé de détection et/ou de quantification de ligands spécifiques d'une pathologie choisie parmi le groupe constitué par les pathologies liées à une réaction allergique ou auto-immune et le cancer du poumon, lesdits ligands étant présents dans un fluide corporel d'un patient (tel que le sérum ou le liquide céphalo-rachidien) , ledit procédé comprenant les étapes suivantes : - on prélève un échantillon du fluide corporel du patient, on fait réagir dans un test de compétition les ligands présents dans l'échantillon avec d'autres ligands discriminables par rapport aux ligands présents dans l'échantillon, lesdits ligands discriminables réagissant avec au moins une structure antigénique (de préférence fixée sur un support solide) spécifique de ladite pathologie, et on détecte et/ou quantifie l'inhibition de la réaction entre les ligands discriminables et la structure antigénique spécifique de la pathologie, par les ligands présents dans l'échantillon.
On entend par "pathologies liées à une réaction allergique ou auto-immune", les réactions d'hypersensibilité de type immédiat ou différé provoquées par le contact avec un allergène. Cette réaction peut être immédiate et spécifique (anaphylaxie, urticaire, ...) ou différée dans le temps.
Cette pathologie comprend également les maladies auto-immunes et/ou les infections conduisant à un désordre du système immunitaire. L'auto-immunité est un état d'immunisation d'un sujet contre ses propres constituants. La production par un organisme d'anticorps dirigés contre ses propres constituants a été observée dans un certain nombre de pathologies, telles que les infections liées au SLE (Systemic Lupus Erythematosus disease) , le syndrome Gougerot-Sjôgren (ou pathologie Sjôgren) , la polyarthrite rhumatoide, etc. D'autres exemples de maladies ayant ces caractéristiques sont également des pathologies telles que sarcoidosis et osteopenia, spondylarthritis, scleroderma, multiple sclerosis, amyotrophic latéral sclerosis, hyperthyroidism, maladie d'Addison, auto-immune haemolytic anaemia, maladie de Crohn, syndrome de Goddpasture, maladie de Graves, Hashimoto's thyroiditis, idiopathic purpura haemorrhagica, diabètes insulino- dépendants, myasthenia, pemphigus vulgaris, pernicious anaemia, poststreptococcal glomerulonephritis, psoriasis et stérilité spontanée.
Cette pathologie peut être également un syndrome d'hyperprolifération, en particulier le cancer du poumon.
Selon l'invention, les ligands sont choisis parmi le groupe constitué par les cellules APC (Antigen Présenting Cell_telles que les macrophages, les cellules dendritiques) , les récepteurs des cellules APC, les anticorps (monoclonaux ou polyclonaux) ainsi que leurs fragments (portions Fab des anticorps) et/ou un mélange d'entre eux. De préférence, les ligands selon l'invention sont des immunoglobulines de classe G.
On entend par "ligands discriminables par rapport aux ligands présents dans l'échantillon", des ligands différents de ceux présents dans l'échantillon et qui sont susceptibles d'être identifiés et/ou quantifiés de manière sélective par différents moyens chimiques ou physiques. De tels moyens peuvent par exemple être un marquage desdits ligands au moyen d'un marqueur radioactif, enzymatique, chemoluminescent, bioluminescent, ou biochimique (biotine) . Lesdits ligands peuvent également être des ligands spécifiques d'une espèce animale. De préférence, les ligands selon l'invention sont des immunoglobulines de classe G. Selon une forme d'exécution préférée de l'invention, les ligands sont des immunoglobulines de classe Y purifiés à partir du jaune d'oeuf de poule. Il est donc possible d'utiliser le procédé de détection et/ou de quantification selon l'invention en utilisant des ligands discriminables (IgY de jaune d'oeuf de poule) que l'on fait réagir sur une structure antigénique (par exemple un allergène) fixé sur un support solide et spécifique de ladite pathologie, lesdits IgY saturant la structure antigénique. On fait ensuite réagir dans un test de compétition les ligands présents dans l'échantillon, par exemple un sérum d'un patient malade ou d'un patient sain, comportant notamment des immunoglobulines avec lesdits IgY extraits de l'oeuf de poule.
Avantageusement, il est également possible de rajouter de manière additionnelle au sérum à tester des immunoglobulines IgY extraites de l'oeuf de poule. Ensuite, on détecte et/ou quantifie l'inhibition de la réaction croisée entre les .ligands discriminables, c'est-à-dire les IgY extraites de l'oeuf de poule, et la structure antigénique spécifique de la pathologie (par exemple un allergène testé) , par les ligands présents dans l'échantillon (c'est-à-dire les immunoglobulines présentes dans le sérum du patient testé) .
Il est ensuite possible de comparer l'inhibition de la réaction de patients sains par rapport à celle de patients souffrant de la pathologie testée.
Préférentiellement, la structure antigénique est un allergène choisi parmi le groupe constitué par les allergenes majeurs présents dans la lait de vache, en particulier la β-lactoglobuline bovine (BLG) , les antigènes majeurs intervenant dans les phénomènes allergiques vis-à-vis des plantes, (en particulier les allergenes des pollens) , des animaux (en particulier les allergenes présents dans les poils d'animaux, les allergenes des venins d'animaux, 1'antigène des acariens présents dans la poussière domestique, les antigènes responsables de l'allergie aux acariens, l'entérotoxine B staphylococcale (SEB) , un ou plusieurs épitopes de ces allergenes et/ou un mélange d'entre eux tel que décrit dans la publication ISBN 91-970475-5-4 Pharmacia AB incorporée ici par référence.
De préférence, la structure antigénique est un complexe antigénique spécifique d'une maladie auto-immune. De préférence, cette structure antigénique est un marqueur spécifique du lupus (SLE) ou de la pathologie de Sjôgren, en particulier la membrane plasmatique ou une portion de cette membrane contenant du DNA membranaire et ayant un poids supérieur à 100 KD, tel que notamment décrit dans la demande de brevet PCT/BE95/00100 dont le numéro de dépôt est incorporé par référence.
Ces complexes antigéniques ont également été décrits par Roitt I. M. (Essential Immunology, Blac well Scientific Publication (chapitre 14) ISBN 0-632-01994-8) et par Hu bel R. L. (Auto-anticorps et maladies auto-immunes, Ed. Scientifiques Elsevier (1994) ISBN 2-906077-58-5) .
Cette structure antigénique peut être également un allergène présenté au niveau d'une muqueuse utilisé selon l'invention dans le diagnostic du cancer du poumon. La présente invention concerne également un complexe immunoreactif comprenant au moins un allergène lié à un ligand, éventuellement marqué, réagissant spécifiquement contre cet allergène.
On entend par "complexe immunoreactif", une liaison spécifique entre les allergenes ou les complexes antigêniques spécifiques d'une pathologie liée à une réaction auto-immune, et les ligands spécifiques précédemment décrits, susceptible d'être utilisée dans un dispositif de détection et/ou de quantification de ligands spécifiques de la pathologie liée à une réponse allergique.
Un autre aspect de la présente invention concerne les épitopes allergeniques spécifiques d'un syndrome liés à une réponse allergique, en particulier les épitopes allergeniques de l'antigène de la β-lactoglobuline bovine
(BLG) tels que décrits dans les figures 14 à 16 et les épitopes allergeniques de l'antigène DRP1 (Major Mite Fecal lergene) et les épitopes allergeniques de l'antigène majeur LolPl de Lolium Perenne tels que décrits dans les figures 34 et 35 respectivement.
La présente invention concerne . également l'anticorps (monoclonal ou polyclonal) dirigé contre ledit complexe immunoreactif ou lesdits épitopes allergeniques selon l'invention.
Un autre aspect de l'invention concerne le dispositif de détection et/ou de quantification d'un ligand spécifique desdites pathologies, comprenant ledit complexe, lesdits épitopes et/ou ledit anticorps selon l'invention.
Le dispositif selon la présente invention comprend, en outre, des réactifs destiné à la détection et/ou à la quantification desdits ligands par un procédé choisi parmi le groupe constitué par la reconnaissance par des anticorps marqués, de manière isotopique ou non isotopique, sur filtre, sur support solide, sur gel, en solution, en "sandwich", par double immunodiffusion, par contre-immunoélectrophorèse, par hémagglutination et/ou un mélange d'entre eux.
La présente invention concerne également une composition pharmaceutique, cosmétique et/ou alimentaire destinée à modifier la réponse immunitaire humorale et/ou cellulaire d'un patient vis-à-vis d'un allergène, comprenant ledit allergène, un ou plusieurs épitopes dudit allergène, le complexe immunoreactif selon l'invention, l'anticorps dirige contre ce complexe et/ou un mélange d'entre eux.
On entend par "modification de la réponse immunitaire humorale et/ou cellulaire d'un patient vis-à-vis d'un allergène", la modification du pool d'anticorps réagissant de manière spécifique à l'encontre de certains épitopes allergiques, c'est-à-dire la capacité pour un patient d'avoir une production d'anticorps comparable à celle d'un sujet sain telle qu'elle est diagnostiquée dans les exemples de la description.
Avantageusement, le patient est un nouveau-né et la composition est administrée à la mère avant et/ou pendant la grossesse ou l'allaitement maternel. Un dernier aspect de la présente invention concerne l'utilisation de ladite composition pharmaceutique pour la préparation d'un médicament destiné à modifier la réponse immunitaire humorale et/ou cellulaire d'un patient vis-à-vis d'un allergène et/ou pour le traitement et/ou la prévention de pathologies liées à une réponse allergique, en particulier le traitement et/ou la prévention d'allergies et/ou de cancers.
Selon une forme d'exécution préférée de cette utilisation, le patient est un nouveau-né et la composition est administrée à la mère avant ou pendant la grossesse ou l'allaitement maternel. Brève description des ficaires .
Les figures 1 à 7 repré sentent 1 ' influence de l'administration orale d'un hydrolysat de lait sur la réponse immunitaire d'un individu adulte à la β- lactoglobuline.
Les figures 8 et 9 représentent la modulation de la réponse anticorps anti-β- lactoglobuline de nouveaux-nés en fonction de l'alimentation lactée de leur mère.
Les figures 10 à 12 représentent la mesure de l'inhibition d'un pool d'immunoglobulines IgG marquées par le sérum de patients sains et intolérants à un allergène particulier.
La figure 13 représente la mesure de l'inhibition d'un anticorps monoclonal marqué par le sérum d'un patient sain et intolérant à un allergène.
Les figures 14 à 16 représentent la reconnaissance spécifique de certains épitopes linéaires de l'allergène BLG par des pools d'immunoglobulines de sérum de patients sains, atteints d'allergie ou d'un cancer du poumon,
Les figures 17 à 31 représentent la mesure de l'inhibition d'un pool d'immunoglobulines IgG marquées par le sérum de patients sains et intolérants à un allergène particulier (antigène SEB de l'entérotoxine de staphylocoque, antigène DPT spécifique de l'allergie aux acariens, antigènes Gl et LolPl spécifiques de l'allergie au pollen de la graminée d'J^ntoxanthum odoratum et Lolium Perenne et antigène majeur du venin de guêpe) . La figure 32 représente la mesure de l'inhibition d'un pool d'IgG obtenues d'un individu sain fixées sur un complexe antigénique spécifique du lupus et éventuellement du Sjôgren par différents sera issus de patients souffrant de la pathologie du lupus, de la pathologie de Sjôgren et de patients sains à différentes dilutions de sérums. La figure 33 représente la mesure de l'inhibition d'un pool d'IgG issues de patients souffrant des symptômes du lupus fixées sur un complexe antigénique spécifique du lupus et/ou du Sjôgren par des sera issus de patients souffrant des symptômes du lupus, des symptômes du Sjôgren ou de patients sains à différentes dilutions de sérum. Les figures 34 et 35 représentent la reconnaissance spécifique de certains épitopes linéaires des allergenes DRP1 et LolPl par des pools d' immunoglobulines de sérum de patients sains ou de patients allergiques. La figure 36 représente l'inhibition de la liaison d'anticorps discriminables (IgY purifiées du jaune d'oeuf de poule) au complexe antigénique BLG par des anticorps IgG de différents sera.
Exemples.
1. Influence de l 'administration orale d ' un hydrolysat de lai sur Ja répo se IgrG eç TαM de souris adul tes à la β- lactoσlobuline .
Depuis l'invention des tests de détection d'anticorps par l'utilisation d'une surface recouverte d'un antigène comme les RASTS et les ELISAS (phase solide) , mesurant des anticorps de plus faible affinité que les tests antérieurs (RIA; phase liquide), on s'est aperçu d'une chose qui reste étonnante, bien que jamais soulignée : de nombreux antigènes capables d'induire une réponse allergique par anticorps de classe IgE chez les malades, sont aussi capables d'induire des anticorps de classe IgG chez tous les individus, y compris les sujets sains, atopiques ou non. C'est le cas de la β-lactoglobuline (BLG), la lactalbumine et la caséine, les antigènes majeurs du lait de vache (LV) , ou de pollens, du DPT et diverses moisissures pour les aéroallergènes. Pourtant, il ne suffit pas qu'une protéine soit ingérée pour induire cette réponse; chacun ne fait pas de tels anticorps contre l'albumine de boeuf ou la gliadine du blé, par exemple. Considérant l'allergie comme un cas particulier de réponse immune généralement répandue, il est important d'analyser aussi cette réponse chez les sujets non allergiques, car elle singularise déjà certains antigènes parmi d'autres protéines alimentaires. La réponse IgG anti-BLG (et IgA) est dirigée contre des épitopes qui diffèrent partiellement entre sujets allergiques symptomatiques et sujets guéris ou sains.
Des souris syngéniques de trois souches distinctes (l'une domestique, les autres BalbC et C57B1) nourries sans lait depuis 5 générations au moins et âgées de 6 semaines ont été réparties en groupes égaux de 8 animaux et soumises à des régimes différents (voir figure 1) .
Le premier consistait à recevoir de l'eau comme unique boisson pendant 72 jours, l'autre consistait à recevoir de l'eau pendant 6 semaines puis un hydrolysat commercial de lait de vache (N.ANHA ® de Nestlé) , pendant 30 jours. Ensuite, toutes les souris ont reçu du lait de vache dilué de 1/3 dans leur eau de boisson. On mesure les anticorps IgG et IgM au jour 0 (début du lait entier à 1/3) et 30 jours plus tard vis-à-vis de la β-lactoglobuline (BLG) comme représentant de l'allergénicité du lait, par une méthode d'ELISA, en utilisant la BLG intacte (n-BLG à l'état natif) et des peptides obtenus par digestion pepsinique de la BLG (d-BLG) (voir figs. 2 à 7) . Il apparaît que : le régime alimentaire constitué par des granules déclarés sans addition de lait n'est cependant pas entièrement dépourvu d'antigènes de lait (contamination à la production) . Les mesures montrent cependant que l'apport est 30 fois inférieur à celui de l'équivalent antigénique fourni par l'hydrolysat de lait.. Ceci explique que même les souris ne recevant que de l'eau comme boisson ont développé des anticorps anti-BLG; - la pré-nutrition des souris à l'hydrolysat de lait influence manifestement la réponse IgM et IgG vis-à-vis de la β-lactoglobuline; ceci dépend de la souche sélectionnée et indique donc un déterminisme génétique; enfin, la spécificité des anticorps est ainsi modifiable puisque les titres mesurés sur n-BLG et d-BLG ne varient pas de façon parallèle, indiquant donc une modulation différente selon la catégorie ou le type d'épitopes (ici, conformationnels; versus structurels) ; ceci est observé pour les IgM (demi-vie courte) (voir figs. 2 et 3) mais déjà observable aussi pour les IgG (voir figs. 5 et 6) .
2. Modulation de la réponse anticorps anti -BLG de souriceaux au moment du sevraσe en fonction de l ' alimentation lactée de leur mère . Dans ce même modèle, on administre du lait entier à la concentration de l/l ou 1/30 dans le lait de boisson à des souris en âge de se multiplier et appartenant à la souche domestique. On mesure les anticorps des souriceaux à l'âge de 4 semaines en tenant compte du délai entre le début du régime maternel et la date de naissance (et donc de la conception) (voir figs. 8 et 9).
Il apparaît que le régime alimentaire de la mère fait indéniablement varier les titres et la spécificité des anticorps de sa progéniture selon le délai entre l'instauration du régime maternel et celui de la conception, et d'autre part en fonction de l'apport quantitatif de lait.
L'ensemble de ces données permet de montrer que les manipulations à la fois quantitatives et qualitatives du rapport alimentaire en antigènes de lait a une influence sur la réponse immune de souris adultes, tant pour le titre des anticorps que pour la spécificité épitopique. Ceci est vrai pour leur propre réponse et pour celle qui apparaîtra chez leur progéniture. Cette influence de la réponse de la progéniture par la manipulation de la diète maternelle rend vraisemblable l'hypothèse d'une manipulation de la réponse de bébés contre les antigènes de lait en modifiant l'apport et la qualité des antigènes de lait fournis à la mère avant et durant sa grossesse.
Il est donc possible d'apporter chez un nouveau-né une tolérance immunitaire (humorale, mais probablement aussi cellulaire) vis-à-vis d'un syndrome lié à une réponse allergique en traitant la mère du nouveau-né avant et/ou pendant sa grossesse. Ce traitement prophylactique permet donc d'éviter chez un patient un traitement thérapeutique lourd de longue durée et coûteux durant l'enfance et/ou 1'adolescence.
3. Diagnostic de groupes d'individus présentant des syndromes liés à une réponse allergique. a. Réponse allergique à la β-lactoσlobuline.
La β-lactoglobuline du lait de vache utilisée comme allergène est fixée sur un support solide.
On identifie des groupes d'individus par un test de compétition entre des immunoglobulines marquées (ces immunoglobulines sont fixées à de la biotine et révélées par la réaction d'une enzyme peroxydase liée à de la polystreptavidine) et les sérums de patients (test ELISA) . On analyse le sérum de 44 individus sains (CM tolérants) et de 44 individus présentant une intolérance au lait de vache (CM intolérants) .
L'analyse de ces résultats indique qu'il est possible d'identifier les groupes d'individus sains et intolérants au lait de vache par rapport à leur réaction spécifique vis-à-vis de l'allergène (voir figure 10). Cette réaction s'observe également avec des allergenes constitués de l'allergène BLG natif (n-BLG) ou digérés à la pepsine (d-BLG) (voir figs. 11 et 12) .
Un test de compétition a également été réalisé en utilisant une compétition entre des anticorps monoclonaux de souris M7 marqués comme précédemment et des sérums de patients.
La figure 13 donne le résultat de ce test de compétition qui permet d'identifier les individus sains (44 CM tolérants et 65 donneurs de sang (BD) ) et les 44 individus présentant une intolérance au lait de vache (CM intolérants) .
Par conséquent, certains anticorps monoclonaux permettent d'identifier de manière préférentielle dans cette compétition les individus présentant une intolérance au lait de vache.
Caractérisâtion d s épitopes linéaires d'un allergène spécifique de certains syndromes.
Une relation entre l'atopie et le cancer du poumon a été décrite dans différentes publications (Me Duffie H. H. et al., Chest 1988; 93 pp. 241 - 246; Chest 1991; 99 pp. 404- 407, et Michils et al., Cancer 1992; 69 pp. 2252 - 2257) .
Certains allergenes (BLG, antigène pi de la mite présente dans la poussière domestique (Dermatophagoides pteronyssinus) induisent la production d'immunoglobulines chez des patients atteints de cancer.
Par conséquent, la Demanderesse a cherché à identifier les épitopes linéaires particuliers de l'allergène BLG susceptibles de réagir avec des immunoglobulines G présentes dans le sérum de patients atteints d'un cancer.
On synthétise sur une phase solide des octapeptides composant une suite successive de 8 acides aminés dans l'ordre de la structure primaire de la BLG.
On révèle ensuite des peptides ayant permis de fixer des immunoglobulines G biotinées et provenant d'un pool de 12 sujets, qui sont soit allergiques au lait, soit normaux, soit atteints d'un cancer du poumon.
La révélation de la fixation des anticorps est faite par de la streptavidine couplée à de la β-galactosidase (voir figures 13 à 15) . Dans ces figures, on identifie certains épitopes particuliers reconnus uniquement par des pools d'immunoglobulines d'un sérum de patients atteints d'un cancer du poumon ou uniquement reconnus par les immunoglobulines présentes dans le sérum d'un patient allergique au lait.
Une procédure similaire a été utilisée pour caractériser les épitopes linéaires des allergenes DRPl et LolPl (figures 34 et 35) .
Par conséquent, il est possible de caractériser une "signature" précise d'une pathologie (allergie, cancer, cancer et allergie) . En conclusion, sur base des exemples susmentionnés, il est possible de caractériser une pathologie liée à une réponse allergique par le fait que le système immunitaire de patients sains, par rapport à des patients malades, reconnaît spécifiquement certains épitopes d'allergenes par des anticorps spécifiques.
Il est donc possible de modifier cette réponse immunitaire en présentant à des patients un choix particulier d'épitopes allergiques ou non allergiques pour diagnostiquer une pathologie liée à une réponse immunitaire ou pour obtenir une prévention ou une thérapie de cette pathologie liée à une réponse allergique. En particulier, il est possible de moduler cette réponse d'anticorps spécifiques chez des nouveaux-nés en additionnant une composition pharmaceutique, cosmétique et/ou alimentaire à la mère avant et/ou pendant la grossesse. Comme le démontrent les figures 11 et 12, il est possible d'utiliser comme référence marquée un pool d'immunoglobulines spécifiques d'un épitope d'un allergène caractéristique d'un profil épitopique normal (individus CM tolérants) et de diagnostiquer les individus normaux (CM tolérants caractérisés par leur important pourcentage d'inhibition) et les individus intolérants au lait de vache
(CM intolérants caractérisés par leur faible pourcentage d'inhibition) .
4. Diagnostic de groupes d ' individus présentant des syndromes liés â une. réponse flllerα gue vd.s- -vis de. différents allergenes mai urs .
Le diagnostic de différents groupes d'individus a pu être effectué vis-à-vis de certains antigènes majeurs de différentes allergies selon la procédure expérimentale telle que décrite dans l'exemple précédent.
Les différents allergenes ont été fixés sur un support solide. On identifie des groupes d'individus par un test de compétition entre des immunoglobulines marquées et les sera de patients. a. Eczéma et réaction à l'antiσène SEB de l'entérotoxine de staphylocoque
Fig Type de patient Eff. Origine du Antigène pool d'IgG utilisé
17 Allerσie aux acariens IgG SEB
- eczéma enfants 22 d'enfants entérotoxine de
- eczéma adultes 39 avec eczéma staphylocoque
Contrôles
- - - enfants sains 22
- adultes sains 48
- psoriasis adultes 8
Fig Type de patient Eff. Origine du .Antigène pool d' IgG utilisé
18 Allerqie aux acariens IgG SEB d'enfants entérotoxine de
- eczéma enfants 31 avec eczéma staphylocoque
Contrôles
- adultes sains 50
- psoriasis adultes 4
Fig Type de patient Eff. Origine du .Antigène pool d'IgG utilisé
19 Allerσie aux acariens IgG SEB d'adultes entérotoxine de
- eczéma adultes 31 sains staphylocoque
Contrôles
- adultes sains 50
- psoriasis adultes 4
L'analyse des résultats des figures 17 à 19 indique qu'il est possible d'identifier des groupes d'individus sains et présentant une allergie aux acariens (enfants et adultes) par leur réaction spécifique vis-à-vis de l'allergène.
Cette allergie active aux acariens se présente sous la forme d'un eczéma, qu'il soit adulte ou enfant. On peut conclure que les anticorps de malades souffrant d'une allergie active aux acariens reconnaissent sur l'antigène majeur des épitopes particuliers peu ou mal reconnus par les anticorps sériques des sujets sains, qu'ils soient adultes ou enfants, ou encore atteints d'une maladie de peau non allergique comme le psoriasis, utilisés comme contrôle.
Il semblerait que des épitopes particuliers soient de type conformâtionnel car toute altération physique de l'antigène SEB (comme celle qui suit les congélations/dégels répétés) modifie la sensibilité des tests.
b. Eczémas de type rhinite et asthmes allergiques
Fig Type de patient Eff. Origine du 4Antigène pool d'IgG utilisé
20 Allerσie aux acariens IgG DPT
- eczéma adultes 29 d'adultes
- rhinite 17 avec eczéma
- asthme 40
Contrôles
- adultes sains 64
- psoriasis 4
L'analyse des résultats figurant à la figure 20 indique qu'il est également possible d'identifier des groupes d'individus sains et allergiques aux acariens (eczéma ou rhinite ou asthme) par leur réaction spécifique vis-à-vis de 1'allergène DPT.
Fig Type de patient Eff. Origine du 4Antigène pool d'IgG utilisé
21 Allerσie au oollen Gl IgG Gl = pollen de
- asthme 16 d'adultes la graminée
Allerσie aux acariens avec eczéma Antoxanthum odoratum
- eczéma adultes 31
- - Contrôles
- adultes sains 50
- psoriasis 4
L'analyse des résultats figurant à la figure 21 montre que les sujets allergiques aux acariens ressemblent aux sujets de contrôle pour l'inhibition d'IgG d'autres allergiques (eczéma) sur cet antigène de pollen, alors que les allergiques au pollen Gl se distinguent par une inhibition différente (moindre) de symptômes à l'égard de l'antigène testé. C'est l'expression de symptômes chez le sujet qui détermine le niveau de compétition spécifique entre sérum et IgG purifiées.
Fig Type de patient Eff. Origine du 4Antigène pool d'IgG utilisé
22 Allerσie aux acariens IgG de BLG β- sujets lactaglobuline
- eczéma adultes 31 sains du lait de vache
Contrôles
- sujets sains 64
- psoriasis 4 L'analyse des résultats figurant à la figure 22 indique les sujets allergiques et les sujets de contrôle ne diffèrent pas entre eux lorsqu'ils sont testés sur un antigène sans relation avec leur état.
c. Allergies respiratoires aux acariens
Fig Type de patient Eff. Origine du .Antigène pool d'IgG utilisé
23 Allerσie aux acariens IgG DPT
- rhinite 17 d'allergi¬
- asthme 39 ques
Contrôles
- adultes sains 64
Fig Type de patient Eff. Origine du Antigène pool d'IgG utilisé
24 idem que pour la figure 23 IgG de DPT contrôles
Fig Type de patient Eff. Origine du .Antigène pool d'IgG utilisé
25 idem que pour la figure 23 IgG de BLG contrôles
L'analyse des résultats présentés dans les figures
23 à 25 indique qu'il est possible d'identifier des groupes d'individus sains par rapport à des individus allergiques ou intolérants, par leur réaction spécifique vis-à-vis de 1«allergène DPT ou BLG. Fig Type de patient Eff. Origine du Antigène pool d' IgG utilisé
26 Allerσie aux acariens IgG de Gl
- respiratoire 43 contrôles
Allerσie au pollen Gl
- respiratoire 16 contrô es
- adultes sains 50
L'analyse des résultats présentés à la figure 26 indique que les allergiques aux acariens et les sujets de contrôle sont semblables à présent qu'ils sont testés sur pollen Gl. Cependant, on distingue maintenant les allergiques au pollen Gl par rapport aux allergiques aux acariens et aux sujets de contrôles.
Fig Type de patient Eff. Origine du .Antigène pool d'IgG utilisé
27 Allerσie au pollen IgG LolPl LolPl d'allergi¬
- respiratoire 62 ques
Contrôles
- adultes sains 63
L'analyse des résultats présentés dans la figure 27 indique qu'il est possible d'identifier des groupes d'individus sains par rapport aux allergiques par leur réaction spécifique vis-à-vis de l'allergène LolPl. Fig Type de patient Eff. Origine du -Antigène pool d'IgG utilisé
28 idem que pour la figure 23 .Anticorps DPT monoclonal de souris anti Der pi n° M5
L'analyse des résultats présentés dans la figure 28 montre que les patients allergiques au DPT et sujets de contrôle inhibent différemment l'anticorps monoclonal sur le
DPT, mais avec un chevauchement important des distributions.
Fig Type de patient Eff. Origine du 4Antigène pool d' IgG utilisé
29 idem que pour la figure 23 .Anticorps DPT monoclonal de souris anti Der pi n° M6
L'analyse des résultats figurant à la figure 29 indique que les sujets de contrôle inhibent mieux que les allergiques alors que ceux-ci ont des titres plus élevés d'anticorps anti-DPT. Il ya donc reconnaissance d'épitopes distincts permettant d'identifier les différents groupes d'individus. L'épitope unique (reconnu ici par un anticorps monoclonal) est surtout reconnu par les sujets de contrôle et nettement moins bien par les allergiques. L'analyse de ces différents résultats indique que les sujets allergiques aux acariens et qui souffrent de symptômes respiratoires reconnaissent par leurs anticorps (notamment IgG) des épitopes différents de ceux des sujets sains ou souffrant d'allergie à l'égard d'un autre type d'allergène.
Ceci s'observe dans l'un ou l'autre sens selon le type d'anticorps (IgG purifiées ou anticorps monoclonal). Cette caractéristique ne semble cependant pas s'étendre à d'autres allergenes (BLG ou pollen Gl) , auxquels ils sont cliniquement indifférents. Ceci a pu également se vérifier à l'échelon d'un épitope singulier de type conformâtionnel (reconnu par un anticorps monoclonal) .
d. Allergie au venin de cruêpe
Fig Type de patient Eff Origine du .Antigène pool d'IgG utilisé
30 Ail. au venin (IσE+) IgG Venin de guêpe
- symptômes systémiques 32 d'allergi¬ Vespula avant vaccin ques au germanica venin de
- id. après 2 ans de 32 guêpe vaccin (désensibilisés)
- symptômes locaux 4
Contrôles
- sujets sains 32
L'analyse des résultats de la figure 30 montre que les sujets allergiques (en danger) se distinguent des sujets sains et des sujets désensibilisés par leur aptitude à mieux inhiber les IgG d'allergiques. Les sujets n'ayant présenté que des syrriptômes locaux sont semblables au sujets de contrôle. Fig Type de patient Eff. Origine du .Antigène pool d' IgG utilisé
31 idem que pour la figure 30 IgG de idem que pour sujets la figure 30 désensibili ses
L'analyse des résultats de la figure 31 indique que les sujets allergiques et les sujets désensibilisés se ressemblent et diffèrent des sujets de contrôle ou sensibilisés mais sans symptômes généralisés.
L'analyse de ces résultats indique que l'expression systémique des symptômes (généralisés) est associée à la reconnaissance d'épitopes particuliers sur les antigènes du venin de guêpe distincts de ceux reconnus par les sujets de contrôle, voire sensibilisés mais ne courant pas de danger d'anaphylaxie. La désensibilisation par immunothérapie spécifique fait perdre une partie de cette spécificité, sans pour autant faire revenir ces sujets à un spectre de reconnaissance d'épitopes complètement différent de celui des sujets à risque d'anaphylaxie avant traitement.
5. Diagnostic de groupes d ' individus présentant des syndromes liés à une maladie auto-immune : lupus érvthêmateux disséminé (SLE)
Fig Type de patient Eff Origine du .Antigène pool d'IgG utilisé
32 Malades IgG de SLE .ADN de membrane
- SLE 8 purifié
- Sjôgren 8
Contrôles
- adultes sains 6 L'analyse des résultats présentés dans la figure 32 montre qu'à diverses dilutions de sérum, les malades inhibent mieux les IgG de SLE que les sujets normaux (analyse variance à une voie + correction de Scheffe : p < 0,05) .
Fig Type de patient Eff. Origine du -Antigène pool d'IgG utilisé
-33 idem que pour la figure 32 IgG de .ADN de membrane sujets sains
L'analyse des résultats présentés dans la figure 33 montre que les sujets normaux inhibent mieux la liaisons anticorps que les sujets malades (SLE et Sjôgren vs normaux : p < 0,05 : anova + Scheffe) bien qu'ils aient des titres d'anticorps nettement plus faibles.
Par conséquent, le procédé selon l'invention permet également de discerner avec une spécificité fine la reconnaissance d'épitopes particuliers sur des molécules d'ADN de membrane par des auto-anticorps en fonction de l'état clinique (malades ou pas).
La figure 36 représente l'inhibition de la liaison d'IgY obtenues de jaune d'oeuf de poule au complexe antigénique BLG par des IgG issues de différents sera
(patients allergiques, patients normaux, patients souffrant d'un cancer du poumon) .
Les IgY discriminables spécifiquement par rapport à des anticorps humains, sont extraits et purifiées à partir du jaune d'oeuf de poules, lesdites poules étant soit normales sans avoir été nourries au lait (oeuf type I) , soit ayant été immunisées per os au lait par administration de lait (oeuf type II) .
Ces résultats montrent qu'il est possible d'obtenir une discrimination entre des individus allergiques et des individus normaux ou souffrant du cancer du poumon.
7. Composi tion cosmétique selon l ' invention
Composition Pourcentage en poids
Phase huileuse
Tampon BRIJ 721 6.00
Alcoolcétyle 10.00
Huile minérale 3.00
Propylparahydrobenzoate 0.002
Phase aqueuse
Carbopol 934 ® 0.15
Hydroxyde de sodium 0.05
Méthylparahydrobenzoate 0.18
Epitopes selon l' invention 0.05 à 5.00
Total 100.00
La composition cosmétique selon l'invention peut être appliquée sous forme de crème directement sur la peau du patient.
Certains dérivés selon l'invention peuvent également être incorporés dans la- phase huileuse de la composition cosmétique au lieu d'être dissous dans la composition aqueuse.
8 . Composi tion alimen taire selon l ' invention Les épitopes spécifiquement allergiques obtenus de la structure primaire de la BLG sont additionnés à un yoghourt à boire avec les ferments lactiques, un substitut de lait écrémé ainsi que des matières grasses obtenues après pasteurisation dans un échangeur thermique à plaque et après incubation en cuve à 45 °C pendant environ 4 heures sous brassage.
8. Composition pharmaceutique comprenant les épi topes ou le complexe immunoreactif selon l 'invention Les épitopes ou le complexe immunoreactif selon
1'invention sont additionnés à un véhicule pharmaceutique adéquat pour l'administration orale, par exemple sous forme de tablettes, enrobées ou non, de pilules, de capsules, de solution, d'huile essentielle et/ou de sirop. Pour d'autres types d'application, d'autres véhicules pharmaceutiques peuvent être utilisés selon le mode d'administration choisi.
La composition pharmaceutique selon l'invention est préparée selon les procédés généralement utilisés par l'Homme du Métier, en particulier par les pharmaciens, et peut comprendre tout véhicule ou tout adjuvant pharmaceutiquement adéquat, solide ou liquide et non toxique.
L'incorporation des épitopes ou du complexe immunoreactif selon l'invention dans un milieu galénique peut également être envisagé. Le pourcentage de produit actif dans le véhicule pharmaceutique peut varier selon de très larges gammes, uniquement limitées par la tolérance ou le niveau d'acceptation du produit par le patient. Les limites sont généralement déterminées par la fréquence d'administration et le mode d'administration au patient (intraveineuse, orale, etc) .

Claims

REVENDICATIONS.
1. Procédé de détection et/ou de quantification de ligands spécifiques d'une pathologie choisie parmi le groupe constitué par les pathologies liées à une réaction allergique ou auto-immune et le cancer du poumon, et présents dans un fluide corporel d'un patient, caractérisé en ce que : on prélève un échantillon du fluide corporel du patient, on fait réagir dans un test de compétition les ligands présents dans l'échantillon avec d'autres ligands discriminables, lesdits ligands discriminables réagissant avec au moins une structure antigénique spécifique de ladite pathologie, et on détecte et/ou quantifie l'inhibition de la réaction entre les ligands discriminables et la structure antigénique spécifique de la pathologie, par les ligands présents dans l'échantillon.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les ligands sont choisis parmi le groupe constitué par les cellules APC (Antigen Présenting Cell) , les récepteurs des cellules APC, les anticorps, leurs fragments et/ou un mélange d'entre eux.
3. Procédé selon la revendicatioin 1 ou 2, caractérisé en ce que les ligands discriminables sont des ligands marqués.
4. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les ligands sont des immunoglobulines de classe G.
5. Procédé selon l ' une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les ligands discriminables sont des immunoglobulines IgY extraites du j aune d' oeuf de poule .
6. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la structure antigénique est un allergène choisi parmi le groupe constitué par les antigènes majeurs allergiques présents dans le lait, en particulier la β-lactoglobuline bovine (BLG) issue du lait de vache, les antigènes majeurs allergiques présents dans les végétaux, en particulier dans les pollens, dans les poils d'animaux, dans les venins d'animaux, en particulier dans le venin de guêpe, les antigènes majeurs de réaction allergique aux acariens, à la mite présente dans la poussière de maison (antigène pi du Dermatophagoîdes pteronyssinus), l'antigène majeur de l'Aspergillus fumigatus, 1'entérotoxine B staphylococcale (SEB), un ou plusieurs épitopes de ces allergenes et/ou un mélange d'entre eux.
7. Complexe immunoreactif comprenant au moins un allergène lié à un ligand, éventuellement marqué, réagissant spécifiquement contre cet allergène ou un complexe antigénique spécifique d'une pathologie liée à une réaction auto-immune.
8. Complexe immunoreactif selon la revendication 7, caractérisé en ce que le ligand est choisi parmi le groupe constitué par les cellules .APC (Antigen Présenting Cell) , les récepteurs des cellules APC, les anticorps, leurs fragments et/ou un mélange d'entre eux.
9. Complexe immunoreactif selon la revendication 7 ou 8, caractérisé en ce que le ligand est une immunoglobuline de classe G.
10. Complexe immunoreactif selon l'une quelconque des revendications 7 à 9, caractérisé en ce que l'allergène est choisi parmi le groupe constitué par les antigènes majeurs allergiques présents dans le lait, en particulier la β-lactoglobuline bovine (BLG) issue du lait de vache, les antigènes majeurs allergiques présents dans les végétaux, en particulier dans les pollens, dans les poils d'animaux, dans les venins d'animaux, en particulier dans le venin de guêpe, les antigènes majeurs de réaction allergique aux acariens, à la mite présente dans la poussière de maison (antigène pi du Dermatophagoides pteronyssinus), l'antigène majeur de l'Aspergillus fumigatus, l'entérotoxine B staphylococcale (SEB) , un ou plusieurs épitopes de ces allergenes et/ou un mélange d'entre eux.
11. Epitope allergénique d'un allergène choisi parmi le groupe constitué par les antigènes majeurs allergiques présents dans le lait, en particulier la β- lactoglobuline bovine (BLG) issue du lait de vache, les antigènes majeurs allergiques présents dans les végétaux, en particulier dans les pollens, dans les poils d'animaux, dans les venins d'animaux, en particulier dans le venin de guêpe, les antigènes majeurs de réaction allergique aux acariens, à la mite présente dans la poussière de maison (antigène pi du Dermatophagoides pteronyssinus), l'antigène majeur de l'Aspergillus fumigatus, l'entérotoxine B staphylococcale (SEB) , un ou plusieurs épitopes de ces allergenes et/ou un mélange d'entre eux.
12. Epitope allergénique de l'antigène de la β- lactoglobuline bovine (BLG) identifié dans les figures 14 à 16.
13. Epitope allergénique de l'antigène DERP1 identifié dans la figure 34.
14. Epitope allergénique de l'antigène LolPl identifié dans la figure 35.
15. Anticorps dirigé contre le complexe immunoreactif selon l'une quelconque des revendications 7 à 10 et/ou contre les épitopes selon l'une quelconque des revendications 11 à 14.
16. Dispositif de détection et/ou de quantification de ligands spécifiques d'une pathologie liée à une réponse allergique comprenant le complexe selon l'une quelconque des revendications 7 à 10, les épitopes selon l'une quelconque des revendications 11 à 14 et/ou l'anticorps selon la revendication 15.
17. Dispositif selon la revendication 16, caractérisé en ce qu'il comprend les réactifs destinés à la détection et/ou quantification des ligands par un procédé choisi parmi le groupe constitué par la reconnaissance par des anticorps marqués, de manière isotopique ou non isotopique, sur filtre, sur support solide, sur gel, en solution, en "sandwich", par double immunodiffusion, par contre-immunoélectrophorèse, par hémagglutination et/ou un mélange d'entre eux.
18. Composition pharmaceutique, cosmétique et/ou alimentaire destinée à modifier la réponse immunitaire d'un patient vis-à-vis d'un allergène ou d'un complexe antigénique spécifique d'une pathologie liée à une réaction auto-immune, caractérisée en ce qu'elle comprend ledit allergène ou ledit complexe antigénique, l'hydrolysat dudit allergène, un ou plusieurs épitopes de celui-ci, un complexe immunoreactif selon l'une quelconque des revendications 7 à 10, les épitopes selon l'une quelconque des revendications 11 à 14, 1'anticorps dirigé contre ledit complexe selon la revendication 15 et/ou un mélange d'entre eux.
19. Composition selon la revendication 18, caractérisée en ce que l'allergène est choisi parmi le groupe constitué par les antigènes majeurs allergiques présents dans le lait, en particulier la β-lactoglobuline bovine (BLG) issue du lait de vache, les antigènes majeurs allergiques présents dans les végétaux, en particulier dans les pollens, dans les poils d'animaux, dans les venins d'animaux, en particulier dans le venin de guêpe, les antigènes majeurs de réaction allergique aux acariens, à la mite présente dans la poussière de maison (antigène pi du Dermatophagoides pteronyssinus), l'antigène majeur de l'Aspergillus fumigatus, 1'entérotoxine B staphylococcale (SEB), un ou plusieurs épitopes de ces allergenes et/ou un mélange d'entre eux.
20. Composition selon la revendication 18 ou 19, caractérisée en ce que le patient est un nouveau-né et que la composition est administrée à la mère avant et/ou pendant la grossesse.
21. Utilisation de la composition pharmaceutique selon la revendication 18 ou 19 pour la préparation d'un médicament destiné à modifier la réponse immunitaire d'un patient vis-à-vis d'un allergène.
22. Utilisation de la composition pharmaceutique selon la revendication 21, caractérisée en ce que le patient est un nouveau-né et que la composition est administrée à la mère avant et/ou pendant la grossesse.
23. Utilisation de la composition pharmaceutique selon la revendication 18 ou 19, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement et/ou la prévention de pathologies liées à une réaction allergique.
24. Utilisation selon la revendication 23, caractérisée en ce que le syndrome lié à une réponse allergique est le cancer.
25. Utilisation de la composition pharmaceutique selon la revendication 18 ou 19 pour la préparation d'un médicament destiné au traitement et/ou à la prévention de pathologies liées à une réaction auto-immune.
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