WO1996030756A1 - METHOD OF DETERMINING β-GLUCAN - Google Patents

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    • Y10T436/143333—Saccharide [e.g., DNA, etc.]

Definitions

  • the present invention relates to a method for measuring / 8-U, 3) (1,4) -D-glucan (hereinafter sometimes abbreviated as ⁇ -glucan), and more particularly to various barley and other cereals.
  • the present invention relates to a method for measuring ⁇ -glucan contained in rice, malt, wort, beer, and the like. Background art
  • Calcofluor represented by the following structural formula is a fluorescent agent that specifically binds to ⁇ -glucan and increases the fluorescence intensity by the binding.
  • a flow injection method for quantifying glucan using this compound has been proposed. Reported by Jörgensen et al. Of Carlsberg, Denmark (Carl sberg Res s. Comm ⁇ n. Vol. 53, p. 277—285, 198 88; An alytica-EBC , 3. 1 1. 2.) o
  • Each of these uses a system such as that shown in Figure 1 or Figure 2, with 8 to 35 mg Z liter of Calcofluor in Tris or glycine buffer in the pH 10 to pH 8 range. Inject the sample or mix the flow of the solution into which the sample has been injected, mix with the S-glucan using an appropriate tube, and use the fluorescence detector to detect the fluorescence. It measures the increase in strength.
  • the measured value changes due to the effect of sugar in the wort sample and ethanol in beer.
  • the effect of these changes depends on the measurement conditions such as the sample injection volume and the volume of the empty volume of the mixed part, and that the measured value of the glucan content differs in the same sample.
  • An object of the present invention is to improve the accuracy and reproducibility of the measurement of glucan by the flow injection method using Ca1c0f1uor.
  • High-molecular weight yg-glucan with a molecular weight of 10,000 or more is passed through the column without holding it on a carrier, and low-molecular-weight sugars, ethanol, and fluorescent reaction inhibitors such as Calc0f1 ⁇ 0r are passed through a column carrier.
  • the purpose is to set up a system that separates and elutes from ⁇ -glucan by holding certain gel particles for several seconds to several tens of seconds and measurement conditions.
  • the present invention relates to a method for measuring glucan by a flow injection system using Ca1c0f1uor.
  • a method for measuring glucan after injecting a sample into a flowing solution, a polymer having a molecular weight of 10,000 or more to be detected is determined. Elution within a period of time (within a few minutes (preferably within 3 minutes)) and elution of low molecular components such as maltose, ethanol, and Ca1c0f1u0r fluorescent reaction inhibitor Pass the sample stream through a gel filtration column that can be delayed from glucan to separate the target / S-glucan and components that cause measured value fluctuations. This is a system for measuring with a fluorescence detector after passing.
  • the liquid to be detected is equal to the total volume of the voids between the gel particles through the voids between the gel particles without the polymer to be detected—glucan entering the inside of the network structure of the gel particles.
  • the volume of the solvent referred to as the external volume of gel particles or the void volume
  • the external volume of the gel particles must be within the specified time (within several minutes) so that the gel is immediately eluted from the column.
  • the internal volume of the column that is less than the amount of liquid eluted from the column at the same time, and corresponds to the amount of liquid until the low molecular substance entering the inside of the network of gel particles elutes from the column
  • the amount of gel (the total volume of the external volume of the gel particles and the volume of the solvent inside the gel particles) is more than 10 times the sample injection volume. This is an 8-glucan measurement method characterized by being placed in
  • the molecular weight of the high molecular weight of 10,000 or more; 8-glucan and low molecular weight sugar, ethanol, Ca1c0f1u0r Sufficient separation from the fluorescent reaction inhibitor cannot be achieved. Disclosure of the invention
  • the present invention relates to a method for measuring / S-glucan by a flow injection system using C a1 cof 1 uor, wherein the external volume of gel particles is within the range of the column eluate within a predetermined time, and
  • the method is characterized in that a gel filtration column with an internal volume of at least 10 times the sample injection volume is placed between the point where the sample of the system is injected into the flow solution and the detector, About the method.
  • Figure 1 shows an example of a conventional system for measuring 5-glucan content by a flow injection method using Ca1c0f1uor.
  • FIG. 2 shows another example of a conventional system for measuring glucan content by a flow injection method using Ca1c0f1uor.
  • FIG. 3 shows an example of a system for measuring the content of / S—glucan using a gel filtration column by the flow injection method using Calcofluor.
  • FIG. 4 shows another example of a system for measuring the content of / ⁇ -glucan using a gel filtration column by the flow injection method using Ca1c0f1uor.
  • FIG. 5 is a diagram showing the effect of the vacant volume of the reaction part in the method of the present invention.
  • FIG. 6 is a diagram showing the effect of the sample injection amount in the method of the present invention.
  • 1 is a C a 1 c0 f1 u0 r reaction solution
  • 2 is a pump
  • 3 is a sample injector
  • 4 is a reaction part
  • 5 is an integrate (data processing such as quantitative calculation of detection data)
  • 6 is a fluorescence detector
  • 7 is a waste liquid
  • 8 is a buffer or distilled water
  • 9 is a gel filtration column.
  • the method of the present invention comprises a system as shown in FIG. 3 and FIG. 4, and the system which has been conventionally used as shown in FIG. 1 and FIG. 2 can be applied as it is.
  • Important points in the measurement method of the present invention are the type of carrier particles used and the volume of the column. Normally, elution of the sample takes too long with the gel filtration column used for analysis. It takes more than 30 minutes), which is unsuitable for the flow fusion method, which is characterized by a short measurement time. However, conversely, when the column volume is greatly reduced to shorten the analysis time, the fluorescence reaction inhibitors of macromolecules: 8-glucan and maltose, ethanol, and Ca1c0f1u0r are reduced. Separation from molecular components may be insufficient.
  • the molecular weight distribution of —glucan in samples such as worts and beads is also considered.
  • the difference changes the peak height, and the measured value is affected by the molecular weight distribution, which does not meet the purpose of the present invention of measuring the total amount of high molecular 5-glucan.
  • the external volume of gel particles in the column used is small, In order to pass through the column, it is necessary that the amount of the solution eluted from the column in a predetermined time is equal to or less than that.
  • the external volume of the gel particles is set to be equal to or less than the column eluate per minute in order to dissolve the polymer-glucan within one minute. That is, it can be analyzed by HPLC within one minute.
  • the present invention generally uses carrier particles having a molecular weight of exclusion limit of 4,000 or more and 300,000 or less, but preferably those having a molecular weight of exclusion limit of about 100,000.
  • carrier particles satisfying such conditions for example, Shodex OHpak SB-803 HQ (trade name, manufactured by Showa Denko KK).
  • a column having a high theoretical plate number (an index indicating the separation ability of the column) is suitable, and it is desirable to use a gel filtration carrier having a theoretical plate number of 10,000 or more.
  • the above column can be used in a system using one pump as shown in FIG. 3, but it is suitable for the fluorescence reaction of Ca1c0fluor and Calcof1uor.
  • problems such as a decrease in resolution due to passing of the buffer solution through the column and rapid deterioration of the column. Therefore, as shown in Fig. 4, the flow liquid in which the sample is injected and passed through the column is separated from the flow liquid containing Ca1c0f1 ⁇ 0r, and after passing through the column, / ⁇ -glucan in the sample is removed.
  • C a 1 c 0 f 1 u 0 r Therefore, it would be more desirable to use a combined system.
  • the position where the gel chromatography column is installed in the system is from the site where the sample is injected into the flowing liquid to the detector, preferably from the site where the sample is injected to Ca 1 c 0 f 1 u 0 r. It is present before reaching the reaction site, and the low-molecular-weight sugar, ethanol, and Ca 1 c0 f 1 uor fluorescent reaction inhibitor in the sample and / S-glucan are separated and eluted first.
  • the polymer / 8-glucan-containing effluent and the Ca1c0f1uor reaction solution are mixed in the reaction zone, and polymer-1 glucan is detected.
  • the inhibitor, sugar and ethanol are also mixed with Calcofluor, passed through a detector, and when the amount of the inhibitor is large, the peak of S-glucan is detected.
  • a negative peak is observed in the peak, there is no special peak because it is usually buried in the tailing of the ⁇ -glucan peak.
  • the above-mentioned inhibitor shows a negative peak, maltose and ethanol generate a positive peak, and it is considered that both cancel each other out and no peak appears.
  • the liquid (solvent) that carries the sample to the gel filtration column is preferably one that does not deteriorate the column and does not affect the reaction between the next Calcofluor and 9-glucan, specifically, distilled water, etc. .
  • a Teflon tube with an inner diameter of 0.5 mm and an empty volume of 0.5 ml was used as the reaction part.
  • the column was filled with Shodex OHpak SB-803 HQ (Limited exclusion molecular weight: 100,000) as a carrier particle into a column with an inner diameter of 6.0 mm and a length of 50 mm. ⁇ (0.5 ml of gel particle external volume, 0.9 ml of column internal volume) was used, and the sample injection volume was 0.02 ml.
  • Purified ⁇ -glucan (manufactured by Sigma) extracted from barley as a standard solution was 30 mg / liter, 50 mg / liter, 75 mg / liter, 100 mg / liter, Dissolve in distilled water to give 150 mg / liter, 200 mgZ liter, and 25 OmgZ liter, and measure the peak height obtained by each standard solution. Then, a calibration curve was created.
  • the / 5-glucan content in the wort E and beer F of the sample was measured in the same manner as in Example 1 at the specified environmental temperature (the temperature around the measuring device was 18, 22, 25 ° C). Then, the / S-glucan content in the sample was determined from a calibration curve prepared using the same standard solution as in Example 1. Table 2 shows the results. Table 2 Changes in ⁇ -glucan content (ppm) in samples at various room temperature
  • Example 2 The peak height was measured in the same manner as in Example 1, except that wort ⁇ and beer F were used as the sample as in Example 2 and the whole system was measured in a thermostat at 20 ° C. Was measured, and the content of / ⁇ -glucan in the sample was determined from a calibration curve prepared using the same standard solution as in Example 1. The results are shown in Table 2.
  • Example 1 As is evident from the results in Table 1, the measured value in Example 1 is 100 Omg Z liter or very close to the theoretical value, whereas the comparative example shows yS in all cases.
  • the measurement time for one sample can be within one minute, and considering the sample injection operation, the conventional method that does not substantially use a column It was found that the measurement time was the same as that of the measurement device of the above.
  • the ambient temperature during measurement must always be constant. Even when the same measurement is repeated, the ambient temperature needs to be the same and constant.
  • Example 4 In Example 1, distilled water was flowed at a flow rate of 1 m1 Zin as a flow liquid on the column side, and Calcofluor was run at a flow rate of 2 m1 Zmin as a mixed liquid after passing through a force ram. The procedure was performed in the same manner as in Example 1 except that a Teflon tube whose 0.5 mm volume was changed to a predetermined value was used and the sample injection volume was 0.05 mL.
  • the vertical axis of the figure shows the relative value when the measured value when the empty volume of the reaction part is 300 u u ⁇ is 1. As is apparent from this figure, no change in the measured value is observed when the volumetric volume is 500 u1 or less. This is presumably because the longer the mixing tube, the higher the separation of the polymer; 5-glucan and the low-molecular yS-glucan.
  • the method of the present invention low content of maltose and the like contained in the sample
  • the / 5-glucan content in a sample can be measured with high accuracy and high reproducibility without being affected by components such as the sugar saccharides ethanol and the calcium fluorescence inhibitor. Therefore, it is possible to objectively compare and evaluate the content of glucan in samples of various cereals, malt extracts, worts, beer, etc.

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Description

明 糸田 β一グルカンの測定方法 技術分野
本発明は、 /8— U, 3) ( 1 , 4) 一 D—グルカン （以下、 β ーグルカンと略記することがある。 ） の測定方法に関し、 さらに詳 しくは各種の大麦をはじめとする穀類や麦芽， 麦汁， ビールなどに 含まれる β一グルカンを測定する方法に関する。 背景技術
下記の構造式で表される C a l c o f l u o rは、 β -グルカン と特異的に結合し、 その結合により蛍光強度が増加する蛍光剤であ り、 この化合物を用いて ーグルカンを定量するフローインジェク ション法がデンマークのカールズベルグ社のョルゲンセンらによつ て報告されている （C a r 1 s b e r g Re s. C o mm υ n . Vol.53 , p.277— 28 5, 1 9 8 8 ; An a l y t i c a -E B C, 3. 1 1. 2.) o
Figure imgf000003_0001
また、 同様の原理による C a l c o f l u o rを用いたフローイ ンジェ ク ショ ン法が数名の研究者によって報告されており （ J 0 u r n a 1 o f t h e I n s t i t u t e o f B r e w i n g, Vol.95, p.327, 1 989 : J o u r n a l o f t h e I n s t i t u t e o f B r ew i n g, Vol.93, p. 396, 1 987 ) 、 近年スウェーデンの T e c a t o r社ゃァ メ リ力の F i a t r on社 （J o u r n a l o f t h e Am e r i c a n S o c i e t y o f B r ewi n g Ch em i s t s , Vol.93 , p.3 9 6, 1 9 87) によって C a l c o f 1 υ o rを用いたフローインジェクショ ンシステムが市販されてい る o
これらはいずれも図 1 もしくは図 2に見られる様なシステムを応 用したものであり、 pH l 0から pH8の範囲のトリス緩衝液もし くはグリシン緩衝液に C a l c o f l u o rを 8〜35mgZリ ツ トルとなるように溶解させた反応液の流液に試料を注入もしくは試 料を注入した溶液の流液を混合し、 適当なチューブを用いS—グル カンと結合させ、 蛍光検出器にてその蛍光強度の増加を測定するも のである。
これらの方法により麦汁， ビール等のサンプル中の —グルカン 含量を決定するにあたり、 大麦より抽出した精製/ S—グルカンを溶 解させた濃度既知の溶液を標準試料として用いている。
し力、し、 これまで報告されている C a 1 c 0 f 1 u 0 rを用いた フローインジヱクション法においてはサンプルである麦汁中の糖や ビール中エタノールの影響により測定値が変化すること、 また、 そ れらの影響がサンプル注入量， 混合部分の空寸体積量等の測定条件 により異なり、 同一のサンプルにおいて —グルカン含量の測定値 が異なることが報告されている。
さらに、 最近に至って麦汁やビール中に C a 1 c 0 f 1 u 0 rの 蛍光反応を阻害する低分子成分 （糖類， エタノール等） が存在する ことや、 それらの麦汁， ビール中における含量が使用する麦芽の種 類， 量等によって異なることが明らかとなった。
これらの糖， エタノール， C a 1 c 0 f 1 u 0 rの蛍光反応阻害 物質といったものが、 麦汁， ビール中の ^ーグルカン含量を従来の C a 1 c 0 f 1 u o rを用いたフローインジェクション法によって 測定する上で誤差を生む要因となることは明らかである。
そのため、 測定するサンプル中の糖やエタノール含量、 C a 1 c 0 f 1 u 0 rの蛍光反応阻害物質等の影響を受けないシステムを構 築することが精度の向上に有効であり、 その開発が待たれている。 本発明の目的は、 C a 1 c 0 f 1 u o rを用いるフローインジェ クション法による ーグルカンの測定において、 その精度と再現性 の向上を図ることにあり、 そのための手段として短いゲル慮過カラ ムを用いて分子量 1万以上の高分子の yg —グルカンは力ラム担体に 保持させることなく素通りさせ、 低分子の糖， エタノール， C a l c 0 f 1 υ 0 rの蛍光反応阻害物質等はカラム担体であるゲル粒子 に数秒から数十秒保持させることにより、 β —グルカンと分離溶出 させるシステム並びに測定条件を設定することである。
また、 使用するカラムの容量を最適化して、 カラムを使用しない 場合と同等の分析時間 （数分 （好ましくは 3分） 以内） で分析でき るようにすることである。
本発明は、 C a 1 c 0 f 1 u o rを用いるフローインジェクショ ンシステムによる —グルカンの測定法において、 サンプルを流液 に注入後、 検出対象である分子量 1万以上の高分子 —グルカンを 所定時間以内 （数分 （好ましくは 3分） 以内） に溶出させ、 かつマ ルトース， エタノール， C a 1 c 0 f 1 u 0 rの蛍光反応阻害物質 といった低分子成分の溶出を高分子の S —グルカンよりも遅らせる ことが可能なゲル濾過カラムにサンプル流液を通し、 目的とする /S ーグルカンと測定値変動の要因となる成分を分離させ、 そのカラム 通過後に蛍光検出器にて測定するシステムである。
以上に述べたように、 本発明は検出対象である高分子 —グルカ ンがゲル粒子の網目構造の内部に入り込むことなく、 ゲル粒子間の 空隙を経てゲル粒子間の空隙の全体積に等しい液量 （ゲル粒子外部 容積量あるいはボイ ド容量という） の溶媒を流した時に速やかに力 ラムから溶出するようゲル粒子外部容積量が所定時間内 （数分以内
(好ましくは 3分以内） ） にカラムから溶出する液量以下の範囲で あり、 かつゲル粒子の網目構造の内部に入り込む低分子物質がカラ ムから溶出するまでの液量に対応するカラム内部容積量 （ゲル粒子 外部容積量とゲル粒子内溶媒容積とを合わせた量） がサンプル注入 量の 1 0倍以上であるゲル it過カラムを、 システムのサンプルを注 入する箇所より検出器までの間に配置することを特徵とする 8—グ ルカンの測定法である。
なお、 サンプル注入量に対して上記力ラム内部容積量が小さいと 、 分子量 1万以上の高分子の; 8—グルカンと低分子の糖、 エタノー ル、 C a 1 c 0 f 1 u 0 rの蛍光反応阻害物質との十分な分離が行 えないことになる。 発明の開示
すなわち本発明は、 C a 1 c o f 1 u o rを用いるフローインジ ェクシヨンシステムによる/ S —グルカンの測定方法において、 ゲル 粒子外部容積量が所定時間内のカラム溶出液量以下の範囲にあり、 かつカラム内部容積量がサンプル注入量の 1 0倍以上であるゲル濾 過カラムを該システムのサンプルを流液に注入する箇所より検出器 までの間に配置することを特徴とする /3 -グルカンの測定方法に関 する。 図面の簡単な説明
図 1 は、 C a 1 c 0 f 1 u o rを用いたフローイ ンジェクショ ン 法による 5—グルカン含有量の従来型測定システムの 1例を示す。 図 2は、 C a 1 c 0 f 1 u o rを用いたフローインジェクショ ン 法による —グルカン含有量の従来型測定システムの他の例を示す。 図 3は、 C a l c o f l u o rを用いたフローインジェクシヨ ン 法による /S —グルカン含有量のゲル濂過カラム使用測定システムの 1例を示す。
図 4は、 C a 1 c 0 f 1 u o rを用いたフローインジェクショ ン 法による / δ —グルカン含有量のゲル濂過カラム使用測定システムの 他の例を示す。
図 5は、 本発明の方法における反応部分の空寸体積量の影響を示 した図である。
図 6は、 本発明の方法におけるサンプル注入量の影響を示した図 である。
図中、 1 は C a 1 c 0 f 1 u 0 r反応液、 2はポンプ、 3はサン プル注入器、 4は反応部分、 5はインテグレ一夕 （検出データの定 量計算等のデータ処理を行う） 、 6は蛍光検出器、 7は廃液、 8は 緩衝液もしくは蒸留水、 9はゲル濾過カラムを示す。 発明を実施するための最良の形態
本発明の方法は、 図 3および図 4に示される様なシステムからな り、 図 1 および図 2に示される様な従来用いられていたシステムを そのまま応用することが可能である。
本発明の測定方法における重要な点として、 使用する担体粒子の 種類， カラムの容積がある。 通常、 用いられている分析用のゲル濾 過カラムを用いた場合、 サンプルの溶出に時間がかかりすぎ （分析 時間は 3 0分以上要する） 、 短時間での測定を特徴とするフローィ ンジ クシヨン法には不適切となる。 しかし、 逆に分析時間を短縮 するためカラムの容積を大幅に減少させると、 高分子；8—グルカン とマルト一ス， エタノール， C a 1 c 0 f 1 u 0 rの蛍光反応阻害 物質の低分子成分との分離が不十分になる恐れがある。
また、 目的とする ; β—グルカンが担体の粒子に保持され、 分子量 ごとに分離溶出した場合 （分子ふるいがかかると言う） 、 麦汁， ビ ール等の試料中の —グルカンの分子量分布の違いによってピーク 高さが変化し、 測定値が分子量分布の影響を受けることになり、 高 分子 5—グルカンの総量を測定するという本発明の目的に適合しな くなる。
したがって、 短時間で高分子の /S—グルカンと糖， エタノール， C a 1 c 0 f 1 υ 0 rの蛍光反応阻害物質の低分子物質を分離する ことが可能で、 かつ高分子 /8—グルカンを分子ふるいにかけること なく溶出できるゲル濾過カラ厶の要件が必要となる。
具体的にはフローインジェクショ ン法として、 高分子 S—グルカ ンを早く溶出する必要があるため、 使用するカラムのゲル粒子外部 容積量は小さい方が望ましく、 高分子 /S—グルカンを短時間で通過 させるためには、 所定時間にカラムより溶出される液量以下である ことが必要である。
また、 低分子の糖， エタノール， C a 1 c 0 f 1 u 0 rの蛍光反 応阻害物質を分離するためには、 少なく ともサンプル注入量の 1 0 倍量以上のゲル粒子充填後のカラム内部容積量が必要と考えられる。 なお、 後述する実施例では、 高分子 —グルカンを 1分以内で溶 出させるようにするため、 上記のゲル粒子外部容積量は 1分当たり のカラム溶出液量以下としてある。 すなわち、 1分以内に H P L C で分析することができる。 次に、 目的とする高分子8—グルカンを分子ふるいにかけること なく、 高分子 /S—グルカンと低分子の糖， エタノール， C a l c o f 1 u 0 rの蛍光反応阻害物質を分離するためには、 限界排除分子 量 4千以上 30万以下の担体粒子を用いる必要があると考えられる。 限界排除分子量が 30万を超えるものを用いた場合、 麦汁， ビー ル中の高分子S—グルカンが分子ふるい作用を受けるとともに、 溶 出が遅れるため、 低分子の糖， エタノール， C a 1 c 0 f 1 u 0 r の蛍光反応阻害物質との分離が不十分なものとなる。 また、 限界排 除分子量が 4千未満のものを用いた場合、 逆に低分子の糖， ェタノ ール， C a 1 c 0 f 1 u 0 rの蛍光反応阻害物質の溶出が早くなる ため、 —グルカンとの分離が不十分なものとなる。
以上の理由から、 本発明では通常、 限界排除分子量 4千以上 30 万以下の担体粒子を用いるが、 特に限界排除分子量 1 0万前後のも のが望ましい。 このような条件を満たす担体粒子としては、 例えば Sh o d e x OHp a k SB— 80 3 HQ (商品名、 昭和電 ェ株式会社製） . A s a h i p a k G S 320 HQ (商品名、 昭和電工株式会社製） 等が挙げられる。
また、 本発明を実施するには、 理論段数 （カラムの分離能を表す 指標） の高いカラムが適しており、 1万以上の理論段数を有するゲ ル濾過担体を用いることが望ましい。
本発明の方法を実施する場合、 図 3に示した様なポンプ 1つを用 いたシステムにおいても上記カラムを使用することできるが、 C a 1 c 0 f l u o rおよび C a l c o f 1 u o rの蛍光反応に合わせ た緩衝液をカラムに通すことによる分離能の低下やカラムの劣化が 早い等の問題がある。 それ故、 図 4に示すように、 サンプルを注入 しカラムに通す流液と C a 1 c 0 f 1 υ 0 rを含む流液は別にし、 カラム通過後、 試料中の/ δ—グルカンと C a 1 c 0 f 1 u 0 rを反 応、 結合させるシステムとした方がより望ましいと考えられる。 また、 該システム中にゲル濂過カラムを設置する位置は、 サンブ ルを流液に注入する部位から検出器までであり、 好ましくは該サン プル注入部位から C a 1 c 0 f 1 u 0 r反応部位に至るまでの間に 存在し、 サンプル中の低分子の糖， エタノール， C a 1 c 0 f 1 u o rの蛍光反応阻害物質と /S—グルカンとが分離され、 先に溶出し てくる高分子 /8—グルカン含有流液と C a 1 c 0 f 1 u o r反応液 とが反応部分で混合され、 高分子 一グルカンが検出される。
なお、 本発明の方法では、 ^ーグルカン検出後、 前記阻害物質， 糖， エタノールも同様に C a l c o f l u o rと混合され、 検出器 を通り、 前記阻害物質が多い場合には、 S—グルカンのピークの後 にマイナスピークが見受けられるが、 通常は ^ーグルカンのピーク のテーリ ングに埋もれているため、 特別なピークは見受けられない。 なお、 前記阻害物質が負のピークを示すのに対し、 マルトース， エタノールは正のピークを生じるため、 両者が打ち消し合ってピー クが表れないものと考えられる。
ゲル濾過カラムにサンプルを運ぶ流液 （溶媒） としては、 カラム を劣化させず次の C a l c o f l u o r と；9ーグルカンとの反応に 影響を与えないものが望ましく、 具体的には蒸留水等が考えられる。
C a 1 c 0 f 1 u o rを用いるフローインジェクション法による 则定装置にゲル濾過カラムを組み入れて使用する場合、 測定時の環 境温度 （測定を行う室の温度） を常に一定にしておく必要がある。 しかも、 その環境温度値を 1 0〜4 0°Cの範囲、 より好ましくは 1 5〜 3 0ての環境温度範囲に設定することが望ましい。
これは、 後述の実施例においても説明するが、 測定時の環境温度 が変化すると、 S—グルカンの測定値が変化するもので、 カラムの 分離能やサンプル中に含まれる低分子の yS—グルカンと C a 1 c 0 f 1 u o r との反応性が周囲温度に応じて変化するからである。
次に、 本発明を実施例により詳しく説明する。
実施例 1
図 4に示したシステムを使用して実施した。 カラム側の溶媒とし ては蒸留水、 カラム通過後の混合液として、 C a 1 c 0 f 1 u 0 r 2 0, T r i t o n X 1 0 0を含む 0. 1 M G l y c i n e - Na OH緩衝液 （pH 9. 2) を使用し、 流速は両液とも 2m lノ m i nの条件で実施した。 なお、 蛍光検出器の励起波長は 3 6 0 nm、 蛍光波長は 4 2 0 nmで測定した。 0. 1 M G l c i n e 一 Na OH緩衝液の代わりに、 0. 1 M T r i s - HC 1緩衝液 (p H 8. 2) を用いてもよい。
反応部分として内径 0. 5 mm, 空寸体積量 0. 5 m lのテフ口 ンチューブを使用した。 また、 カラムは担体粒子として昭和電工株 式会社製の 「S h o d e x OHp a k S B - 8 0 3 HQ」 （ 限界排除分子量 1 0万） を内径 6. 0 mm, 長さ 5 0 mmのカラム に充塡したもの （ゲル粒子外部容積量 0. 5 m l， カラム内部容積 量 0. 9m 1 ) を使用し、 サンプル注入量は 0. 0 2m l とした。 標準溶液として大麦より抽出した精製^—グルカン （S i gma 社製） を 3 0 m g /リ ッ トル、 5 0 m gノリ ッ トル、 7 5 m gノリ ッ トル、 1 0 0 m g /リ ッ トル、 1 5 0 m g /リ ッ トル、 2 0 0 m gZリ ッ トル、 2 5 O mgZリ ツ トルとなるように蒸留水中に溶解 させたものを使用し、 各標準溶液により得られる測定ピークの高さ より検量線を作成した。
一方、 ビールに 8—グルカナ一ゼを添加したビール中の yS—グル カンを分解後、 加熱処理により —ダルカナーゼを失活させて調製 した；3—グルカンを含まないビールに大麦 yS—グルカンを 1 0 0m g/リ ッ トルとなるように溶解したものをサンプル A、 同様に調製 した ζδ—グルカンを含まない麦汁に大麦 /S—グルカンを 1 0 Omg リ ッ トルとなるように溶解したものをサンプル B、 1 0 % (w/ v) のマルトース水溶液に大麦 J3—グルカンを 1 0 OmgZリ ツ ト ルとなるように溶解したものをサンプル Cとし、 さらに 5 % ( v/ V ) のェタノール水溶液に大麦 /3—グルカンを 1 0 O mgノリ ッ ト ルとなるように溶解したものをサンプル Dとし、 各サンプルのピー クの高さを測定し、 上記検量線よりサンプル中の /8—グルカン含量 を決定した。 結果を第 1表に示す。 なお、 環境温度 （測定装置周辺 の温度） は 2 0 °Cである。
第 1表 β —グルカン含量（ppm) に対する測定条件の影響
—グルカン含量 （p pm)
サンプル
実施例 1 比較例 1 比較例 2 比較例 3 サンプル A 1 0 0 8 1 8 3 8 4 サンプル B 1 0 1 8 4 8 6 8 6 サンプル C 1 0 1 1 1 0 1 0 4 1 1 1 サンブル D 1 0 0 1 0 8 1 0 3 1 0 7 実施例 2
実施例 1 と同様にしてサンプルの麦汁 Eおよびビール F中の /5— グルカン含量を所定の環境温度 （測定装置周辺の温度は 1 8, 2 2， 2 5 °C) にて同様に測定し、 実施例 1 と同様の標準溶液を用いて作 成した検量線よりサンプル中の/ S—グルカン含量を決定した。 結果 を第 2表に示す。 第 2表 種々の室温下における試料中の ^ -グルカン含量（ppm) の変化
Figure imgf000013_0001
実施例 3
サンプルとして実施例 2と同様に麦汁 Ε， ビール Fを用い、 かつ 2 0 °Cの恒温槽にシステム全体を入れて測定を行ったこと以外は実 施例 1 と同様にしてピークの高さを測定し、 実施例 1 と同様の標準 溶液を用いて作成した検量線よりサンプル中の/ δ —グルカン含量を 決定した。 結果を第 2表に示す。
比較例 1
図 2に示したシステムを使用し、 ゲル濾過カラムが取り付けられ ていないこと以外は実施例 1 と同一条件で試料のサンプル A〜 Dに ついてピークの高さを測定し、 実施例 1 と同様の標準溶液を用いて 作成した検量線よりサンプル中の —グルカン含量を決定した。 結 果を第 1表に示す。
比較例 2
サンプル注入量を 0 . l m 1 にしたこと以外は実施例 1 と同一シ ステム、 同一条件でサンプル A〜 Dについてピークの高さを測定し、 実施例 1 と同様の標準溶液を用いて作成した検量線よりサンプル中 の S —グルカン含量を決定した。 結果を第 1表に示す。
この場合、 カラム内部容積量は 0 . 9 m lであるから、 サンプル 注入量の 9倍の容量を有することとなる。 比較例 3
ゲル濂過粒子として昭和電工株式会社製の 「S h o d e x O H p a k S B - 8 0 4 H Q」 （限界排除分子量 2 0 0万） を使用 したこと以外は実施例 1 と同一システム、 同一条件にてサンプル A 〜Dについてピークの高さを測定し、 実施例 1 と同様の標準溶液を 用いて作成した検量線よりサンプル中の S —グルカン含量を決定し た。 結果を第 1表に示す。
第 1表の結果から明らかなように、 実施例 1 の測定値が理論値通 り 1 0 O m g Zリ ッ トルもしくはこれに非常に近い値を示すのに対 し、 比較例ではいずれも yS —グルカンとマルト一ス， エタノール， C a 1 c 0 f 1 υ 0 r蛍光反応阻害物質との分離ができない、 もし くは不十分なため、 理論値よりも低い値や高い値を示している。 したがって、 適切な要件を備えたゲル爐過カラムを使用すること により、 ビールや麦汁中に含まれる測定値の変動要因となる低分子 物質を —グルカンと分離することが可能であり、 より正確な測定 ができることが示された。
また、 実施例 1の測定装置， 条件を見れば明らかなように、 1サ ンプルの測定時間は 1分以内で可能であり、 サンプル注入操作を考 慮すれば、 実質的にカラムを用いない従来の測定装置の場合と測定 時間は変わらないことが認められた。
なお、 第 2表が示すように、 測定装置全体を一定温度に保つこと により、 室温によらず一定の測定値が得られ、 さらに精度が向上す ることが認められた。
すなわち、 測定時の周囲温度は常に一定の温度で行う必要がある。 また、 同一測定を繰り返す場合にも環境温度は同一値、 かつ一定で ある必要がある。
実施例 4 実施例 1 において、 カラム側の流液として蒸留水を 1 m 1 Zm i n の流速で、 力ラム通過後の混合液として C a l c o f l u o rを 2 m 1 Zm i nの流速で実施し、 さらに反応部分として内径 0 . 5 m m、 空寸体積量を所定値に変化させたテフロンチューブを使用し、 さら にサンプル注入量を 0 . 0 0 5 m l としたこと以外は実施例 1 と同 様にして行った。
上記の条件で反応部分の空寸体積量を変化させて測定した。 得ら れた結果を図 5に示す。
図の縦軸は反応部分の空寸体積が 3 0 0 u \ のときの測定値を 1 とした場合の相対値を示している。 この図から明らかなように、 空 寸体積量 5 0 0 u 1以下では測定値の変動が認められない。 このこ とは、 ミキシングチユーブが長いほど分離された高分子 ;5—グルカ ンと低分子 yS —グルカンとが再度混合されてしまうためと考えられ 実施例 5
実施例 4 と同一条件で、 空寸体積量を 0 . 5 m l とし、 サンプル 注入量を 5 1から 8 0 1 まで変化させて測定を行った。 その結 果を図 6に示す。 なお、 図 6の縦軸はサンプル注入量を 5 1 とし た時の測定値を 1 とした場合の相対値を示している。 この図から明 らかなように、 サンプル注入量を 8 0 1程度に増やしても、 測定 誤差はほとんど生じていない。 すなわち、 カラム内部容積量 9 0 0 1 に対してサンプル注入量を 1 1 1以下にすること （カラム内 部容積量がサンプル注入量の 1 1倍量以上となること） により、 測 定値の変動はほとんど認められない。 産業上の利用可能性
本発明の方法によれば、 サンプルに含まれるマルトース等の低分 子糖類ゃェタノール， Ca l c o f l u o r蛍光反応阻害物質など の成分による影響を受けないで、 サンプル中の /5—グルカン含有量 を高い精度で、 かつ再現性よく測定することができる。 したがって、 種々の穀類， 麦芽抽出液， 麦汁， ビールなどのサンプル中の ーグ ルカン含有量を客観的に比較、 評価することが可能である。

Claims

言青 求 の 範 囲
(1) C a 1 c 0 f 1 u o rを用いるフローイ ンジェクショ ンシス テムによる S—グルカンの測定方法において、 ゲル粒子外部容積量 が所定時間内のカラム溶出液量以下の範囲にあり、 かつカラム内部 容積量がサンプル注入量の 1 0倍以上であるゲル濾過カラムを該シ ステムのサンプルを流液に注入する箇所より検出器までの間に配置 することを特徴とする /8— （ し 3 ) ( 1 , 4 ) — D—グルカンの 測定方法。
(2) ゲル粒子として、 限界排除分子量 3 0万以下 4千以上のもの を使用する請求項 1記載の/ S— （ 1 , 3) (し 4 ) 一 D—グルカ ンの測定方法。
(3) 試料を注入した蒸留水をカラムに通過させた後、 C a l c o f 1 υ 0 rを含み、 C a 1 c o f 1 u o rの蛍光反応に適した組成 の流液と混合させる請求項 1 または 2記載の — （ 1， 3 ) ( 1 ,
4 ) —D—グルカンの測定方法。
(4) 測定時における測定装置周辺の温度を所定値かつ一定温度に 保つ請求項 1〜 3のいずれかに記載の S— （し 3) ( 1 , 4 ) 一 D一グルカンの測定方法。
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