WO1996029093A1 - Tumorzellen zur verwendung als tumorvakzine, die mindestens ein antigen, für welches bereits eine immunantwort besteht, enthalten - Google Patents

Tumorzellen zur verwendung als tumorvakzine, die mindestens ein antigen, für welches bereits eine immunantwort besteht, enthalten Download PDF

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WO1996029093A1
WO1996029093A1 PCT/EP1996/001142 EP9601142W WO9629093A1 WO 1996029093 A1 WO1996029093 A1 WO 1996029093A1 EP 9601142 W EP9601142 W EP 9601142W WO 9629093 A1 WO9629093 A1 WO 9629093A1
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tumor
cells
antigen
vaccine according
tumor vaccine
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Application number
PCT/EP1996/001142
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Inventor
Tamàs SCHWEIGHOFFER
Original Assignee
Boehringer Ingelheim International Gmbh
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001176—Heat shock proteins

Definitions

  • Turaor cells for use as tumor vaccines which contain at least one antigen for which an immune response already exists.
  • the invention relates to tumor vaccines.
  • tumor vaccines are based on three prerequisites: 1. There are qualitative and quantitative differences between tumor cells and normal cells; 2. The immune system is well suited to determine these differences; 3. The immune system can be taught - through active specific immunization with vaccines - to recognize these differences and to induce the rejection of the tumor.
  • the tumor must present new antigens or neoepitopes that do not occur on normal cells.
  • the immune system needs to be activated to respond to these new antigens.
  • a major obstacle to cancer immunotherapy is the low immunogenicity of tumors, particularly in humans. This is surprising in that the large number of genetic changes in advanced cancers should lead to the formation of peptide neoepitopes, which should be recognized in the context of MHC-I molecules by cytotoxic lymphocytes.
  • tumor vaccines based on active immunotherapy have been produced in various ways; an example of this are irradiated tumor cells, which are treated with adjuvants such as Corynebacterium parvum to induce new immune responses.
  • tumor cells that secrete various cytokines, whereby the expression of foreign genes in tumor cells is not induced here, but rather a change in the immunological environment of the tumor cell is sought. This is intended either to enhance the presentation of tumor-specific antigens to the immune system or to activate tumor-specific lymphocytes.
  • Pardoll 1992.
  • Tumor cells that have been genetically engineered to secrete large amounts of various cytokines such as IL-2, GM-CSF, or to express co-stimulating molecules have been shown in experimental animal models to trigger strong host anti-tumor responses (Fearon et al., 1991; Dranoff et al., 1993; Zatloukal et al., 1993).
  • cytokines such as IL-2, GM-CSF
  • co-stimulating molecules have been shown in experimental animal models to trigger strong host anti-tumor responses (Fearon et al., 1991; Dranoff et al., 1993; Zatloukal et al., 1993).
  • cytokine-secreting tumor vaccines for such applications has not yet been established.
  • CTLs cytotoxic T-lymphocytes
  • the object of the present invention was to provide a new tumor vaccine with which the immune tolerance to unknown tumor antigens can be eliminated.
  • the object of the invention is to achieve anti-tumor immunity in tumor-tolerant hosts by expanding the antigen spreading to tumor antigens by triggering a well-defined cell response of the memory type that already exists in the host and countering it against tumor cells directs.
  • the tumor vaccine according to the invention is characterized in that it contains the tumor cells which are modified in such a way that they contain one or more antigens for which an immune response already exists in the individual to be treated.
  • the modification of the tumor cells consists in that, after Transfection with a DNA encoding the antigen, expressing the antigen.
  • Molecular units e.g. Complete proteins, fragments thereof, peptides, glycolipids or molecules modified by stereospecific glycosylation are suitable. These molecules are expressed by the tumor cells in such a way that they are recognized by the immune system, in particular by T cells or by immunoglobulins, and can trigger an efficient immune response. For the present invention, the effect is exploited that the immune system has a memory for previously perceived antigens.
  • This memory capacity is expressed at the cellular level in particular by the fact that T cells and plasma cells (B cells) react with increased reactivity to the reappearance of the antigen, which now, when repeated, is a "recognition antigen", which leads to rapid reactivity Distribution of an increased volume of cytokines, an acceleration of the proliferation of T or B cells and an acceleration of the secondary reactions required for the processing of these antigens.
  • the consequence of this is the elimination of the antigen or the elements associated therewith (viruses, bacteria, cells) through an increased cytolytic activity and / or antibody production.
  • the response of the immune system triggered by the recurrence of the recognition antigen is referred to as the "memory response".
  • the tumor vaccine according to the invention it is thus brought about that the already existing specific memory T cells reach the immunogen, ie the tumor cells of the vaccine, because they express exactly the antigen against which the specific memory T cells are directed.
  • the processes triggered in the host by the tumor vaccine according to the invention furthermore lead to the fact that the refocusing of the memory response on the tumor cells not only breaks the tolerance of the host to the tumor, but also leads to a faster and more predictable build-up of the anti-tumor immunity .
  • mice which had been pre-immunized with either the whole BCG (live vaccine) or with the purified recombinant hsp65 protein and thus had been made ready for a memory response, had an immunity against subsequent tumor setting with wild-type M3 cells could induce.
  • the hsp65 hybrid protein used served as a prototype for a recognition antigen.
  • M. bovis BCG is a representative of immunogens that leave stable and long-lasting, in many cases lifelong, immunity. In immune people, this protection can be characterized as a so-called “delayed-type hypersensitivity reaction” (DTH).
  • DTH delayed-type hypersensitivity reaction
  • This reaction is primarily generated by T cells of the Thl type (inflammatory T cells) (Mutis et al., 1993; ElGhazali et al., 1993); it is this reaction pattern that is a prerequisite for an efficient anti-tumor reaction (Puccetti et al., 1994).
  • Hsp65 of M. bovis had been shown to be one of the main targets of this host response (Kaufmann, 1988; Kaufmann et al., 1987).
  • mycobacteria or their derivatives has already been proposed with regard to various aspects for various tumor therapy approaches: these approaches include the use of various forms of BCG as an adjuvant for administration together with irradiated, lysed or otherwise disabled growth cells (Bloemena et al., 1993); Approaches that make use of the cross-reactivity between BCG-derived protein antigens and tumor-specific antigens; Approaches based on the transfection of a complete hsp65 from M. leprae in tumor cells to elicit an immune response.
  • BCG-hsp65 was also shown to be antigenic determinants with the hepatoma cell line "Line 10" has in common (Ahsan and Sasaki, 1991).
  • Guinea pigs that had been immunized with sonicated BCG membranes showed no or only delayed tumor development when they were given a tumor with cells from the hepatoma line.
  • T cells from rats that had been treated with live BCG also showed cytotoxicity against an H-ras-transformed fibrosarcoma cell line (Ta ura et al., 1993); in this case the mammalian homologue hsp70 was the target for the reaction.
  • tumor vaccines in the form of isolated hsp-peptide complexes have been shown to cause effective protective immunity.
  • this protection is tumor-specific, which shows that it is not specific for hsp as such, but is due to the peptides associated with hsp (Udono et al., 1994).
  • Heat shock proteins are so-called molecular "chaperones", a family of proteins with a high degree of cross-species agreement. They are immunogenic, presumably because they bind peptides to them non-covalently.
  • Lukacs et al., 1993 and WO 94/11513 proposed a tumor vaccine consisting of tumor cells transfected with an hsp or another "chaperone". In this System, the antitumor effect may be a direct result of the chaperone function of the transfected protein.
  • the "chaperone” function is a kind of companion function for other proteins.
  • the antitumor effect may be due to the increased chaperone function for the tumor suppressor protein p53, which leads to the correct folding and conformation of inactive p53, thereby eliminating its loss of the tumor suppressor function becomes.
  • the present invention differs from the proposal described in WO 94/11513 in that the immune response already present in the host is used for the production and use of the tumor vaccine according to the invention, in that it is directed against the antigen expressed by the tumor cells of the tumor vaccine.
  • the fact that the prerequisite for an existing immune response is present is shown in the animal experiments carried out in that Heatl-expressing M3 tumor cells grow in naive mice with the kinetics of wild-type cells.
  • the tumor vaccine according to the invention is not restricted to hsp65 derivatives or other proteins with chaperone function.
  • the test results obtained in the context of the present invention show on the basis of a Recognition antigen against which an immune response of the host already exists, that this immune response can be specifically directed against tumor cells in order to stop tumor growth.
  • the protective mechanism which can be achieved with the tumor vaccines according to the invention differs from that of the tumor vaccines of the prior art: due to its shortening, the Heatl protein used in the experiments does not represent a functional hsp with regard to the chaperone effect; furthermore, due to its attached signal sequence and the GPI (glycosyl-phosphatidyl-inositol) link modification, it is directed to an intracellular biosynthetic pathway that differs from that of the natural hsp.
  • the present invention differs from the tumor vaccines of the prior art not only with regard to the principle on which it is based, but also with regard to the proposed application and mode of action, hsp65 from BCG was examined within the scope of the present invention on behalf of other recognition antigens to determine whether the mechanism of Redirection of the memory response to tumor cells and the defense mechanisms triggered thereby by the host organism can be used specifically for a new application principle for tumor therapy.
  • the present invention can be widely used as a general strategy for the immunotherapy of tumor diseases.
  • all proteins or fragments are considered as Recognizing antigens (or the sequences coding therefor) are suitable for producing the tumor vaccine for which a corresponding memory response is present in the organism to be treated.
  • the antigen must be well recognized by the host's immune system. It is advantageous if the already existing immune response is present as a cellular response in the form of memory T lymphocytes or in the form of DTH protection. However, the immune response can also manifest itself in the form of antibodies against the antigen, provided that the host has a correspondingly high titer for the recognition of the antigen.
  • the DNA molecules coding for them are used, at least one partial sequence of the recognition antigen should already be known (or the antigen identified and purified so far to determine partial sequences), which enables the production of vectors and thus its expression on the cells used for the tumor vaccine.
  • antigens are most easily found among the derivatives of common human pathogens that cause long-term "memory" after natural infections or after immunizations, especially vaccinations.
  • the tumor vaccine according to the invention For the application of the tumor vaccine according to the invention to larger patient populations, it is therefore expedient in practice to test the patients to be treated as to whether they have an immune response to a previously defined antigen, a pathogen, for example whether they are active against BCG, tetanus, Rubella, measles, hepatitis B, herpes, influenza, etc. are immune.
  • a pathogen for example whether they are active against BCG, tetanus, Rubella, measles, hepatitis B, herpes, influenza, etc. are immune.
  • diagnostic tests based on immunological methods for example ELISA tests, are known and are routinely used; an example of this is the tuberculin test.
  • a possible application strategy can be to use individually produced tumor vaccines for the individual patient on the basis of the individually determined immunity against certain antigens in this patient; i.e. that the antigens used for the production of the tumor vaccine are derived from the pathogens against which the patient is immune.
  • An alternative strategy is based on the use of a tumor vaccine that is uniform for this population group in accordance with the statistical distribution that a larger population group has with regard to immunity to different pathogens. Such a tumor vaccine then expresses a mixture of antigens that covers this distribution.
  • the prerequisite for the use of the present invention that the patients to be treated must have immunity to the antigen expressed by the tumor cells of the tumor vaccine is not a restriction for practice
  • allogeneic cells which take over the function of the memory cells instead of the host's own cells, can be administered to the patient as a supportive measure, e.g. before or simultaneously with the tumor vaccine according to the invention or in a mixture with it.
  • allogeneic memory cells e.g. those described in GB-A 2230790 are suitable.
  • Suitable antigens are the membrane protein LMP of the Epstein-Barr virus (Trivedi et al., 1991), influenza nucleoproteins (Bowness et al., 1994; DiBrino et al., 1993), tetanus toxin fragments (Valmori et al ., 1994; Reece et al., 1993), adenovirus coat protein or fragments thereof (Grunhaus et al., 1994; Hermiston et al., 1993), hepatitis B virus antigen (Folgori et al., 1994; Lo Man et al., 1993) a 10 kDa protein from Mycobacterium tuberculosis (Barnes et al., 1992), Herpes Simplex virus antigens (Bonneau et al., 1993), or Cyto ceremoniovirus antigens (Berencsi et al., 1993).
  • Complete cDNAs which code for a protein of a pathogenic organism can be used for the transfection of the tumor cells.
  • a protein of a pathogenic organism such as bacterial or viral proteins, in particular virus capsid proteins (Marrack and Kappler, 1994)
  • virus capsid proteins Marrack and Kappler, 1994
  • DNA fragments which code for antigens can be used, the size limitation being given by the fact that an MHC presentation or an antibody recognition of the expressed antigens must take place, which is generally given with a size of at least 8 amino acids is. If fragments are used, those sequence segments which code for epitopes are preferably used.
  • sequence sections can also be used for the transfection of the tumor cells which have mutations.
  • mutations which consist in the exchange of one or more amino acids and / or in deletions, serve above all to increase the stability of the expressed antigen, for example by slowing down its degradation in the tumor cell, or to increase the affinity of the antigen for the immunogenic reaction partner.
  • a further modification of the antigenic sequences can consist of adding signal or regulative sequences which promote the most advantageous presentation possible with regard to the recognition of the antigen.
  • signal or regulatory sequences are natural or derived from natural sequences that normally control the synthesis and transport of cellular proteins, e.g. the GPI link sequence (Powell et al., 1991; Chan et al., 1991; Robinson et al., 1991), the signal sequence of HSA or the insertion signal sequence (Minev et al., 1994; Bacik et al. , 1994).
  • Expression of the recognition antigen by the tumor cell either causes it to be presented as such directly on the cell surface (this is particularly the case with antigens that are recognized by antibodies), or it is processed within the cell and a fragment thereof on the Cell surface is presented using MHC or HLA molecules.
  • the administration of antigen mixtures is advantageous, in particular in order to reinforce the first recognition of the tumor vaccine by the host or in view of the application to broader sections of the population.
  • the selection of a suitable combination of recognition antigens is preferably made with a view to use on a patient from whom an immune response which already exists against these antigens is known from the outset or which is determined before the tumor vaccine is used.
  • a selection of antigens in the form of purified plasmids which each contain the sequence coding therefor.
  • the standard methods known for the transfection of higher eukaryotic cells can be used, which include gene transfer using viral vectors (retrovirus, adenovirus, adeno-associated virus) or physical methods (transfection using cationic peptides); Overviews of common methods are e.g. by Mitani and Caskey, 1993; Jolly, 1994; Vile and Rüssel, 1994; Tepper and Mule, 1994; Zatloukal et al., 1993.
  • a preferred method for the transfection of the tumor cells in the context of the present invention is based on the method described in WO 93/07283, which is also applicable to the production of tumor vaccines.
  • This method uses a conjugate of a ligand for the target cell and one Substance with the ability to bind to DNA, especially a polycation such as polylysine, and is based on receptor-mediated endocytosis of the conjugate / DNA
  • transfected tumor cells can be used.
  • individual e.g. with multiple recognition antigen sequences
  • transfected tumor cells can be used.
  • suitable conjugates e.g. Transferrin-polylysine conjugates and adenovirus-polylysine conjugates, complexed and the tumor cells incubated with the transfection complexes thus obtained.
  • peptides as recognition antigens
  • the tumor cells of the tumor vaccine according to the invention are autologous (patient's own) and / or allogeneic cells. Allogeneic tumor cells (from tumor cell lines) can be used if the antigens on them at least partially match those of the patient's autologous tumor cells. Examples of allogeneic cells which can serve as the basis for the tumor vaccine according to the invention are e.g. in WO 91/06866 and in US-A 5,030,621.
  • the tumor cells are inactivated such that, while maintaining their ability to express the antigen, they lose their ability to divide.
  • the proportion of the modified cells in the total number of cells can be varied, preferably it is at least about 10%.
  • the recognition antigen is expressed and presented by the tumor cell in an amount that balances the recognition antigen and those contained on the cell from the outset Corresponds to tumor antigens, which ensures that, in the course of the memory response to the recognition antigen, the tumor antigens are also recognized.
  • This amount can be determined, for example, by means of series experiments, in which the cells are transfected under different conditions or, for example, with different vectors which enable expression of different strengths.
  • the tumor vaccine according to the invention can optionally be combined with additional immunostimulating measures.
  • a measure may consist of immunostimulating proteins, e.g. Add cytokines such as interleukin-2, TNF- ⁇ , IFN- ⁇ , etc. and / or the tumor vaccine in the form of a mixture of tumor cells which express the recognition antigen with other tumor cells producing one or more immunostimulating proteins, such as e.g. are described in WO 94/21808, or fibroblasts.
  • T cells respond to the tumor vaccine Corresponds to tumor antigens, which ensures that, in the course of the memory response to the recognition antigen, the tumor antigens are also recognized. This amount can be determined, for example, by means of series experiments, in which the cells are transfected under different conditions or, for example, with different vectors which enable expression of different strengths.
  • the tumor vaccine according to the invention can optionally be combined with additional immunostimulating measures.
  • a measure may consist of immunostimulating proteins, e.g. Add cytokines such as interleukin-2, TNF- ⁇ , IFN- ⁇ , etc. and / or the tumor vaccine in the form of a mixture of tumor cells which express the recognition antigen with other tumor cells producing one or more immunostimulating proteins, such as e.g. are described in WO 94/21808, or fibroblasts.
  • Fragments i) and iii) were subcloned separately into pUC19 (Pharmacia), the plasmids containing an insert were identified by restriction analysis, and fragment i) with HindIII / Apal and fragment iii) with AccI and EcoRI digestion were released. The isolated three fragments were ligated into a HindIII / EcoRI cut and purified pUC19 plasmid; Clones in the correct order i - * ii - * iii were confirmed by means of enzymatic digestion and transferred to the expression vector pCDNAl under the control of the CMV / T7 promoter (Boshart et al., 1985).
  • the vector pHeat2 was obtained by converting an EcoRI / SalI fragment of the plasmid pRIB1300, which contains the complete coding sequence of hsp65, into pCDNAl. The structure of the two constructs was confirmed by sequence analysis.
  • Cells from the mouse melanoma cell line Cloudman S91 (clone M3; ATCC No. CCL 53.1; Zatloukal et al., 1995) or C0S-7 cells (ATCC CRL1651) were placed in 6 cm plastic dishes or T25 culture bottles, coated with 0.1% gelatin, grown in DMEM medium containing 10% FCS, 2 mM glutamine and antibiotics and then transfected.
  • the transfection of the cells with the vector pHeatl was transfected using the method referred to as "adenovirus-assisted transfer infection" (Cotten et al., 1992).
  • the transfection complexes were prepared by first mixing biotinylated, 8-methoxypsoralen / UV-inactivated adenovirus dl 1014 in 100 ⁇ l HBS (1.2 x 10 12 particles per ml) with streptavidinylated polylysine 290 (StreptpL) in 100 ⁇ l HBS and incubating for 30 min at room temperature. Then 6 ⁇ g plasmid DNA in 150 ⁇ l HBS was added, mixed well and incubated for a further 30 min. Then polylysine-modified human transferrin (TfpL) in 150 ⁇ l HBS was added, mixed thoroughly and incubated for 30 min.
  • TfpL polylysine-modified human transferrin
  • 3 x 10 ⁇ cells were treated with complexes containing 3 x 10 9 adenovirus particles dll014, 600 ng StreptpL, 6 ug pCMVL and 6.8 ug TfpL. After the transfection, the culture medium was changed and the cells were left to stand for 24 hours before further use.
  • the cells were then analyzed using the method described by Zatloukal et al., 1995 (FACS analysis, "Fluorescence Activated Cell Scanning") with antibodies of the designation IIH9, IVD8, CBA1, HAT5, IIC8 (they are cross-reactive monoclonal Antibodies against M. leprae or M. tuberculosis (Young et al., 1992); the antibodies were obtained from Hansen Disease Laboratories, CDC, Atlanta, GA.), Jlld (ATCC No. TIB 183) and polyclonal anti-BCG serum (Dako) colored.
  • FACS analysis Fluorescence Activated Cell Scanning
  • the Heatl hybrid protein is expressed in COS-7 cells because these cells allow high expression through episomal replication of the vector (Siromons, 1993).
  • the GPI exchange motif at the N-terminus of the construct results in an end product with a GPI anchor which is directed against a protein on the outer surface of the cell membrane and therefore allows positive cells to be identified by means of FACS analysis.
  • the result of the characterization with the various antibodies against members of the 65 kDa heat shock protein family from related mycobacteria, which were used to recognize the purified recombinant hsp65 and the Heatl protein, is shown in Table I.
  • FIG. 1 The expression of Heatl on transfected COS-7 cells is shown in FIG. 1:
  • panels a, b and c show the expression in COS cells which are associated with the plasmid pAXlll, which is the sequence coding for mouse HSA contained, were transfected;
  • Figures d, e and f show the corresponding experiments with pHeatl.
  • the results with cells incubated for 24 h, which were stained with the monoclonal antibody HAT5, are on the plates b and e, the ones stained with JIld in c and f, and the only with the FITC-labeled goat anti-mouse reagent treated are shown in a and d.
  • Lysates from Heatl-transfected COS-7 cells were separated on 10% non-reducing gels with SDS-PAGE and the recombinant protein was detected by Western blot using a mixture of the above-listed antibodies as primary antibodies.
  • the recombinant bacterial hsp65 preparations to be used for the pre-immunization were quantified by comparing them with a standard preparation in a sandwich ELISA using the polyclonal anti-BCG serum as a coating antibody and the monoclonal antibodies IIH9 or IIC8 as the labeled antibody.
  • a pool of hsp65 cross-reactive antibodies recognized a standard preparation of recombinant hsp65 (Thole et al., 1987), a purified extract from E. coli which expresses the recombinant hsp65 (B032) and the Heatl protein in the lysate of pHeatl-transfected C0S -7- cells.
  • Non-transfected control cells and HSA-expressing COS-7 cells showed no reactivity (FIG. 2).
  • the Heatl protein appeared in multiple bands, of which two main bands could be clearly identified: a sharp band with a molecular weight of approx. 60 kDa (in accordance with the molecular weight calculated on the basis of the coding sequence) and a pool at approx.
  • M3 tumor cells were grown as described under b). Where necessary, the cells were irradiated at 50 Gy with a gamma ray device (Nordion, Canada).
  • mice 6 to 8 week old mice were subcutaneously or intraperitoneally
  • mice were given 10 ⁇ wild-type M3 cells for tumor placement. The growth of the tumors was followed by weekly size determination of the tumors.
  • mice The immunotherapeutic treatment of the mice was carried out by subcutaneously injecting 10 ⁇ pHeatl-transfected M3 cells (not irradiated) into mice.
  • mice mice pre-immunized with soluble recombinant hsp65;
  • FIG. 3 shows the tumor index being shown on the ordinate: a shows the experiments with Heatl-expressing M3 cells which were injected into naive mice; b shows the course of tumor formation in mice that were pre-immunized with live BCG; soluble recombinant hsp65 was used for the experiments shown in c.
  • the tumor index is drawn as a thick line for each animal that developed a tumor, i.e. 3 of 4 in a, 1 of 4 in b and 4 of 4 in c.
  • mice were first pre-immunized as indicated above. After two immunizations (one week apart) with tumor vaccines from 10 5 pHeatl-transfected, irradiated M3 cells, the mice were rested with 10 ⁇ wild-type M3 cells after a further week's rest. Cells treated, which corresponded to a 100-fold tumorigenic dose.
  • FIG. 4 the type of presentation is analogous to that in FIG. 3
  • a first group was pre-immunized with live BCG and after 6 weeks of rest with the tumor vaccine from Heatl-transfected M3- Cells immunized. Only one of 8 experimental animals developed a tumor with approximately wild-type kinetics, while all others remained tumor-free after the tumor was set (FIG. 4a).
  • some mice developed small, dark-pigmented spots 2 weeks after the tumor was set. These spots showed no growth and did not appear to affect animal health.
  • a second test group of mice received the pre-immunization in the form of 50 ⁇ g bacterial recombinant hsp65 each with otherwise identical test parameters.
  • the success rate was similar to that in the first group, with only one animal developing a tumor with wild-type kinetics (Fig. 4b).
  • mice were immunized with whole irradiated E. coli bacteria of the strain M1456, which express the recombinant hsp65 protein. 6 of 8 animals from this group developed tumors after treatment with M3 wild-type cells, mostly with wild-type kinetics (FIG. 4c).
  • a fourth experimental group served as a control for tumor-specific immunization. After pre-immunization with live BCG, the mice in this group were treated with M3 wild-type cells, without previously using the Tumor vaccines from Heatl-transfected M3 cells have been immunized. All animals from this group developed tumors (Fig. 4d).

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Abstract

Eine Tumorvakzine aus autologen und/oder allogenen Tumorzellen ist mit einem oder mehreren Antigenen modifiziert, für die im zu behandelnden Individuum bereits eine Immunantwort existiert. Bevorzugt sind die Tumorzellen mit rekombinanter DNA, z.B. einem Plasmid, transfiziert, die die für das Antigen kodierende Sequenz enthält.

Description

Turaorzellen zur Verwendung als Tumorvakziπe, die mindestens ein Antigen, für welches bereits eine Immunantwort besteht, enhalten.
Die Erfindung bezieht sich auf Tumorvakzine.
Die Entwicklung von Tumorvakzinen beruht auf drei Voraussetzungen: 1. es bestehen qualitative und quantitative Unterschiede zwischen Tumorzellen und normalen Zellen; 2. das Immunsystem ist gut geeignet, diese Unterschiede festzustellen; 3. dem Immunsystem kann - durch aktive spezifische Immunisierung mit Vakzinen - beigebracht werden, diese Unterschiede zu erkennen und die Abstoßung des Tumors herbeizuführen.
Für das Entstehen einer Anti- umorantwort müssen zwei Kriterien erfüllt sein: Erstens muß der Tumor neue Antigene oder Neoepitope, die auf normalen Zellen nicht vorkommen, präsentieren. Zweitens muß das Immunsystem entsprechend aktiviert werden, um auf diese neuen Antigene zu reagieren. Ein wesentliches Hindernis bei der Immuntherapie von Krebs ist die geringe Iπununogenizität von Tumoren, besonders im Menschen. Dies ist insofern überraschend, als die große Anzahl von genetischen Veränderungen in fortgeschrittenen Krebserkrankungen zur Entstehung von Peptid-Neoepitopen führen sollte, die im Kontext mit MHC-I-Molekülen von zytotoxischen Lymphozyten erkannt werden sollten.
Für die Immuntherapie von Krebs auf zellulärer Basis wurden zwei allgemeine Strategien entwickelt: Die adoptive Immuntherapie, die sich der in vitro Expansion von tumorreaktiven Lymphozyten und deren Wiedereinführung in den Wirt bedient; andererseits die aktive Immuntherapie, welche Tumorzellen verwendet, in der Erwartung, daß damit entweder neue oder verstärkte Immunantworten gegen Tumorantigene hervorgerufen werden, die zu einer systemischen Tumorantwort führen. Tumorvakzine auf der Grundlage der aktiven Immuntherapie wurden auf verschiedene Arten hergestellt; ein Beispiel dafür sind bestrahlte Tumorzellen, die mit Adjuvantien wie Corynebacterium parvum versetzt werden, um neue Immunreaktionen hervorzurufen.
In den letzten Jahren wurden vor allem genetisch veränderte Tumorzellen für eine aktive Immuntherapie gegen Krebs verwendet. Eine der jüngsten dieser Strategien verwendet Tumorzellen, die verschiedene Zytokine sekretieren, wobei hier nicht die Expression fremder Gene in Tumorzellen induziert wird, sondern eine Veränderung der immunologischen Umgebung der Tumorzelle angestrebt wird. Damit soll entweder die Präsentierung von tumorspezifischen Antigenen gegenüber dem Immunsystem oder die Aktivierung von tumorspezifischen Lymphozyten verstärkt werden. Eine Übersicht über diese Strategien wird von Pardoll, 1992, gegeben.
Von Tumorzellen, die genetisch verändert wurden, um große Mengen verschiedener Zytokine wie IL-2, GM-CSF zu sekretieren oder um co-stimulierende Moleküle zu exprimieren, wurde in experimentellen Tiermodellen gezeigt, daß sie starke Anti-Tumorreaktionen des Wirts auslösen (Fearon et al., 1991; Dranoff et al., 1993; Zatloukal et al., 1993). Im Gegensatz dazu könnte es beim Menschen, wenn er bereits eine beträchtliche Tumorbelastung aufweist und eine Toleranz gegen den Tumor entwickelt hat, außerordentlich schwer sein, die ganze Kaskade von komplexen Wechselwirkungen zu erfassen, die benötigt wird, um eine wirkungsvolle Anti-Tumorreaktion auszulösen. Die tatsächliche Wirksamkeit von Zytokine sekretierenden Tumorvakzinen für solche Anwendungen ist noch nicht erwiesen. Im Zuge der Entwicklung der adoptiven Immuntherapie wurde ein Weg gezeigt, die Immuntoleranz zu brechen, indem CTLs (zytotoxische T-Lymphozyten) gegen das tolerierte Antigen erzeugt wurden (Ohashi et al., 1991; Röcken et al., 1992).
Der vorliegenden Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, eine neue Tumorvakzine bereitzustellen, mit welcher die Immuntoleranz gegen unbekannte Tumorantigene beseitigt werden kann.
Lehmann et al., 1992, beschreiben die Induktion einer experimentellen allergischen Enzephalomyelitis (EAE) in entsprechend empfänglichen Tieren durch ein Peptid des Proteins MBP ( "Myelin Basic Protein" ), das einem einzigen Epitop entspricht. Von den aus den behandelten Tieren isolierten MBP-reaktiven T-Zellen wurde überraschenderweise festgestellt, daß sie nicht nur das Originalpeptid erkannten, mit dem immunisiert wurde, sondern auch diverse andere vom MBP-Molekül abgeleiteten Epitope. Diese Erweiterung der Immunantwort auf neue Epitope desselben Antigenmoleküls wurde als "Epitopausweitung" ("Epitope Spreading") oder "Antigenausweitung" ("Antigen Spreading") bezeichnet. Diese Erweiterung der Primärantwort auf unbekannte Epitope findet auf Molekülebene statt. Aus diesem Befund kann abgeleitet werden, daß, sobald ein spezielles Antigen erkannt wird, auch in der Nähe befindliche Antigene mit deutlich verstärkter Effizienz in den T-Zell-Aktivierungsweg geleitet werden.
Ausgehend von dieser Beobachtung wurde nun zur Lösung der gestellten Aufgabe zunächst von der Überlegung ausgegangen, daß als solche "in der Nähe befindlichen" nicht nur Epitope desselben Moleküls anzusehen sind, sondern daß dazu auch andere Moleküle gehören, die von der Zelle stammen, die anfänglich erkannt wurde. Obwohl der Mechanismus des Antigen Spreading noch nicht im einzelnen aufgeklärt ist, ist die Ausweitung des Konzepts auf andere Antigen-Moleküle, die nicht vom selben Protein-Molekül, sondern von der selben Zielzelle stammen, deshalb sinnvoll, weil die Zielzelle nach ihrer Erkennung durch das Immunsystem als ganze zerstört wird und somit die ganze Zelle Antigene zur Verfügung stellt, die von APCs (Antigen Presenting Cells) aufgenommen und prozessiert werden. Es ist nicht bekannt, ob das antigenische Repertoire, das von APCs aufgenommen wird, in irgend einer Weise gesteuert wird, aber da eine große Vielfalt an potentiellen Antigenen, einschließlich Zellfragmenten, ganzen Bakterien und sogar synthetischen Partikeln, von Makrophagen aufgenommen wird, ist eine anfängliche Beschränkung des Repertoires unwahrscheinlich.
Die erfindungsgemäße Lösung der gestellten Aufgabe besteht nun darin, durch Erweiterung des Antigen Spreadings auf Tumorantigene eine Anti-Tumor-Immunität in tumortoleranten Wirten dadurch zu bewirken, daß man eine im Wirt bereits existierende, gut definierte Zellantwort vom Memory-Typ auslöst und sie gegen Tumorzellen lenkt.
Die erfindungsgemäße Tumorvakzine ist dadurch gekennzeichnet, daß sie die Tumorzellen enthält, die derart modifiziert sind, daß sie ein oder mehrere Antigene enthalten, für die im zu behandelnden Individuum bereits eine Immunantwort existiert.
In einer bevorzugten Ausführungsform besteht die Modifikation der Tumorzellen darin, daß sie, nach Transfektion mit einer für das Antigen kodierenden DNA, das Antigen exprimieren.
Als Antigene sind molekulare Einheiten, z.B. komplette Proteine, Fragmente davon, Peptide, Glykolipide oder durch stereospezifische Glykosylierung modifizierte Moleküle, geeignet. Diese Moleküle werden von den Tumorzellen derart exprimiert, daß sie vom Immunsystem, insbesondere von T-Zellen oder von Immunglobulinen, erkannt werden und eine effiziente Immunantwort auslösen können. Für die vorliegende Erfindung wird der Effekt ausgenützt, daß das Immunsystem ein Erinnerungsvermögen für bereits früher wahrgenommene Antigene besitzt. Dieses Erinnerungsvermögen äußert sich auf zellulärer Ebene insbesondere dadurch, daß T-Zellen und Plasmazellen (B-Zellen) auf das erneute Auftreten des Antigens, das nun, beim wiederholten Auftreten, ein "Erkennungsantigen" darstellt, mit erhöhter Reaktivität reagieren, was zu einer raschen Ausschüttung eines erhöhten Volumens von Zytokinen, einer Beschleunigung der Proliferation der T- bzw. B- Zellen sowie einer Beschleunigung der für die Prozessierung dieser Antigene erforderlichen sekundären Reaktionen führt. Die Folge davon ist die Eliminierung des Antigens bzw. der damit assoziierten Elemente (Viren, Bakterien, Zellen) durch eine erhöhte zytolytische Aktivität und/oder Antikörperproduktion. (Die durch erneutes Auftreten des Erkennungsantigens ausgelöste Reaktion des Immunsystems wird als "Memory Response" bezeichnet.)
Mit der erfindungsgemäßen Tumorvakzine wird somit bewirkt, daß die schon existierenden spezifischen Memory-T-Zellen zum Immunogen, also den Tumorzellen des Vakzins, gelangen, weil diese genau das Antigen exprimieren, gegen das die spezifischen Memory-T-Zellen gerichtet sind. Dies führt zu einer wirksamen Erkennung und einer verstärkten Präsentierung nicht nur des von den Zellen aufgrund der gentechnischen Veränderung exprimierten Erkennungsantigens, sondern auch anderer Antigene, die auf den Tumorzellen vorhanden sind, also auch der Tumorantigene, was auf zellulärer Ebene eine Erweiterung einer Primärantwort, also ein Antigen Spreading, auf unbekannte Epitope, darstellt.
Die durch die erfindungsgemäßen Tumorvakzine im Wirt ausgelösten Vorgänge führen weiterhin dazu, daß die Re-Fokussierung der Memory-Response auf die Tumorzellen nicht nur die Toleranz des Wirts gegen den Tumor bricht, sondern auch zu einem rascheren und besser vorhersagbaren Aufbau der Anti-Tumorimmunitat führt.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde die Verwirklichung des Prinzips, das im Wirt existierende Erinnerungsvermögen an das Erkennungsantigen für die Immunabwehr von unbekannten Tumorantigenen auszunutzen, anhand eines Hybridproteins der Bezeichnung "Heatl" auf der Grundlage des hsp65-Proteins von Mycobacterium bovis BCG gezeigt. Dieses Hybridprotein wurde als Erkennungsantigen verwendet, indem ein dafür kodierendes Plasmid in Zellen der Maus-Melanomzellinie M3 transfiziert wurde, die als Tumorvakzine dient. Es konnte gezeigt werden, daß die Verabreichung einer solchen Tumorvakzine in Mäuse, die entweder mit dem ganzen BCG (Lebend-ImpfStoff) oder mit dem gereinigten rekombinanten hsp65-Protein vorimmunisiert worden und somit für eine Memory-Response bereit gemacht worden waren, eine Immunität gegen anschließende Tumorsetzungen mit Wildtyp-M3-Zellen induzieren konnte. In den durchgeführten Versuchen diente das verwendete hsp65-Hybridprotein als Prototyp eines Erkennungsantigens.
M. bovis BCG ist ein Vertreter von Immunogenen, die eine stabile und langanhaltende, in vielen Fällen lebenslängliche, Immunität hinterlassen. In immunen Menschen kann dieser Schutz als sog. "Hypersensitivitätsreaktion vom verzögerten Typ" ("delayed-type hypersensitivity reaction" DTH) charakterisiert werden. Diese Reaktion wird in erster Linie von T-Zellen des Typs Thl (inflammatorische T-Zellen) erzeugt (Mutis et al., 1993; ElGhazali et al., 1993); eben dieses Reaktionsmuster dürfte eine Voraussetzung für eine effizienten Anti-Tumorreaktion sein (Puccetti et al., 1994). Von hsp65 des M. bovis war gezeigt worden, daß es eines der Hauptziele dieser Wirtsreaktion ist (Kaufmann, 1988; Kaufmann et al., 1987).
Die Anwendung von Mycobakterien oder deren Derivaten wurde bereits hinsichtlich verschiedener Aspekte für diverse Tumortherapieansätze vorgeschlagen: diese Ansätze beinhalten u.a. die Anwendung verschiedener Formen von BCG als Adjuvans zwecks Verabreichung gemeinsam mit bestrahlten, lysierten oder auf andere Weise wachstumsunfähig gemachten Tumorzellen (Bloemena et al., 1993); Ansätze, die sich der Kreuzreaktivität zwischen BCG-abgeleiteten Proteinantigenen und Tumor¬ spezifischen Antigenen bedienen; Ansätze auf der Grundlage der Transfektion eines kompletten hsp65 von M. leprae in Tumorzellen, um eine Immunantwort hervorzurufe .
Von BCG-hsp65 wurde ferner gezeigt, daß es mit der Hepatom-Zellinie "Line 10" Antigen-Determinanten gemeinsam hat (Ahsan und Sasaki, 1991). Meerschweinchen, die mit sonikierten BCG-Membranen immunisiert worden waren, zeigten keine oder nur eine verzögerte Tumorentwicklung, wenn ihnen mit Zellen der Hepatomlinie ein Tumor gesetzt wurde. Auch zeigten T-Zellen von Ratten, die mit Lebend-BCG behandelte worden waren, eine Zytotoxizität gegen eine H-ras- transformierte Fibrosarkom-Zellinie (Ta ura et al., 1993); in diesem Fall erwies sich das Säugetier- Homologe hsp70 als Ziel für die Reaktion. Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung erhaltenen Ergebnisse zeigen, daß die mit der erfindungsgemäßen Tumorvakzine erreichten Effekte auf anderen Mechanismen beruhen; dies äußert sich u.a. in den Vergleichsversuchen, in denen die Immunisierung von Mäusen mit BCG die Tiere dann nicht vor einer Tumorentwicklung nach Tumorsetzung mit M3-Zellen schützte, wenn der Vakzinierungsschritt mit den Heatl-transfizierten M3-Zellen ausgelassen wurde.
In einem weiteren bekannten Vorschlag wurde von Tumorvakzinen in Form von isolierten hsp- Peptidkomplexen gezeigt, daß sie eine wirksame Schutzimmunität hervorrufen. Dieser Schutz ist jedoch tumorspezifisch, was zeigt, daß er nicht spezifisch für hsp als solches, sondern auf die mit hsp assoziierten Peptide zurückzuführen ist (Udono et al., 1994).
Heat-Shock-Proteine sind sog. molekulare "Chaperones", eine Proteinfamilie mit einem hohen Grad an speziesübergreifender Übereinstimmung. Sie wirken immunogen, vermutlich weil sie Peptide nicht-kovalent an sich binden. Von Lukacs et al., 1993, und in der WO 94/11513 wurde eine Tumorvakzine, bestehend aus Tumorzellen, die mit einem hsp oder einem anderen "Chaperone" transfiziert sind, vorgeschlagen. In diesem System dürfte die Antitumorwirkung eine direkte Folge der Chaperone-Funktion des transfizierten Proteins sein. Die "Chaperone"-Funktion ist eine Art Begleiterfunktion für andere Proteine. Im Fall von hsp65, das ein typischer Vertreter von Chaperone- Proteinen ist, dürfte die Antitumorwirkung auf die verstärkte Chaperone-Funktion für das Tumorsuppressor- Protein p53 zurückzuführen sein, die zur richtigen Faltung und Konformation von inaktivem p53 führt, wodurch dessen Verlust der Tumorsuppressorfunktion aufgehoben wird. Die von Lukacs et al., 1993, durchgeführten Versuche zeigten, daß transduzierte J774-Makrophagen-Tumorzellinien ihre tumorigene Wirkung in normalen (naiven, d. h. noch nie mit dem Antigen bzw. den Tumorzellen konfrontierten) Wirten verlieren und daß ein Inoculum aus solchen Tumorzellen in der Lage ist, auch nachfolgende Tumorsetzungen mit Wildtyp- J774-Zellen abzuwehren.
Von dem in der WO 94/11513 beschriebenen Vorschlag unterscheidet sich die vorliegende Erfindung dadurch, daß für die Herstellung und Anwendung der erfindungsgemäßen Tumorvakzine die im Wirt bereits vorhandene Immunantwort benutzt wird, indem diese gegen das von den Tumorzellen der Tumorvakzine exprimierte Antigen gerichtet wird. Daß die Voraussetzung einer existierenden Immunantwort gegeben ist, erweist sich in den durchgeführten Tierversuchen darin, daß Heatl exprimierende M3-Tumorzellen in naiven Mäusen mit der Kinetik von Wildtyp-Zellen wachsen. Im Gegensatz zu dem von Lukacs et al., 1993, beschriebenen System ist die erfindungsgemäße Tumorvakzine nicht auf hsp65-Derivate bzw. andere Proteine mit Chaperone-Funktion beschränkt.
Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung erhaltenen Versuchsergebnisse zeigen anhand eines Erkennungsantigens, gegen das eine Immunantwort des Wirts bereits existiert, daß diese Immunantwort gezielt gegen Tumorzellen umgeleitet werden kann, um dem Tumorwachstum Einhalt zu gebieten. Der mit den erfindungsgemäßen Tumorvakzinen erzielbare Schutzmechanismus unterscheidet sich von dem der Tumorvakzine des Standes der Technik: das in den Versuchen verwendete Heatl-Protein stellt aufgrund seiner Verkürzung kein hinsichtlich der Chaperone- Wirkung funktionelles hsp dar; außerdem wird es aufgrund seiner angefügten Signalsequenz und der GPI(Glykosyl-Phosphatidyl-Inositol)-Link-Modifikation einem intrazellulären Biosyntheseweg zugeleitet, der sich von dem des natürlichen hsp unterscheidet.
Die vorliegende Erfindung unterscheidet sich von den Tumorvakzinen des Standes der Technik nicht nur hinsichtlich des ihr zugrunde liegenden Prinzips, sondern auch hinsichtlich der vorgeschlagenen Anwendung und Wirkungsweise, hsp65 von BCG wurde im Rahmen der vorliegenden Erfindung stellvertretend für andere Erkennungsantigene daraufhin untersucht, ob der Mechanismus der Umleitung der Memory-Response auf Tumorzellen und die dadurch vom Wirtsorganismus ausgelösten Abwehrmechanismen gezielt für ein neuartiges Anwendungsprinzip für die Tumortherapie genutzt werden kann.
Aufgrund der Tatsache, daß weite Teile der Weltbevölkerung gegen verschiedene Pathogene geimpft sind, davon ca. 40 % mit BCG (Aldovini und Young, 1991), kann die vorliegende Erfindung als allgemeine Strategie für die Immuntherapie von Tumorerkrankungen breit angewendet werden. Neben hs 65 bzw. Fragmenten oder Derivaten davon sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung sämtliche Proteine bzw. Fragmente als Erkennungsantigene (bzw. die dafür kodierenden Sequenzen) zur Herstellung der Tumorvakzine geeignet, für die eine entsprechende Memory-Response in dem zu behandelnden Organismus vorhanden ist.
Bezüglich der Eignung eines Erkennungsantigen für die Anwendung im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind vor allem die folgenden Parameter zu berücksichtigen:
1. Das Antigen muß vom Immunsystem des Wirts gut erkannt werden. Dabei ist es von Vorteil, wenn die bereits existierende Immunantwort als zelluläre Antwort in Form Memory-T-Lymphozyten bzw. in Form eines DTH- Schutzes vorliegt. Die Immunantwort kann sich jedoch auch in Form von Antikörpern gegen das Antigen äußern, sofern im Wirt ein für die Erkennung des Antigens entsprechend hoher Titer vorhanden ist.
2. Es ist von Vorteil, wenn Methoden, insbesondere geeignete Immunoassays, zur Verfügung stehen, mit denen bestimmt werden kann, ob der Wirt eine Immunität gegen das Erkennungsantigen aufweist.
3. Es sollte, für den Fall daß nicht die Antigene als solche, sondern die dafür kodierenden DNA-Moleküle eingesetzt werden, zumindest eine Teilsequenz des Erkennungsantigens bereits bekannt sein (bzw. das Antigen identifiziert und soweit gereinigt sein, um Teilsequenzen zu bestimmen), womit die Herstellung von Vektoren und somit seine Expression auf den für die Tumorvakzine eingesetzten Zellen ermöglicht wird. Solche Antigene können am leichtesten unter den Derivaten von verbreiteten humanen Pathogenen gefunden werden, die eine langfristige "Memory" nach natürlichen Infektionen oder nach Immunisierungen, insbesondere Impfungen, hervorrufen. Für die Anwendung der erfindungsgemäßen Tumorvakzine auf größere Patientenkollektive wird somit in der Praxis zweckmäßig so vorgegangen, daß die zu behandelnden Patienten darauf getestet werden, ob sie eine Immunantwort auf ein vorher definiertes Antigen, ein Pathogen, aufweisen, z.B. ob sie gegen BCG, Tetanus, Röteln, Masern, Hepatitits B, Herpes, Influenza, etc. immun sind. Für diese und andere Infektionskrankheiten sind diagnostische Tests auf der Grundlage immunologischer Methoden, z.B. ELISA-Tests, bekannt und werden routinemäßig angewandt; ein Beispiel dafür ist der Tuberkulintest.
Eine mögliche Anwendungsstrategie kann darin bestehen, beim einzelnen Patienten individuell hergestellte Tumorvakzine auf der Grundlage der bei diesem Patienten individuell festgestellten Immunität gegen bestimmte Antigene einzusetzen; d.h. daß die für die Herstellung der Tumorvakzine verwendeten Antigene von den Pathogenen abgeleitet sind, gegen die der Patient immun ist.
Eine alternative Strategie geht davon aus, entsprechend der statistischen Verteilung, die eine größere Bevölkerungsgruppe hinsichtlich der Immunität gegen verschiedene Pathogene aufweist, eine für diese Bevölkerungsgruppe einheitliche Tumorvakzine zu verwenden. Eine solche Tumorvakzine exprimiert dann ein Gemisch von Antigenen, die diese Verteilung abdeckt.
Die Voraussetzung für die Anwendung der vorliegenden Erfindung, daß die zu behandelnden Patienten eine Immunität gegen das von den Tumorzellen der Tumorvakzine expri ierte Antigen aufweisen müssen, stellt für die Praxis keine Beschränkung dar. Aufgrund der vielfachen Kontakte mit Pathogenen, denen ein Mensch im Laufe seines Lebens ausgesetzt ist, existiert ein breites Spektrum von Antigenen, die für die Tumorvakzine in Frage kommen; es ist somit zu erwarten, daß praktisch die gesamte Bevölkerung auf diese Weise therapierbar ist.
Für einige Anwendungen, z.B. wenn beim Patienten aufgrund seines schlechten Immunstatus keine ausreichend starke Memory-Response zu erwarten ist, können dem Patienten als unterstützende Maßnahme allogene Zellen, die anstelle der wirtseigenen Zellen die Funktion der Memory-Zellen übernehmen, verabreicht werden, z.B. vor oder gleichzeitig mit der erfindungsgemäßen Tumorvakzine bzw. in Mischung damit. Als allogene Memory-Zellen sind z.B. die in der GB-A 2230790 beschriebenen geeignet.
Beispiele für Vertreter geeigneter Antigene sind das Membranprotein LMP des Epstein-Barr-Virus (Trivedi et al., 1991), Influenza-Nucleoproteine (Bowness et al., 1994; DiBrino et al., 1993), Tetanustoxin-Fragmente (Valmori et al., 1994; Reece et al., 1993), Adenovirus- Hüllprotein, bzw. Fragmente davon (Grunhaus et al., 1994; Hermiston et al., 1993), Hepatitis B-Virus- Antigen (Folgori et al., 1994; Lo Man et al., 1993) ein 10 kDa Protein von Mycobakterium tuberculosis (Barnes et al., 1992), Herpes Simplex Virusantigene (Bonneau et al., 1993), oder Cyto egalovirusantigene (Berencsi et al., 1993).
Bezüglich der Größe der Moleküle besteht grundsätzlich keine Beschränkung, sofern der für den DNA-Transfer in die Zelle verwendete Vektor die Insertion großer Abschnitte erlaubt; eine etwaige Größenbeschränkung kann somit lediglich gegebenenfalls durch das im einzelnen verwendete GentransferSystem bedingt sein, z.B. im Falle der Anwendung retroviraler Vektoren, die die Insertion einer Fremdsequenz von nur etwa maximal 7-10 kD erlauben.
Für die Transfektion der Tumorzellen können komplette cDNAs, die für ein Protein eines pathogenen Organismus kodieren, verwendet werden, wie Bakterien- oder Virusproteine, insbesondere Viruskapsidproteine (Marrack und Kappler, 1994). Es sind generell u.a. alle diejenigen Proteine geeignet, die auch für Impfungen gegen Infektionskrankheiten verwendet werden. Zahlreiche dieser Proteine wurden bereits kloniert und sind auf rekombinantem Weg herstellbar (vgl. oben). Neben den kompletten cDNAs können DNA-Fragmente verwendet werden, die für Antigene kodieren, wobei die Größenbeschränkung nach unten dadurch gegeben ist, daß eine MHC-Präsentation oder eine Antikörpererkennung der exprimierten Antigene erfolgen muß, was im allgemeinen bei einer Größe von mindestens 8 Aminosäuren gegeben ist. Im Falle der Verwendung von Fragmenten werden vorzugsweise solche Sequenzabschnitte eingesetzt, die für Epitope kodieren. Es sind Methoden verfügbar, von immunogenen Proteinen die epitopen Regionen zu charakterisieren und somit die Voraussetzung für die Verwendung von Epitopen im Rahmen der vorliegenden Erfindung zu schaffen (Folgori et al., 1994). Bevorzugt werden für eine Tumorvakzine mehrere Fragmente eingesetzt; die verwendeten Mischungen können verschiedene Epitope desselben Proteins sein oder auch aus jeweils einem oder mehreren Epitopen verschiedener Proteine bestehen.
Außer den für die natürlichen Proteine (bzw. Fragmente davon) kodierenden Sequenzen können auch Sequenzabschnitte für die Transfektion der Tumorzellen verwendet werden, die Mutationen aufweisen. Derartige Mutationen, die im Austausch einer oder mehrerer Aminosäuren und/oder in Deletionen bestehen, dienen vor allem der Erhöhung der Stabilität des exprimierten Antigens, indem z.B. dessen Abbau in der Tumorzelle verlangsamt wird, oder der Verstärkung der Affinität des Antigens zum immunogenen Reaktionspartner.
Eine aufgrund der Mutation erzielte Verbesserung der Wirkung kann in Vergleichsversuchen getestet werden, indem z.B. nach Random-Mutation natürlicher Antigen- Sequenzen die erhaltenen Mutanten in Tumorzellen transfektiert und die erzielte Schutzwirkung mit der der natürlichen Antigene verglichen wird.
Eine weitere Modifikation der antigenen Sequenzen kann darin bestehen, Signal- bzw. regulative Sequenzen anzufügen, die im Hinblick auf die Erkennung des Antigens dessen möglichst vorteilhafte Präsentation fördern. Bei derartigen Signal- bzw. regulativen Sequenzen handelt es sich um natürliche oder von natürlichen Sequenzen abgeleitete, die normalerweise die Synthese und den Transport von zellulären Proteinen steuern, z.B. die GPI-Link-Sequenz (Powell et al., 1991; Chan et al., 1991; Robinson et al., 1991), die Signalsequenz von HSA oder die Insertion-Signalsequenz (Minev et al., 1994; Bacik et al., 1994).
Die Expression des Erkennungsantigens durch die Tumorzelle bewirkt entweder, daß dieses als solches direkt an der Zelloberfläche präsentiert wird (dies ist insbesondere bei Antigenen der Fall, die von Antikörpern erkannt werden), oder daß es innerhalb der Zelle prozessiert wird und ein Fragment davon an der Zelloberfläche mittels MHC- bzw. HLA-Molekülen präsentiert wird. Die Verabreichung von Antigen-Mischungen ist von Vorteil, insbesondere um die erste Erkennung der Tumorvakzine durch den Wirt zu verstärken bzw. im Hinblick auf die Anwendung auf breitere Bevölkerungsschichten.
Vorzugsweise wird die Auswahl einer geeigneten Kombination von Erkennungsantigenen im Hinblick auf die Anwendung an einem Patienten, von dem man eine bereits gegen diese Antigene existierende Immunantwort von vornherein kennt bzw. diese vor Anwendung der Tumorvakzine bestimmt, getroffen. Zweckmäßigerweise liegt für die Anwendung der vorliegenden Erfindung eine Auswahl von Antigenen in Form von gereinigten Plasmiden vor, die die jeweils dafür kodierende Sequenz enthalten.
Für die Transfektion der Tumorzellen können die für die Transfektion höherer eukaryotischer Zellen bekannten Standardmethoden verwendet werden, zu denen der Gentransfer mittels viraler Vektoren (Retrovirus, Adenovirus, Adeno-assoziiiertes Virus) oder physikalische Methoden (Transfektion mittels kationischer Peptide) zählen; Übersichten über gebräuchliche Methoden werden z.B. von Mitani und Caskey, 1993; Jolly, 1994; Vile und Rüssel, 1994; Tepper und Mule, 1994; Zatloukal et al., 1993, gegeben.
Ein im Rahmen der vorliegenden Erfindung bevorzugtes Verfahren für die Transfektion der Tumorzellen beruht auf der Grundlage der in der WO 93/07283 beschriebenen Methode, die auch auf die Herstellung von Tumorvakzinen anwendbar ist. Auf die Offenbarung der WO 94/21808 wird diesbezüglich Bezug genommen. Diese Methode benutzt ein Konjugat aus einem Liganden für die Zielzelle und einer Substanz mit Bindungsfähigkeit an die DNA, insbesondere einem Polykation wie Polylysin, und beruht auf rezeptorvermittelter Endozytose des Ko jugat/DNA-
Komplexes, wobei außerdem ein Mittel vorgesehen ist, das die Freisetzung des in die Zelle importieren
Komplexes aus den Endosomen erleichtert, insbesondere ein inaktiviertes Adenovirus.
Diese Methode ermöglicht die besonders flexible Anwendung der Erfindung, indem für einzelne Tumorvakzinierungen auf einfache Weise individuell, z.B. mit mehreren Erkennungsantigen-Sequenzen, transfizierte Tumorzellen verwendet werden. Dafür werden z.B. aus einem Vorrat von Plasmiden, die jeweils ein oder mehrere verschiedene für ein Erkennungsantigen kodierende Sequenzen enthalten, das bzw. die jeweils gewünschten ausgewählt, mit geeigneten Konjugaten, z.B. Transferrin-Polylysin-Konjugaten und Adenovirus- Polylysin-Konjugaten, komplexiert und die Tumorzellen mit den so erhaltenen Transfektionskomplexen inkubiert.
Für die Herstellung geeigneter Vektoren steht eine große Auswahl von Standardplasmiden (s. z.B. Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2.Aufläge) zur Verfügung; diese müssen für die Eignung im Rahmen der vorliegenden Erfindung lediglich die an Vektoren generell gestellten Anforderungen erfüllen, daß sie geeignete Promotoren aufweisen, die eine effiziente Expression des Erkennungsantigens in der Wirtszelle ermöglichen; zweckmäßigerweise enthalten sie außerdem für die Züchtung in Bakterien erforderliche Sequenzen, wie Selektionsmarker.
Im Falle der Anwendung von Peptiden als Erkennungsantigen ist es auch möglich, statt die Zellen mit der kodierenden DNA zu transfizieren, die Peptide als solche in die Zellen einzubringen, was z.B. durch einfache Ko-Inkubation der Zellen mit den Peptiden ("in vitro loading") erzielt werden kann.
Die Tumorzellen der erfindungsgemäßen Tumorvakzine sind autologe (patienteneigene) und/oder allogene Zellen. Allogene Tumorzellen (aus Tumorzellinien) können verwendet werden, sofern die auf ihnen vorhandenen Antigene zumindest teilweise mit denen der autologen Tumorzellen des Patienten übereinstimmen. Beispiele für allogene Zellen, die als Grundlage für die erfindungsgemäßen Tumorvakzine dienen können, sind z.B. in der WO 91/06866 und in der US-A 5,030,621, beschrieben.
Die Tumorzellen werden inaktiviert, und zwar derart, daß sie unter Beibehaltung ihrer Fähigkeit zur Expression des Antigens ihre Fähigkeit zur Teilung verlieren.
Die Isolierung, Züchtung, Transfektion, Inaktivierung der Zellen, sowie gegebenenfalls die Formulierung der Tumorzellen mit geeigneten Hilfs- und Trägerstoffen, wird nach bekannten Methoden vorgenommen; bezüglich autologer Zellen wird insbesondere auf die Offenbarung der WO 94/21808 verwiesen.
Der Anteil der modifizieren Zellen an der Gesamtzahl der Zellen kann variiert werden, vorzugsweise beträgt er mindestens etwa 10 %.
Das Erkennungsantigen wird von der Tumorzelle in einer Menge exprimiert und präsentiert, die einem ausgewogenen Verhältnis zwischen Erkennungsantigen und den auf der Zelle von vornherein enthaltenen Tumorantigenen entspricht, wodurch gewährleistet ist, daß, im Zuge der Memory-Response auf das Erkennungsantigen, die Tumorantigene miterkannt werden. Diese Menge kann z.B. mittels Serienversuchen festgelegt werden, in denen die Zellen unter unterschiedlichen Bedingungen oder z.B. mit unterschiedlichen Vektoren, die eine verschieden starke Expression ermöglichen, transfiziert werden.
Die erfindungsgemäße Tumorvakzine kann gegebenenfalls mit zusätzlichen immunstimulierenden Maßnahmen kombiniert werden. Eine derartige Maßnahme kann darin bestehen, immunstimulierende Proteine, z.B. Zytokine, wie Interleukin-2, TNF-α, IFN-γ, etc. zuzusetzen und/oder die Tumorvakzine in Form einer Mischung von Tumorzellen, die das Erkennungsantigen exprimieren, mit anderen, ein oder mehrere immunstimulierende Proteine produzierenden Tumorzellen, wie sie z.B. in der WO 94/21808 beschrieben sind, oder Fibroblasten, zu verwenden.
Figurenübersicht
Fig. 1: Expression von Heatl auf transfizierten COS-7-
Zellen Fig. 2: Western Blot von Heat-Shock-Protein-Derivaten Fig. 3: Hemmung des Tumorwachstums durch M3-Zellen, die
Heatl exprimieren Fig. 4: Verlust der Tumorigenizität von Wildtyp-M3-
Zellen in vorimmunisierten und mit Heatl exprimierenden M3-Zellen behandelten
Versuchstieren Fig. 5: Immunhistologischer Nachweis der Beteiligung von
T-Zellen an der Reaktion auf die Tumorvakzine Tumorantigenen entspricht, wodurch gewährleistet ist, daß, im Zuge der Memory-Response auf das Erkennungsantigen, die Tumorantigene miterkannt werden. Diese Menge kann z.B. mittels Serienversuchen festgelegt werden, in denen die Zellen unter unterschiedlichen Bedingungen oder z.B. mit unterschiedlichen Vektoren, die eine verschieden starke Expression ermöglichen, transfiziert werden.
Die erfindungsgemäße Tumorvakzine kann gegebenenfalls mit zusätzlichen immunstimulierenden Maßnahmen kombiniert werden. Eine derartige Maßnahme kann darin bestehen, immunstimulierende Proteine, z.B. Zytokine, wie Interleukin-2, TNF-α, IFN-γ, etc. zuzusetzen und/oder die Tumorvakzine in Form einer Mischung von Tumorzellen, die das Erkennungsantigen exprimieren, mit anderen, ein oder mehrere immunstimulierende Proteine produzierenden Tumorzellen, wie sie z.B. in der WO 94/21808 beschrieben sind, oder Fibroblasten, zu verwenden.
Figurenübersicht
Fig. 1: Expression von Heatl auf transfizierten COS-7-
Zellen Fig. 2: Western Blot von Heat-Shock-Protein-Derivaten Fig. 3: Hemmung des Tumorwachstums durch M3-Zellen, die
Heatl exprimieren Fig. 4: Verlust der Tumorigenizität von Wildtyp-M3-
Zellen in vorimmunisierten und mit Heatl exprimierenden M3-Zellen behandelten
Versuchstieren iii) PCR-Produkt der Primer 5"1- GCTCTAGAGTCTACAGAGGGGGTGGCAGCTCC-3' und 5'- GCTCTAGAATTCTCCGTGTTTCTGTT-3'(unter Vorlage des Plasmids pAXlll), geschnitten mit XBal und EcoRI.
Die Fragmente i) und iii) wurden getrennt in pUC19 (Pharmacia) subkloniert, die ein Insert enthaltenden Plasmide wurden mittels Restriktionsanalyse identifiziert und Fragment i) mit Hindlll/Apal- und Fragment iii) mit AccI und EcoRI-Verdau freigesetzt. Die isolierten drei Fragmente wurden in ein Hindlll/EcoRI geschnittenes und gereinigtes pUC19- Plasmid hineinligiert; Klone mit der korrekten Reihenfolge i -* ii -* iii mittels enzymatischem Verdau bestätigt und unter der Kontrolle des CMV/T7-Promotors (Boshart et al., 1985) in den Expressionsvektor pCDNAl überführt. Der Vektor pHeat2 wurde erhalten, indem ein EcoRI/Sall-Fragment des Plasmids pRIB1300, das die komplette kodierende Sequenz von hsp65 enthält, in pCDNAl überführt wurde. Die Struktur der beiden Konstrukte wurde mittels Sequenzanalyse bestätigt.
b) Charakterisierung der rekombinanten Proteine
Zellen der Maus-Melanomzellinie Cloudman S91 (Klon M3; ATCC No. CCL 53.1; Zatloukal et al., 1995) bzw. C0S-7- Zellen (ATCC CRL1651) wurden in 6 cm Plastikschalen oder T25 Kulturflaschen, beschichtet mit 0.1 % Gelatine, in DMEM-Medium, enthaltend 10 % FCS, 2 mM Glutamin und Antibiotika, gezüchtet und anschließend transfiziert.
Die Transfektion der Zellen mit dem Vektor pHeatl wurde mittels der als "Adenovirus-unterstützten TransferrInfektion" bezeichneten Methode transfiziert (Cotten et al., 1992). Die Transfektionskomplexe wurden hergestellt, indem zunächst biotinyliertes, 8-Methoxypsoralen/UV-inaktiviertes Adenovirus dl 1014 in 100 μl HBS (1.2 x 1012 Partikel pro ml) mit streptavidinyliertem Polylysin 290 (StreptpL) in 100 μl HBS gemischt und 30 min bei Raumtemperatur inkubiert wurde. Daraufhin wurden 6 μg Plasmid-DNA in 150 μl HBS beigegeben, gut gemischt und weitere 30 min inkubiert wurde. Dann wurde Polylysin-modifiziertes humanes Transferrin (TfpL) in 150 μl HBS beigegeben, gründlich gemischt und 30 min inkubiert.
3 x 10^ Zellen wurden mit Komplexen behandelt, die 3 x 109 Adenoviruspartikel dll014, 600 ng StreptpL, 6 μg pCMVL und 6.8 μg TfpL enthielten. Nach der Transfektion wurde das Kulturmedium gewechselt, und die Zellen wurden vor der Weiterverwendung 24 h stehen gelassen.
Dann wurden die Zellen unter Verwendung der von Zatloukal et al., 1995, beschriebenen Methode (FACS- Analyse, "Fluorescence Activated Cell Scanning") mit Antikörpern der Bezeichnung IIH9, IVD8, CBA1, HAT5, IIC8 ( es handelt es sich um kreuzreaktive monoklonale Antikörper gegen M. leprae oder M. tuberculosis (Young et al., 1992); die Antikörper wurden bezogen von Hansen Disease Laboratories, CDC, Atlanta, GA.), Jlld (ATCC Nr. TIB 183) sowie polyklonalem anti-BCG-Serum (Dako) gefärbt.
Andererseits wurden die Expressionsprodukte im Western- Blot nachgewiesen.
i) Charakterisierung in COS-7-Zellen
Das Heatl-Hybridprotein in COS-7-Zellen exprimiert, weil diese Zellen durch episomale Replikation des Vektors eine hohe Expression erlauben (Siromons, 1993). Das GPI-Austauschmotiv am N-Terminus des Konstrukts ergibt ein Endprodukt mit einer GPI-Verankerung, die gegen ein Protein auf der äußeren Oberfläche der Zellmembran gerichtet ist und daher eine Identifizierung von positiven Zellen mittels FACS- Analyse erlaubt. Das Ergebnis der Charakterisierung mit den diversen Antikörpern gegen Mitglieder der 65 kDa Heat Shock-Proteinfamilie aus verwandten Mykobakterien, die verwendet wurden, um das gereinigte rekombinante hsp65 und das Heatl-Protein zu erkennen, ist in Tab. I dargestellt.
Die Expression von Heatl auf transfizierten COS-7- Zellen ist in Fig. 1 dargestellt: In der Figur zeigen die Tafeln a, b und c die Expression in COS-Zellen, die mit dem Plasmid pAXlll, das die für Maus-HSA kodierende Sequenz enthielt, transfiziert waren; die Figuren d, e und f zeigen die entsprechenden Versuche mit pHeatl. Die Ergebnisse mit 24 h lang inkubierten Zellen, die mit dem monoklonalen Antikörper HAT5 gefärbt wurden, sind auf den Tafeln b und e, die mit Jlld gefärbten in c und f, und die nur mit dem FITC-markierten Ziegen- anti-Maus-Reagens behandelten sind in a und d dargestellt. Die Regionen entsprechend 0-95 %, 95-99 % und 99-100 % der Kontrollen sind mit horizontalen Linien der Bezeichnung 1, 2 und 3 kenntlich gemacht, um die Wirkung der Transfektion sichtbar zu machen. Es zeigte sich, daß die Transfektion der Zellen mittels Adenovirus-unterstützter Transferrinfektion eine spezifische Expression des Heatl-Proteins bewirkte, die mit dem monoklonalen Antikörper HAT5 erkannt wurde. Nicht transfizierte COS-7-Zellen reagierten weder mit HA 5 noch mit dem Maus-HSA-spezifischen monoklonalen Antikörper Jlld, während Zellen, die mit dem Plasmid pAXlll transfiziert waren, das für das Maus-HSA kodiert, mit Jlld, nicht jedoch mit HAT5 angefärbt wurden.
ii) Charakterisierung in M3-Zellen
Auch in der Maus-Melanomzellinie M3 wurde die Expression von Heatl nachgewiesen mittels FACS-Analyse, wobei eine etwas geringere Anzahl von M3-Zellen eine hohe Expression zeigten als die COS-7-Zellen (23 % gegenüber 50 %, was offensichtlich auf eine bessere Transfektierbarkeit von COS-7-Zellen zurückzuführen ist).
iii) Nachweis im Western Blot
Lysate von Heatl-transfizierten COS-7-Zellen wurden auf 10 % nicht-reduzierenden Gelen mit SDS-PAGE aufgetrennt und das rekombinante Protein mittels Western Blot unter Verwendung einer Mischung der oben aufgezählten Antikörper als Primärantikörper nachgewiesen. Die für die Vorimmunisierung zu verwendenden Präparate des rekombinanten bakteriellen hsp65 wurden quantitativ bestimmt, indem sie in einem Sandwich-ELISA unter Verwendung des polyklonalen anti-BCG-Serums als Beschichtungsantikörper und den monoklonalen Antikörpern IIH9 oder IIC8 als markierter Antikörper mit einem Standardpräparat verglichen wurden.
Ein Pool von hsp65-kreuzreaktiven Antikörpern erkannte ein Standardpräparat von rekombinantem hsp65 (Thole et al., 1987), einen gereinigten Extrakt von E.coli, der das rekombinante hsp65 exprimiert (B032) sowie das Heatl-Protein im Lysat von pHeatl-transfizierten C0S-7- Zellen. Nicht-transfizierte Kontrollzellen und HSA- exprimierende COS-7-Zellen zeigten keine Reaktivität (Fig. 2). Das Heatl-Protein erschien in Mehrfachbanden, von denen zwei Hauptbanden deutlich identifiziert werden konnten: eine scharfe Bande mit einem Molekulargewicht von ca. 60 kDa (in Übereinstimmung mit dem auf Grundlage der kodierenden Sequenz berechneten Molekulargewicht) und ein Pool bei ca. 70 kDa (möglicherweise Vorläufer des reifen Produkts, deren Molekulargewicht höher ist als erwartet, entweder weil der N-terminale Teil noch nicht durch die GPI-Gruppe ersetzt ist, und/oder weil einige mögliche Glykosylierungsstellen, die vom HSA-Teil des Heatl- Hybrids stammen, einen hohen Mannoseanteil aufweisen).
c) Herstellung der Tumorvakzine
M3-Tumorzellen wurden gezüchtet, wie unter b) beschrieben. Wo erforderlich, wurden die Zellen mit 50 Gy mit einem Gammastrahlengerät (Nordion, Kanada) bestrahlt.
Beispiel 2
a) Vorimmunisierung von Mäusen
6 bis 8 Wochen alte Mäuse wurden subkutan oder intraperitoneal mit
i) 5 x lθ5 Zellen von lebendigem M. bovis BCG, Stamm Pasteur, zugelassen für den Gebrauch im Menschen, gemischt mit inkomplettem Freund's Ad uvans (IFA) in einem Gesamtvolumen von 100 μl; oder mit
ii) zwei 100 μg Dosen rekombinantes hsp65 in IFA (Incomplete Freund's Adjuvans); oder mit iii) ca. 109 Zellen E.coli M1456, enthaltend das hsp65- Expressionsplasmid, nach Bestrahlung mit 50 Gy
injiziert und vor den weiteren Behandlungen 4 bis 15 Wochen ruhen gelassen.
b) Behandlung von vorimmunisierten Mäusen mit einer Tumorvakzine aus Heatl exprimierenden M3-Zellen
i) Um das Auswachspotential der Heatl exprimierenden Zellen zu bestimmen, wurden 10^ transfizierte Zellen ohne Bestrahlung den Mäusen nach der Ruheperiode subkutan injiziert.
Für die Impfung wurden 10^ der transfizierten M3-Zellen 24 h nach der Transfektion bestrahlt und 2 x mit einer Woche Abstand subkutan den Versuchstieren injiziert. Nach einer weiteren Woche erhielten die Mäuse zwecks Tumorsetzung 10^ Wildtyp-M3-Zellen. Das Wachstum der Tumore wurde mittels wöchentlicher Größenbestimmung der Tumore verfolgt. Der Tumorindex wurde nach der Formel TI = (x+0.5)x(y+0.5)x(z+0.5)-0.53 berechnet, wobei x, y und z die Dimensionen darstellen und alle Angaben in mm ausgedrückt sind (diese Formel gibt einen Meßfehler von 0.5 mm wieder und ermöglicht es, quasi zweidimensionale Tumore, d.h. solche, die keine meßbare dritte Dimension haben, zu beurteilen, während der berechnete Tumorindex proportional dem Tumorvolumen bleibt).
Die immuntherapeutische Behandlung der Mäuse wurde durchgeführt, indem 10^ pHeatl-transfizierte M3-Zellen (nicht bestrahlt) subkutan injiziert wurden in
unbehandelte Mäuse; mit löslichem rekombinantem hsp65 vorimmunisierte Mäuse;
mit ganzem BCG vorimmunisierte Mäuse.
Im Anschluß daran wurde das Tumorwachstum verfolgt: die Entwicklung der Tumore in den Gruppen von Mäusen, die unbehandelt waren und die mit rekombinantem hsp65 vorimmunisiert waren, verlief ähnlich wie in der Kontrollgruppe, die mit nicht-transfizierten M3-Zellen behandelt worden war, während die meisten mit BCG vorimmunisierten Mäuse tumorfrei blieben und ein Tier verlangsamtes Tumorwachstum zeigte. Der Verlauf dieser Experimente ist in Fig. 3 dargestellt, wobei der Tumorindex auf der Ordinate dargestellt ist: a zeigt die Versuche mit Heatl exprimierenden M3-Zellen, die in naive Mäuse injiziert wurden; b zeigt den Verlauf der Tumorbildung bei Mäusen, die mit Lebend-BCG vorimmunisiert waren; für die in c dargestellten Versuche wurde lösliches rekombinantes hsp65 verwendet. Der Tumorindex ist als dicke Linie für jedes Tier eingezeichnet, das einen Tumor entwickelte, d.s. 3 von 4 in a, 1 von 4 in b und 4 von 4 in c. Diese Versuche zeigen somit, daß M3-Melanomzeilen, die Heatl exprimieren, ihre tumorigene Wirkung in BCG- vorimmunisierten Tieren verlieren.
ii) Um die Schutzwirkung der Tumorvakzine gegen Tumorbildung nach Tumorsetzung mit Wildtyp-M3-Zellen festzustellen, wurde wie folgt vorgegangen:
Die Mäuse wurden zunächst vorimmunisiert, wie oben angegeben. Nach zwei Immunisierungen (einwöchiger Abstand) mit Tumorvakzinen aus 105 pHeatl- transfizierten, bestrahlten M3-Zellen wurden die Mäuse nach einer weiteren Woche Ruhepause mit 10^ Wildtyp-M3- Zellen behandelt, was einer lOOfachen tumorigenen Dosis entsprach.
Im Zuge dieser Versuche, deren Ergebnis in Fig. 4 dargestellt ist (die Art der Darstellung ist analog wie in Fig. 3), wurde eine erste Gruppe mit Lebend-BCG vorimmunisiert und nach 6 Wochen Ruhezeit mit der Tumorvakzine aus Heatl-transfizierten M3-Zellen immunisiert. Nur eines von 8 Versuchstieren entwickelte einen Tumor mit annähernder Wildtyp-Kinetik, während alle anderen nach der Tumorsetzung tumorfrei blieben (Fig. 4a). In einem Parallelversuch entwickelten einige Mäuse 2 Wochen nach der Tumorsetzung kleine, dunkel pigmentierte Flecken. Diese Flecken zeigten kein Wachstum und schienen die Gesundheit der Tiere nicht zu beeinträchtigen.
Eine zweite Versuchsgruppe von Mäusen erhielt bei ansonsten identischen Versuchsparametern die Präimmunisierung in Form von je 50 μg bakteriellem rekombinantem hsp65. Die Erfolgsrate war ähnlich wie in der ersten Gruppe, wobei auch hier nur ein Tier einen Tumor mit Wildtyp-Kinetik entwickelte (Fig. 4b).
In einer dritten Versuchsgruppe (Kontrolle für die Vorimmunisierung) wurden Mäuse mit ganzen bestrahlten E.coli Bakterien des Stammes M1456, die das rekombinante hsp65-Protein exprimieren, immunisiert. 6 von 8 Tieren aus dieser Gruppe entwickelten nach der Behandlung mit M3-Wildtypzellen Tumore, meistens mit Wildtyp-Kinetik (Fig. 4c).
Eine vierte Versuchsgruppe diente zur Kontrolle für die tumorspezifische Immunisierung. Die Mäuse dieser Gruppe wurden nach Prä-Immunisierung mit Lebend-BCG mit M3- Wildtypzellen behandelt, ohne vorher mit den Tumorvakzinen aus Heatl-transfizierten M3-Zellen immunisiert worden zu sein. Alle Tiere aus dieser Gruppe entwickelten Tumore (Fig. 4d).
Beispiel 3
Beteiligung von T-Zellen an der Reaktion auf die Tumorvakzine
In Versuchen mit IL-2 sekretierenden Tumorvakzinen war gefunden worden, daß u.a. makrophagenahnliche Zellen, Granulozyten und NK-Zellen für die Eliminierung dieser Inokula verantwortlich sind, während jedoch keine Beteiligung von T-Zellen nachgewiesen worden war.
Für die entsprechende immunhistologische Untersuchung der Wirkung der erfindungsgemäßen Tumorvakzine wurden von den Versuchstieren Schnitte hergestellt, wie von Zatloukal et al., 1995, beschrieben, und mit den folgenden Antikörpern inkubiert: 145-2Cll-Biotin (CD3), RM4-5-Biotin (CD4), 53-6.7-Biotin (CD8), B220-Biotin (CD45-R), Ml/70 (Mac-1, CDllb), Gr-1 (RB6-8C5), (alle diese Antikörper wurden von Pharmingen bezogen); F4/80- Biotin (Serotec) und anti-Asialo-GMl-Antiserum (Wako Chemicals). Streptavidin- lkalische Phosophatase (Boehringer Mannheim) oder Kaninchen-anti-Kaninchen- alkalische Phosphatase (Serotec) wurden als FITC- markierte Antikörper eingesetzt.
Im Gegensatz zu den von Zatloukal et al., 1995, erhaltenen Ergebnissen wurde festgestellt, daß nach Injektion von pHeatl-transfizierten Zellen in Mäuse, die mit Lebend-BCG vorimmunisiert waren, mit anti-CD3- und anti-CD4-Antikörpern eine geringe, jedoch signifikante Anzahl positiver Zellen nachweisbar ist (Fig. 5: a: F4/80, b: CDllb, c: CD4 (jeweils 50fache Vergrößerung), d: CD3 (lOOfache Vergrößerung). Positive Zellen sind mit Pfeilspitzen markiert.). Insgesamt ähnelte die qualitative Zusammensetzung der Zellpopulation derjenigen, die an der Stelle der Tumorsetzung in IL-2-Tumorvakzin-behandelten Mäusen beobachtet wurde (Zatloukal et al., 1995).
Insgesamt ähnelte die qualitative Zusammensetzung der Zellpopulation derjenigen, die an der Stelle der Tumorsetzung in IL-2-Tumorvakzin-behandelten Mäusen beobachtet wurde (Zatloukal et al. , 1995).
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Claims

Patentansprüche
1. Tumorvakzine, dadurch gekennzeichnet, daß sie autologe und/oder allogene Tumorzellen enthält, die derart modifiziert sind, daß sie ein oder mehrere Antigene enthalten, für die im zu behandelnden Individuum bereits eine Immunantwort existiert.
2. Tumorvakzine nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Tumorzellen mit rekombinanter DNA transfiziert sind, die eine oder mehrere für ein Antigen kodierende Sequenzen enthält.
3. Tumorvakzine nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die rekombinante DNA Plasmid- DNA ist.
4. Tumorvakzine nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die rekombinante DNA ein retroviraler Vektor ist.
5. Tumorvakzine nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die rekombinante DNA ein adenoviraler Vektor ist.
6. Tumorvakzine nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen von einem Humanpathogen abgeleitet ist.
7. Tumorvakzine nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen von einem Virusprotein abgeleitet ist.
8. Tumorvakzine nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen ein Protein(fragment) von Epstein-Barr-Virus, Influenza-Virus, Adenovirus, Hepatitis B-Virus, Herpes Simplex Virus oder Cytomegalovirus, oder ein Derivat davon ist.
9. Tumorvakzine nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen von einem bakteriellen Protein abgeleitet ist.
10. Tumorvakzine nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen von Mycobacterium- Protein abgeleitet ist.
11. Tumorvakzine nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen von Mycobacterium tuberculosis abgeleitet ist.
12. Tumorvakzine nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen von Mycobacterium bovis abgeleitet ist.
13. Tumorvakzine nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen von Bacillus Calmette Guerin abgeleitet ist.
14. Tumorvakzine nach einem der Ansprüche 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen ein Heat Shock Protein oder ein Fragment oder Derivat davon ist.
15. Tumorvakzine nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen hsp65 oder ein Fragment oder ein Derivat davon ist.
16. Tumorvakzine nach einem der Ansprüche 6 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen mit einer Sequenz modifiziert ist, die von einer natürlichen Signal- oder regulatorischen Sequenz abgeleitet ist, die normalerweise Synthese und/oder Transport zellulärer Proteine steuert.
17. Tumorvakzine nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Sequenz ausgewählt ist aus der Gruppe GPI-Link-Sequenz, Signalsequenz von HSA und Insertion-Signalsequenz.
18. Tumorvakzine nach einem der Ansprüche 6 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen gegenüber dem natürlichen Antigen eine oder mehrere Mutationen aufweist.
19. Tumorvakzine nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie autologe Tumorzellen enthält.
20. Tumorvakzine nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie Zellen einer Tumorzellinie enthält.
21. Tumorvakzine nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie außerdem Zellen, insbesondere Tumorzellen oder Fibroblasten enthält, die ein oder mehrere Zytokine exprimieren.
22. Tumorvakzine nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß das Zytokin Interleukin-2 ist.
23. Tumorvakzine nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie außerdem ein oder mehrere Zytokine enthalten.
24. Tumorvakzine nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß das Zytokin Interleukin-2 ist.
25. Verfahren zur Herstellung einer Tumorvakzine nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man autologe Tumorzellen oder Zellen einer Tumorzellinie mit einem Komplex aus der Plasmid- DNA und einem Konjugat aus einem zellulären Liganden und einem organischen Polykation in Gegenwart eines endosomolytischen Mittels transfiziert, die transfizierten Zellen inaktiviert und gegebenenfalls mit einem oder mehreren Zytokinen und/oder mit Zytokin produzierenden Zellen sowie mit pharmazeutisch annehmbaren Hilfs- und Trägerstoffen mischt.
26. Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß das Konjugat Transferrin- Polylysin und das endosomolytische Mittel ein, gegebenenfalls mit Polylysin konjugiertes, inaktiviertes Adenovirus ist.
27. Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß Zytokin Interleukin-2 ist.
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