WO1996024686A2 - Detection de bacteries du genre listeria selon des techniques d'hybridation de sondes nucleiques - Google Patents

Detection de bacteries du genre listeria selon des techniques d'hybridation de sondes nucleiques Download PDF

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WO1996024686A2
WO1996024686A2 PCT/FR1996/000202 FR9600202W WO9624686A2 WO 1996024686 A2 WO1996024686 A2 WO 1996024686A2 FR 9600202 W FR9600202 W FR 9600202W WO 9624686 A2 WO9624686 A2 WO 9624686A2
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listeria
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Claude Mabilat
Brunehild Sallen
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Bio Merieux
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria

Definitions

  • the present invention relates to the field of detection and / or amplification techniques, using oligonucleotide probes or primers, and their application to the search for the presence or identification of bacteria of the genus Listeria.
  • Listeria are Gram + bacteria belonging to the family of Listeriaceae, which is subdivided into two genera the genus Listeria and the genus Brochothrix (Collins et al, 1991, International Journal of Systematic Bacteriology, 41, 240-246)
  • the genus Listeria groups the following bacterial species Listeria monocytogenes, Listeria innocua, Listeria seeligert, Listeria welshimeri, Listeria ivanovu, Listeria murrayi and Listeria grayi
  • Listeria monocytogenes has a pathogenic capacity for humans This species is particularly responsible in humans for severe pathologies such as meningoencephalitis, septicemia or abortion
  • the species Listeria monocytogenes has been recognized as the agent responsible for several epidemics of food poisoning, notably in Canada in 1981, in the United States from 1983 to 1985, in Switzerland from 1983 to 1987 and very recently in France in 1992 and 1993
  • the mortality rate associated with these pidripartis is very high, about a third of
  • the present invention overcomes the aforementioned drawbacks for demonstrating the presence of bacteria of the genus Listeria, and more particularly of the species Listeria monocytogenes, by using a genetic marker in a detection process by nucleic acid hybridization , combining specificity, sensitivity and speed
  • RNA molecules Bacterial ribosomes contain at least three distinct RNA molecules called 5S, 16S and 23S rRNAs. Historically, these names have been chosen by reference to their sedimentation rate, which is related to the size of these RNA molecules
  • the ribosomal RNA (rRNA) of bacteria can be used as a target.
  • rRNA ribosomal RNA
  • nucleic acid extracted from bacteria means either the total nucleic acid, or the ribosomal RNA, in particular the 23S rRNA, or the genomic DNA, or even the DNA obtained from the reverse transcription of 23 S ribosomal RNA;
  • nucleotide fragment or an "oligonucleotide” are two synonymous terms designating a sequence of nucleotide patterns characterized by the informational sequence of natural (or possibly modified) nucleic acids and capable of hybridizing, like natural nucleic acids, with a nucleotide fragment
  • the chain may contain nucleotide motifs with a structure different from that of natural nucleic acids.
  • a nucleotide fragment (or oligonucleotide) can contain, for example, up to 100 nucleotide units. It generally contains at least 10, and in particular at least 12 nucleotide units and can be obtained from a natural nucleic acid molecule and / or by genetic recombination and / or by chemical synthesis,
  • a nucleotide motif is derived from a monomer which can be a natural nucleotide of nucleic acid, the constituent elements of which are a sugar, a phosphate group and a nitrogenous base; in DNA the sugar is deoxy-2-ribose, in RNA the sugar is ribose; depending on whether it is DNA or RNA, the nitrogen base is chosen from adenine, guanine, uracil, cytosine, thymine; or the monomer is a nucleotide modified in at least one of the three constituent elements; by way of example, the modification can take place either at the base level, with modified bases such as inosine, methyl-5-deoxycytidine, deoxyuridine, dimethylamino-5-deoxyuridine, diamino-2,6- purine, bromo-5-deoxyuridine or any other modified base capable of hybridization, either at the sugar level, not for example the replacement of at least one deoxyribose by a
  • hybridization means the process during which, under appropriate conditions, two nucleotide fragments having sequences sufficiently
  • hybridization conditions are determined by "stringency", that is to say the rigor of the operating conditions. Hybridization is all the more specific as it is performed at higher stringency. Stringency is a function in particular of the base composition of a probe / target duplex, as well as by the degree of mismatch between two nucleic acids. The stringency can also be a function of the parameters of the hybridization reaction, such as the concentration and the type of ionic species present in the hybridization solution, the nature and the concentration of denaturing agents and / or the temperature of hybridization. The stringency of the conditions under which a hybridization reaction must be carried out depends in particular on the probes used.
  • the temperature for the hybridization reaction is between about 20 and 65 ° C, in particular between 35 and 65 ° in saline at a concentration of about 0.8 to 1M .
  • probe is a nucleotide fragment comprising for example from 10 to
  • nucleotide motifs in particular from 12 to 35 nucleotide motifs, having a specificity of hybridization under determined conditions to form a hybridization complex with a target nucleic acid having, in the present case, a nucleotide sequence comprised either in a ribosomal RNA , either in DNA obtained by reverse transcription of said ribosomal RNA, or in DNA (here called ribosomal DNA or rDNA) in which said ribosomal RNA is the transcription product; a probe can be used for diagnostic purposes (in particular capture or detection probes) or for therapy purposes,
  • a "capture probe” is immobilized or immobilizable on a solid support by any suitable means, for example by covalence, by adsorption, or by direct synthesis on a solid support (see in particular patent application WO 92 10092) - a "detection probe" can be marked by means of a marker chosen for example from radioactive isotopes, enzymes, in particular enzymes capable of acting on a chromogenic, fluorigenic or luminescent substrate (in particular a peroxidase or a phosphatase alkaline), chromophoric chemical compounds, chromogenic, fluorigenic or luminescent compounds, nucleotide base analogs, and iigands such as biotin,
  • a “primer” is a probe comprising for example from 10 to 100 nucleotide units and having a specificity of hybridization under conditions determined for the initiation of an enzymatic polymerization, for example in an amplification technique such as PCR (Polymerase Chain Reaction), in a sequencing process, in a reverse transcription method, etc.
  • the probes according to the invention can be used, for diagnostic purposes, in the search for the presence or absence of a target nucleic acid in a sample, according to all the known hybridization techniques and in particular the techniques of point deposit on filter, called “dot-blot” (MANIATIS et al, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, 1982), DNA transfer techniques called “Southern blot” (SOUTHERN. EM, J. Mol.
  • the technique is used sandwich, with a capture probe and / or a detection probe, said probes being capable of hybridizing with two different regions of the target nucleic acid, and at least one of said probes (generally the detection probe) being able to hybridize with a target region that is specific to the species or group of species sought, it being understood that the capture probe and the detection probe must have nucleotide sequences at least partially different.
  • the nucleotide probes of the invention can be used in conventional hybridization methods
  • the nucleic acid to be detected can be DNA (possibly obtained after amplification) or RNA.
  • the target nucleic acid can be obtained by extraction, according to known methods, from the nucleic acids of a sample to be examined.
  • the denaturation of a double-stranded nucleic acid can be carried out by known methods of chemical, physical or enzymatic denaturation, and in particular by heating to an appropriate temperature, above 80 ° C.
  • the demonstration of the presence of a given Listeria species requires the use of probes allowing the detection of a point mutation. For this, it is advisable to operate with probes of a predetermined length (number of nucleotide units), under conditions which are themselves predetermined. Further details are given below, with particular reference to the sandwich hybridization method which constitutes one of the most practical hybridization methods currently.
  • This method comprises contacting a first probe fixed on a solid support with a solution containing the nucleic acid to be analyzed, and bringing said support into contact with the detection probe, incubating the mixture obtained, rinsing of the support, to remove the constituents which are not fixed on the support by specific hybridization, and the qualitative or quantitative detection, using a revelation reaction of the marker fixed on the support, of the fixed detection probe.
  • the revelation of the presence of the marker can be carried out for example by colorimetry, fluorescence or luminescence.
  • the capture probe is brought into contact with the sample and with the detection probe can be carried out sequentially, possibly with intermediate rinsing of the support. It is also possible to operate by placing the capture probe fixed on the support in simultaneous or almost simultaneous contact with a solution containing the sample and the detection probe which can be added as a mixture or separately
  • the incubation and subsequent washing stages, which constitute the key stages of the sandwich hybridization process, are each carried out at a constant temperature which can for example be included in the range mentioned above (see “Definitions”).
  • nucleic acid hybrids have a dissociation temperature which depends on the number of bases hybridized (the temperature increases with the size of the hybrid) and which also depends on the nature of the bases hybridized and, for each hybridized base, of the nature of the adjacent bases.
  • the dissociation of the hybrids occurs over a temperature interval of a few degrees and can be easily determined, for example by U V spectroscopy. It is possible to determine experimentally the half-dissociation temperature of the hybrid formed by a given probe with the target of complementary sequence, by simple routine experiments.
  • the hybridization temperature used in the sandwich hybridization technique must obviously be chosen below the semi-dissociation temperature. More exactly, we operate at a temperature lower than the semi-dissociation temperature of the least stable hybrid. among the two hybrids formed by the target with a pan the capture probe and on the other hand the detection probe, so that the two hybrids are stable at the temperature at which one operates A point mutation, i.e.
  • the subject of the invention is therefore a single-stranded oligonucleotic, characterized in that it is chosen from oligonucleotides, having at least 12 nucleotide units, the sequence of which is included in one of the sequences (a 1 ) to (a 10 ) from the following list
  • oligonucleotides of the invention some can be used to characterize a species or a group of species of the genus Listeria. These are in particular the oligonucleotides defined using the sequences (b 1 ) to (bis) and (c 1 ) to (c 1 4 ) below.
  • the invention relates in particular to an oligonucleotide as defined above, characterized in that it comprises a sequence of at least five consecutive nucleotide motifs included in a sequence included inside the square brackets appearing in the sequences (b 1 ) to (b 15 ) from the following list:
  • the invention relates in particular to an oligonucleotide as defined above, characterized in that its sequence is included in one of the sequences (c 1 ) to (e 14 ) below
  • oligonucleotides of the invention some can be used as a probe making it possible to detect any bacterium of the genus Listeria. These include
  • oligonucleotides defined using the sequences (d 1 ) to (d 6 ) below.
  • the invention therefore also relates to an oligonucleotide as defined above, characterized in that its sequence is included in one of the following sequences (d 1 ) to (d 6 ):
  • the oligonucleotides of the invention can be immobilized on a solid support (this is notably the case with a capture probe) or labeled with a tracer agent (detection probe) .
  • the subject of the invention is also a method for determining the presence or absence of at least one bacterium of the genus Listeria, in a sample containing or capable of containing nucleic acids of at least one such bacterium, according to a method in which said sample is brought into contact with at least one nucleic probe, then the formation or absence of formation of a hybridization complex between said probe and the nucleic acid of the sample, characterized in that the said probe is an oligonucleotide chosen from those which have been defined previously.
  • nucleic probes For the determination of the presence or absence of a species or a group of species of bacteria of the genus Listeria, it is possible to use as nucleic probes on the one hand a first probe as defined above and on the other share a probe as defined by one of the sequences (b 1 ) to (b 15 ) or (c 1 ) to (e 14 ), it being understood that said first and second probes are capable of hybridizing with non-overlapping regions of rRNA 23 (or its complement) of a bacteria of the genus Listeria.
  • the first probe is for example immobilized on a solid support and the second probe is labeled with a tracer agent.
  • o can use as probe at least one oligonucleotide as defined by the sequences (d 1 ) to
  • a specific probe of the genus Listeria (included in one of the sequences (d 1 ) to (d) can be used to determine the bacteria which have just been mentioned. 6 )) in combination with the specific sequences q have just been indicated.
  • a two probe system is used for the determination of the presence or absence of Listeria monocytogenes. , in particular in a process characterized by the fact
  • one of the probes has a sequence included in the sequence (b 1 ), (b 10 ), (b 14 ) or (b 15 ) and the other probe a sequence included in the sequence (b 4 ),
  • oligonucleotides which have been defined above can also be used as nucleotide primers for the synthesis of a nucleic acid in the presence of a polymerase in a manner known per se, and in particular in amplification methods using such a synthesis in the presence of '' a polymerase (PCR, RT-PCR, etc.)
  • the oligonucleotides of the invention can in particular be used as primers for the reverse reverse transcription specific for a 23 S ribosomal RNA sequence of at least one species or at least one group of species of the Listeria genus to obtain a sequence of corresponding complementary DNA
  • a reverse transcription may constitute the first stage of an RT-PCR, the next stage being the PCR amplification of the complementary DNA obtained.
  • oligonucleotides can also be used as primers, in particular for the amplification specific by polymerase chain reaction of the rDNA sequence complementary to a 23 S ribosomal RNA sequence of at least one species or at least one group of species of the genus Listeria
  • the oligonucleotides defined above may also be used as therapy probes to treat infections caused by at least one species or group of species of bacteria of the genus Listeria
  • These probes s of therapy capable of hybridizing to 23 S ribosomal RNA and / or to the genomic DNA of said bacteria can block the phenomena of translation and / or transcription and / or replication
  • the principle of gene therapy methods is known and is based in particular on the use of a probe corresponding to an anti-sense strand the formation of a hybrid between the probe and the sense strand is capable of disturbing at least one of the steps of decrypting genetic information
  • the sequencing was carried out according to the following steps: extraction of the DNA from the strains by the method of Sjöbring et al. (1990 Polymerase chain reaction for detection of Mycobacterium tuberculosis J Clin. Microbiol. 28 (10) .2200-2204), PCR amplification of 23S ribosomal DNA using eubacterial primers defined in the zones
  • R means G or A
  • This step allowed the amplification of 3 zones of approximately 1kb making it possible to cover the entire 23 S target and which were sequenced on each of the 2 strands by the chain termination method on an Applied Biosystems ABI 360 sequencer ( Sanger et al., Proc. Natl Acad Sci USA, 1977, 74 5463-5467)
  • This probe was used as a detection probe in a sandwich hybridization test
  • RNA from Gram + bacteria was extracted according to the basic protocol for the extraction of RNA from Gram + bacteria described in "Current Protocols in Molecular Biology" 1987, Ausubel FM et al., Wiley interscience, New York.
  • a microtiter plate (Nunc 439454) is deposited a solution of 1 ng / ⁇ l of the capture oligonucleotide, the 5 'end of which is coupled with the reagent Aminolink 2 (registered trademark, Applied Biosystems, Foster city, California) in 3X PBS (0.45 M NaCl; 0.15 M sodium phosphate; pH 7.0). The plate is incubated for 2 h at 37 ° C.
  • the Aminolink 2 reagent makes it possible to add an arm comprising a 6-aminohexyl group to the 5 ′ end of the probe.
  • the target (10 ⁇ l of total RNA) mixed with 40 ⁇ l of salmon PBS buffer (PBS-3X + salmon sperm DNA 10 ⁇ g / ml (Sigma D 9156) is deposited in the well in the presence of 50 ⁇ l of a solution of the oligonucleotide-peroxidase conjugate, constituting the detection probe, at a concentration of 0.1 ng / ⁇ l of oligonucleotide in PBS-horse buffer (PBS 3X + 10% horse serum (BioMérieux 55842))
  • PBS-horse buffer PBS 3X + 10% horse serum (BioMérieux 55842)
  • the plate is incubated for 1 h 37 ° C. and then washed 3 times with 300 ⁇ l of PBST buffer.
  • 100 ⁇ l of OPD substrate ortho-phenylenediamine Cambridge Medical Biotechnology ref / 456
  • OPD substrate ortho-phenylenediamine Cambridge Medical Biotechnology ref /
  • the adaptation of the specific combination of probes tested on the VIDAS machine (BIO MERIEUX-VITEK) was carried out.
  • the wall of the microplate well is here replaced by the SPR ("Solid Phase Receptacle") (BIOMERIEUX- VITEK-USA) which is a conical support made from a material called K resin (registered trademark for a butadiene-styrene copolymer ).
  • K resin registered trademark for a butadiene-styrene copolymer
  • the various reagents are deposited in a strip with several cuvettes and the various stages take place in the SPR which is capable of aspirating and discharging the reagents.
  • the sandwich hybridization reaction described in the protocol below takes place on the internal wall of the cone.
  • the capture oligonucleotide comprising at its 5 ′ end the ligand Aminolink 2 (Applied Biosystems-ref. 400808) is fixed passively on the internal surface of the SPR, at a concentration of 1 ng / ⁇ l in a volume of 315 ⁇ l of a 4x PBS solution (200 mM sodium phosphate pH 7.0, 600 mM NaCl). After overnight at room temperature or two hours at 37 ° C., the cones are washed twice with a PBS Tween solution, then dried under vacuum
  • the strip associated with the VIDAS automaton contains in reagents the reagents necessary for detection, that is to say:
  • the contents of the first and second wells are drawn into the pretreated cone as indicated above. After incubation for 30 minutes, the cone is washed twice with a PBS Tween solution and 250 ⁇ l of MUP substrate (4-methyl umbelliferyl phosphate) are aspirated and then released into a reading cuvette The device measures the fluorescent signal expressed in URF ( relative fluorescence units) of the cuvette
  • L. mnocua can be detected using the combination of the following two probes for capture and detection, respectively:
  • L. ivanovn can be detected using the combination of the following two probes for capture and detection, respectively.

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Abstract

Oligonucléotides monocaténaires capables de s'hybrider avec l'ARN ribosomique 23S de bactéries du genre Listeria, ou avec l'un des brins de l'ADN correspondant. Ces oligonucléotides sont utilisables notamment comme sondes spécifiques, selon les cas, du genre Listeria, ou d'une espèce ou d'un groupe d'espèces dudit genre, dans des méthodes de détection utilisant les techniques d'hybridation de sondes nucléiques.

Description

Détection de bactéries du genre Listeria selon des techniques d'hybridation de sondes nucléiques
La présente invention concerne le domaine des techniques de détection et/ou d'amplification, à l'aide de sondes ou d'amorces oligonucléotidiques, et leur application à la recherche de la présence ou à l'identification de bactéries du genre Listeria.
Les Listeria sont des bactéries Gram + appartenant à la famille des Listeriaceae, qui est subdivisée en deux genres le genre Listeria et le genre Brochothrix (Collins et al , 1991, International Journal of Systematic Bacteriology, 41, 240-246) Le genre Listeria regroupe les espèces bactériennes suivantes Listeria monocytogenes, Listeria innocua, Listeria seeligert, Listeria welshimeri, Listeria ivanovu, Listeria murrayi et Listeria grayi Seule l'espèce Listeria monocytogenes présente un pouvoir pathogène pour l'homme Cette espèce est notamment responsable chez l'homme de pathologies sévères telles que des méningo-encéphalites, septicémies ou avortements Par ailleurs, depuis 1981, l'espèce Listeria monocytogenes est reconnue comme agent responsable de plusieurs épidémies d'intoxications alimentaires, notamment au Canada en 1981, aux Etats Unis de 1983 à 1985, en Suisse de 1983 à 1987 et très récemment en France en 1992 et 1993 Le taux de mortalité associé à ces épidémies est très élevé, un tiers environ des cas aboutissant à un avortement ou à un décès.
Il est donc important de développer un test de diagnostic bactériologique suffisamment spécifique et sensible pour permettre une détection rapide et sélective de l'espèce Listeria monocytogenes, utilisable notamment dans l'industrie alimentaire et le diagnostic médical.
Une première génération de tests rapides a été proposée, bases sur la technique de cytométrie de flux (Donnelly C. W. , G. J. Baigent, and E. H. Briggs, 1988 Flow cytometry for automated analysis of milk containing Listeria monocytogenes ; J. Assoc. Off. Anal. Chem.71: 655-658) ou sur la méthode ELISA ("enzyme-linked immunosorbent assay") (Mattingley J. A., B.T. Butman, M.C. Planck, R.J. Durham, and B. J. Robinson, 1988 : Rapid monoclonal antibody-based enzyme-linked immunosorbent assay for the détection of Listeria in food products ; J. Assoc. Off. Anal. Chem 71: 679-681). Toutefois, ces techniques ne permettent que la détection des bactéries appartenant au genre Listeria sans aucune discrimination des espèces, et notamment de l'espèce pathogène Listeria monocytogenes. D'autres techniques de détection par hybridation d'acides nucléiques, utilisant des marqueurs génétiques, ont ensuite été développées. Il a ainsi été montré que certaines séquences d'acides nucléiques sont spécifiques de la seule espèce L. monocytogenes. Ces séquences font notamment partie des gènes codant pour des déterminants de virulence, tels que la région en aval du gène hlyA (listeriolysine O) (Mengaud J., M.F. Vicente, J. Chenevert, J Moniz-Pereira, C. Geoffroy, B. Gicquel-Sanzey, F. Baquero, J.C. Perez-Diaz, and P. Cossart, 1988 : Expression in Escherichia coli and séquence analysis of the listeriolysin O déterminant of Listeria monocytogenes ; Infect. Immun. 56: 766-772) ou le gène lap ("invasion-associated protein", encore appelée p60, Kôhler S., M. Leimeister-Wàchter, T Chakraborty, F
Lottspeich, and W Goebel, 1990 . The gène coding for protein p60 of Listeria monocytogenes and its use as a spécifie probe for Listeria monocytogenes ; Infect. Immun. 58: 1943-1950) Toutefois, l'utilisation de ces marqueurs nécessite une étape préalable d'amplification d'acide nucléique afin d'obtenir une sensibilité convenable des tests, car chacun de ces gènes n'est présent qu'en monocopie.
La présente invention pallie les inconvénients précédemment cités pour la mise en évidence de la présence de bactéries du genre Listeria, et plus particulièrement de l'espèce Listeria monocytogenes, par utilisation d'un marqueur génétique dans un procédé de détection par hybridation d'acides nucléiques, alliant spécificité, sensibilité et rapidité
Les ribosomes bactériens contiennent au moins trois molécules d'ARN distinctes appelées ARNr 5S, 16S et 23 S. Historiquement, ces dénominations ont été choisies par référence à leur vitesse de sédimentation, qui est reliée à la taille de ces molécules d'ARN
Dans le procédé de l'invention, l'ARN ribosomique (ARNr) des bactéries peut être utilisé comme cible. Un des avantages de cette utilisation est que l'ARNr est retrouvé en abondance dans toutes les cellules des organismes vivants
L'utilisation de l'ARNr 16S de Listeria dans le diagnostic des listerioses a été décrite
(voir notamment Wang R.-F.et al., 1991 Development of a 16S rRNA-based oligomer probe spécifie for Listeria monocytogenes , Appl. Environ. Microbiol. 57.3666-3670, les demandes de brevet n° EP 314 294, n° WO 90/0884 et le brevet des Etats Unis n° US 5 089 386)
On a maintenant découvert sur l'ADN codant pour l'ARN ribosomique de la sous-unité 23S des zones variables selon les genres bactériens, mais qui apparaissent conservées parmi les espèces appartenant au genre des Listeria, ce qui permet de discriminer au moins un groupe d'espèces du genre Listeria d'autres genres ou groupes de genres bactériens Par ailleurs, il existe dans lesdites zones conservées parmi les espèces du genre Listeria, des variations mineures de séquence entre lesdites espèces. Ces différents résultats ont permis de concevoir des sondes nucléiques spécifiques d'espèces ou de groupes d'espèces de Listeria.
Avant d'exposer plus en détail l'invention, différents termes utilisés dans la description et les revendications sont définis ci -après :
- par "acide nucléique extrait de bactéries" on entend soit l'acide nucléique total, soit l'ARN ribosomique, en particulier l'ARNr 23S, soit l'ADN génomique, soit encore l'ADN obtenu à partir de la transcription inverse de l'ARN ribosomique 23 S ;
- un "fragment nucléotidique" ou un "oligonucléotide" sont deux termes synonymes désignant un enchaînement de motifs nucléotidiques caractérisé par la séquence informationnelle des acides nucléiques naturels (ou éventuellement modifiés) et susceptibles de s'hybrider, comme les acides nucléiques naturels, avec un fragment nucléotidique
complémentaire ou sensiblement complémentaire, dans des conditions prédéterminées.
L'enchaînement peut contenir des motifs nucléotidiques de structure différente de celle des acides nucléiques naturels. Un fragment nucléotidique (ou oligonucléotide) peut contenir par exemple jusqu'à 100 motifs nucléotidiques. Il contient généralement au moins 10, et en particulier au moins 12 motifs nucléotidiques et peut être obtenu à partir d'une molécule d'acide nucléique naturelle et/ou par recombinaison génétique et/ou par synthèse chimique,
- un motif nucléotidique est dérivé d'un monomère qui peut être un nucléotide naturel d'acide nucléique dont les éléments constitutifs sont un sucre, un groupement phosphate et une base azotée ; dans l'ADN le sucre est le désoxy-2-ribose, dans l'ARN le sucre est le ribose ; selon qu'il s'agit d'ADN ou d'ARN, la base azotée est choisie parmi l'adénine, la guanine, l'uracile, la cytosine, la thymine ; ou bien le monomère est un nucléotide modifié dans l'un au moins des trois éléments constitutifs ; à titre d'exemple, la modification peut intervenir soit au niveau des bases, avec des bases modifiées telles que l'inosine, la méthyl-5-désoxycytidine, la désoxyuridine, la diméthylamino-5-désoxyuridine, la diamino-2,6-purine, la bromo-5-désoxyuridine ou toute autre base modifiée capable d'hybridation, soit au niveau du sucre, pas exemple le remplacement d'au moins un désoxyribose par un polyamide (P.E.
Nielsen et al, Science, 254, 1497-1500 (1991)), soit encore au niveau du groupement phosphate, par exemple son remplacement par des esters notamment choisis parmi les diphosphates. alkyl- et aryl-phosphonates et phosphorothioates. - par "séquence informationnelle", on entend toute suite ordonnée de motifs de type nucléotidique, dont la nature chimique et l'ordre dans un sens de référence constituent un information analogue à celle donnée par la séquence des acides nucléiques naturels,
- par "hybridation", on entend le processus au cours duquel, dans des condition appropriées, deux fragments nucléotidiques ayant des séquences suffisamment
complémentaires sont susceptibles de s'associer par des liaisons hydrogène stables et spécifiques, pour former un double brin. Les conditions d'hybridation sont déterminées par la "stringence", c'est-à-dire la rigueur des conditions opératoires. L'hybridation est d'autant plus spécifique qu'elle est effectuée à plus forte stringence. La stringence est fonction notamment d la composition en bases d'un duplex sonde/cible, ainsi que par le degré de mésappariement entre deux acides nucléiques. La stringence peut également être fonction des paramètres de la réaction d'hybridation, tels que la concentration et le type d'espèces ioniques présentes dans la solution d'hybridation, la nature et la concentration d'agents dénaturants et/ou la température d'hybridation. La stringence des conditions dans lesquelles une réaction d'hybridation doit être réalisée dépend notamment des sondes utilisées. Toutes ces données sont bien connues et les conditions appropriées peuvent éventuellement être déterminées dans chaque cas par des expériences de routine. En général, selon la longueur des sondes utilisées, la température pour la réaction d'hybridation est comprise entre environ 20 et 65°C, en particulier entre 35 et 65° dans une solution saline à une concentration d'environ 0,8 à 1M.
- une "sonde" est un fragment nucléotidique comprenant par exemple de 10 à
100 motifs nucléotidiques, notamment de 12 à 35 motifs nucléotidiques, possédant une spécificité d'hybridation dans des conditions déterminées pour former un complexe d'hybridation avec un acide nucléique cible ayant, dans le cas présent, une séquence nucléotidique comprise soit dans un ARN ribosomique, soit dans un ADN obtenu par transcription inverse dudit ARN ribosomique, soit encore dans un ADN (appelé ici ADN ribosomique ou ADNr) dont ledit ARN ribosomique est le produit de transcription ; une sond peut être utilisée à des fins de diagnostic (notamment sondes de capture ou de détection) ou à des fins de thérapie,
- une "sonde de capture" est immobilisée ou immobilisable sur un support solid par tout moyen approprié, par exemple par covalence, par adsorption, ou par synthèse directe sur un support solide (voir notamment la demande de brevet WO 92 10092) - une "sonde de détection" peut être marquée au moyen d'un marqueur choisi par exemple parmi les isotopes radioactifs, des enzymes, en particulier des enzymes susceptibles d'agir sur un substrat chromogène, fluorigène ou luminescent (notamment une peroxydase ou une phosphatase alcaline), des composés chimiques chromophores, des composés chromogènes, fluorigènes ou luminescents, des analogues de bases nucléotidiques, et des iigands tels que la biotine,
- une "amorce" est une sonde comprenant par exemple de 10 à 100 motifs nucléotidiques et possédant une spécificité d'hybridation dans des conditions déterminées pour l'initiation d'une polymérisation enzymatique, par exemple dans une technique d'amplification telle que la PCR (Polymerase Chain Reaction), dans un procédé de séquençage, dans une méthode de transcription inverse, etc..
Les sondes selon l'invention peuvent être utilisées, à des fins de diagnostic, dans la recherche de la présence ou de l'absence d'un acide nucléique cible dans un échantillon, selon toutes les techniques d'hybridation connues et notamment les techniques de dépôt ponctuel sur filtre, dites "dot-blot" (MANIATIS et al, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, 1982), les techniques de transfert d'ADN dites "Southern blot" (SOUTHERN. E.M., J. Mol. Biol., 98, 503 (1975), les techniques de transfert d'ARN dites "Northern blot", ou les techniques dites "sandwich" (DUNN A.R., HASSEL J.A., Cell, 12, 23 (1977)) ; on utilise en particulier la technique sandwich, avec une sonde de capture et/ou une sonde de détection, lesdites sondes étant capables de s'hybrider avec deux régions différentes de l'acide nucléique cible, et l'une au moins desdites sondes (généralement la sonde de détection) étant capable de s'hybrider avec une région de la cible qui est spécifique de l'espèce ou du groupe d'espèces recherché, étant entendu que la sonde de capture et la sonde de détection doivent avoir des séquences nucléotidiques au moins partiellement différentes.
Dans des conditions qui sont précisées dans l'exemple 1 ci-après, on a déterminé la séquence nucléotidique de l'ADNr correspondant à l'ARN ribosomique 23 S de deux espèces de Listeria, ainsi que d'une espèce du genre phylogénique immédiatement voisin de celui des Listeria, à savoir le genre Brochothrix. Cette étude a porté sur les espèces L. monocytogenes, L. innocua et Brochothrix thermosphacta.
On a recherché des régions fortement conservées pour le seul genre Listeria, permettant de le distinguer des autres genres bactériens, ainsi que des régions variables au sein du genre Listeria, et qui permettent donc de distinguer plusieurs espèces ou groupes d'espèces de Listeria. On a ainsi sélectionné, en faisant référence à la numérotation de la séquence nucléotidique de l'ARNr 23 S de Listeria monocytogenes ATCC 191 15, trois régions intéressantes, à savoir 664-728, 1188-1251 et 2209-2275. On a déterminé les séquences de ce mêmes régions pour différentes souches des autres espèces de Listeria ainsi que pour l'espèce Brochothrix campestris. Les résultats de ces différents séquençages sont résumés dans le tableau de séquences présenté en Annexe. Dans les séquences de ce tableau, le signe * représente un site vacant dont la représentation est nécessaire pour l'alignement des séquences en tenant compte de certaines espèces possédant à ce site un motif nucléotidique
supplémentaire.
Les résultats de ces recherches, c'est-à-dire les alignements de séquences figurant dans l tableau en Annexe, ont permis de concevoir des sondes permettant de détecter des groupes d'espèces ou d'identifier certaines espèces du genre Listeria. En choisissant des sondes dans le régions conservées chez toutes les espèces de Listeria, on peut détecter la présence ou l'absence d'au moins une bactérie quelconque du genre Listeria. En utilisant des sondes contenant des zones mutées pour une espèce particulière (par rapport à l'espèce de référence, ici L. monocytogenes), il est possible de détecter directement la présence d'une telle espèce. Dans les techniques d'hybridation sandwich, utilisant deux sondes en combinaison (sonde de capture et sonde de détection), on utilisera par exemple en combinaison une sonde spécifique du genre Listeria et une sonde spécifique de l'espèce considérée. On peut aussi utiliser en combinaison deux sondes spécifiques de ladite espèce, lorsqu'elles existent, ces deux sondes étant complémentaires de régions non chevauchantes de l'ARNr 23 S de ladite espèce.
Dans d'autres cas (notamment pour Listeria monocytogenes), il n'existe pas de sonde unique permettant de caractériser directement une espèce donnée. Il est alors possible d'utilise en combinaison deux sondes, (notamment selon la technique d'hybridation sandwich), à savoir par exemple : d'une part, une première sonde permettant l'hybridation avec l'ARNr (ou l'ADN de Listeria monocytogenes et d'une seconde espèce de Listeria, et d'autre part, une deuxième sonde capable de s'hybrider avec l'ARNr ou l'ADNr de Listeria monocytogenes et d'une ou plusieurs autres espèces de Listeria mais pas de ladite seconde espèce. Si on observe une hybridation de l'acide nucléique de l'échantillon avec un tel système de deux sondes, on peut conclure à la présence de Listeria monocytogenes
Comme on l'a indiqué précédemment, les sondes nucléotidiques de l'invention peuvent être utilisées dans les méthodes classiques d'hybridation L'acide nucléique à détecter (cible) peut être de l'ADN (éventuellement obtenu après amplification) ou de l'ARN. Dans le cas d'une cible nucléique double brin, il convient de procéder à sa dénaturation avant la mise en oeuvre du procédé de détection. L'acide nucléique cible peut être obtenu par extraction selon les méthodes connues des acides nucléiques d'un échantillon à examiner. La dénaturation d'un acide nucléique double brin peut être effectuée par les méthodes connues de dénaturation chimique, physique ou enzymatique, et en particulier par chauffage à une température appropriée, supérieure à 80°C
Dans certains cas, la mise en évidence de la présence d'une espèce de Listeria donnée nécessite l'utilisation de sondes permettant la détection d'une mutation ponctuelle. Pour cela, il convient d'opérer avec des sondes d'une longueur (nombre de motifs nucléotidique) prédéterminée, dans des conditions elles-mêmes prédéterminées. D'autres précisions sont données ci-après, en faisant référence plus particulièrement à la méthode d'hybridation sandwich qui constitue l'une des méthodes d'hybridation les plus pratiques actuellement. Cette méthode comprend la mise en contact d'une première sonde fixée sur un support solide avec une solution contenant l'acide nucléique à analyser, et la mise en contact dudit support avec la sonde de détection, l'incubation du mélange obtenu, le rinçage du support, pour éliminer les constituants non fixés sur le support par hybridation spécifique, et la détection qualitative ou quantitative, à l'aide d'une réaction de révélation du marqueur fixé sur le support, de la sonde de détection fixée. La révélation de la présence du marqueur peut être effectuée par exemple par colorimétrie, fluorescence ou luminescence. La mise en contact de la sonde de capture avec l'échantillon et avec la sonde de détection peut être effectuée de façon séquentielle, éventuellement avec rinçage intermédiaire du support. On peut également opérer par mise en contact simultanée ou quasi-simultanée de la sonde de capture fixée sur le support avec une solution contenant l'échantillon et la sonde de détection qui peuvent être ajoutées sous forme de mélange ou séparément
Les stades d'incubation et de lavage consécutif, qui constituent les étapes-clés du procédé d'hybridation sandwich, sont chacune effectuée à une température constante qui peut être par exemple comprise dans la gamme mentionnée plus haut (voir les "Définitions"). On sait que les hybrides d'acides nucléiques ont une température de dissociation qui dépend du nombre de bases hybridées (la température augmentant avec la taille de l'hybride) et qui dépend également de la nature des bases hybridées et, pour chaque base hybridée, de la nature des bases adjacentes. La dissociation des hybrides se produit sur un intervalle de température de quelques degrés et peut être facilement déterminée, par exemple en spectroscopie U V. Il est possible de déterminer expérimentalement la température de demi-dissociation de l'hybride formé par une sonde donnée avec la cible de séquence complémentaire, par de simples expériences de routine. La température d'hybridation utilisée dans la technique d'hybridation sandwich doit évidemment être choisie en-dessous de la température de demi-dissociation Plu exactement, on opère à une température inférieure à la température de demi-dissociation de l'hybride le moins stable parmi les deux hybrides que forme la cible avec d'une pan la sonde de capture et d'autre part la sonde de détection, afin que les deux hybrides soient stables à la température à laquelle on opère Une mutation ponctuelle, c'est-à-dire une mutation entraînant un mésappariement portant sur une seule paire de bases dans l'hybride, entraîne une modification, généralement un abaissement, de la température de demi-dissociation En utilisant des sondes suffisamment courtes, un tel mésappariement unique peut entraîner un abaissement relativement important de la température de demi-dissociation, de l'ordre de quelques degrés Ainsi, en choisissant, à l'aide d'expériences de routine préalables, une sonde de longueur appropriée, en opérant dans une solution tampon donnée, il est possible de déterminer une température à laquelle il sera possible de n'observer l'hybridation que dans le cas où la sonde est strictement complémentaire de la cible. En outre, grâce au choix de sondes courtes de longueur prédéterminée, il est possible de mettre en oeuvre la technique
d'hybridation sandwich à une température unique prédéterminée, par exemple 37°C Pour une discussion plus détaillée de la technique d'hybridation sandwich avec utilisation de sondes courtes, on peut se reporter notamment à la demande de brevet FR-2 663 040
L'invention a donc pour objet un oligonucléotique monocatenaire, caractérise par le fait qu'il est choisi parmi les oligonucléotides, ayant au moins 12 motifs nucléotidiques, dont la séquence est incluse dans l'une des séquences (a1) à (a10) de la liste suivante
Figure imgf000010_0001
Figure imgf000011_0001
ainsi qu'un oligonucléotide complémentaire dudit oligonucléotide.
Parmi les oligonucléotides de l'invention dont la séquence est incluse dans la séquence (a4), on citera en particulier ceux dont la séquence est incluse dans la séquence (a'4) :
(a'4) CCGAAACTGT GGATGAACCT CTTTAGAGGT TCGTGGTAGG
Parmi les oligonucléotides de l'invention, certains peuvent être utilisés pour caractériser une espèce ou un groupe d'espèces du genre Listeria. Ce sont notamment les oligonucléotides définis à l'aide des séquences (b1) à (bis) et (c1) à (c1 4) ci-après.
L'invention concerne en particulier un oligonucléotide tel que défini ci-dessus, caractérisé par le fait qu'il comporte une séquence d'au moins cinq motifs nucléotidiques consécutifs incluse dans une séquence comprise à l'intérieur des crochets figurant dans les séquences (b1) à (b15) de la liste suivante :
Figure imgf000012_0001
ainsi qu'un oligonucléotide complémentaire dudit oligonucléotide.
L'invention concerne notamment un oligonucléotide tel que défini précédemment, caractérisé par le fait que sa séquence est incluse dans l'une des séquences (c1) à (e14) suivantes
Figure imgf000012_0002
Figure imgf000013_0002
ainsi qu'un oligonucléotide complémentaire dudit nucléotide.
Parmi les oligonucléotides de l'invention, certains sont utilisables comme sonde permettant de détecter toute bactérie du genre Listeria. Ce sont notamment les
oligonucléotides définis à l'aide des séquences (d1) à (d6) ci-après.
L'invention a donc également pour objet un oligonucléotide tel que défini précédemment, caractérisé par le fait que sa séquence est incluse dans l'une des séquences (d1) à (d6) suivantes :
Figure imgf000013_0001
Pour l'utilisation dans les techniques d'hybridation classiques, les oligonucléotides de l'invention peuvent être immobilisés sur un support solide (c'est notamment le cas d'une sonde de capture) ou marqués avec un agent traceur (sonde de détection).
L'invention a également pour objet un procédé de détermination de la présence ou de l'absence d'au moins une bactérie du genre Listeria, dans un échantillon contenant ou susceptible de contenir des acides nucléiques d'au moins une telle bactérie, selon une méthode dans laquelle on met en contact ledit échantillon avec au moins une sonde nucléique, puis on détermine de façon connue en soi la formation ou l'absence de formation d'un complexe d'hybridation entre ladite sonde et l'acide nucléique de l'échantillon, caractérisé par le fait que ladite sonde est un oligonucléotide choisi parmi ceux qui ont été définis précédemment.
Pour la détermination de la présence ou de l'absence d'une espèce ou d'un groupe d'espèces de bactérie du genre Listeria, on peut utiliser comme sondes nucléiques d'une part une première sonde telle que définie précédemment et d'autre part une sonde telle que définie par l'une des séquences (b1) à (b15) ou (c1) à (e14), étant entendu que lesdites première et seconde sondes sont capables de s'hybrider avec des régions non chevauchantes de l'ARNr 23 (ou son complémentaire) d'une bactérie du genre Listeria. La première sonde est par exemple immobilisée sur un support solide et la seconde sonde est marquée avec un agent traceur Pou déterminer la présence ou l'absence d'au moins une bactérie (quelconque) du genre Listeria, o peut utiliser comme sonde au moins un oligonucléotide tel que défini par les séquences (d1) à
(d6)
On peut détecter la présence de certaines bactéries du genre Listeria, éventuellement avec une seule sonde, par exemple
- Listeria seeligen : sonde incluse dans la séquence (b2), (b12), (c2) ou (c10) ,
- Listeria innocua : sonde incluse dans la séquence (b13) ou (c12) ,
- Listeria ivanovn sonde incluse dans la séquence (b6) ou (c6) ,
- Listeria grayi et/ou Listeria mυrrayi (ces deux espèces ne pouvant pas être distinguées à l'aide des sondes de l'invention) sonde incluse dans la séquence (b3), (b7), (b8), (b9), (c3), (c7) ou (c8)
Lorsqu'on souhaite utiliser une sonde qui dérive de l'Annexe 1/3, en vue de la détermination d'une espèce particulière, il convient de vérifier préalablement à l'aide des sonde (b6) ou (c6) si Listeria ivanovn est présente Dans l'affirmative, on ne peut pas utiliser une sonde dérivée de l'Annexe 1/3 pour la détermination envisagée (car la séquence correspondan à l'Annexe 1/3 n'a pas été déterminée pour L. ivanovn)
Lorsqu'on utilise un système à deux sondes, on peut utiliser, pour déterminer les bactéries qui viennent d'être mentionnées, d'une part une sonde spécifique du genre Listeria (incluse dans l'une des séquences (d1) à (d6)) en combinaison avec les séquences spécifiques q viennent d'être indiquées. Lorsqu'il existe plusieurs sondes spécifiques de l'espèce recherchée, on peut bien entendu utiliser la combinaison de deux telles sondes spécifiques de cette espèce Pour la détermination de la présence ou de l'absence de Listeria monocytogenes, on utilise un système à deux sondes, en particulier dans un procédé caractérise par le fait
- que l'une des sondes a une séquence incluse dans la séquence (b1), (b10), (b14) ou (b15) et l'autre sonde une séquence incluse dans la séquence (b4),
- ou que l'une des sondes a une séquence incluse dans la séquence (c1), (c9), (c13) ou (c14) et l'autre incluse dans la séquence (c4) Les divers oligonucléotides qui ont été définis précédemment peuvent également être utilisés comme amorces nucléotidiques pour la synthèse d'un acide nucléique en présence d'une polymérase de façon connue en soi, et notamment dans des méthodes d'amplification utilisant une telle synthèse en présence d'une polymérase (PCR, RT-PCR, etc )
On peut utiliser notamment les oligonucléotides de l'invention comme amorces pour la transcription inverse spécifique d'une séquence d'ARN ribosomique 23 S d'au moins une espèce ou d'au moins un groupe d'espèces du genre Listeria pour obtenir une séquence d'ADN complémentaire correspondante Une telle transcription inverse peut constituer le premier stade d'une RT-PCR, le stade suivant étant l'amplification par PCR de l'ADN complémentaire obtenu On peut également utiliser ces oligonucléotides comme amorces, notamment pour l'amplification spécifique par reaction de polymérisation en chaîne de la séquence d'ADNr complémentaire d'une séquence d'ARN ribosomique 23 S d'au moins une espèce ou d'au moins un groupe d'espèces du genre Listeria Les oligonucléotides définis précédemment peuvent être également utilisés comme sondes de thérapie pour traiter les infections provoquées par au moins une espèce ou un groupe d'espèces de bactéries du genre Listeria Ces sondes de thérapie, capables de s'hybrider sur l'ARN ribosomique 23 S et/ou sur l'ADN genomique desdites bactéries peuvent bloquer les phénomènes de traduction et/ou de transcription et/ou de réplication Le principe des méthodes de thérapie genique est connu et repose notamment sur l'utilisation d'une sonde correspondant à un brin anti-sens la formation d'un hybride entre la sonde et le brin sens est capable de perturber au moins l'une des étapes du décryptage de l'information génétique La formation d'un duplex entre un oligonucléotide selon l'invention et l'ARN ribosomique 23 S des bactéries-cibles est également susceptible de perturber la configuration spatiale dudit ARNr et/ou l'association dudit ARNr avec les protéines constitutives du ribosome Les sondes de thérapie sont donc utilisables comme médicaments antibactériens, permettant de lutter contre les infections causées par des Listeria, y compris Listeria monocytogenes
Les exemples suivants illustrent l'invention EXEMPLE 1 : Détermination de la séquence nucléotidique des ARN ribosomique 23S de Listeria
La séquence nucléotidique de l'ADN correspondant à l'ARN ribosomique de la sousunité 23 S pour les espèces suivantes a été déterminée
L. monocytogenes ATCC 191 15
L. innocua ATCC 33090
L. seeligert CCUG 15330
Brochothrix thermosphacta ATCC 1 1509
Le séquençage a été réalisé selon les étapes suivantes extraction de l'ADN des souches par la méthode de Sjöbring et al. (1990 Polymérase chain reaction for détection of Mycobacterium tuberculosis J Clin. Microbiol. 28 (10).2200-2204), amplification par PCR de l'ADN ribosomique 23S à l'aide d'amorces eubactériennes définies dans les zones
phylogéniquement conservées de ce type d'ARN Les couples de sondes eubactériennes utilisés, correspondant à des séquences communes à toutes les bactéries, étaient les suivants .
Figure imgf000016_0001
On rappelle que R signifie G ou A
Cette étape a permis l'amplification de 3 zones d'environ lkb permettant de couvrir l'ensemble de la cible 23 S et qui ont été séquencées sur chacun des 2 brins par la méthode de terminaison de chaîne sur un séquenceur Applied Biosystems ABI 360 (Sanger et al., Proc. Natl Acad Sci USA, 1977, 74 5463-5467)
On a ensuite sélectionné trois régions correspondant aux séquences nucléotidiques 664-728, 1188-1251 et 2209-2275 (référence a L. monocytogenes ATCC 191 15 , voir Annexes 1/3 à 3/3)
L'ARN 23 S de ces régions a été séquence pour diverses espèces et souches de Listeria et de Brochothrix Les résultats sont rassemblés dans le tableau de séquences figurant en Annexe EXEMPLE 2 : Utilisation de sondes dirigées contre l'ARN ribosomique 23S du genre Listeria pour l'identification spécifique de Listeria monocytogenes
On a préparé la sonde suivante (complémentaire d'une séquence de la page 2/3 de l'Annexe)
ACGAACCTCT AAAGAG
Cette sonde a été utilisée comme sonde de détection dans un test d'hybridation sandwich
Une autre sonde (complémentaire d'une séquence de la page 3/3 de l'Annexe) a été préparée
TAAGCGTGGC GGGTTAGAAT,
et a été utilisée comme sonde de capture dans ce test
L'ARNr 23 S d'une collection de souches de Listeria et d'autres espèces bactériennes (voir ci-dessous) a été testée par hybridation à l'aide de ces deux sondes :
- 23 souches de L. monocytogenes , de sérovars et de provenances variées
-17 souches de L. mnocua
- 8 souches de L. seeligen
- 9 souches de L. welshimen
- 16 souches de L. ivanovii
- 3 souches de L. grayi
- 4 souches de L. murrayi
- 2 souches de Brochothrix thermosphacta
- 1 souche de Brochothrix campestris
- 1 souche de Bacillus subtilis
- 1 souche de Bacillus cereus
- 1 souche de Bacillus megatenum
- 3 souches de Eiγsepelothrtx rhustopathiae
- 1 souche de Lactobacillus acidophilus
- 2 souches de Streptococcus groupe A
- 1 souche de Streptococcus groupe B
- 1 souche de Streptococcus groupe C - 1 souche de Streptococcus faecalis
- 1 souche de Streptococcus suis
- 1 souche de Escherichia coli L'hybridation des ARN ribosomiques d'une bactérie-cible a été conduite selon le procédé de détection semi-automatisé décrit dans le brevet français n° 2.663.040. La sonde de détection est conjuguée à la phosphatase alcaline.
L'ARN ribosomique des souches a été extrait selon le protocole de base pour l'extraction de l'ARN des bactéries Gram + décrit dans "Current Protocols in Molecular Biology" 1987, Ausubel FM et al., Wiley interscience, New York. Dans une plaque de microtitration (Nunc 439454) est déposée une solution de 1 ng/μl de l'oligonucléotide de capture, dont l'extrémité 5' est couplée avec le réactif Aminolink 2 (marque déposée, Applied Biosystems, Foster city , Californie) dans du PBS 3X (0.45 M NaCl ; 0.15 M phosphate de sodium ; pH 7.0). La plaque est incubée 2 h à 37° C puis lavée 3 fois avec 300 μl de PBST (PBS 1x, Tween 20: 0,5 %> (Merck 822184)). Le réactif Aminolink 2 permet d'ajouter à l'extrémité 5' de la sonde un bras comportant un groupement 6-aminohexyle. L'utilisation d'une sonde couplée à un ligand possédant un groupement polaire (aminé primaire) fixée de façon passive sur le support, permet d'obtenir un signal amélioré (demande FR 2.679.255)
La cible (10 μl d'ARN totaux) mélangée avec 40 μl de tampon PBS saumon (PBS-3X + ADN de sperme de saumon 10 μg/ml (Sigma D 9156) est déposée dans le puits en présence de 50 μl d'une solution du conjugué oligonucléotide-peroxydase, constituant la sonde de détection, à la concentration de 0.1 ng/μl en oligonucléotide dans un tampon PBS-cheval (PBS 3X + 10 % sérum de cheval (BioMérieux 55842)) La plaque est incubée 1 h à 37° C puis lavée par 3 fois avec 300 μl de tampon PBST. Dans chaque puits, on ajoute 100 μl de substrat OPD (ortho-phénylènediamine Cambridge Médical Biotechnology ref/456) à la concentration de 4 mg/ml dans un tampon (0,055 M acide citrique, 0, 1 M
monohydrogénophosphate de sodium, pH 4,93), auquel on ajoute extemporanément du peroxyde d'hydrogène à 30% dilué au 1/1000. Après 20 min de réaction l'activité enzymatique est arrêtée par 100 μl d'acide sulflirique 1N et la lecture est effectuée à 492 nm sur un appareil Axia Microreader (AXIA) (bioMérieux). Les résultats des tests effectués ont montré que la combinaison de sondes utilisée est spécifique de L. monocytogenes.
L'adaptation de la combinaison spécifique de sondes testées sur l'automate VIDAS (BIO MERIEUX-VITEK) a été effectuée. La paroi du puits de microplaque est ici remplacée par le SPR ("Solid Phase Réceptacle") (BIOMERIEUX- VITEK-USA) qui est un support conique réalisé à partir d'un matériau appelé K résine (marque déposée pour un copolymère butadiène-styrène). Les divers réactifs sont déposés dans une barrette à plusieurs cuvettes et les différentes étapes se déroulent dans le SPR qui est capable d'aspirer et de refouler les réactifs. La réaction d'hybridation sandwich décrite dans le protocole ci-dessous se produit sur la paroi interne du cône.
Dans un premier temps, l'oligonuciéotide de capture comportant à son extrémité 5' le ligand Aminolink 2 (Applied Biosystems-réf.400808) est fixé passivement sur la surface interne du SPR, à une concentration de 1 ng/μl dans un volume de 315 μl d'une solution de PBS 4x (phosphate de sodium 200 mM pH 7,0, NaCl 600 mM). Après une nuit à température ambiante ou deux heures à 37°C, les cônes sont lavés 2 fois par une solution PBS Tween, puis séchés sous vide
La barrette associée à l'automate VIDAS contient dans des cuvettes les réactifs nécessaires à la détection, c'est à dire:
- dans le premier puits de la barrette, 10 μl de l'ARN extrait dans le même tampon que pour le protocole microplaque ci-dessus
- dans un second puits, 200 μl d'une solution à 0,1 ng/μl du conjugué de détection oligonucléotide-phosphatase alcaline,
- dans un troisième et un quatrième puits, 600 μl de solution de lavage PBS Tween
- et enfin une cuvette avec 250 μl de substrat MUP (méthyl-4 umbelliféryl phosphate) en solution dans un tampon diéthanolamine
Les contenus du premier et du second puits sont aspirés dans le cône prétraité comme indiqué précédemment. Après incubation 30 minutes, le cône est lavé 2 fois par une solution de PBS Tween et 250 μl de substrat MUP (méthyl-4 umbelliféryl phosphate) sont aspirés puis relachés dans une cuvette de lecture L'appareil mesure le signal fluorescent exprimé en URF (unités relatives de fluorescence) de la cuvette
Les résultats obtenus avec ce système sont identiques à ceux obtenus en plaque de microtitration EXEMPLE 3 :
De façon analogue, on peut détecter la présence de L. mnocua à l'aide de la combinaison des deux sondes suivantes pour la capture et la détection, respectivement :
1ère sonde : GGGTTAGAAT GGTCATACAG CCAGGGT
2ème sonde : CCACGCGCTT AGCGTGG
EXEMPLE 4 :
De façon analogue, on peut détecter la présence de L. ivanovn à l'aide de la combinaison des deux sondes suivantes pour la capture et la détection, respectivement .
1ère sonde : TTCATCCACA GTTTCGGTAA TATGT
2ème sonde : CGAACCTCTA TAAGAGGTTC A
Figure imgf000021_0001
Figure imgf000022_0001
Figure imgf000023_0001

Claims

REVENDICATIONS
1. Oligonucléotide monocaténaire, caractérisé par le fait qu'il est choisi parmi les oligonucléotides, ayant au moins 12 motifs nucléotidiques, dont la séquence est incluse dans l'une des séquences (ai) à (a1o) de la liste suivante .
Figure imgf000024_0001
ainsi qu'un oligonucléotide complémentaire dudit oligonucléotide.
2. Oligonucléotide selon la revendication 1 , caractérise par le fait qu'il comporte une séquence d'au moins cinq motifs nucléotidiques consécutifs incluse dans une séquence comprise à l'intérieur des crochets figurant dans les séquences (b1) a (b15) de la liste suivante :
Figure imgf000024_0002
Figure imgf000025_0002
ainsi qu'un oligonucléotide complémentaire dudit oligonucléotide.
3. Oligonucléotide selon la revendication 1 ou 2, caractérisé par le fait que sa séquence est incluse dans l'une des séquences (c1) à (c14) suivantes
Figure imgf000025_0001
ainsi qu'un oligonucléotide complémentaire dudit nucléotide.
4 Oligonucléotide selon la revendication 1, caractérise par le fait que sa séquence est incluse dans l'une des séquences (di) à (de) suivantes :
Figure imgf000026_0001
ainsi qu'un oligonucléotide complémentaire dudit oligonucléotide.
5. Oligonucléotide selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérise par le fait qu'il est immobilise sur un support solide.
6. Oligonucléotide selon l'une quelconque des revendications 1 a 4, caractérise par le fait qu'il est marque avec un agent traceur
7. Procédé de détermination de la présence ou de l'absence d'au moins une bactérie du genre Listeria, dans un échantillon contenant ou susceptible de contenir des acides nucléiques d'au moins une telle bactérie, selon une méthode dans laquelle on met en contact ledit échantillon avec au moins une sonde nucléique, puis on détermine de façon connue en soi la formation ou l'absence de formation d'un complexe d'hybridation entre ladite sonde et l'acide nucléique de l'échantillon, caractérise par le fait que ladite sonde est un oligonucléotide choisi parmi ceux qui sont définis dans l'une quelconque des revendications 1 a 6.
8. Procédé selon la revendication 7, pour la détermination de la présence ou l'absence d'une espèce ou d'un groupe d'espèces de bactéries du genre Listeria, caractérise par le fait q l'on utilise comme sondes nucléiques d'une part une première sonde telle que définie dans l'un quelconque des revendications 1 a 4 et d'autre part une seconde sonde telle que définie dans l revendication 2 ou 3, étant entendu que lesdites première et seconde sondes sont capables de s'hybrider avec des régions non chevauchantes de l'ARNr 23 S (ou son complémentaire) d'une bactérie du genre Listeria.
9. Procède selon la revendication précédente, caractérise par le fait que l'on utilise ladite première sonde est telle que définie dans la revendication 5 et ladite deuxième sonde est telle que définie dans la revendication 6.
10. Procède selon l'une quelconque des revendications 7 a 9, pour la détermination de la présence d'au moins une bactérie quelconque du genre Listena, ou de l'absence d'une telle bactérie, caractérisé par le fait que l'on utilise comme sonde un oligonucléotide tel que défini dans la revendication 4.
1 1. Procédé selon l'une quelconque des revendications 7 à 9, pour la détermination de la présence ou de l'absence de Listeria seeligeri, caractérisé par le fait que l'on utilise une sonde telle que définie dans la revendication 2, incluse dans la séquence (b2) ou (b12), ou telle que définie dans la revendication 3, incluse dans la séquence (c2) ou (c10)
12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 7 à 9, pour la détermination de la présence ou de l'absence de Listeria innocua, caractérisé par le fait que l'on utilise une sonde telle que définie dans la revendication 2, incluse dans la séquence (b13), ou telle que définie dans la revendication 3, incluse dans la séquence (c12).
13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 7 à 9, pour la détermination de la présence ou de l'absence de Listeria ivanovn, caractérisé par le fait que l'on utilise une sonde telle que définie dans la revendication 2, incluse dans la séquence (b6), ou telle que définie dans la revendication 3, incluse dans la séquence (c6).
14. Procédé selon l'une quelconque des revendications 7 à 9, pour la détermination de la présence ou de l'absence de Listeria grayi et/ou Listeria murrayi, caractérisé par le fait que l'on utilise une sonde telle que définie dans la revendication 2, incluse dans la séquence (b3),
(b7), (b8) ou (b9), ou telle que définie dans la revendication 3, incluse dans la séquence (c3), (c7) ou (c8).
15. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 1 à 14, caractérisé par le fait que l'on utilise ladite sonde en combinaison avec une sonde telle que définie dans la
revendication 4
16 Procédé selon revendication 8, pour la détermination de la présence ou de l'absence de Listeria monocytogenes, caractérisé par le fait
- que l'une des sondes est telle que définie dans la revendication 2, incluse dans la séquence (b1), (b10), (b14) ou (b 15), et l'autre sonde est telle que définie dans la revendication 2, incluse dans la séquence (b4),
- ou que l'une des sondes est telle que définie dans la revendication 3, incluse dans la séquence (c1), (c9), (c13) ou (c14), et l'autre sonde est telle que définie dans la revendication 3, incluse dans la séquence (c4)
17 Utilisation comme amorce nucléotidique pour la synthèse d'un acide nucléique en présence d'une polymérase, d'un oligonucléotide tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 4.
18. Sonde de thérapie, caractérisée par le fait qu'elle comprend un oligonucléotide tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 4.
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