WO1995033852A1 - Procede et sondes pour la detection de marqueurs lies au locus des amyotrophies spinales infantiles - Google Patents

Procede et sondes pour la detection de marqueurs lies au locus des amyotrophies spinales infantiles Download PDF

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WO1995033852A1
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Arnold Munnich
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Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale
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Definitions

  • SMA Infantile spinal muscular atrophy
  • I, II and III Infantile spinal muscular atrophies are divided into categories known as types I, II and III, according to the age of onset of symptoms and their course (2).
  • Type II spinal muscular atrophies also appear in the first year of life of affected children, but after they have acquired sitting position. They can hardly stand up any longer and reach the stage of adolescence at best.
  • the invention is based more particularly on the discovery that the 5ql3 region comprised several loci which, apart from repetitive sequences in variable number, had sequences of substantially identical nucleotides and formed as many polymorphic markers characteristic of this region.
  • the polymorphism of these markers is at the source of our ability to discriminate them, to sometimes correlate them with those worn by the parents of the subjects studied, or on the contrary, to identify the de novo nature of the mutations or deletions of which they can be the object.
  • new DNA markers more particularly polymorphic markers (microsatellites) were identified by screening of fragments, contained in the above range of two cM identified by (7) and contained in a 4 Mb YAC. This screening was carried out using a bank of YACs from the Center d'Etudes du Polymorphisme Humain (CEPH), Paris, France, using the first generation YACs 755B12 (containing the marker AFM265wf5) and 751E3 (containing the AFM marker 281yh9), by PCR amplification between the specific primers of each marker according to the three-dimensional method (3d) previously described (8).
  • a chromosomal walk according to a method previously described (12), allowed the identification of new YACs overlapping the previous YACs, and containing the new polymorphic DNA markers (microsatellites).
  • the high resolution genetic map previously carried out made it possible to recognize recombination events between the SMA locus and the nearest flanking polymorphic loci (D5S629, and D5S637) (7).
  • the CEPH YAC libraries were screened by PCR amplification between the primers specific for each marker according to the three-dimensional method (3d) previously described (8).
  • the genotype of the YACs containing the microsatellite markers was established by electrophoresis of the PCR products on denaturing polyacrylamide gel, transferred onto charged nylon membrane and hybridized with an oligonucleotide (CA) n or (CT) n labeled with 32 P. Detection dinucleotide repeats were performed by a method described (9). The size of the YACs was estimated after electrophoresis in pulsed field.
  • the DNA of the YACs was separated from the yeast chromosomes after electrophoresis in a pulsed field on agarose gel, known under the brand "SEAPLAQUE GTG 1%". After treatment with b agarase, the DNA was precipitated in ethanol. A total of 300 ng of YAC was digested with the restriction enzyme Sau 3A, then partially repaired, before being cloned into bacteriophage M13 at the Sal 1 site partially repaired.
  • the M13 clones containing repeats (CA) or (CT) were detected by screening with oligonucleotides (CA) 20 or (CT) 20 labeled with 32 P. The positive matrices were then sequenced (10). Oligonucleotide primers flanking the (CA) or (CT) repeats were chosen.
  • the chromosomal location of the markers was determined after PCR amplification of the DNAs of a panel of somatic hybrids on chromosome 5. This panel comprises the line HHW105 containing as unique human chromosome the entire chromosome 5, the line HH 1064 containing the deleted chromosome 5 in the 5qll-ql4 region and the HHW213 line containing chromosome 5p (11). Polymorphic loci were recognized by testing 5 unrelated control individuals. Non-polymorphic markers have been used as STS (abbreviation of the English expression "Sequence Tagged Site").
  • This walk used, from the selected YACs, the PCR amplification products generated between the oligonucleotide A33 chosen in the moderately repeated sequences of the ALU type. These products allowed the selection of new YACs overlapping the previous ones according to the method previously described (12). New polymorphic DNA markers were then isolated again from these YACs.
  • the 19 markers specific for the 5ql3 region were selected to select potentially overlapping YACs. Nine of them detect more than one locus in the 5ql3 region (Table 1). Indeed, four polymorphic microsatellite markers [C212 (D5F149S1-S2), C271 (D5F148S1-S2), C272 (D5F150S1-S2), C171 (D5F151S1-S2)] revealed the presence of two amplification products and a marker [C161 (D5F153S1-S2-S3)] revealed 3 amplification products on the somatic hybrid HHW105. None of them were located outside the 5ql3 region. These results demonstrate that the markers C212, C272, C271, C171 detect 2 loci and the marker C161 detects three loci in the 5ql3 region. These results indicate the presence of repeated elements on chromosome 5ql3 (Table 1).
  • the invention relates more particularly to means (nucleic acids and methods) enabling the detection and, where appropriate, the discrimination of several of these polymorphic markers.
  • DNA strands each of which is characterized in that its own nucleotide sequence: is contained in the nucleic sequence of one of the strands of a polymorphic marker of a human chromosomal region deemed to have a locus SMA, this marker containing variable repetition sequences, in particular dinucleotide sequences; itself contains a characteristic sequence present in this polymorphic marker but external to the region thereof which contains said repetition sequences, this characteristic sequence having a sufficient size, in particular at least 12 and, preferably, at least minus 15 nucleotides, so that a fragment of the same sequence can be used as a primer for the detection by PCR of corresponding markers in a DNA preparation of human origin.
  • C212 D5F149S1, S2
  • C272 D5F150S1, S2
  • C161 D5F153S1, S2, S3
  • C171 (D5F151S1, S2), hereinafter "C171"
  • strands of DNAs can be used as direct probes, for example for the presence or not of a deletion in the corresponding marker.
  • the invention then also relates in this case to recombinant DNAs (single strand or double strand) containing this strand recombinant with a non-human nucleic acid and not capable of hybridizing with a fragment of human DNA.
  • the preferred strands are those which can be used in a chain amplification method, in particular of the PCR type (abbreviation of the English expression "Polymerase Chain Reaction” or chain reaction in the presence of a polymerase) .
  • the invention relates to the pairs of primers preferably comprising at least 12, advantageously at least 15 nucleotides, the sequences of which are respectively contained in the pairs of sequences, in particular derived from:
  • C212A CCTCCACCCTGGGTGATAAG
  • C212B GCTGATGAAGTTGTAGGAGGC
  • C272A TAGAGACGGGGTTTCGGCAT
  • C272B GATCTGCCTTCCTTCCTGC
  • C161A GGCTTCCTCCTGAGTATGCA
  • C161B GTTTCACTGGATGGAACGGC
  • C171A ATCGCCCTCGAAATGCTATG
  • C171B CTGTTCCACTATGAAGCTATG
  • the invention naturally also relates to DNA strands which can be considered as complete replicas of the corresponding markers, these strands (which then also comprise the corresponding repeated sequences), which can also be used as markers-specific probes corresponding, for example to verify the existence or not of this specific marker on one of the alleles of a chromosome studied.
  • the invention also relates to a method for studying the chromosomal region pondered to contain at least one of the genes involved, either by its presence or by its absence, in SMA and originating from a subject (patient or fetus) affected or likely to be reached, this method comprising bringing a sample of chromosomal DNA from this subject or fetus into contact with at least one of the DNA strands as defined above, in particular under conditions amplifiers allowing, as soon as it hybridizes to corresponding markers of this chromosomal DNA, the elongation of its chains towards and beyond the repeated sequences of these markers, then to be placed under conditions making it possible to discriminate between the elongation chains obtained according to their respective lengths, to obtain information representative of the number of these markers.
  • telomere sequences capable of hybridizing to the regions of the markers, external to those which contain their sequences. respective repeats, the discrimination between the elongation chains produced being then obtained, in particular by their migration in an appropriate electrophoretic gel.
  • the method according to the invention will also be and by way of comparison, used on chromosomal preparations originating from parents or other related persons.
  • the detection in a given subject, in particular in the fetus, of the presence of at least one polymorphic marker on each of the alleles of the corresponding chromosome, in particular when the study Comparative will conclude that the fetus has inherited these markers from its two parents and is not predisposed to the disease. The same could be true for young children, whenever the clinical signs which they present lead the clinician to wonder about the possibility that they would have to develop the disease.
  • the invention makes it possible to obtain, at least in a certain number of cases, if only to ensure, in neonatal medicine, the absence of genetic potentiality of the disease in the fetus or to confirm a negative diagnosis in infants, when certain clinical signs seemed to indicate the contrary.
  • the DNA of the various individuals was extracted from leukocyte pellets or from lymp * hoblastoid lines. It was then digested with various restriction enzymes and then put to migrate on 0.8% agarose gel, before being transferred to a charged nylon membrane.
  • PCR amplification was carried out between the primers specific for markers C212 (D5F149S1 and S2), C272 (D5F150S1 and S2) and C161 (D5F153S1, S2 and S3).
  • the amplification conditions are as follows: denaturation at 94 ° C for 1 min., Hybridization at 55 ° C for 1 min. and extension at 72 ° C for 1 min. for 30 cycles.
  • the PCR products are then put to migrate on denaturing polyacrylamide gel, transferred to a positively charged nylon membrane which is hybridized with a probe recognizing the repetitions of CA dinucleotides (20).
  • the DNA of clone 595C11 was deposited and allowed to migrate on agarose gel (known under the designation "SEAPLAQUE GTG 0.5%"). After migration, the fragments, from 12 to 23 Kb in size, are cut out, digested with b-agarase and then precipitated in ethanol. After partial repair of the Sau 3A site, the DNA is subcloned to the partially repaired Xho 1 site of the bacteriophage FIX II (Stratagene).
  • Lambda clones containing markers C212 (L-51), C272 (L-51, L-132) and C171 (L-5, L-13) were used as probes to search for restriction polymorphisms (RFLP) with restriction enzymes EcoR I, Bgl II, Hind III and Xba I.
  • the JK53 probe (D5S112) was used as an internal control for gene assay analyzes. Autoradiographs were examined by densitometry at 600 nm (Hoefer Scientific Instruments, San Francisco).
  • clone L-132 which contains the marker C272 was used as a probe for the Southern blot analysis of families of SMA showing an abnormal parental contribution. Analysis of the RFLPs and the gene assay then confirmed the presence of inherited or de novo deletions (Figure 5).
  • the present study provides direct genetic and physical evidence of the existence of deletions encompassing the disease locus in 10 affected children belonging to 9 unrelated families.
  • the presence of deletions from the 5ql3 region is strongly supported by the observation of an allelic reduction statistically associated with the severe form of the disease (type I).
  • Deletions are also occasionally encountered in patients of type II or III. Distinct allelic mutations could therefore explain the variable clinical expression of the disease.
  • deletions can occur de novo, a characteristic which could explain the low coefficient of segregation previously reported by several authors in the SMA (26, 27) and so far poorly understood.
  • De novo deletions from the 5ql3 region may also explain the apparent genetic heterogeneity of ADS (18, 28) when, in the same family, a healthy child has the same haplotype as the affected child with flanking markers. This observation is also important for genetic counseling. Indeed, the apparent haplo-identity between a fetus and the child affected by the same family determined using flanking markers can lead to errors in prenatal diagnosis when a de novo deletion occurs.
  • the presence of repeated elements in the 5ql3 region may explain the instability of this region, thus contributing to the appearance of deletions in subjects suffering from SMA by unequal crossing-over events.
  • sequence C272 is apparently contained in a DNA fragment (called L132) capable of revealing the presence, either of inherited deletions, or of de novo deletions by the analysis in "Southern blot" of polymorphisms of lengths. restriction fragments or by analysis of the gene assay (assay of a certain rate of deterioration of a gene due to the weakening of a hybridization signal given by a probe capable of recognizing it.
  • L132 DNA fragment capable of revealing the presence, either of inherited deletions, or of de novo deletions by the analysis in "Southern blot" of polymorphisms of lengths. restriction fragments or by analysis of the gene assay (assay of a certain rate of deterioration of a gene due to the weakening of a hybridization signal given by a probe capable of recognizing it.
  • Figure 1 Genetic map of deletions in patients with SMA.
  • the deletion can involve either the centrometer block C212-C272-C171 or the telomeric block.
  • FIG. 2 Contribution of parental alleles in patients with SMA determined by the markers C212 and C272.
  • the figure shows the study of families either with the marker C272 (families 1, 2, 5 and 7b) or with the marker C212 (families 3, 4, 6 and 7a). Patients have type I (families 3, 5, 6 and 7), type II (families 1 and 2) or type III (family 4).
  • the construction of the haplotypes with the markers flanking the SMA locus (11) enabled us to determine that the healthy children of families 4 and 5 had received the mutated allele from their mother.
  • Figure 4 Proof of the existence of de novo deletions detected by the C161 microsatellite in patients with type I.
  • Figure 5 Analysis of the restriction fragment length polymorphism (RFLP) and of the gene assay at the locus detected by phage L-132 in patients with type I SMA.
  • the genetic analysis was carried out after digestion of DNA either with EcoR I (families 6 and 7) or with Xba I (families 3 and 5).
  • the membranes were hybridized with the clone L-132 5a and the probe JK53 5b.
  • the gene dosage was determined by densitometric examination of the hybridization signal for families 3, 6 and 7.
  • family 6 the intensity of the band is reduced by 50% in the mother and the affected child, which indicates that it is an inherited deletion.
  • families 7 and 3 the intensity of the band of affected children is significantly lower than that of the parents suggesting that the deletion occurred de novo.
  • family 5 the analysis of the RFLP detected by the enzyme Xba I shows that the affected child has not received an allele from its mother.

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Abstract

Procédé pour l'étude de la région chromosomique réputée contenir un gène impliqué, soit par sa présence, soit par son absence, dans l'amyotrophie spinale infantile (SMA) et provenant d'un sujet (patient ou f÷tus) atteint ou susceptible d'être atteint. Ce procédé comprenant la mise en contact d'un échantillon d'ADN chromosomique de ce sujet ou f÷tus avec un brin d'ADN apte à reconnaître des marqueurs polymorphes de la région chromosomique 5q13 dans des conditions amplificatrices autorisant l'élongation de ses chaînes vers et au-delà des séquences répétées de ces marqueurs, puis à discriminer entre les chaînes d'élongation obtenues selon leurs longueurs respectives, pour obtenir des informations représentatives du nombre de ces marqueurs.

Description

PROCEDE ET SONDES POUR LA DETECTION DE MARQUEURS LIES AU LOCUS DES AMYOTROPHIES SPINALES INFANTILES
Les amyotrophies spinales infantiles (SMA) représentent le groupe d'affections héréditaires récessives autosomigues fatales le plus fréquent après la mucoviscidose (incidence : 1/6 000) (1) . Les SMAs sont caractérisées par une dégénérescence des motoneurones de la corne antérieure de la moelle épinière, entrainant une paralysie progressive des membres et du tronc associée à une atrophie musculaire. Les amyotrophies spinales infantiles sont divisées en catégories dites de types I, II et III, selon l'âge de début des symptômes et leur évolutivité (2).
Il est rappelé que les amyotrophies spinales de type I ne s'observent que chez le nouveau-né et chez le nourrisson : c'est le type le plus grave, l'espérance de vie de ces enfants ne dépassant guère quelques années.
Les amyotrophies spinales de type II se manifestent également dès la première année de vie des enfants atteints, mais après qu'ils aient acquis la station assise. Ils ne peuvent alors plus guère se lever et atteignent au mieux le stade de 1'adolescence.
Enfin, l'amyotrophie spinale de type III apparaît chez l'enfant, lorsque celui-ci commence à marcher, les symptômes rappelés plus haut se développant alors plus lentement.
Hormis le diagnostic fondé sur des signes cliniques et paracliniques (électromyographie et biopsie musculaire) d'apparition de la maladie, signes qui ne présentent souvent pas la spécificité requise, il n'existe guère d'autres procédés permettant un diagnostic équivalent, fut-ce seulement dans un nombre limité de cas. Il va sans dire que le clinicien est encore plus désarmé, s'agissant d'anticiper l'apparition future de la maladie chez des patients présumés à risques ou, en médecine néonatale, chez le foetus.
L'anomalie biochimique de cette affection est inconnue. Néanmoins, le gène responsable des trois formes de SMA a été localisé, par analyse de liaison génétique, sur le chromosome 5qll.2-ql3.3 (3-6), de sorte qu'il s'agirait d'affections alléliques.
Récemment, le gène responsable des SMAs a été localisé sur le chromosome 5 dans un intervalle de 2 centimorgans (cM) défini par les loci flanquants D5S629 et D5S637 (7) .
Plusieurs fragments issus de ce chromosome ont été clones dans des chromosomes artificiels de levures ou YACs (abréviation de l'expression anglaise correspondante : "Yeast Artificial Chromosomes") . Plusieurs contigs de YACs de la région 5ql3 ont été décrits, l'expression "contig de la région 5ql3" se rapporte à un ensemble de YACs dont les insérats formés de fragments de la région 5ql3 peuvent être considérés comme se chevauchant les uns les autres, cet ensemble de fragments recouvrant néanmoins la totalité de la région 5ql3. L'un de ces contigs était constitué de 7 YACs chevauchants couvrant approximativement 3,2 Mb (13), l'autre de 10 YACs chevauchants couvrant une région de 2 Mb (14) . Mais aucun des marqueurs connus jusqu'à ce jour ne permet l'établissement d'une corrélation, fut elle seulement partielle mais fiable, entre la détection que l'on peut en faire et les signes cliniques de la maladie.
L'invention repose plus particulièrement sur la découverte que la région 5ql3 comportait plusieurs loci qui, abstraction faite de séquences répétitives en nombre variable, possédaient des séquences de nucléotides sensiblement identiques et formaient autant de marqueurs polymorphes caractéristiques de cette région. Le polymorphisme de ces marqueurs est à la source de la capacité que l'on a de les discriminer, de les corréler parfois à ceux que portent les parents des sujets étudiés, ou au contraire, à identifier le caractère de novo des mutations ou délétions dont ils peuvent être l'objet. C'est également ce polymorphisme qui est à l'origine de la capacité dont l'on dispose désormais dans un certain nombre de cas, soit d'y trouver la confirmation du caractère correct d'un diagnostic clinique de SMA, notamment de type 1, soit parfois de l'exclure, par exemple en médecine néonatale et lorsqu'il existe un antécédent de la maladie chez un frère ou une soeur.
Ces nouveaux marqueurs d'ADN plus particulièrement des marqueurs polymorphes (microsatellites) , ont été identifiés par criblage de fragments, contenus dans le susdit intervalle de deux cM identifié par (7) et contenu dans un YAC de 4 Mb. Ce criblage a été effectué en mettant en oeuvre une banque de YACs du Centre d'Etudes du Polymorphisme Humain (CEPH) , Paris, France, et cela en utilisant les YACs de première génération 755B12 (contenant le marqueur AFM265wf5) et 751E3 (contenant le marqueur AFM 281yh9) , par amplification PCR entre les amorces spécifiques de chaque marqueur selon la méthode tridimensionnelle (3d) précédemment décrite (8) . Une marche chromosomique, selon une méthode préalablement décrite (12), a permis l'identification de nouveaux YACs chevauchant les YACs précédents, et contenant les nouveaux marqueurs d'ADN polymorphes (microsatellites) .
Il a notamment été procédé comme suit. Familles
La carte génétique haute résolution préalablement effectuée avait permis de reconnaître des événements de recombinaison entre le locus SMA et les loci polymorphes flanquants les plus proches (D5S629 , et D5S637) (7). L'analyse génétique des neuf familles comportant des recombinaisons clefs a été réalisée avec les nouveaux marqueurs polymorphes. Il s'agit soit de familles consanguines (n = 5) soit de familles comportant plusieurs sujets atteints (n = 4) . Cette analyse génétique a consisté en la construction des haplotypes les plus vraisemblables, établis en minimisant le nombre d'événements de recombinaison éiotique.
Criblage des banques de YAC
Les banques de YAC du CEPH ont été criblées par amplification PCR entre les amorces spécifiques de chaque marqueur selon la méthode tridimensionnelle (3d) précédemment décrite (8) . Le génotype des YACs contenant les marqueurs microsatellites a été établi par électrophorèse des produits de PCR sur gel de polyacrylamide dénaturant, transféré sur membrane de nylon chargé et hybride avec un oligonucléotide (CA)n ou (CT)n marqué au 32P. La détection des répétitions dinucléotidiques a été effectuée par une méthode décrite (9) . La taille des YACs a été estimée après électrophorèse en champ puisé.
Génération des marqueurs à partir des YACs sélectionnés
L'ADN des YACs a été séparé des chromosomes de levure après électrophorèse en champ puisé sur gel d'agarose, connu sous la marque "SEAPLAQUE GTG 1 %". Après traitement par la b agarase, l'ADN a été précipité dans l'éthanol. Un total de 300 ng de YAC a été digéré par l'enzyme de restriction Sau 3A, puis réparé partiellement, avant d'être clone dans le bactériophage M13 au site Sal 1 réparé partiellement.
Les clones M13 contenant des répétitions (CA) ou (CT) ont été détectés grâce au criblage par les oligonucléotides (CA) 20 ou (CT) 20 marqués au 32P. Les matrices positives ont alors été séquencées (10) . Des amorces oligonucléotidiques flanquant les répétitions (CA) ou (CT) ont été choisies. La localisation chromosomique des marqueurs a été déterminée après amplification PCR des ADNs d'un panel d'hybrides somatiques du chromosome 5. Ce panel comporte la lignée HHW105 contenant comme unique chromosome humain le chromosome 5 entier, la lignée HH 1064 contenant le chromosome 5 délété dans la région 5qll-ql4 et la lignée HHW213 contenant le chromosome 5p (11) . Les loci polymorphes ont été reconnus en testant 5 individus contrôles non apparentés. Les marqueurs non polymorphes ont été utilisés comme STS (abréviation de l'expression anglaise "Séquence Tagged Site" ou site de séquence marqué) .
Marche chromosomique
Cette marche a utilisé, à partir des YACs sélectionnés, les produits d'amplification PCR générés entre l'oligonucléotide A33 choisi dans les séquences moyennement répétées de type ALU. Ces produits ont permis la sélection de nouveaux YACs chevauchant les précédents selon la méthode préalablement décrite (12) . Des nouveaux marqueurs d'ADN polymorphes ont été alors de nouveau isolés à partir de ces YACs.
Cette marche chromosomique a permis l'identification de nouveaux YACs chevauchant les précédents, et de nouveaux marqueurs d'ADN ont alors été isolés. Sur les 28 marqueurs identifiés, 9 ont été exclus de l'étude car ils étaient aussi présents sur le bras court du chromosome 5, démontrant l'existence d'une duplication partielle de la région 5ql3 sur le chromosome 5p (tableau 1) .
Les 19 marqueurs spécifiques de la région 5ql3 ont été retenus pour sélectionner des YACs potentiellement chevauchants. Neuf d'entre eux détectent plus d'un locus dans la région 5ql3 (tableau 1) .. En effet, quatre marqueurs microsatellites polymorphes [C212 (D5F149S1-S2) , C271 (D5F148S1-S2) , C272 (D5F150S1-S2) , C171 (D5F151S1-S2) ] ont révélé la présence de deux produits d'amplification et un marqueur [C161(D5F153S1-S2-S3) ] a révélé 3 produits d'amplification sur l'hybride somatique HHW105. Aucun d'eux n'était localisé en dehors de la région 5ql3. Ces résultats démontrent que les marqueurs C212, C272, C271, C171 détectent 2 loci et le marqueur C161 détecte trois loci dans la région 5ql3. Ces résultats indiquent la présence d'éléments répétés sur le chromosome 5ql3 (tableau 1) .
Du fait de l'organisation géno ique complexe de cette région, ces loci polymorphes ont été utilisés pour sélectionner les YACs chevauchants et les génotyper par rapport à l'ADN du donneur, afin de s'assurer que toute la région était couverte. La confirmation de cette organisation génomique a été apportée par l'identification d'un YAC (903D1) dont le génotype est identique à ceux des YACs 595C11 et 759A3. Le contig de YAC contient un minimum de 5 YACs couvrant approximativement 4 Mégabases depuis le marqueur AFM265wf5 jusqu'au marqueur AFM281yh9 (figure
1).
Cartographie génétique haute résolution au locus
SMA
Basé sur l'analyse conventionnelle des haplotypes et sur la méthode d'homozygotie par la descendance, 10 méioses recombinantes clefs ont été sélectionnées. L'analyse génétique de ces méioses recombinantes a été réalisée avec les nouveaux marqueurs polymorphes isolés à partir du contig de YAC (figure 1) . Les marqueurs les plus polymorphes C212 et C272 ne révèlent plus d'événement de recombinaison avec le locus SMA. Ces résultats démontrent que ces marqueurs détectent les loci les plus proches du gène des SMAs.
L'invention concerne plus particulièrement des moyens (acides nucléiques et procédés) permettant la détection et, s'il y a lieu, la discrimination de plusieurs de ces marqueurs polymorphes.
En particulier, elle concerne des brins d'ADN dont chacun est caractérisé en ce que sa propre séquence de nucléotides : est contenue dans la séquence nucléique de l'un des brins d'un marqueur polymorphe d'une région chromosomique humaine réputée comporter un locus SMA, ce marqueur contenant des séquences de répétition, notamment dinucléotidiques, en nombre variable ; contient elle-même une séquence caractéristique présente dans ce marqueur polymorphe mais extérieure à la région de celui-ci qui contient lesdites séquences de répétition, cette séquence caractéristique présentant une taille suffisante, notamment d'au moins 12 et, de préférence, d'au moins 15 nucléotides, pour qu'un fragment de même séquence soit utilisable en tant qu'amorce pour la détection par PCR de marqueurs correspondants dans une préparation d'ADN d'origine humaine.
Parmi les brins préférés de l'invention, on mentionnera ceux dont la propre séquence -ou la séquence qui lui est complémentaire- est constituée par tout ou partie de l'une des régions extérieures à la région contenant les séquences de répétition, respectivement contenues dans l'une des séquences d'ADNs ci-après identifiées sous les désignations C212, C272, AFM157, C161 et C171. C212 (D5F149S1, S2), ci-après "C212"
ACCTGANCCCAGANGGTCAAGGCTGCAGTGAGACGAGATTGCNCCACTGCCCTCC ACCCTGGGTGATAAGAGTGGGACCCTGTNTCAAAACATACACACACACACACACA CACACACACACACACACACACACACTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTC TCTCTCTCTCTCTCAAAAACACTTGGTCTGTTATTTTTNCGAAATTGTCAGTCAT AGTTATCTGTTAGACCAAAGCTGNGTAAGNACATTTATTACATTGCCTCCTACAA CTTCATCAGCTAATGTATTTGCTATATAGCAATTACATATNGGNATATATTATCT TNAGGGGATGGCCANGTNATAAAACTGTCACTGAGGAAAGGA
C272 (D5F150S1, S2), ci-après "C272"
CCTCCCACCTNAGCCTCCCCAGTAGCTAGGACTATAGGCGTGCNCCACCAAGCTC AGCTATTTTTNNTATTTAGTAGAGACGGGGTTTCGGCANGCTTAGGCCTCGTNTC GAACTCCAGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTG TGTGTAGATATTTATTCCCCCTCCCCCTTGGAAAAGTAAGTAAGCTCCTACTAGG AATTTAAAACCTGCTTGATCTATATAAAGACAAACAAGGAAAGACAAACATGGGG GCAGGAAGGAAGGCAGATC
AFM157xdlO
TCGAGGTAGATTTGTATTATATCCCATGTACACACACACACACACACACACACAC ACACACACACACAGACTTAATCTGTTTACAGAAATAAAAGGAATAAAATACCGTT TCTACTATACACCAAAACTAGCCATCTTGAC
C161 (D5F153S1, S2, S3), ci-après "C161"
CCCTGAGAAGGCTTCCTCCTGAGTATGCATAAACATTCACAGCTTGCATGCGTGT GTGTGTGTGTGTGTGTGTGTATGTTTGCTTGCACTGTAAAAACAATTGCAACATC AACAGAAATAAAAATTAAAGGAATAATTCTCCTCCGACTCTGCCGTTCCATCCAG TGAAACTCTTCATTCTGGGGTAAAGTTCCTTCAGTTCTTTCATAGATAGGTATAT ACTTCATAAGTCAAACAATCAGGCTGGGTGCAGTAGCTCATGCCTGTAATCCCAG CCCTTTGGGAGGCCGAGCTGGGCAGATCGA
C171 (D5F151S1, S2), ci-après "C171"
TCCACCCGCCTTGGCCTCCCAAAGCNCTGGGATTACAGGCGTGACTGCCGCACCC AGCTGTAAACTGGNTTNNTAATGGTAGATTTTNAGGTATTAACAATAGATAAAAA GATACTTTTNGGCATACTGTGTATTGGGATGGGGTTAGAACAGGTGTNCTACCCA AGACATTTACTTAAAATCGCCCTCGAAATGCTATGTGAGCTGTGTGTGTGTGTGT GTGTGTGTGTGTATTAAGGAAAAGCATGAAAGTATTTATGCTTGATTTTTTTTTT TNACTCATAGCTTCATAGTGGANCAGATACATAGTCTAAATCAAAATGTTTAAAC TTTTTATGTCACTTGCTGTC
Ces brins d'ADNs, surtout s'ils sont assez longs, peuvent être utilisés comme sondes directes, par exemple pour la présence ou non d'une délétion dans le marqueur correspondant. L'invention concerne alors également dans ce cas des ADNs recombinants (simple brins ou double brins) contenant ce brin recombinant à un acide nucléique non humain et non susceptible d'hybrider avec un fragment d'ADN humain.
Cependant, de préférence, les brins préférés sont ceux qui peuvent être utilisés dans un procédé d'amplification de chaînes, notamment de type PCR (abréviation de l'expression anglaise "Polymerase Chain Reaction" ou réaction de chaînes en présence d'une polymerase) .
En particulier, l'invention concerne les paires d'amorces comportant de préférence au moins 12, avantageusement au moins 15 nucléotides dont les séquences sont respectivement contenues dans les paires de séquences, notamment issues de :
- C212
(1) ACCTGANCCCAGANGGTCAAGGCTGCAGTGAGACGAGATTGCNCCACTGCC CTCCACCCTGGGTGATAAGAGTGGGACCCTGTNTCAAAACATA (2) séquence complémentaire de :
CAAAAACACTTGGTCTGTTATTTTTNCGAAATTGTCAGTCATAGTTATCTG TTAGACCAAAGCTGNGTAAGNACATTTATTACATTGCCTCCTACAACTTCA TCAGCTAATGTATTTGCTATATAGCAATTACATATNGGNATATATTATCTT NAGGGGATGGCCANGTNATAAAACTGTCACTGAGGAAAGGA ou vice versa
- C272
(1) CCTCCCACCTNAGCCTCCCCAGTAGCTAGGACTATAGGCGTGCNCCACCAA GCTCAGCTATTTTTNNTATTTAGTAGAGACGGGGTTTCGGCANGCTTAGGC CTCGTNTCGAACTCCA
(2) séquence complémentaire de : AGATATTTATTCCCCCTCCCCCTTGGAAAAGTAAGTAAGCTCCTACTAGGA ATTTAAAACCTGCTTGATCTATATAAAGACAAACAAGGAAAGACAAACATG GGGGCAGGAAGGAAGGCAGATC ou vice versa
- AFM157xdlO
(1) TCGAGGTAGATTTGTATTATATCCCATGTA
(2) séquence complémentaire de :
CTTAATCTGTTTACAGAAATAAAAGGAATAAAATACCGTTTCTACTATACA CCAAAACTAGCCATCTTGAC ou vice versa
- C161
(1) CCCTGAGAAGGCTTCCTCCTGAGTATGCATAAACATTCACAGCTTGCATGC
(2) séquence complémentaire de :
ATGTTTGCTTGCACTGTAAAAACAATTGCAACATCAACAGAAATAAAAATT AAAGGAATAATTCTCCTCCGACTCTGCCGTTCCATCCAGTGAAACTCTTCA TTCTGGGGTAAAGTTCCTTCAGTTCTTTCATAGATAGGTATATACTTCATA AGTCAAACAATCAGGCTGGGTGCAGTAGCTCATGCCTGTAATCCCAGCCCT TTGGGAGGCCGAGCTGGGCAGATCGA ou vice versa - C171
(1) TCCACCCGCCTTGGCCTCCCAAAGCNCTGGGATTACAGGCGTGACTGCCGC ACCCAGCTGTAAACTGGNTTNNTAATGGTAGATTTTNAGGTATTAACAATA GATAAAAAGATACTTTTNGGCATACTGTGTATTGGGATGGGGTTAGAACAG GTGTNCTACCCAAGACATTTACTTAAAATCGCCCTCGAAATGCTATGTGAG CT
(2) séquence complémentaire de : ATTAAGGAAAAGCATGAAAGTATTTATGCTTGATTTTTTTTTTTNACTCAT AGCTTCATAGTGGANCAGATACATAGTCTAAATCAAAATGTTTAAACTTTT TATGTCACTTGCTGTC ou vice versa étant naturellement entendu que 1 'expression "vice versa" signifie que chacune des amorces issues des paires susdites de séquences (1) et (2) pourrait être remplacée par une amorce complémentaire.
A titre d'exemples de paires d'amorces préférées, correspondant aux familles sus-indiquées, on mentionne les oligo-nucléotides suivants :
C212A : CCTCCACCCTGGGTGATAAG C212B : GCTGATGAAGTTGTAGGAGGC
C272A : TAGAGACGGGGTTTCGGCAT C272B : GATCTGCCTTCCTTCCTGC
C161A : GGCTTCCTCCTGAGTATGCA C161B : GTTTCACTGGATGGAACGGC
C171A : ATCGCCCTCGAAATGCTATG C171B : CTGTTCCACTATGAAGCTATG
L'invention concerne naturellement aussi des brins d'ADN qui peuvent être considérés comme des répliques entières des marqueurs correspondants, ces brins (qui comportent alors également les séquences répétées correspondantes) , pouvant aussi être utilisées comme sondes spécifiques des marqueurs correspondants, et ce par exemple à des fins de vérification de l'existence ou non de ce marqueur spécifique sur l'un des allèles d'un chromosome étudié.
L'invention concerne aussi un procédé pour l'étude de la région chromosomique réputée contenir au moins l'un des gènes impliqués, soit par sa présence, soit par son absence, dans la SMA et provenant d'un sujet (patient ou foetus) atteint ou susceptible d'être atteint, ce procédé comprenant la mise en contact d'un échantillon d'ADN chromosomique de ce sujet ou foetus avec au moins l'un des brins d'ADN tel que définis ci-dessus, notamment dans des conditions amplificatrices autorisant, dès lors qu'il s'hybriderait à des marqueurs correspondants de cet ADN chromosomique, l'élongation de ses chaînes vers et au-delà des séquences répétées de ces marqueurs, puis à se placer dans des conditions permettant de discriminer entre les chaînes d'élongation obtenues selon leurs longueurs respectives, pour obtenir des informations représentatives du nombre de ces marqueurs.
Il sera de préférence procédé par PCR, l'échantillon d'ADN chromosomique étant alors mis en contact avec une paire d'amorces telles que ci-dessus définies, susceptibles de s'hybrider aux régions des marqueurs, extérieures à celles qui contiennent leurs séquences répétées respectives, la discrimination entre les chaînes d'élongation produites étant alors obtenues, notamment par leur migration dans un gel électrophorétique approprié.
Il résulte, notamment des expériences dont les résultats sont relatés plus loin, que dans un pourcentage appréciable de cas, l'existence ou la potentialité d'une SMA, notamment de type l, se manifeste par un nombre de marqueurs polymorphes détectés inférieur à celui observé dans des ADNs chromosomiques provenant de sujets sains, cette réduction témoignant de ce que chez les sujets atteints, des parties essentielles de la région 5ql3 ont en fait été délétées.
Dans des formes d'exécution préférées de l'invention, plus particulièrement appliquées à des sujets à risques, notamment en raison de l'existence présente ou passée d'autres cas de SMA dans la même famille, le procédé selon l'invention sera également et à titre comparatif mis en oeuvre sur des préparations chromosomiques provenant des parents ou autres personnes apparentées.
Les essais dont les résultats sont exposés ci- après, tendent à montrer que ceux des sujets ayant reçu de leurs deux parents un allèle contenant un marqueur ayant donné matière à élongation de chaîne, sont moins menacés par une SMA, notamment de type 1, que ceux qui n•en ont reçu qu'un ou dont 1*un des allèles n'est par porteur d'un tel marqueur.
Du fait du polymorphisme des marqueurs mis en oeuvre, il est en effet possible de discerner, notamment grâce aux migrations différentiées des produits d'amplification, tenant à leurs tailles différentes, ceux des allèles porteurs d'un marqueur hérité, le cas échéant, de l'un des parents et ceux hérités, le cas échéant, de l'autre, ou encore, comme l'invention a permis de le constater, l'apparition de délétions de novo, avec pour conséquence le risque d'apparition de la maladie chez des sujets dont les parents ne témoignaient apparemment d'aucune prédisposition pour elles.
A l'inverse, la détection chez un sujet donné, notamment chez le foetus, de la présence d'au moins un marqueur polymorphe sur chacun des allèles du chromosome correspondant, notamment lorsque l'étude comparative permettra de conclure que le foetus a hérité ces marqueurs de ses deux parents respectifs et qu'il n'est pas prédisposé à la maladie. Il pourrait en être de même pour des enfants en bas âge, chaque fois que les signes cliniques qu'ils présentent conduisent le clinicien à s'interroger sur la possibilité qu'ils auraient à développer la maladie.
On comprend alors l'importance du résultat que l'invention permet d'obtenir, au moins dans un certain nombre de cas, ne serait-ce que pour s'assurer, en médecine néonatale, de l'absence de potentialité génétique de la maladie chez le foetus ou pour confirmer un diagnostic négatif chez l'enfant en bas âge, alors que certains signes cliniques semblaient présager du contraire.
L'invention et les résultats qu'elle permet d'obtenir sont encore illustrés de façon plus détaillée -et non limitative- dans ce qui suit. Il sera également fait référence aux dessins, et au tableau, dont l'interprétation peut être faite en se reportant aux légendes qui apparaissent à la fin de la présente description.
FAMILLES ET METHODES
FAMILLES
Deux-cent-une familles de SMA ont été étudiées. Celles-ci ont été sélectionnées selon les critères diagnostiques retenus par le Consortium International sur les SMA (15) . Les sujets ayant une SMA confirmée ont été répartis en trois sous-groupes (type I, II ou III) . Quatre-vingt-dix patients appartenaient au type I, 81 au type II et 30 au type III. Deux grandes familles de référence du CEPH, 22 familles saines composées des deux parents et d'un enfant, et 60 individus sains non-apparentés ont été utilisés comme contrôles. Pour les besoins de l'analyse statistique. il n'a été inclus dans l'étude qu'un seul enfant atteint par famille.
METHODES
Buvardage de Southern (Southern blot) :
L'ADN des différents individus a été extrait à partir de culots de leucocytes ou de lignées lymp*hoblastoïdes. Il a ensuite été digéré par différents enzymes de restriction puis mis à migrer sur gel d'agarose 0.8%, avant d'être transféré sur membrane de nylon chargé.
Détection des polymorphismes de répétition dinucléotidigue :
A partir des mêmes ADNs, une amplification PCR a été réalisée entre les amorces spécifiques des marqueurs C212 (D5F149S1 et S2) , C272 (D5F150S1 et S2) et C161 (D5F153S1, S2 et S3). Les conditions d'amplification sont les suivantes: dénaturation à 94°C pendant 1 min., hybridation à 55°C pendant 1 min. et extension à 72°C pendant 1 min. durant 30 cycles. Les produits de PCR sont ensuite mis à migrer sur gel de polyacrylamide dénaturant, transférés sur une membrane de nylon chargée positivement qui est hybridée avec une sonde reconnaissant les répétitions de dinucléotides CA (20) .
Construction d'une banque de phages à partir du YAC 595C11
Après digestion partielle par l'enzyme Sau 3A, l'ADN du clone 595C11 a été déposé et mis à migrer sur gel d'agarose (connu sous la désignation "SEAPLAQUE GTG 0.5%"). Après migration, les fragments, d'une taille de 12 à 23 Kb, sont découpés, digérés par la b-agarase puis précipités dans l'éthanol. Après réparation partielle du site Sau 3A, l'ADN est sous- cloné au site Xho 1 réparé partiellement du bactériophage FIX II (Stratagene) . Les clones lambda contenant les marqueurs C212 (L-51) , C272 (L-51, L-132) et C171 (L-5, L-13) ont été utilisés comme sondes pour rechercher des polymorphismes de restriction (RFLP) avec les enzymes de restriction EcoR I, Bgl II, Hind III et Xba I. La sonde JK53 (D5S112) a été utilisé comme contrôle interne pour les analyses de dosage génique. Les autoradiographies ont été examinées par densitométrie à 600 nm (Hoefer Scientific Instruments, San Francisco) .
RESULTATS
Pour tester l'hypothèse selon laquelle la présence d'éléments répétés pouvait favoriser la survenue de réarrangements chez les patients, la ségrégation des allèles a été analysée aux loci détectés par les marqueurs C212 et C272 chez 201 familles de SMA non consanguines. Une non-contribution parentale à ces loci chez huit enfants atteints appartenant à sept familles non apparentées. Quatre patients étaient atteints de la forme de type I, deux de type II et deux de type III. L'absence de contribution parentale était d'origine maternelle dans cinq des cas (familles 3, 4, 5, 6) et d'origine paternelle dans les trois autres (familles 1, 2, 7; figure 1) . Un des patients de type I présentait un réarrangement survenu d_e novo n'emportant qu'un seul des deux loci reconnus par les marqueurs C212 et C272 (figure 1, famille 7) . Des résultats identiques ont été obtenus en utilisant des paires d'oligonucléotides différentes pour chacun des marqueurs. La construction des haplotypes à 1*aide des marqueurs flanquant le locus SMA (21) a permis d'exclure l'hypothèse d'une fausse paternité ou d'une erreur d'échantillonage. Ces résultats indiquent la présence de réarrangements emportant le locus morbide chez ces huit patients. De plus, parce que le nombre de patients présentant un réarrangement avait pu être sous-estimé par un défaut d'informativité des méioses, le nombre de produits d'amplification PCR distincts révélés par les marqueurs C212 et C272 a été analysé chez les familles de SMA des trois types ainsi que chez 60 contrôles composés d'individus non-apparentés (figure 2). Chez 16 des 90 patients de type I (18%), un seul produit d'amplification PCR avec le marqueur C272 a été détecté, résultat statistiquement très diffèrent de celui observé chez les patients de type II (1/81 soit 1%), de type III (1/30 soit 3%) et les contrôles (0/59 soit 0%, p<0.001). De même, la proportion de patients de type I présentant deux produits d'amplification PCR (55/90 soit 61%) est également significativement différente de celle des parents (69/180 soit 38%) et des contrôles (12/59 soit 20%, p<0.001). Des résultats similaires ont été obtenus avec le marqueur C212 (tableau) . La possibilité que la réduction du nombre de fragments amplifiés chez les types I pouvait être due à une consanguinité éloignée a été exclue par comparaison du nombre de fragments partagés par les parents des sujets atteints de SMA et celui des parents de 20 familles non- apparentées contrôles. Les résultats n'ont alors pas montré de différence statistiquement significative (données non présentées) .
On a ensuite analysé avec le marqueur C161 les 20 familles de type I dont l'enfant atteint ne présentait qu'un produit d'amplification PCR avec les marqueurs C212 ou C272. Dans deux des vingt familles, nous avons observé un réarrangement survenant de novo et emportant 2 des 3 loci détectés par le marqueur C161 (figure 3, familles 8 et 9). Ces résultats soutiennent bien l'hypothèse selon laquelle la réduction allelique aux loci détectés par les marqueurs C212 et C272 chez les SMA de type I est due à une perte d'allèle à ces loci. Pour caractériser l'extension de la région 5ql3 délétée chez ces patients, on a analysé ces familles avec les autres marqueurs polymorphes générés à partir du nouveau contig de YACs. L'haplotypage complet de ces familles nous a permis de cartographier les différentes délétions et de délimiter les bornes du plus petit remaniement entre les marqueurs C161 et C212-C272 (figure 4) . Ces résultats suggèrent que le locus SMA se situe dans une région de 1.2 Mb contenue dans le YAC 903D1 (20, 23) . Cependant, à cause de la parfaite ho ologie de séquence des régions flanquant les répétitions CA des marqueurs C212 et C272, il n'a pas été possible de déterminer lequel des deux loci manquait chez l'unique patient présentant la perte d'un seul locus (famille 7, figure 1 et 4). Pour fournir la preuve physique de la présence de délétions dans la région 5ql3, le clone L-132, qui contient le marqueur C272, a été utilisé comme sonde pour l'analyse en Southern blot des familles de SMA montrant une contribution parentale anormale. L'analyse des RFLP et du dosage génique confirma alors la présence de délétions héritées ou de novo (figure 5).
DISCUSSION ET CONCLUSION
La présente étude fournit la preuve génétique et physique directe de l'existence de délétions englobant le locus de la maladie chez 10 enfants atteints appartenant à 9 familles non-apparentées. De plus, la présence de délétions de la région 5ql3 est fortement soutenue par l'observation d'une réduction allelique statistiquement associée à la forme sévère de la maladie (type I) . Les délétions sont aussi rencontrées occasionnellement chez des patients de type II ou III. Des mutations alleliques distinctes pourraient donc expliquer l'expression clinique variable de la maladie. Ces résultats confirment aussi que le ou les gènes responsables des trois types de SMA se situent bien dans la même région. Les dystrophies musculaires de Duchenne ou de Becker peuvent également résulter de délétions mais, dans ce cas, il existe une différence mécanistique entre les types de délétions (25) alors qu'une telle analyse n'est pas encore rendue possible dans les SMA. Cette étude démontre également que les délétions peuvent se produire de novo, une caractéristique qui pourrait expliquer le faible coefficient de ségrégation précédemment rapporté par plusieurs auteurs dans les SMA (26, 27) et jusqu'ici assez mal compris. Les délétions de novo de la région 5ql3 peuvent également expliquer l'apparente hétérogénéité génétique des SMA (18, 28) quand, dans une même famille, un enfant sain présente le même haplotype que l'enfant atteint avec les marqueurs flanquants. Cette observation est également importante pour le conseil génétique. En effet, l'apparente haplo-identité entre un foetus et l'enfant atteint d'une même famille déterminée à 1'aide des marqueurs flanquants peut conduire à des erreurs de diagnostic prénatal lorsqu'une délétion de novo survient. La présence d'éléments répétés dans la région 5ql3 peut expliquer l'instabilité de cette région contribuant ainsi à l'apparition de délétions chez les sujets atteints de SMA par des événements de crossing-over inégaux.
Il est a remarquer que la séquence C272 est apparemment contenue dans un fragment d'ADN (dénommé L132) susceptible de révéler la présence, soit de délétions héritées, soit de délétions de novo par l'analyse en "Southern blot" des polymorphismes de longueurs des fragments de restriction ou par l'analyse du dosage génique (dosage d'un certain taux de détérioration d'un gène du fait de l'affaiblissement d'un signal d'hybridation donnée par une sonde susceptible de le reconnaître.
Tableau
Marqueurs τype(n) produits P C
Statut Nombre d' amplifie ations distinctes d e
1 2 3 4
C212 I 13% 13%
Atteints (90) 66.5% 6.5%
I I 2.5% 35.5% 59% 2.5%
(76)"
I I I 3% 23% 66.5% 6.5%
(30) Parents I 1.5% 42% 45.5% 10.5%
(180)
I I .5% 30% 53% 16%
(150)
I I I 0 23.5% 52.5% 23.5%
(59) Contrôles (60) 0 18% 60% 21.5%
C272 I 18.5% 15.5%
Atteints (90) 61% 4.5%
I I 1% 34% 63% 1%
(81)
I I I 3% 33% 46.5% 16.5%
(30) Parents I 1.5% 38.5% 47.5% 11.5%
(180)
I I .5% 33% 53% 13%
(162) I I I 1.5% 22% 44% 32%
(59)
Contrôles (59) 0 20% 54% 25%
Tableau. Nombre de produits d'amplification PCR distincts observé avec les marqueurs C212 et C272 chez les sujets atteints de SMA de type I, II et III, leurs parents et des contrôles. (n) indique le nombre d'individus testés. LEGENDES DES FIGURES
Figure 1 : Carte génétique des délétions chez les patients atteints de SMA.
A) . Carte génomique de la région 5ql3. Les différents marqueurs sont indiqués au-dessus de leur position génétique. Les parenthèses encadrant les blocs C212-
C272-C171 indiquent que l'ordre des marqueurs à l'intérieur du bloc est inconnu.
B) . Carte génétique des délétions. Les tirets correspondent aux marqueurs cités ci-dessus.
Dans la famille 7, la délétion peut entraîner soit le bloc centromèrique C212-C272-C171 soit le bloc télomèrique.
Figure 2 : Contribution des allèles parentaux chez les patients atteints de SMA déterminé par les marqueurs C212 et C272. La figure montre l'étude des familles soit avec le marqueur C272 (familles 1, 2, 5 et 7b) soit avec le marqueur C212 (familles 3, 4, 6 et 7a) . Les patients sont atteints de la forme de type I (familles 3, 5, 6 et 7) , de type II (familles 1 et 2) ou de type III (famille 4) . La construction des haplotypes avec les marqueurs flanquant le locus SMA (11) nous a permis de déterminer que les enfants sains des familles 4 et 5 avaient reçu l'allèle muté de leur mère. Dans la famille 7, on note la contribution incomplète du père à son enfant atteint avec les marqueurs C212 (7a) et C272 (7b) comparé au foetus haplo-identique comme établi avec les marqueurs flanquants (données non présentées) . F: father (père) , M: other (mère) , A: affected (atteint) , NA: nonaffected (non-atteint) , Fe: fétus (foetus) . Les points indiquent les fragments alleliques. Figure 3 : Nombre de produits d'amplification PCR distincts révélés par le marqueur C272 chez les patients, leurs parents et des contrôles. Un total de 90 patients de type I, 81 patients de type II, 30 patients de type III, leurs parents et 59 contrôles ont été étudiés. En abscisse figure le nombre de produits d'amplication PCR distincts, en ordonnée le nombre d'individus testés (%) . : atteints, : parents, : contrôles.
Figure 4 : Preuve de l'existence de délétions survenues de novo détectées par le microsatellite C161 chez des patients atteints de type I.
4a. La ségrégation des allèles détectés par le marqueur C272 ne prouve ni n'exclue l'existence de délétions dans les familles 8, 9 et 10. On note que les patients ne présentent qu'un seul produit d'amplification PCR.
4b. La ségrégation des allèles détectés par le marqueur C161 révèle l'existence de délétions survenues de novo dans les familles 8 et 9 car l'enfant atteint n'a reçu qu'un seul locus de ses parents (famille 8) ou de son père (famille 9) . Dans la famille 10, la détection de six produits d'amplification PCR distincts exclue toute possibilité d'une délétion emportant un des trois loci détectés par C161.
F: father (père) , M: mother (mère) , A: affected (atteint) . Les points indiquent les fragments alleliques.
Figure 5: Analyse du polymorphisme de longueur des fragments de restriction (RFLP) et du dosage génique au locus détecté par le phage L-132 chez les patients atteints d'une SMA de type I. L'analyse génétique a été réalisée après digestion de l'ADN soit avec EcoR I (familles 6 et 7) soit avec Xba I (familles 3 et 5). Les membranes ont été hybridées avec le clone L-132 5a et la sonde JK53 5b. Le dosage génique a été déterminé par examen densitométrique du signal d'hybridation pour les familles 3, 6 et 7. Dans la famille 6, 1'intensité de la bande est réduite de 50% chez la mère et l'enfant atteint ce qui indique qu'il s'agit d'une délétion héritée. Dans les familles 7 et 3, l'intensité de la bande des enfants atteints est nettement plus faible que celle des parents suggérant que la délétion soit survenue de novo. Dans la famille 5, l'analyse du RFLP détecté par l'enzyme Xba I montre que l'enfant atteint n'a pas reçu d'allèle de sa mère.
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Claims

R E V E N D I C A T I O N S
1. Brin d'ADN caractérisé en ce que sa propre séquence de nucléotides : est contenue dans la séquence nucléique de l'un des brins d'un marqueur polymorphe d'une région chromosomique humaine, réputé comporter un locus SMA et contenant des séquences de répétitions, notamment dinucléotidiques, en nombre variable ; contient elle-même une séquence caractéristique présente dans ce marqueur polymorphe mais extérieure à la région de celui-ci qui contient lesdites séquences de répétition, cette séquence caractéristique présentant une taille suffisante, notamment d'au moins 12 et, de préférence, d'au moins 20 nucléotides, pour qu'un fragment de même séquence soit utilisable en tant qu'amorce pour la détection par PCR de marqueurs correspondants dans une préparation d'ADN d'origine humaine.
2. Brin d'ADN selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'une partie au moins de sa propre séquence, ou de la séquence qui lui est complémentaire, est contenue dans une région extérieure à la région contenant les répétitions de dinucléotides de cette dernière, au sein de la séquence C212 qui suit : ACCTGANCCCAGANGGTCAAGGCTGCAGTGAGACGAGATTGCNCCACTGCCCTCC ACCCTGGGTGATAAGAGTGGGACCCTGTNTCAAAACATACACACACACACACACA CACACACACACACACACACACACACTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTC TCTCTCTCTCTCTCAAAAACACTTGGTCTGTTATTTTTNCGAAATTGTCAGTCAT AGTTATCTGTTAGACCAAAGCTGNGTAAGNACATTTATTACATTGCCTCCTACAA CTTCATCAGCTAATGTATTTGCTATATAGCAATTACATATNGGNATATATTATCT TNAGGGGATGGCCANGTNATAAAACTGTCACTGAGGAAAGGA
3. Brin d'ADN selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'une partie au moins de sa propre séquence, ou de la séquence qui lui est complémentaire, est contenue dans une région extérieure à la région contenant les répétitions de dinucléotides de cette dernière, au sein de la séquence C272 qui suit :
CCTCCCACCTNAGCCTCCCCAGTAGCTAGGACTATAGGCGTGCNCCACCAAGCTC
AGCTATTTTTNNTATTTAGTAGAGACGGGGTTTCGGCANGCTTAGGCCTCGTNTC
GAACTCCAGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTG
TGTGTAGATATTTATTCCCCCTCCCCCTTGGAAAAGTAAGTAAGCTCCTACTAGG
AATTTAAAACCTGCTTGATCTATATAAAGACAAACAAGGAAAGACAAACATGGGG
GCAGGAAGGAAGGCAGATC
4. Brin d'ADN selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'une partie au moins de sa propre séquence, ou de la séquence qui lui est complémentaire, est contenue dans une région extérieure à la région contenant les répétitions de dinucléotides de cette dernière, au sein de la séquence AFM157xdlO qui suit :
TCGAGGTAGATTTGTATTATATCCCATGTACACACACACACACACACACACACAC ACACACACACACAGACTTAATCTGTTTACAGAAATAAAAGGAATAAAATACCGTT TCTACTATACACCAAAACTAGCCATCTTGAC
5. Brin d'ADN selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'une partie au moins de sa propre séquence, ou de la séquence qui lui est complémentaire, est contenue dans une région extérieure à la région contenant les répétitions de dinucléotides de cette dernière, au sein de la séquence C161 qui suit :
CCCTGAGAAGGCTTCCTCCTGAGTATGCATAAACATTCACAGCTTGCATGCGTGT GTGTGTGTGTGTGTGTGTGTATGTTTGCTTGCACTGTAAAAACAATTGCAACATC AACAGAAATAAAAATTAAAGGAATAATTCTCCTCCGACTCTGCCGTTCCATCCAG TGAAACTCTTCATTCTGGGGTAAAGTTCCTTCAGTTCTTTCATAGATAGGTATAT ACTTCATAAGTCAAACAATCAGGCTGGGTGCAGTAGCTCATGCCTGTAATCCCAG CCCTTTGGGAGGCCGAGCTGGGCAGATCGA
6. Brin d'ADN selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'une partie au moins de sa propre séquence, ou de la séquence qui lui est complémentaire, est contenue dans une région extérieure à la région contenant les répétitions de dinucléotides de cette dernière, au sein de la séquence C171 qui suit :
TCCACCCGCCTTGGCCTCCCAAAGCNCTGGGATTACAGGCGTGACTGCCGCACCC
AGCTGTAAACTGGNTTNNTAATGGTAGATTTTNAGGTATTAACAATAGATAAAAA
GATACTTTTNGGCATACTGTGTATTGGGATGGGGTTAGAACAGGTGTNCTACCCA
AGACATTTACTTAAAATCGCCCTCGAAATGCTATGTGAGCTGTGTGTGTGTGTGT
GTGTGTGTGTGTATTAAGGAAAAGCATGAAAGTATTTATGCTTGATTTTTTTTTT
TNACTCATAGCTTCATAGTGGANCAGATACATAGTCTAAATCAAAATGTTTAAAC
TTTTTATGTCACTTGCTGTC
7. Paire d'amorces, notamment pour PCR, caractérisée en ce que leurs propres séquences sont contenues dans les deux séquences qui suivent :
- C212
(1) ACCTGANCCCAGANGGTCAAGGCTGCAGTGAGACGAGATTGCNCCACTGCC CTCCACCCTGGGTGATAAGAGTGGGACCCTGTNTCAAAACATA
(2) séquence complémentaire de : CAAAAACACTTGGTCTGTTATTTTTNCGAAATTGTCAGTCATAGTTATCTG TTAGACCAAAGCTGNGTAAGNACATTTATTACATTGCCTCCTACAACTTCA TCAGCTAATGTATTTGCTATATAGCAATTACATATNGGNATATATTATCTT NAGGGGATGGCCANGTNATAAAACTGTCACTGAGGAAAGGA ou vice versa
8. Paire d'amorces selon la revendication 7, caractérisée en ce que les deux amorces présentent respectivement les séquences de nucléotides qui suivent :
C212A : CCTCCACCCTGGGTGATAAG C212B : GCTGATGAAGTTGTAGGAGGC
9. Paire d'amorces, notamment pour PCR, caractérisée en ce que leurs propres séquences sont contenues dans les deux séquences qui suivent :
- C272
(1) CCTCCCACCTNAGCCTCCCCAGTAGCTAGGACTATAGGCGTGCNCCACCAA GCTCAGCTATTTTTNNTATTTAGTAGAGACGGGGTTTCGGCANGCTTAGGC CTCGTNTCGAACTCCA (2) séquence complémentaire de :
AGATATTTATTCCCCCTCCCCCTTGGAAAAGTAAGTAAGCTCCTACTAGGA ATTTAAAACCTGCTTGATCTATATAAAGACAAACAAGGAAAGACAAACATG GGGGCAGGAAGGAAGGCAGATC ou vice versa
10. Paire d'amorces selon la revendication 9, caractérisée en ce que les deux amorces présentent respectivement les séquences de nucléotides qui suivent :
C272A : TAGAGACGGGGTTTCGGCAT C272B : GATCTGCCTTCCTTCCTGC
11. Paire d'amorces, notamment pour PCR, caractérisée en ce que leurs propres séquences sont contenues dans les deux séquences qui suivent :
- C161
(1) CCCTGAGAAGGCTTCCTCCTGAGTATGCATAAACATTCACAGCTTGCATGC
(2) séquence complémentaire de :
ATGTTTGCTTGCACTGTAAAAACAATTGCAACATCAACAGAAATAAAAATT AAAGGAATAATTCTCCTCCGACTCTGCCGTTCCATCCAGTGAAACTCTTCA TTCTGGGGTAAAGTTCCTTCAGTTCTTTCATAGATAGGTATATACTTCATA AGTCAAACAATCAGGCTGGGTGCAGTAGCTCATGCCTGTAATCCCAGCCCT TTGGGAGGCCGAGCTGGGCAGATCGA ou vice versa
12. Paire d'amorces selon la revendication 11, caractérisée en ce que les deux amorces présentent respectivement les séquences de nucléotides qui suivent :
C161A : GGCTTCCTCCTGAGTATGCA C161B : GTTTCACTGGATGGAACGGC
13. Paire d'amorces, notamment pour PCR :
- C171
(1) TCCACCCGCCTTGGCCTCCCAAAGCNCTGGGATTACAGGCGTGACTGCCGC ACCCAGCTGTAAACTGGNTTNNTAATGGTAGATTTTNAGGTATTAACAATA GATAAAAAGATACTTTTNGGCATACTGTGTATTGGGATGGGGTTAGAACAG GTGTNCTACCCAAGACATTTACTTAAAATCGCCCTCGAAATGCTATGTGAG CT (2) séquence complémentaire de :
ATTAAGGAAAAGCATGAAAGTATTTATGCTTGATTTTTTTTTTTNACTCAT AGCTTCATAGTGGANCAGATACATAGTCTAAATCAAAATGTTTAAACTTTT TATGTCACTTGCTGTC ou vice versa
14. Paire d'amorces selon la revendication 13, caractérisée en ce que les deux amorces présentent respectivement les séquences de nucléotides qui suivent :
C171A : ATCGCCCTCGAAATGCTATG C171B : CTGTTCCACTATGAAGCTATG
15. Paire d'amorces, notamment pour PCR, caractérisée en ce que leurs propres séquences sont contenues dans les deux séquences qui suivent : AFM157xdlO
TCGAGGTAGATTTGTATTATATCCCATGTACACACACACACACACACACACACAC ACACACACACACAGACTTAATCTGTTTACAGAAATAAAAGGAATAAAATACCGTT TCTACTATACACCAAAACTAGCCATCTTGAC
16. Fragment d'ADNs caractérisé en ce que leurs séquences sont choisies parmi les séquences complètes définies dans l'une quelconque des revendications 2 à 6 ou les séquences qui leur sont respectivement complémentaires.
17. Fragment recombinant le fragment d'ADN de la revendication 16 ou d'une partie de ce fragment avec un fragment non humain.
18. Utilisation d'un fragment selon la revendication 17 en tant que sonde d'hybridation pour la détection directe du marqueur correspondant à ce fragment ou de la région le contenant.
19. Procédé pour l'étude de la région chromosomique réputée contenir au moins l'un des gènes impliqués, soit par sa présence, soit par son absence, dans la SMA et provenant d'un sujet (patient ou foetus) atteint ou susceptible d'être atteint, ce procédé comprenant la mise en contact d'un échantillon d'ADN chromosomique de ce sujet ou foetus avec au moins l'un des brins d'ADN tel que définis ci-dessus, notamment dans des conditions amplificatrices autorisant, dès lors qu'il s'hybriderait à des marqueurs correspondants de cet ADN chromosomique, l'élongation de ses chaînes vers et au-delà des séquences répétées de ces marqueurs, puis à se placer dans des conditions permettant de discriminer entre les chaînes d'élongation obtenues selon leurs longueurs respectives, pour obtenir des informations représentatives du nombre de ces marqueurs.
20. Procédé selon la revendication 19, caractérisé en ce qu'il comprend la mise en contact de l'échantillon chromosomique avec une paire d'amorces conformes à l'une quelconque des revendications 7 à 15 et en ce que la discrimination entre les chaînes d'élongation est obtenue, notamment par migrations électrophorétiques sur gel.
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