WO1995030772A1 - Procede de detection d'un polymorphisme de gene p4502d6 de cytochrome humain - Google Patents

Procede de detection d'un polymorphisme de gene p4502d6 de cytochrome humain Download PDF

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WO1995030772A1
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Tetsuya Kamataki
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Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.
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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Definitions

  • the present invention relates to a method for genetic diagnosis of drug-metabolism-related enzymes, and particularly to a novel method for detecting a gene polymorphism of cytochrome P4502D6 (hereinafter abbreviated as CYP2D6).
  • CYP2D6 cytochrome P4502D6
  • cytochrome P450 is an enzyme that plays an important role in detoxification and metabolic activation of drugs and extracorporeal foreign substances, and in the biosynthesis of steroidformon-bile acid.
  • CYP2D6 is a molecular species of P450, and is involved in the metabolism of many drugs that are particularly important in clinical treatment.
  • antihypertensive drugs such as buderisoquin and propapropeno have been studied. It has been reported that as many as 26 kinds of drugs such as propranolol, a blocker, and imibramin, a tricyclic antidepressant, are specific substrates for the CYP2D6.
  • CYP2D6 is a force composed of 9 exons, a type A mutation that is a single base substitution in exon 5 at the 2637th position in genomic DNA, and 1934 A B-type mutation, which is a single nucleotide substitution at the exon-intron junction site in exon 4, and a D-type mutation, which is all deficient, have been reported. It has been shown to be severely impaired.
  • the present invention is to clarify a novel mutation of the CYP2D6 gene, and to detect such a polymorphism in the CYP2D6 gene.
  • the aim is to provide a new way of issuing.
  • an object of the present invention is to develop a simple, easy, and highly sensitive and accurate detection method capable of detecting a new CYP2D6 gene polymorphism using a small amount of a DNA sample. You.
  • the present inventor has analyzed the CYP2D6 gene of Japanese PM and analyzed the pedigree for the above-mentioned purposes. Here, the present invention has been completed.
  • the present invention provides a CYP2D6 gene characterized by detecting, in exon 9 of the CYP2D6 gene, the presence of an insertion consisting of a repeating sequence of 9 bases of TCACCCGTG. It concerns 6 gene polymorphism detection methods.
  • the abbreviations of the amino acid sequence and the base sequence are in accordance with the IUPAC-IUB regulations or commonly known or commonly used in the art, and the base number is CYP2D6 genomic DNA (Yokota. Notation of literature such as T.].
  • the new type of mutation revealed by the present invention is based on the 9-base repetitive sequence of TCACCCGTG at exon 9 of the CYP2D6 gene at position 4213. It is specially identified as having an insertion.
  • the method of the present invention is not limited to any particular method as long as such a specific mutation is detected, and for example, various conventional methods can be widely used. Since the gene mutation to be detected has been clarified and identified by the present invention, it will be easy for those skilled in the art to appropriately employ a method for the detection according to the disclosure of the present application.
  • the method of the present invention can be performed by analyzing the nucleotide sequence at the specified position, and naturally includes the analysis.
  • the Southern hybridization method and the dot hybridization method [all Southern E.,, J. Mo 1. Biol., 98, 503-517 (1975)] would be a viable option. For example,
  • PCR-SSO method Specific sequence oligonucleotide; PCR—specific system ij oligonucleotide method], PCR—allele-specific oligonucleic acid using SS0 and dot hybridization method Reit method II e 1 e specific o I ig o m e ⁇ : AS 0; Saiki, RK Bu gawan, TL, Horn, GT, u11is, KBandEric1, H, A., Nature, U_163-166 (1986)].
  • the use of the above-described RFLP method can be preferably exemplified.
  • the method can be simply and easily performed using a small amount of a DNA sample. Detection with high sensitivity and accuracy is possible easily.
  • the present invention will be described in detail by taking this detection method (PCR-RFLP method) as an example.
  • various operations that can be employed in the detection method of the present invention for example, chemical synthesis of DNA, enzymatic treatment for the purpose of DNA cleavage, deletion, addition or binding, isolation, purification, replication, and selection of DNA All can follow the ordinary law [Molecular Genetics Experimental Method, Kyoritsu Publishing Co., Ltd., published in 1983; PCR Technology, Takara Shuzo Co., Ltd., published in 1990, etc.].
  • the isolation and purification of DNA can be performed according to agarose gel electrophoresis, and the DNA sequence can be determined, for example, by the dideoxy method [Sanger, F., Nick 1 en, S. and Cou I son, AR Natl.
  • a PCR method for amplifying a specific region of DNA is also a conventional method (for example, Sai.RK, Scharf, S., Fa1 oona, FA, uI1is, KB, Horn, G.T ,, E r 1 ich, HA a "Arnheim, N., Science, 230, 1350-1354 (1985)] c
  • the genome to be measured is the genome to be measured
  • DNA is a human-derived sample and can be used without any particular limitation as long as it contains the sample.
  • examples include body fluids such as blood, bone marrow fluid, semen, peritoneal fluid, tissue cells such as liver, and hair such as hair.
  • Genomic DNA can be extracted, purified, and prepared from these samples according to standard methods. From the genomic DNA, a DNA region containing the mutation site according to the present invention can be amplified to obtain a large and concentrated sample. This can be carried out, for example, according to the PCR method, using primers containing the above-mentioned exon 9 insulin portion and appropriately set so as to specifically amplify only the CYP2D6 gene. It is done by doing.
  • the setting of such primers may be performed in accordance with a conventional method, and there is no limitation on the base length of the region to be amplified, and it is usually from 100 to 500. It can be about bp.
  • the DNA region to be amplified is set so as to include any restriction enzyme site that can be suitably used in the subsequent RFLP method.
  • any settings can be made for the digested fragment obtained by treating the DNA region with the enzyme, as long as the difference in length allows detection between the mutated gene and the normal (wild type) gene. Can be.
  • One preferred example of such a primer setting is a sense primer (9-1S) and an antisense primer (9-AS), which will be described in Examples below. It is possible to specifically amplify only the above-mentioned desired region of CYP2D6 in distinction from two pseudogenes having extremely high sequence homology, namely, CYP2D7 and CYP2D8.
  • the desired restriction enzyme site (StyI site) is included at one place, and the treatment with this enzyme results in a 77 bp (wild-type) or 86 bp (mutant) and 25 bp.
  • the desired DNA regions of 334 bp (wild type) and 343 bp (mutant type) are obtained, giving a 7 bp (common) cleavage fragment.
  • the desired DNA region amplified in accordance with the PCR method can be easily converted into the desired DNA region by employing the Southern blot method or the gel electrophoresis method in accordance with the detection of RFLP. The difference can be detected and confirmed.
  • the desired DNA region is subjected to a treatment (digestion) with the restriction enzyme appropriately selected as described above, and the generated fragment is confirmed as a specific band according to a conventional method.
  • the CYP2D6 gene polymorphism (the presence of the mutation according to the present invention) can be detected from the band pattern obtained as described above.
  • FIG. 1 shows the nucleotide sequence and the location of the primer set in Reference Example 2 (1).
  • FIG. 2 shows the nucleotide sequence and the location of the primer set in Example 1 (1).
  • FIG. 3 shows an electrophoretic photograph of PM and EM obtained according to the method described in Example 1, and the 9-base insertion base observed as a result.
  • FIG. 4 shows the nucleotide sequence and the location of the primer set in Example 2 (1).
  • FIG. 5 shows the judgment based on the band length of the insulation of CYP 2D6 gene exon 9 shown in Example 2 (3).
  • FIG. 6 shows the distinction between the types according to the judgment shown in FIG. A schematic diagram showing
  • Figure 7 shows the PM obtained according to Example 2 and its parents. The result of the determination is shown.
  • compositions are concentrations or amounts per liter, and if necessary, sterilized by autoclaving (121 ° C, 20 minutes).
  • Denhardt (Denhardt's) solution 10 g of pigment, 10 g of polyvinylpyrrolidone, bovine serum albumin
  • Formamide dye formamide 100 m 1, xylene cyano FFO.lg, bromophenol 0.1 g, 0.5 MEDTA 4 m 1
  • LB medium 1 g glucose, 5 g sodium chloride, 5 g yeast extract, 10 g pat-tripton
  • ⁇ LBA mp + medium glucose 1 g, sodium chloride 5 g, yeast extract 5 g, bactotripton 10 g, ampicillin (25 g final after autoclaving) No so that it becomes m1)
  • H agar medium Bactotripton 20 g, sodium chloride 8 g, agar powder 12 g
  • Genomic DNA was prepared from human peripheral blood according to the following method. That is, blood was collected using anti-coagulant drug Human peripheral blood (10 ml) was centrifuged at 3000 rpm for 10 minutes to obtain a buffer coat. An equal volume of cold PBS was added to the obtained buffer coat, and the centrifugation operation was repeated 2 to 3 times. The obtained buffy coat was washed with a 5-fold amount of 0.2% sodium chloride—5 mM EDTA solution, and centrifuged at 500 rpm for 10 minutes to collect a precipitate.
  • prehybridization buffer pH 8.0
  • prehybridization buffer pH 8
  • CYP 2 D 6 c DNA of thermally denatured probe the full length 1. 5 kb was 5 0 ng addition, 6 5 ° C For 8 to 12 hours.
  • the nylon membrane was washed once with 2 XSSC—0.1% SDS at room temperature for 15 minutes, and once with 0.5 XSSC—0.1% SDS at 50 ° C. for 15 minutes once. After air-drying, autoradiography was performed at 180 ° C for 12 to 16 hours.
  • Each of the prepared genomic DNAs was treated with the restriction enzymes EcoRI or Xbal according to the above (2), and subjected to Southern blot analysis.
  • CYP2D7 and CYP2D7 which have very high nucleotide sequence homology CYP2D8 has been reported, and according to Southern blot analysis after treatment of CYP2D6 and their respective Ec0RIs, they were 9.4, 16.0 and 8.6 kb, respectively. It is known to provide a band [see Kimra, S., etc., above].
  • Primers are designed to specifically amplify only those mutation sites in the CYP 2D6 gene to detect A and B mutations in the CYP 2D6 gene As a result, the 3 'end was set as a mutation site, and two types of primers ( ⁇ '-SW and A'-SM) were selected which had selectivity with a difference of one base.
  • Fig. 1 shows the nucleotide sequences of these primers and their locations.
  • Preparation and purification of each primer designed or set in the above (1) were performed as follows. That is, the oligonucleotide synthesized by detritylation with 3 ml of 29% ammonia water was After detaching from the range with 3 ml of 29% ammonia water, the plate was incubated at 60 ° C for 4 hours. After evaporating the ammonia water, the resulting pellets are dissolved in 201 formamide dye, and this solution is heated at 100 ° C for 5 minutes, and then 20% denatured acrylic acid gel Was used for electrophoresis. In addition, 1 XTBE was used as a buffer for electrophoresis.
  • the position of the gel portion containing the oligonucleotide was confirmed by UV lamp irradiation, cut out, and extruded and crushed using a 1 ml syringe. To this, 5 ml of STE was added, and the mixture was slowly rotated overnight and extracted for 10 to 12 hours. After heating the extract at 100 ° C for 10 minutes,
  • Amplification of the genomic DNA containing the type A mutation of the CYP2D6 gene (a single base deletion at exon 5 at position 263 in the genomic DNA) using PCR was performed by Perkin-Elmer Cetus. The procedure was as follows using a DNA Thermal Cycler (Perkin Elmer Ces) (see Fig. 1).
  • the genomic DNA solution (50 ng / 1) 11 prepared in (1) of Reference Example 1 was added to purified water 17.51, 5 mM deoxyribonucleotide 5'-trifolate.
  • Solution (dNTP) solution 1 // 1, 10 XPCR solution (10 mM) 2.
  • ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ sense primer (A-S) 11, 10 uM antisense primer (A — AS) Add 1, boil for 5 minutes and cool on ice for 3 minutes.
  • Taq DNA polymerase (1 UZ / 1) was added to make the total amount 25/1, and an equivalent layer of mineral oil was further layered. C 1 minute, 55 ° C 2 minutes, and 72 ° C 2 minutes were defined as 1 cycle, and the reaction was performed for 25 cycles.
  • the band length (575 bp) and the restriction enzyme (AvaI, PvuII) were treated with AvaI
  • the band of 350, 204, 203 3 is?
  • the 1111 treatment was performed by observing the 464 and 295 bp bands, respectively.
  • Aval treatment of 400, 350 bp band, and CYP2D8 amplification, Pvul I treatment of 431, 14.6, 90, 70, 27 bp band CYP2D6 can be clearly distinguished from the above CYP2D6 due to the observation of
  • a combination of two types of sense primers ( ⁇ '-SW, A'-SM) that differ only in the 3'-terminal 1 base and the antisense primer (A-AS) used in (3) above, Also, using the sample solution prepared in (3) above,
  • PCR solution (7.5 mM) 2.5 // 1, 10 M for determination
  • a sense primer ( ⁇ '-SW or A'-SM) l / l and 10 M antisense primer (A-AS) 11 were added, and the mixture was boiled for 5 minutes and cooled on ice for 3 minutes.
  • the reaction was carried out for 25 cycles, with 1 minute at 72 ° C. as one cycle.
  • the mineral oil was removed, and electrophoresis was carried out using a 1.5% agarose gel containing 0.02% ethyl bromide (EtBr).
  • ⁇ ' one SW specifically amplifies only the wild-type strain
  • '— SM specifically amplifies only the Ali mutation. Only when a 451 bp band is observed, wild-type, A'-SW, A '— heterozygous A-type mutation, A' when a 451 bp band is observed on both SM side SM side only
  • the B-type mutation (genomic DNA) of the CYP2D6 gene was performed according to (3) above. In this way, genomic DNA was amplified which contained the portion of the 193rd fourth exon 4 at which the exon-intron junction site was replaced by one base.
  • the B-type mutation in the CYP 2D6 gene utilizes the disappearance of the MVaI-recognition enzyme, a restriction enzyme that replaces a single base at the exon-intron junction site in exon 4. Can be determined.
  • Primers were set to specifically amplify all exo- and exo-intron junction sites of the CYP2D6 gene at four locations, and the primers were set as in Reference Example 2. Then, each primer was purified, and using these, each fragment was amplified by the following PCR method.
  • FIG. 2 shows the set base sequence of the primer, the corresponding position of CYP2D6, and the outline of each obtained fragment.
  • the antisense primer (B—AS) for amplifying the exon 2 to 4 sites used above and the antisense primer (A—A) for widening the exon 5 to 6 sites are used.
  • S) and the antisense primer (A-AS) used were the same as those prepared in Reference Example 2, respectively.
  • the genomic DNA containing the exo- and exo-in / out-port junctions of the CYP2D6 gene was amplified as follows.
  • the genomic DNA solution (50 ng / 1) 1/1 prepared in Reference Example 1 was added to purified water 17.5 15 mM dNTP solution lzl, 10 x PCR solution (10 mM) 2 5/1, 10 M sense primers 1/1, 10 uM antisense primer 1-1 were added, and the mixture was boiled for 5 minutes and cooled on ice for 3 minutes. To this is added Taq DNA polymerase (1 U ⁇ 1) 11 to make the total volume 251, and an additional equivalent equivalent of mineral oil is added.
  • each amplified DNA fragment is derived from CYP2D6 depends on the band length and the appropriate restriction enzyme (F1:
  • phosphorylation was performed as follows. That is, a denaturation buffer (pH 9.5) 751 was added to the blunt-ended DNA fragment, and the mixture was boiled for 2 minutes and left on ice for 2 minutes. Adenosine phosphate (ATP, 50 picomoles / p. ⁇ ) L / zl, 10X Blunt end buffer 10 ⁇ 1, The reaction was carried out at 37 ° C for 1 hour by adding 12 ⁇ l of purified water and 2 ⁇ l of T4 polynucleotide kinase (11 U // ⁇ l) to make a total of 100 ⁇ 1. .
  • the 1M Tris HC1 (H8.0) 47 / alkaline phosphatase (0. ⁇ To make the total amount 5 2 ⁇ 1, and then reacted at 65 ° C for 30 minutes. Add purified water to bring the total amount to 200 1, and then perform phenol extraction three times. Mouth form extraction was performed once. To this supernatant was added 15 ⁇ l of sodium triacetate ( ⁇ ⁇ 5.6) solution and 375 / l of cold ethanol, and after cooling to 180 ° C, 120 Centrifuge at 0 rpm, 4 ° C for 20 minutes, wash the precipitate with 70% ethanol, dry the precipitate, dissolve in 0 0, and remove one side of the vector. Oxidation.
  • a mixture of 100 ng of the fragment containing the exo- and exo-intron attachment sites of CYP 2D6 and 10 ng of the blue-script vector was added to the mixture. One shot was taken. After completion of the ligation reaction, 300 1 of the competent cell suspension was added to the DNA solution, and the mixture was left on ice for 20 minutes. After heating at 42 ° C for 2 minutes, 1 ml of B solution was added and the mixture was incubated for 1 hour. Centrifuge at 300 rpm at 4 ° C for 3 minutes, remove supernatant 1 ml, resuspend, inoculate LB medium, culture at 37 ° C overnight, and transform the transformants. Obtained.
  • TG1 was used as host E. coli, and the above-mentioned competent cell was prepared by the following method.
  • a colony of the obtained transformant was recovered and cultured in 3 ml of LBA Amp + medium.
  • the culture was centrifuged to recover the cells, and a small amount was prepared in plasmid DNA according to the following method.
  • the orientation of the integrated DNA fragment within the plasmid was confirmed by treatment with the vector's multicloning site and the restriction enzyme selected from the restriction enzyme map of the integrated DNA fragment.
  • the phage single-stranded DNA was prepared by the following method c, ie, the plaque of the transformant was recovered and cultured in 3 ml of 2 XTY medium for 6 hours. 1.5 ml of this culture
  • the suspension was centrifuged twice for 5 minutes at 1500 rpm, and the supernatant was recovered.
  • sequence reaction was performed according to the manual attached to Sequence 1 ⁇ VER. 2.0 .
  • ⁇ type DNA 7 // 1 (700 ng) and a primer (1 pmol 1 // 1, 5 x annealing ring buffer (pH 7.5) 21) are mixed, and 65 After heating for 2 minutes, gradually cool the primer
  • sucrose gradient gel having a gel thickness of 0.4 mm was prepared. 20% N, N, N ', N' — tetramethylethylethylenediamine (TEMED) and 10% ammonium persulfate per 40 ml of gel A solution and 15 ml of gel B solution After adding 3 2 1 and 9/1, respectively, the gel A solution and the gel B solution were sucked in order using a disposable 50 ml syringe, and bubbles were removed. The mixture was gently stirred by inhaling three pieces, and injected into a glass plate. Fill the remaining space with top gel. The electrophoresis was performed for 2 to 7 hours at a constant voltage of 2500 to 300 V using 1XTBE.
  • TEMED tetramethylethylethylenediamine
  • the gel was immersed in 1% (10%) acetic acid in 10% methanol for 15 minutes to fix D ⁇ ⁇ , dried while sucking with a gel dryer, and —80 ° C overnight. The X-ray film was exposed.
  • the above mutation in the CYP2D6 gene is a new type of mutation that has not been reported before, and this mutation was considered to be the cause of PM.
  • a sense primer was set so as to include an insertion site of exon 9 which is a site of a novel mutation, and to specifically amplify only CYP2D6.
  • the antisense primer is the same as the one created in Example 1 (9-AS).
  • Figure 4 shows the primer sequences and their positions.
  • Each primer was purified in the same manner as in Reference Example 2. Was used to amplify the genomic DNA of Exon 9 by the following PCR method.
  • Genomic DNA solution (50 ng / ⁇ ⁇ ) 11 prepared in Reference Example 1 was added to purified water 17.5 / 1, 5 mM d NTP solution 1 ⁇ 1, 10 XPCR solution [only in this example 2 0 mM Tris HC 1 (pH 8.4), 250 mM potassium chloride, 0.5% Tween 20, lmg Zml gelatin, 10 mM magnesium chloride composition 2.
  • Add 5 ⁇ l, 10 ° sense primer (9—S) 1 ⁇ 1, and ⁇ ⁇ antisense primer (91 AS) 1 / zl boil for 5 minutes, and then boil for 3 minutes Ice cooled. to this
  • Taq DNA polymerase (lUc1) 1 fi1 was added to make the total amount 25/21, and an equivalent layer of mineral oil was further added. The reaction was performed for 25 cycles, with one minute at C and two minutes at 72 ° C as one cycle.
  • the amplified DNA fragment is derived from CYP 2D6 depends on the band length (334 bp) and the restriction enzyme (Sty I, Asp 718) treated, and the Styl treatment yielded a 25, 7 and 77 bp band, while Asp 718 treated 189,
  • the DNA fragment amplified in (2) above was treated with the restriction enzyme StyI, and the band length was determined (FIG. 5).
  • FIG. 7 shows the results of detection of the novel mutation of the CYP2D6 gene in PM and its parents.
  • a band of 86 bp was observed in PM and its mother (MP in the figure), confirming the mutation (insulation) according to the present invention.
  • This mutation in PM was found to be inherited from the mother.
  • FP indicates the father of PM, and the figure also shows the results of EM.
  • a novel mutation in the CYP2D6 gene is clarified, and a method for detecting a new CYP2D6 polymorphism having such a mutation is provided.
  • the detection of the CYP2D6 gene polymorphism it is possible to diagnose the gene of PM, and in particular, it is possible to diagnose PM not caused by the known polymorphism of the CYP2D6 gene. It is extremely useful for diagnosing, predicting, and investigating the cause of side effects caused by various drugs.

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Description

明 細 書
ヒ トチ ト ク ローム P 4 5 0 2 D 6
遺伝子多型の検出方法
技 術 分 野
本発明は薬物代謝関連酵素の遺伝子診断法、 殊にチ ト. ク ローム P 4 5 0 2 D 6 (以下、 C Y P 2 D 6 と略す） の遺伝子多型の新規な検出方法に関する。
従 来 技 術
ヒ トチ トク ローム P 4 5 0 ( P 4 5 0 ) は、 薬物や生 体外異物の解毒化及び代謝的活性化、 ステロイ ドホルモ ンゃ胆汁酸の生合成等の重要な働きを担う酵素である。 C Y P 2 D 6は、 該 P 4 5 0の 1分子種であり、 殊に臨 床治療上重要な多く の薬物の代謝に関与しており、 現在 までに、 抗高血圧薬であるブデリ ソキンやプロパフヱノ ン、 S —遮断薬であるプロプラノ ロール、 三環系抗うつ 薬であるィ ミ ブラ ミ ン等の 2 6種類もの薬物が、 該 C Y P 2 D 6の特異的基質となることが報告されている
[ E i c h e 1 b a um, M, and Gross, A. S. , Cl in. Ph a rnia c. Th e r. , £6, 377 - 394 ( 1990 )〕 。
—方、 上記 C Y P 2 D 6には多型性が存在するこ とが 明らかにされており、 常用量の服用でも代謝能の低いひ と （poor metabo l i zer : 以下 P Mと略す） では、 高い血 中濃度を維持する こ とによ り、 薬の効き過ぎ （副作用） が生じることが報告されている。 上記 C Y P 2 D 6 にお ける多型性には人種差が存在し、 P Mの頻度は欧米人で は 5〜 1 0 %である CKimura, S, , Umeno, M. , Skoda, R.
， Meyer, U. A. and Gonzalez, F. J. , Am. J. Hum. Ge n e t. , 15, 889 - 904 ( 1989 ) ] のに対して、 日本人では 0〜 2 % と非常に少ない 〔Yokota， T. , Tamu ra, S. , Furuya, H. , K i mu r a, S. , Wa t a n a b e, . , K a n a z a wa, I . , K o n d o, I . and Gonzalez, F. J, Pharmacogenetics, 3r 256 - 263 ( 1993 ) 従って、 許可前の新薬が C Y P 2 D 6の特異的基質であ つた場合は、 臨床試験においてはその低い P M頻度のた めに副作用の発現を確認できずに、 上市後に重篤な副作 用の生じる可能性が充分に考えられ、 この点より 日本人 において特に注意を払う必要がある 〔鎌滝哲也， T DM 研究.， jj， 2 - 7 ( 1993) 〕 。
最近、 上記 C Y P 2 D 6 における多型の原因はその遺 伝子における変異にあるこ とが欧米人の C Y P 2 D 6の 遺伝子解析により明らかにされた 〔Gonzalez, F. 1. and Meyer, U. A. , Cl in. Pharmac. Ther. , 50, 233 - 238 ( 1991 )； He im, M, and Meyer, U. A.， Lancet, 336, 529 - 532 ( 1990 ) Smi th, C. A. D. , Gou gh, A. C. , Lei h, P. N. , Summe r s, B. A. Harding, A. E. , M a ; a n g a n o r e , D. M. , 81 u rma n, S. G. , S c h a p i r a, A. H. V. , W i 11 i a m s , A . C . , S p u r r , N . K . and wo l f, C. R. , Lancet, 339, 1373-137? (1992)〕 。 即ち、 C Y P 2 D 6 は 9つのェク ソ ンから構成される力 、 ゲノ ム D N Aで 2 6 3 7番目のェク ソ ン 5 における 1塩基置 換である A型変異、 同 1 9 3 4番目のェク ソ ン 4 におけ るェク ソ ンーィ ン ト ロ ン接合部位の 1塩基置換である B 型変異及び全欠損である D型変異が報告され、 これらの 変異 · 欠損により代謝能が著し く損なわれるこ とが明ら かにされている。
上記 A型変異及び B型変異は C Y P 2 D 6の変異で非 常に高い割合を占めていると考えられ、 欧米人の P Mの 9 5 %はこの両者の変異によって説明できるとの報告
[Da ly, A. K. , Arms t ron , Μ. , Mo η km a n, S. C. , I d l e, M. E. and i dl e, J. , , Pharmacogenet i cs, 33 - 41 ( 1991 ) 〕 や、 欧米人の P Mの 7 5 %は B型変異に、 5〜 1 1 %は A型変異に属するとの報告 〔上記 Gonza l ez, F. J. 等〕 が める ο
しかしながら、 日本人においてはこれらの変異の頻度 が低いために殆ど研究は進められていない現伏にある。
発 明 の 開 示
本発明は、 C Y P 2 D 6遺伝子の新規な変異を明らか にする ものであり、 かかる C Y P 2 D 6遺伝子多型を検 出する新しい方法を提供するこ とを目的とする。 特に本 発明は、 少量の D N A試料を利用して、 C Y P 2 D 6遣 伝子の新しい多型を検出できる簡便、 容易でしかも感度 及び精度の高い上記検出方法を開発するこ とを目的とす る。
本発明者は上記目的より、 日本人の P Mの C Y P 2 D 6遺伝子の解析及び家系解析を行なった結果、 上記目的 に合致する新しい遺伝子多型を見出すと共に、 その検出 技術を開発する に成功し、 こ こ に本発明を完成する に至 つた。
即ち、 本発明は、 C Y P 2 D 6遺伝子のェク ソ ン 9 に おいて、 T C A C C C G T Gの 9塩基の繰返し配列によ るィ ンサーシ ョ ンの存在を検出する こ とを特徵とする、 C Y P 2 D 6遺伝子多型の検出方法に係わる。
本明細書において、 ア ミ ノ酸配列及び塩基配列の略号 による表示は、 I U P A C— I U Bの規定乃至当該分野 における通称又は慣用に従う ものと し、 塩基番号は C Y P 2 D 6ゲノ ム D N A 〔上記 Yokota. T. 等の文献の 表記〕 に従って表記する。
本発明によって明らかにされた新しい型の変異は、 C Y P 2 D 6遺伝子のェク ソ ン 9である 4 2 1 3番目に おいて、 T C A C C C G T Gの 9塩基の繰返し配列によ るィ ンサーショ ンの存在と して特徵付けられる。
本発明方法は、 かかる特定の変異を検出する限りにお いてその手法等に何等の限定もなく、 例えば常法である 各種の方法を広く 採用することができる。 本発明によつ て検出すべき遺伝子変異が明らかにされこれが特定され ている以上、 その検出のための手法の適宜採用は、 本出 願開示に従えば当業者に容易であろう。 例えば本発明方 法は、 上記特定された位置の塩基配列の解析を行なう こ とによっても可能であ り勿論これを包含する。 サザンハ ィブリ ダィゼ一シヨ ン法ゃ ドッ トハイ ブリ ダイゼーショ ン法 〔何れも Southern E. , , J. Mo 1. Biol. , 98, 503 - 517 ( 1975 )〕 も採用し得る選択であろう。 例えば、
P C R (Polymerase c:uin reaction)— R F L P法
(Restriction f ragment length p o I ymo r oh i sm； 制限酵 素断片長多型分析法） 、 P C R -単鎖高次構造多型分析 し Orita. M.， 1 wa h a n L, H. , Ra n a z awa, H. , H a y a s li i , K, and Sek i y a, T. , P r o c, N a 11. A c a d. S c i . , U. S. A. , 86, 2766 - 2770 ( 1989 ) ) 、 P C R— S S O法 [Speci f ic sequence ol igonucleotide; P C R—特異的配歹 ijオ リ ゴ ヌ ク レオチ ド法） 、 P C R— S S 0と ドッ トハイ ブリダ ィゼ一ショ ン法を用いる対立遺伝子特異的ォ リ ゴヌ ク レ ォチ ド法 I I e 1 e specif ic o I i g om e τ： A S 0； S a i k i , R. K. Bu gawa n, T. L. , Ho r n, G. T. , u 1 1 i s, K. B. a nd E r 1 i c h , H , A. ， Na t u r e, U _ 163 - 166 (1986 ) 〕 等に従う ことがで きる。
特に本発明においては、 上記 R F L P法の採用を好ま しく 例示するこ とができ、 殊に P C R法を利用する D N Aの増幅手法との組合わせによれば、 少量の D N A試料 を利用して簡便且つ容易にしかも感度及び精度の高い検 出が可能である。 以下、 この検出法 （P C R — R F L P 法） を例にとり本発明を詳述する。
尚、 本発明の検出法において採用され得る各種の操作、 例えば一部 D N Aの化学合成、 D N Aの切断、 削除、 付 加乃至結合を目的とする酵素処理、 D N Aの単離、 精製、 複製、 選択等はいすれも常法に従うこ とができる 〔分子 遺伝学実験法、 共立出版株式会社、 1 9 8 3年発行 ； P C Rテクノ ロジ一、 宝酒造株式会社、 1 9 9 0年発行 等〕 。 例えば、 D N Aの単離精製は、 ァガロースゲル電 気泳動法等に従い得、 D N A配列の決定は、 例えばジデ ォキシ法 [ San ge r, F. , N i c k 1 e n, S. and C o u I s o n, A. R. , P ro c. Na t l. Ac ad. S c i. , U. S. A. , 74, 5463 - 5467 ( 1977)〕 やマキサムーギルバ一 卜法 iaxam, A, M. and G i l be r t, . , Me t h od i n En z ymo l ogy, 65, 499 - 560 ( 1980 ) 〕 等に 従い得る。 上記 D N A塩基配列の決定は、 市販のシーク エンスキッ ト等を用いる ことによつても容易に行ない得 る。 D N Aの特定領域の増幅のための P C R法もまた常 法 〔例えば、 Sa i. R. K. , Scha r f, S. , Fa 1 oona, F. A. , u I 1 i s, K. B. , Ho r n, G. T, , E r 1 i c h, H. A. a" A r n h e i m, N. , Sc i ence, 230, 1350 - 1354 ( 1985 ) ] に従う こ とができる c これら各種の基本的操作は、 例えば本出願に引用の各種 文献においても採用されており、 後述の実施例とともに 参照される。
本発明の検出法において、 測定対象であるゲノム
D N Aは、 ヒ ト由来のサンプルであり これを含むもので あれば特に限定なく採用でき、 例えば血液、 骨髄液、 精 液、 腹腔液等の体液、 肝臓等の組織細胞、 毛髪等の体毛 等を例示できる。 ゲノ ム D N Aはこれらのサンプルより 常法に従い抽出、 精製し、 調製することができる。 該ゲ ノ ム D N Aより、 本発明にかかる変異部位を含む D N A 領域を増幅し、 多量にかつ濃縮された被検体を得るこ と ができる。 これは、 例えば P C R法に従い実施でき、 上 記ェク ソ ン 9 のイ ンサ一 シ ヨ ン部分を含み、 かつ C Y P 2 D 6遺伝子のみを特異的に増幅するように適宜設定し たプライマーを採用することにより行なわれる。 かかる プライマーの設定は、 常法に従えばよく 、 増幅する領域 の塩基長等にも制限はなく通常 1 0 0 から 5 0 0 b p程度とするこ とができる。 尚、 増幅される D N A領 域は、 引続く R F L P法において好適に使用 し得る任意 . の制限酵素サイ 卜を含むよ う に設定され、 これは該
D N A領域を該酵素により処理して得られる切断断片に、 変異遺伝子と通常 （wild: 野生型） 遺伝子の場合で検出 を可能とする長さの違いをもたらす限りにおいてどのよ う に も設定することができる。 かかるプライマー設定の 好適な 1例は、 後述の実施例に示す、 セ ンスプライマー ( 9一 S ) 及びア ンチセ ンスプライマ一 （ 9 — A S ) で あり、 かかる設定によれば、 C Y P 2 D 6について塩基 配列の相同性が非常に高い 2つのシユー ドジーン、 即ち C Y P 2 D 7及び C Y P 2 D 8、 と区別して C Y P 2 D 6の上記所望領域のみを特異的に増幅するこ とが可能で ある。 かかるつプライマ一の設定によれば、 所望の制限 酵素サイ ト （ S t y I サイ 卜） を 1ケ所含み、 この酵素 処理により 7 7 b p (野生型） 又は 8 6 b p (変異型） と 2 5 7 b p (共通） の切断断片を与える、 3 3 4 b p (野生型） 及び 3 4 3 b p (変異型） の所望 D N A領域 が增幅される。
かく して P C R法に従い増幅された所望 D N A領域は、 R F L Pの検出に従うサザンブロ ッ ト法或いはゲル電気 泳動法等の採用により、 容易に、 その領域に含まれる変 異を検出確認するこ とができ る。 該所望 D N A領域は、 上記において適宜に選択された制限酵素による処理 （消 化） に供され、 生成した切断断片は常法に従い特定バン ドと して確認される。
上記のようにして得られたバン ドのパターンより、 C Y P 2 D 6遺伝子多型 （本発明にかかる変異の存在） を検出するこ とができ る。
図面の簡単な説明
図 1 は、 参考例 2 ( 1 ) において設定したプライマー の塩基配列と存在位置を示す。
図 2は、 実施例 1 ( 1 ) において設定したプライマー の塩基配列と存在位置を示す。
図 3は、 実施例 1に示す方法に従って得られた P M及 び E Mについての電気泳動写真とその結果観察される 9 塩基イ ンサーシ ヨ ンの塩基を示す。
図 4は、 実施例 2 ( 1 ) において設定したプライマー の塩基配列と存在位置を示す。
図 5は、 実施例 2 ( 3 ) に示す C Y P 2 D 6遺伝子ェ ク ソ ン 9のィ ンサ一シ ョ ンのバン ド長による判定を示す 図 6 は、 図 5 に示す判定に従う型の区別を示す模式図 乙いめる。
図 7は、 実施例 2に従い得られた P M及びその両親の 判定結果を示す。
発明を実施するための最良の形態 以下、 本発明を更に詳しく 説明するため実施例を挙げ るが、 本発明はこれに限定されない。
尚、 各例に用いた試薬等に関する略号は、 それぞれ次 のものを示す。 これらの組成は 1 リ ッ トル当りの濃度又 は量であり、 必要のあるものはオー トク レープ （ 1 2 1 °C、 2 0分） 等の滅菌処理を行なった。
• T E溶液… 1 0 mM ト リ ス H C 1 ( p H 7. 5 ) 、 I mMエチ レ ン ジァ ミ ン 4酢酸ジナ ト リ ウム
(E D T A) ( p H 8. 0 )
• 2 0 X S S C 3 M塩化ナ ト リ ウム、 0. 3 Mク ェ ン 酸ナ ト リ ウム
• 5 X デンハル ト （ D e n h a r d t ' s ) 溶液…フ ィ コール 1 0 g、 ポ リ ビニルピロ リ ドン 1 0 g、 牛血清アルブミ ン
( B S A) 1 0 g
• 2 Xハイブリ ダィゼー シ ョ ン緩衝液 （ p H 8. 0 ) … 0. 1 M ト リ ス H C 1 ( p H 8. 0 ) 、 2 M塩化ナ ト リ ウム、 2 0 m M E D T A. 0. 2 % ドデシルサル フ ェー ト ナ ト リ ウ ム （ S D S)
• S E溶液… 1 0 mM ト リ ス : H C 1 ( H 7. 4 ) 、 5 0 m M E D T A、 0. 5 %N— ラ ウ ロ イ ルザルコ シ ン 2ナ ト リ ウ ム
• ホルムア ミ ド色素…ホルムア ミ ド 1 0 0 m 1 、 キ シ レ ン シァ ノ ーノレ F F O . l g、 ブロモフ ヱ ノ ールブル一 0. l g、 0. 5 M E D T A 4 m 1
* S T E…： L O O mM塩化ナ ト リ ウ ム、 1 0 mM ト リ ス H C 1 ( p H 7. 5 ) 、 1 mM E D T A ( p H 8. 0 )
• L B培地…グルコース 1 g、 塩化ナ ト リ ウム 5 g、 酵 母エキス 5 g、 パク ト ト リ プ ト ン 1 0 g
· L B A m p +培地…グルコース 1 g、 塩化ナ ト リ ウム 5 g、 酵母エキス 5 g、 バク ト ト リ プ ト ン 1 0 g、 ァ ン ピシ リ ン （オー トク レーブ後、 終濃度 2 5 gノ m 1 となるように添加）
• L B A m p Tプレー ト …上記 L B Am p +培地に寒天 末 1 1 gを添加
• 2 X T Y培地…パク ト ト リ プ ト ン 1 6 g、 酵母エキス 1 0 g、 塩化ナ ト リ ウム 5 g
• 2 X T Yプレー 卜…上記 2 X T Y培地に寒天末 1 1 g を添カロ
· 1 0 X P C R緩衝液 （ p H 8. 3 ) 1 0 0 mM ト リ ス H C 1 ( H 8. 3 ) 、 5 0 0 m M塩化カ リ ウム、 0. 0 1 % ( wノ V ) ゼラチ ン、 塩化マグネ シウム (単位を mMと し、 濃度はその度に示した）
• H寒天培地…バク ト ト リ プ ト ン 2 0 g、 塩化ナ ト リ ウ ム 8 g、 寒天末 1 2 g
• H上層寒天…パク ト ト リ プ ト ン 2 0 g、 塩化ナ ト リ ウ ム 8 g、 寒天末 8 g
• 1 0 X T 4 D N Aポ リ メ ラーゼ緩衝液 （ p H 8. 8 ) ••• 6 6 7 mM ト リ ス H C 1 ( p H 8. 8 ) 、 6 7 m M 塩化マグネ シウム、 1 1 6 mM硫酸ア ンモニゥム、 1 0 0 mM 2—メ ノレカ プ トエタ ノ ール、 6 7 μ Μ E D T A、 0. 1 6 7 % B S A
• 1 O xデナチュ レー ン ヨ ン （Denaturaiion) 緩衝液 ( H 9. 5 ) "' 2 0 mM ト リ ス H C I ( ρ Η 9. 5 )
I mMスペル ミ ジ ン、 0. l mM E D T A
• 1 0 Xブラ ン トエン ド （Blunt end ) 緩衝液… 0. 5 M ト リ ス H C l (p H 9. 5 ) 、 0. 1 M塩化マグネ シゥム、 0. 1 M 2— メ ルカ プ トエタ ノ ール
• ラベ リ ング ミ ッ ク ス (Labeling mix) … 7. 5 Mデ ォキシグアノ シ ン 5 ' — ト リ フ ォ スフ ェー ト
( d G T P) 、 7. 5 μ Μデォキシシチ ジ ン 5 ' — 卜 リ フ ォ スフ ェー ト （ d C T P) 、 7. 5 μ Μデォキシ チ ミ ジ ン 5 ' — ト リ フ ォ スフ ェ ー ト （ d T T P )
• 4 0 %アク リ ルア ミ ド保存液…ア ク リ ルア ミ ド 3 8 g ビスァク リ ルア ミ ド 2 g、 精製水で計 1 0 0 m 1 とす る
• 1 0 X T B E ( p H 8. 3 ) … ト リ ス 1 0 8 g、 ホウ 酸 5 5 g、 E D T A 9. 3 g
· ゲル A…尿素 7 6. 8 g、 4 0 %アク リ ルア ミ ド保存. 液 2 4 m l 、 1 0 x T B E 8 m l 、 精製水で計 1 6 0 m 1 とする
• ゲル B…尿素 1 4. 4 g、 4 0 %アク リ ルア ミ ド保存 液 4. 5 m l 、 1 0 X T B E 7. 5 m l 、 シ ョ糖
3. 0 g、 プロモフ エ ノ ールブル一色素溶液 （ 1 0 m g /m 1 ) 、 精製水で計 3 0 m 1 とする
• 1 0 X H溶液… 5 0 0 mM ト リ ス H C 1 ( H
7. 5 ) 、 1 0 0 m M塩化マグネ シウム、 1 0 m Mジ チオス レィ ト ール （D T T：) 、 l O O mM塩化ナ ト リ ゥム
• 1 0 X M溶液… l O O mM ト リ ス H C 1 ( H
7. 5 ) 、 Ι Ο Ο πιΜ塩化マグネシウム、 1 0 mM D T T、 5 0 0 mM塩化ナ ト リ ウム
参考例 1
( 1 ) ヒ ト末梢血ゲノ ム D N Aの調製
ヒ 卜の末梢血よ り ゲノ ム D N Aを以下の方法に従って 調製した。 即ち、 抗凝固剤へパ リ ンを使用 して採血した ヒ ト末梢血 1 0 m 1 を 3 0 0 0 r p m、 1 0分間遠心分 離し、 バッ フ ィ ーコー トを得た。 得られたバッ フイ コー 卜に等量の冷 P B Sを加え、 同様に遠心分離操作を 2〜 3回繰返した。 得られたバッ フィ コー トを 5倍量の 0. 2 %塩化ナ ト リ ウム— 5 mM E D T A溶液で洗浄 し、 5 0 0 0 r p m、 1 0分間遠心分離し、 沈殿を回収 した。 沈殿のへモグ口 ビン色が消えるまで上記洗浄操作 を繰返し、 得られた沈殿に T E溶液 0. 5 m l を加えて 完全に懸濁させた後、 リ ボヌ ク レア一ゼ A ( R N a s e A、 l O m g Zm l ) 及びァクチナーゼ E ( 2 0 m g / m l ) をそれぞれ 及び 1 0 0 ^/ 1ずつ加えた。 こ れを再度懸濁させた後、 S E溶液 1. 5 m l を加え、 3 7 °Cで 2時間イ ンキュベー ト後、 T E溶液 l m l で希 釈した o
次にフヱノ ールーク ロロホルム溶液による抽出操作を 蛋白層が消失するまで繰返し、 最後にク ロ口ホルム抽出 を行ない、 抽出物を 1 Z2 0量の 5 M塩化ナ ト リ ウム、 3倍量の冷エタ ノ ールで沈殿させ、 得られた D N Aを 7 0 %エタノ ールで洗浄し、 得られたゲノ ム D N Aを T E溶液に溶解し 2 6 0 n mにおける吸光度を測定 （分 光光度計 ： 島津 U V— 1 6 0使用） して定量した。
( 2 ) C Y P 2 D 6 c D N Aを用いたサザンブロ ッ ト分 析
上記 （ 1 ) で調製したゲノ ム D N A 8 gを、 制限酵 素 E c 0 R I 又は X b a I で消化し、 0. 8 %ァガロー スゲルでパルスフィ ール ド （東洋社製ェレポス P S — 1 5 1 0使用、 1 0 0 V、 フ ォ ワー ド 2秒、 バッ ク
0. 6秒） を用いて電気泳動後、 0. 5 N水酸化ナ ト リ ゥム溶液一 1 M塩化ナ ト リ ウム溶液、 1 M ト リ ス H C 1 ( H 7. 4 ) 一 1 M塩化ナ ト リ ウム溶液で変性し、 中 和を 3 0分間ずつ行ない、 2 0 X S S Cで 3 0分間浸し た後、 キヤ ビラ リ 一法でナイ ロ ン膜 （Schleicher &
Shuel 1) に D N Aを 8〜 1 2時間かけて ト ラ ンスフ ァ ー させた。 3 X S S Cで膜を洗浄した後、 8 0 °Cで 2時間 ベイクするこ とにより D N Aをナイロン膜に固着させた。
1 0 0 β g Zm gの熱変性サケ精子 D N Aを含むプレ ハイブリダィゼ一シ ヨ ン緩衝液 （p H 8. 0 ) ( I Xノヽ ィブリ ダイゼーショ ン緩衝液と 1 Xデンハル ト溶液を含 む） 中で、 6 5 °Cで 2時間イ ンキュベー ト してナイ ロ ン 膜をブロ ッキングした後、 1 0 0 μ gノ m gの熱変性サ ケ精子 D N Aを含むプレハイブリ ダィゼ一ショ ン緩衝液 ( p H 8. 0 ) に 〔 a _ 32P〕 d C T P (アマシャ ム社） を用いてラベル後、 熱変性したプローブ （全長 1. 5 k bの C Y P 2 D 6 c D N A) 5 0 n gを加え、 6 5 °C で 8〜 1 2時間、 ハイ ブリ ダィゼ一ショ ンを行なった。 ハイブリ ダィゼーシ ヨ ン後、 ナイ ロ ン膜を 2 X S S C— 0. 1 % S D Sで室温 1 5分間 1回、 0. 5 X S S C— 0. 1 % S D Sで 5 0 °C 1 5分間 1回それぞれ洗浄し、 風乾後、 一 8 0 °Cで 1 2〜 1 6時間オー トラ ジオグラフ ィ 一を行なった。
( 3 ) 解析結果と考察
抗高血圧薬であるデブリ ソキンを用いたヒ トにおける 代謝試験により L 0 1 Q代謝率 Metabo l i c ra t io
(MR) =未変化体/水酸化体代謝物 ： L o g 10MR > 1. 1を P Mと定義する〕 力く 1. 5 0を示した P Mとそ の両親及び E M (Extensive meiabolizer:以下 E Mと略 す） から、 それぞれ末梢血を採取し、 上記 （ 1 ) に従い ゲノ ム D N Aを調製した。
調製された各ゲノ ム D N Aにっき、 上記 （ 2 ) に従つ て制限酵素 E c o R I又は X b a lで処理し、 サザンブ ロ ッ ト分析を行なった。
その結果、 C Y P 2 D 6について E c 0 R I処理した P Mとその両親の試料の分析では、 1 6. 0、 9. 4及 び 8. 6 k bに共通してバン ドが確認された。
しかして、 C Y P 2 D 6について塩基配列の相同性が 非常に高い 2つのシユー ドジー ン C Y P 2 D 7及び C Y P 2 D 8が報告されており、 C Y P 2 D 6及びこれ らのそれぞれの E c 0 R I処理後のサザンブロ ッ 卜分析 によれば、 それぞれ 9. 4、 1 6. 0及び 8 . 6 k bに バン ドを与えることが知られている 〔前記 Kimu ra, S. 等 参照〕 。
また、 X b a I 処理後の上記各試料分析でも、 3人に 共通して 2 9 . 0、 4. 8 k bにそれぞれバン ドが認め られ、 P Mとその父親の試料では更に 1 1 . 5 k bにノ< ン ドが認められた。
上記 X b a I 処理後のサザンプロ ッ ト分析については、 従来より多数の検討がなされており、 4 4. 0、
2 9. 0、 1 1 . 5、 1 6. 0 + 9. O k b のバン ドに おいて遺伝子多型が示されている。 これらの報告によれ ば、 3つの C Y P 2 D遺伝子が 5 ' 側より C Y P 2 D 8、 C Y P 2 D 7、 C Y P 2 D 6 と位置すると 2 9. O k b に、 同 3つの遺伝子に更にもう 1つの C Y P 2 D 7が加 わり 5 ' 側より C Y P 2 D 8、 C Y P 2 D 7、 C Y P 2 D 7、 C Y P 2 D 6 と位置すると 4 4. O k bにそれぞ れバン ドが検出される。 また、 1 1 . 5 k bのバン ドは C Y P 2 D 6の完全欠損 （D型変異） であることを示し [ Johans son, ], , Y u e, Q. Y, , D a h 1 , . L. , H e i m, M. ,
Be r t i l s s on. L. , Meye r, 1). A. , S j o q v i s t , F . , and 1 n g e 1 m a n - S u n d b e r g, M. , Eur. J. Cl in. Pha rmaco l, , 40,
553 - 556 ( 1991 )〕 、 1 6. 0、 9. 0 k bのバン ドが同 時に認められると C Y P 2 D 7、 C Y P 2 D 6の間のゲ ノ ム D N Aの変異であることが報告されている。
これらのことから、 P Mは対立遺伝子の一方が C Y P—
2 D 6の完全欠損である D型変異であり、 それは父親か ら遺伝したものと考えられた。
参考例 2
P C R分析による C Y P 2 D 6遺伝子の変異の検索
( 1 ) プライマーの設定
C Y P 2 D 6遺伝子の A型変異と B型変異の検出のた めに、 C Y P 2 D 6遺伝子のこれら変異部位のみを特異 的に増幅するようにプライマーを設計し、 また A型変異 の判定用と して 3 ' 末端を変異部位に設定し、 1塩基の 差異で選択性を持たせた 2種類のプライマー （Α' — S W及び A' — S M) を設定した。
これら各プライマーの塩基配列とその存在位置を図 1 に示す。
( 2 ) プライマーの精製
上記 （ 1 ) で設計又は設定された各プライマ一の調製、 精製を次の通り行なった。 即ち、 2 9 %アンモニア水 3 m 1 で脱 ト リチル化して合成したォ リ ゴヌ ク レオチ ドを、 2 9 %ア ンモニア水 3 m 1 で レ ン ジから切り離した後、 6 0 °Cで 4時間イ ンキュベー ト した。 アンモニア水を蒸 発させた後、 得られたペレツ トを 2 0 1 のホルムア ミ ド色素に溶解させ、 この溶液を 1 0 0 °Cで 5分間加熱後、 2 0 %変性ァク リルア ミ ドゲルで電気泳動を行なった。 尚、 電気泳動用緩衝液には 1 X T B Eを使用 した。
上記泳動後、 ォ リ ゴヌ ク レオチ ドを含むゲル部分の位 置を U Vラ ンプ照射により確認後切り出し、 1 m l の シ リ ンジを用いて押出し粉砕した。 こ こ に S T E 5 m l を 加え、 ローテ一夕一でゆっ く り と回転させ 1 0〜 1 2時 間抽出した。 抽出液を 1 0 0 °Cで 1 0分間加熱した後、
3 0 0 0 r p mで 1 0分間遠心分離した。 上清を、 予め T E溶液で平衡化した D E A Eセフアデッ クス A— 5 0 カラムに通し、 オ リ ゴヌ ク レオチ ドを吸着させ、 1. 5 M塩化ナ ト リ ウム— 1 0 mM ト リ ス H C 1 ( p H 7. 5 ) 1 5 0 / 1、 0. I N水酸化ナ ト リ ウム一 I mM
E D T A 2 0 0 1、 1 0 mM ト リ ス H C 1 ( p H
7. 5 ) 5 0 // 1 を順にカラムに通して溶出させた。 尚、 ォ リ ゴヌ ク レオチ ド回収のためのチューブには予め 1 M ト リ ス H C 1 ( H 7. 5 ) を 5 0 ^/ 1 入れておき、 溶 出.液をすばやく 中和した。 この溶液をエタノ ール沈殿さ せ、 得られたオ リ ゴヌ ク レオチ ドを適量の精製水に溶解 させ、 2 6 0 n mの吸光度を計る こ とによ り定量した。 ( 3 ) P C R法によ り C Y P 2 D 6遺伝子の A型変異検 出のためのゲノ ム D N Aの増幅
P C R法を用いて C Y P 2 D 6遺伝子の A型変異 （ゲ ノ ム D N Aで 2 6 3 7番目のェク ソ ン 5における 1塩基 欠損） の部分を含むゲノ ム D.N Aの増幅を、 パーキンェ ルマーシータス （Perkin Elmer Ce s) 社の D N Aサー マルサイ ク ラ一 （DNA Thermal Cycler) を用いて以下の 通り行なつた （図 1参照） 。
即ち、 参考例 1の （ 1 ) で調製したゲノ ム D N A溶液 ( 5 0 n g / 1 ) 1 1 に、 精製水 1 7. 5 1、 5 mMデォキシ リ ボヌ ク レオチ ド 5 ' — ト リ フ ォ スフ エ一 ト （d N T P ) 溶液 1 // 1、 1 0 X P C R溶液 （ 1 0 mM) 2. Ι Ο μ Μセ ンスプライマー （A— S ) 1 1、 1 0 u Mア ンチセ ンスプライマー （A— A S ) 1 1 を加えて 5分間煮沸後、 3分間氷冷した。 これに T a q D N Aポ リ メ ラーゼ （ 1 UZ / 1 ) を加え て全量を 2 5 / 1 と し、 更に ミ ネラルオイルを当量重層 し、 9 4。C 1分、 5 5 °C 2分、 7 2 °C 2分を 1サイ クル と して、 2 5サイ ク ルの反応を行なっ た。
反応終了後、 ミ ネラルオイルを除き、 フ エ ノ ール抽出、 ク ロ 口ホルム抽出、 エタ ノ ール沈殿を順次行ない、 得ら れた D N A断片を T E 3 0 1 に溶解させた。
増幅した D Ν Α断片が C Y P 2 D 6であることの確認 は、 そのバン ド長 （ 7 5 7 b p ) と、 これを制限酵素 (A v a I、 P v u I I ) 処理して、 A v a I処理では 3 5 0、 2 0 4、 2 0 3 ゎ のバン ドが、 ？ 11 1 1処 理では 4 6 4、 2 9 5 b pのバン ドをそれぞれ観察する こ とにより行なっ た。
尚、 上記において、 C Y P 2 D 7が増幅すれば、
A v a l処理で 4 0 0、 3 5 0 b pのバン ドが、 C Y P 2 D 8が増幅すれば、 P v u l I処理で 4 3 1、 1 4 6. 9 0、 7 0、 2 7 b pのバン ドが観察されるため、 これ らと上記 C Y P 2 D 6とは明確に区別できる。
( 4 ) C Y P 2 D 6遺伝子の A型変異の判定
3 ' 末端の 1塩基のみが異なるセ ンスプライマ一 2種 類 （Α' — SW、 A' — S M) と、 上記 （ 3 ) で用いた ア ンチセ ンスプライマー （A— A S) とを組み合わせ用 い、 また上記 （ 3 ) で調製した試料溶液を用いて、
C Y P 2 D 6遺伝子 A型変異の判定を以下の通り行なつ
7«** o ，
即ち、 （ 3 ) で調製した試料溶液 1 1 に、 精製水 1 7. 5 m M d N T P溶液 1 1 、 1 0 x
P C R溶液 （ 7. 5 mM) 2. 5 // 1、 判定用の 1 0 M セ ンスプライ マ一 （Α' — S W又は A' — S M) l / l 、 1 0 Mアンチセンスプライマ一 （A— A S ) 1 1 を加 えて 5分間煮沸後、 3分間氷冷した。 T a q D N Aポ リ メ ラ一ゼ （ 1 UZ/ 1 ) 1 1 を加えて全量を 2 5 ^ 1 と し、 更にミ ネラルオイルを当量重層し、 9 4 °C 1分、 5 5 °C 1分、 7 2 °C 1分を 1サイ クルと して 2 5サイ ク ルの反応を行なった。 反応終了後、 ミ ネラルオイルを除 き、 0. 0 2 %ェチデュームブロ ミ ド （E t B r ) を含 む 1. 5 %ァガロースゲルを用いて電気泳動後、 判定を 行なった。
3 ' 末端の 1塩基のみが異なるセンスプライマ一の内、 Α' 一 SWは野生株のみを、 ' — S Mは A犁変異のみ をそれぞれ特異的に増幅させるものであるため、 A' — S W側にのみ 4 5 1 b pのバン ドが観察されると野生型、 A ' 一 S W、 A ' — S M側の両方に 4 5 1 b p のバン ド が観察されるとヘテロの A型変異、 A' S M側のみ
4 5 1 b pのバン ドが観察されるとホモの A型変異と、 それぞれ判定できる。
この結果、 P Mとその両親ともに野生型を示す A' - S W側のみに 4 5 1 b pのバン ドが認められ、 A型変異 ではないことが確認された。
( 5 ) P C R法による C Y P 2 D 6遺伝子の B型変異検 出のためのゲノ 厶 D N Aの増幅
セ ンスプライマーと して （ B— S) を、 ア ンチセ ンス プライマーと して （B— A S) をそれぞれ用いて、 上記 ( 3 ) に準じて C Y P 2 D 6遺伝子の B型変異 （ゲノ ム D N Aで 1 9 3 4番目のェク ソ ン 4におけるェク ソ ン一 イ ン トロ ン接合部位の 1塩基置換） の部分を含むゲノ ム D N Aの増幅を行なった。
増幅した D N A断片が C Y P 2 D 6であることの確認 は、 そのバン ド長 （ 5 ' 3 b p ) と、 これを制限酵素
(A v a l ) 処理して、 3 1 1、 1 4 6、 7 6 b pのノく' ン ドをそれぞれ観察するこ とにより行なった。 上記にお いて、 C Y P 2 D 7、 C Y P 2 D 8が増幅すれば、
A v a l処理で 4 5 7、 7 6 b pのバン ドが観察される ため、 これらと上記 C Y P 2 D 6 とは明確に区別できる。
( 6 ) C Y P 2 D 6遺伝子の B型変異の判定
C Y P 2 D 6遺伝子の B型変異は、 ェク ソ ン 4におけ るェク ソ ン—イ ン ト ロ ン接合部位の 1塩基置換の制限酵 素 M V a I の認識酵素の消失を利用して判定できる。
即ち、 上記 （ 5 ) で調製した試料溶液 1 0 1 に、 1 0 X M溶液 2 u l 、 M v a I ( 1 0 UZ i l ) 2 z l 、 精製水 6 1 を加えて全量を 2 0 // 1 と し、 3 7 °C 2時 間イ ンキュベー ト後、 2 %ァガロースゲルを用いて電気 泳動を行なつた。
2 7 9 b pのバン ドが観察されると野生型、 3 8 4、
2 7 9 b pのバン ドが観察されるとヘテロの B型変異、
3 8 4 b pのバン ドが観察される とホモの B型変異と判 定できる。
この結果、 P Mとその両親ともに 2 7 9 b pのバン ド が認められ、 B型変異ではないことが確認された。
実施例 1
P Mにおける C Y P 2 D 6遺伝子の塩基配列の解析
( 1 ) プライマーの設定及び精製
C Y P 2 D 6遺伝子のすべてのェク ソ ン、 ェク ソ ン一 ィ ン ト ロ ン接合部位を 4ケ所に別けてそれぞれ特異的に 増幅するようにプライマーを設定し、 参考例 2 と同様に して各プライマーを精製し、 これらを用いて以下の P C R法にて各フラグメ ン トを増幅させた。
設定したプライマーの塩基配列、 C Y P 2 D 6の対応 位置及び得られる各フラグメ ン 卜の概略を図 2に示す。 尚、 上記で利用するェク ソ ン 2〜 4の部位を増幅させる ためのア ンチセ ンスプラ イ マ一 （B— A S ) 、 ェク ソ ン 5〜 6の部位を增幅させるセ ンスプライマ一 （A— S ) 及びアンチセンスプライマ一 （A— A S ) は、 それぞれ 参考例 2で作成したものと同一のものを使用 した。 ( 2 ) P C R法による C Y P 2 D 6遺伝子のェク ソ ン及 びェク ソ ン一イ ン ト ロ ン接合部位の増幅
P C R法を用いて C Y P 2 D 6遺伝子のェク ソ ン及び ェク ソ ンーィ ン ト口 ン接合部位を含むゲノ ム D N Aを次 の通り増幅させた。
即ち、 参考例 1で調製したゲノ ム D N A溶液 （ 5 0 n g / 1 ) 1 / 1 に、 精製水 1 7. 5 1 5 m M d N T P溶液 l z l 、 1 0 x P C R溶液 （ 1 0 mM) 2. 5 / 1 、 1 0 Mセ ンスプライマー 1 / 1 、 1 0 u Mアンチセ ンスプライマー 1 〃 1 を加えて 5分間煮沸 後、 3分間氷冷した。 これに T a q D N Aポ リ メ ラ一ゼ ( 1 U ^ 1 ) 1 1 を加えて全量を 2 5 1 と し、 更 に ミ ネラルオイルを当量重層し、 9 4 °C 1分、 F 1では 5 3 °C、 F 2では 4 8 ° (、 F 3では 5 5。 (、 F 4では 5 0 °Cでそれぞれ 2分、 7 2 °C 2分を 1サイ クルと して、 2 5サイ クルの反応を行なった。 反応終了後、 ミ ネラル オイルを除き、 フヱノ ール抽出、 クロ口ホルム抽出、 ェ タノール沈殿を順次行ない、 得られた各 D N A断片を T E 2 0 1 に溶解させた。
増幅した各 D N A断片が C Y P 2 D 6由来のものであ ることは、 バン ド長と、 適当な制限酵素 （ F 1 ：
H h a l 、 F 2 : A v a I 、 F 3 : A v a I 、 P v u l I 、 F 4 : S t y I ) 処理によるバン ドの観察により確 π、し 3 o
( 3 ) ブルースク リ プ トベクタ一へのサブクローニング 上記 （ 2 ) で得た C Y P 2 D 6 の各 D N A断片 （F 1 〜 F 4 ) の平滑末端化を次の通り実施した。
即ち、 それぞれ 5 0 0 n g相当を T E 2 0 // 1 に溶解 し、 2 m M d N T P 8 / l 、 T 4 D N Aポ リ メ ラーゼ 1 μ I ^ 1 0 X T 4 D N Aポリ メ ラ一ゼ緩衝液 （ ρ Η 8 . 8 ) 4 // 1 、 精製水 を加え全量 4 0 μ 1 と し、 3 7 °C、 1 5分間反応を行なった。 精製水を加えて全量 を 2 0 0 // 1 にした後 フ エノ ール抽出 2回、 ク ロロホ ルム抽出 1回を行ない > 得られた上清に 3 M酢酸ナ ト リ ゥ ム （ p H 5. 6 ) 溶液 1 5 t l と冷エタ ノ ール 3 7 5 〃 1 を加え、 — 8 0 °Cに冷却後、 1 2 0 0 0 r p m、 4 °Cで 2 0分間遠心分離し、 沈殿を 7 0 %エタ ノ ールで洗 浄後乾燥した。
上記 P C R産物の 5 ' 末端にはリ ン酸基がつかないた め、 リ ン酸化を次の通り実施した。 即ち、 平滑末端化し た D N A断片にデナチユ レ一シ ヨ ン緩衝液 （ p H 9 . 5 ) 7 5 1 を加え、 2分間煮沸後、 氷中に 2分間放置した。 アデノ シ ン ト リ フ ォ スフ ェ ー ト （ A T P、 5 0 ピコモル / p. \ ) l /z l 、 1 0 Xブラ ン 卜エ ン ド緩衝液 1 0 ^ 1、 精製水 1 2 ^ 1 、 T 4ポ リ ヌ ク レオチ ドキナーゼ （ 1 1 U//〃 l ) 2 μ 1 を加えて計 1 0 0 〃 1 と し、 3 7 °C、 1時間反応を行なった。 精製水を加えて全量を 2 0 0 /ti l 〖こした後、 フエノ ール抽出 2回、 クロ口ホルム抽出 1回を行ない、 得られた上清に 3 M酢酸ナ ト リ ウム ( P H 5. 6) 溶液 1 5 X 1 と冷エタノ ール 3 7 5 〃 1 を加え、 一 8 0 °Cに冷却後、 1 2 0 0 0 r p m、 4でで 2 0分間遠心分離し、 沈殿を 7 0 %エタノ ールで洗浄し た。 沈殿を乾燥させた後、 1 0 // 1 の精製水に溶解させ るこ とにより、 挿入フラグメ ン トをそれぞれ調製した。
ブル一スク リ プ トベクター を H i n c l I で処 理後、 1 M ト リ ス H C 1 ( H 8. 0 ) 4 7 / アル カ リ ホスファタ一ゼ （ 0.
Figure imgf000029_0001
}を加え、 全量を 5 2 ^ 1 と した後、 6 5 °C、 3 0分間反応させた 精製水を加えて全量を 2 0 0 1 にした後、 フヱノ ール 抽出を 3回、 ク ロ口ホルム抽出を 1回行なった。 この上 清に、 3 Μ酢酸ナ ト リ ウム （ρ Η 5. 6 ) 溶液 1 5 μ 1 と冷エタノ ール 3 7 5 / l を加え、 一 8 0 °Cに冷却後、 1 2 0 0 0 r p m、 4 °Cで 2 0分間遠心分離し、 沈殿を 7 0 %エタノ ールで洗浄し、 沈殿を乾燥させた後、 2 0 1 の Τ Εに溶解し、 ベク タ一側の脱リ ン酸化を行なつ た。 C Y P 2 D 6のェク ソ ン及びェク ソ ン一イ ン ト ロ ン接 合部位を含んだフラグメ ン ト 1 0 0 n gと、 ブルースク リ ブ 卜ベクター 1 0 n gとを混合し、 ライゲ一シヨ ンを 行なった。 連結反応終了後の D N A溶液にコ ン ビテン ト セル懸濁液 3 0 0 〃 1 を加え、 氷中に 2 0分間放置した。 これに 4 2 °C、 2分間のヒー ト ショ ッ クを与えた後、 1 m 1 の B溶液を加えて 1時間ィ ンキュベ一 ト した。 3 0 0 0 r p m、 4 °Cで 3分間遠心分離し、 上清 l m 1 を除き、 再度懸濁させた後、 L B培地に播き、 3 7 °Cで 一晩培養して、 形質転換体を得た。
尚、 宿主大腸菌と しては、 T G 1を用い、 上記コ ン ビ テン トセルは以下の方法により作製した。
大腸菌の一夜培養液 2 m 1 を 2 0 0 m 1 の B培地に 植え、 6 5 0 n mにおける吸光度が 0. 6付近になるま で 3 7 °Cで培養した。 これを氷水中で 3 0分間冷却後、 集菌し、 1 0 0 m l の 5 0 mM塩化カルシウムに懸濁さ せた。 1 5分間ゆつ く り転倒攪拌しながら氷中に ί時間 放置した後、 再度集菌し。 2 0 m 1 の 5 O mM塩化カル シゥム一 2 0 %グリセロールに懸濁させた。 これを、 3 1 0 1 ずつ分注し、 液体窒素でただちに凍結後、 — 8 0 °Cで保存した。 なお、 集菌以降の操作はすべて低 温室 （ 4 °C ) で行なった。 ( 4 ) 二本鎖 D N Aの少量調製
得られた形質転換体のコロニーを回収し L B A m p + 培地 3 m l で培養した。 この培養液を遠心分離して菌体 を回収し、 プラス ミ ド D N Aに少量調製を以下の方法に 従って行なった。
即ち、 先の培養液の 1. 5 m l をチューブにうつし、 5 0 0 0 r p m、 5分間遠心分離後、 沈殿の菌体を回収 し、 1 0 mM E D T A溶液 2 0 0 μ 1 に懸濁させた後、 1 % S D S - 0. 1 M水酸化ナ ト リ ウム溶液 4 0 0 z l を加え、 氷中に 5分間放置した。 5 M酢酸カ リ ウム の 2 0 0 / 1 を加えて 5分間氷冷し、 1 3 0 0 0 r p m で 5分間遠心分離した。 この上清を別のチューブに移し、 イ ソプロパノ ール 7 0 0 μ 1 を加えた。 これを
1 3 0 0 0 r p m、 4 °Cで 5分間遠心分離し、 得られた 沈殿を 2 0 mM ト リ ス H C 1 ( H 7. 5 ) / 1 0 m M E D T A溶液 1 1 で懸濁させた後、 R N a s e I ( l O m g Zm l ) を加えて 6 5 °Cで 1 5分間ィ ンキュペー ト した。 フヱノ ール抽出、 ク ロ口ホルム抽出 を行なつた後、 3 M酢酸ナ ト リ ウム （ p H 5. 6 ) 1 2 tz l と冷エタノ ール 2 2 4 // 1 を加え、 一 8 0 °Cに冷却 後、 1 3 0 0 0 r p m、 4 °Cで 1 0分間遠心分離し、 沈 殿を 7 0 %エタノ ールで洗浄した。 沈殿を乾燥させた後、 2 0 μ 1 の T Eに溶解した。 回収したプラス ミ ドをべク 夕一のマルチク ロ一ニングサイ 卜及び組込んだ D N A断 片の制限酵素地図より選んだ制限酵素で処理後、 ァガロ ースゲル電気泳動することにより、 それぞれ目的の
D N A断片が挿入されていることを確認した。
( 5 ) M l 3ベクターへのサブク ローニング
組込んだ D N A断片のプラス ミ ド内での方向性を、 ベ クタ一のマルチク ローニングサイ ト及び及び組込んだ D N A断片の制限酵素地図より選んだ制限酵素で処理を 行ない、 確認した。
ベクターのマルチク ローニング部位にのみに認識部位 をもつ 2種類の制限酵素 （E c o R I 及び B a m H I ) で処理して回収したフラグメ ン トを、 これらフラグメ ン ト と同様に処理した M 1 3ベクタ一に挿入し、 ライゲ一 シヨ ンを行なった。 連結反応終了後の D N A溶液
( 1 0 0 n g ) 3 0 / 1 にコ ン ビテン トセル懸濁液
3 0 0 / 1 を加え、 4 0分間氷中に放置した。 4 2 °C、 2分間のヒー ト ショ ッ ク後、 H上層寒天 3 m l 、 大腸菌 一夜培養液 2 0 0 \ を混合し、 Η寒天培地上に播き、 3 7 °Cで一晚培養して形質転換体を得た。 尚、 宿主大腸 菌には J M 1 0 3 を用いた。 こ こでコ ン ビテン トセルは、 上記 （ 4 ) に示した方法に従い作製した。 ( 6 ) フ ァ ージ一本鎖 D N Aの調製
フ ァ ージ一本鎖 D N Aの調製を以下の方法で行なった c 即ち、 形質転換体のプラークを回収し、 2 X T Y培地 3 m 1 中で 6時間培養した。 この培養液 1. 5 m l を
1 5 0 0 0 r p m. 5分間、 2回遠心分離して上清を回 _ 収した。 先の上清 1. 3 m 1 に 2 0 %ポリエチレングリ コール （P E G) — 2. 5 M塩化ナ ト リ ウム 2 0 0 / 1 を加え、 室温で 1 5分間放置した後、 1 5 0 0 0 r p m、 5分間遠心分離し、 フ ァージ D N Aを沈殿させた。 更に、 1 5 0 0 0 r p m. 2分間遠心分離し、 上清を完全に取 り除き、 沈殿を Τ Ε 2 0 0 μ 1 に溶解させ、 フヱノ ール 1 0 0 u 1 を加え攪拌後、 室温で 1 5分間放置した。 更 にクロ口ホルム 1 0 0 1 を加えて同様の操作を行なつ た。 1 0 0 0 0 r p m、 5分間遠心分離し、 上清 1 5 0 // 1 を取り、 3 M酢酸ナ ト リ ウム （p H 5. 6 ) 溶液 1 5 // 1 と冷ェタノ 一ル 3 7 5 // 1 を加ぇ、 一 8 0 °Cに 冷却後、 エタノ ール沈殿を行なった。 1 2 0 0 0 r p m. 4 °Cで 2 0分間遠心分離を行ない、 沈殿を 7 0 %ェタノ —ルで洗浄した。 沈殿を乾燥させた後、 2 0 1 の Τ Ε に溶解し、 一本鎖 D N Aを回収した。 ァガロースゲル電 気泳動を行ない、 フラグメ ン トの入っていない Μ 1 3ベ ク タ一より調製した一本鎖 D Ν Αを対照と して、 移動度 の小さいバン ドが検出されることを利用して、 目的の
D N A断片が挿入されていることを確認した。
( 7 ) C Y P 2 D 6遺伝子のェク ソ ン及びェク ソ ン一ィ ン ト ロ ン接合部位の塩基配列の解析
上記 （ 6 ) で得られた一本鎖 D N Aを用いて、 塩基配 列の解析を文献記載の方法 〔Sange r, F.， Mik l en, S. and
Cou 1 s on, A. R. , P r o c. N a t 1. A c a d. S c i . , U. S. A. , 74, 5463 - 5467 (1977 )〕 に従い、 以下の通り実施した。 尚、 シーク ェ ンス反応は、 S e q u e n a s e 1 λι V E R . 2 . 0 に添 付されているマニュアルに従って行なった。
即ちまず、 铸型 D N A 7 // 1 ( 7 0 0 n g ) とプライ マー （ 1 ピコモル 1 // 1 、 5 x アニー リ ング緩 衝液 （ p H 7 . 5 ) 2 1 を混合し、 6 5でで 2分間加 熱後、 徐々に冷却するこ とによりプライマ一を鍀型
D N Aにァニールさせた。 次に、 0. 1 M D T T 1
1 、 ラベ リ ング ミ ッ ク ス 2. 0 / 1 、 〔 一 33 Ρ〕 デ ォキシアデノ シ ン 5 ' — ト リ フ ォ スフ ェー ト （ d A T P ) 0. 5 / 1 、 8倍希釈した Sequenase 2 ^ 1 を加え、 室 温で 2〜 5分間イ ンキュベー ト した。 その間、 4種のジ デォキシ N T Pを含む反応停止液を 2. 5 ^ 1 ずつ分注 し、 3 7 °Cでプレイ ンキュベー シ ョ ン した。 反応終了後、 反応混合液を 3. 5 / 1 ずつ各停止液の中に加え、 更に 3 7 °Cで 5分間イ ンキュベー ト した。 ホルムア ミ ド色素 液 4 1 を加え、 2分間煮沸した後、 ゲルへ添着した。 ゲルは 6 0 c mのガラス板を用い、 ゲル厚 0. 4 mmの ショ糖濃度勾配ゲルを作製した。 ゲル A溶液 4 0 m 1 、 ゲル B溶液 1 5 m 1 に対して、 2 0 % N , N， N ' ， N' —テ トラメ チルエチ レ ンジァ ミ ン （T E M E D) と 1 0 %アンモニゥムパ—サルフエ一 卜 （A P S ) をそれ ぞれ 3 2 1及び 9 / 1加えた後、 ディ スポ一ザブルの 5 0 m 1 シ リ ンジを使 してゲル A溶液、 ゲル B溶液の 順に吸い、 気泡を 2〜 3個吸入するこ とで穏やかに攪拌 し、 ガラスプレー トの中に注入した。 残りのスペースに は、 上層ゲルを満たし 。 電気泳動は、 1 X T B Eを用 い、 2 5 0 0〜 3 0 0 ΰ Vの定電圧で 2〜 7時間行なつ た。 泳動後、 ゲルを 1 () %酢酸一 1 0 %メ タノ ールに 1 5分間浸漬して D Ν Αを固定し、 ゲル ドライヤーで吸 引 しながら乾燥させ、 — 8 0 °Cで一晩 X線フ ィ ルムを露 光させた。
( 8 ) 解析結果と考察
P Mの各ェク ソ ン及びェク ソ ンーィ ン ト 口 ン接合部位 の塩基配列の解析を行なった結果、 ェク ソ ン 9
( 4 2 1 3 b ) において T C A C C C G Tの 9塩基 (4 2 1 3〜 4 2 2 2 b p ) の繰返し配列によるィ ンサ —ショ ンを確認した （図 3 ) 。
このイ ンサー シ ヨ ンによ り 3ア ミ ノ酸 （バ リ ン、 プロ リ ン、 ト レォニ ン） の挿入が考えられた。 またこの位置 は、 薬物酸化反応において重要な鉄との結合部位であり ヘム蛋白である P 4 5 0において重要な働きを担ってい る、 ヘム結合領域 （H R— 2領域） の直後であった。
P Mにおいては、 このイ ンサーシ ヨ ンによる 3ア ミ ノ酸 の挿入が代謝活性に対してなんらかの影響を与え、 代謝 能が著しく低下したもの と推測された。
C Y P 2 D 6遺伝子の上記変異は、 今までに報告のな い新しい型の変異であり、 この変異が P Mの原因と考え られた。
実施例 2
C Y P 2 D 6遺伝子新規変異の検出 （P C R— R F L P ) ( 1 ) プライマーの設定及び精製
新規な変異の部位であるェク ソ ン 9のィ ンサー シ ョ ン 部位を含み、 且つ C Y P 2 D 6のみ特異的に増幅するよ うに、 セ ンスプライマーを設定した。 アンチセ ンスブラ イマ一は実施例 1で作成したもの （ 9— A S ) と同一の ものである。 設定されたプライマーの塩基配列とその位 置を図 4に示す。
参考例 2 と同様にして各プライマ一を精製し、 これら を用いて以下の P C R法にてェク ソ ン 9のゲノ ム D N A を増幅させた。
( 2 ) P C R法による C Y P 2 D 6遣伝子のェク ソ ン 9 の増幅
前記参考例 1で調製したゲノ ム D N A溶液 （ 5 0 n g / β \ ) 1 1 に、 精製水 1 7. 5 / 1、 5 mM d N T P溶液 1 ^ 1、 1 0 X P C R溶液 〔この例のみ 2 0 0 mM ト リ ス H C 1 ( p H 8. 4 ) 、 2 5 0 mM塩 化カ リ ウム、 0. 5 %ツイ ーン 2 0、 l m g Zm l ゼラ チ ン、 1 0 mM塩化マグネシウムの組成と した〕 2. 5 μ 1 、 1 0 Μセ ンスプライマー （ 9 — S ) 1 〃 1、 Ι Ο μ Μア ンチセ ンスプライマー （ 9 一 A S ) 1 /z l を 加えて 5分間煮沸後、 3分間氷冷した。 これに
T a q D N Aポ リ メ ラーゼ （ l U c 1 ) 1 fi 1 を加え て全量を 2 5 /2 1 と し、 更に ミ ネラルオイルを当量重層 し、 9 4 °C 1分、 5 5。C 1分、 7 2 °C 2分を 1サイ クル と して、 2 5サイ ク ルの反応を行なった。
反応終了後、 ミ ネラルオイ ルを除き、 フ エ ノ ール抽出 ク ロ 口ホルム抽出、 エタ ノ ール沈殿を順次行ない、 得ら れた各 D N A断片を T E 2 0 1 に溶解させた。
増幅した D N A断片が C Y P 2 D 6由来のものである こ とは、 バン ド長 （ 3 3 4 b p ) と、 制限酵素 （ S t y I、 A s p 7 1 8 ) 処理し、 S t y l 処理で 2 5 7、 7 7 b pのバン ドが、 A s p 7 1 8処理で 1 8 9、
1 4 5 b pのバン ドがそれぞれ観察されるこ とにより確 認された。 この時、 C Y P 2 D 7が増幅すると S t y l 処理で 3 3 1 b pのバン ドが、 C Y P 2 D 8が増幅する.— と A s p 7 1 8処理で 3 2 0 b pのバン ドが観察され、 これらと明確に区別できる。
( 3 ) P C R産物の制限酵素処理による C Y P 2 D 6遺 伝子のェク ソ ン 9のィ ンサ一ショ ンの判定
上記 （ 2 ) で増幅した D N A断片を制限酵素 S t y I で処理し、 そのバン ド長で判定を行なった （図 5 ) 。
即ち、 （ 2 ) で調製した試料溶液 1 0 1 に 1 0 X H 溶液 2 μ 1、 S t y l ( 1 0 \] / β 1 ) 2 // 1 、 精製水 6 / 1 を加えて全量を 2 0 〃 1 と し、 3 7 °Cで 2時間ィ ンキュペー ト した。 反応終了後、 フ ヱ ノ ール抽出、 ク ロ 口ホルム抽出、 エタ ノ ール沈殿を順に行ない、 D N A断 片を T E 5 // 1 に溶かした。 1 0 %アク リルア ミ ドゲル を用いて電気泳動を行なつて、 7 7 b pのバン ドが観察 されると野生型と、 7 7 b p及び 8 6 b pのバン ドが観 察されるとへテロの変異型と、 また 8 8 6 b pのバン ド が観察されるとホモの変異型とそれぞれ判定した
(図 6 ) 。 ( 4 ) 結果と考察
P Mとその両親における、 上記 C Y P 2 D 6遺伝子の 新規変異の検出の結果を図 7に示す。 P Mとその母親 (図中 M P ) において 8 6 b pのバン ドが認められ、 本 発明にかかる変異 （イ ンサ一シヨ ン） が確認された。 P Mにおけるこの変異は母親より遺伝したこ とが明らか となった。 尚、 図中 F Pは P Mの父親を示し、 図には E Mの結果も併記されている。
以上の結果より、 本発明にかかる C Y P 2 D 6遺伝子 の新規変異の検出は P Mの遺伝子診断に有用であるこ と が明らかである。
産業上の利用可能性
本発明によれば、 C Y P 2 D 6の遺伝子の新規な変異 が明らかにされ、 かかる変異を有する C Y P 2 D 6の新 規遺伝子多型の検出方法が提供される。
該 C Y P 2 D 6遺伝子多型の検出によれば、 P Mの遺 伝子診断が可能であり、 殊に既知の C Y P 2 D 6遺伝子 多型に起因しない P Mの診断が可能となるこ とで、 各種 薬物による副作用発見の診断、 予知、 原因究明等を行な う上で極めて有用である。

Claims

請 求 の 範 囲
ヒ ト チ 卜 ク ローム P 4 5 0 2 D 6遺伝子のェク ソ ン 9において、 T C A C C C G T Gの 9塩基の繰返 し配 列によるィ ンサーシ ョ ンの存在を検出する こ とを特徵 とする ヒ 卜チ ト ク ローム P 4 5 0 2 D 6遺伝子多型の 検出方法。
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