WO1995025524A1 - UTILISATION DU GINSENOSIDE Ro OU D'UN EXTRAIT VEGETAL EN CONTENANT POUR STIMULER LA SYNTHESE DU COLLAGENE - Google Patents

UTILISATION DU GINSENOSIDE Ro OU D'UN EXTRAIT VEGETAL EN CONTENANT POUR STIMULER LA SYNTHESE DU COLLAGENE Download PDF

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WO1995025524A1
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collagen
ginsenoside
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Marc Dumas
Catherine Chaudagne
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    • A61Q19/08—Anti-ageing preparations

Definitions

  • the Panax come essentially from three countries: - Japan
  • the root part is the most frequently used and generally the most active.
  • the highest saponin content is observed in the tip of the root (ninjin, in Japanese) and in the rootlets (hairy roots; keninjin, in Japanese).
  • the saponins most frequently encountered in plants of the Panax family are of the damarane type.
  • saponin ginsenoside R 0 or Chikusetsusaponine V there is a particular saponin ginsenoside R 0 or Chikusetsusaponine V, with oleanane structure, corresponding to the formula below:
  • Chikusetsu Ninjin In Japan, P. japonicus is also known as Chikusetsu Ninjin.
  • the structure of Chikusetsusaponin V was described in 1971 by: KONDO N., MARUMOTO Y., SHOJI J., Studies on the constituents of Panacis Japonici Rhizoma. IV
  • type I collagen represents 80 to 90% of the total skin collagen, the rest consisting mainly of type III collagen, that is to say approximately 10 to 15% of the total skin collagen.
  • Type I and type III collagens are very closely associated to form fibers within the dermis (BOREL JP, MONBOISSE JC, CRSoc. Biol. (1993), 187, 124-142; LAPIERE CM., Br. J. Dermatol. (1990), 122, 5-11).
  • the fall in the level of cutaneous collagens I and III can also be induced by therapeutic treatments, such as the topical application of glucocorticoids (OIKARINEN A., AUTIO P., KIISTALA U., RISTELLI L., RISTELI J., J. Invest. Dermatol., (1992), 98, 220-225).
  • glucocorticoids OIKARINEN A., AUTIO P., KIISTALA U., RISTELLI L., RISTELI J., J. Invest. Dermatol., (1992), 98, 220-225.
  • the main object of the present invention is therefore to solve the technical problem consisting in the supply of a new formulation of a cosmetic or pharmaceutical composition, especially a dermatological composition, having good efficacy in preventing or treating the effects of skin aging, as well as on skin firming, or to improve healing.
  • the present invention relates to the use of ginsenoside R 0 or a plant extract containing it for the preparation of a cosmetic or pharmaceutical composition, in particular dermatological, intended for stimulating the synthesis of collagen, in particular collagen I and / or collagen III.
  • a cosmetic or pharmaceutical composition in particular dermatological, intended for stimulating the synthesis of collagen, in particular collagen I and / or collagen III.
  • the above composition is intended to prevent or treat the effects of skin aging, whether of actinic or spontaneous (chronological) origin.
  • the above composition is intended to promote the formation of skin support tissues.
  • the composition is intended for firming the skin.
  • the composition is intended for the healing of skin wounds.
  • this plant extract is preferably obtained from Japanese Panax japonicus, Chinese Panax japonicus, Panax japonicus var. Mayor, from Panax japonicus var. Angustifolius, preferably from the roots of these plants.
  • the abovementioned extract is obtained by extraction using a polar solvent at reflux such as methanol, from the roots.
  • the cosmetic composition which can be used according to the invention is intended to stimulate the synthesis of collagen, in particular that of collagen I and / or collagen III and contains, as active ingredient, a cosmetically effective amount of ginsenoside R 0 or a plant extract containing it.
  • composition is intended in particular to promote the synthesis of skin support tissues, to firm the skin and to heal skin wounds. It is therefore particularly intended to combat the effects of skin aging or to obtain skin firming.
  • concentrations of ginsenosides R 0 of between 0.001 and 5% by weight relative to the total weight of said composition.
  • This concentration will preferably be between 0.001 and 1% by weight relative to the total weight of said composition.
  • the composition according to the invention will also contain an extract of Centella asiatica, Asian acid, Madecassic acid or Asiaticoside.
  • ginsenoside R 0 or of a plant extract containing it is carried out according to conventional methods allowing both the stimulation of the synthesis of collagen.
  • the simplest route of administration is the topical route, especially when looking for the synthesis of skin support tissues, skin tightening and repair of skin injuries.
  • ginsenoside R 0 or a plant extract containing it is incorporated in an excipient, vehicle or carrier cosmetically or pharmaceutically, in particular dermatologically, acceptable.
  • Such supports are well known to those skilled in the art and also result from examples of cosmetic compositions or pharmaceutical, especially dermatological compositions, described below, which are general in scope.
  • the invention relates to the use of ginsenoside R 0 or a plant extract containing it as an agent intended to stimulate the synthesis of collagen I and / or collagen III.
  • ginsenoside R 0 or a plant extract containing it as a constituent of a culture medium intended to improve the synthesis of collagen I and / or collagen III in a culture of fibroblasts.
  • This agent can be used in any fibroblast culture medium, in particular in a medium where the fibroblasts are included in a matrix, for example in a polymer matrix.
  • the invention also relates to a process for stimulating the synthesis of collagen I and / or collagen III consisting in introducing ginsenoside R 0 or a plant extract containing it into a fibroblast culture medium.
  • 0.001 to 0.1% of ginsenoside R 0 is preferably introduced into a medium below designated by E 199-C, obtained by introduction of L-glutamine at a concentration of 2 mM / l into an E199 medium marketed. by the company GIBCO.
  • the plant extracts containing the ginsenoside R 0 described above can also be used for the preparation of the culture media above.
  • Roots of Panax japonicus CA are used. Meyer.
  • the residue is reextracted in the soxhlet with 130 ml of methanol for 20 h.
  • the 130 ml of methanol are concentrated in vacuo on a rotary evaporator so as to reduce the volume to 45 ml.
  • the solution obtained is thrown into 500 ml of anhydrous acetone.
  • the beige precipitate obtained is separated by filtration, washed with anhydrous acetone and dried in an oven at 45 ° C.
  • Collagen I synthesis is measured with and without treatment on a culture of fibroblasts from a facelift of a 50-year-old woman, using an ELISA method.
  • Fibroblast cultures
  • the fibroblasts are cultured by the explant method until con ⁇ fluence, at 37 ° C., in a medium consisting of a mixture of medium E 199-C and 10% of fetal calf serum, in an atmosphere saturated with humidity with 5% CO 2 .
  • the cells are seeded in 96-well microplates (FALCON) at 10 ⁇ cells per well in medium E 199-C containing 2% serum. After 24 h, this medium is replaced, for a 48 h incubation, by the same medium without serum containing 25 ⁇ M of sodium ascorbate (incubation medium) with or without the products to be tested.
  • the products solubilized in DMSO are added to the culture medium at different concentrations.
  • the amounts of collagen secreted (mean ⁇ standard deviation) by the treated and untreated cells are compared with a Student's t test.
  • the threshold of 0.05 is taken as the level of significance.
  • viability is checked by an M.T.T.
  • the medium is removed and an M.T.T. is realised.
  • the cells are incubated with 100 ⁇ ⁇ of a 0.5 mg / ml solution of a tetrazolium salt in E 199-C medium without phenol red for 3 h at 37 ° C. Then, 100 ⁇ ⁇ Isopropanol are added to each well to dissolve the blue Formazan derivative formed by the mitochondrial succinates dehydrogenases of living cells. The optical density of this solubilized derivative formed is measured at 540 nm.
  • the protocol is the same as that described with collagen I except that the ELISA assay is directed against collagen III (Human) and that the duration of treatment of the cultures is 72 h instead of 48 h with collagen I.
  • Cosmetic composition promoting the formation of skin support tissues
  • Centella asiatica extract 0.4 g
  • a powder composed of complex solid particles is prepared by following the process described in French patent FR 2 685 635. This powder has the following composition by weight: - Nylon powder (support particle, consisting of particles with an average diameter of about 20 ⁇ m): 97
  • Culture medium promoting the production of collagen by fibroblasts The medium comprises:

Abstract

Selon l'invention, on utilise du ginsénoside Ro ou un extrait végétal en contenant pour la préparation d'une composition cosmétique ou pharmaceutique, notamment dermatologique, destinée à la stimulation de la synthèse du collagène, en particulier du collagène I et/ou du collagène III. Cette composition cosmétique ou pharmaceutique est administrée à un mammifère, en particulier un être humain, pour la stimulation de la synthèse du collagène. L'invention concerne également un procédé pour stimuler la synthèse du collagène dans les milieux de cultures de fibroblastes.

Description

Utilisation du ginsenoside Rg ou d'un extrait végétal en contenant pour stimuler la synthèse du collagène.
L'invention concerne l'utilisation du ginsenoside RQ et d'extraits végé¬ taux en contenant pour la préparation de compositions cosmétiques ou phaπna- ceutiques, notamment dermatologiques destinées à la stimulation de la synthèse du collagène, en particulier du collagène I et du collagène m. Elle concerne égale¬ ment des milieux de culture de fibroblastes contenant le ginsenoside RQ OU des extraits végétaux en contenant.
La famille des Panax est connue par ses nombreuses variétés dont les plus connues sont :
- Panax ginseng (C A. Meyer) qui est le plus fréquemment utilisé pour ses vertus médicales,
- Panax notoginseng,
- Panax pseudo-ginseng (subsp. himalaicus), - Panax japonicus (var. major ; var. angustifolius),
- Panax quinquefolium,
- Panax trifolius,
- Panax zingiberensis,
- Panax stipuleanatus. II semble que le Panax ginseng soit parmi les plus riches en saponines et les plus efficaces.
Les Panax proviennent essentiellement de trois pays : - Japon
- Chine - Corée.
Les variétés cultivées dans ces différentes zones peuvent être légère¬ ment différentes et subissent des conditions géoclimatiques différentes.
On constate néanmoins par exemple que la meilleure qualité de gin¬ seng vient de Chine, puis du Japon. Un tubercule de ginseng atteint sa maturité en 4 à 6 ans. La qualité optimale est obtenue avec les tubercules de 6 ans.
On constate des teneurs en saponines très différentes dans les diffé¬ rentes parties de la plante. La partie racinaire est la plus fréquemment utilisée et généralement la plus active. La teneur la plus forte en saponines est observée dans l'extrémité de la racine (ninjin, en japonais) et dans les radicelles (hairy roots ; keninjin, en japo¬ nais). Les saponines les plus fréquemment rencontrés dans les plantes de la famille des Panax sont de type damarane. Cependant, parmi les saponines de Panax, se trouve une saponine particulière le ginsenoside R0 ou Chikusetsusaponine V, à structure oléanane, répondant à la formule ci-dessous :
Figure imgf000004_0001
dans laquelle : le substituant R-- en position 3 est un enchaînement de deux sucres : un bêta-D- glucuronopyranoside et un bêta-D-glucopyranosyl, représenté symboliquement par Glc A-2_Glc, et le substituant R^ en position 28 est un bêta-D-glucopyranosyl, représenté symboliquement par Glc.
Ce ginsenoside est en teneur importante dans le Panax japonicus (japonais) et le P. japonicus chinois, P. japonicus var. mayor, P. japonicus var. angustifolius ainsi que cela apparaît dans la référence bibliographique ci-dessous :
MORITA T., KASAI R., KOHDA H., TANAKA O., ZHOU J., TSUNG-REN Yang.
Chemical and Morphological study on chinese Panax Japonicus C.A. MEYER Chem. Pharm. Bull, 1983, 31, 9-3205 - 2309.
Au Japon, le P. japonicus est également connu sous le nom de Chikusetsu Ninjin. La structure de la Chikusetsusaponine V a été décrite en 1971 par : KONDO N., MARUMOTO Y., SHOJI J., Studies on the constituants of Panacis Japonici Rhizoma. IV The structure of chikusetsusaponin V. Chem. Pharm. Bull. (1971) 19 (6), 1103-1107.
Cette molécule naturelle peut être extraite en particulier par le procédé décrit par J. SHOJI dans Advances in Chinese Médicinal Material Research 1985, p. 455 et suivantes. On a décrit dans la littérature différentes utilisations, en particulier dans le domaine médical des ginsénosides et en particulier du ginsenoside R0, ainsi :
- une activité antivirale de différents ginsénosides dont les ginséno- sides R0 est décrite par Li, Jingbo et al., dans Baiqiien Yike Daxue Xuebao 1992,
18(1), 24-26
- une activité protectrice de l'endothélium de l'aorte du ginsenoside R0 en association avec le ginsenoside Rb est décrite par Liao, Duanfang et al. dans Hunan Yike Daxue Huebao 1992, 17(1), 13-15 - le brevet JP 04005 235, 1992, décrit l'utilisation du ginsenoside pour le traitement de l'hépatite,
- le brevet japonais JP 55 122721 décrit l'utilisation du ginsenoside R0 comme agent antidiabétique,
- Kuo S.C. et al., dans un Planta Med 1990, 56(2), 164-167, décrivent son utilisation comme agent anti-plaquettaire,
- Planta Med 1990, 56(1), 19-23, décrivent son utilisation comme agent antiinflammatoire.
Par ailleurs, différents documents décrivent l'utilisation d'extraits de Panax japonicus dans le domaine de la cosmétique. On citera à cet égard : - le brevet japonais JP 61 047 411 qui décrit l'utilisation de tels extraits pour favoriser la pousse des cheveux,
- le brevet japonais JP 62093 217 qui décrit l'utilisation d'un extrait de Panax japonicus comme tonique capillaire,
- le brevet japonais JP 61 289008 qui concerne une composition cos- métique contenant un extrait de racines de Panax japonicus en combinaison avec des mucopolysaccharides.
Il a maintenent été découvert une activité surprenante du ginsenoside R0 et des extraits végétaux en contenant, de stimulation de la synthèse du collagène, en particulier des collagènes des types I et III, ci-après dénommés en abréviation respectivement "collagène I" et "collagène III", ce qui les rend particulièrement utiles pour lutter contre les effets du vieillissement cutané, ainsi que pour obtenir un raffermissement cutané, ou améliorer la cicatrisation.
En effet, les modifications de l'apparence et surtout des propriétés mécaniques de la peau sont dues essentiellement à des modifications des compo- sants du derme. Or, le collagène de type I représente 80 à 90 % du collagène cutané total, le reste étant constitué principalement de collagène de type III, c'est-à-dire environ 10 à 15 % du collagène cutané total. Les collagènes de type I et de type III sont très intimement associés pour former des fibres au sein du derme (BOREL J.P., MONBOISSE J.C, C.R.Soc. Biol. (1993), 187, 124-142 ; LAPIERE CM., Br. J. Dermatol. (1990), 122, 5-11).
Des diminutions importantes du taux des collagènes I et III dans la peau humaine au cours du vieillissement ont été rapportées (DUMAS M., CHAUDAGNE C, BONTE F., MEYBECK A., Mech. Ageing Dev. (accepté pour publication), VITELLARO-ZUCCARELLO L, GARBELLI R., DAL POZZO ROSSI V., Cell Tissue Res., (1992), 268, 505-511). La pertinence de ces résultats est confirmée par l'observation de la diminution avec l'âge de l'expression des gènes codants pour les collagènes I et III (CHEN Y.Q., MAUVŒR R., TAN E.M., UITTO J., J. Invest. Dematol., (1993), 100, 535). La chute du taux des collagènes I et III cutanés peut également être induite par des traitements thérapeutiques, tels que l'application topique de gluco- corticoïdes (OIKARINEN A., AUTIO P., KIISTALA U., RISTELLI L., RISTELI J., J. Invest. Dermatol., (1992), 98, 220-225).
Ainsi, quelle que soit son origine, qu'elle soit spontanée comme dans le cas du vieillissement naturel, ou qu'elle soit induite par une pathologie, par des médicaments ou par une exposition aux rayonnements ultraviolets, la diminution du taux des collagènes I et III peut être ralentie, voire stoppée grâce à la mise en oeuvre de la présente invention conduisant à une stimulation de la synthèse du collagène. La présente invention a donc pour but principal de résoudre le pro¬ blème technique consistant en la fourniture d'une nouvelle formulation d'une com¬ position cosmétique ou pharmaceutique, notamment dermatologique, présentant une bonne efficacité sur la prévention ou le traitement des effets du vieillissement cutané, ainsi que sur le raffermissement cutané, ou pour améliorer la cicatrisation. Ainsi, selon un premier aspect, la présente invention concerne l'utilisa¬ tion du ginsenoside R0 ou d'un extrait végétal en contenant pour la préparation d'une composition cosmétique ou pharmaceutique, notamment dermatologique, destinée à la stimulation de la synthèse du collagène, en particulier du collagène I et/ou du collagène III. Suivant une variante de réalisation, la composition précitée est destinée à prévenir ou traiter les effets du vieillissement cutané, qu'il soit d'origine actinique ou spontanée (chronologique).
Suivant une autre variante de réalisation, la composition précitée est destinée à favoriser la formation des tissus de soutien cutané.
Suivant encore une autre variante, la composition est destinée au raffermissement de la peau.
Suivant encore une autre variante, la composition est destinée à la cicatrisation des blessures cutanées. Lorsque la composition contient un extrait végétal contenant le ginse¬ noside R0, cet extrait végétal est obtenu de préférence à partir de Panax japonicus japonais, de Panax japonicus chinois, de Panax japonicus var. Mayor, de Panax japonicus var. Angustifolius, de préférence à partir des racines de ces plantes.
Suivant une variante particulièrement avantageuse de l'invention, l'extrait précité est obtenu par extraction au moyen d'un solvant polaire au reflux tel que le méthanol, à partir des racines.
Selon une autre variante, l'extrait végétal peut être obtenu à partir de racines par extraction à l'éther de pétrole, puis réextraction à l'aide d'un solvant polaire, tel que le méthanol, et précipitation par l'acétone. Selon d'autres variantes de l'invention, l'extrait végétal pourra être obtenu par tout procédé permettant d'obtenir un extrait contenant au moins 1 % de ginsenoside R0.
La composition cosmétique, utilisable selon l'invention, est destinée à stimuler la synthèse du collagène, en particulier celle du collagène I et/ou du collagène III et contient à titre d'ingrédient actif une quantité cosmétiquement efficace de ginsenoside R0 ou d'un extrait végétal en contenant.
La composition est destinée notamment à favoriser la synthèse des tissus de soutien cutané, au raffermissement de la peau et à la cicatrisation des blessures cutanées. Elle est donc tout particulièrement destinée à lutter contre les effets du vieillissement cutané ou à obtenir un raffermissement cutané.
Une telle composition, par exemple, peut avantageusement être utilisée comme composition pour prévenir l'apparition des rides ou en atténuer la profon¬ deur. Les compositions pharmaceutiques, utilisables selon l'invention, sont destinées à améliorer la cicatrisation ou à traiter les diverses pathologies accompagnées d'une déficience en collagène.
Selon un autre aspect, l'invention concerne encore une méthode de traitement cosmétique ou thérapeutique, notamment dermatologique, d'un mammifère, en particulier un être humain, caractérisée en ce qu'on administre à ce mammifère, une quantité cosmétiquement ou thérapeutiquement efficace de ginse¬ noside R0 ou d'un extrait végétal en contenant, pour stimuler la synthèse du col¬ lagène, en particulier du collagène I et/ou du collagène III, en particulier pour favoriser la synthèse des tissus de soutien cutané ou pour le raffermissement de la peau.
Selon un mode de réalisation avantageux de cette méthode, on admi¬ nistre le ginsenoside R0 ou un extrait végétal en contenant en une quantité efficace pour améliorer la cicatrisation ou traiter les déficiences en collagène d'origines diverses.
D'autres variantes de réalisation de la méthode selon l'invention appa¬ raîtront clairement à la lumière de la description prise dans son ensemble ainsi que des revendications, pour un homme de l'art.
Dans chacun des aspects précédents, on utilisera, de préférence, des concentrations en ginsénosides R0 comprises entre 0,001 et 5 % en poids par rap¬ port au poids total de ladite composition.
Cette concentration sera de préférence comprise entre 0,001 et 1 % en poids par rapport au poids total de ladite composition.
Selon une variante particulièrement intéressante de l'invention, la composition selon l'invention contiendra en outre un extrait de Centella asiatica, de l'acide asiatique, de l'acide madécassique ou de l'asiaticoside.
Elle pourra également comprendre avantageusement un extrait de marrons d'Inde, un extrait de petit-houx, du madécassoside, des saponines de lierre, du séricoside, des alpha-hydroxy-acides, de l'alpha-cétoglutarate, de l'acide ascorbique, de la proline, de la L-hydroxyproline, de la lysine, de l'hydroxylysine, de la glycine ou de la forskoline, l'un de ses dérivés ou un extrait végétal en contenant.
Elle pourra également comprendre avantageusement des inhibiteurs de collagénases ou des inhibiteurs de la biosynthèse de collagénases, par exemple l'acide rétinoïque. Dans le cadre de l'invention, l'administration du ginsenoside R0 ou d'un extrait végétal en contenant est réalisée selon les méthodes classiques permet¬ tant la stimulation de la synthèse du collagène. Habituellement, la voie la plus simple d'administration est la voie topique, en particulier lorsque l'on recherche la synthèse des tissus de soutien cutané, le raffermissement de la peau et la réparation des blessures cutanées.
Selon une variante avantageuse de l'invention, le ginsenoside R0 ou un extrait végétal en contenant est incorporé dans un excipient, véhicule ou support cosmétiquement ou pharmaceutiquement, notamment dermatologiquement, acceptable. De tels supports sont bien connus de l'homme de l'art et résultent éga¬ lement des exemples de compositions cosmétiques ou de compositions pharma¬ ceutiques, notamment dermatologiques, décrites plus loin, qui ont une portée générale.
Selon un autre de ses aspects, l'invention concerne l'utilisation du ginsenoside R0 ou d'un extrait végétal en contenant comme agent destiné à stimuler la synthèse du collagène I et/ou du collagène III.
Elle concerne tout particulièrement l'utilisation du ginsenoside R0 ou d'un extrait végétal en contenant comme constituant d'un milieu de culture destiné à améliorer la synthèse du collagène I et/ou du collagène III dans une culture de fibroblastes.
Cet agent peut être utilisé dans tout milieu de culture de fibroblastes, en particulier dans un milieu où les fibroblastes sont inclus dans une matrice, par exemple dans une matrice polymérique.
L'invention concerne également un procédé de stimulation de la syn- thèse du collagène I et/ou du collagène III consistant à introduire du ginsenoside R0 ou un extrait végétal en contenant dans un milieu de culture de fibroblastes.
Selon ce procédé, on introduit de préférence 0,001 à 0,1 % de ginsenoside R0 dans un milieu ci-après désigné par E 199-C, obtenu par introduction de L-glutamine à une concentration de 2mM/l dans un milieu E199 commercialisé par la société GIBCO.
Les extraits végétaux contenant le ginsenoside R0 décrits précédemment sont également utilisables pour la préparation des milieux de culture ci-dessus.
D'autres buts, caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront clairement à la lecture de la description explicative qui va suivre faite en référence à plusieurs exemples donnés uniquement à titre d'illustration et qui ne sauraient par conséquent en aucun cas limiter la portée de l'invention.
Dans les exemples, les pourcentages sont exprimés en poids, sauf indi¬ cation contraire. Dans le cas des extraits, les quantités de ceux-ci sont exprimées en poids sec. Exemple 1 Préparation d'un extrait
On réalise l'extraction à partir de racines de Panax japonicus CA. Meyer. Après broyage des racines, l'extraction se fait avec du méthanol à reflux pendant 4 h. On obtient une pâte brune, le rendement est de 33 % environ, la teneur en ginsenoside R0 est de 25 % environ.
Exemple 2 Préparation d'un extrait
On utilise des racines de Panax japonicus CA. Meyer.
38,56 g des racines broyées sont extraits au soxhlet pendant 12 h avec 140 mi d'éther de pétrole.
Le résidu est réextrait au soxhlet par 130 ml de méthanol pendant 20 h. Les 130 ml de méthanol sont concentrés sous vide à l'évaporateur rota¬ tif de façon à ramener le volume à 45 ml.
Après refroidissement, la solution est filtrée sur Millex SR de porosité 0,45 micron.
La solution obtenue est jetée dans 500 ml d'acétone anhydre. Le pré- cipité beige obtenu est séparé par filtration, lavé à l'acétone anhydre et séché à l'étuve à 45*C
On obtient 6,13 g d'une poudre beige clair (rendement 15,9 %), la teneur en ginsenoside R0 est de 35 % environ.
Exemple 3
Mise en évidence de la stimulation de la synthèse du collagène I a) Protocole
La synthèse de collagène I est mesurée avec et sans traitement sur une culture de fibroblastes provenant d'un lifting d'une femme de 50 ans, grâce à une méthode ELISA. a.l) Cultures de fibroblastes :
Les fibroblastes sont cultivés par la méthode des explants jusqu'à con¬ fluence, à 37*C, dans un milieu constitué d'un mélange du milieu E 199-C et de 10 % de sérum de veau foetal, dans une atmosphère saturée en humidité avec 5 % de CO2.
Puis, après décollement par une solution isotonique tamponnée pH 7,2 de trypsine à 0,1 % et d'EDTA 0,02 , les cellules sont ensemencées dans des microplaques 96 puits (FALCON) à 10^ cellules par puits dans un milieu E 199-C contenant 2 % de sérum. Après 24 h, ce milieu est remplacé, pour une incubation de 48 h, par le même milieu sans sérum contenant 25 μM d'ascorbate de sodium (milieu d'incu¬ bation) avec ou sans les produits à tester. Les produits solubilisés dans le DMSO sont ajoutés dans le milieu de culture à différentes concentrations.
a.2) Dosage du collagène I :
La quantité du collagène I sécrété dans le milieu après 48 h d'incuba¬ tion avec ou sans les produits a été déterminée à l'aide d'un test ELISA (Enzyme- linked Immuno Sorbent Assay).
Le milieu d'incubation est collecté et transféré dans les puits d'une plaque de microtitration (Immunoplate Nunc) contenant des inhibiteurs de pro- téases. Une incubation de 24 h à 4'C permet l'adhésion du collagène au plastique. Les plaques sont ensuite rincées au PBS (Phosphate Buffered Saline).
Après 24 h d'incubation à 4*C avec de la sérumalbumine pour éviter les liaisons anticorps-plastique non spécifiques, des anticorps de lapin anti- collagène I humain (Institut Pasteur, Lyon, France) sont ajoutés pendant 1,5 h à 22#C Après rinçage au PBS, les anticorps liés sont révélés par des anticorps de chèvres anti IgG de lapin (INTERCHIM, Montluçon, France) conjugués à une phosphatase alcaline qui, en présence du phosphate de paranitrophényle, produira un paranitrophénol absorbant à 405 nm. Les densités optiques obtenues sont converties en nanogrammes de collagène grâce à une courbe d'étalonnage établie dans les mêmes conditions expérimentales avec du collagène I humain purifié (Institut Jacques Boy, France). a.3) Interprétation statistique ;
Les quantités de collagène sécrétées (moyenne ± écart type) par les cellules traitées et non traitées sont comparées avec un test t de Student. Le seuil de 0,05 est pris comme niveau de significativité. Parallèlement, la viabilité est contrôlée par un test M.T.T.
a.4) Test de viabilité cellulaire :
A la fin de la période d'incubation, le milieu est enlevé et un test M.T.T. est réalisé. Les cellules sont incubées avec 100 μ\ d'une solution à 0,5 mg/ml d'un sel de tétrazolium dans du milieu E 199-C sans rouge de phénol pendant 3 h à 37'C Puis, 100 μ\ d'isopropanol sont ajoutés à chaque puits pour solubiliser le dérivé Formazan bleu formé par les succinates déshydrogénases mitochondriales des cellules vivantes. La densité optique de ce dérivé formé solubilisé est mesurée à 540 nm.
b) Résultats obtenus b.l) On applique le protocole décrit précédemment pour étudier l'effet de la concentration en ginsenoside R0 sur la stimulation de la synthèse du col¬ lagène I. Le tableau 1 donne les résultats obtenus avec les compositions conte¬ nant respectivement 0, 1, 2,5 et 10 μg de ginsenoside R0 par ml.
Tableau 1
Figure imgf000012_0001
Le tableau 1 met bien en évidence la stimulation de la synthèse du collagène I. (S : significatif au seuil 0,05). b.2) Des résultats comparables ont été obtenus en partant des extraits obtenus respectivement selon l'exemple 1 et l'exemple 2 ainsi qu'avec le ginsenoside RQ.
Ces résultats sont consignés dans le tableau 2 ci-dessous.
Tableau 2
Figure imgf000013_0001
Exemple 4
Mise en évidence de la stimulation de la synthèse du collagène III a) Protocole :
Le protocole est le même que celui décrit avec le collagène I sauf que le dosage ELISA est dirigé contre le collagène III (Humain) et que la durée de traitement des cultures est de 72 h au lieu de 48 h avec le collagène I.
b) Résultats :
En présence de R0, la synthèse de collagène III est stimulée : à 2,5 g/ml : + 33 %
10 g/ml : + 81 %. Divers exemples également non limitatifs de composition cosmétique ou pharmaceutique, notamment dermatologique, sont donnés ci-après.
Exemple 5
Composition cosmétique favorisant la formation des tissus de soutien cutané
Ginsenoside R0 0 3 ε
Ethanol 2,0 g Conservateur 0,2 g
Gel de Carbopol 940® à 1,25 % qsp 100 g
Applications : 2 fois par jour, sur les zones du corps nécessitant une prévention ou un traitement contre l'effet de "relâchement" cutané.
Exemple 6
Composition cosmétique pour le raffermissement de la peau
Ginsenoside RQ 0,6 g Acide Hyluronique 0,1 g
Extrait de Centella asiatica 0,4 g
Excipient + conservateur qsp 100 g
Applications : 2 fois par jour en massage local pendant 4 semaines sur les zones à traiter. Exemple 7
Pommade pour la cicatrisation des blessures cutanées
Ginsenoside RQ 1 g Palmitate de vitamine A 0,05 g
Oxyde de zinc 0,1 g
Glycérine 1 g
Excipient pour pommade qsp 100 g
Exemple 8
Poudre cicatrisante
On prépare une poudre composée de particules solides complexes en suivant le procédé décrit dans le brevet français FR 2 685 635. Cette poudre a la composition suivante en poids : - poudre de Nylon (particule support, constituée de particules de diamètre moyen d'environ 20 μm) : 97
- ecdystérone : 1
- ginsenoside RQ : 2.
Cette poudre est appliquée en application locale sur les lésions de type ulcère 2 à 3 fois par jour, après nettoyage antiseptique des lésions.
Exemple 9
Milieu de culture favorisant la production du collagène par des fibroblastes Le milieu comprend :
Ginsenoside R0 10 mg
Acide rétinoïque 0,3 mg
Acide ascorbique 1,8 mg
Proline 25 mg Glycine 20 mg
Lysine 20 mg
Milieu E 199-C.qsp 100 ml

Claims

REVENDICATIONS
1. Utilisation du ginsenoside R0, ou d'un extrait végétal en contenant, pour la préparation d'une composition cosmétique ou pharmaceutique, notamment dermatologique, destinée à la stimulation de la synthèse du collagène, en particu- lier du collagène I et/ou du collagène m.
2. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que ladite composition est destinée à prévenir ou traiter les effets du vieillissement cutané.
3. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que ladite composition est destinée à favoriser la formation des tissus de soutien cutané.
4. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que ladite composition est destinée au raffermissement de la peau.
5. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que ladite composition est destinée à la cicatrisation des blessures cutanées.
6. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que la concentration en ginsenoside R0 est comprise entre 0,001 et 5 % en poids, de préférence entre 0,001 et 1 % en poids, par rapport au poids total de la com¬ position.
7. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que la composition contient un extrait de Centella asiatica, de l'acide asiatique, de l'acide madécassique, l'asiaticoside, un extrait de marrons d'Inde, un extrait de petit-houx, du madécassoside, des saponines de lierre, du séricoside, les alpha- hydroxy-acides, de l'alpha-cétoglutarate, de l'acide ascorbique, de la proline, de la L-hydroxyproline, de la lysine, de l'hydroxylysine, de la glycine ou de la forskoline, l'un de ses dérivés ou un extrait végétal en contenant.
8. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que la composition contient des inhibiteurs de collagénases ou des inhibiteurs de la biosynthèse de collagénases, par exemple de l'acide rétinoïque.
9. Utilisation du ginsenoside R0 ou d'un extrait végétal en contenant comme agent destiné à la stimulation de la synthèse du collagène I et/ou du collagène III.
10. Utilisation selon la revendication 9, caractérisée en ce que le ginsenoside R0 ou l'extrait en contenant est utilisé comme constituant d'un milieu de culture de fibroblastes.
11. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisée en ce que ledit extrait végétal est choisi parmi les extraits de Panax japonicus japonais, de Panax japonicus chinois, de Panax japonicus var. mayor, de Panax japonicus var. angustifolius.
12. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisée en ce que ledit extrait est obtenu par extraction au moyen d'un solvant polaire au reflux, tel que le méthanol, à partir de racines.
13. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 12, caractérisée en ce que ledit extrait est obtenu à partir de racines par extraction à l'éther de pétrole puis réextraction à l'aide d'un solvant polaire, tel que le méthanol, et précipitation par l'acétone.
14. Méthode de traitement cosmétique d'un mammifère, en particulier un être humain, caractérisée en ce qu'on administre à ce mammifère une quantité cosmétiquement efficace de ginsenoside RQ OU d'un extrait végétal en contenant, pour la stimulation de la synthèse du collagène, en particulier du collagène I et/ou du collagène III, en particulier pour favoriser la synthèse des tissus de soutien cutané ou pour le raffermissement de la peau.
15. Procédé de stimulation de la synthèse du collagène I et/ou du collagène III, caractérisé en ce qu'il consiste à introduire du ginsenoside R0 ou un extrait végétal en contenant dans un milieu de culture de fibroblastes.
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