WO1995017395A1 - Method for extracting and isolating 10-deacetylbaccatine iii - Google Patents

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WO1995017395A1
WO1995017395A1 PCT/FR1994/001504 FR9401504W WO9517395A1 WO 1995017395 A1 WO1995017395 A1 WO 1995017395A1 FR 9401504 W FR9401504 W FR 9401504W WO 9517395 A1 WO9517395 A1 WO 9517395A1
Authority
WO
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tetraol
solvent
water
aqueous phase
extraction
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Application number
PCT/FR1994/001504
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French (fr)
Inventor
Paul Negol
Marie-Jeanne Serrano
Bruno David
Original Assignee
Pierre Fabre Medicament
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Publication date
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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D305/00—Heterocyclic compounds containing four-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atoms
    • C07D305/14—Heterocyclic compounds containing four-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atoms condensed with carbocyclic rings or ring systems

Definitions

  • the present invention relates to a process for extracting and isolating 10-deacetylbaccatin LU, a compound useful as an intermediate in the hemisynthesis of taxol or its derivatives of oncological interest.
  • Taxanes including taxol, are anticancer agents with particularly advantageous properties.
  • Tetraol (I) was first described as the product resulting from the alkaline methanolysis of taxol by M.C. WANI in 1971 when the taxol was detected.
  • patent applications EP-A 253 738 and EP-A-253 739 mention a process for extracting tetraol which consists in taking up an ethanolic extract of the yew leaves with water, filtering it through Celite and extract the filtrate with methylene chloride before extracting it with water and then separating the different fractions.
  • the tetraol is obtained in purified form after two successive chromatographies on a silica column.
  • the non-dried leaves are extracted with ethanol at 95 ° (five macerations of ten hours each).
  • the alcoholic extracts are combined and concentrated in order to remove the residual ethanol.
  • the aqueous suspension is taken up in methylene chloride (nine extractions).
  • the dichloromethylenic extract is concentrated then chromatography on a silica column.
  • the fraction rich in tetraol is again subjected to chromatography on a silica column.
  • the extraction yield is not mentioned and the title of the final product is assumed to be 100%.
  • Patent application WO-A-92/07842 describes a process which involves preparation by reverse phase chromatography.
  • the raw extract of bark or leaves of Taxus is treated by reverse phase chromatography which allows adsorption of the taxanes which will be selectively eluted.
  • Patent application WO-A-92/18492 describes a general process for extracting and purifying taxanes, in particular by adsorption / elution and liquid / liquid extraction.
  • the plant is extracted with an organic solvent (ethanol, acetone, ethyl acetate).
  • the organic phase is taken up in dichloromethane or ethyl acetate and the hydrophilic fractions are extracted with water.
  • the organic phase is taken up in an ethyl acetate / methanol mixture (3/1) to adsorb the extract on Celite. Celite eluted with dichloromethane leads to an extract of taxanes.
  • a variant consists in replacing the purification with Celite by a liquid / liquid extraction with hexane and a methanol / water mixture (9/1). These methods in all cases only lead to a crude mixture of taxanes, which will then be purified by traditional chromatographic techniques.
  • the present invention therefore relates to an improved process for extracting and isolating tetraol from yew leaves.
  • the plants useful for the method according to the invention are preferably species of the genus Taxus (if).
  • Some botanists differentiate the genus Taxus into several species; T. baccata, T. brevifolia, T. wallichiana, ⁇ chinensis, T. cuspidata, T. canadensis. T. floridana. T. globosa, T. media, T-. hunne elliana ... while other authors consider all these species as subspecies of a collective species: T. baccata.
  • the process therefore applies to the collective species T. baccata in the broad sense as well as to the corresponding cultivars.
  • the method according to the invention being specific to the extraction and isolation of tetraol, it is in relation to this product that the specific conditions for its implementation will be determined.
  • the method according to the invention can very well adapt to any medium rich in taxanes and more particularly in taxanes of similar polarity tetraol, whatever its origin, natural or not, vegetable or not, such as cell cultures of bark or yew leaves, cultures of fungi or their cell cultures, or mixtures of taxanes, residues of taxol extraction.
  • the method according to the invention is characterized in that it comprises the following stages: first stage of extraction of the yew leaves with a suitable protic polar solvent to obtain an aqueous phase containing tetraol, said aqueous phase being an initial extract resulting directly from the first extraction step or being obtained after an additional treatment of said initial extract, second step of extraction of said aqueous phase with a suitable organic solvent essentially immiscible with water, so as to obtain a phase organic rich in tetraol, then last step of isolating the tetraol from said organic phase.
  • the initial extract generally comprises the tetraol in mixture with taxanes of similar polarity, extracted by the same protic polar solvent.
  • the purpose of the second and last step then consists, using an appropriate organic solvent, in extracting and isolating the tetraol from this mixture.
  • the yew leaves are dried and / or ground.
  • the first extraction step is preferably carried out by maceration in the polar protic solvent for a period of between 15 minutes and 6 hours, preferably 1 hour.
  • the initial extract containing the tetraol is then recovered, in particular by filtration.
  • a person skilled in the art will know how to adapt the maceration time as a function of the chosen number of leaf extraction operations. Thus, it can perform several 15-minute macerations with small amounts of solvent, or on the contrary perform an equivalent operation in a single step, adding up the maceration times and the volumes of solvent used in the multiple extraction.
  • the number of macerations will of course be chosen with the objective of depleting the yew leaves of their tetraol content present.
  • the extracts from each maceration are then combined to give the initial extract containing the tetraol.
  • the first extraction step can also be carried out advantageously by maceration in the polar protic solvent under irradiation of microwaves or ultrasound for a period of between 2 and 15 minutes.
  • the extraction temperature is between 10 ° C and the boiling temperature of the solvent.
  • the lowest boiling point of the various solvents will be chosen as the upper limit, or in the presence of an eutectic, the boiling temperature of the latter.
  • the preferred temperature will be room temperature, which is defined in the present patent application as the temperature of the laboratory, between approximately 15 ° C. and approximately 25 ° C.
  • this ambient temperature may be lower or higher than the range proposed.
  • the ambient temperature is more simply defined by the temperature of the environment in which the process will be carried out, without it being essential to supply additional energy to the extraction medium in order to obtain satisfactory yields.
  • the protic polar solvent is advantageously chosen from water, linear or branched Ci-Cs aliphatic alcohols , and mixtures of these solvents in all proportions. Depending on the choice of this first solvent, a person skilled in the art will determine the need to carry out the optional step of processing the initial extract.
  • the protic polar solvent is water.
  • the aqueous phase containing the tetraol is the initial extract resulting directly from the first step. This aqueous phase is then treated directly with the appropriate organic solvent so as to obtain the organic phase rich in tetraol.
  • the protic polar solvent is a hydroalcoholic mixture or an abovementioned alcohol.
  • the initial extract may be considered to be the aqueous phase resulting directly from the first step.
  • the aqueous phase is advantageously obtained after a treatment of the initial extract consisting of evaporating the alcohol, and if necessary, adding an appropriate quantity of water, before and after the evaporation of the alcohol.
  • the protic polar solvent is methanol, with an intermediate stage of treatment of the initial extract, comprising the following stages consisting of: - optionally concentrating the initial extract by evaporation of the methanol , add water to the extract containing tetraol in a 1/1 volume ratio, extract at least once the hydroalcoholic mixture obtained with an equal volume of an ethyl acetate / hexane mixture in a volume ratio 1/1, recover the hydroalcoholic phase, and concentrate the hydroalcoholic phase by removing the methanol, so as to obtain said aqueous phase containing the tetraol, useful for the second step.
  • an intermediate stage of treatment of the initial extract comprising the following stages consisting of: - optionally concentrating the initial extract by evaporation of the methanol , add water to the extract containing tetraol in a 1/1 volume ratio, extract at least once the hydroalcoholic mixture obtained with an equal volume of an ethyl acetate / hexane mixture in a
  • the result of the first extraction step with possibly the additional treatment consists in obtaining the same aqueous phase containing the tetraol, which will be extracted in all cases by an essentially immiscible organic solvent with water, in the second step of the process.
  • This essentially water-immiscible organic solvent is advantageously a halogenated hydrocarbon. It will preferably be chosen from methylene chloride, chloroform and their mixtures.
  • the second step can of course be repeated several times until the aqueous phase in tetraol is exhausted, the different fractions organic then being combined to obtain the organic phase rich in tetraol, useful for the last step. ⁇
  • the last step common to all the variants preferably consists in evaporating the organic solvent, then in taking up the dry residue with a crystallization solvent in which it selectively precipitates.
  • This crystallization solvent is preferably acetonitrile.
  • the solution of tetraol in acetonitrile is left to stand at a temperature of between 0 ° C. and room temperature, to allow the tetraol to precipitate, leaving the impurities in the supernatant.
  • the precipitated solid will then be recovered by the usual techniques of those skilled in the art, in particular by filtration and drying.
  • recrystallization solvents are preferably chosen from the following mixtures (by volume) of solvents:
  • the purity of the isolated tetraol is generally much greater than 90% and the extraction yield relative to the amount of tetraol initially present in the plant is greater than 70% by mass.
  • the examples below make it possible to illustrate different conditions for implementing the method according to the invention.
  • leafy summits dried at room temperature or at a temperature not exceeding 70 ° C., with a particle size of between 2 mm and 0.5 mm for woody fragments (less than 15% mass / total mass) and 2 mm to 100 ⁇ m for leaf fragments.
  • the dosage of the leaves is carried out as follows: the leaf powder (50 g test sample taken according to conventional sampling techniques) is extracted twice with 500 ml of methanol at ambient temperature. The extract obtained is dosed in tetraol by HPLC compared to a calibration range carried out with an authentic sample. The dosage is expressed in mg of tetraol per kg of dried leaves.
  • HPLC analysis is performed on WATERS-MILLIPORE material (Millenium reference) under isocratic conditions (H 2 0 / CH 3 CN: 75/25, 1 ml min) on a Lichrospher 100 MERCK column (5 ⁇ m).
  • the quantity injected is 20 ⁇ l, integration is carried out at 230 nm.
  • HPLC analysis conditions are identical for the dosage of the leaves and for the evaluation of the purity of the isolated tetraol during handling.
  • Taxus baccata leaves 200 g are finely ground and then extracted with 2 liters of water for 1 hour at room temperature, with stirring.
  • Taxus baccata leaves 200 g are finely ground and then extracted twice with 1 liter of water for 30 minutes at 60 ° C with stirring.
  • Taxus baccata leaves 200 g are finely ground and then extracted with 2 liters of water for 2 minutes, with 10-minute ultrasonic activation (FRITCH ultrasonic tank, reference 17.002, Germany).
  • Taxus baccata leaves 500 mg / kg are finely ground and then extracted with 2 liters of methanol for 1 hour at room temperature, with stirring.
  • Taxus baccata leaves 505 mg / kg are finely ground and then extracted with 2 liters of an ethanol / water mixture (70/30) for 1 hour at room temperature, with stirring. After filtration on "AF 15" and rinsing of the marc with 0.7 liter of an ethanol / water mixture (70/30), 2.2 is obtained. liters of a hydroalcoholic phase enriched with tetraol. This extract is concentrated by evaporation then adjusted so as to obtain 200 ml of aqueous phase, then filtered. li Extraction with a water / isopropanol mixture (1/1)
  • Taxus baccata leaves 200 g are finely ground and then extracted with 2 liters of a water / isopropanol mixture (1/1) for 1 hour at room temperature, with stirring.
  • Taxus baccata 500 mg kg
  • the marc is separated from the methanolic extract.
  • the marc recovered is extracted again with 1.5 liters of methanol for one hour at room temperature, then rinsed with 0.7 liters of methanol.
  • the methanolic extracts combined represent 3.7 liters.
  • To this methanolic extract enriched in tetraol are added 350 ml of water, the whole is concentrated by evaporation then adjusted so as to obtain 200 ml of aqueous phase, then filtered.
  • the product is dissolved in the mixture C ⁇ . 2 Ci 2 / hexane (1/1) and precipitated in a similar manner to the previous step.
  • the tetraol thus purified (84.1 mg) then reaches a purity of more than 99%, 85% of the amount of tetraol initially present in the leaf powder being thus obtained.
  • the product is dissolved in the CH 2 ⁇ 2 / hexane mixture (1/1) and allowed to precipitate in a similar manner to the previous step.
  • the tetraol titer thus purified (82.1 mg) then reaches more than 99%.
  • the amount of tetraol thus extracted represents 83% by mass of the amount of tetraol initially present in the leaf powder.
  • This last purification step carried out with an acetone / hexane (1/1) or acetonitrile / CH 2 ⁇ 2 (5/1) mixture gives the same amount of tetraol (81.4 mg) of purity close to 100%.
  • Taxus baccata leaves 500 mg / kg are ground and then extracted once with 2 liters of MeOH at room temperature for 1 hour.
  • the aqueous phase is exhausted four times (v / v) with CH 2 CI 2 .
  • the latter is then concentrated to 100 ml and then washed with 50 ml of an aqueous solution of Na 2 C0 3 (5%).
  • the CH2CI2 phase is dried over Na 2 S0 4 , to which 30 ml of CH3CN are added.
  • 82.3 mg of tetraol titrating 85% is recovered (before the final purification) and corresponding to 70% by mass of the amount of tetraol initially present in the leaf powder.
  • EXAMPLE 4 Extraction and isolation of tetraol on an industrial scale
  • Taxus baccata leaves 30 kg are finely ground and then extracted with 300 liters of water in a 600-liter stainless steel reactor for 1 hour at room temperature, with stirring.
  • This aqueous phase is extracted with four times 225 liters of dichloromethane.
  • the combined organic phases were dried over Na2S0 4 and then evaporated to dryness in vacuo. 225 g of a light brown powdery solid residue are obtained.
  • the extraction yield relative to the amount of tetraol initially present in the leaves is 82% by mass.
  • Taxus baccata leaves 30 kg are finely ground and then extracted with 300 liters of methanol for one hour at room temperature with stirring.
  • an aqueous phase enriched in tetraol is obtained after adding 50 liters of water and concentration by evaporation to a volume of about 30 liters.
  • This aqueous phase adjusted to 42 liters by addition of water, filtered on AF 15, is extracted with four times 27 liters of dichloromethane.
  • the organic phases are combined after concentration. The organic solvent is evaporated.
  • the extraction yield relative to the amount of tetraol initially present in the sheets is 80% by mass.
  • the methane phase is concentrated and adjusted to 60 liters.
  • the hydroalcoholic phase is again extracted with 100 liters of the organic phase of the quaternary water / methanol / hexane / ethyl acetate mixture (1/1/1/1) prepared separately.
  • the hydroalcoholic phase is recovered and concentrated until the methanol is eliminated.
  • the aqueous phase is extracted with four times 53 liters of chloroform.
  • the organic phases enriched in tetraol are combined, and the organic solvent is evaporated. 285 g of a solid pulverulent residue are obtained.
  • the extraction yield relative to the amount of tetraol initially present in the sheets is 70% by mass.
  • Taxus baccata leaves 500 mg / kg are finely ground and then extracted with 300 liters of ethanol for 1 hour at room temperature, with stirring. After spinning on a ROBATEL SLP extractor fitted with a 20 ⁇ m nylon fabric and rinsing of the marc with 105 liters of ethanol, after 50 liters of water are added and concentration by evaporation to a volume of about 30 liters. aqueous phase enriched with tetraol.
  • This aqueous phase adjusted by adding water to 42 liters, is extracted with four times 27 liters of dichloromethane.
  • the organic phases are combined after concentration. The organic solvent is evaporated.
  • the extraction yield relative to the amount of tetraol initially present in the leaves is 69% by mass.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
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  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

A method for extracting and isolating 10-deacetylbaccatine III (tetraol) from yew leaves, comprising a first step of yew leaf extraction using a suitable protic solvent to obtain an aqueous extract which has optionally been subjected to an additional intermediate treatment. Said aqueous extract is extracted using a non-water-miscible organic solvent to give a tetraol-enriched extract which is then treated with a suitable solvent to precipitate out the tetraol. A final purification step produces a product with a titre close to 100 %.

Description

".Procédé d'extraction et d'isolement de la 10-désacétylbaccatine lu "". Process for the extraction and isolation of 10-deacetylbaccatin read"
La présente invention concerne un procédé d'extraction et d'isole ment de la 10-désacétylbaccatine LU, composé utile comme intermédiaire dan Phémisynthèse du taxol ou de ses dérivés présentant un intérêt oncologique.The present invention relates to a process for extracting and isolating 10-deacetylbaccatin LU, a compound useful as an intermediate in the hemisynthesis of taxol or its derivatives of oncological interest.
Les taxanes dont le taxol sont des agents anticancéreux au propriétés particulièrement intéressantes.Taxanes, including taxol, are anticancer agents with particularly advantageous properties.
Toutefois, les taxanes naturels anticancéreux, sont principalemen présents en faible concentration dans les écorces d'If, végétaux connus pour l finesse de leur écorce et leur croissance très lente.However, natural anti-cancer taxanes are mainly present in low concentration in the barks of Yew, plants known for the fineness of their bark and their very slow growth.
Afin d'assurer une exploitation rentables des taxanes anticancéreux sans porter préjudice à la source végétale de matières premières, il a ét rapidement envisagé d'obtenir ces produits par hémisynthèse à partir de la 10 désacétylbaccatine III (I) ou tétraol.In order to ensure profitable exploitation of cancer-fighting taxanes without harming the vegetable source of raw materials, it was quickly envisaged to obtain these products by hemisynthesis from deacetylbaccatin III (I) or tetraol.
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(I) ( I)
En effet, ce dernier se trouve en quantité plus importante dans le feuilles d'if, comme l'ont montré Sénilh & al. en 1981 (C. R. Acad. Se. Paris 1981, 293 (2), 501-503), assurant une source renouvelable de matière pre mière dans la préparation du médicament.Indeed, the latter is found in greater quantity in the yew leaves, as shown by Sénilh & al. in 1981 (C. R. Acad. Sc. Paris 1981, 293 (2), 501-503), ensuring a renewable source of raw material in the preparation of the drug.
Le tétraol (I) a été décrit la première fois comme le produit résultan de la méthanolyse alcaline du taxol par M.C. WANI en 1971 lors de la mise e évidence du taxol.Tetraol (I) was first described as the product resulting from the alkaline methanolysis of taxol by M.C. WANI in 1971 when the taxol was detected.
L'obtention de ce produit avec un rendement élevé devient donc u des aspects essentiels du problème de l'exploitation rentable des taxane d'intérêt oncologique comme le taxol et le taxotère.Obtaining this product with a high yield therefore becomes one of the essential aspects of the problem of the profitable exploitation of taxane of oncological interest such as taxol and taxotere.
Or, si le principe général d'extraction des taxanes à partir des feuille d'if est connu, un seul procédé concerne spécifiquement le tétraol. En effet, le but de la quasi-totalité des procédés est d'obtenir le taxol, produit à haute valeur ajoutée, alors que le tétraol est toujours pris en considéra¬ tion comme sous-produit d'extraction.However, if the general principle of extracting taxanes from yew leaves is known, only one process specifically concerns tetraol. Indeed, the goal of almost all of the processes is to obtain taxol, a product with high added value, while tetraol is always taken into consideration as an extraction by-product.
Il s'agit en général d'extraire le végétal par un alcool, puis d'adopter les conditions de purification spécifiques à l'obtention du taxol.This generally involves extracting the plant with an alcohol, then adopting the specific purification conditions for obtaining taxol.
Cependant, les demandes de brevet EP-A 253 738 et EP-A-253 739 mentionnent un procédé d'extraction du tétraol qui consiste à reprendre un extrait éthanolique des feuilles d'if par de l'eau, le filtrer sur Célite et à extraire le filtrat par le chlorure de méthylène avant de l'extraire par l'eau puis de séparer les différentes fractions. Le tétraol est obtenu sous forme purifiée après deux chromatographies successives sur colonne de silice.However, patent applications EP-A 253 738 and EP-A-253 739 mention a process for extracting tetraol which consists in taking up an ethanolic extract of the yew leaves with water, filtering it through Celite and extract the filtrate with methylene chloride before extracting it with water and then separating the different fractions. The tetraol is obtained in purified form after two successive chromatographies on a silica column.
Ce procédé utilisé dans les deux demandes de brevet citées ci-dessus est très long et complexe.This process used in the two patent applications cited above is very long and complex.
Les feuilles non séchées sont extraites par de l'éthanol à 95° (cinq macérations de dix heures chacune). Les extraits alcooliques sont réunis et concentrés afin d'éliminer l'éthanol résiduel. La suspension aqueuse est reprise par du chlorure de méthylène (neuf extractions). L'extrait dichlorométhylénique est concentré puis chromatographie sur colonne de silice. La fraction riche en tétraol est à nouveau soumise à une chromatographie sur colonne de silice. Le rendement d'extraction n'est pas mentionné et le titre du produit final est supposé à 100%.The non-dried leaves are extracted with ethanol at 95 ° (five macerations of ten hours each). The alcoholic extracts are combined and concentrated in order to remove the residual ethanol. The aqueous suspension is taken up in methylene chloride (nine extractions). The dichloromethylenic extract is concentrated then chromatography on a silica column. The fraction rich in tetraol is again subjected to chromatography on a silica column. The extraction yield is not mentioned and the title of the final product is assumed to be 100%.
La demande de brevet WO-A-92/07842 décrit un procédé où intervient une préparation par chromatographie en phase inverse. L'extrait brut d'écorces ou de feuilles de Taxus est traité par chromatographie en phase inverse ce qui permet d'adsorber les taxanes qui seront élues sélectivement.Patent application WO-A-92/07842 describes a process which involves preparation by reverse phase chromatography. The raw extract of bark or leaves of Taxus is treated by reverse phase chromatography which allows adsorption of the taxanes which will be selectively eluted.
Les phases inverses citées sont la silice Ce, la silice CN et la silice Cis.The reverse phases cited are Ce silica, CN silica and Cis silica.
La demande de brevet WO-A-92/18492 décrit un procédé général d'extraction et de purification des taxanes notamment par adsorption/élution et parextractionliquide/liquide. La plante est extraite par un solvant organique (éthanol, acétone, acétate d'éthyle). La phase organique est reprise par le dichlorométhane ou acétate d'éthyle et les fractions hydrophiles sont extraites par de l'eau. La phase organique est reprise par un mélange acétate d'éthyle/méthanol (3/1) pour adsorber l'extrait sur Célite. La Célite éluée par du dichlorométhane conduit à un extrait de taxanes.Patent application WO-A-92/18492 describes a general process for extracting and purifying taxanes, in particular by adsorption / elution and liquid / liquid extraction. The plant is extracted with an organic solvent (ethanol, acetone, ethyl acetate). The organic phase is taken up in dichloromethane or ethyl acetate and the hydrophilic fractions are extracted with water. The organic phase is taken up in an ethyl acetate / methanol mixture (3/1) to adsorb the extract on Celite. Celite eluted with dichloromethane leads to an extract of taxanes.
Une variante consiste à remplacer la purification par la Célite par une extraction liquide/liquide par l'hexane et un mélange méthanol/eau (9/1). Ces méthodes dans tous les cas ne conduisent qu'à un mélange brut de taxanes, qui seront ensuite purifiés par des techniques chromatographiques traditionnelles.A variant consists in replacing the purification with Celite by a liquid / liquid extraction with hexane and a methanol / water mixture (9/1). These methods in all cases only lead to a crude mixture of taxanes, which will then be purified by traditional chromatographic techniques.
Enfin, dans la demande EP-A-521 675 une préparation par CO2 supercritique de la 10-désacétylbaccatine III est revendiquée. Cependant le procédé décrit plus spécialement l'extraction du taxol.Finally, in application EP-A-521 675 a preparation by supercritical CO 2 of 10-deacetylbaccatin III is claimed. However, the process more specifically describes the extraction of taxol.
La présente invention concerne donc un procédé amélioré d'extrac¬ tion et d'isolement du tétraol à partir des feuilles d'if.The present invention therefore relates to an improved process for extracting and isolating tetraol from yew leaves.
Les végétaux utiles pour le procédé selon l'invention sont de préfé¬ rence les espèces du genre Taxus (if). Certains botanistes différencient le genre Taxus en plusieurs espèces ; T. baccata, T. brevifolia, T. wallichiana, ~ chinensis, T. cuspidata, T. canadensis. T. floridana. T. globosa, T. média, T-. hunne elliana ... alors que d'autres auteurs considèrent toutes ces espèces comme des sous-espèces d'une espèce collective : T. baccata. Le procédé s'applique donc sur l'espèce collective T. baccata au sens large ainsi que sur les cultivars correspondants.The plants useful for the method according to the invention are preferably species of the genus Taxus (if). Some botanists differentiate the genus Taxus into several species; T. baccata, T. brevifolia, T. wallichiana, ~ chinensis, T. cuspidata, T. canadensis. T. floridana. T. globosa, T. media, T-. hunne elliana ... while other authors consider all these species as subspecies of a collective species: T. baccata. The process therefore applies to the collective species T. baccata in the broad sense as well as to the corresponding cultivars.
Le procédé selon l'invention étant spécifique à l'extraction et l'isolement du tétraol, c'est bien par rapport à ce produit que seront détermi¬ nées les conditions spécifiques de sa mise en oeuvre.The method according to the invention being specific to the extraction and isolation of tetraol, it is in relation to this product that the specific conditions for its implementation will be determined.
De ce fait, bien que spécifié pour l'extraction et la purification du tétraol à partir des feuilles d'if, le procédé selon l'invention pourra très bien s'adapter à tout milieu riche en taxanes et plus particuhèrement en taxanes de polarité voisine du tétraol, quelle que soit son origine, naturelle ou non, végétale ou non, comme des cultures cellulaires d'écorce ou de feuilles d'if, des cultures de champignons ou leurs cultures cellulaires, ou encore des mélanges de taxanes, résidus d'extraction du taxol.Therefore, although specified for the extraction and purification of tetraol from yew leaves, the method according to the invention can very well adapt to any medium rich in taxanes and more particularly in taxanes of similar polarity tetraol, whatever its origin, natural or not, vegetable or not, such as cell cultures of bark or yew leaves, cultures of fungi or their cell cultures, or mixtures of taxanes, residues of taxol extraction.
Les manipulations décrites en exemples ont été réalisées sur des feuilles séchées dont la teneur en tétraol était voisine de 500 mg/kg. Bien entendu, l'invention s'applique à des Taxus pauvres en tétraol (300 mg/kg) et a fortiori à des Taxus riches (1000 mg/kg et au-delà). Le procédé selon l'invention est caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : première étape d'extraction des feuilles d'if par un solvant polaire protique approprié pour obtenir une phase aqueuse contenant le tétraol, ladite phase aqueuse étant un extrait inital résultant directement de la pre¬ mière étape d'extraction ou étant obtenue après un traitement additionnel dudit extrait initial, deuxième étape d'extraction de ladite phase aqueuse par un solvant organique approprié essentiellement non miscible à l'eau, de manière à obtenir une phase organique riche en tétraol, puis dernière étape d'isolement du tétraol de ladite phase organique.The manipulations described in examples were carried out on dried leaves whose tetraol content was close to 500 mg / kg. Of course, the invention applies to Taxus poor in tetraol (300 mg / kg) and a fortiori to Taxus rich (1000 mg / kg and beyond). The method according to the invention is characterized in that it comprises the following stages: first stage of extraction of the yew leaves with a suitable protic polar solvent to obtain an aqueous phase containing tetraol, said aqueous phase being an initial extract resulting directly from the first extraction step or being obtained after an additional treatment of said initial extract, second step of extraction of said aqueous phase with a suitable organic solvent essentially immiscible with water, so as to obtain a phase organic rich in tetraol, then last step of isolating the tetraol from said organic phase.
L'extrait initial comprend généralement le tétraol en mélange avec des taxanes de polarité voisine, extraits par un même solvant polaire protique. Le but de la deuxième et de la dernière étape consiste alors, par un solvant organique approprié, à extraire et isoler le tétraol de ce mélange.The initial extract generally comprises the tetraol in mixture with taxanes of similar polarity, extracted by the same protic polar solvent. The purpose of the second and last step then consists, using an appropriate organic solvent, in extracting and isolating the tetraol from this mixture.
D'une manière avantageuse, les feuilles d'if sont séchées et/ou broyées. La première étape d'extraction est de préférence effectuée par macération dans le solvant polaire protique pour une durée comprise entre 15 minutes et 6 heures, de préférence 1 heure. L'extrait initial contenant le tétraol est ensuite récupéré, notam¬ ment par filtration.Advantageously, the yew leaves are dried and / or ground. The first extraction step is preferably carried out by maceration in the polar protic solvent for a period of between 15 minutes and 6 hours, preferably 1 hour. The initial extract containing the tetraol is then recovered, in particular by filtration.
L'homme du métier saura adapter le temps de macération en fonction du nombre choisi d'opérations d'extraction des feuilles. Ainsi, il pourra effectuer plusieurs macérations de 15 minutes avec de faibles quantités de solvant, ou au contraire effectuer une opération équivalente en une seule étape, additionnant les temps de macération et les volumes de solvant employés dans l'extraction multiple.A person skilled in the art will know how to adapt the maceration time as a function of the chosen number of leaf extraction operations. Thus, it can perform several 15-minute macerations with small amounts of solvent, or on the contrary perform an equivalent operation in a single step, adding up the maceration times and the volumes of solvent used in the multiple extraction.
Le nombre de macérations sera bien entendu choisi avec pour objectif d'épuiser les feuilles d'if de leur teneur en tétraol présent. Dans le cas de plusieurs macérations, les extraits de chaque macération sont alors regroupés pour donner l'extrait initial contenant le tétraol.The number of macerations will of course be chosen with the objective of depleting the yew leaves of their tetraol content present. In the case of several macerations, the extracts from each maceration are then combined to give the initial extract containing the tetraol.
La première étape d'extraction pourra également être conduite d'une manière avantageuse par macération dans le solvant polaire protique sous irradiation de micro-ondes ou d'ultra-sons pour une durée comprise entre 2 et 15 minutes.The first extraction step can also be carried out advantageously by maceration in the polar protic solvent under irradiation of microwaves or ultrasound for a period of between 2 and 15 minutes.
La température d'extraction est comprise entre 10°C et la tempéra¬ ture d'ébullition du solvant. Dans le cas d'un mélange de solvants, on choisira comme limite supérieure la température d'ébullition la plus basse des différents solvants, ou en présence d'un eutectique, la température d'ébullition de ce dernier.The extraction temperature is between 10 ° C and the boiling temperature of the solvent. In the case of a mixture of solvents, the lowest boiling point of the various solvents will be chosen as the upper limit, or in the presence of an eutectic, the boiling temperature of the latter.
La température préférée sera la température ambiante, que l'on définit dans la présente demande de brevet comme la température du labora- toire, comprise entre environ 15°C et environ 25°C. Bien entendu, il est compris qu'en fonction des variations saisonnières de température, cette température ambiante pourra être inférieure ou supérieure à la fourchette proposée. En fait, on définit plus simplement la température ambiante par la température de l'environnement dans lequel sera conduit le procédé, sans qu'il ne soit indispensable de fournir une énergie additionnelle au milieu d'extractions pour obtenir des rendements satisfaisants.The preferred temperature will be room temperature, which is defined in the present patent application as the temperature of the laboratory, between approximately 15 ° C. and approximately 25 ° C. Of course, it is understood that depending on the seasonal temperature variations, this ambient temperature may be lower or higher than the range proposed. In fact, the ambient temperature is more simply defined by the temperature of the environment in which the process will be carried out, without it being essential to supply additional energy to the extraction medium in order to obtain satisfactory yields.
Le solvant polaire protique est avantageusement choisi parmi l'eau, les alcools aliphatiques linéaires ou ramifiés en Ci-Cs, et les mélanges de ces solvants en toutes proportions. Selon le choix de ce premier solvant, l'homme du métier déterminera la nécessité d'effectuer l'étape facultative de traitement de l'extrait initial.The protic polar solvent is advantageously chosen from water, linear or branched Ci-Cs aliphatic alcohols , and mixtures of these solvents in all proportions. Depending on the choice of this first solvent, a person skilled in the art will determine the need to carry out the optional step of processing the initial extract.
Il pourra s'agir d'une simple évaporation de l'alcool aliphatique ou du mélange hydroalcoolique éventuellement additionné d'eau, de manière à obtenir un extrait en phase aqueuse. II pourra également s'agir d'une étape plus complexe où l'on cherche¬ ra à éliminer certaines impuretés présentes dans l'extrait initial contenant le tétraol par une extraction liquide/liquide avec un solvant hydrophobe.It could be a simple evaporation of the aliphatic alcohol or of the hydroalcoholic mixture possibly added with water, so as to obtain an extract in aqueous phase. It could also be a more complex step in which one seeks to eliminate certain impurities present in the initial extract containing the tetraol by a liquid / liquid extraction with a hydrophobic solvent.
Selon un premier mode de réalisation de l'invention, le solvant polaire protique est l'eau. Dans ce cas, la phase aqueuse contenant le tétraol est l'extrait initial résultant directement de la première étape. Cette phase aqueuse est alors traitée directement par le solvant organique approprié de manière à obtenir la phase organique riche en tétraol.According to a first embodiment of the invention, the protic polar solvent is water. In this case, the aqueous phase containing the tetraol is the initial extract resulting directly from the first step. This aqueous phase is then treated directly with the appropriate organic solvent so as to obtain the organic phase rich in tetraol.
Selon un deuxième mode de réalisation de l'invention, le solvant polaire protique est un mélange hydroalcoolique ou un alcool précité. Dans le cas d'un mélange hydroalcoolique essentiellement aqueux, on pourra considérer l'extrait initial comme étant la phase aqueuse résultant directement de la première étape. Toutefois et d'une manière générale, la phase aqueuse est avantageusement obtenue après un traitement de l'extrait initial consistant à évaporer l'alcool, et le cas échéant, à ajouter une quantité appropriée d'eau, avant efou après l'évaporation de l'alcool.According to a second embodiment of the invention, the protic polar solvent is a hydroalcoholic mixture or an abovementioned alcohol. In the in the case of an essentially aqueous hydroalcoholic mixture, the initial extract may be considered to be the aqueous phase resulting directly from the first step. However, in general, the aqueous phase is advantageously obtained after a treatment of the initial extract consisting of evaporating the alcohol, and if necessary, adding an appropriate quantity of water, before and after the evaporation of the alcohol.
Selon un troisième mode de réalisation de l'invention, le solvant polaire protique est le méthanol, avec une étape intermédiaire de traitement de l'extrait initial, comprenant les étapes suivantes consistant à : - éventuellement concentrer l'extrait initial p ar évaporation du méthanol , ajouter de l'eau à l'extrait contenant le tétraol dans un rapport en volume 1/1, extraire au moins une fois le mélange hydroalcoolique obtenu par un volume égal d'un mélange acétate d'éthyle/hexane dans un rapport en volume 1/1, récupérer la phase hydroalcoolique, et concentrer la phase hydroalcoolique en éliminant le méthanol, de manière à obtenir ladite phase aqueuse contenant le tétraol, utile pour la deuxième étape. Bien entendu, l'homme du métier saura adapter le procédé selon l'invention, en choisissant ou non d'effectuer le traitement additionnel de l'extrait initial en fonction de données telles que la teneur en alcool du solvant d'extraction des feuilles d'if.According to a third embodiment of the invention, the protic polar solvent is methanol, with an intermediate stage of treatment of the initial extract, comprising the following stages consisting of: - optionally concentrating the initial extract by evaporation of the methanol , add water to the extract containing tetraol in a 1/1 volume ratio, extract at least once the hydroalcoholic mixture obtained with an equal volume of an ethyl acetate / hexane mixture in a volume ratio 1/1, recover the hydroalcoholic phase, and concentrate the hydroalcoholic phase by removing the methanol, so as to obtain said aqueous phase containing the tetraol, useful for the second step. Of course, a person skilled in the art will know how to adapt the method according to the invention, by choosing whether or not to carry out the additional treatment of the initial extract as a function of data such as the alcohol content of the extracting solvent for the leaves of 'if.
Quelque soit ce solvant de départ employé, le résultat de la première étape d'extraction avec éventuellement le traitement additionnel consiste bien à obtenir une même phase aqueuse contenant le tétraol, laquelle sera extraite dans tous les cas de figure par un solvant organique essentiellement non miscible à l'eau, dans la deuxième étape du procédé.Whatever this starting solvent used, the result of the first extraction step with possibly the additional treatment consists in obtaining the same aqueous phase containing the tetraol, which will be extracted in all cases by an essentially immiscible organic solvent with water, in the second step of the process.
Ce solvant organique essentiellement non miscible à l'eau est avantageusement un hydrocarbure halogène. Il sera de préférence choisi parmi le chlorure de méthylène, le chloroforme et leurs mélanges.This essentially water-immiscible organic solvent is advantageously a halogenated hydrocarbon. It will preferably be chosen from methylene chloride, chloroform and their mixtures.
La deuxième étape pourra bien entendu être répétée plusieurs fois jusqu'à épuisement de la phase aqueuse en tétraol, les différentes fractions organiques étant alors réunies pour obtenir la phase organique riche en tétraol, utile pour la dernière étape.^ The second step can of course be repeated several times until the aqueous phase in tetraol is exhausted, the different fractions organic then being combined to obtain the organic phase rich in tetraol, useful for the last step. ^
Pour isoler le tétraol, la dernière étape commune à toutes les variantes consiste de préférence à évaporer le solvant organique, puis à reprendre le résidu sec par un solvant de cristallisation dans lequel il précipite sélectivement.To isolate the tetraol, the last step common to all the variants preferably consists in evaporating the organic solvent, then in taking up the dry residue with a crystallization solvent in which it selectively precipitates.
Ce solvant de cristallisation est de préférence l'acétonitrile. La solution de tétraol dans l'acétonitrile est laissée à reposer à une température comprise entre 0°C et la température ambiante, pour laisser précipiter le tétraol en laissant les impuretés dans le surnageant.This crystallization solvent is preferably acetonitrile. The solution of tetraol in acetonitrile is left to stand at a temperature of between 0 ° C. and room temperature, to allow the tetraol to precipitate, leaving the impurities in the supernatant.
Le solide précipité sera alors récupéré par les techniques usuelles de l'homme du métier, notamment par filtration et séchage.The precipitated solid will then be recovered by the usual techniques of those skilled in the art, in particular by filtration and drying.
Une purification supplémentaire, qui n'affecte pas le rendement d'extraction par rapport à la quantité de tétraol initialement présente dans la plante consiste à faire recristalliser le tétraol. Les solvants de recristallisation sont de préférence choisi parmi les mélanges (en volume) de solvants suivants :An additional purification, which does not affect the extraction yield relative to the amount of tetraol initially present in the plant, consists in recrystallizing the tetraol. The recrystallization solvents are preferably chosen from the following mixtures (by volume) of solvents:
- chlorure de méthylène/hexane : 1/1 à 1/3- methylene chloride / hexane: 1/1 to 1/3
- chlorure de méthylène/acétonitrile : 1/1 à 1/5- methylene chloride / acetonitrile: 1/1 to 1/5
- chlorure de méthylène/hexane/méthanol : 1/1/0,1 - acétone/hexane : 1/1 à 1/4- methylene chloride / hexane / methanol: 1/1 / 0.1 - acetone / hexane: 1/1 to 1/4
Après cette reprécipitation, la pureté du tétraol isolé est générale¬ ment très supérieure à 90% et le rendement d'extraction par rapport à la quantité de tétraol initialement présent dans le végétal est supérieur à 70% en masse. Les exemples ci-après permettent d'illustrer différentes conditions de mise en oeuvre du procédé selon l'invention.After this reprecipitation, the purity of the isolated tetraol is generally much greater than 90% and the extraction yield relative to the amount of tetraol initially present in the plant is greater than 70% by mass. The examples below make it possible to illustrate different conditions for implementing the method according to the invention.
Nous entendons par feuilles "séchées finement broyées" les sommi¬ tés feuillées séchées à température ambiante ou à température ne dépassant pas 70°C, d'une granulométire comprise entre 2 mm et 0,5 mm pour les fragments ligneux (moins de 15% masse/masse totale) et 2 mm à 100 μm pour les fragments de feuilles.We mean by "finely ground dried" leaves the leafy summits dried at room temperature or at a temperature not exceeding 70 ° C., with a particle size of between 2 mm and 0.5 mm for woody fragments (less than 15% mass / total mass) and 2 mm to 100 μm for leaf fragments.
Le dosage des feuilles est effectué de la manière suivante : la poudre de feuilles (prise d'essai de 50 g prélevée selon les techniques classiques d'échantillonnage) est extraite à deux reprises par 500 ml de méthanol à température ambiante. L'extrait obtenu est dosé en tétraol par CLHP par rapport à une gamme d'étalonnage réalisée avec un échantillon authentique. Le dosage est exprimé en mg de tétraol par kg de feuilles séchées.The dosage of the leaves is carried out as follows: the leaf powder (50 g test sample taken according to conventional sampling techniques) is extracted twice with 500 ml of methanol at ambient temperature. The extract obtained is dosed in tetraol by HPLC compared to a calibration range carried out with an authentic sample. The dosage is expressed in mg of tetraol per kg of dried leaves.
Les exemples présentés ont été réalisés sur une matière première dont la teneur en tétraol (en masse) exprimée par rapport à la feuille séchée est d'environ 500 mg/kg.The examples presented were carried out on a raw material whose tetraol content (by mass) expressed relative to the dried sheet is approximately 500 mg / kg.
L'analyse CLHP e st ré alisée sur du matériel WATERS-MILLIPORE (référence Millenium) en condition isocratique (H20/CH3CN : 75/25, 1 ml mn) sur colonne Lichrospher 100 MERCK (5 μm). La quantité injectée est de 20 μl, l'intégration est réalisée à 230 nm.The HPLC analysis is performed on WATERS-MILLIPORE material (Millenium reference) under isocratic conditions (H 2 0 / CH 3 CN: 75/25, 1 ml min) on a Lichrospher 100 MERCK column (5 μm). The quantity injected is 20 μl, integration is carried out at 230 nm.
Les conditions d'analyses CLHP sont identiques pour le dosage des feuilles et pour l'évaluation de la pureté du tétraol isolé lors des manipulations.The HPLC analysis conditions are identical for the dosage of the leaves and for the evaluation of the purity of the isolated tetraol during handling.
L'échantillon de référence ainsi que le tétraol extrait au cours des différentes manipulations présentées ont montré les mêmes caractéristiques spectrales que celles mentionnées dans la littérature ( 1H RMN, ! 3C RMN, UV, IR, point de fusion ...).The reference sample and the tetraol extracted during the various manipulations presented showed the same spectral characteristics as those mentioned in the literature (1 H NMR,! 3 C NMR, UV, IR, melting point, etc.).
EXEMPLE 1 : Extraction initiale des feuilles pour obtenir un extrait aqueuxEXAMPLE 1 Initial extraction of the leaves to obtain an aqueous extract
Différents modes d'extraction du tétraol par l'eau, le méthanol, l'éthanol ou l'isopropanol, ont été mis en oeuvre sous diverses conditions opératoires.Different modes of extraction of tetraol with water, methanol, ethanol or isopropanol, have been used under various operating conditions.
l.a Extraction par l'eau à température ambiantel.a Extraction with water at room temperature
200 g de feuilles séchées de Taxus baccata (titre en tétraol = 490 mg/kg) sont broyées finement puis extraites par 2 litres d'eau pendant 1 heure à température ambiante, sous agitation.200 g of dried Taxus baccata leaves (tetraol titer = 490 mg / kg) are finely ground and then extracted with 2 liters of water for 1 hour at room temperature, with stirring.
Après filtration sur "AF 15" (porosité 10 à 20 μm, FILTROX, Saint Gall, Suisse) et rinçage du marc par 0,7 litre d'eau, on obtient 2,2 litres de phase aqueuse et un marc épuisé en tétraol. l.b Extraction par l'eau à 60°CAfter filtration on "AF 15" (porosity 10 to 20 μm, FILTROX, Saint Gall, Switzerland) and rinsing of the marc with 0.7 liter of water, 2.2 liters of aqueous phase are obtained and a marc spent in tetraol. lb Water extraction at 60 ° C
200 g de feuilles séchées de Taxus baccata (titre en tétraol = 490 mg/kg) sont broyées finement puis extraites par deux fois 1 litre d'eau pendant 30 minutes à 60°C sous agitation.200 g of dried Taxus baccata leaves (tetraol titer = 490 mg / kg) are finely ground and then extracted twice with 1 liter of water for 30 minutes at 60 ° C with stirring.
Après filtration sur "AF 15" et rinçage du marc par 0,4 litre d'eau, on obtient 2 litres de phase aqueuse et un marc épuisé en tétraol.After filtration on "AF 15" and rinsing of the marc with 0.4 liter of water, 2 liters of aqueous phase are obtained and a spent marc in tetraol.
l.c Extraction par l'eau avec activation micr ondesl.c Water extraction with microwave activation
200 g de feuilles séchées de Taxus baccata (titre en tétraol = 505 mg/kg) sont broyées finement puis extraites par 2 litres d'eau sous activation micro-ondes (4 fois 30 secondes entrecoupées par 1 minute de repos) dans un four micro-ondes domestique (puissance absorbée = 1000 W). Après filtration sur "AF 15" et rinçage du marc par 0,7 litre d'eau, on obtient 2,2 litres de phase aqueuse et un marc épuisé en tétraol.200 g of dried Taxus baccata leaves (tetraol titer = 505 mg / kg) are finely ground and then extracted with 2 liters of water under microwave activation (4 times 30 seconds interspersed with 1 minute of rest) in a micro oven - domestic waves (absorbed power = 1000 W). After filtration on "AF 15" and rinsing of the marc with 0.7 liter of water, 2.2 liters of aqueous phase are obtained and a spent marc in tetraol.
l.d Extraction par l'eau avec activation par ultra-sonsl.d Extraction by water with activation by ultrasound
200 g de feuilles séchées de Taxus baccata (titre en tétraol = 500 mg/kg) sont broyées finement puis extraites par 2 litres d'eau pendant 2 minutes, avec une activation ultra-sons de 10 minutes (bac à ultra-sons FRITCH, référence 17.002, Germany).200 g of dried Taxus baccata leaves (tetraol titer = 500 mg / kg) are finely ground and then extracted with 2 liters of water for 2 minutes, with 10-minute ultrasonic activation (FRITCH ultrasonic tank, reference 17.002, Germany).
Après filtration sur "AF 15" et rinçage du marc par 0,4 litre d'eau, on obtient 2 litres de phase aqueuse et un marc épuisé en tétraol.After filtration on "AF 15" and rinsing of the marc with 0.4 liter of water, 2 liters of aqueous phase are obtained and a spent marc in tetraol.
l.e Extraction par le méthanoll.e Extraction with methanol
200 g de feuilles séchées de Taxus baccata (titre en tétraol = 500 mg/kg) sont broyées finement puis extraites par 2 litres de méthanol pendant 1 heure à température ambiante, sous agitation.200 g of dried Taxus baccata leaves (tetraol titer = 500 mg / kg) are finely ground and then extracted with 2 liters of methanol for 1 hour at room temperature, with stirring.
Après filtration sur "AF 15" et rinçage du marc par 0,7 litre de méthanol, on obtient 2,2 litres d'une phase méthanoHque enrichie en tétraol. A cet extrait méthanolique sont ajoutés 300 ml d'eau, le tout est concentré par évaporation puis ajusté de manière à obtenir 200 ml de phase aqueuse, puis filtré.After filtration on "AF 15" and rinsing of the marc with 0.7 liter of methanol, 2.2 liters of a methane phase enriched in tetraol are obtained. To this methanolic extract are added 300 ml of water, the whole is concentrated by evaporation then adjusted so as to obtain 200 ml of aqueous phase, then filtered.
l.f Extraction par l'éthanoll.f Ethanol extraction
200 mg de feuilles séchées de Taxus baccata (titre en tétraol = 490 mg/kg) sont broyées finement puis extraites par 2 litres d'éthanol pendant 1 heure à température ambiante, sous agitation.200 mg of dried leaves of Taxus baccata (tetraol titer = 490 mg / kg) are finely ground and then extracted with 2 liters of ethanol for 1 hour at room temperature, with stirring.
Après filtration sur "AF 15" et rinçage du marc par 0,7 litre d'étha- nol, on obtient 2,2 litres d'une phase éthanolique enrichie en tétraol. A cet extrait éthanolique sont ajoutés 300 ml d'eau, le tout est concentré par évaporation puis ajusté de manière à obtenir 200 ml de phase aqueuse, puis filtré.After filtration through "AF 15" and rinsing of the marc with 0.7 liters of ethanol, 2.2 liters of an ethanolic phase enriched in tetraol are obtained. To this ethanolic extract are added 300 ml of water, the whole is concentrated by evaporation and then adjusted so as to obtain 200 ml of aqueous phase, then filtered.
l.g Extraction par un mélange méthanol/eau (70/30)l.g Extraction with a methanol / water mixture (70/30)
200 g de feuilles séchées de Taxus baccata (titre en tétraol = 500 mg/kg) sont broyées finement puis extraites par 2 litres d'un mélange métha¬ nol/eau (70/30) pendant 1 heure à température ambiante, sous agitation. Après filtration sur "AF 15" et rinçage du marc par 0,7 litre d'un mélange méthanol/eau (70/30), on obtient 2,2 litres d'une phase hydroalcoolique enrichie en tétraol. Cet extrait est concentré par évaporation puis ajusté de manière à obtenir 200 ml de phase aqueuse d'extrait aqueux, puis filtré.200 g of dried Taxus baccata leaves (tetraol titer = 500 mg / kg) are finely ground and then extracted with 2 liters of a methanol / water mixture (70/30) for 1 hour at room temperature, with stirring. After filtration on "AF 15" and rinsing of the marc with 0.7 liter of a methanol / water mixture (70/30), 2.2 liters of an alcoholic phase enriched in tetraol are obtained. This extract is concentrated by evaporation and then adjusted so as to obtain 200 ml of aqueous phase of aqueous extract, then filtered.
l.h Extraction par un mélange éthanol/eau (70/30)l.h Extraction with an ethanol / water mixture (70/30)
200 g de feuilles séchées de Taxus baccata (titre en tétraol = 505 mg/kg) sont broyées finement puis extraites par 2 litres d'un mélange éthanol eau (70/30) pendant 1 heure à température ambiante, sous agitation. Après filtration sur "AF 15" et rinçage du marc par 0,7 litre d'un mélange éthanol/eau (70/30), on obtient 2.2. litres d'une phase hydroalcoolique enrichie en tétraol. Cet extrait est concentré par évaporation puis ajusté de manière à obtenir 200 ml de phase aqueuse, puis filtré. l.i Extraction par un mélange eau/isopropanol (1/1)200 g of dried Taxus baccata leaves (tetraol titer = 505 mg / kg) are finely ground and then extracted with 2 liters of an ethanol / water mixture (70/30) for 1 hour at room temperature, with stirring. After filtration on "AF 15" and rinsing of the marc with 0.7 liter of an ethanol / water mixture (70/30), 2.2 is obtained. liters of a hydroalcoholic phase enriched with tetraol. This extract is concentrated by evaporation then adjusted so as to obtain 200 ml of aqueous phase, then filtered. li Extraction with a water / isopropanol mixture (1/1)
200 g de feuilles séchées de Taxus baccata (titre en tétraol = 510 mg/kg) sont broyées finement puis extraites par 2 litres d'un mélange eau/iso- propanol (1/1) pendant 1 heure à température ambiante, sous agitation.200 g of dried Taxus baccata leaves (tetraol titer = 510 mg / kg) are finely ground and then extracted with 2 liters of a water / isopropanol mixture (1/1) for 1 hour at room temperature, with stirring.
Après filtration sur "AF 15" et rinçage du marc par 0,7 litre d'un mélange eau/isopropanol (171), on obtient 2,2 litres d'une phase hydroalcoolique enrichie en tétraol. Cet extrait est concentré par évaporation puis ajusté de manière à obtenir 200 ml de phase aqueuse, puis filtré.After filtration on "AF 15" and rinsing of the marc with 0.7 liter of a water / isopropanol mixture (171), 2.2 liters of an aqueous alcoholic phase enriched in tetraol are obtained. This extract is concentrated by evaporation then adjusted so as to obtain 200 ml of aqueous phase, then filtered.
l.j Extraction par le méthanol à deux reprisesl.j Extraction with methanol twice
200 g de feuilles séchées de Taxus baccata (titre en tétraol = 500 mg kg) sont broyées finement puis extraites par 2 litres de méthanol pendant 1 heure à température ambiante, sous agitation.200 g of dried leaves of Taxus baccata (tetraol titer = 500 mg kg) are finely ground and then extracted with 2 liters of methanol for 1 hour at room temperature, with stirring.
Le marc est séparé de l'extrait méthanolique. Le marc récupéré est extrait à nouveau par 1,5 litres de méthanol pendant une heure à température ambiante, puis rincé par 0,7 litre de méthanol. Les extraits méthanoliques réunis représentent 3,7 litres. A cet extrait méthanolique enrichi en tétraol sont ajoutés 350 ml d'eau, le tout est concentré par évaporation puis ajusté de manière à obtenir 200 ml de phase aqueuse, puis filtré.The marc is separated from the methanolic extract. The marc recovered is extracted again with 1.5 liters of methanol for one hour at room temperature, then rinsed with 0.7 liters of methanol. The methanolic extracts combined represent 3.7 liters. To this methanolic extract enriched in tetraol are added 350 ml of water, the whole is concentrated by evaporation then adjusted so as to obtain 200 ml of aqueous phase, then filtered.
EXEMPLE 2. Extraction de la phase aqueuse et isolement purification du tétraolEXAMPLE 2. Extraction of the aqueous phase and isolation purification of the tetraol
2.a Extraction par le chlorure de méthylène2.a Extraction with methylene chloride
2,2 litres d'une phase aqueuse enrichie en tétraol, obtenue en l.a, sont extraits par quatre fois 1,5 litres de chlorure de méthylène. Les phases organiques sont réunies, (séchées sur Na2SU4) puis le solvant est évaporé sous pression réduite (25 mm Hg) à 40°C. On obtient 1,5 g d'un résidu solide, pulvérulent, de couleur brun clair. Ce résidu est dissous par 5 ml d'acétonitrile, puis abandonné 15 heures à température ambiante pendant lesquelles le tétraol précipite.2.2 liters of an aqueous phase enriched in tetraol, obtained in la, are extracted with four times 1.5 liters of methylene chloride. The organic phases are combined, (dried over Na 2 SU 4 ) then the solvent is evaporated under reduced pressure (25 mm Hg) at 40 ° C. 1.5 g of a solid, powdery residue of light brown color are obtained. This residue is dissolved in 5 ml of acetonitrile, then left for 15 hours at room temperature during which the tetraol precipitates.
On récupère (après filtration sur fritte n° 4, rinçage par 2 ml CH3CN) 92,5 mg de poudre blanche titrant 90% en 10-désacétylbaccatine III (dosage CLHP décrit plus haut).92.5 mg of white powder titrating 90% 10-deacetylbaccatin III (HPLC assay described above) is recovered (after filtration on frit No. 4, rinsing with 2 ml CH 3 CN).
Il est éventuellement possible d'améliorer la pureté du produit obtenu en opérant une ultime purification. Le produit est solubilisé dans le mélange CΗ.2Ci2/hexane (1/1) et mis à précipiter de manière analogue à l'étape précédente. Le tétraol ainsi purifié (84,1 mg) atteint alors une pureté de plus de 99%, 85% de la quantité de tétraol initialement présent dans la poudre de feuilles étant ainsi obtenu.It is optionally possible to improve the purity of the product obtained by carrying out a final purification. The product is dissolved in the mixture CΗ. 2 Ci 2 / hexane (1/1) and precipitated in a similar manner to the previous step. The tetraol thus purified (84.1 mg) then reaches a purity of more than 99%, 85% of the amount of tetraol initially present in the leaf powder being thus obtained.
Cette dernière étape de purification effectuée avec un mélange acétone/hexane (1/1) ou
Figure imgf000014_0001
(1/5) donne la même quantité de tétraol (84,15 mg) de pureté voisine de 100%.This last purification step carried out with an acetone / hexane mixture (1/1) or
Figure imgf000014_0001
(1/5) gives the same amount of tetraol (84.15 mg) of purity close to 100%.
2.b extraction par le chloroforme2.b chloroform extraction
2,2 litres d'une phase aqueuse enrichie en tétraol, obtenue en suivant le mode opératoire décrit en l.a, sont extraits par quatre fois 1,5 litres de chloroforme. Les phases organiques sont réunies et portées à sec sous pression réduite (25 mm Hg) à 40°C.2.2 liters of an aqueous phase enriched in tetraol, obtained by following the procedure described in l.a, are extracted with four times 1.5 liters of chloroform. The organic phases are combined and brought to dryness under reduced pressure (25 mm Hg) at 40 ° C.
On obtient 1,6 g d'un résidu solide, pulvérulent, de couleur brun clair. Ce résidu est dissous par 5 ml d'acétonitrile, puis abandonné 15 heures à température ambiante pendant lesquelles le tétraol précipite.1.6 g of a solid, powdery residue of light brown color are obtained. This residue is dissolved in 5 ml of acetonitrile, then left for 15 hours at room temperature during which the tetraol precipitates.
On récupère (après filtration sur fritte n° 4, rinçage par 2 ml CH3CN) 95,7 mg de poudre blanche titrant 85% en 10-désacétylbaccatine III (dosage CLHP décrit plus haut).95.7 mg of white powder titrating 85% 10-deacetylbaccatin III (HPLC assay described above) is recovered (after filtration on frit No. 4, rinsing with 2 ml CH 3 CN).
Il est éventuellement possible d'améliorer la pureté du produit obtenu en opérant une ultime purification. Le produit est solubilisé dans le mélange CH2θ2/hexane (1/1) et mis à précipiter de manière analogue à l'étape précédente. Le titre du tétraol ainsi purifié (82,1 mg) atteint alors plus de 99%. La quantité de tétraol ainsi extraite représente 83% en masse de la quantité de tétraol initalement présent dans la poudre de feuilles. Cette dernière étape de purification effectuée avec un mélange acétone/hexane (1/1) ou acétonitrile/CH2θ2 (5/1) donne la même quantité de tétraol (81,4 mg) de pureté voisine de 100%.It is optionally possible to improve the purity of the product obtained by carrying out a final purification. The product is dissolved in the CH 2 θ 2 / hexane mixture (1/1) and allowed to precipitate in a similar manner to the previous step. The tetraol titer thus purified (82.1 mg) then reaches more than 99%. The amount of tetraol thus extracted represents 83% by mass of the amount of tetraol initially present in the leaf powder. This last purification step carried out with an acetone / hexane (1/1) or acetonitrile / CH 2 θ 2 (5/1) mixture gives the same amount of tetraol (81.4 mg) of purity close to 100%.
2.c extraction par le chlorure de méthylène2.c extraction with methylene chloride
Le mode opératoire décrit en 2a est repris pour la phase aqueuse obtenue en l.c.The procedure described in 2a is repeated for the aqueous phase obtained in l.c.
On obtient 90,4 mg de tétraol titrant 86% (avant l'ultime purifica- tion) et correspondant à 77% en masse de la quantité de tétraol initialement présente dans la poudre de feuilles.90.4 mg of tetraol is obtained, grading 86% (before the final purification) and corresponding to 77% by mass of the quantity of tetraol initially present in the leaf powder.
2.d Extraction par le chlorure de méthylène2.d Extraction with methylene chloride
Le mode opératoire décrit en 2. a est repris pour la phase aqueuse obtenue en l.e.The procedure described in 2. a is repeated for the aqueous phase obtained in l.e.
On obtient 97,7 mg de tétraol titrant 86% (avant l'ultime purifica¬ tion) et correspondant à 84% en masse de la quantité de tétraol initialement présente dans la poudre de feuilles.97.7 mg of tetraol is obtained, titrating 86% (before the final purification) and corresponding to 84% by mass of the amount of tetraol initially present in the leaf powder.
2.e Extraction par le chlorure de méthylène2.e Extraction with methylene chloride
Le mode opératoire décrit en 2. a est repris pour la phase aqueuse obtenue en l.f. On obtient 95,7 mg de tétraol titrant 85% (avant l'ultime purifica¬ tion) et correspondant à 83% en masse de la quantité de tétraol initialement présente dans la poudre de feuilles.The procedure described in 2. a is repeated for the aqueous phase obtained in l.f. 95.7 mg of tetraol is obtained, titrating 85% (before the final purification) and corresponding to 83% by mass of the amount of tetraol initially present in the leaf powder.
2.f Extraction par le chlorure de méthylène2.f Extraction with methylene chloride
Le mode opératoire décrit en 2. a est repris pour la phase aqueuse obtenue en l.g. On obtient 98,8 mg de tétraol titrant 82% (avant l'ultime purifica¬ tion) et correspondant à 81% en masse de la quantité de tétraol initialement présente dans la poudre de feuilles.The procedure described in 2. a is repeated for the aqueous phase obtained in lg 98.8 mg of tetraol is obtained, titrating 82% (before the final purification) and corresponding to 81% by mass of the amount of tetraol initially present in the leaf powder.
EXEMPLE 3 : Extraction liquide/liquide intermédiaire par mélange quaternaire de solvants sur un extrait initial méthanoli¬ que concentré avant l'extraction classique par un solvant chloréEXAMPLE 3 Liquid / intermediate liquid extraction by quaternary mixture of solvents on an initial methanoli¬ extract that concentrated before conventional extraction with a chlorinated solvent
200 g de feuilles de Taxus baccata (titre en tétraol = 500 mg/kg) sont broyées puis extraites une seule fois par 2 litres de MeOH à température ambiante pendant 1 heure.200 g of Taxus baccata leaves (tetraol titer = 500 mg / kg) are ground and then extracted once with 2 liters of MeOH at room temperature for 1 hour.
Ces 2 litres sont concentrés à 400 ml. Sont ajoutés à cette phase méthanoHque 400 ml d'H2θ, 400 ml d'hexane et 400 ml d'acétate d'éthyle afin de réaliser une première extraction liquide/liquide. La phase hydroalcoolique récupérée est soumise à une deuxième extraction volume à volume par la phase organique du mélange quaternaire suivant, méthanol/H2θ/hexane/acé- tate d'éthyle (1/1/1/1). La phase hydro alcoolique récupérée est concentrée jusqu'à élimina¬ tion complète du méthanol.These 2 liters are concentrated to 400 ml. 400 ml of H 2 θ, 400 ml of hexane and 400 ml of ethyl acetate are added to this methane phase in order to carry out a first liquid / liquid extraction. The hydroalcoholic phase recovered is subjected to a second volume-to-volume extraction with the organic phase of the following quaternary mixture, methanol / H 2 θ / hexane / ethyl acetate (1/1/1/1). The hydro alcoholic phase recovered is concentrated until complete elimination of methanol.
La phase aqueuse est épuisée quatre fois (v/v) par du CH2CI2. Ce dernier est alors concentré à 100 ml puis lavé par 50 ml d'une solution aqueuse de Na2C03 (5%). La phase CH2CI2 est séchée sur Na2S04, auxquels sont ajoutés 30 ml de CH3CN. Après précipitation/cristallisation, on récupère 82,3 mg de tétraol titrant 85% (avant l'ultime purification) et correspondant à 70% en masse de la quantité de tétraol initialement présente dans la poudre de feuilles. EXEMPLE 4. Extraction et isolement du tétraol à l'échelle industrielleThe aqueous phase is exhausted four times (v / v) with CH 2 CI 2 . The latter is then concentrated to 100 ml and then washed with 50 ml of an aqueous solution of Na 2 C0 3 (5%). The CH2CI2 phase is dried over Na 2 S0 4 , to which 30 ml of CH3CN are added. After precipitation / crystallization, 82.3 mg of tetraol titrating 85% is recovered (before the final purification) and corresponding to 70% by mass of the amount of tetraol initially present in the leaf powder. EXAMPLE 4. Extraction and isolation of tetraol on an industrial scale
4.a extraction par l'eau4.a water extraction
30 kg de feuilles séchées de Taxus baccata (titre en tétraol = 495 mg/kg) sont broyées finement puis extraites par 300 litres d'eau dans un réacteur inox de 600 litres pendant 1 heure à température ambiante, sous agitation.30 kg of dried Taxus baccata leaves (tetraol titer = 495 mg / kg) are finely ground and then extracted with 300 liters of water in a 600-liter stainless steel reactor for 1 hour at room temperature, with stirring.
Après essorage sur essoreuse ROBATEL SLP munie d'une toile nylon de 20 μm et rinçage du marc par 105 litres d'eau, on obtient 330 litres d'une phase aqueuse enrichie en tétraol.After spinning on a ROBATEL SLP wringer fitted with a 20 μm nylon fabric and rinsing of the marc with 105 liters of water, 330 liters of an aqueous phase enriched with tetraol are obtained.
Cette phase aqueuse est extraite par quatre fois 225 litres de dichlorométhane. Les phases organiques réunies sont séchées sur Na2S04 puis évaporées sous vide jusqu'à siccité. On obtient 225 g d'un résidu solide pulvérulent brun clair.This aqueous phase is extracted with four times 225 liters of dichloromethane. The combined organic phases were dried over Na2S0 4 and then evaporated to dryness in vacuo. 225 g of a light brown powdery solid residue are obtained.
Ce résidu est dissous dans 1 litre d'acétonitrile puis la solution est abandonnée 15 heures à température ambiante, pendant lesquelles le tétraol précipite (13,8 g).This residue is dissolved in 1 liter of acetonitrile then the solution is left for 15 hours at room temperature, during which the tetraol precipitates (13.8 g).
Après recristallisation de ce précipité, on obtient 12,17 g de tétraol sous forme de poudre blanche titrant 100% de 10-désacétylbaccatine III.After recrystallization of this precipitate, 12.17 g of tetraol are obtained in the form of a white powder titrating 100% of 10-deacetylbaccatin III.
Le rendement d'extraction par rapport à la quantité de tétraol initialement présente dans les feuilles est de 82% en masse.The extraction yield relative to the amount of tetraol initially present in the leaves is 82% by mass.
4.b extraction par le méthanol4.b methanol extraction
30 kg de feuilles séchées de Taxus baccata (titre en tétraol = 490 mg/kg) sont broyées finement puis extraites par 300 litres de méthanol pendant une heure à température ambiante sous agitation.30 kg of dried Taxus baccata leaves (tetraol titer = 490 mg / kg) are finely ground and then extracted with 300 liters of methanol for one hour at room temperature with stirring.
Après filtration sur AF 15 et rinçage du marc par 105 litres de méthanol, on obtient après addition de 50 litres d'eau et concentration par évaporation jusqu'à un volume de 30 litres environ une phase aqueuse enrichie en tétraol. Cette phase aqueuse ajustée à 42 litres par addition d'eau, filtrée sur AF 15 est extraite par quatre fois 27 litres de dichlorométhane. Les phases organiques sont réunies après concentration. Le solvant organique est évaporé.After filtration on AF 15 and rinsing of the marc with 105 liters of methanol, an aqueous phase enriched in tetraol is obtained after adding 50 liters of water and concentration by evaporation to a volume of about 30 liters. This aqueous phase, adjusted to 42 liters by addition of water, filtered on AF 15, is extracted with four times 27 liters of dichloromethane. The organic phases are combined after concentration. The organic solvent is evaporated.
On obtient 220 g d'un résidu solide pulvérulent brun clair. Ce résidu est dissous dans 0,80 litre d'acétonitrile puis la solution est abandonnée 15 heures à température ambiante, pendant lesquelles le tétraol précipite.220 g of a light brown powdery solid residue are obtained. This residue is dissolved in 0.80 liters of acetonitrile and then the solution is left for 15 hours at room temperature, during which the tetraol precipitates.
Après recristallisation de ce précipité dans le mélange CH2CI2/CH3CN (1/5), on obtient 12,37 g tétraol sous forme de poudre blanche titrant 95% en 10-désacétylbaccatine III.After recrystallization of this precipitate from the CH 2 CI 2 / CH 3 CN mixture (1/5), 12.37 g tetraol are obtained in the form of a white powder titrating 95% in 10-deacetylbaccatin III.
Le rendement d'extraction par rapport à la quantité de tétraol initialement présente dans les feuilles est de 80% en masse.The extraction yield relative to the amount of tetraol initially present in the sheets is 80% by mass.
4.c Extraction parle méthanol et extractions liquide/liquide par mélange quaternaire4.c Extraction by methanol and liquid / liquid extractions by quaternary mixture
30 kg de feuilles séchées de Taxus baccata (titre en tétraol = 505 mg/kg) sont broyées finement puis extraites par 300 litres de méthanol pendant 1 heure à température ambiante. Après filtration et rinçage du marc par deux fois 30 litres de métha¬ nol, on obtient 320 litres d'une phase méthanoHque enrichie en taxanes.30 kg of dried leaves of Taxus baccata (tetraol titer = 505 mg / kg) are finely ground and then extracted with 300 liters of methanol for 1 hour at room temperature. After filtration and rinsing of the marc with twice 30 liters of methanol, 320 liters of a methane phase enriched in taxanes are obtained.
La phase méthanoHque est concentrée et ajustée à 60 litres.The methane phase is concentrated and adjusted to 60 liters.
On ajoute alors à la phase méthanolique 60 litres d'eau, 60 litres d'hexane et 60 litres d'acétate d'éthyle, on effectue une première extraction Hquide/liquide et l'on récupère la phase hydroalcoolique (125 Htres environ).60 liters of water, 60 liters of hexane and 60 liters of ethyl acetate are then added to the methanolic phase, a first Hquide / liquid extraction is carried out and the hydroalcoholic phase is recovered (approximately 125 hectares).
La phase hydro alcoolique est à nouveau extraite par 100 litres de la phase organique du mélange quaternaire eau/méthanol/hexane/acétate d'éthyle (1/1/1/1) préparée séparément.The hydroalcoholic phase is again extracted with 100 liters of the organic phase of the quaternary water / methanol / hexane / ethyl acetate mixture (1/1/1/1) prepared separately.
La phase hydroalcoolique est récupérée et concentrée jusqu'à élimination du méthanol.The hydroalcoholic phase is recovered and concentrated until the methanol is eliminated.
On obtient 52 Htres d'une phase aqueuse enrichie en tétraol.52 hectares are obtained from an aqueous phase enriched in tetraol.
La phase aqueuse est extraite par quatre fois 53 litres de chloro¬ forme. Les phases organiques enrichies en tétraol sont réunies, et le solvant organique est évaporé. On obtient 285 g d'un résidu solide pulvérulent.The aqueous phase is extracted with four times 53 liters of chloroform. The organic phases enriched in tetraol are combined, and the organic solvent is evaporated. 285 g of a solid pulverulent residue are obtained.
Le résidu est repris par deux Htres d'acétonitrile puis après précipita¬ tions, on obtient 12,47 g de poudre blanchâtre , titrant 85% en tétraol.The residue is taken up in two hectares of acetonitrile, then after precipitation, 12.47 g of whitish powder are obtained, titrating 85% in tetraol.
Le rendement d'extraction par rapport à la quantité de tétraol initialement présente dans les feuilles est de 70% en masse.The extraction yield relative to the amount of tetraol initially present in the sheets is 70% by mass.
La pureté est améliorée par une reprécipitation par le système CH2Cl2/hexane (1/1) pour atteindre 98% sans altérer le rendement d'extraction (70%). On obtient alors 10,82 g de tétraol titrant 98%.The purity is improved by reprecipitation by the CH 2 Cl 2 / hexane system (1/1) to reach 98% without altering the extraction yield (70%). 10.82 g of tetraol grading 98% are then obtained.
4.d Extraction par l'éthanol4.d Ethanol extraction
30 kg de feuilles séchées de Taxus baccata (titre en tétraol = 500 mg/kg) sont broyées finement puis extraites par 300 litres d'éthanol pendant 1 heure à température ambiante, sous agitation. Après essorage sur essoreuse ROBATEL SLP munie d'une toile nylon de 20 μm et rinçage du marc par 105 litres d'éthanol, on obtient après addition de 50 litres d'eau et concentration par évaporation jusqu'à un volume de 30 litres environ une phase aqueuse enrichie en tétraol.30 kg of dried Taxus baccata leaves (tetraol titer = 500 mg / kg) are finely ground and then extracted with 300 liters of ethanol for 1 hour at room temperature, with stirring. After spinning on a ROBATEL SLP extractor fitted with a 20 μm nylon fabric and rinsing of the marc with 105 liters of ethanol, after 50 liters of water are added and concentration by evaporation to a volume of about 30 liters. aqueous phase enriched with tetraol.
Cette phase aqueuse ajustée par addition d'eau à 42 litres est extraite par quatre fois 27 litres de dichlorométhane. Les phases organiques sont réunies après concentration. Le solvant organique est évaporé.This aqueous phase, adjusted by adding water to 42 liters, is extracted with four times 27 liters of dichloromethane. The organic phases are combined after concentration. The organic solvent is evaporated.
On obtient 225 g d'un résidu solide pulvérulent brun clair.225 g of a light brown powdery solid residue are obtained.
Ce résidu est dssous dans 1,2 litres d'acétonitrile puis la solution est abandonnée 15 heures à température ambiante, pendant lesquelles le tétraol précipite.This residue is dissolved in 1.2 liters of acetonitrile and then the solution is left for 15 hours at room temperature, during which the tetraol precipitates.
Après recristallisation de ce précipité par le mélange dichloromé- thane/hexane (1/1), on obtient 10,9 g de tétraol sous forme de poudre blanche titrant 95% en 10-désacétylbaccatine III.After recrystallization of this precipitate from the dichloromethane / hexane mixture (1/1), 10.9 g of tetraol are obtained in the form of a white powder titrating 95% in 10-deacetylbaccatin III.
Le rendement d'extraction par rapport à la quantité de tétraol initialement présente dans les feuilles est de 69% en masse. The extraction yield relative to the amount of tetraol initially present in the leaves is 69% by mass.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé d'extraction et d'isolement de la 10-désacétylbaccatine III (tétraol) à partir de feuilles d'if, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : - première étape d'extraction des feuilles d'if par un solvant polaire protique approprié pour obtenir une phase aqueuse contenant le tétraol, ladite phase aqueuse étant un extrait initial résultant directement de la première étape d'extraction ou étant obtenue après un traitement additionnel dudit extraitinitial, - deuxième étape d'extraction de ladite phase aqueuse par un solvant organique approprié essentiellement non miscible à l'eau, de manière à obtenir une phase organique riche en tétraol, puis dernière étape d'isolement du tétraol de ladite phase organique.1. Method for extracting and isolating 10-deacetylbaccatin III (tetraol) from yew leaves, characterized in that it comprises the following steps: - first step for extracting yew leaves by a polar protic solvent suitable for obtaining an aqueous phase containing tetraol, said aqueous phase being an initial extract resulting directly from the first extraction step or being obtained after an additional treatment of said initial extract, - second step of extraction of said aqueous phase with a suitable organic solvent essentially immiscible with water, so as to obtain an organic phase rich in tetraol, then last step of isolation of the tetraol from said organic phase.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les feuilles d'if sont séchées et/ou broyées.2. Method according to claim 1, characterized in that the yew leaves are dried and / or ground.
3. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2 caractérisé en ce que les feuilles d'if sont extraites par macération, dans le solvant polaire protique pour une durée comprise entre 15 minutes et 6 heures, de préférence 1 heure.3. Method according to one of claims 1 or 2 characterized in that the yew leaves are extracted by maceration, in the polar protic solvent for a period of between 15 minutes and 6 hours, preferably 1 hour.
4. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que la première étape d'extraction des feuilles d'if est effectuée par macération dans le solvant polaire protique sous irradiation de micro-ondes ou d'ultra-sons, pour une durée comprise entre 2 et 15 minutes.4. Method according to one of claims 1 or 2, characterized in that the first stage of extraction of the yew leaves is carried out by maceration in the polar protic solvent under irradiation of microwaves or ultrasound, for a duration between 2 and 15 minutes.
5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que les feuilles d'if sont extraites à une température comprise entre 10°C et la température d'ébuHition du solvant polaire protique.5. Method according to one of claims 1 to 4, characterized in that the yew leaves are extracted at a temperature between 10 ° C and the boiling point of the protic polar solvent.
6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le solvant polaire protique est choisi parmi l'eau, les alcools aliphatiques linéaires ou ramifiés en C1-C3, et les mélanges de ces solvants en toutes proportions. 6. Method according to one of claims 1 to 5, characterized in that the protic polar solvent is chosen from water, linear or branched C 1 -C 3 aliphatic alcohols, and mixtures of these solvents in all proportions .
7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que le solvant polaire protique est l'eau.7. Method according to claim 6, characterized in that the protic polar solvent is water.
8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que la phase aqueuse contenant le tétraol est l'extrait initial résultant directement de la première étape. 8. Method according to claim 7, characterized in that the aqueous phase containing the tetraol is the initial extract resulting directly from the first step.
9. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que le solvant polaire protique est un mélange hydroalcooHque ou un alcool.9. Method according to claim 6, characterized in that the protic polar solvent is a hydroalcooHque mixture or an alcohol.
10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que la phase aqueuse est obtenue après un traitement de l'extrait initial consistant à évaporer l'alcool, et le cas échéant, à ajouter une quantité appropriée d'eau, avant et ou après l'évaporation de l'alcool.10. Method according to claim 9, characterized in that the aqueous phase is obtained after a treatment of the initial extract consisting of evaporating the alcohol, and if necessary, adding an appropriate amount of water, before and or after alcohol evaporation.
11. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que le solvant polaire protique est le méthanol et la phase aqueuse est obtenue après un traitement de l'extrait initial, comprenant les étapes suivantes consistant à : - éventueUement concentrer l'extrait initial par évaporation du méthanol,11. Method according to claim 9, characterized in that the protic polar solvent is methanol and the aqueous phase is obtained after a treatment of the initial extract, comprising the following steps consisting in: - optionally concentrating the initial extract by evaporation methanol,
- ajouter de l'eau à l'extrait contenant le tétraol dans un rapport en volume 1/1,- add water to the extract containing the tetraol in a 1/1 volume ratio,
- extraire au moins une fois le mélange hydroalcoolique obtenu par un volume égal d'un mélange acétate d'éthyle/hexane dans un rapport en volume 1/1, - récupérer la phase hydro alcoolique, et concentrer la phase hydroalcoolique en évaporant le méthanol.- extract at least once the hydroalcoholic mixture obtained by an equal volume of an ethyl acetate / hexane mixture in a volume ratio 1/1, - recover the hydroalcoholic phase, and concentrate the hydroalcoholic phase by evaporating the methanol.
12. Procédé selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisé en ce que le solvant organique approprié essentiellement non miscible à l'eau est un hydrocarbure halogène, préférentiellement choisi parmi le chlorure de méthy- lène, le chloroforme et leurs mélanges.12. Method according to one of claims 1 to 11, characterized in that the appropriate organic solvent essentially immiscible with water is a halogenated hydrocarbon, preferably chosen from methylene chloride, chloroform and their mixtures.
13. Procédé selon l'une des revendications 1 à 12, caractérisé en ce que le tétraol est isolé par évaporation du solvant organique approprié, puis par reprise du résidu par un solvant de cristaUisation dans lequel il précipite.13. Method according to one of claims 1 to 12, characterized in that the tetraol is isolated by evaporation of the appropriate organic solvent, then by taking up the residue with a crystallization solvent in which it precipitates.
14. Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que le solvant de cristaUisation est acétonitrile.14. Method according to claim 13, characterized in that the cristaUisation solvent is acetonitrile.
15. Procédé selon l'une des revendications 13 ou 14, caractérisé en ce qu'une purification supplémentaire du produit de cristallisation par l'acéton¬ itrile est opérée par recristallisation dans l'un des mélanges (volume/volume) de solvants suivants : - chlorure de méthylène/hexane : 1/1 à 1/315. Method according to one of claims 13 or 14, characterized in that additional purification of the crystallization product with acetonitrile is carried out by recrystallization from one of the mixtures (volume / volume) of the following solvents: - methylene chloride / hexane: 1/1 to 1/3
- chlorure de méthylène/acétonitrile : 1/1 à 1/5- methylene chloride / acetonitrile: 1/1 to 1/5
- chlorure de méthylène/hexane/méthanol : 1/1/0,1 acétone/hexane : 1/1 à 1/4 - methylene chloride / hexane / methanol: 1/1 / 0.1 acetone / hexane: 1/1 to 1/4
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