' CA 02275980 1999-06-22 PROCÉDÉ DE RÉCUPÉRATION DE PACITAXELINE~
Ä PARTIR DE SOURCES NATURELLES
1. PROBL~ME TECHNIQUE Ä RÉSOUDRE
La Pacitaxeline~ est un agent anticancéreux très efficace. Le facteur qui a limité le développement de ce médicament végétal est sa faible teneur dans les espèces végétales qui en contiennent comme les ifs, mais aussi les faibles rendements des procédés d'extraction connus.
Des synthèses chimiques ont été proposées et ont permis l'obtention de Pacitaxeline~ (aussi appelé Taxol ou Paclitaxel), de formule chimique 0 Ac0 0 OH
Ph' ' NH
0 ' ~ 0 Ph HO ' 0 OCOPh OAc OH
La complexité des _-ynthèses chimiques mises en oeuvre et leur rendement modéré génèrent des coûts très élevés. 'CA 02275980 1999-06-22 PACITAXELIN RECOVERY PROCESS ~
FROM NATURAL SOURCES
1. TECHNICAL PROBLEM TO SOLVE
Pacitaxeline ~ is a very effective anticancer agent. The factor that limited development of this herbal medicine is its low content in the plant species which contain it like the yew, but also the weak ones yields from known extraction processes.
Chemical syntheses have been proposed and have made it possible to obtain Pacitaxeline ~ (also called Taxol or Paclitaxel), with the chemical formula 0 Ac0 0 OH
Ph '' NH
0 ' ~ 0 Ph HO ' 0 OCOPh OAc OH
The complexity of the chemical methods used and their yield moderate generate very high costs.
2. AVANTAGES RECHERCHÉS
II existait un besoin pour un procédé permettant l'extraction et la purification de Pacitaxeline~ avec des rendements élevés en raison d'une quantité limitée de ressources naturelles susceptibles de fournir le principe actif recherché et en raison des contraintes environnementales. 2. ADVANTAGES SOUGHT
There was a need for a process allowing the extraction and the purification of Pacitaxeline ~ with high yields due to a limited amount of natural resources likely to provide the desired active ingredient and in due to environmental constraints.
3. DESCRIPTION DE L'INVENTION
L'objet de la présente invention est donc un procédé permettant la récupération de Pacitaxeline~ à partir de sources naturelles.
' CA 02275980 1999-06-22 Selon une première variante, le procédé de l'invention permettant de récupérer, avec des rendements élevés, la Pacitaxeline~ à partir d'une source naturelle est caractérisé en ce que - dans une première étape, la source naturelle contenant du Pacitaxeline~
est séchée et broyée, puis l'huile résultant du broyage est récupérée par extraction et enrichie a des teneurs en Pacitaxeline~ comprises entre 3 à
5%, l'enrichissement incluant une étape de décoloration partielle par précipitation soit en milieu basique soit en milieu acide;
- dans une deuxième étape, le précipité récupéré est solubilisé en présence d'un solvant apolaire, puis la solution ainsi formée est percolorée à l'aide d'hexane;
- dans une troisième étape, la solution obtenue par percoloration est séparée en une phase huileuse et en une phase hexane, chaque phase est soumise à un traitement d'enrichissement en Pacitaxeline~, la phase huileuse étant enrichie jusqu'à une teneur en Pacitaxeline~ comprise entre 25 et 30% et la phase hexane est enrichie jusqu'à des teneurs en Pacitaxeline~
comprises entre 15 et 20%, de plus, au cours de l'enrichissement de la phase huileuse, les contaminants sont extraits, - dans une quatrième étape, les phases huileuses et hexanes enrichies sont mélangées et la solution ainsi obtenue est soumise à un traitement d'enrichissement jusqu'à des teneurs de 50 à 60% en Pacitaxeline~, cette étape d'enrichissement comprenant une étape de précipitation en milieu acide dans le cas où la décoloration partielle de la première étape a été
réalisée en milieu basique ou une étape de précipitation en milieu basique dans le cas où la décoloration partielle de la première étape a été réalisée en milieu acide, et - dans une cinquième étape, la solution enrichie obtenue dans la quatrième étape est enrichie par chromotagraphie jusqu'à une teneur de 98-99% en Pacitaxeline~.
Le procédé en question est illustré dans le flowchart désigné par Figure I.
Une deuxième variante de l'invention est constituée par le procédé décrit par le schéma réactionnel décrit dans la Figure II.
Ce procédé est constitué de 14 étapes successives. La présente invention est définie de façon plus détaillée dans les exemples qui suivent. Ces exemples ainsi que les schémas réactionnels sont donnés à titre illustratif de l'invention et ils ne sauraient être interprétés comme limitant la portée de la présente invention.
EXEMPLE
L'exemple ci-dessous ne se limite pas à une seule famille des ifs. Les extraits du Pacitaxeline~ peuvent être préparés à partir de Taxus hrevifolia, Taxus canadensis, Taxus baccata, Taxus walichiana, Taxus yunnanensis, Taxus hicksü, Taxus densiformis, Taxus gem, Taxus wardü, Taxus cuspidata, Taxus capitata et Taxus brownü. Les écorces, les branches et les aiguilles de toutes ces espèces peuvent être utilisées comme sources d'extraction du Pacitaxeline~.
Présentement, quelques procédés d'extraction du Pacitaxeline~ ont été décrits (Wani et al. J. Am. Chem. Soc. 93 (9) : 2325-2327, 1971 ). La méthode d'isolation de Pacitaxeline~ la plus utilisée est la chromatographie sur gel de silice.
L'élution de différents composants de l'extrait de Pacitaxeline~ se fait par un mélange de solvants organiques; et la purification du Pacitaxeline~ se fait également avec quelques étapes de cristallisation en présence d'un ou de plusieurs solvants organiques. 3. DESCRIPTION OF THE INVENTION
The object of the present invention is therefore a method allowing the recovery of Pacitaxeline ~ from natural sources.
'CA 02275980 1999-06-22 According to a first variant, the method of the invention making it possible to recover, with high yields, Pacitaxeline ~ from a source natural is characterized in that - in a first step, the natural source containing Pacitaxeline ~
is dried and ground, then the oil resulting from the ground is recovered by extraction and enriched with Pacitaxeline ~ contents between 3 to 5%, enrichment including a partial bleaching step by precipitation either in basic medium or in acid medium;
- in a second step, the precipitate recovered is dissolved in the presence of an apolar solvent, then the solution thus formed is percolated using hexane;
- in a third step, the solution obtained by percoloration is separated in an oily phase and in a hexane phase, each phase is subjected to a Pacitaxeline ~ enrichment treatment, the oily phase being enriched up to a Pacitaxeline ~ content of between 25 and 30% and the hexane phase is enriched up to Pacitaxeline contents ~
between 15 and 20%, moreover, during the enrichment of the oily phase, the contaminants are extracted, - in a fourth step, the enriched oily and hexane phases are mixed and the solution thus obtained is subjected to a treatment enrichment up to contents of 50 to 60% in Pacitaxeline ~, this enrichment step including a precipitation step in the middle acid in case partial discoloration of the first stage has been performed in basic medium or a precipitation step in basic medium in the case where partial discoloration of the first stage has been carried out in an acid medium, and - in a fifth step, the enriched solution obtained in the fourth step is enriched by chromotagraphy up to a content of 98-99% in Pacitaxeline ~.
The process in question is illustrated in the flowchart designated by Figure I.
A second variant of the invention consists of the process described by the reaction scheme described in Figure II.
This process consists of 14 successive steps. The present invention is defined in more detail in the following examples. These examples as well as the reaction schemes are given by way of illustration of the invention and they should not be interpreted as limiting the scope of this invention.
EXAMPLE
The example below is not limited to a single family of ifs. The extracts from Pacitaxeline ~ can be prepared from Taxus hrevifolia, Taxus canadensis, Taxus baccata, Taxus walichiana, Taxus yunnanensis, Taxus hicksü, Taxus densiformis, Taxus gem, Taxus wardü, Taxus cuspidata, Taxus capitata and Taxus brownü. The bark, branches and needles of all these species can be used as sources of Pacitaxeline ~ extraction.
Currently, some Pacitaxeline ~ extraction processes have been described (Wani et al. J. Am. Chem. Soc. 93 (9): 2325-2327, 1971). The method insulation of Pacitaxeline ~ the most used is chromatography on silica gel.
Elution of different components of the extract of Pacitaxeline ~ is made by a mixture of organic solvents; and the purification of Pacitaxeline ~ is also done with some stages of crystallization in the presence of one or more solvents organic.
4 L'exemple ci-contre décrit la nouvelle méthode d'isolation et de purification du Pacitaxeline~ à partir des aiguilles et des branches de Taxus canadensis.
ÉTAPE 1 Les aiguilles et les branches de Taxus canadensis sont lavées et séchées entre 20-60°C pendant 16 à 24 heures, ensuite elles sont réduites en poudre fine par le broyeur. Les poudres sont conditionnées dans des sacs en coton et bien attachés.
Ces sacs sont immergés dans le méthanol pendant 24 heures entre 20-25°C. La phase organique est récupérée, un autre volume de méthanol est ajouté et l'infusion continue encore 24 heures, l'extraction peut se répéter 2 ou 3 fois. Les phases organiques sont groupées, filtrées ou centrifugées à 0-2°C, 5000 rpm pendant 30 minutes pour éliminer les particules insolubles et ensuite évaporées ou distillées sous pression réduite à une température entre 40-45°C
jusqu'à
l'obtention d'un liquide très épais. Ce liquide très épais est le concentré ou l'huile de Pacitaxeline~.
ÉTAPE 2 75 g d'huile de Pacitaxeline~ sont dissous dans 300 ml de chlorure de méthylène sous agitation magnétique. L'utilisation d'un bain ultrasonique facilite la dissolution de l'huile de Pacitaxeline~. Le mélange est ensuite filtré ou centrifugé à 0-2°C, 000 rpm pendant 30 minutes. Le mélange est récupéré et les particules insolubles sont éliminées. Une analyse du mélange par HPLC munie d'une colonne Nova-Pak C18 (4 pm, 3,9 X 150 mm, Waters) indique la teneur du Pacitaxeline~ de 3-3,5%.
ÉTAPE 3 : LAVAGE OU PARTITION
Le mélange contenant du Pacitaxeline~ est transvasé dans une ampoule à
décanter de 2litres, on ajoute un volume d'eau purifiée et on agite vigoureusement pendant quelques minutes. On laisse décanter le mélange pendant 10 à 30 minutes, ensuite on ajoute 1 volume de méthanol par volume de chlorure de méthylène pour séparer les phases. La phase aqueuse est relarguée par du chlorure de sodium pour bien séparer cette phase de la phase organique.
On répète le lavage ou la partition du mélange une deuxième fois.
ÉTAPE 4 La phase organique est récupérée et évaporée à sec sous pression réduite à
40-45°C. L'analyse de résidu par HPLC indique la teneur en Pacitaxeline~ de 10,5%.
ÉTAPE 5 : 1~~e PRÉCIPITATION
Le résidu sec est dissous dans 200 ml méthanol et ajouté goutte à goutte sous agitation à 20-25°C dans une solution NaOH 10-100 mM, préférablement entre 20-50 mM. Le volume du solvant par rapport au volume NaOH est de 1 pour 20, préférablement 1 pour 10. Le précipité se forme instantanément et récupéré par centrifugation à 10 000 rmp entre 2-20°C pendant 30 minutes. Poids du précipité
36,50 g.
ÉTAPE 6 : 1~~e DÉCOLORATION PARTIELLE OU PERCOLORATION
Le précipité est solubilisé dans environ 150-200 ml d'acétone et le mélange est versé dans une ampoule à décanter. On ajoute 1 volume égal d'hexane et on mélange bien les deux phases, ensuite on ajoute un deuxième volume d'hexane et on continue à ajouter de l'hexane (un volume d'hexane à la fois) jusqu'à
l'obtention d'une phase huileuse. Une agitation rigoureuse est nécessaire entre chaque ajout d'hexane. La phase huileuse est plus lourde que la phase d'hexane et se dépose au fond de l'ampoule à décanter. La phase huileuse est récupérée et la phase d'hexane très colorée éliminée. Une analyse de la phase huileuse par HPLC munie d'une colonne Nova-Pack C18 (4 pm, 3,9 x 150 mm, Waters) indique la teneur en Pacitaxeline~ de 19-20%.
ÉTAPE 7 : 2e DÉCOLORATION PARTIELLE OU PERCOLORATION
La phase huileuse est diluée avec de l'acétone à un volume environ 150-200 ml.
On répète la même opération que l'étape précédente. La deuxième décoloration est généralement faite avec 3 volumes d'hexane. La phase huileuse est récupérée et la phase d'hexane est écartée.
ÉTAPE 8 : 2e PRÉCIPITATION
La phase huileuse est évaporée à sec et le résidu est resolubilisé dans du méthanol à un volume final de 200 ml. On ajoute goutte à goutte le mélange dans une solution HCI 10 -100 mM sous agitation, préférablement entre 20-50 mM. Le volume du solvant par rapport au volume HCI est de 1 pour 20, préférablement 1 pour 10. Le précipité se forme instantanément et est récupéré par centrifugation à 10 000 rpm entre 2-20°C pendant 30 minutes. Poids du précipité :
17,50 g. Une analyse du précipité par HPLC munie d'une colonne Nova-Pak C18 (4 wm, 3,9 x 150 mm, Waters) indique la teneur en Pacitaxeline~ de 40-50%.
Étape 9 : 1~~e PURIFICATION PAR CHROMATOGRAPHIE
Le précipité est solubilisé avec un mélange contenant 98% CH2C12 et 2%
isopropanol. Le volume du mélange utilisé est environ de 30 à 50 ml. La phase organique est filtrée ou centrifugée à 10 000 rpm, entre 0-2°C pendant 15 minutes.
La phase organique est récupérée et mise en contact avec le gel de silice (32-75 ~,m ou 200-450 mesh), le gel est séché sous ventilation à température ambiante.
La colonne en verre d'une dimension de 30 cm de long et de 7,6 cm de diamètre intérieur est chargé du gel de silice jusqu'à une hauteur de 22 cm. Un mélange de solvant de 98% CH2C12 et 2% isopropanol est utilisé pour équilibrer le gel. Le débit constant de 50 ml/min. avec une pression de 40 psi est réglé par un système de délivrance de solvant (Dynamax, SC-I, Solvent delivery system).
Le gel contenant du Pacitaxeline~ est déposé sur la surface du gel de la colonne et l'élution débute à 50 ml/min. Le volume pour chaque fraction est environ 1000 ml, et le volume de solvant utilisé est de 8000 ml. Toutes les fractions sont concentrées et analysées par HPLC, l'analyse indique la présence de Pacitaxeline~ dans la fraction IV avec une teneur de 35%, 53% dans la fraction V
et 39% dans la fraction VI.
ÉTAPE 10 ; l8re CRISTALLISATION
Les fractions contenant du Pacitaxeline~ sont groupées ensemble et évaporées à
sec. Le résidu est dissous dans 10 ml acétone. Le solvant est ajouté dans 50 ml hexane, le mélange devient trouble avec l'apparition des cristaux. On laisse reposer le mélange de solvant toute la nuit à une température entre 2-8°C, la formation des cristaux continue durant la nuit. Les cristaux sont récupérés par filtration sous vide et rincés avec de l'hexane. L'analyse par HPLC indique la teneur en Pacitaxeline~ de 70%.
ÉTAPE 11 : 2e PURIFICATION PAR CHROMATOGRAPHIE
Les cristaux sont dissous avec 10 à 15 ml du mélange contenant 98% CH2CIz et 2% isopropanol et mis en contact avec le gel de silice (32-75 ~m ou 200-450 mesh), le gel est séché sous ventilation à température ambiante.
La colonne en verre d'une dimension de 30 cm de long et de 2,6 cm de diamètre intérieur est chargé du gel de silice jusqu'à une hauteur de 22 cm. Un mélange de solvant de 98% CH2C12 et 2% isopropanol est utilisé pour équilibrer le gel. Le débit constant de 10 ml/min. avec une pression de 40 psi est réglé par un système de délivrance de solvant (Dynamax, SD-1, Solvent delivery system).
Le gel contenant du Pacitaxeline~ est déposé sur la surface du gel de la colonne et l'élution débute à 10 ml/min. Le volume pour chaque fraction est environ 120 ml, et le volume du solvant utilisé est de 1000 ml. Toutes les fractions sont concentrées et analysées par HPLC, l'analyse indique la présence de Pacitaxeline~ dans la fraction IV avec une teneur de Pacitaxeline~ de 70%, 83%
dans la fraction V et 82% dans la fraction VI.
ÉTAPE 12 : 2e CRISTALLISATION
Les fractions contenant du Pacitaxeline~ sont groupées ensemble et évaporées à
sec. Le résidu est dissous dans 10 ml acétone. Le solvant est ajouté dans 50 ml hexane, le mélange devient trouble avec l'apparition des cristaux. On laisse reposer le mélange de solvant toute la nuit à une température entre 2-8°C, la formation des cristaux continue durant la nuit. Les cristaux sont récupérés par filtration sous vide et lavés avec un mélange de 80% hexane et 20% acétone.
L'analyse par HPLC indique la teneur en Pacitaxeline~ de 94-95%.
ÉTAPE 13 : 3e PURIFICATION PAR CHROMATOGRAPHIE
Les cristaux sont dissous 10 à 12 ml du mélange contenant 98% CH2CIz et 2%
isopropanol et mis en contact avec le gel de silice (32-75 ~m ou 200-450 mesh), le gel est séché sous ventilation à températrue ambiante.
La colonne en verre d'une dimension de 30 cm de long et de 2,6 cm de diamètre intérieur est chargé du gel de silice jusqu'à une hauteur de 20 cm. Un mélange de solvant de 98% CH2C12 et 2% isopropanol est utilisé pour équilibrer le gel. Le débit constant de 10 ml/min. avec une pression de 40 psi est réglé par un système de délivrance de solvant (Dynamax, SI-1, Solvent delivery system).
Le gel contenant du Pacitaxeline~ est déposé sur la surface du gel de la colonne et l'élution débute à 10 ml/min. Le volume pour chaque fraction est environ 120 ml, et le volume du solvant utilisé est de 500 ml. Toutes les fractions sont concentrées et analysées par HPLC, l'analyse indique la présence de Pacitaxeline~ dans la fraction II avec une teneur de Pacitaxeline~ de 90%, 95% dans la fraction III
et VI.
ÉTAPE 14 : 3e CRISTALLISATION
Les fractions contenant du Pacitaxeline~ à une teneur de 95% sont groupées ensemble et évaporées à sec. Le résidu est dissous dans 10 ml acétone. Le solvant est ajouté dans 50 ml hexane, le mélange devient trouble avec l'apparition des cristaux. On laisse reposer le mélange de solvant toute la nuit à une température entre 2-8°C, la formation des cristaux continue durant la nuit. Les cristaux sont récupérés par filtration sous vide et lavés avec un mélange de 80%
hexane et 20% acétone. L'analyse par HPLC indique la teneur en Pacitaxeline~
de 98-99%.
Ä noter le rendement très élevé obtenu, supérieur à 95% en poids de Pacitaxeline~ récupéré par rapport au poids de Pacitaxeline~ présent dans la source naturelle traitée.
Les procédés selon l'invention sont en outre caractérisés par le fait que les installations chromatographiques utilisées sont d'une capacité limitée du fait qu'elles sont alimentées par une solution enrichie contenant déjà des teneurs en Pacitaxeline~ supérieures à 35% et de préférence comprise entre 40 et 50% en poids par rapport au poids total de la solution traitée. 4 The example opposite describes the new method of isolation and purification of Pacitaxeline ~ from needles and branches of Taxus canadensis.
Needles and branches of Taxus canadensis are washed and dried between 20-60 ° C for 16 to 24 hours, then they are powdered fine by the grinder. The powders are packaged in cotton bags and well attached.
These bags are immersed in methanol for 24 hours between 20-25 ° C. The organic phase is recovered, another volume of methanol is added and the infusion continues for another 24 hours, the extraction can be repeated 2 or 3 time. The organic phases are grouped, filtered or centrifuged at 0-2 ° C, 5000 rpm for 30 minutes to remove insoluble particles and then evaporated or distilled under reduced pressure at a temperature between 40-45 ° C
until obtaining a very thick liquid. This very thick liquid is the concentrate or the oil from Pacitaxeline ~.
75 g of Pacitaxeline oil ~ are dissolved in 300 ml of chloride methylene under magnetic stirring. The use of an ultrasonic bath facilitates the dissolution Pacitaxeline oil ~. The mixture is then filtered or centrifuged at 0-2 ° C, 000 rpm for 30 minutes. The mixture is recovered and the particles insolubles are eliminated. An analysis of the mixture by HPLC provided with a Nova-Pak C18 column (4 pm, 3.9 X 150 mm, Waters) indicates the content of the Pacitaxeline ~ 3-3.5%.
STEP 3: WASHING OR SHEET MUSIC
The mixture containing Pacitaxeline ~ is transferred to an ampoule.
decant 2 liters, add a volume of purified water and stir vigorously for a few minutes. Let the mixture settle for 10 to 30 minutes, then add 1 volume of methanol per volume of methylene chloride to separate the phases. The aqueous phase is released with sodium chloride to separate this phase from the organic phase.
The washing or partitioning of the mixture is repeated a second time.
The organic phase is recovered and evaporated to dryness under reduced pressure at 40-45 ° C. Residue analysis by HPLC indicates the content of Pacitaxeline ~ from 10.5%.
STEP 5: 1 ~~ PRECIPITATION
The dry residue is dissolved in 200 ml of methanol and added dropwise under stirring at 20-25 ° C in a 10-100 mM NaOH solution, preferably Between 20-50 mM. The volume of the solvent relative to the volume NaOH is 1 to 20, preferably 1 to 10. The precipitate is formed instantly and recovered by centrifugation at 10,000 rmp at 2-20 ° C for 30 minutes. Weight of precipitate 36.50 g.
STEP 6: 1 ~~ e PARTIAL DECOLORATION OR PERCOLORATION
The precipitate is dissolved in approximately 150-200 ml of acetone and the mixture East poured into a separatory funnel. Add 1 equal volume of hexane and mix the two phases well, then add a second volume of hexane and we continue to add hexane (one volume of hexane at a time) until obtaining an oily phase. Rigorous agitation is necessary Between each addition of hexane. The oily phase is heavier than the hexane phase and settles at the bottom of the separating funnel. The oily phase is recovered and the very colored hexane phase eliminated. An analysis of the oily phase by HPLC fitted with a Nova-Pack C18 column (4 pm, 3.9 x 150 mm, Waters) indicates the Pacitaxeline ~ content of 19-20%.
STEP 7: 2nd PARTIAL DECOLORATION OR PERCOLORATION
The oily phase is diluted with acetone to a volume of approximately 150-200 ml.
The same operation is repeated as the previous step. The second discoloration is usually made with 3 volumes of hexane. The oily phase is recovered and the hexane phase is discarded.
STEP 8: 2nd PRECIPITATION
The oily phase is evaporated to dryness and the residue is resolubilized in methanol to a final volume of 200 ml. The mixture is added dropwise in a 10-100 mM HCI solution with stirring, preferably between 20-50 mM. The volume of the solvent relative to the volume HCI is 1 to 20, preferably 1 to 10. The precipitate is formed instantly and is recovered by centrifugation at 10,000 rpm between 2-20 ° C for 30 minutes. Precipitate weight:
17.50 g. A
analysis of the precipitate by HPLC equipped with a Nova-Pak C18 column (4 wm, 3.9 x 150 mm, Waters) indicates the Pacitaxeline ~ content of 40-50%.
Step 9: 1 ~~ e PURIFICATION BY CHROMATOGRAPHY
The precipitate is dissolved with a mixture containing 98% CH2C12 and 2%
isopropanol. The volume of the mixture used is approximately 30 to 50 ml. The sentence organic is filtered or centrifuged at 10,000 rpm, between 0-2 ° C for 15 minutes.
The organic phase is recovered and brought into contact with silica gel (32-75 ~, m or 200-450 mesh), the gel is dried under ventilation at temperature ambient.
The glass column, 30 cm long and 7.6 cm in diameter inside is loaded with silica gel up to a height of 22 cm. A mix of 98% CH2Cl2 and 2% isopropanol solvent is used to balance the gel. The constant flow of 50 ml / min. with a pressure of 40 psi is regulated by a system solvent delivery system (Dynamax, SC-I, Solvent delivery system).
The gel containing Pacitaxeline ~ is deposited on the surface of the gel of the column and the elution begins at 50 ml / min. The volume for each fraction is approximately 1000 ml, and the volume of solvent used is 8000 ml. All fractions are concentrated and analyzed by HPLC, the analysis indicates the presence of Pacitaxeline ~ in fraction IV with a content of 35%, 53% in the fraction V
and 39% in fraction VI.
STEP 10; 18th CRYSTALLIZATION
The fractions containing Pacitaxeline ~ are grouped together and evaporated at dry. The residue is dissolved in 10 ml acetone. The solvent is added in 50 ml hexane, the mixture becomes cloudy with the appearance of the crystals. We let rest the solvent mixture overnight at a temperature between 2-8 ° C, the crystal formation continues overnight. The crystals are recovered through vacuum filtration and rinsed with hexane. HPLC analysis indicates the Pacitaxeline ~ content of 70%.
STEP 11: 2nd PURIFICATION BY CHROMATOGRAPHY
The crystals are dissolved with 10 to 15 ml of the mixture containing 98% CH2CIz and 2% isopropanol and brought into contact with silica gel (32-75 ~ m or 200-450 mesh), the gel is dried under ventilation at room temperature.
The glass column, 30 cm long and 2.6 cm in diameter inside is loaded with silica gel up to a height of 22 cm. A mix of 98% CH2Cl2 and 2% isopropanol solvent is used to balance the gel. The debit constant of 10 ml / min. with a pressure of 40 psi is regulated by a system of solvent delivery (Dynamax, SD-1, Solvent delivery system).
The gel containing Pacitaxeline ~ is deposited on the surface of the gel of the column and the elution begins at 10 ml / min. The volume for each fraction is approximately 120 ml, and the volume of the solvent used is 1000 ml. All fractions are concentrated and analyzed by HPLC, the analysis indicates the presence of Pacitaxeline ~ in fraction IV with a content of Pacitaxeline ~ of 70%, 83%
in fraction V and 82% in fraction VI.
STEP 12: 2nd CRYSTALLIZATION
The fractions containing Pacitaxeline ~ are grouped together and evaporated at dry. The residue is dissolved in 10 ml acetone. The solvent is added in 50 ml hexane, the mixture becomes cloudy with the appearance of the crystals. We let rest the solvent mixture overnight at a temperature between 2-8 ° C, the crystal formation continues overnight. The crystals are recovered through vacuum filtration and washed with a mixture of 80% hexane and 20% acetone.
Analysis by HPLC indicates the Pacitaxeline ~ content of 94-95%.
STEP 13: 3rd PURIFICATION BY CHROMATOGRAPHY
The crystals are dissolved 10 to 12 ml of the mixture containing 98% CH2CIz and 2%
isopropanol and brought into contact with silica gel (32-75 ~ m or 200-450 mesh), the gel is dried under ventilation at room temperature.
The glass column, 30 cm long and 2.6 cm in diameter inside is loaded with silica gel up to a height of 20 cm. A mix of 98% CH2Cl2 and 2% isopropanol solvent is used to balance the gel. The debit constant of 10 ml / min. with a pressure of 40 psi is regulated by a system of solvent delivery (Dynamax, SI-1, Solvent delivery system).
The gel containing Pacitaxeline ~ is deposited on the surface of the gel of the column and the elution begins at 10 ml / min. The volume for each fraction is approximately 120 ml, and the volume of the solvent used is 500 ml. All fractions are concentrated and analyzed by HPLC, the analysis indicates the presence of Pacitaxeline ~ in the fraction II with a Pacitaxeline ~ content of 90%, 95% in fraction III
and VI.
STEP 14: 3rd CRYSTALLIZATION
The fractions containing 95% Pacitaxeline ~ are grouped together and evaporated to dryness. The residue is dissolved in 10 ml acetone. The solvent is added in 50 ml hexane, the mixture becomes cloudy with the appearance crystals. The solvent mixture is allowed to stand overnight at temperature between 2-8 ° C, crystal formation continues during the night. The crystals are collected by vacuum filtration and washed with a mixture of 80%
hexane and 20% acetone. Analysis by HPLC indicates the content of Pacitaxeline ~
from 98-99%.
Ä note the very high yield obtained, greater than 95% by weight of Pacitaxeline ~ recovered relative to the weight of Pacitaxeline ~ present in the natural source processed.
The methods according to the invention are further characterized by the fact that the chromatographic installations used are of limited capacity due to that they are supplied with an enriched solution already containing contents in Pacitaxeline ~ greater than 35% and preferably between 40 and 50% in weight relative to the total weight of the treated solution.