Procédé peur l'extraction de silymarine à partir des nlantes, silymarine ainsi obtenue et son utilisation en thérapeutique.
L'invention concerne un procédé pour l'obtention de silymarine pure par extraction des fruits du chardon de Notre-Dame (Silybum marianum Gaertn.).
Par l'expression silymarine on entend selon l'état de
la technique le groupe de la silymarine, c'est-à-dire les
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drogue (DE-AS 1 923 082).
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brute C25H22010 et ont été caractérisées dans la littérature comme étant, du point de vue de la chimie structurale,
la silybine, la silydianine et la silychristine (DE-AS
1 923 082; PELTER, A. et HANSEL, R., Tetrahedron Letters, London 25, 2911, 1968; WAGNER, H., HOR HAMMER, L., SELIG-
MANN, 0. et FARNSWORTH, N.R., Tetrahedron Letters No. 31, pages 2675 - 2678, 1970; WAGNER, H., SELIGMANN, O., HOR-
HAMMER, L. et SEITZ, M., Tetrahedron Letters No. 22, pages
1895 - 1899, 1971). La silymarine IV est la taxifoline (DEAS 1 923 082).
La silymarine est un précieux médicament du foie et le mélange des différentes silymarines a, en raison d'un synergisme, une activité supérieure à la somme des activités
des différents isomères (DE-AS 1 923 082).
Grâce à la DE-AS 1 923 082 on connaît un procédé pour l'extraction de la silymarine (silymarines I-IV) , selon lequel les fruits séchés de Silybum marianum Gaertn. sont
pressés mécaniquement pour leur enlever la plus grande partie des huiles grasses. Par extraction complète (épuise-
ment) du résidu de pressage avec de l'acétate d'éthyle, évaporation de la solution d'acétate d'éthyle, reprise du résidu sec dans du méthanol aqueux, dégraissage par partage similaire multiple- à contre-courant et évaporation sous
vide jusqu'à siccité de la solution méthanolique dégraissée, on ob-
<EMI ID=3.1> tion totale de silymarine.
En tant qu'état de la technique supplémentaire on peut encore citer la DE-OS 2 020 407. Le procédé de cette DE-OS concerne l'isolement de la silymarine sans dégraissage préalable, par extraction globale directe au moyen d'un "rr�élange de solvantsconstitué d'alcool-eau-esters d'acides gras inférieurs ou hydrocarbures" et séparation des constituants gras "par distillation subséquente.de 10-40% du volume de la solution d'extraction obtenue, repos subséquent et élimination des graisses déposées au-dessus de la solution". Ce procédé ne conduit, selon la demande, qu'à un extrait à 40% de silymarine ; de plus la demande de brevet recommande une recristallisation avec le méthanol, sans autre indication en ce qui concerne d'éventuelles mesures
à prendre pour mettre en oeuvre le procédé. Lors d'une tentative de mise en oeuvre, ce procédé n'a pas été reproductible et dans le produit final il restait environ 13% des graisses d'origine.
Un autre procédé est connu par la DE-OS 2 017 789. Les produits finals de ce procédé devraient contenir 40 à 70% de silymarine et le rendement en produit final est de 0,8 à 2,4% au maximum (pour de la silymarine à 40%). Un essai de mise en oeuvre a montré que ce procédé également n'était pas reproductible.
De plus il existe dans l'état de la technique le brevet FR 72 14042 qui concerne la préparation d'un extrait à partir de silybum marianum,sans dégraissage préalable. Il est précisé que le produit final contient environ 82% de polyhydroxyphénylchromones ; 50% de ces 82% doivent représenter de la silymarine. On doit à ce propos remarquer que la silymarine appartient à une autre classe de composés, à savoir les polyhydroxyphénylchromanones, mais non les polyhydroxyphénylchromones. Ce procédé également n'est pas reproductible.
Jusqu'à présent on n'a pas réussi à améliorer considérablement le procédé de la DE-AS 1 923 082. D'une part on rencontre des difficultés dans la séparation des substances actives à partir de la drogue en préservant le mélange de silymarine présent et d'autre part dans la séparation de
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difficiles à éliminer- Ces difficultés n'ont été que partiellement surmontées selon la DE-AS 1 923 082.
Comme la silymarine est un précieux médicament pour le foie, il existe un besoin d'avoir la possibilité de disposer de silymarine à une forte concentration, supérieure à la concentration connue jusqu'à présent par l'état de la technique.
La présente invention a pour but de mettre au point un nouveau procédé pour l'extraction de silymarine pure (silymarines I-IV) qui soit dans une large mesure exempte d'impuretés et qui contienne tous les isomères naturels. Grâce à ce procédé, on pourra, de façon simple, obtenir un produit particulièrement pur et des rendements élevés.
On a trouvé de façon surprenante un procédé qui évite les inconvénients des méthodes connues et,qui conduit par une voie économique à de la silymarine pure (silymarines I-IV) (pureté de 90-96%) .
Le procédé selon l'invention pour l'obtention de silymarine (silymarines I-IV) selon lequel on débarrasse les fruits de silybum marianum d'une grande partie de l'huile grasse par extraction par pression à froid, on broie la masse extraite par pression, on extrait le résidu d'extraction par pression avec de l'acétate d'éthyle, on évapore l'extrait d'acétate d'éthyle et on traite, est caractérisé en ce que a) on extrait le résidu d'extraction par pression plusieurs fois avec de l'acétate d'éthyle anhydre et on sépare les extraits du résidu, b) ou bien l'on dégraisse le résidu d'évaporation a) des extraits à l'acétate d'éthyle combinés par extraction solide-liquide répétée à l'éther de pétrole, ou b') on dissout le résidu d'évaporation a) dans le méthanol et on dégraisse la solution par extraction liquideliquide répétée à l'éther de pétrole, c)
ou bien on dissout largement le résidu dégraissé b) dans le méthanol et on sépare la solution des constituants insolubles, ou
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de l'éther de pétrole, d) on ajoute à la solution méthanolique c) ou cI) un alcane inférieur chlorosubstitué en tant que solvant et de l'eau, on extrait, on sépare la solution hydrométhanolique et on la conserve, e) on mélange intimement la phase du solvant chloré plusieurs fois avec du méthanol et de l'eau sous agitation et l'on sépare par décantation, f) on évapore les phases hydrométhanoliques combinées, g) on met le résidu d'évaporation en suspension dans' un peu de méthanol, on introduit ensuite la suspension dans de l'eau en agitant et on lave plusieurs fois le précipité à l'eau après centrifugation, et h) on sèche le précipité sous vide, on le broie et on le sèche de nouveau sous vide.
Un mode préféré de mise en oeuvre du procédé selon l'invention est caractérisé en ce que a) on extrait le résidu d'extraction par pression sous agitation puissante, dans une proportion de 1:8 à 1:12, de préférence 1:10, à une température de 65 à 76[deg.]C, de préférence de 75[deg.]C, 2 à 4 fois, de préférence 3 fois, pendant à chaque fois 1/2 heure à 1 heure 1/2, de préférence 1 heure,avec de l'acétate d'éthyle anhydre et on sépare la drogue extraite, <EMI ID=7.1> réunis à 40 - 55[deg.]C, de préférence 50[deg.]C, sous vide à 15 mbar, on dégraisse le résidu d'évaporation a) par extraction solideliquide à l'éther de pétrole 60/70[deg.] dans une proportionde 1:15 à 1:25, de préférence 1:20, répétée trois fois pendant 10 à 20 minutes, de préférence 15 minutes, ou
b') on dissout le résidu d'évaporation a) dans 6 à 10 fois, de préférence 8 fois, son poids de méthanol, on sépare les constituants restant non dissous,, on dégraisse par extraction liquide-liquide à l'éther de pétrole (domaine d'ébullition 60/700C) dans une proportion de 1:1,5 à 1:2,5, <EMI ID=8.1>
nutes, de préférence 15 minutes, c) ou bien on dissout le résidu dégraissé b) dans 6 à
10 fois, de préférence 8 fois, son poids de méthanol et on sépare les constituants restant non dissous, ou
ci) on sépare la solution méthanolique dégraissée b') de l'éther de pétrole, d) on ajoute le même volume de chloroforme et le même volume d'eau à la solution méthanolique c) ou c') et on. a gite puissamment le mélange pendant environ 15 minutes et on sépare par décantation, e) on mélange 5 fois sous agitation puissante la phase chloroformique avec du méthanol et de l'eau dans les proportions en volume de 1:1:1, à chaque fois pendant 15 minutes et on sépare ensuite la phase chloroformique, <EMI ID=9.1> de à 15 mbar les phases hydrométhanoliques combinées,
g) on met le résidu d'évaporation en suspension dans
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rence 1:5, et on introduit la suspension en agitant dans 8 à 12 fois, de préférence 10 fois son volume d'eau, de même que l'on lave plusieurs fois à l'eau le résidu après
centrifugation,
h) on sèche le précipité 20 à 30, de préférence 24 heures, à une température de 30 à 50[deg.]C, de préférence 40[deg.]C, sous vide à 10 mbar, ensuite on broie et on sèche de nouveau le produit broyé sous vide à 10 mbar, également à une
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base de la substance anhydre.
En ce qui concerne la technologie de mise en oeuvre, les différentes étapes et les mesures spécifiques sont choisies de manière à ce que le mélange de substances actives présent dans la drogue soit pratiquement isolé en totalité. Si l'on s'écartait de ces étapes de procédure, l'un ou l'autre des composés serait totalement ou en partie perdu. Cette difficulté croît avec le degré d'enri- <EMI ID=12.1>
culier dans les étapes avancées du procédé,étant donné que les substances actives recherchées ont tendance à être perdues en partie sous forme de composés isolés ou de mélange global avec les impuretés à éliminer.
Le procédé selon l'invention prend ce point en considération de sorte qu'il conduit à un produit pur avec un rendement optimal en obtenant dans une large mesure la proportion d'isomères qui se trouve dans la drogue.
De manière surprenante on ne parvient au produit avantageux recherché que grâce à la combinaison de mesures particulières de mise en oeuvre du procédé, de solvants ou respectivement systèmes de solvants et de conditions physiques ou respectivement chimiques choisie.
Grâce à l'extraction par pression à froid des fruits de silybum marianum, on empêche la dégradation chimique
ou la polymérisation de la silymarine et on évite l'émulsification intime de la silymarine et des- impuretés dans l'huile grasse ce qui serait nuisible pour la séparation subséquente. La drogue est en partie dégraissée par l'extraction sous pression. Environ 25 - 30% de l'huile sont extraits par pression.
L'étape de broyage fin permet une extraction subséquente plus rapide car l'agent, d'extraction peut pénétrer plus facilement dans les particules de drogue.
Il est dans ce procédé décisif que l'extraction à l'acétate d'éthyle soit effectuée avec de l'acétate d'éthyle
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étapes suivantes du procédé, séparer les impuretés. Cet effet surprenant est, en combinaison avec les autres mesures particulières du procédé,décisif pour le succès du procédé, à savoir l'obtention de silymarine pure.
La proportion drogue/solvant dans l'extraction à l'acé-
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de telle sorte qu'elle garantisse, sans excès inutiles, la dissolution de la silyuarine de façon spécifique et avec ménagement. L'extraction répétée 2 à 4 fois, de préférence 3 fois, permet l'extraction complète de la silymarine à
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férence 7 5[deg.]C, est favorable à une bonne dissolution des substances actives et ne conduit pas simultanément à des phénomènes de décomposition des produits chimiques alors présents.
L'agitation poussée avec un agitateur intensif entraîne un "ameublissement" mécanique de la drogue, ce qui favorise l'extraction. La faible durée choisie lors de chacune des nombreuses extractions, de 1/2 heure à 1 heure 1/2, de préférence 1 heure, permet cependant d'effectuer une extraction avec épuisement.
Les extraits à l'acétate d'éthyle combinés sont éva-
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nagée.
Le dégraissage solide-liquide subséquent, répété plusieurs fois, du résidu à l'éther de pétrole avec un.. proportion relativement élevée de résidu par rapport à l'éther de pétrole, de par exemple environ 1:20, présente l'avantage de permettre de séparer complètement l'huile grasse dans un temps court et sans grande dépense en ce qui concerne l'appareillage. Facultativement on peut dissoudre le résidu d'évaporation dans environ 8 fois son poids de méthanol, séparer les constituants non dissous et effectuer ensuite une extraction liquide-liquide répétée avec de l'éther de pétrole, dans une proportion d'environ 1:2. Les résultats sont pratiquement les mêmes.
Le méthanol, en tant que solvant relativement peu coûteux, convient particulièrement bien, en raison de sa grande capacité de solvatation, à la dissolution du résidu dégraissé. La silymarine (silymarines I-IV) s'y dissout relativement bien. La proportion élevée résidu/solvant est
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lymarines 1-IV). Dans le résidu il n'y a plus de silymarine.
Il est nouveau et particulièrement inventif d'utiliser des solvants organiques chlorés, en particulier des alcanes inférieurs chlorosubstitués comme le chloroforme, le chlorure de méthylène, le 1, 2-dichloroéthane, de préférence le chloroforme, pour éliminer les impuretés restant encore de la silymarine (silymarines I-IV) sans que la silymarine dans son ensemble ne subisse une perte et également sans qu'aucun isomère ne disparaisse. Grâce à cela; la séparation d'autres impuretés lipophiles, qui n'avaient pas été éliminées dans l'étape de dégraissage avec l'huile et l'éther de pétrole, de même que d'autres impuretés moins polaires qui certes avaient d'abord été dissoutes dans le méthanol mais qui se comportaient de façon correspondante dans un système de phases de partition.
L'équilibre en solution diagramme de phase - du système de solvants choisi - tant en ce qui concerne sa nature que sa quantité -, dans ce cas méthanol-eau-chloroforme 1:1:1, est en présence de la silymarine (silymarines I-IV) et d'éventuelles impuretés encore présentes, particulièrement approprié car avec ce système de solvants on obtient de bonnes séparations en deux phases. La zone de dissociation du diagramme de phase comprend les proportions de solvants indiquées.
Le coefficient de partition de la silymarine (silymarines I-IV) entre les deux phases est très élevé. Après avoir effectué six extractions dans le système méthanol/ chloroforme/eau 1/1/1 (v/v/v) on obtient une proportion de silymarine dans les phases hydrométhanoliques combinées par rapport à la silymarine restant dans la phase chloroformique de 13:1. Ce grâce à quoi on peut extraire pratiquement toute la silymarine (silymarines I-IV) de la phase méthanolique.
Selon l'invention on a pu, de manière surprenante, obtenir que les silymarines I à IV restent également dans la phase hydrométhanolique sous forme de composés individuels, dans les mêmes proportions, de sorte que la proportion des isomères soit maintenue.
La phase hydrcméthanolique est évaporée jusqu'à siccité, de façon ménagée, à une température basse et sous vide et le résidu est mis en suspension plusieurs fois dans l'eau pour être lavé complètement. Cette étape de lavage s'est révélée avantageuse pour remédier aux occlusions dues à des impuretés dans le produit qui se produisent lors des f�ltrations normales.
Par rapport aux procédés de l'état de la technique, le procédé selon l'invention présente l'avantage de conduire de façon simple à une silymarine (silymarines I-IV) pure
à 90 - 96% avec un rendement d'environ 1,7%. Seule la combinaison selon l'invention des mesures opératoires choisies avec utilisation d'acétate d'éthyle anhydre et d'un alcane substitué par le chlore, comme le chloroforme, conduit de façon surprenante à l'obtention de silymarine très pure à partir des fruits de silybum marianum.
L'effet de l'extraction de la drogue à l'acétate d'éthyle anhydre est à signaler comme particulièrement inven-
tif par rapport à l'état de la technique. Grâce à cette extraction les substances hydrophiles de la drogue restent dans le résidu. Lors des étapes subséquentes comme la partition dans les solvants, il n'est normalement plus nécessaire de séparer dans une large mesure ces impuretés hydrophiles de la silymarine.
De plus est particulièrement surprenante l'activité de partition des solvants d'un alcane inférieur chlorosubstitué, en particulier le chloroforme, dans la deuxième phase du procédé en raison de la sélectivité spécifique, pratiquement toutes les impuretés présentes lors de cette étape de mise en oeuvre du procédé étant alors éliminées, de sorte que la silymarine reste largement pure dans la solution méthanolique.
Exemples d'extraction de la silymarine (silymarines 1-IV)
Exemple 1 :
300 kg de fruits de chardon de Notre-Dame extraits par
pression à froid et finement broyés sont additionnés de
3000 1 d'acétate d'éthyle anhydre et chauffés à 75[deg.]C. A
cette température, on agite énergiquement le mélange avec un agitateur intensif pendant une heure. Ensuite on filtre et on extrait le résidu de drogue encore deux fois, comme décrit, avec de l'acétate d'éthyle.
Les solutions d'acétate d'éthyle clarifiées et
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vide à 15mbar. Pour dégraisser, on agite bien le résidu à la température ambiante trois fois avec des portions de 300 1 d'éther de pétrole
60/70[deg.], 15 minutes et on chasse ensuite le solvant sous vide. Le produit brut ainsi obtenu est repris dans une quantité quadruple de méthanol, la matière solide ne passant pas en solution est alors séparée par centrifugation, lavas deux fois avec des portions de méthanol égales à la moitié des quantités mentionnées et enfin - comme elle ne contient pratiquement pas de silymarine séparé e.
Les solutions méthanoliques combinées sont ensuite additionnées de chloroforme, puis d'eau dans une proportion volumétrique de 1:1:1 et transférées dans un récipient de décantation. Après agitation puissante du mélange pendant 15 minutes et séparation des phases, on élimine la
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1:1:1 avec du méthanol-eau. Ensuite on sépare
la phase chloroformique.
Les phases hydrométhanoliques combinées sont évaporées à 50[deg.]C sous vide à 15 mbar et le résidu est mis en suspension dans cinq fois la même quantité de méthanol. La suspension est ajoutée, sous forme d'un jet fin, à dix fois le même volume d'eau puis agitée puissamment pendant 15 minutes. Ensuite on centrifuge et on lave le produit de centrifugation,en suspension,plusieurs fois avec de l'eau. Le produit est séché à l'é-
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et séché encore pendant 48 heures supplémentaires
<EMI ID=21.1> <EMI ID=22.1>
On obtient une poudre colorée en beige clair avec une teneur en silymarine de 90 - 96% (déterminée selon la méthode à la dinitrophénylhydrazine
(méthode à la DNPH) en procédant de façon analogue à la détermination de la silymarine dans les fruits du chardon de Notre-Dame, DAB VII édition 1968, second supplément 1975, page 198, ainsi que selon l'interprétation quantitative des courbes de réflexion ou "courbe de rémission") .
L'identification a été effectuée par chromatographie en couches minces.
La proportion relative des différents isomères a été déterminée par interprétation quantitative des courbes de réflexion (voir figure unique).
<EMI ID=23.1>
drogue sèche.
Exemple 2 :
300 kg de fruits de chardon de Notre-Dame extraits par
pression à froid et finement pulvérisés sont additionnés de
3000 1 d'acétate d'éthyle anhydre et chauffés à 75[deg.]C. A
cette température on agite puissamment, pendant une heure, le mélange avec un agitateur intensif.
Ensuite on filtre et on extrait encore deux fois à l'acétate d'éthyle le résidu de drogue , comme décrit.
Les solutions d'acétate d'éthyle clarifiées et
<EMI ID=24.1>
sous vide à 15 mbar.
Le résidu d'évaporation est dissous avec 120 1 de méthanol et les substances solides qui ne passent pas alors en solution sont éliminées par c.entrifugation. La solution méthanolique est soumise
3 fois pendant 15 minutes à une extraction liquide-liquide avec des portions de 135 1 d'éther de pétrole.
La solution méthanolique est d'abord additionnée de chloroforme, ensuite d'eau dans une proportion
<EMI ID=25.1> volumétrique de 1:1:1 et transférée dans un récipient de décantation.
Après avoir agité puissamment le mélange pendant
15 minutes et obtention d'une séparation des phases, on sépare la phase inférieure (phase chloroformique) et on extrait encore 5 fois, pendant 15 minutes avec du méthanol et de l'eau, également dans une proportion volumétrique de 1:1:1. On se' pare ensuite la phase chloroformique.
Les phases hydrométhanoliques combinées sont évaporées à 50[deg.]C sous vide à 15 mbar et le résidu
est mis en suspension dans 5 fois la même quantité de méthanol. La suspension est introduite sous agitation, sous forme d'un et fin, dans 10 fois son volume d'eau et agitée puissamment ensuite pendant 15 minutes. Ensuite on centrifuge
et on lave le produit de centrifugation, en suspension, plusieurs fois avec de l'eau. Le produit est séché à l'étuve sous vide pendant 24
<EMI ID=26.1>
Le procédé conduit à une silymarine à 90 - 96% de la même qualité que dans l'exemple 1.
Exemple 3 :
Les mêmes caractéristiques de mise en oeuvre du procédé en utilisant du chlorure de méthylène à la place du chloroforme conduisent à une silymarine à 90 - 94%.
<EMI ID=27.1>
Exemple 4 :
Les mêmes caractéristiques de mise en oeuvre du procédé avec utilisation de 1,2�dichloroéthane au lieu de chloroforme conduisent à une silymarrne à 90 - 93%. Le rendement est de 1,8%.
Pour tous .les exemples :
Le degré de pureté et les petites variations dans le rendement dépendent de la drogue.
REVENDICATIONS
1. Procédé pour l'obtention de silymarine (silymarines
<EMI ID=28.1>
rianum d'une grande partie de l'huile grasse par extraction par pression à froid, on broie la masse extraite par pression, on extrait le résidu d'extraction par pression avec de l'acétate d'éthyle, on évapore l'extrait d'acétate d'éthyle et on traite., caractérisé en ce que a) on extrait le résidu d'extraction par pression plusieurs fois avec de l'acétate d'éthyle anhydre et on sépare les extraits du résidu, b) ou bien l'on dégraisse le résidu d'évaporation a) des extraits à l'acétate d'éthyle combinés par extraction solide-liquide répétée à l'éther de pétrole, ou
b') on dissout le résidu d'évaporation a) dans le méthanol et on dégraisse la solution par extraction liquideliquide répétée à l'éther de pétrole, c) ou bien on dissout largement le résidu dégraissé b) dans le méthanol et on sépare la solution des constituants insolubles, ou c') on sépare la solution méthanolique dégraissée b')
de l'éther de pétrole, d) on ajoute à la solution méthanolique c) ou c') un alcane inférieur chlorosubstitué en tant que solvant et de l'eau, on extrait, on sépare la solution hydrométhanolique et on la conserve, e)on mélange intimement la phase du solvant chloré plusieurs fois avec du méthanol et de l'eau sous agitation et l'on sépare par décantation, f) on évapore les phases hydrométhanoliques combinées, g) on met le résidu d'évaporation en suspension dans
un peu de méthanol, on introduit ensuite la suspension dans
de l'eau en agitant et on lave plusieurs fois le précipité
à l'eau après centrifugation, et
h) on sèche le précipité sous vide, on le broie et on
le sèche de nouveau sous vide.
Process for the extraction of silymarin from Nantes, silymarin thus obtained and its use in therapy.
The invention relates to a process for obtaining pure silymarin by extracting the fruits of the thistle of Notre-Dame (Silybum marianum Gaertn.).
By the expression silymarin is meant according to the state of
the technique the silymarin group, that is to say the
<EMI ID = 1.1>
drug (DE-AS 1 923 082).
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crude C25H22010 and have been characterized in the literature as being, from the point of view of structural chemistry,
silybin, silydianin and silychristin (DE-AS
1,923,082; PELTER, A. and HANSEL, R., Tetrahedron Letters, London 25, 2911, 1968; WAGNER, H., HOR HAMMER, L., SELIG-
MANN, 0. and FARNSWORTH, N.R., Tetrahedron Letters No. 31, pages 2675-2678, 1970; WAGNER, H., SELIGMANN, O., HOR-
HAMMER, L. and SEITZ, M., Tetrahedron Letters No. 22, pages
1895 - 1899, 1971). Silymarin IV is taxifoline (DEAS 1 923 082).
Silymarin is a precious liver drug and the mixture of different silymarins has, due to synergism, an activity greater than the sum of the activities
different isomers (DE-AS 1 923 082).
Thanks to DE-AS 1 923 082 a process is known for the extraction of silymarin (silymarins I-IV), according to which the dried fruits of Silybum marianum Gaertn. are
mechanically pressed to remove most of the fatty oils from them. By complete extraction (exhausts-
ment) of the pressing residue with ethyl acetate, evaporation of the ethyl acetate solution, recovery of the dry residue in aqueous methanol, degreasing by multiple similar sharing- against the current and evaporation under
vacuum until dry of the degreased methanolic solution, one obtains
<EMI ID = 3.1> total silymarin.
DE-OS 2 020 407 can also be cited as additional prior art. The process of this DE-OS relates to the isolation of silymarin without prior degreasing, by direct global extraction by means of an "rr � mixture of solvents consisting of alcohol-water-esters of lower fatty acids or hydrocarbons "and separation of the fatty constituents" by subsequent distillation. From 10-40% of the volume of the extraction solution obtained, subsequent rest and elimination grease deposited on top of the solution. " This process leads, according to demand, only to an extract containing 40% of silymarin; moreover the patent application recommends recrystallization with methanol, without further indication with regard to possible measures
to take to implement the method. During an attempted implementation, this process was not reproducible and in the final product there remained approximately 13% of the original fats.
Another process is known from DE-OS 2 017 789. The final products of this process should contain 40 to 70% of silymarin and the yield of final product is 0.8 to 2.4% at most (for silymarin 40%). An implementation test has shown that this process also was not reproducible.
Furthermore, there exists in the prior art patent FR 72 14042 which relates to the preparation of an extract from silybum marianum, without prior degreasing. It is specified that the final product contains approximately 82% of polyhydroxyphenylchromones; 50% of these 82% must represent silymarin. In this regard, it should be noted that silymarin belongs to another class of compounds, namely polyhydroxyphenylchromanones, but not polyhydroxyphenylchromones. This process also is not reproducible.
Up to now we have not succeeded in considerably improving the process of DE-AS 1 923 082. On the one hand we encounter difficulties in the separation of the active substances from the drug while preserving the mixture of silymarin present and on the other hand in the separation of
<EMI ID = 4.1> <EMI ID = 5.1>
difficult to eliminate - These difficulties were only partially overcome according to DE-AS 1 923 082.
As silymarin is a precious drug for the liver, there is a need to have the possibility of having silymarin at a high concentration, higher than the concentration hitherto known by the state of the art.
The object of the present invention is to develop a new process for the extraction of pure silymarin (silymarins I-IV) which is to a large extent free from impurities and which contains all the natural isomers. Thanks to this process, it will be possible, in a simple manner, to obtain a particularly pure product and high yields.
Surprisingly, a process has been found which avoids the drawbacks of known methods and which leads economically to pure silymarin (silymarins I-IV) (purity of 90-96%).
The process according to the invention for obtaining silymarin (silymarins I-IV) according to which the fruits of silybum marianum are freed from a large part of the fatty oil by extraction by cold pressure, the mass extracted is ground by pressure, the extraction residue is extracted by pressure with ethyl acetate, the ethyl acetate extract is evaporated and treated, is characterized in that a) the extraction residue is extracted with pressure several times with anhydrous ethyl acetate and the extracts are separated from the residue, b) or the evaporation residue is degreased a) the ethyl acetate extracts combined by solid-liquid extraction repeated with petroleum ether, or b ') the evaporation residue is dissolved a) in methanol and the solution is degreased by repeated liquid liquid extraction with petroleum ether, c)
or the degreased residue b) is largely dissolved in methanol and the solution is separated from the insoluble constituents, or
<EMI ID = 6.1>
petroleum ether, d) adding to the methanolic solution c) or cI) a chlorosubstituted lower alkane as solvent and water, extracting, separating the hydromethanolic solution and keeping it, e) intimately mix the phase of the chlorinated solvent several times with methanol and water with stirring and it is separated by decantation, f) the combined hydromethanolic phases are evaporated, g) the evaporation residue is suspended in a little methanol, the suspension is then introduced into water with stirring and the precipitate is washed several times with water after centrifugation, and h) the precipitate is dried under vacuum, it is ground and it is dried again under empty.
A preferred embodiment of the process according to the invention is characterized in that a) the extraction residue is extracted by pressure with strong stirring, in a proportion of 1: 8 to 1:12, preferably 1:10 , at a temperature of 65 to 76 [deg.] C, preferably 75 [deg.] C, 2 to 4 times, preferably 3 times, for each time 1/2 hour to 1 hour 1/2, of preferably 1 hour, with anhydrous ethyl acetate and the extracted drug is separated, <EMI ID = 7.1> combined at 40 - 55 [deg.] C, preferably 50 [deg.] C, under vacuum at 15 mbar, the evaporation residue a) is degreased by solid liquid extraction with petroleum ether 60/70 [deg.] in a proportion of 1:15 to 1:25, preferably 1:20, repeated three times for 10 to 20 minutes, preferably 15 minutes, or
b ') the evaporation residue is dissolved a) in 6 to 10 times, preferably 8 times, its weight of methanol, the constituents remaining undissolved are separated, degreased by liquid-liquid extraction with petroleum ether (boiling range 60 / 700C) in a proportion of 1: 1.5 to 1: 2.5, <EMI ID = 8.1>
nutes, preferably 15 minutes, c) or dissolve the degreased residue b) in 6 to
10 times, preferably 8 times, its weight of methanol and the components remaining undissolved are separated, or
ci) separating the degreased methanolic solution b ') from petroleum ether, d) adding the same volume of chloroform and the same volume of water to the methanolic solution c) or c') and on. vigorously stir the mixture for approximately 15 minutes and separate by decantation, e) the chloroform phase is mixed 5 times with vigorous stirring with methanol and water in volume proportions of 1: 1: 1, each time for 15 minutes and then the chloroform phase is separated, <EMI ID = 9.1> from to 15 mbar the combined hydromethanol phases,
g) the evaporation residue is suspended in
<EMI ID = 10.1>
rence 1: 5, and the suspension is introduced with stirring into 8 to 12 times, preferably 10 times its volume of water, just as the residue is washed several times with water
centrifugation,
h) the precipitate is dried 20 to 30, preferably 24 hours, at a temperature of 30 to 50 [deg.] C, preferably 40 [deg.] C, under vacuum at 10 mbar, then it is ground and dried new product crushed under vacuum at 10 mbar, also at a
<EMI ID = 11.1>
base of the anhydrous substance.
With regard to the technology of implementation, the different stages and the specific measures are chosen so that the mixture of active substances present in the drug is practically completely isolated. If one deviates from these procedural steps, one or the other of the compounds would be totally or partly lost. This difficulty increases with the degree of <EMI ID = 12.1>
especially in the advanced stages of the process, since the active substances sought tend to be lost in part in the form of isolated compounds or as an overall mixture with the impurities to be removed.
The process according to the invention takes this point into consideration so that it leads to a pure product with an optimal yield by obtaining to a large extent the proportion of isomers which is found in the drug.
Surprisingly, the desired advantageous product is only obtained thanks to the combination of specific measures for implementing the process, of solvents or respectively solvent systems and of physical or chemical conditions respectively chosen.
By cold pressing extraction of silybum marianum fruits, chemical degradation is prevented
or the polymerization of silymarin and the intimate emulsification of the silymarin and of the impurities in the fatty oil is avoided, which would be detrimental for the subsequent separation. The drug is partially degreased by pressure extraction. About 25 - 30% of the oil is extracted by pressure.
The fine grinding step allows for faster subsequent extraction because the extraction agent can more easily penetrate into the drug particles.
It is in this decisive process that the extraction with ethyl acetate is carried out with ethyl acetate
<EMI ID = 13.1>
following process steps, separate the impurities. This surprising effect is, in combination with the other particular measures of the process, decisive for the success of the process, namely obtaining pure silymarin.
The drug / solvent ratio in acetate extraction
<EMI ID = 14.1>
so that it guarantees, without unnecessary excess, the dissolution of silyuarin in a specific and careful manner. The extraction repeated 2 to 4 times, preferably 3 times, allows the complete extraction of the silymarin to
<EMI ID = 15.1>
ference 7 5 [deg.] C, favors good dissolution of the active substances and does not simultaneously lead to phenomena of decomposition of the chemicals then present.
Thorough agitation with an intensive agitator causes a mechanical "loosening" of the drug, which promotes extraction. The short duration chosen during each of the numerous extractions, from 1/2 hour to 1 hour and a half, preferably 1 hour, however makes it possible to carry out an extraction with exhaustion.
The combined ethyl acetate extracts are evacuated.
<EMI ID = 16.1>
swam.
The subsequent solid-liquid degreasing, repeated several times, of the petroleum ether residue with a relatively high proportion of residue relative to petroleum ether, for example around 1:20, has the advantage of allow the fatty oil to be completely separated in a short time and without great expense with regard to the apparatus. Optionally, the evaporation residue can be dissolved in approximately 8 times its weight of methanol, separate the undissolved constituents and then carry out repeated liquid-liquid extraction with petroleum ether, in a proportion of approximately 1: 2. The results are practically the same.
Methanol, as a relatively inexpensive solvent, is particularly suitable, because of its high solvating capacity, for dissolving the degreased residue. Silymarin (silymarins I-IV) dissolves there relatively well. The high proportion of residue / solvent is
<EMI ID = 17.1>
lymarines 1-IV). In the residue there is no longer any silymarin.
It is new and particularly inventive to use chlorinated organic solvents, in particular chlorosubstituted lower alkanes such as chloroform, methylene chloride, 1, 2-dichloroethane, preferably chloroform, to remove the impurities still remaining in silymarin (silymarins I-IV) without loss of silymarin as a whole and also without any isomers disappearing. Thanks to that; the separation of other lipophilic impurities, which had not been removed in the degreasing step with oil and petroleum ether, as well as other less polar impurities which admittedly had first been dissolved in methanol but which behaved correspondingly in a system of partition phases.
The equilibrium in phase diagram solution - of the chosen solvent system - both in terms of its nature and its quantity -, in this case methanol-water-chloroform 1: 1: 1, is in the presence of silymarin (silymarins I -IV) and any impurities still present, particularly suitable because with this solvent system good separations in two phases are obtained. The dissociation zone of the phase diagram includes the proportions of solvents indicated.
The partition coefficient of silymarin (silymarins I-IV) between the two phases is very high. After having carried out six extractions in the methanol / chloroform / water system 1/1/1 (v / v / v) we obtain a proportion of silymarin in the combined hydromethanolic phases compared to the silymarin remaining in the chloroformic phase of 13: 1 . This allows us to extract practically all of the silymarin (silymarins I-IV) from the methanolic phase.
According to the invention, it has been possible, surprisingly, to obtain that the silymarins I to IV also remain in the hydromethanolic phase in the form of individual compounds, in the same proportions, so that the proportion of the isomers is maintained.
The hydrmethanol phase is evaporated to dryness, in a controlled manner, at a low temperature and under vacuum and the residue is suspended several times in water to be washed completely. This washing step has proved to be advantageous for overcoming the occlusions due to impurities in the product which occur during normal filtration.
Compared with the prior art methods, the method according to the invention has the advantage of leading in a simple manner to a pure silymarin (silymarins I-IV)
at 90 - 96% with a yield of around 1.7%. Only the combination according to the invention of the operational measures chosen with the use of anhydrous ethyl acetate and an alkane substituted by chlorine, such as chloroform, leads surprisingly to obtaining very pure silymarin from fruits. of silybum marianum.
The effect of extracting the drug from anhydrous ethyl acetate should be noted as particularly inventive.
tif compared to the state of the art. Thanks to this extraction the hydrophilic substances of the drug remain in the residue. In subsequent steps such as partitioning into solvents, it is normally no longer necessary to largely separate these hydrophilic impurities from silymarin.
In addition, the partitioning activity of the solvents of a chlorosubstituted lower alkane, in particular chloroform, is particularly surprising in the second phase of the process due to the specific selectivity, practically all the impurities present during this implementation step. of the process then being eliminated, so that the silymarin remains largely pure in the methanolic solution.
Examples of silymarin extraction (silymarins 1-IV)
Example 1:
300 kg of thistle fruit of Notre-Dame extracted by
cold pressure and finely ground are added
3000 1 of anhydrous ethyl acetate and heated to 75 [deg.] C. AT
At this temperature, the mixture is vigorously stirred with an intensive agitator for one hour. Then filter and extract the drug residue two more times, as described, with ethyl acetate.
Clarified ethyl acetate solutions and
<EMI ID = 18.1>
empty at 15mbar. To degrease, the residue is stirred well at room temperature three times with 300 l portions of petroleum ether
60/70 [deg.], 15 minutes and then the solvent is removed in vacuo. The crude product thus obtained is taken up in a quadruple quantity of methanol, the solid matter not passing into solution is then separated by centrifugation, washed twice with portions of methanol equal to half the quantities mentioned and finally - as it does not contain practically no separate silymarin e.
The combined methanolic solutions are then added with chloroform, then with water in a volumetric proportion of 1: 1: 1 and transferred to a settling vessel. After vigorous stirring of the mixture for 15 minutes and separation of the phases, the
<EMI ID = 19.1>
1: 1: 1 with methanol-water. Then we separate
the chloroform phase.
The combined hydromethanolic phases are evaporated at 50 [deg.] C under vacuum at 15 mbar and the residue is suspended in five times the same amount of methanol. The suspension is added, in the form of a fine jet, to ten times the same volume of water and then stirred vigorously for 15 minutes. Then centrifuged and the centrifugation product, suspended, is washed several times with water. The product is dried in the
<EMI ID = 20.1>
and dried again for an additional 48 hours
<EMI ID = 21.1> <EMI ID = 22.1>
A light beige colored powder is obtained with a silymarin content of 90 - 96% (determined according to the dinitrophenylhydrazine method
(DNPH method) by proceeding analogously to the determination of silymarin in the fruits of the thistle of Notre-Dame, DAB VII edition 1968, second supplement 1975, page 198, as well as according to the quantitative interpretation of the reflection curves or "remission curve").
The identification was carried out by thin layer chromatography.
The relative proportion of the different isomers was determined by quantitative interpretation of the reflection curves (see single figure).
<EMI ID = 23.1>
dry drug.
Example 2:
300 kg of thistle fruit of Notre-Dame extracted by
cold pressure and finely sprayed are added with
3000 1 of anhydrous ethyl acetate and heated to 75 [deg.] C. AT
this temperature is vigorously stirred for one hour, the mixture with an intensive agitator.
Then the drug residue is filtered and extracted twice more with ethyl acetate, as described.
Clarified ethyl acetate solutions and
<EMI ID = 24.1>
under vacuum at 15 mbar.
The evaporation residue is dissolved with 120 l of methanol and the solid substances which do not then go into solution are removed by c. Centrifugation. The methanolic solution is subjected
3 times for 15 minutes at a liquid-liquid extraction with 135 l portions of petroleum ether.
The methanolic solution is first added with chloroform, then water in a proportion
<EMI ID = 25.1> volumetric 1: 1: 1 and transferred to a settling tank.
After vigorously agitating the mixture for
15 minutes and obtaining a separation of the phases, the lower phase is separated (chloroform phase) and extraction is carried out 5 more times, for 15 minutes with methanol and water, also in a volumetric proportion of 1: 1: 1 . We then adorn the chloroform phase.
The combined hydromethanolic phases are evaporated at 50 [deg.] C under vacuum at 15 mbar and the residue
is suspended in 5 times the same amount of methanol. The suspension is introduced with stirring, in the form of one and fine, into 10 times its volume of water and stirred vigorously for 15 minutes. Then we centrifuge
and washing the centrifugation product, in suspension, several times with water. The product is dried in a vacuum oven for 24
<EMI ID = 26.1>
The process leads to a 90-96% silymarin of the same quality as in Example 1.
Example 3:
The same characteristics of implementation of the process using methylene chloride in place of chloroform lead to a silymarin at 90 - 94%.
<EMI ID = 27.1>
Example 4:
The same characteristics of implementation of the process with the use of 1,2 d dichloroethane instead of chloroform lead to a silymarrne at 90 - 93%. The yield is 1.8%.
For all .the examples:
The degree of purity and small variations in yield depend on the drug.
CLAIMS
1. Process for obtaining silymarin (silymarins
<EMI ID = 28.1>
rianum of a large part of the fatty oil by extraction by cold pressure, the mass extracted by pressure is ground, the extraction residue by pressure is extracted with ethyl acetate, the extract d is evaporated ethyl acetate and treated, characterized in that a) the extraction residue is pressurized several times with anhydrous ethyl acetate and the extracts are separated from the residue, b) or the evaporation residue is degreased a) of the ethyl acetate extracts combined by repeated solid-liquid extraction with petroleum ether, or
b ') the evaporation residue is dissolved a) in methanol and the solution is degreased by repeated liquid-liquid extraction with petroleum ether, c) or the degreased residue is largely dissolved b) in methanol and the solution of the insoluble constituents, or c ') separating the degreased methanolic solution b')
petroleum ether, d) a chlorosubstituted lower alkane as solvent and water are added to the methanolic solution c) or c '), the hydromethanolic solution is separated and separated, e) the phase of the chlorinated solvent is mixed thoroughly with methanol and water with stirring and separated by decantation, f) the combined hydromethanolic phases are evaporated, g) the evaporation residue is suspended in
a little methanol, the suspension is then introduced into
water with stirring and the precipitate is washed several times
with water after centrifugation, and
h) the precipitate is dried under vacuum, ground and
dry it again under vacuum.