WO1995008262A1 - Procede pour favoriser l'embryogenese somatique secondaire et application a la regeneration de plantes, en particulier de la vigne - Google Patents

Procede pour favoriser l'embryogenese somatique secondaire et application a la regeneration de plantes, en particulier de la vigne Download PDF

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primary
plant
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Olivier Maes
Thierry Jouenne
Jean Guern
Pierre Coutos-Thevenot
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor

Definitions

  • the present invention relates to a process for promoting secondary embryogenesis from primary somatic embryos in culture and to the application of this process to the regeneration of plants, in particular of the vine. It also relates to a plant obtained by a regeneration process comprising the aforementioned process.
  • the subject of the present invention is a process for promoting the production of secondary plant embryos from a culture of primary somatic embryos, characterized in that a medium is introduced into the culture medium of said primary somatic embryos. protein inhibiting primary embryogenesis in effective concentration to obtain secondary embryogenesis.
  • the inhibition of primary embryogenesis is called the arrest of development at a stage in the evolution of embryogenesis which can be the globule or heart or torpedo stage.
  • the method according to the present invention can be applied to the production of somatic vine embryos.
  • the Applicant has surprisingly found that certain proteins and in particular a certain class of those reputed to inhibit primary embryogenesis, make it possible to promote secondary embryogenesis. More particularly, the method according to the invention can be implemented by introducing into the culture medium of primary embryos a fraction containing at least one protein, extracted from a culture of plant embryos blocked in their development. According to a particular embodiment of the present invention,
  • these isolated proteins are introduced into the embryo culture from which it is desired to obtain secondary embryos.
  • the culture from which the abovementioned fraction is extracted is a culture aged approximately 15 days, and the initial density of which was high, for example of the order of 1 to 2 ⁇ l of volume of sedimented cell aggregates (PCV) by milliliter of medium.
  • PCV sedimented cell aggregates
  • the protein is obtained from a culture of plant embryos belonging to the same species as said primary somatic embryos.
  • the protein is an extracellular protein extracted from a culture medium for plant embryos.
  • anionic proteins optionally glycosylated, having an apparent molecular weight of between approximately 32 kDa and approximately 66 kDa.
  • Optimal efficiency is obtained when the method of the invention is applied to cultures carried out, at least partially, in the absence of light.
  • the extracellular protein is introduced into the induction and / or development medium of the embryos.
  • the primary embryos according to an advantageous variant are at least partially made up of genetically transformed cells, using a technique well known to those skilled in the art.
  • the secondary embryos obtained according to the method according to the present invention can be used in the methods known to those skilled in the art for obtaining regenerated plants.
  • cytokinin such than benzyladenine.
  • the present invention therefore also relates to a plant, in particular a vine, obtained by a regeneration process comprising the process for promoting the production of secondary embryos described above.
  • the cell population densities at the time of inoculation determined by the PCV are between 0.05 and 1 ⁇ l of PCV.mL ** 1 .
  • the PCV-cell density correspondence is ensured by counts made by the method of dispersion in chromic acid. Purification of extracellular proteins
  • An embryo culture is carried out, as indicated above, at an initial inoculation density of 1 ⁇ l of PCV per milliliter of medium. No daily subculture is practiced. After 14 days of culture, while the embryos are blocked in their development at the globule or heart stage, as described by P. Coutos-Thevenot et al. (Plant Science, (1992) 8 ⁇ 137-145), the extracellular proteins secreted during somatic embryogenesis are extracted. The medium of this culture is clarified by vacuum filtration through glass particle filters (Pyrex France) then glass fiber membranes (GF / C, Whatman) before being concentrated 100 to 200 times, using the Amicon ultrafiltration system equipped with a membrane having a cutoff threshold of 3000 Daltons (YM 3).
  • the concentrate is applied to an HPLC cation exchange column (SP-5PW, Waters) balanced with a phosphate buffer (Na 2 HPO -NaH 2 P ⁇ , 25 mM, pH 6.5) at a flow rate of 0.8 mLmin -i.
  • SP-5PW HPLC cation exchange column
  • a phosphate buffer Na 2 HPO -NaH 2 P ⁇ , 25 mM, pH 6.5
  • the fraction of the proteins not retained is collected, detected by optical density and monitored at 280 nm on a UV detector (M440, Waters).
  • This fraction of protein not retained (70% of the initial proteins) is reinjected on an anion exchange column (DEAE-5PW, Waters) balanced with a TRIS buffer (TRIS-HC1, 25 mM, pH 8.5) at 0.8 ml.min-i.
  • the column is then eluted in 40 minutes by a linear gradient of saline solution (TRIS-HCl 25 mM, 1 M NaCl, pH 8.5) from 0 to 0.3 M. Different peaks of elution are observed and are collected in separate fractions. These fractions are stored at 4 ° C.
  • the protein fractions are sterilized by filtration at 0.22 ⁇ m and their concentration determined by the Lovvry method using bovine serum albumin as a standard.
  • the protein fractions collected during elution from the anionic column (DEAE) during the first 25 minutes of the gradient constitute a complex peak with three shoulders for fractions 1 to 3, while the other fractions are collected in the form of separate peaks. A total of 8 fractions were collected.
  • an SDS-type electrophoresis is practiced.
  • fractions For each fraction, several peptides are observed. It appears that all of these fractions contain at least one glycosylated protein, as determined by Western blot. The first three fractions appear as complex mixtures of peptides in a wide range of molecular weights, while fractions 4 to 7 appear less complex and composed of different polypeptides, ranging from 32 to 66 kDa.
  • proembryogenic masses inoculated with 0.1 ⁇ l of PCV.mL-i are supplemented at the start of the culture in an auxin-free medium with one of the protein fractions collected according to example 1.
  • the experiments are carried out for each of the fractions in 24-well microtiter dishes in 1 mL of liquid medium and grown in the dark on an orbital shaker (130 rpm) at 26 ° C. For each culture, four independent repetitions are performed.
  • mass control proembryogenic cultures are carried out under the same conditions, except that, instead of adding a protein fraction, an identical volume of HPLC buffer is added, corresponding to a 0.25 M NaCl concentration, which is greater than that necessary to elute the protein fractions from the column.
  • the protein fractions are added at concentrations ranging from 1 to 100 times their initial concentration found in inoculated cultures with high cell density and I50 (dose inhibiting the development of 50% of embryos) to each fraction varies from 10 to 15 ⁇ g.mL-i.
  • the protein fractions are then all tested at 15 ⁇ g.mL-i and their influence on the embryogenic progression is measured after 20 days of culture.
  • the embryos of each well are counted.
  • the developmental stages taken into consideration are the globule, heart, torpedo and seedling stages. The results are collated in the single appended figure.
  • the single appended figure shows, for each protein fraction tested and for the control cultures, the number of embryos for each stage of development taken into account, expressed as a percentage relative to the total number of embryos counted in each well. .
  • the control it is observed that 80% of the embryos have developed to the torpedo stage. It is approximately the same for the cultures treated by fractions 1, 2, 3 and 8, for which 70 to 90% of the embryos have also reached the torpedo stage.
  • fractions 4 and 5 there is a substantially identical proportion, of the order of 30 or 40% of embryos at each of the three globule, heart and torpedo stages.
  • fraction 6 the embryos at the globule and heart stages are preponderant.
  • fraction 7 the number of embryos that have reached the torpedo stage is greater than that of less developed embryos.
  • the proportion of embryos blocked at the first stage of development, that is to say at the globule stage is greater than 20%, which is very significantly higher than the proportion of embryos of the same stage counted for fractions 1, 2, 3 and 8 and for the control cultures.

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Abstract

La présente invention concerne un procédé pour favoriser la production d'embryons végétaux secondaires à partir d'une culture d'embryons somatiques primaires, caractérisé en ce qu'on introduit dans le milieu de culture desdits embryons somatiques primaires une protéine inhibitrice de l'embryogénèse primaire en concentration efficace pour obtenir l'embryogénèse secondaire.

Description

PROCEDE POUR FAVORISER L ' EMBRYOGENESE SOMATIQUE SECONDAIRE ET APPL ICATION A LA REGENERATION DE PLANTES EN PARTICUL IER DE LA VIGNE
La présente invention se rapporte à un procédé permettant de favoriser l'embryogenèse secondaire à partir d'embryons somatiques primaires en culture et à l'application de ce procédé à la regénération de plantes en particulier de la vigne. Elle concerne également une plante obtenue par un procédé de regénération comprenant le procédé précité.
Pour la majeure partie des espèces végétales, la production d'embryons in natura se fait par voie sexuée ce qui a l'inconvénient, pour les espèces hétérozygotes telles que la vigne par exemple, d'entraîner une recombinaison des caractères génétiques et de perdre ainsi les caractéristiques principales des parents dont ils sont issus. Dans le cas de la vigne, les caractéristiques du cépage seraient perdues, ce qui est inacceptable en oenologie.
Pour permettre une multiplication clonale, c'est-à-dire à l'identique, plusieurs méthodes ont été développées, notamment in vitro.
Elles peuvent aboutir à la formation d'embryons semblables à ceux issus de la fécondation des gamètes mâles et femelles, mais qui sont au niveau génétique une copie de la plante dont ils sont issus. Ces embryons sont appelés somatiques, leur production suit en général le schéma suivant : 1) induction du potentiel embryogène par des auxines exogènes, généralement en fortes concentrations, qui permettent l'apparition d'agrégats (ou masses) proembryogènes (PEM) qui correspondent à des groupes de 10 à 50 cellules, notamment méristèmatiques. Il arrive aussi que les embryons soient obtenus directement sur un tel milieu.
2) transfert de ces cellules sur des milieux exempts d'auxines voire à faible concentration en auxine, qui conduisent à la formation d'embryons somatiques à partir de ces PEM, en suivant les différents stades d'évolution de l'embryogenèse végétale. Ces stades d'évolution sont généralement caractérisés par une forme particulière. Ainsi dans le cas de la vigne, il est habituel de distinguer successivement les stades suivants : globule, coeur, torpille et plantule.
Ces principes sont décrits, en ce qui concerne la propagation de cellules de vigne, dans la demande de brevet US 4 532 733. Par ailleurs, il est souhaitable dans certains cas pour obtenir des plantes transgéniques, d'utiliser des embryons somatiques comme source de matériel végétal de transformation. En utilisant dans ce cas les techniques de transformation classiquement utilisées, telles que la coculture avec des agro-bactéries, ou la biolistique, on obtient des embryons dont certaines zones seulement sont transformées. La possibilité de favoriser l'embryogenèse secondaire, ou encore appelée embryogenèse adventive, à partir des zones transformées, et donc d'augmenter l'efficacité du système transformation-régénération, présente donc un intérêt évident. D'autre part, dans le cas où la transformation génétique des embryons doit être effectuée, favoriser la formation d'embryons secondaires, au niveau de l'épiderme des embryons transformés, au lieu d'un développement normal des pousses est aussi très important pour augmenter le nombre de transformants produits. C'est pourquoi la présente invention a pour objet un procédé pour favoriser la production d'embryons végétaux secondaires à partir d'une culture d'embryons somatiques primaires, caractérisé en ce qu'on introduit dans le milieu de culture desdits embryons somatiques primaires une protéine inhibitrice de l'embryogenèse primaire en concentration efficace pour obtenir l'embryogenèse secondaire.
On appelle inhibition de l'embryogenèse primaire l'arrêt du développement à un stade de l'évolution de l'embryogenèse qui peut être le stade globule ou coeur ou torpille.
Plus particulièrement, le procédé selon la présente invention peut s'appliquer à la production d'embryons somatiques de vigne.
De manière générale, dans le cas des suspensions de cellules embryogènes du type 41 B, en culture dans des conditions classiques sans transfert fréquent, on observe un blocage rapide du développement au stade globule ou coeur. Certains auteurs ont avancé que ce phénomène d'inhibition était dû à la présence de macromolécules extra-cellulaires supérieures à 10 kDa (Plant Cell Tiss. Org. Cuit. (1992) 22, 125-133).
La Demanderesse a trouvé de manière surprenante que certaines protéines et notamment une certaine classe de celles réputées pour inhiber l'embryogenèse primaire, permettaient de favoriser l'embryogenèse secondaire. Plus particulièrement, le procédé selon l'invention peut être mis en oeuvre en introduisant dans le milieu du culture des embryons primaires une fraction contenant au moins une protéine, extraite d'une culture d'embryons végétaux bloqués dans leur développement. Selon un mode particulier de réalisation de la présente invention,
1) on fait une culture d'embryon de la plante considérée,
2) on isole les protéines inhibitrices de l'embryogenèse, et
3) on introduit ces protéines isolées dans la culture d'embryon dont on veut obtenir des embryons secondaires. De préférence la culture dont on extrait la fraction précitée est une culture âgée d'environ 15 jours, et dont la densité initiale était élevée, par exemple de l'ordre de 1 à 2 μl de volume d'agrégats cellulaires sédimentés (PCV) par millilitre de milieu.
Selon une variante particulière, la protéine est obtenue à partir d'une culture d'embryons végétaux appartenant à la même espèce que lesdits embryons somatiques primaires.
De préférence, la protéine est une protéine extracellulaire extraite d'un milieu de culture d'embryons végétaux.
Parmi les protéines extracellulaires convenant pour mettre en oeuvre le procédé selon l'invention, il est avantageux de choisir les protéines anioniques, éventuellement glycosylées, présentant un poids moléculaire apparent compris entre 32 kDa environ et 66 kDa environ en
SDS-PAGE
Une efficacité optimale est obtenue quand le procédé de l'invention est appliqué à des cultures effectuées, au moins partiellement, en l'absence de lumière.
De préférence, la protéine extracellulaire est introduite dans le milieu d'induction et/ou de développement des embryons.
Les embryons primaires selon une variante avantageuse sont au moins partiellement constitués de cellules transformées génétiquement, au moyen d'une technique bien connue de l'homme de l'art.
Les embryons secondaires obtenus suivant le procédé selon la présente invention peuvent être utilisés dans les procédés connus de l'homme de métier pour l'obtention de plantes régénérées. Par exemple, on pourra utiliser le procédé décrit dans le document US 4 532 733, notamment colonne 3, lignes 27 à 44, comprenant le transfert des embryons dans un milieu de culture de type Murashige et Skoog ( 1962), supplémenté en cytokinine, telle que la benzyladénine. Pour ces procédés de regénération à partir, d'embryons secondaires, on pourra également se reporter à ceux décrits par G-Maheswaran et al, Ann-Bot., 57 (1988) 109-117 ou par C-S-Loh et al, New Phytol., 95 (1983) 349-358.
Suivant un second aspect, la présente invention a donc également pour objet une plante, en particulier une vigne, obtenue par un procédé de regénération comprenant le procédé pour favoriser la production d'embryons secondaires décrit plus haut.
Les exemples qui suivent sont destinés à illustrer l'invention sans aucunement en limiter la portée.
Exemple 1 : Obtention de protéines extracellulaires d'embryogenèse primaire
Origine de la culture d'embryon primaire On utilise comme source d'agrégats de cellules embryogènes, la culture de cellules embryogènes de porte-greffe de vigne 41 B, déposée à l'European Collection of Animal Cell Cultures sous le n° PL 92042917 décrite dans la demande internationale PCT déposée le 11 mai 1993 sous le numéro PCT/FR93/00456. Pour initier les cultures d'embryons dans un milieu dépourvu d'auxine, la suspension cellulaire est filtrée successivement sur des tamis de 500 μm et 200 μm, et la fraction retenue sur 200 μm est lavée trois fois dans un milieu de culture dépourvu d'auxine, selon le protocole décrit précédemment. Les densités de population cellulaire au moment de l'inoculation déterminée par le PCV (Packed Cell Volume, unité de volume cellulaire sédimenté à 1 x g) sont comprises entre 0,05 et 1 μl de PCV.mL** 1 . La correspondance PCV-densité cellulaire est assurée par des numérations faites par la méthode de dispersion dans l'acide chromique. Purification des protéines extracellulaires
On réalise une culture d'embryons, comme indiqué ci-dessus, à une densité d'inoculation initiale de 1 μl de PCV par millilitre de milieu. Aucune sous-culture journalière n'est pratiquée. Après 14 jours de culture, alors que les embryons sont bloqués dans leur développement au stade globule ou coeur, comme décrit par P. Coutos-Thevenot et al. (Plant Science, ( 1992) 8ϋ 137-145), on extrait les protéines extracellulaires sécrétées pendant l'embryogenèse somatique. Le milieu de cette culture est clarifié par filtration sous vide à travers des filtres de particules de verre (Pyrex France) puis des membranes de fibres de verre (GF/C, Whatman) avant d'être concentré de 100 à 200 fois, en utilisant le système d'ultrafiltration Amicon équipé d'une membrane ayant un seuil de coupure de 3000 Daltons (YM 3). Le concentré est appliqué à une colonne CLHP d'échange de cations (SP-5PW, Waters) équilibrée avec un tampon phosphate (Na2HPO -NaH2Pθ , 25 mM, pH 6,5) à un débit de 0,8 mLmin-i .
On recueille la fraction des protéines non retenues, détectée par densité optique et suivie à 280 nm sur un détecteur UV (M440, Waters). Cette fraction de protéine non retenues (70% des protéines initiales) est réinjectée sur une colonne d'échange d'anions (DEAE-5PW, Waters) équilibrée avec un tampon TRIS (TRIS-HC1, 25 mM, pH 8,5) à 0,8 ml.min-i. La colonne est ensuite éluée en 40 minutes par un gradient linéaire de solution saline (TRIS-HC1 25 mM, NaCl 1 M, pH 8,5) de 0 à 0,3 M. Différents pics d'élution sont observés et sont recueillis dans des fractions séparées. Ces fractions sont conservées à 4° C. Les fractions protéiques sont stérilisées par filtration à 0,22 μm et leur concentration déterminée par la méthode de Lovvry en utilisant de la sérum albumine bovine comme étalon. Les fractions protéiques receuillies pendant l'élution de la colonne anionique (DEAE) pendant les 25 premières minutes du gradient constituent un pic complexe avec trois épaulements pour les fractions 1 à 3, alors que les autres fractions sont recueillies sous forme de pics séparés. Au total, 8 fractions ont été recueillies. Pour caractériser les protéines présentes dans chaque fraction, en estimant leur masse molaire, on pratique une électrophorèse de type SDS-
PAGE à voltage constant (200 V). Le gel est ensuite coloré au bleu de
Coomassie ou révélé par la technique dite de Western blot avec le complexe Concanavaline A-péroxidase (Bio-rad Laboratoires, Richmond CA).
Pour chaque fraction, on observe plusieurs peptides. Il apparaît que toutes ces fractions contiennent au moins une protéine glycosylée, comme déterminé par Western blot. Les trois premières fractions apparaissent comme des mélanges complexes de peptides dans une large gamme de masses moléculaires, alors que les fractions 4 à 7 apparaissent moins complexes et composées de polypeptides différents, allant de 32 à 66 kDa.
Exemple 2 : Production d'embryogenèse secondaire par complémentation en protéines inhibitrices de l'embryogenèse primaire
Les masses proembryogènes inoculées à 0,1 μl de PCV.mL-i sont complémentées au début de la culture dans un milieu exempt d'auxine avec l'une des fractions protéiques recueillies suivant l'exemple 1. Les expériences sont réalisées pour chacune des fractions dans des boîtes de microtitration de 24 puits dans 1 mL de milieu liquide et cultivées à l'obscurité sur un agitateur orbital (130 rpm) à 26° C. Pour chaque culture on effectue quatre répétitions indépendantes. Parallèlement des cultures de masse proembryogènes témoins sont réalisées dans les mêmes conditions, si ce n'est qu'au lieu d'ajouter une fraction protéique, on ajoute un volume identique de tampon CLHP, correspondant à une concentration en NaCl 0,25 M, qui est supérieure à celle nécessaire pour éluer les fractions protéiques de la colonne.
Dans des expériences préliminaires d'inhibition protéique, les fractions protéiques sont ajoutées à des concentrations allant de 1 à 100 fois leur concentration initiale trouvée dans les cultures inoculées à haute densité cellulaire et le I50 (dose inhibant le développement de 50% des embryons) pour chaque fraction varie de 10 à 15 μg.mL-i. Les fractions protéiques sont ensuite toutes testées à 15 μg.mL-i et leur influence sur la progression embryogène est mesurée après 20 jours de culture. Les embryons de chaque puits sont dénombrés. Les stades de développement pris en considération sont les stades globule, coeur, torpille et plantule. Les résultats sont rassemblés sur la figure unique annexée. Sur la figure unique annexée, on a représenté, pour chaque fraction protéique testée et pour les cultures témoins, le nombre d'embryons pour chaque stade de développement pris en considération, exprimé en pourcentage par rapport au nombre total d'embryons dénombrés dans chaque puits. On observe, en ce qui concerne le témoin, que 80% des embryons se sont développés jusqu'au stade torpille. Il en est environ de même pour les cultures traitées par les fractions 1, 2, 3 et 8, pour lesquelles 70 à 90% des embryons sont parvenus également au stade torpille.
Par contre, les résultats obtenus avec les fractions 4, 5, 6 et 7 qui contiennent des protéines de masse molaire de 32 kDa à 66 kDa, sont très sensiblement différents.
Pour les fractions 4 et 5, on trouve une proportion sensiblement identique, de l'ordre de 30 ou 4O% d'embryons à chacun des trois stades globule, coeur et torpille. Pour la fraction 6, les embryons aux stades globule et coeur sont prépondérants. Tandis que pour la fraction 7, le nombre d'embryons parvenus au stade torpille est supérieur à celui des embryons moins développés. Toutefois, pour cette fraction, la proportion d'embryons bloqués au premier stade de développement, c'est-à-dire au stade globule est supérieure à 20 %, ce qui est très sensiblement supérieur à la proportion des embryons du même stade dénombrés pour les fractions 1, 2, 3 et 8 et pour les cultures témoins. Ainsi, il apparaît clairement que le traitement des cultures d'embryons par les fractions 4, 5, 6 et 7, entraîne une diminution très notable du nombre d'embryons développés au stade torpille et une plus forte proportion d'embryons au stade globule. On peut donc en conclure que ces fractions ont provoqué l'inhibition du développement des embryons somatiques. On remarquera toutefois que, bien que le développement des embryons soit bloqué pour la majorité d'entre eux, une faible proportion a échappé à cette inhibition et pour laquelle les embryons ont atteint le stade de plantule. Une observation microscopique de ces plantules recueillies montre que, sur l'épiderme de celles-ci, se sont formé de nombreux embryons secondaires, ou adventifs, dont le développement semble s'être arrêté au stade globulaire.
Ainsi, la complémentation de culture d'embryons somatiques primaires, avec des fractions extraites de cultures d'embryons dont le développement était bloqué, a permis d'obtenir la formation d'une grande quantité d'embryons secondaires, qu'il sera possible de développer ultérieurement, après transplantation dans un milieu approprié, suivant l'un des procédés bien connus de l'homme de l'art, comme décrit plus haut, pour obtenir la regénération de nouvelles plantes.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé pour favoriser la production d'embryons végétaux secondaires à partir d'une culture d'embryons somatiques primaires, caractérisé en ce qu'on introduit dans le milieu de culture desdits embryons somatiques primaires une protéine inhibitrice de l'embryogenèse primaire en concentration efficace pour obtenir l'embryogenèse secondaire.
2. Procédé pour favoriser la production d'embryons végétaux secondaires à partir d'une culture d'embryons somatiques primaires, caractérisé en ce qu'on introduit dans le milieu de culture desdits embryons primaires une fraction contenant au moins une protéine, extraite d'une culture d'embryons végétaux bloqués dans leur développement.
3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que la culture dont on extrait la fraction précitée est une culture âgée d'environ 15 jours, et dont la densité initiale était élevée, par exemple de l'ordre de 1 à 2 μl de volume d'agrégats cellulaires sédimentés (PCV) par millilitre de milieu.
4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la protéine précitée est obtenue à partir d'une culture d'embryons végétaux appartenant à la même espèce que lesdits embryons somatiques primaires.
5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la protéine précitée est une protéine extracellulaire extraite d'un milieu de culture d'embryons végétaux.
6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la protéine précitée est une protéine de type anionique, éventuellement glycosylée.
7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que la protéine précitée présente un poids moléculaire apparent compris entre 32 kDa et 66 kDa en SDS-PAGE
8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que la protéine précitée est introduite dans le milieu d'induction et/ou de développement des embryons.
9. Procédé selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que les embryons somatiques primaires sont au moins partiellement constitués de cellules génétiquement transformées.
10. Procédé selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que la culture d'embryons primaires est une culture d'embryons de vignes.
11. Plante, en particulier vigne, obtenue par un procédé de regénération comprenant le procédé selon l'une des revendications 1 à 10.
PCT/FR1994/001105 1993-09-22 1994-09-21 Procede pour favoriser l'embryogenese somatique secondaire et application a la regeneration de plantes, en particulier de la vigne Ceased WO1995008262A1 (fr)

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JP7509606A JPH09504688A (ja) 1993-09-22 1994-09-21 二次体細胞胚発生を促進する方法、植物特にブドウの木の再生への応用
ES94928425T ES2114228T3 (es) 1993-09-22 1994-09-21 Procedimiento para favorecer la embriogenesis somatica secundaria y aplicacion a la regeneracion de plantas, en particular de la vid.
NZ273969A NZ273969A (en) 1993-09-22 1994-09-21 Method of enhancing secondary somatic embryogenesis over primary somatic embryogenesis, regeneration of plants; grapevines
AU77857/94A AU687446B2 (en) 1993-09-22 1994-09-21 Method for encouraging secondary somatic embryogenesis and application to the regeneration of plants, in particular the grape vine
DE69408681T DE69408681T2 (de) 1993-09-22 1994-09-21 Verfahren zur förderung der sekundären somatischen embryogenese und anwendung zur pflanzenregeneration, insbesondere der weinrebe

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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104871974A (zh) * 2015-05-25 2015-09-02 中国农业科学院郑州果树研究所 一种诱导无核葡萄幼胚发生体细胞胚的方法及专用培养基

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6995016B2 (en) 2000-08-17 2006-02-07 Her Majesty The Queen In Right Of Canada, As Represented By The Minister Of Agriculture And Agri-Food Process for inducing direct somatic embryogenesis in immature scutella cells of pooideae, and rapidly regenerating fertile plants

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4532733A (en) * 1982-12-03 1985-08-06 The Board Of Governors For Higher Education, State Of Rhode Island In vitro propagation of grape
WO1987002701A1 (fr) * 1985-10-22 1987-05-07 Plant Genetics, Inc. Procedes et agents d'enbryogenese somatique amelioree
EP0293598A2 (fr) * 1987-04-29 1988-12-07 DNA PLANT TECHNOLOGY CORPORATION (under the laws of the state of Delaware) Embryogénèse somatique et régénération de plantes de cacao

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS61288000A (ja) * 1985-06-14 1986-12-18 花王株式会社 液体洗剤組成物
US4828747A (en) * 1988-03-25 1989-05-09 Lever Brothers Company Suspending system for insoluble peroxy acid bleach

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4532733A (en) * 1982-12-03 1985-08-06 The Board Of Governors For Higher Education, State Of Rhode Island In vitro propagation of grape
WO1987002701A1 (fr) * 1985-10-22 1987-05-07 Plant Genetics, Inc. Procedes et agents d'enbryogenese somatique amelioree
EP0293598A2 (fr) * 1987-04-29 1988-12-07 DNA PLANT TECHNOLOGY CORPORATION (under the laws of the state of Delaware) Embryogénèse somatique et régénération de plantes de cacao

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
C.-S- LOH ET AL.: "Cytokinins and the regeneration of plantlets from secondary embryoids of winter oilseed rape, Brassica napus ssp. oleifera", THE NEW PHYTOLOGIST, vol. 95, 1983, pages 349 - 358 *
D.J. GRAY ET AL.: "Initiation and maintenance of long term somatic embryogenesis from anthers and ovaries of Vitis longii", PLANT CELL, TISSUE AND ORGAN CULTURE, vol. 9, no. 1, 1987, DORDRECHT, NL, pages 73 - 80 *
G. MAHESWARAN ET AL.: "Direct secondary somatic embryogenesis from immature sexual embryos of Trifolium repens cultured in vitro", ANNALS OF BOTANY, vol. 57, 1986, pages 109 - 117 *
L.C. MARTINELLI ET AL.: "A study for the characterization of somatic embryogenesis on grapevine", IN VITRO, vol. 29A, no. 3, March 1993 (1993-03-01), pages 63A *
P. COUTOS-THEVENOT ET AL.: "Extracellular protein patterns of grapevine cell suspensions in embryogenic and non-embryogenic situations", PLANT SCIENCE, vol. 86, 1992, pages 137 - 145 *
P. COUTOS-THEVENOT ET AL.: "Somatic embryogenesis from grapevine cell. I - Improvement of embryo development by changes in culture conditions", PLANT CELL, TISSUE AND ORGAN CULTURE, vol. 29, 1992, pages 125 - 133 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104871974A (zh) * 2015-05-25 2015-09-02 中国农业科学院郑州果树研究所 一种诱导无核葡萄幼胚发生体细胞胚的方法及专用培养基

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