WO1994024600A1 - Laserstreulichtmikroskop - Google Patents

Laserstreulichtmikroskop Download PDF

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    • G—PHYSICS
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    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/06—Means for illuminating specimens

Definitions

  • Different devices are used to enlarge and examine objects and surfaces of objects in the subminiature range. For example, Light microscopes, electron microscopes or scanning electron microscopes etc. are used.
  • the captured image can only be evaluated with a CCD camera attached and a subsequent image processing.
  • Another problem is the very small solid angle at which this and other systems are used for detection. This applies in the same way to all other systems that are equipped with lenses or lens-like lenses.
  • the objects have to be specially prepared, e.g. by vapor deposition of a metal film. This means not only a considerable effort, but also an exclusion of different objects for the preparation. Here, too, the area on which detection is carried out is still considerably restricted.
  • the task now is to develop a method in which all types of objects can be enlarged without contact and unprepared and a large amount of information is available for evaluation.
  • a laser beam is adjusted to the necessary beam width with an expansion lens and then focused with a lens with a small focal length in the focus on the minimum possible diameter.
  • lasers in the visible range of approximately 100 nm corresponding to 1 ⁇ m can be achieved in focus.
  • the focused beam is moved over the slide using mechanical devices or optoelectric systems, and in this way the object is identified and pre-analyzed.
  • the step size should not exceed the beam diameter.
  • a hemisphere is attached around the focus point above the slide and, in the case of transparent slides, also below the slide, the center or -points are in the focal point of the laser beam. are located.
  • photo sensors are attached directly or indirectly in a regular grid. Since the reading of individual photo sensors, such as photo elements, is only possible with considerable expenditure of electronics and, above all, time, the use of indirect photo sensors is recommended. These consist of fine optical fibers that start from the individual measuring points on the hemisphere surface and are bundled into one or, if necessary, several lines.
  • Another possibility is the use of transparent materials, the surface element being tapered over a certain distance onto the light guide cross-sectional area.
  • the incoming light is then guided into the optical fiber by multiple reflection.
  • the hemispherical detection surfaces created with the device according to the invention around the focal point now enable a comprehensive evaluation of the reflected and above all of the scattered light.
  • Structural analyzes can thus be carried out down to a few nm.
  • FIGS. 1 and 2 An embodiment of the method according to the invention is described with reference to FIGS. 1 and 2.
  • FIGS. 1 and 2 The following details are shown in FIGS. 1 and 2:
  • the laser beam from the laser 1 passes through the deflecting mirror 2 into the expansion optics 3.
  • the beam is expanded here.
  • This widened beam 4 strikes the focusing lens 5 and is focused on the focus point 7.
  • the slide 8 is scanned in the two possible directions of the plane. This results in reflections and scattering 6, which then fall onto a hemispherical surface 9 and are detected there.
  • FIGS. 3 to 9 The following details are shown in FIGS. 3 to 9:
  • the light-receiving positions 19 are located on the receiving hemisphere 9 at an equal distance from one another or in sections divided into sectors. In these positions, the optical fibers 21 either lead directly from the hemisphere surface 20 into the interior of the hemisphere or this is done according to light collectors. 8 or 9.
  • These light collectors are either a diffusing screen 27 which is fitted into a frame 28 or a sector part 29 which tapers to the optical fiber diameter and is made of a transparent material, with the former measuring the overall brightness of the diffusing screen and the second with the light reaches the optical fiber 21 via multiple reflections.
  • the optical fibers 21 open onto the linear CCD 22 and sit on the glass pane 24 of the CCD.
  • a bracket 23 ensures that the optical fibers 21 are held directly above the row of pixels 25.
  • the information reaches the computer (not shown) via the connecting tiller 26.
  • the beam is guided over the horizontal mirror 17 and vertical mirror 18.
  • These mirrors then each consist of the mirror receptacle 15, on which the mirror body 10 with its reflection layer 11 rests in such a way that an edge of the mirror body is embedded in an elastic plastic 12 and rests on the opposite side via the adhesive layer 14 on the piezo element 13 .
  • By changing the voltage applied to the piezo element its shape changes, which results in a change in the position of the mirror in such a way that the mirror rotates around the edge mounted in plastic.
  • the fine focusing can be achieved in a similar manner by holding the focus lens 5 in a plastic ring 19 which rests on piezo elements 13.
  • the piezo elements rest on the lens holder 16.
  • a change in the voltage of all the piezo elements carrying the lens also results in a change in the bearing Lens, which can raise or lower the focus point.

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Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur lasermikroskopischen Vergrößerung von Objekten sowie auf eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens. Bei dem Verfahren können insbesondere organische, elastische oder isolierende Objekte bis in den Nanometerbereich sowie deren Oberflächenstrukturen berührungslos und unpräpariert untersucht und mit geringem technischen Aufwand die erzeugten optischen Signale verarbeitet werden. Hierzu werden die Proben mit einem über eine Aufweitungsoptik (3) auf einen größeren Strahldurchmesser aufgeweiteten und anschließend mit einer Fokussierlinse (5) geringer Brennweite auf einen möglichst kleinen Strahldurchmesser fokussierten Laserstrahl angestrahlt, wobei das Objekt abgerastert werden kann. Die Intensität von Lichtreflexionen und Streustrahlung (6) wird in einem sehr großen Raumwinkel, bevorzugt auf der inneren Oberfläche von einer oder zwei Halbkugelschalen mit direkten oder indirekten Fotosensoren erfaßt. Als Lichtsensoren können Lichtleitfasern eingesetzt werden.

Description

Laserstreulichtmikroskop
Stand der Technik
Zur Vergrößerung und Untersuchung von Objekten und Oberflächen von Objekten im Subminiaturbereich werden unterschiedliche Geräte eingesetzt. So werden dazu z.B. Lichtmikroskope, Elektronenmikroskope oder Rasterelektronenmikroskope etc. benutzt.
Diese Geräte sind sattsam bekannt und brauchen hier nicht im einzelnen aufgeführt werden. Aber übliche Lichtmikroskope ohne weitere Elektronik fallen dann aus, wenn es darum geht, das aufgenommene Bild noch auszuwerten und Aussagen darüber zu entwickeln.
Die hierzu notwenige Elektronik, meistens eine CCD-Kamera, ist recht aufwendig und die Auswertungslogik, also der dazu notwenige Rechner und das Programm, sind selten so eingerichtet, daß reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten sind.
Bei auswertenden Geräten, wo überwiegend bereits das Bild elektronisch erzeugt wurde, handelt es sich immer um sehr komplexe, sehr aufwendige und vor allem sehr teure Systeme.
Problem
Die bei der Vergrößerung und Auswertung auftretenden Probleme sind mannigfaltig und abhängig vom verwendeten Verfahren.
Bei der am häufigsten verwendeten Lichtmikroskopie kann, wie zuvor dargestellt, nur mit einer aufgesetzten CCD-Kamera und einem sich anschließenden Imageprocessing eine Auswertung des aufgenommenen Bildes vollzogen werden. Ein weiteres Problem ist der sehr kleine Raumwinkel, unter dem mit diesem und auch anderen Systemen detektiert wird. Dies gilt in gleicher Weise für alle anderen Systeme, die mit Linsen oder linsenähnlichen Objektiven ausgerüstet sind.
Bei anderen Vergößerungssystemen müssen die Objekte speziell präpariert werden, so z.B. durch Aufdampfung eines Metallfilms. Dies bedeutet nicht nur einen erheblichen Aufwand, sondern auch einen Ausschluß verschiedener Objekte für die Präparation. Auch hier ist weiterhin die Fläche, auf der detektiert wird, erheblich eingeschränkt.
Sonstige Rasteraufnahmen sind ebenfalls nur entweder bei präparierten oder stofflich geeigneten Proben möglich.
Die Untersuchung von organischen, elastischen und isolierenden Objekten ist bisher nur mit der Lichtmikroskopie möglich. Problemlösung
Es gilt nun ein Verfahren zu entwickeln, bei dem alle Arten von Objekten berührungslos und unpräpariert vergrößert werden können und eine große Fülle von Informationen zur Aus- wertung zur Verfügung stehen.
Auch sollte es mit gewissen Beschränkungen möglich sein, Objekte auch dicht unter einer Wasseroberfläche entsprechend zu vergrößern und eine Auswertung zu vollziehen.
Die Lasermikroskopie
Das erfindungsgemäße Verfahren der Lasermikroskopie mit dem Einsatz von einer oder auch zwei halbkugelförmigen Auswertungsflächen bietet eine ideale Problemlösung. Ein Laserstrahl wird mit einer Aufweitungsoptik auf die notwendige Strahlbreite eingestellt und dann mit einer Linse geringer Brennweite im Fokus auf den minimal möglichen Durchmesser gebündelt.
Da dieser zum einen durch die Wellenlänge des Laserlichtes begrenzt ist und zum anderen durch die Parameter Strahldurchmesser vor der Linse und Brennweite der Linse bestimmt wird, sind mit Lasern im sichtbaren Bereich Strahldurchmesser von ca. lOOOnm entsprechend 1 μm im Fokus zu erreichen.
Dies alleine ist aber nicht ausreichend, eine genügend auflösende Vergrößerung zu erzielen, insbesondere nicht bei der Auswertung und Analyse von organischen Objekten, so z.B. bei der Analyse von Erythrozyten. Hier ist es unabdingbar, weitere Informationen auszuwerten.
Um dies durchzuführen, ist es erforderlich, in einem möglichst großen Raumwinkel alle Lichterscheinungen bei der Bestrahlung des Objekts mit dem hochgebündelten Laserstrahl zu erfassen und hierüber tief in die Oberflächenstruktur des zu untersuchenden Partikels einzudringen.
So wird mittels mechanischer Vorrichtungen oder auch optoelektrischer Systeme der fokussierte Strahl über den Objektträger bewegt und auf diese Weise das Objekt ausgemacht und voranalysiert. Die Schrittweite sollte dabei nicht den Strahldurchmesser überschreiten. Um den Fokuspunkt herum wird eine Halbkugel oberhalb des Objektträgers und bei transparenten Objektträgern auch unterhalb des Objektträgers angebracht, deren Mittelpunkt resp. -punkte sich im Fokuspunkt des Laserstrahls befindet resp. befinden.
Innerhalb der Halbkugeln sind in einem regelmäßigen Raster direkt oder indirekt Fotosensoren angebracht. Da die Auslesung einzelner Fotosensore, wie z.B. Fotoelemente nur mit erheblichem Aufwand an Elektronik und vor allem an Zeit möglich ist, bietet sich der Einsatz von indirekten Fotosensoren an. Diese bestehen aus feinen Lichtleitfasern, die von den einzelnen Meßpunkten auf der Halbkugeloberfläche ausgehen und zu einer oder bei Bedarf auch mehreren Zeilen gebündelt werden.
Diese Zeilen enden dann auf einer linearen CCD. Auf diese Weise werden die Helligkeiten an den verschiedenen Punkten der inneren Oberfläche der Halbkugel auf eine oder mehrere CCD-Zeilen abgebildet, wobei jeder Pixel oder jede Pixelgruppe der CCD für eine ganz bestimmte Position auf der Halbkugel steht.
Sollten sich scharf begrenzte und nahezu punktuelle Intensitäten auf der Kugeloberfläche ergeben, die räumlich zwischen den einzelnen Aufnahmepunkten liegen und somit mit der festgelegten Rasterung auf der Halbkugeloberfläche nicht erfaßbar sind, dann müssen die Felder, die sich um den Aufnahmepunkt herum ergeben mit speziellen Kollektorflächen ausgerüstet werden.
Diese können entweder aus kleinen Sektorflächen bestehen, die aus einem geeigneten Streumaterial gefertigt sind, wobei die auf diese kleinen Sektorflächen auftreffende Intensität zur Aufhellung des gesamten Flächenelementes führt und mittels der Fotosensore resp. Lichtleiterfasern diese Gesamthelligkeit gemessen wird.
Eine andere Möglichkeit ist der Einsatz von transparenten Materialien, wobei das Flächenelement über eine bestimmte Strecke auf die Lichtleiterquerschnittsfläche verjüngt wird. Durch Mehrfachreflektion wird dann das eintretende Licht in die Lichtleitfaser geführt. Die mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung geschaffenen halbkugelförmigen Detektierflachen um den Fokuspunkt herum ermöglichen nun eine umfassende Auswertung des reflektierten und vor allem des gestreuten Lichtes.
Auf diese Weise lassen sich nicht nur alle Objekte bis zur Größe des minimalen Strahldurchmessers genau vermessen und auswerten, sondern auch die Oberflächenstruktur läßt sich durch die Streulichtauswertung analysieren.
Dies insbesondere dann, wenn ein linear polarisierter Laser eingesetzt wird und dadurch besonders charakteristische Streulichtverteilungen erzielt werden. Deren Auswertung läßt Aussagen auch über extrem kleine Strukturen zu.
Somit können Strukturanalysen bis zu einigen nm herab durchgeführt werden.
Durch den Einsatz von Piezoelementen bei den Umlenkspiegeln und bei der Linsenhalterung können einerseits sehr kleine Strukturen abgefahren und erfaßt werden und andererseits sehr schnell dadurch nachjustiert werden, indem der Fokuspunkt gesenkt oder gehoben wird. Da die Messung im maximal möglichen Raumwinkel erfolgt, kann sowohl die Form größerer Körper abgetastet, vermessen und berechnet werden, als auch deren Oberflächenbeschaffenheit aus dem Streulicht abgelesen werden. Aufgrund der berührungslosen Messung von nicht speziell präparierten Objekten bietet sich der Einsatz besonders im Bereich der serologischen Diagnostik an.
Hier ist es Aufgabe des erfindungsgemäßen Verfahrens, mit- tels der erfindungsgemäßen Vorrichtung die Oberflächen von Erythrozyten zu vermessen und deren Belegung mit Antikörpern zu quantifizieren. Da es sich bei allen verwendeten Elementen um recht preisgünstige Massenfabrikate handelt, bleibt auch der Preis des Gesamtsystems in Grenzen und liegt weit unter dem vergleichbarer Meßsysteme.
Beschreibung
Anhand der Figuren 1 und 2 wird eine Ausführung des erfin- dungsgemäßen Verfahrens beschrieben.
Anhand der Figuren 3 bis 9 wird eine Ausführung der erfindungsgemäßen Vorrichtung beschrieben.
So werden in den Figuren 1 und 2 die folgenden Einzelheiten dargestellt:
Der Laserstrahl aus dem Laser 1 gelangt über den Umlenkspiegel 2 in die Aufweitungsoptik 3. Hier wird der Strahl aufgeweitet. Dieser aufgeweitete Strahl 4 trifft auf die Fokussierlinse 5 und wird auf den Fokuspunkt 7 gebündelt. Mit dem auf den kleinstmöglichen Durchmesser fokussierten Strahl wird der Objektträger 8 in den beiden möglichen Richtungen der Ebene abgerastert. Hierbei entstehen Reflektionen und Streuungen 6, die dann auf eine halbkugelige Fläche 9 fallen und dort detektiert werden.
In den Figuren 3 bis 9 sind die folgenden Einzelheiten dargestellt:
Auf der Aufnahmehalbkugel 9 befinden sich in einem gleichen Abstand voneinander oder in Sektoren aufgeteilten Abständen die Lichtaufnahmepositionen 19. In diese Positionen führen von der Halbkugeloberfläche 20 entweder direkt die Lichtleitfasern 21 in das Innere der Halbkugel oder dies geschieht über Lichtkollektoren gem. Fig. 8 oder Fig. 9. Bei diesen Lichtkollektoren handelt es sich entweder um eine Streuscheibe 27, die in einem Rahmen 28 eingepaßt ist oder um einen sich auf den Lichtleitfaserdurchmesser verjüngenden Sektorteil 29 aus einem transparenten Material, wobei beim Ersteren die sich einstellende Gesamthelligkeit der Streuscheibe gemessen wird und beim Zweiteren das Licht über Mehrfachreflektionen zur Lichtleitfaser 21 gelangt.
Die Lichtleitfasern 21 münden auf der linearen CCD 22 und sitzen auf der Glasscheibe 24 der CCD auf. Eine Halterung 23 stellt sicher, daß die Lichtleitfasern 21 direkt über der Pixelreihe 25 gehalten werden.
Über die Anschlußpinne 26 gelangen die Informationen in den nicht dargestellten Rechner.
Um den Strahl 4 schneller und unter Rechnerkontrolle zu führen, wird der Strahl über den Horizontalspiegel 17 und Vertikalspiegel, 18 geführt. Diese Spiegel bestehen dann jeweils aus der Spiegelaufnahme 15, auf dem der Spiegelkörper 10 mit seiner Reflektionsschicht 11 in der Weise aufliegt, daß eine Kante des Spiegelkörpers in einem elastischen Kunststoff 12 eingebettet ist und auf der gegenüberliegenden Seite über die Klebeschicht 14 auf dem Piezoelement 13 aufliegt. Durch die Veränderung der an das Piezoelement angelegten Spannung verändert sich dessen Form, wodurch sich eine Lageveränderung des Spiegels ergibt und zwar in der Weise, daß sich der Spiegel um die in Kunststoff gelagerte Kante dreht.
In ähnlicher Weise läßt sich die Feinfokussierung erreichen, indem die Fokuslinse 5 in einem Kunststoffring 19 gehalten wird, welcher auf Piezoelementen 13 aufliegt. Die Piezoelemente liegen auf der Linsenhalterung 16 auf.
Durch eine Spannungsveränderung an allen die Linse tragenden Piezoelementen ergibt sich auch eine Lagerveränderung der Linse, wodurch der Fokuspunkt gehoben oder gesenkt werden kann.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren der Lasermikroskopie, dadurch gekennzeichnet, daß Proben mit einem auf den kleinstmöglichen Durchmesser fokussierten Laserstrahl angestrahlt werden und Lichtreflektionen und Lichtstreuungen in einem sehr großen Raumwinkel erfaßt werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Erfassung der Reflektionen und Streuungen auf einer halbkugelförmigen Fläche erfaßt werden.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Erfassung auf einer kugelförmigen Fläche erfolgt.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die erfaßten Intensitätsverteilungen in einem Rechner ausgewertet werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß aus dem Laserstrahl ein Teilstrahl zur Kompensation von Intensitätsschwankungen über einen Teilerspiegel herausgeführt wird.
6. Vorrichtung eines Lasermikroskops, dadurch gekennzeichnet, daß der Laserstrahl erst über eine Aufweitungsoptik auf einen größeren Strahldurchmesser aufgeweitet wird und dann mit einer Linse geringer Brennweite auf einen möglichst kleinen Strahldurchmesser fokussiert wird, die Erfassung der Intensitäten auf einer oder zwei inneren Oberflächen von Halbkugelschalen mit direkten oder indirekten Fotosensoren erfolgt und das Objekt mechanisch unter dem Fokuspunkt in beiden Richtungen bewegt wird und/oder der Strahl optoelektrisch über das Objekt geführt wird und die Meßwerte in einem Rechner ausgewertet werden.
7. Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß als Lichtsensoren Lichtleitfasern eingesetzt werden, die auf einer oder mehreren linearen CCD 's führen und die Pixel oder Pixelgruppen jeweils für eine bestimmte Position auf der Halbkugelfläche stehen und die dort auftretenden Lichtquanten verarbeiten.
8. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 6 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß der Laserstrahl über Umlenkspiegel geführt wird, deren Winkelstellung durch Anlegung von
Spannungen an Piezoelemente verändert werden kann.
9. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß als Klebe- und Befestigungsmaterialien der Spiegel und der Verbindung mit den Piezoelementen elastische Kunststoffe eingesetzt werden.
10. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 6 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Objektträger mechanisch in allen beiden Richtungen der Ebene über Schrittmotore bewegt wird.
11. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 6 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die fokussierlinse mechanisch oder elektromechanisch auf- und abwärts geführt werden kann.
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