WO1993022419A1

WO1993022419A1 - Un biosensor enzimatico para la determinacion de glicerol en medios liquidos

Info

Publication number: WO1993022419A1
Application number: PCT/ES1993/000030
Authority: WO
Inventors: José María FERRERO CORRAL; Angel Montoya Baides
Original assignee: Tabacalera, S.A.
Priority date: 1992-04-23
Filing date: 1993-04-22
Publication date: 1993-11-11
Also published as: AU4041593A; ES2042411B1; ES2042411A1; EP0596081A1

Abstract

Este biosensor es aplicable, preferentemente, para determinar cuantitativamente la presencia de glicerol en un medio líquido, como por ejemplo en la adición de las denominadas ''salsas'' al tabaco durante la elaboración del mismo. Este producto, ''la salsa'', contiene entre sus componentes, humectantes tal y como glicerol y propilenglicol, por lo cual es muy importante contar con medios para controlar su concentración, incluso en el producto final. El biosensor cuenta con una cápsula en la que se mantienen enzimas activas y la cápsula está dotada de un agitador, estando controlada la temperatura de dicha cápsula. La muestra a analizar, se introduce en la cápsula, en una cantidad calibrada. Existe un amplificador asociado a un electrodo y todo ello conectado a un sistema de tratamiento de datos.

Description

ÜN BIOSENSOR ENZIMATICO PARA LA DETERMINACIÓN DE GLICEROL EN MEDIOS LÍQUIDOS

D E S C R I P C I Ó N

5

OBJETO DE LA INVENCIÓN

El invento se refiere a un biosensor enzimático para la determinación de glicerol en un medio líquido, y

10 en particular a un biosensor basado en la transformación enzimática del glicerol mediante la acción secuencial de la glicero inasa, que cataliza una primera reacción en virtud de la cual un primer substrato, constituido por el glicerol, es transformado en glicerol-3-fosfato, y la

15 glicerol-3-fosfato oxidasa que cataliza una segunda reacción según la cual un segundo substrato, constituido por el glicerol-3-fosfato, es transformado en fosfato de dihidroxiacetona con consumo de oxígeno del medio, caracterizado porque dicho consumo es cuantificado

20 mediante un electrodo amperométrico que genera una señal de intensidad, indicativa de la concentración de oxígeno en el medio, que está conectado a la entrada de un amplificador electrónico de transrresistencia que aplica al electrodo una tensión adecuada de acuerdo con la

25 segunda reacción enzimática y convierte dicha señal de intensidad en una señal de tensión sustancialmente proporcional a dicho consumo de oxígeno, estando conecta¬ da la salida de dicho amplificador de transrresistencia a un convertidor de analógico a digital que suministra

30 señales codificadas a un sistema de tratamiento de datos que opera con dichas señales, utilizando un programa específicamente desarrollado que gestiona la adquisición

*•->> de datos de dicho convertidor y calcula, a partir de ellos, la concentración de glicerol en el medio líquido

35 de reacción por interpolación en una familia de curvas adquiridas mediante ensayos previos sobre muestras calibradas; estando caracterizado adicionalmente dicho biosensor porque se establece un nivel inicial de oxígeno en dicho medio líquido por agitación del mismo a tempera- tura constante controlada por un sistema termostático.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La determinación cuantitativa de la presencia de glicerol en medios líquidos es esencial en ciertos procesos industriales en los que se añade esta substancia a determinados artículos de consumo. Un caso típico es la adición de las denominadas "salsas" al tabaco durante su elaboración, que contienen, entre otros componentes, humectantes tales como el glicerol y el propilenglicol, siendo especialmente importante controlar su concentra¬ ción no solamente en dichas salsas, sino también en el producto final. Actualmente, dicha determinación se efectúa por procedimientos analíticos convencionales, entre los cuales destaca por su sensibilidad, especifici¬ dad y precisión de cromatografía de gases. Estos procedi¬ mientos utilizan frecuentemente equipos costosos operados por personal altamente cualificado, siendo necesario el envío de las muestras a un laboratorio donde son prepara- das y analizadas, con la consiguiente pérdida de tiempo, toda vez que no es rentable ni adecuada la instalación de dichos equipos en las líneas de producción.

El presente invento resuelve este problema utilizando un biosensor, entendiéndose como tal un dispositivo que integra al menos tres componentes funda¬ mentales : una molécula bioactiva. capaz de reconocer y reaccionar específicamente con la substancia que se pretende analizar (analito) , un transductor fisico- químico íntimamente asociado a la molécula bioactiva. capaz de generar una señal cuando se produce la interac¬ ción específica con el analito, y un dispositivo electró¬ nico que amplifica, acondiciona y trata la señal generada proporcionando información sobre la concentración del analito en el medio de reacción.

Ya en 1962 Clark y Lyon describieron un sensor enzimático para la determinación de urea utilizando la enzima ureasa. El 1965, Kadish y Hall pusieron a punto un sistema para medir glucosa utilizando glucosa oxidasa en una disolución en la que se hallaba sumergido un electro¬ do de oxígeno. El 1967, Updike y Hicks desarrollaron un sistema que introducía la importante novedad de utilizar la glucosa oxidasa inmovilizada en un gel de poliacrila- mida en contacto íntimo con el electrodo.

Posteriormente, aunque continuaron los trabajos de investigación en esta línea, no se aportaron novedades importantes ni desde el punto de vista conceptual ni en cuanto a posibilidades reales de aplicación. Sin embargo, a principios de la década de los 80 se produjo un enorme interés hacia los biosensores, potenciado indudablemente por el espectacular desarrollo de la electrónica y la informática. Ello ha permitido planterar como posibilidad real e inmediata la integración de los substratos bioló¬ gicos en microcircuitos para construir sensores bioelec- trónicos.

Las nuevas tecnologías de transductores (fibra óptica, cristales de onda acústica de superficie, tran¬ sistores de efecto de campo selectivos, etc.), el desa¬ rrollo de nuevos métodos de medida y la generalización del uso de sistemas biológicos novedosos (anticuerpos, bacterias, orgánulos celulares, liposomas, etc.), han propiciado una gran expansión de las áreas de investiga- ción relacionadas con los biosensores.

Atendiendo al tipo de molécula bioactivas utilizadas, los biosensores pueden ser enzimáticos o inmunológicos, perteneciendo al primer tipo el biosensor objeto del presente invento.

Las reacciones enzimáticas son relativamente sencillas de detectar y, en las condiciones adecuadas, son capaces de generar señales fiables en tiempos cortos.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

El biosensor objeto del presente invento utiliza como moléculas bioactivas dos enzimas, como se ha comentado en el párrafo de introducción, que catalizan específicamente dos reacciones consecutivas, la última de las cuales consume oxígeno del medio de reacción.

Dichas reacciones pueden esquematizarse del modo siguiente :

GLICEROKINASA GLICEROL -1- ATP G-3-P + ADP

G-3-P-0 G-3-P + 0₂ DHAP + H₂0₂

donde

ATP : Adenosin-trifosfato

G-3-P : Glicero1-3-fosfato

G-3-P-0 : Glicero1-3-fosfato-oxidasa

DHAP : Dihidroxiacetona fosfato. Dado que la concentración inicial de oxígeno en el medio líquido de reacción en reposo es usual ente muy baja, dicho medio se somete a agitación mediante un dispositivo mecánico, preferiblemente de tipo magnético, con objeto de aumentar dicha concentración por disolución del oxígeno atmosférico. Adicionalmente, puesto que la cinética de las reacciones y las actividades de las enzimas dependen de la temperatura y del pH, el proceso de medida se realiza en condiciones termostáticas y con pH estabilizado mediante un tampón adecuado. En el caso del presente invento, el Ph de trabajo se ha fijado en 9, valor comprendido entre los valores de pH para los cuales las enzimas presentan su máxima actividad (8,5 para la G- 3-P-O y 10 para la glicerokinasa) , habiéndose comprobado que en estas condiciones las medidas son satisfactorias.

El transductor utilizado es un electrodo sensible a la presión parcial de oxígeno y la señal generada es una intensidad de corriente que pasa a través del electrodo cuando se aplica al mismo un potencial constante y adecuado a la reacción de oxidación-reducción que tiene lugar. En cuanto al dispositivo electrónico, es un circuito amplificador de transrresistencia que cumple simultáneamente dos funciones : generar dicho potencial de polarización, y medir la intensidad por conversión en una tensión eléctrica proporcional. Se caracteriza porque se utiliza un primer amplificador operacional integrado de altas prestaciones que tiene una entrada inversora, una entrada no inversora y una salida, aplicándose a dicha entrada no inversora una tensión negativa constante obtenida mediante un divisor de tensión resistivo conec¬ tado entre los extremos de un diodo zener de referencia, estando conectado el terminal activo del electrodo a un punto que está conectado, a su vez, a dicha entrada inversora a través de una primera resistencia, al ánodo del diodo zener a través de una segunda resistencia y dicha salida a través de un circuito formado por una tercera resistencia y un condensador en paralelo, con lo cual el terminal activo del electrodo está sometido a una tensión negativa sustancialmente constante de aproximada¬ mente -0,65 V y la corriente que pasa a través del mismo se deriva en su totalidad a través de dicha tercera resistencia, apareciendo en dicha salida de dicho primer amplificador operacional una tensión que tiene una primera componente continua dependiente de la tensión de avalancha del diodo zener y de los valores de las resis¬ tencias del circuito y una segunda componente variable que es igual al producto de la intensidad de corriente en el electrodo por dicha tercera resistencia, y en donde la combinación de dicha tercera resistencia y dicho conden¬ sador en paralelo constituye un filtro de paso bajo que tiene una frecuencia de corte de aproximadamente 2 Hz. El circuito incluye adicionalmente un segundo amplificador operacional integrado, montado en configuración de sumador inversor, que tiene su entrada no inversora conectada a masa y su entrada inversora conectada a una tensión constante regulable a través de una primera resistencia de ponderación fija, a la salida del primer amplificador operacional a través de una segunda resis- tencia de ponderación variable, y a su propia salida a través de una resistencia de realimentación, con lo cual pueden regularse independientemente el nivel de continua de la señal de salida de dicho segundo amplificador operacional y el factor de amplificación de la componente variable de la señal de salida de dicho primer amplifica¬ dor operacional.

Adicionalmente, la tensión de salida de dicho segundo amplificador operacional es codificada digital- mente en un convertidor de analógico a digital y los datos obtenidos son adquiridos por un sistema de trata¬ miento de datos que calcula la disminución de oxígeno y, por tanto, la concentración de glicerol en la muestra a analizar. El cálculo se realiza por interpolación sobre una superficie formada por un haz de curvas almacenado en el sistema de tratamiento de datos a partir de ensayos sobre muestras calibradas.

Los autores han desarrollado varios prototipos del biosensor, con los cuales se han efectuado numerosas medidas de glicerol en salsas de tabaco, aromas y extrac¬ tos de tabaco. Con objeto de validar el método, los resultados se han comparado sistemáticamente con los obtenidos por cromatografía de gases. La precisión media de los valores de concentración proporcionados por el biosensor se sitúa en torno al 5 % y la correlación con los valores cromatográficos de referencia es superior a 0.99, con tiempos de ensayo del orden de 2 minutos.

DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Se describirá ahora el invento con referencia a los dibujos que se acompañan, en los cuales :

La figura 1.- Es un esquema que muestra el sistema de medida utilizado de acuerdo con una realiza¬ ción preferida del biosensor objeto del presente invento.

La figura 2.- Ilustra un esquema de circuito del amplificador de transrresistencia utilizado en dicha realización preferida.

La figura 3.- Muestra, a escala 1:1, el aspecto físico de un prototipo de amplificador de transrresisten- cia desarrollado de acuerdo con la realización preferida del invento .

La figura 4.- Muestra un conjunto de curvas registradas para diversas concentraciones de glicerol mediante el biosensor de acuerdo con el invento.

REALIZACIÓN PREFERENTE DE LA INVENCIÓN

Con referencia a la figura 1 de los dibujos, se muestra en forma esquemática el sistema de medida utili¬ zado de acuerdo con una realización preferida del inven¬ to, a modo de ejemplo no limitativo. Una cápsula (2) de reacción, que puede consistir en un tubo de ensayo, contiene un tampón adecuado para mantener la actividad de las enzimas utilizadas en un nivel óptimo, lo cual ocurre, de acuerdo con los experimentos realizados por los autores del invento, para un pH de 9. Dicha cápsula (2) de reacción está asociada a un dispositivo (3) de agitación, preferiblemente de tipo magnético sumergible, con objeto de establecer una concentración inicial de oxígeno en el medio líquido de reacción contenido en dicha cápsula por disolución del oxígeno atmosférico. La temperatura de la cápsula (2) de reacción está controlada y estabilizada por un dispositivo (1) , que puede consis- tir en un baño termostático. Las enzimas que intervienen en las reacciones pueden añadirse a la cápsula de reac¬ ción previamente a la determinación de glicerol, pero preferiblemente estarán inmovilizadas en las proximidades del electrodo (4) de media que, en el presente caso, consiste en un electrodo de oxígeno. La muestra a anali¬ zar se introduce en la cápsula (2) de reacción mediante un dispositivo dosificador (8) , que puede consistir en un inyector automático, una pipeta calibrada, o cualquier otro medio que permita liberar en forma manual o auto á- tica cantidades calibradas de muestra sobre la cápsula (2) de reacción. Una característica específica del dispositivo dosificador (8) es que debe disponer de medios que permitan generar una señal indicativa del momento de inyección de la muestra con objeto de iniciar el proceso de medida.

El electrodo (4) de oxígeno está conectado a la entrada de un amplificador (5) de transrresistencia que está conectado, a su vez, a través de un cable (10) de conductores múltiples, a un sistema (6) de adquisición y tratamiento de datos que incluye al menos un convertidor de analógico a digital y un microprocesador o microcon- trolador capaz de gestionar la adquisición de datos, efectuar los cálculos precisos para la determinación de la concentración de glicerol de la muestra por interpola¬ ción sobre una superficie definida por curvas obtenidas a partir de muestras calibradas, y gestiona; la presenta¬ ción de resultados e información auxiliar a través de un dispositivo (7) de visualización. Obviamente, los bloques (6) y (7) pueden estar unificados en un ordenador provis¬ to de una tarjeta de adquisición de datos. La línea (9) conectada entre el dispositivo dosificador (8) y el sistema (6) de adquisición y tratamiento de datos trans¬ mite una señal indicativa del momento de inyección de la muestra para desencadenar el proceso de adquisición y medida, como se ha comentado anteriormente.

En la figura 2 se muestra un esquema del amplificador (10) de transrresistencia utilizado de acuerdo con el invento, cuyos componentes y conexiones se han descrito anteriormente. Según dicho esquema, la tensión aplicable al terminal no inversor del primer amplificador operacional AOP1 viene dada por la expre¬ sión: RB

U₊ = V, ( 1)

RA + RB

dado que la tensión del punto M con respecto a masa es la correspondiente al diodo zener DI polarizado en sentido inverso por la tensión -Vcc de alimentación a través de la resistencia R0, formando las resistencias RA y RB un divisor de tensión de coeficiente RB/(RA + RB) . En la ecuación (1) , V_z es la tensión de avalancha del diodo zener (preferiblemente un diodo zener de referencia con bajo coeficiente de temperatura) .

u. + v_ u, - u„ ^x = (2)

R2 R3

donde u_s es la tensión de salida del amplificador opera¬ cional AOP1, como se muestra en la figura.

La sustitución en la ecuación anterior de la expresión (1) , da lugar a la siguiente ecuación para la tensión u_s :

RAR3 - R2RB u_s __ _Vz - R3i_e (₃)

R2 (RA + RB)

que muestra que dicha tensión de salida tiene dos co po- nentes, a saber : una componente de tensión continua que depende de la tensión de avalancha del diodo zener DI y de los valores de las resistencias que aparecen en el primer término del segundo miembro, y una componente de tensión variable igual al producto de la corriente del electrodo por la resistencia R3 de realimentación. - Íl ¬

eon objeto de rechazar señales de alta frecuen¬ cia indeseadas, se ha incorporado el condensador C en paralelo con la resistencia R3, con lo cual la función de trasferencia del circuito corresponde a un filtro de paso bajo de frecuencia de corte igual a l/2πR3 C que, con los componentes seleccionados, es aproximadamente de 2 Hz.

La salida del primer amplificador operacional A0P1 está conectada a la entrada inversora de un segundo amplificador operacional A0P2 a través de una resistencia ajustable R6. Se aplica también a dicha entrada inversora una tensión regulable entre un valor positivo y un valor negativo simétricos, a través de una resistencia R7. La entrada inversora de dicho segundo amplificador operacio- nal AOP2 está conectada a masa y su salida está conecta¬ da, a través de una resistencia R8, a la entrada inverso¬ ra. La configuración descrita corresponde a un círculo sumador inversor cuya función de transferencia es :

donde u_Q es la tensión de salida del amplificador opera¬ cional AOP2 y Upr es la tensión continua regulable proporcionada por la combinación de las resistencias R4, R5, los diodos zener D2 y D3 y el potenciómetro Rp, apareciendo dicha tensión continua en el cursor de dicho potenciómetro.

Esta configuración permite ajustar independien¬ temente el nivel de tensión continua de la señal u₀ de salida del circuito descrito y el factor de amplificación R8/R6 que se aplica a la componente variable, con objeto

HOJA SUSTI de adecuar la señal a las exigencias del convertidor de analógico a digital a cuya entrada está conectada la salida del amplificador de transrresistencia.

La figura 3 ilustra, a escala natural, el aspecto físico de un prototipo de amplificador de trans¬ rresistencia desarrollado por los autores del invento. Los componentes electrónicos están dispuestos sobre una tarjeta de circuito impreso contenida en una pequeña caja metálica, pudiendo observarse los ajustes de ^"nivel de continua y de amplificación o ganancia. El electrodo se conecta al amplificador a través de un conector coaxial, como se indica en la parte izquierda de la figura. Las tensiones de alimentación y la salida del amplificador corresponden a los terminales de un conector múltiple que puede verse en la parte derecha de la figura y que se conecta al sistema de adquisición y tratamiento de datos (línea múltiple 10 de la figura 1) .

En la figura 4 se reproducen varias curvas correspondientes a la señal de salida del amplificador de transrresistencia en función del tiempo para varias concentraciones de glicerol, presentadas por el sistema de adquisición y tratamiento de datos que, para el prototipo desarrollado, consistió en un ordenador provis¬ to de una tarjeta de adquisición de datos normalizada. Los programas desarrollados específicamente por los autores permiten almacenar múltiples curvas de este tipo obtenidas mediante ensayos con muestras calibradas e interpolar muestras incógnita mediante un algoritmo de interpolación tridimensional en la superficie definida por la familia de curvas normalizada (se trata efectiva¬ mente de una superficie, toda vez que la función de concentración de oxígeno en el medio de reacción depende de dos variables independientes, a saber : el tiempo y la concentración de glicerol) . Como ya se ha mencionado anteriormente, el proceso de adquisición y cálculo se inicia al recibir el sistema de tratamiento de datos una señal procedente del dispositivo dosificador (8) de inyección de muestra.

Aun cuando el invento se ha expuesto con referencia a una realización particular de aplicación a la determinación de glicerol en salsas de tabaco, aromas y extractos, se entenderá que es aplicable a la determi¬ nación de glicerol en cualquier medio líquido. En cuanto a los componentes y circuitos descritos, podrían modifi¬ carse o sustituirse por otros que realizasen la misma función sin que esto afectase al contenido y ámbito de aplicación del invento, como se define en las reivindica¬ ciones anexas.

Claims

R E I V I N D I C A C I O N E S

le.- Un biosensor enzimático para la determina¬ ción de glicerol en medios líquidos, y en particular un biosensor basado en la transformación enzimática del glicerol mediante la acción secuencial de la glicerokina- sa, que cataliza una primera reacción en virtud de la cual un primer substrato, constituido por el glicerol, es transformado en glicerol-3-fostafo, y la glicerol-3- fosfato oxidasa que cataliza una segunda reacción según la cual un segundo substrato, constituido por el glice- rol-3-fosfato, es transformado en fosfato de dihidroxia- cetona con consumo de óxido del medio, caracterizado porque dicho consumo en cuantificado mediante un electro- do amperométrico que genera una señal de intensidad indicativa de la concentración de oxígeno en el medio, y que está concectado a la entrada de un amplificador electrónico de transrresistencia que aplica al electrodo una tensión adecuada de acuerdo con la segunda reacción enzimática y convierte dicha señal de intensidad en una señal de tensión sustancialmente proporcional a dicho consumo de oxígeno, estando conectada la salida de dicho amplificador de transrresistencia a un convertidor de analógico a digital que suministra señales codificadas a un sistema de tratamiento de datos que opera con dichas señales- utilizando un programa específicamente desarro¬ llado que gestiona la adquisición de datos de dicho convertidor y calcula, a partir de ellos, la concentra¬ ción de glicerol en el medio líquido de reacción por interpolación en una familia de curvas adquiridas median¬ te ensayos previos sobre muestras calibradas.

2a.- Un biosensor enzimático para la determina¬ ción de glicerol en medios líquidos, según la reivindica- ción 1&, caracterizado porque se establece un nivel inicial de oxígeno en dicho medio líquido por agitación del mismo a temperatura constante controlada por un sistema termostático y porque las reacciones enzimáticas tienen lugar en un medio tamponado a un pH aproximadamen- te 9.

3β.- Un biosensor enzimático para la determina¬ ción de glicerol en medios líquidos de acuerdo con la reivindicación la, caracterizado adicionalmente porque, como amplificador de transrresistencia, se utiliza un circuito que incluye un primer amplificador operacional integrado de altas prestaciones que tiene una entrada inversora, una entrada no inversora y una salida, apli¬ cándose a dicha entrada no inversora una tensión negativa constante obtenida medíate un divisor de tensión resisti¬ vo conectado entre los extremos de un diodo zener de referencia, estando conectado el terminal activo del electrodo a un punto que está conectado, a su vez, a dicha entrada inversora a través de una primera resisten- cia, al ánodo del diodo zener a través de una segunda resistencia y dicha salida a través de un circuito formado por una tercera resistencia y un condensador en paralelo, con lo cual el terminal activo del electrodo está sometido a una tensión negativa sustancialmente constante de aproximadamente -0,65 V y la corriente que pasa a través del mismo se deriva en su totalidad a través de dicha tercera resistencia, apareciendo en dicha salida de dicho primer amplificador operacional una tensión que tiene una primera componente continua depen- diente de la tensión de avalancha del diodo zener y de los valores de las resistencias del circuito y una segunda componente variable que es igual al producto de la intensidad de corriente en el electrodo por dicha tercera resistencia, y en donde la combinación de dicha tercera resistencia y dicho condensador en paralelo constituye un filtro de paso bajo que tiene una frecuen¬ cia de corte de aproximadamente 2 Hz.

4a.- Un biosensor enzimático para la determina- ción de glicerol en medios líquidos de acuerdo con la reivindicación 2a, en el cual el circuito incluye adicio¬ nalmente un segundo amplificador operacional integrado, montado en configuración de sumador inversor que tiene su entrada no inversora conectada a masa y su entrada inversora conectada a una tensión constante regulable a través de una primera resistencia de ponderación fija, a la salida del primer amplificador operacional a través de una segunda resistencia de ponderación variable, y a su propia salida a través de una resistencia de realimenta- ción, con lo cual pueden regularse independientemente el nivel de continua de la señal de salida de dicho segundo amplificador operacional y el factor de amplificación de la componente variable de la señal de salida de dicho primer amplificador operacional.

5a.- un biosensor enzimático para la determina¬ ción de glicerol en medios líquidos de acuerdo con la reivindicación 1», en el cual dicho sistema de tratamien¬ to de datos es un microprocesador.

6a.- un biosensor enzimático para la determina¬ ción de glicerol en medios líquidos de acuerdo con la reivindicación ia, en el cual dicho sistema de tratamien¬ to de datos es un microprocesador.

7a.- un biosensor enzimático para la determina¬ ción de glicerol en medios líquidos de acuerdo con la reivindicación ia, en el cual dicho sistema de tratamien¬ to de datos es un ordenador. 8a.- Un biosensor enzimático para la determina¬ ción de glicerol en medios líquidos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el medio líquido es una salsa, aroma o extracto de tabaco.