WO1993012132A1 - PHOSPHOTRIESTERS DE LA ddU, LEUR PREPARATION ET LEUR APPLICATION EN THERAPEUTIQUE - Google Patents

PHOSPHOTRIESTERS DE LA ddU, LEUR PREPARATION ET LEUR APPLICATION EN THERAPEUTIQUE Download PDF

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WO1993012132A1
WO1993012132A1 PCT/FR1992/001174 FR9201174W WO9312132A1 WO 1993012132 A1 WO1993012132 A1 WO 1993012132A1 FR 9201174 W FR9201174 W FR 9201174W WO 9312132 A1 WO9312132 A1 WO 9312132A1
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ddu
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dmso
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PCT/FR1992/001174
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Inventor
Jean-Louis Imbach
Gilles Gosselin
Original Assignee
Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs)
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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical

Definitions

  • the present invention relates to phosphotriesters of ddU, their preparation and their therapeutic application.
  • DdU is 2 ', 3'-dideoxy-uridine, the formula of which is given in Annex 1.
  • R ' 1 is 5'-ddU, 3'-dT or 5'-dT,
  • R ' 2 is a cation, the methyl radical, the radical -CH 2 O-CO- C (CH 3 ) 3 , -CH 2 CH 2 OCH 3 , -CH 2 CH 2 CN, -CH 2 CH 2 S-CO -C (CH 3 ) 3 ,
  • the thin layer chromatographies were carried out on Merck 60F 254 silica plates (art.5554).
  • the silica gel column chromatographies were carried out with Merck 60 H silica (art. 7736) or with Merck RP2 silanized silica (art. 7719).
  • the HPLC analyzes were carried out on a Waters Radial-Pak column (diam .: 8 mm, 1: 100 mm) C 18 with a spherical particle size of 10 ⁇ m. This column is protected by a Guard-Pak guard column.
  • the HPLC system is composed of a U 6 K injector, two M-6000 A pumps, an M-720 programmer
  • the HPLC purifications were carried out on a SFCC Nucleosil column (diam .: 19 mm, 1: 150 mm) with a spherical particle size of 10 ⁇ m.
  • the HPLC system is composed of a U 6 K injector, two M-510 EF pumps, an M-720 programmer, a UV detector M-481 and a Data Module 746 recorder (Waters).
  • the elution is carried out with a solution of acetonitrile in water at a flow rate of 6.25 ml per minute.
  • UV spectra were recorded on a UVIKON 810 spectrophotometer.
  • the mass spectra were taken on a JEOL JMS DX 300 device by the FAB ionization method in a glycerol (G), glycerol / thioglycerol (GT) or alcohol matrix.
  • G glycerol
  • GT glycerol / thioglycerol
  • the proton NMR spectra were recorded on a Varian EM 360 device or on a Br ⁇ ker AC 250 device.
  • the chemical shifts are expressed in ppm relative to the tetramethylsilane (TMS) signal.
  • the multiplicity and the shape of the signals observed by NMR are indicated by one (or more) letter (s): s (singlet), d (doublet), t (triplet), m (multiplet), 1 (large).
  • the phosphorus NMR spectra were recorded on a Br ⁇ ker WP 200 SY device with decoupling of the proton.
  • the chemical shifts are expressed in ppm relative to the H 3 PO 4 signal taken as an external reference.
  • the released acid is neutralized by adding a solution of triethylammonium bicarbonate and the product is extracted with dichloromethane.
  • the organic phase is concentrated under reduced pressure and chromatographed on a column of silica gel (eluent: MeOH (0-4%) in CH 2 Cl 2 ) to give
  • nucleotide 9 in the form of triethylammonium after evaporation in the presence of triethylamine.
  • the solvent is partially evaporated before the reaction medium is diluted with dichloromethane and extracted with an aqueous solution of triethylammonium bicarbonate.
  • the aqueous phase is evaporated and the residue obtained is chromatographed on a column of silica gel (eluent, MeOH (0-40%) in CH 2 Cl 2 ).
  • the appropriate fractions are evaporated, taken up with methanol and filtered through a Millipore filter.
  • a last evaporation of the solvent in the presence of triethylamine gives 3.3 g (77%) of dinucleoside 10.
  • An analytical sample is obtained after purification by semi-preparative HPLC (nucleosil column C 18 , eluent 2% CH 3 CN in H 2 O), filtration on Millipore filter and lyophilization in water.
  • This compound was obtained by following a procedure analogous to that described for the synthesis of 13.
  • O O'-bis (2 ', 3'-dideoxyuridin-5'-yl) O- (S- (O- (4-methoxytrityl) 2-oxyethylsulfidyl) 2-thioethyl) phosphate 19. Diester 10 (175 mg, 0.298 mmol.) And 636 mg (1.49 mmol.) Of mono-O- (4-methoxytrityl) dithiodiethanol in 10 ml of pyridine are treated with 221 mg (0.746 mmol.) Of 1- (2-mesitylesulfonyl) 3-nitro 1,2,4 triazole.
  • reaction medium is diluted with CH 2 Cl 2 and washed with an aqueous solution of NaHCO 3 then with water.
  • organic phase is dried over Na 2 SO 4 and concentrated under reduced pressure.
  • the crude obtained is chromatographed on a column of silica gel
  • Protected compound 11 (200 mg; 0.254 mmol.) Is treated with 30 ml / mmol. a mixture of acetic acid, water (8: 2) for 3 h. The solvent is evaporated. After coevaporation with water, the crude product obtained is dissolved in water, washed with CH 2 Cl 2 and concentrated under reduced pressure. The purification is carried out by semi-preparative chromatography on a thin layer of silica (eluent isopropanol, ammonia, water (8: 1: 1). The product is extracted from the silica with MeOH and the solution filtered on a Millipore filter. Lyophilization in water gives 47 mg (35%) of 23.
  • the phosphodiester 10 dimer is put into sodium form by exchange on a DOWEX W50 Na + column and is then lyophilized.
  • a suspension of 200 mg (394 ⁇ mol.) Of the pulverulent product obtained in 10 ml of acetonitrile is reacted with 940 mg (3.88 mmol.) Of pivaloyloxymethyl iodide at reflux. After 15 ', the reflux is stopped and the reaction medium is diluted with a solution of triethylammonium bicarbonate.
  • the diester 11 is put into sodium form by passage through a DOWEX W50 Na + column and is lyophilized in water.
  • the pulverulent product obtained (308 mg, 0.380 mmol.) Is suspended in 10 ml of acetonitrile and is treated with 946 mg (0.888 mmol.) Of pivaloyloxymethyl iodide. After 2 h, the reaction is complete (partial detritylation of the product of arrival). MeOH (1 ml) is added and after 15 '(total detityl tion) the solvent is evaporated.
  • the compounds of the invention have been subjected to pharmacological tests showing their advantage in the treatment of viral diseases. - Evaluation of anti-HIV 1 activity on CEM cells
  • HIV human immunodeficiency virus
  • EMF human T lymphoblastoid cell.
  • HIV-1 HIV-1 (LAI isolate) in CEM cells is measured by an assay for reverse transcriptase (RTase) in the culture supernatant after 5 days of infection.
  • RTase reverse transcriptase
  • This activity reflects the presence of virus released by the cells. After adsorption of the virus, the test compounds are added at different concentrations to the culture medium.
  • the antiviral activity is expressed by the lowest concentration of compound which decreases the production of RTase by at least 50% (ED50).
  • the compounds of the invention have an ED50 ranging from 10 -6 M to 10 -4 M for a CD50 of 10 -5 M to 10 -4 M.

Abstract

Dérivés de la ddU répondant à la formule (I) dans laquelle R'1 est la 5'-ddU, la 3'-dT ou la 5'-dT, R'2 est un cation, le radical méthyle, le radical -CH2O-CO-C(CH3)3, -CH2CH2OCH3, -CH2CH2CN, -CH2CH2S-CO-C(CH3)3, (a), (b), les formules des motifs -O-ddU -O-3'-dT et -O-5'-dT étant les suivantes respectivement: (c), (d), (e). Application en thérapeutique.

Description

PHOSPHOTRIESTERS DE LA ddU, LEUR PREPARATION
ET LEUR APPLICATION EN THERAPEUTIQUE
La présente invention a pour objet des phosphotriesters de la ddU, leur préparation et leur application en thérapeutique. La ddU est la 2',3'-didésoxy-uridine dont la formule est donnée en annexe 1.
Les composés de l'invention répondent à la formule (I) donnée en annexe 1 dans laquelle
R'1 est la 5'-ddU, la 3'-dT ou la 5'-dT,
R'2 est un cation, le radical méthyle, le radical -CH2O-CO- C(CH3)3, -CH2CH2OCH3, -CH2CH2CN, -CH2CH2S-CO-C(CH3)3,
COOEt
-CH2CH2S-SCH2CH2OH,-CH2CH9-NH-CO-
Figure imgf000003_0001
La 2'-désoxythymidine (dT) se lie par la liaison 3'ou 5' : les formules sont données en annexe 1.
La préparation des composés est indiquée ci-après et dans l'annexe 2.
Les chromatographies sur couche mince ont été réalisées sur plaques de silice Merck 60F 254 (art.5554). Les chromatographies sur colonne de gel de silice ont été effectuées avec de la silice Merck 60 H (art. 7736) ou avec de la silice silanisée RP2 Merck (art. 7719).
Les analyses CLPH ont été effectuées sur colonne Waters Radial-Pak (diam. : 8 mm, 1 : 100 mm) C18 de granulométrie sphérique de 10 μm. Cette colonne est protégée par une précolonne Guard-Pak. Le système CLHP est composé d'un injecteur U6K, de deux pompes M-6000 A, d'un programmateur M-720
(Waters), d'un détecteur UV multicanal Pye Unicam PU 4021 et d'un centre de contrôle vidéo PU 4850 (Philipps). L'elution a été réalisée avec une solution d'acétonitrile dans un tampon d'acétate d'ammonium 0,1 M (pH 5,9) à un débit de 2 ml par minute (TR : temps de rétention).
Les purifications CLHP ont été effectuées sur colonne SFCC Nucléosil (diam.: 19 mm, 1 : 150 mm) de granulométrie sphérique de 10 μm. Le système CLHP est composé d'un injecteur U6K, de deux pompes M-510 EF, d'un programmateur M-720, d'un détecteur UV M-481 et d'un enregistreur Data Module 746 (Waters). L'elution est réalisée avec une solution d'acétonitrile dans l'eau à un débit de 6,25 ml par minute.
Avant analyse, purification CLHP ou lyophilisation, les solutions ont été filtrées sur filtre Millex HV-4
(Millipore).
Les spectres UV ont été enregistrés sur un spectrophotomètre UVIKON 810.
Les spectres de masse ont été pris sur un appareil JEOL JMS DX 300 par la méthode d'ionisation FAB dans une matrice de glycérol (G), glycérol/thioglycérol (GT) ou d'alcool
3-nitrobenzylique (NBA).
Les spectres RMN du proton ont été enregistrés sur un appareil Varian EM 360 ou sur appareil Brϋker AC 250.
Les déplacements chimiques sont exprimés en ppm par rapport au signal du tétraméthylsilane (TMS).
La multiplicité et l'allure des signaux observés par RMN sont indiquées par une (ou plusieurs) lettre(s) : s (singulet), d (doublet), t (triplet), m (multiplet), 1 (large).
Les spectres RMN du phosphore ont été enregistrés sur un appareil Brϋker WP 200 SY avec découplage du proton.
Les déplacements chimiques sont exprimés en ppm par rapport au signal de H3PO4 pris comme référence externe.
5'-O-Diméthylthexylsilyl 2'-didésoxythymidine 2.
La 2'-désoxythymidine 1 (1,09 g, 4,50 mmol.) en solution dans 32 ml de pyridine est mise en réaction avec 1,10 ml (5,50 mmol.) de chlorure de diméthylthexylsilyle durant 48 h.
L'acide libéré est neutralisé par addition d'une solution de bicarbonate de triéthylammonium et le produit est extrait avec du dichlorométhane. La phase organique est concentrée sous pression réduite et chromatographiée sur colonne de gel de silice (éluant : MeOH (0-4%) dans CH2Cl2) pour donner
1,39 g (80%) de 2.
2 UV (EtOH) : λ max 266 nm (ε 10600)
λ min 233 nm (ε 1700)
SM (FAB positif, GT) : 385 (2M+H)+, 127 (TH2)+, RMN1H (DMSO-d6) : 6 = 0,11 (s, 6H, (CH3)2Si) ; 0,82-0,87 (m, 12H, H(CH3)2C(CH3)2Si) ; 1,59 (quintuplet, 1H,
H(CH3)2)C(CH3)2Si, J = 6,8 Hz) ; 1,78 (s, 3H, CH3) ; 2,06 (m, 2H, H-2', 2") ; 3,73 (m, 2H, H-5',5") ; 3,79 (m, 1H, H-4') ; 4,18 (m, 1H, H3') ; 5,28 (d, 1H, OH, J = 3,3 Hz) ; 6,15 (t, 1H, H-1', J = 6,9 Hz) ; 7,43 (s, 1H, H-6) ; 7,73 (si, 1H, NHCO) ppm.
3'-O-(4-Méthoxytrityl) 5'-O-diméthylthexysilyl 2'-désoxy- thymidine 3.
A une solution de 1,33 g (3,45 mmol.) de 2 dans 11 ml de pyridine sont ajoutés 2,14 g (6,93 mmol.) de chlorure de 4-méthoxytrityle. Après 40 heures, le mélange reactionnel es dilué avec du CH2Cl2 et lavé avec une solution aqueuse de
NaHCO3 puis avec de l'eau. La phase organique est séchée sur Na2SO4, concentrée et purifiée par chromatographie sur colonn de gel de silice (éluant : MeOH (0-5%) dans CH2Cl2) pour conduire à 2,19 g (96%) de 3 suffisamment pur pour la suite de la synthèse.
3 UV (EtOH) : λ max 266 nm (ε 13700)
λ min 249 nm (ε 10400)
λ max 231 nm (ε 19300)
λ min 227 nm (ε 19000)
SM(FAB positif, NBA) : 657 (M+H)+, 273 (MTr)+
RMN1H (DMSO-d6) : 6 = -0,07 et -0,04 (s et s) ; 3H et 3H, 2CH3Si) ; 0,65-0,73 (m, 12H, H(CH3)2C(CH3)2CSi) ; 1,35-1,60 (m, 3H, H-2',2'', H(CH3)2C(CH3)2Si) ; 1,70 (s, 3H, CH3) ; ≈ 3,40 (H-5' partiellement masqué par l'eau) ; 3,55 (d, 1H, H-5'', J = 13,5 Hz) ; 3,73 (s, 3H, CH3OTr) ; 3,97 (s, 1H, H-4') ; 4,17 (d, 1H, H-3', J = 4 Hz) ; 6,14 (dd, 1H, H-1', J = 6,1 et 8,4 Hz) ; 6,89-7,45 (m, 15H, Tr, H-6), 11,3 (sl, NHCO) ppm.
3'-0-(4-Méthoxytrityl) 2 * -désoxythymidine 4
La désilylation de 2,06 g (3,14 mmol.) de 3 est réalisée à l'aide de 5,70 ml d'une solution 1,1 M de fluorure de tétra- butylammonium dans le THF en 6 h. Le solvant est évaporé et le brut obtenu purifié par chromatographie sur colonne de ge de silice (éluant : MeOH (0-8%) dans CH2Cl2) pour conduire à 1,47 g (91%) de 4. 4 UV (EtOH) : λ max 265 nm (ε 12100)
λ min 250 nm (ε 10500)
λ inflex 228 nm (ε 18500)
SM (FAB positif, NBA) : 515 (M+H)+, 273 (MTr)+
RMN1H (DMSO-d6) : δ = 1,50 (dd, 1H, H-2', J = 5,5 et 13,4 Hz) ; 1,62-1,79 (m, 1H, H-2") ; 1,70 (s, 3H, CH3) ; 3,15 (m, 1H, H5') ; 3,36 (m, 1H, H-5'') ; 3,74 (s, 3H,
CH3OTr) ; 3,76 (m, 1H, H-4') ; 4,25 (d, 1H, H-3', J = 5,3 Hz) ; 4,95 (t, 1H, OH, J = 5,0 Hz) ; 6,18 (dd, 1H, H-1', J = 5,4 et 9,3 Hz) ; 6,90-7,44 (m, 14H, Tr) ; 7,60 (s, 1H, H-6) ; 11,3 (sl, 1H, NHCO) ppm.
O-(2',3'-didésoxyuridin-5'-yl)-hydrogénophosphonate 5.
Une solution 2 M d'acide phosphoreux (70,5 ml, 141 mmol.) dans la pyridine anhydre est ajoutée à 3,00 g de 2',3'-didésoxyuridine 6 (14,1 mmol.) et est traité avec 9,6 ml de chlorure de pivaloyle (77,9 mmol.). Après 3 heures de réaction, une solution aqueuse 1 M de bicarbonate de triéthyl- ammonium est ajoutée jusqu'à neutralisation et le solvant est évaporé sous pression réduite. L'huile obtenue est chromato- graphiée sur colonne de gel de silice (éluent MeOH (0-35%) dans CH2Cl2) pour conduire a 5. Le produit est repris dans du methanol et est filtré sur filtre Millipore. L'é aporation du solvant donne 4,17 g (78%) de 5_ (forme triéthylammonium) suffisamment pur pour la suite de la synthèse. Un échantillon de plus grande pureté est obtenu après une purification supplémentaire par chromatographie sur.couche mince de gel de silice utilisant un mélange d'isopropanol, ammoniaque, eau (8:1:1:) comme éluant. Le produit sous forme ammonium est extrait de la silice avec du methanol, le solvant est chassé par évaporation et le résidu est repris à l'eau, filtré sur filtre Millipore et lyophilisé.
5 CLHP: TR = 172s (99,9%) (3% CH3CN/AcONH4 0,1 M). UV (H2O) : λ max 262 nm (ε 9940)
λ min 230 nm (ε 2080)
SM (FAB négatif, GT) : 275 (M)-
RMN1H (DMSO-d6) :δ = 1,78-2,05 (m, 3H, H-2',3',3'') ;
2,18-2,45 (m, 1H, H-2 ') ; 3,65-3,95 (m, 2H, H-5',5'') ; 4,11 (m, 1H, H-4') ; 5,55 (d, 1H, H-5, J = 8,1 Hz) ; 5,9 (dd, 1H, H-T, J = 6,8 et 3,8 Hz), 6,63 (d, 1H, HP, J = 592 Hz) ; 7,87 (d, 1H, H-6, J = 8,1 Hz) ppm
RMN31P (DMSO-d6) : 5 = 1,596 ppm
O-(5'-O-(4-Méthoxytrityl) 2'-désoxythymidin-3'yl) hydrogéno- phosphonate 7.
Une solution de 5,65 g (83,0 mmol.) d'imidazole dans 70 ml d'acetonitrile est traitée à 0°C par 2,22 ml (25,4 mmol.) de trichlorure de phosphore et 13,0 ml (92,2 mmol.) de triéthyl amine durant 30'. Ce mélange est additionné à 4,36 g (8,47 mmol.) de 5'-O-(4-méthoxytrityl) 2'-desoxythymidine 8 dans 70 ml d'acetonitrile. La phosphorylation est laissée 3 h et 2 ml d'eau sont ajoutés. La solution est concentrée sous pression réduite, reprise avec une solution aqueuse de bicarbonate de triéthylammonium et extraite avec du CH2Cl2. La phase organique est séchée sur Na2SO4 et évaporée. L'huile obtenue est purifiée sur colonne de gel de silice (éluant : MeOH (0-20%) dans CH2Cl2) pour donner 4,2 g (86%) du nucléotide 7 sous forme acide.
7 UV (EtOH 95) :λ max 265 nm (ε 12000)
λ min 249 nm (ε 9200)
λ inflex 229 nm (ε 19300)
SM (FAB négatif, GT) : 576 (M)-
RMN1H (DMSO-d6) : δ = 1,38 (s, 3H, CH3), 2,33 (m, 1H,.
H-2') ; 2,72 (m, 1H, H-2'') ; 3,16 (dd, 1H, H-5', J = 2, et 10,3 Hz) ; 3,27 (dd, 1H, H-5'', J = 3,8 et 10,2 Hz) ; 3,73 (s, 3H, CH3OTr) ; 4,07 (m, 1H, H-4') ; 4,76 (m, 1H,
H-3') ; 6,19 (t, 1H, H-1', J = 6,9 Hz) ; 6,60 (d, 1H, HP,
J = 590 Hz) ; 6,85-7,47 (m, 14H, Tr) ; 11,4 (si, 1H,
NHCO) ppm
RMN31P (DMSO-d6) : δ = -0,315 ppm. O-(3'-O-(4-Méthoxytrityl) 2'-désoxythymidin-5'-yl) hydrogenophosphonate 9.
Ce composé a été préparé selon le mode opératoire décrit lors de la synthèse de 7. Ainsi, 1,40 g (2,72 mmol.) de
3'-O-(4-méthoxytrityl) 2-désoxythymidine 4 conduit à 1,28 g (69%) du nucléotide 9 sous forme de triéthylammonium après évaporation en présence de triéthylamine. 9 UV (EtOH) : λ max 264 nm (ε 11700)
λ min 250 nm (ε 10700)
λ inflex 228 nm (ε 18300)
SM (FAB négatif, GT) : 576 (M)-, 125 (T)- RMN1H (DMSO-d6) : δ = 1,12 (t, 9H, (CH3CH2)3N, J = 7,3 Hz) ; 1,55 (dd, 1H, H-2', J = 5,2 et 13,1 Hz) ; 1,73 (s et m, 4H, CH3 et H-2'') ; 2,92 (q, 6H, (CH3CH2)3N, J = 7,2 Hz) ; 3,36 (m, 1H, H-5') ; 3,59 (m, 1H, H-5") ; 3,73 (s, 3H, CH3O) ; 3,81 (m, 1H, H-4') ; 4,20 (d, 1H, H-3', J = 4,7 Hz) ; 6,23 (dd, 1H, H-1 * , J = 5,4 et 8,7 Hz) ; 6,55 (d, 1H, HP, J = 643 Hz) ; 6,90-7,60 (m, 14H, Tr) ; 8,22 (s, 1H, H-6) ; 11,2 (sl, 1H, NHCO) ppm
RMN31P (OMSO-d6) :δ = -0,812 ppm.
O,O-bis(2',3'-didésoxyuridin-5'-yl) phosphate 10. (Composé 1 ) Une solution de 2,98 g d'hydrogenophosphonate 5 (7,90 mmol., forme triéthylammonium) et de 1,51 g (7,12 mmol.) 2',3'-didésoxyuridine 6 dans 55 ml de pyridine est traitée par 2,4 ml (19,5 mmol.) de chlorure de pivaloyle pendant 2 h. Le dinucleoside hydrogenophosphonate intermédiaire est alors oxydé à l'aide de 45 ml d'une solution d'iode 2 M dans le mélange pyridine, eau, tétrahydrofuranne (8:40:2). Le solvant est partiellement évaporé avant que le milieu reactionnel ne soit dilué avec du dichlorométhane et extrait avec une solution aqueuse de bicarbonate de triéthylammonium. La phase aqueuse est évaporée et le résidu obtenu est chromatographie sur colonne de gel de silice (éluant, MeOH (0-40%) dans CH2Cl2). Les fractions appropriées sont évaporées, reprises avec du methanol et filtrées sur filtre Millipore. Une dernière évaporation du solvant en présence de triéthylamine donne 3, g (77%) du dinucléoside 10. Un échantillon analytique est obtenu après purification par CLHP semi-préparative (colonne nucléosil C18, éluant 2% CH3CN dans H2O), filtration sur filtre Millipore et lyophilisation dans l'eau.
10 CLHP : TR 776 s (99,5%) (3% CH3CN/AcONH4 0,1 M)
UV (H2O) : λ max 262 nm (ε 17900)
λ min 231 nm (ε 1630)
SM (FAB négatif, GT) : 485 M-, 373 (MH-B)-
RMN1H (DMSO-d6) :δ = 1,80-2,05 (m, 6H, H-2',3',3'') ;
2,17-2,32 (m, 2H, H-2'') ; 3,77 et 3,83 (m et m, 2H et 2H, H-5',5'') ; 4,11 (m, 2H, H-4') ; 5,53 (d, 2H, H-5, J = 8,0 Hz) ; 5,95 (dd, 2H, H-1', J = 6,6 et 3,6 Hz) ; 7,95 (d, 2H, H-6, J = 8,0 Hz) ppm
RMN31P (DMSO-d6, D2O) :δ = -0,732 ppm.
O-(5'-O-(4-Méthoxytrityl) 2'-désoxythymidin-3'-yl)
O-(2',3'-didésoxyuridin-5'-yl) phosphate 11.
Une solution d'hydrogenophosphonate (2,06 g, 3,57 mmol.) 7 et de 2',3'-didésoxyuridine 6 (630 mg, 2,97 mmol.) dans 60 ml de pyridine anhydre est traitée avec 915 μl (7,43 mmol.) de chlorure de pivaloyle durant 3 h. Le milieu reactionnel est alors dilué avec du CH2Cl2, lavé avec une solution aqueuse de NaHCO3 puis avec de l'eau. La phase organique est séchée sur Na2SO4 et concentrée. Le résidu est repris avec 76 ml d'une solution d'iode à 2% dans le mélange pyridine, eau (98:2). Après 30', une solution aqueuse de bicarbonate de triéthyl- ammonium est ajoutée et l'iode en excès est réduite par addition de thiosulfate de sodium. Le solvant est évaporé sous pression réduite et le brut chromatographie sur colonne de gel de silice (éluant : MeOH (0-30%) dans CH2Cl2). Les fractions appropriées sont rassemblées, évaporées, et le produit obtenu est dissous dans du MeOH pour être passé sur filtre Millipore. Le filtrat est évaporé pour conduire à 1, 69 g (72%) de 11 suffisamment pur pour la suite de la synthèse. 11 RMN1H (DMSO-d6) : δ = 1,34 (s, 3H, CH3 dT) ; 1,67-1,98 (m, 3H, H-2',3',3'' ddU) ; 2,11-2,55 (m, 3H, H-2' ' ddU, H-2',2'' dT) ; 3,12 (dl, 1H, H-5' dT, J = 8 Hz) ; 3,26 (dd, 1H, H-5' ' dT, J = 4 et 10 Hz) ; 3,60-3,90 (m, 2H, H-5'5' ' ddU) ; 3,73 (s, 3H, CH3OTr) ; 4,04 (m, 1H, H-4' ddU) ; 4,11 (m, 1H, H-4' dT) ; 4,71 (m, 1H, H-3' dT) ;
5,48 (d, 1H, H-5 ddU, J = 8,1 Hz) ; 5,89 (dd, 1H, H-1' ddU, J = 3,8 et 6,6 Hz) ; 6,22 (dd, 1H, H-1 ' dT, J = 6,0 et 8,2 Hz) ; 6,83-7,45 (m, 14H, MTr), 7,49 (s, 1H, H-6 dT) ; 7,88 (d, 1H, H-6 ddU, J = 8,1 Hz) ; 11,1 (sl, 2NHCO) ppm
RMN31P (DMSO-d6) : δ = 1,836 ppm.
O-(3'-O-(4-Méthoxytrityl) 2'-dêsoxythymidin-5'-yl)
O-(2',3'-didésoxyuridin-5'-yl) phosphate 12.
Ce composé a été obtenu selon le mode opératoire décrit lors de la synthèse de 11. Ainsi, 1,18 g (1,74 mmol.) d'hydrogéno- phosphonate 9 et 307 mg (1,45 mmol.) de 2',3'-didesoxyuridine 6 conduisent à 941 mg (73%) de diester 12 sous forme de triéthylammonium après évaporation en présence de triéthyl- amine.
12 UV (EtOH) : λ max 264 nm (ε 18700)
λ min 245 nm (ε 13500)
λ inflex 230 nm (ε 17500)
SM (FAB négatif, GT) : 787 (M)-, 111 (U)- RMN1H (DMSO-d6) : δ = 1,08 (t, 9H, (CH3CH2)3N, J = 7,3 Hz) ; 1,39-1,54 (m, 1H, H-2' dT) ; 1,62-2,00 (m, 4H, H-2'' dT, H-2',3',3'' ddU) ; 1,75 (s, 3H, CH3 dT) ;
2,11-2,30 (m, 1H, H-2' ddU) ; 2,82 (q, 6H, (CH3CH2)3N, J = 7,3 Hz) ; 3,40 (m, 1H, H-5'' dT), 3,45-3,82 (m, 3H, H-5' dT, H-5',5'' ddU) ; 3,73 (s, 3H, CH3O) ; 3,84 (m, 1H, H-4' dT) ; 3,97 (m, 1H, H-4' ddU) ; 4,22 (d, 1H, H-3' dT, J = 5,1 Hz) ; 5,50 (d, 1H, H-5 ddU, J = 8,1 Hz) ; 5,90 (dd, 1H, H-1' ddU, H = 4,1 et 6,6 Hz) ; 6,24 (dd, 1H, H-1' dT,
J = 5,4 et 9,4 Hz) ; 6,85-7,47 (m, 14H, Tr) ; 7,75 (s, 1H, H-6 dT) ; 7,84 (d, 1H, H-6 ddU, J = 8,0 Hz), 11,2 (sl, 2H, 2NHCO) ppm
RMN31P (DMSO-d6) : δ = 0,810 ppm. O,O'-bis(2',3'-didésoxyuridin-5'-yl) O-méthyl phosphate
13. (Composé 2)
Le diester 10 (245 mg, 0,417 mmol.) en solution dans 12,5 ml de pyridine est traité avec 85 μl (2,09 mmol.) de MeOH et avec 309 mg (1,04 mmol.) de 1-(2-mésitylènesulfonyl) 3-nitro 1,2,4 triazole. Après 2 h de réaction, une solution aqueuse de bicarbonate de triéthylammonium est ajoutée et le solvant est évaporé sous pression réduite. La purification est réalisée par chromatographie sur colonne de gel de silice
(éluant : MeOH (0-7%) dans CH2Cl2) puis par CLHP semi-préparative (colonne nucléosil C18, éluant : CH3CN (18%) dans l'eau) pour conduire à 28 mg (13%) de triester 13 après filtration sur filtre Millipore et lyophilisation dans l'eau.
13 CLHP : TR = 308s (98,4%) (15% CH3CN/AcONH4 0,1 M)
UV (H2O) : λ max 261 nm (ε 18300)
λ min 231 nm (ε 4600)
SM (FAB positif, GT) : 501 (M+H)+, 389 (M-B)+, 113 (BH2)+ ; (FAB négatif, GT), 499 (M-H)-
RMN1H (DMSO-d6) : δ = 1,65-2,12 (m, 6H, 2H-2', 3',3'') ; 2,22-2,39 (m, 2H, 2H-2') ; 3,678 et 3,684 (d et d, 3H, CH3OP, J = 11,2 et 11,2 Hz) ; 3,95-4,25 (m, 6H,
2H-4' ,5',5'') ; 5,59 (d, 2H, 2H-5, J = 8,1 Hz) ; 6,00 (m, 2H, 2H-1') ; 7,648 et 7,655 (d et d, 1H et 1H, 2H-6, J = 8,1 et 8,1 Hz) ; 11,3 (sl, 2H, 2NHCO) ppm
RMN31P : δ = 0,571 ppm.
O,O'-bis (2',3'-didéseoxyuridin-5'-yl) O-(2-méthoxyéthyl) phosphate 14 (Composé 4)
Un mode opératoire identique à celui décrit pour la synthèse de 13 à été employé pour obtenir 14. La réaction de 10 (300 mg, 0,511 mmol.) avec 200 μl (2,6 mmol.) de méthoxyéthanol donne 171 mg (62%) de 14 après lyophilisation dans l'eau. La purification a été réalisée par chromatographie sur colonne de gel de silice (éluant : EtOH (0-10%) dans CH2Cl2) puis sur colonne de silice silanisée RP2 (éluant : EtOH (0-25%) dans l'eau. 14 CLHP : TR = 600 s (100%) (15% CH3CN/AcONH4 0,1M)
UV (H2O) : λ max 261 (ε 18600)
λ min 230 (ε 4400)
SM (FAB négatif, GT) : 543 (M-H)-, 485 (M-CH3OCH2CH2)- RMN1Η (DMSO-d6) : δ = 1,71-1,87 (m, 2H, 2H-3'); 1,87-2,0
(m, 4H, 2H-2',3' '); 1,99 (m, 2H, 2H-2' '); 3,25 (s, 3H, CH3O); 3,50 (m, 2H, CH3OCH2); 4,02-4,25 (m, 8H, CH2CH2OP, 2H-4',5',5' '); 5,58 (d, 2H, H-5, J = 8,1 Hz); 5,99 (dd, 2H, 2H-1', J = 4,1 et 7,0 Hz); 7,65 (d, 2H, 2H-6, J = 8,2 Hz); 11,26 (sl, 2H, 2NHCO)
RMN31P (DMSO-d6) : δ = -0,346 ppm.
O,O'-Bis (2',3'-didesoxyuridin-5'-yl) O-(2-cyanoéthyl) phosphate 15 (Composé 5)
Ce composé a été préparé selon le même mode opératoire que celui utilisé lors de la synthèse de 13
La réaction de 234 mg (0,481 mmol.) de 10 avec 165 μl de
3-hydroxypropionitrile conduit à 140 mg (54%) de 15 après deux purifications sur colonne de gel de silice (éluant :
MeOH (0-10%) dans CH2Cl2) et lyophilisation dans l'eau.
15 CLHP : TR = 464 s (100%) (15% CH3CN/AcONH40.1M)
UV (H2O) : λ max 261 nm (ε 19300)
λ min 230 nm (ε 4400)
SM (FAB positif, GT) : 540 (M+H)+; (FAB négatif, GT) 538
(M-H)-, 485 (M-CH2CH2CN)-
RMNΗ (DMSO-d6) : δ = 1,71-1,87 (m, 2H, 2H-3'); 1,87-2,10
(m, 4H, 2H-2',3"); 2,28 (m, 2H, 2H-2"); 2,92 (t, 2H, CH2CN, J = 5,9 Hz); 4,10-4,30 (m, 8H, CH2CH2CN,
H-4',5',5"); 5,60 (d, 2H, H-5, J = 8,1 Hz). 6,00 (m, 2H,
2H-1'); 7,63 (d, 2H, 2H-6, J = 8,0Hz); 11,30 (sl, 2H,
2NHCO) ppm
RMN31P (DMS0-d6) : δ = -0,875 ppm.
O,O'-bis(2',3'-didésoxyuridin-5'-yl) O-(S-pivaloyl-2-thio- éthanol) phosphate 16 (Composé 6)
La réaction de 311 mg (0,529 mmol.) de 10 avec 430 mg (2,65 mmol.) de S-pivaloyl 2-thioéthanol en présence de 391 mg (1,32 mmol.) 1-(2-mésitylènesulfonyl) 3-nitro 1,2,4-triazole dans la pyridine (10,6 ml) a été réalisée en 5h. Le mélange reactionnel a été dilué avec une solution aqueuse 1M de bicarbonate de triéthylammonium avant d'être extrait avec du CH2Cl2. La phase organique a été lavée avec de l'eau, séchée sur sulfate de sodium, concentrée sous pression réduite puis purifiée sur colonne de gel de silice (éluant : MeOH (0-4%) dans le CH2Cl2) pour conduire à 254 mg (76%) de 16 après lyophilisation dans le mélange eau/dioxanne.
16 CLHP : TR = 532 s (98,8%) (30% CH3CN/AcNH4 0,1M)
UV (H2O) : λ max 261 nm (ε 17500)
λ min 230 nm (ε 8000)
SM (FAB positif, GT, NBA) : 631 (M+H)+
RMN1H (DMSO-d6) : δ = 1,16 (s, 9H, (CH3)3C); 1,71-1,89 (m, 2H, 2H-3'); 1,89-2,09 (m, 4H, 2H-2',3"); 2,29 (m, 2H, 2H-2"); 3,10 (t, 2H, SCH2, J = 6,5 Hz); 4,03 (m, 2H, CH2CH2OP); 4,06-4,27 (m, 6H, 2H-4', 5', 5"); 5,586 (d, 1H, 1H-5, J = 8,1 Hz); 5,741 (d, 1H, 1H-5, J = 8,0 Hz); 6,00
(m, 2H, 2H-1'); 7,638 ( d, 1H, 1H-6, J = 7,8 Hz); 7,641 (d, 1H, 1H-6, J = 8,0 Hz); 11,31 (sl, 2H, 2NHCO) ppm RMN31P (DMSO-d6) : δ = -0,866 ppm.
O,O'-bis(2',3'-didesoxyuridin-5'-yl) O-(2-(4-nitrobenzamido) éthyl) phosphate 17 (Composé 8)
Ce composé a été obtenu en suivant un mode opératoire analogue à celui décrit pour la synthèse de 13.
La réaction de 300 mg (0,511 mmol.) de 10 avec 537 mg (2,56 mmol.) de N-(2-hydroxyéthyl) 4-nitrobenzamide conduit à 205 mg (59%) du composé 17 après deux purifications sur colonne de gel de silice (éluant : MeOH (0-6%) dans CH2Cl2 et lyophilisation dans un mélange eau /dioxanne.
17 CLHP : TR = 324 s (98,3%) (25% CH3CN/AcNH4 0,1M)
UV (H2O) : λ max 261 nm (ε 25200)
λ min 230 nm (ε 7500)
SM (FAB positif, NBA) : 679 (M+H)+ RMN1H (DMSO-d6) : δ = 1,68-1,87 (m, 2H, 2H-3'); 1,87-2,05 (m, 4H, 2H-2',3"); 2,25 (m, 2H, 2H-2"); 3,55 (m, 2H, NHCH2); 4,05-4,24(m, 8H, 2H-4',5',5",CH2CH2OP); 5,57 (d, 2H, 2H-5, J = 8,0 Hz); 5,96 (m, 2H, 2H-1'); 7,60 (d, 1H, 1H-6, J = 8,5 Hz); 7,62 (d, 1H, 1H-6, J = 8,3 Hz); 8,06
(d, 2H, 2H arom., J = 8,9 Hz); 8,31 (d, 2H, 2H arom., J = 8,7 Hz); 8,99 (t, 1H, NHCH2, J = 5,5 Hz); 11,30 (sl, 2H, NHCO) ppm
RMN31P (DMSO-d6) : δ = -0,398 ppm.
O,O'-bis (2',3'-didesoxyuridin-5'-yl) O-(benzyloxycarbonyl L-sérinyl ethylester) phosphate 18 (Composé 9)
La méthode de synthèse de ce composé est identique à celle décrite pour le triester 13
Ainsi, 300 mg (0,511 mmol.) du diester 10 et 824 mg (3,08 mmol.) d'ethylester de la N-benzyloxycarbonyl L-sérine conduisent à 130 mg (35%) de 18 après plusieurs purifications sur colonne de gel de silice (éluant : MeOH (0-8%) dans
CH2Cl2) ainsi que sur silice silanisée RP2 (éluant : EtOH (0-40%) dans l'eau) et lyophilisation dans un mélange
eau/dioxanne.
18 CLHP : TR = 564 s (100%) (30% CH3CN/AcNH4 0,1M)
UV (H2O) : λ max 261 nm (ε 19700)
λ min 230 nm (ε 5800)
SM (FAB positif, GT) : 736 (M+H)+
RMN1H (DMSO-d6) : δ = 1,16 (t, 3H, CH3CH2, J = 7,1 Hz);
1,70-1,87 (m, 2H, 2H-3'); 1,87-2,09 (m, 4H, 2H-2',3"); 2,27 (m, 2H, 2H-2"); 4,03-4;30 (m, 10H, 2H-4',5',5", CH3CH2O, CHCH2OP); 4,43 (m, 1H, NHCHCH2); 5,06(s, 2H,
CH2Ph); 5,58 (d, 2H, 2H-5, J = 8,1 Hz); 5,99 (m, 2H,
2H-1'); 7,26-7,42 (m, 5H, Ph); 7,620 (d,1H, 1H-6, J = 8,0 Hz); 7,624 (d, 1H, 1H-6, J = 8,2); 7,93 (d, 1H, NHCHCH2, J = 8,2 Hz); 11,30 (si, 2H, 2NHCO) ppm
RMN31P (DMSO-d6) : δ = -0,855 ppm.
O,O'-bis (2',3'-didésoxyuridin-5'-yl) O-(S-(O-(4-méthoxy- trityl) 2-oxyéthylsulfidyl) 2-thioéthyl) phosphate 19. Le diester 10 (175 mg, 0,298 mmol.) et 636 mg (1,49 mmol.) de mono-O-(4-méthoxytrityl) dithiodiéthanol dans 10 ml de pyridine sont traités avec 221 mg (0,746 mmol.) de 1-(2-mésitylè nesulfonyl) 3-nitro 1,2,4 triazole. Après 2 h, le milieu reactionnel est dilué avec du CH2Cl2 et lavé avec une solution aqueuse de NaHCO3 puis avec de l'eau. La phase organique est séchée sur Na2SO4 et concentrée sous pression réduite. Le brut obtenu est chromatographie sur colonne de gel de silice
(éluant : MeOH (0-4%) dans CH2Cl2) pour conduire à 168 mg (63%) de triester protégé 19.
19 UV (EtOH) : λ max 261 nm (ε 20600), 232 nm (ε 19700) λ min 244 nm (ε 16200), 227 nm
SM (FAB, positif, GT) : 895 (M+H)+, 273 (MTr)+
RMN1H (DMSO-d6) : δ = 1,75-1,88 (m, 2H, 2H-3'), 1,91-2,08 (m, 4H, 2H-2',3'') ; 2,23-2,48 (m, 2H, 2H-2'') ; 2,88 (t, 2H, CH2CH2OP, J = 6,3 Hz) ; 2,92 (t, 2H, CH2CH2OMTr, J = 6,4 Hz) ; 3,24 (t, 2H, CH2CH2OMTr, J = 6,0 Hz) ; 3,74 (s, 3H, CH3O) ; 4,07-4,18 (m, 8H, 2H-4',5',5'', CH2CH2OP) ; 5,569 et 5,572 (d et d, 2H, 2H-5, J = 8,1 et 8,1 Hz) ; 5,99 (m, 2H, 2H-1 ') ; 6,88-7,45 (m, 14H, Tr) ; 7,62 (d, 2H, 2H-6, J m 8,1 Hz) ; 11,3 (si, 2H, 2NHCO) ppm
RMN31P (DMSO-d6) : δ = -0,601 ppm.
0-(5'-0-(4-Méthoxytrityl) 2'-désoxythymidin-3'-yl)
O-(2* ,3'-didesoxyuridin-5'-y1) 0-(S-(0-(4-méthoxytrityl)
2-oxyéthylsulfidyl) 2—(thioéthyl) phosphate 20.
Ce composé a été obtenu selon le même mode opératoire utilisé lors de la synthèse de 19.
Ainsi 355 mg (0,450 mmol.) du diester H conduisent à 310 mg (58%) de triester 20..
20 SM (FAB positif, NBA) : 1197 (M+H)+, 273 (MTr)+
RM^H (DMS0-d6) : δ = 1 , 44 et 1 , 46 (s et s, 3H, CH3 dT) ; 1,65-1,74 (m, 1H, H-3* ddU) ; 1,75-2,05 (m, 2H, H-2',3'' ddU) ; 2,17-2,34 (m, 1H, H-2' ddU) ; 2,40-2,57 (m,
H-2',2'1 dT) ; 2,81 (m, 2H, SCH2CH2OP) ; 2,89 (m, 2H, SCH2CH2OMTr) ; 3,15-3,42 (m, 4H, H-5',5'' dT, SCH2CH2OMTr) ; 4,02-4,22 (m, 6H, H-4',5',5'' ddU, H-4' dT, SCH2CH2OP) ; 5,03 (m, 1H, H-3' dT), 5,53 et 5,54 (d et d, 1H, H-5 ddU, J = 8,1 et 8,1 Hz) ; 5,93 (m, 1H, H-1' ddU) ; 6,21 (t, 1H, H-1' dT, J = 7,0 Hz) ; 6,82-7,43 (m, 14H, Tr) ; 7,47 (s, 1H, H-6 dT) ; 7,58 et 7,59 (d et d,
1H, H-6 ddU, J = 8,1 et 8,1 Hz) ; 11,3 (sl, 2H, 2NHCO dT ddU) ppm
RMN31P (DMSO-d6) : δ = -1,689 et -1,748 ppm.
O-(5'-O-(4-Méthoxytrityl) 2'-désoxythymidin-3'-yl)
O-(2',3'-didésoxyuridin-5'-yl) O-(S-pivaloyl 2-thioéthyl) phosphate 21.
La réaction de 266 mg (0,377 mmol.) du diester 11 avec 274 mg (1,69 mmol.) de S-pivaloyl 2-thioéthanol selon le mode opératoire décrit lors de la synthèse de 19 conduit à 124 mg (55%) du triester 21.
21 RMN1H (DMSO-d6) : δ = 1,13 et 1,14 (s et s, 9H, (CH3)3C) ;
1,46 et 1,44 (s et s, 3H, CH3 dT) ; 1,65-1,85 (m, 1H, H-3' ddU) ; 1,85-2,08 (m, 2H, H-2',3'' ddU) ; 2,18-2,40 (m, 1H, H-2'' ddU) ; 2,42-2,60 (m, H-2',2'' dT) ; 3,05 (m, 2H, SCH2CH2) ; 3,17-3,45 (m, 2H, H-5',5'' dT), 3,73 (s, 3H, CH3O Tr) ; 3,92-4,25 (m, 6H, H-4' dT, H-4',5',5'' ddU, SCH2CH2OP) ; 5,04 (m, 1H, H-3' dT) ; 5,54 et 5,55 (d et d, 1H, H-5 ddU, J = 8,1 Hz et 8,1 Hz) ; 5,94 (m, 1H, H-1' ddU) ; 6,21 (t, 1H, H-1' dT, J = 7,0 Hz) ; 6,85-7,45 (m, 14H, Tr) ; 7,49 (s, 1H, H-6 dT) ; 7,598 et 7,602 (d et d, 1H, H-6 ddU, J = 8,1 et 8,1 Hz) ; 11,4 (sl, 2H, 2NHCO) ppm
RMN31P (DMSO-d6) : δ = -1,749 et -1,854 ppm.
O-(3'-O-(4-Méthoxytrityl) 2'-désoxythymidin-5'-yl)
O-(2',3'-didesoxyuridin-5'-yl) O-(S-(O-(4 méthoxytrityl)
2-oxyéthylsulfidyl) 2-(thioéthyl) phosphate 22
Le même mode opératoire que celui décrit lors de la synthèse de 19 a été employé. Ainsi, 400 mg (0,449 mmol.) de diester 12 conduisent à 348 mg (65%) du triester 22. 22 UV (EtOH) : λ max 263 nm (ε 22000)
λ min 250 nm (ε 19700)
λ max 232 nm (ε 34400)
λ min 227 nm (ε 33500)
SM (FAB positif, NBA) : 1197 (M+H)+, 273 (MTr)+
RMN1H (DMSO-d6) : δ = 1,55-2,07 (m, 5H, H-2',2'' dT,
H-2',3',3'' ddU) ; 1,69 (s, 3H, CH3 dT) ; 2,78 (t, 2H, MTrOCH2CH2, J = 6,3 Hz) ; 2,88 (t, 2H, POCH2CH2, J = 5,8 Hz) ; 3,21 (t, 2H, MTrOCH2CH2, J = 5,7 Hz) ; 3,67-4,17 (m, 8H, H-4',5',5'' dT, H-4',5',5'' ddU, POCH2CH2) ; 3,72 (s, 6H, 2CH3O Tr) ; 4,20 (m, 1H, H-3' dT) ; 5,53 (d, 1H, H-5 ddU, J = 8,1 Hz) ; 5,95 (dd, 1H, H-1' ddU, J = 3,8 et 6,7 Hz) ; 6,19 (dd, 1H, H-1' dT, J = 6,4 et 8,7 Hz) ;
6,85-6,43 (m, 28H, 2Tr) ; 6,44 (s, 1H, H-6 dT) ; 5,57 et 5,59 (d et d, 1H, H-6 ddU, J = 8,1 et 8,1 Hz) ; 11,3 (sl, 2H, 2NHCO) ppm
RMN31P (DMSO-d6) : δ = -0,662 et - 0,722 ppm.
O-(2'-désoxythymidin-3'-yl) O-(2', 3'-didesoxyuridin-5'-yl) phosphate 23 (Composé 10)
Le composé protégé 11 (200 mg ; 0,254 mmol.) est traité par 30 ml/mmol. d'un mélange acide acétique, eau (8:2) pendant 3 h. Le solvant est évaporé. Après coévaporation avec de l'eau, le brut obtenu est dissous dans l'eau, lavé avec du CH2Cl2 et concentré sous pression réduite. La purification es réalisée par chromatographie semi-préparative sur couche mince de silice (éluant isopropanol, ammoniac, eau (8:1:1). Le produit est extrait de la silice avec du MeOH et la solution filtrée sur filtre Millipore. Une lyophilisation dans l'eau donne 47 mg (35%) de 23.
23 CLHP : TR 412s (98,1%) (8% CH3CN/AcONH4 0,1 M)
UV (H2O) : λ max 263 nm (ε 18700)
λ min 232 nm (ε 4200)
SM (FAB négatif GT) : 515 M-
RMN1H (DMSO-d6) : δ = 1,72-2,04 (m, 3H, H-2', 3',3'' ddU) ; 1,76 (s, 3H, CH3 dT) ; 2,04-2,18 (m, 1H, H-2', dT) ;
2,18-2,33 (m, 2H, H-2'' ddU, H-2" dT) ; 3,56 (m, 2H, H-5',5" dT) ; 3,78 (m, 2H, H-5',5" ddU) ; 3,92 (dl, 1H H-4' dT, J = 2,8 Hz) ; 4,11 (m, 1H, H-4' ddU) ; 4,58 (m, 1H, H-3' dT) ; 5,48 (sl, 1H, OH, dT) ; 5,55 (d, 1H, H-5 ddU, J = 8,1 Hz) ; 5,94 (dd, 1H, H-1' ddU, J = 7,0 et 3, Hz) ; 6,12 (dd, 1H, H-1' dT, J = 6,1 et 7,7 Hz) ; 7,66
(s, 1H, H-6 dT) ; 7,95 (d, 1H, H-6 ddU, J = 8,1 Hz) ; 9,
(si, 2NHCO, NH4+) ppm
RMN31P (DMSO-d6) : δ = -1,346 ppm.
O,O'-bis(2',3'-didésoxyuridin-5'-yl) O-(S-(2-hydroxyéthyl- sulfidyl) 2-thioéthyl) phosphate .24 (Composé 7)
La déprotection de 150 mg (0,168 mmol.) de 19 par l'acide acétique a été réalisée de manière analogue à celle décrite lors de la synthèse de .23. Une chromatographie sur colonne de silice (éluant : MeOH (0-10%) dans CH2Cl2) suivie d'une purification par CLHP semi-préparative (colonne Nucléosil C18 ; éluant : 20% CH3CN/H2O) conduit à 45 mg (43%) de 24 après lyophilisation dans le mélange eau/dioxanne.
24 CLHP : TR = 372s (99,1%) (20% CH3CN/AcONH4 0,1 M)
UV (H2O) : λ max 262 nm (ε 18500)
λ min 231 nm (ε 4400)
SM (FAB positif, GT ou NBA) : 623 (M+H)+
RMNΗ (OWSO-d6) : δ = 1,70-2,12 (m, 6H, 2H-2'; 7, 3 ' ,3'') ; 2,18-2,40 (m, 2H, 2H-2'') ; 2,79 (t, 2H, CH2CH2OH, J = 6,3 Hz), ; 2,98 (t, 2H, CH2CH2OP, J = 6,3 Hz) ; 3,60 (m, 2H, CH2CH2OH) ; 4,05-4,20 (m, 8H, 2H-4', 5',5'', CH2CH2OP) ; 4,91 (t, 1H, OH, J = 5,4 Hz) ; 5,59 (d, 2H, 2H-5, J = 8,0 Hz) ; 6,01 (m, 2H, H-1') ; 7,65 (d, 2H, 2H-6, J = 8,1 Hz), 11,3 (sl, 2H, 2NHCO) ppm.
RMN31P (DMSO-d6) : δ ≈ -0,582.ppm
O-(2'-désoxythymidin-3'-yl) O-(2',3'-didésoxyuridin-5'-yl) O-(S-(2-hydroxyéthylsulfidyl) 2-thioéthyl) phosphate 25
(Composé 13)
Le traitement de 290 mg (0,240 mmol.) de 20) par l'acide acétique selon le mode opératoire décrit précédemment lors de la synthèse de .23 conduit, après purification par chromatographie sur colonne de gel de silice (éluant : MeOH (0-10%) dans CH2Cl2) et lyophilisation dans le mélange eau/dioxanne, 80 mg (51%) de 25.
25 CLHP : TR = 584s (52,4%) et 640s (46,1%) (18%
CH3CN/AcONH4 0,1 M)
UV (H2O) : λ max 263 nm (ε 18300)
λ min 232 nm (ε 4300)
SM : (FAB positif, GT) : 653 (M+H)+, 577 (M-SCH2CH2O + M)+ (FAB positif NBA) 653 (M+H)+
RM^H (DMSO-d6) : δ = 1,73-1,91 (m, 1H, H-3' ddU) ; 1,77 (s, 3H, CH3 dT) ; 1,91-2,12 (m, 2H, H-2',3'' ddU) ;
2,22-2,47 (m, 3H, H-2' ddU, H-2',2'' dT) ; 2,801 et 2,807 (t et t, 2H, SCH2CH2OH, J = 6,38 et 6,37 Hz) ; 3,00 (t, 2H, SCH2CH2OP, J = 6,2 Hz) ; 3,55-3,70 (m, 4H, H-5',5'1 dT, OCH2CH2OH) ; 4,07 (m, 1H, H-4' dT) ; 4,11-4,34 (m, 5H, H-4';5';5'' ddU, SCH2CH2OP) ; 4,88 (sl, 1H, OH) ; 4,96 (tl, 1H, H-3' dT, J = 5,8 Hz) ; 5,61 (d, 1H, H-5 ddU, J = 8,1 Hz) ; 6,01 (dd, 1H, H-1' ddU, J = 6,8 et 4,2 Hz) ; 6,19 (dd, 1H, H-1 dT, J = 6,3 et 8,0 Hz) ; 7,65 (d, 1H, H-6 ddU, J = 8,1 Hz) ; 7,68 (s, 1H, H-6 dT) ; 11,3 (si, 2H, 2HNCO) ppm
RMN31P (DMSO-d6) : δ = -1,658 et -1,687 ppm.
O-(2'-désoxythymidin-3'-yl) O-(2',3'-didésoxyuridin-5'-yl) O-(S-pivaloyl 2-thioéthyl) phosphate 26 (Composé 12)
La déprotection de 21 (164 mg ; 0,176 mmol.) selon le mode opératoire décrit lors de la synthèse de 23 conduit à 50 mg (43%) de 26 après chromatographie sur colonne de gel de silice (éluant : MeOH (0-6%) dans CH2Cl2) et lyophilisation dans le mélange eau/dioxanne. 26 CLHP : TR = 520s (59,9%) et 612s (40,1%) (30% CH3CN/AcONH 0,1 M)
UV (H2O) : λ max 262 nm (ε 18300)
λ min 233 nm (ε 7200)
SM (FAB positif, GT) : 661 (M+H)+, 577 (M-(CH3)3CCO+H)+, 127 (TH2)+, 113 (UH2) +
RMN1H (DMSO-d6) : 1,18 (s, 9H, (CH3)3C) ; 1,72-1,93 (m, 1 H-31 ddU) ; 1,79 (s, 3H, CH3 dT) ; 1,93-2,15 (m, 2H, H-2',3" ddU) ; 2,22-2,48 (m, 3H, H-2" ddU, H-2',2" dT) ; 3,14 (t, 2H, CH2S, J = 6,3 Hz) ; 3,62 (m, 2H,
H-5',5' ' dT) ; 4,03-4,18 (m, 3H, H-4' dT, SCH2CH2) ;
4,18-4,32 (m, 3H, H-4',5',5' ' ddU) ; 4,97 (m, 1H, H-3' dT) ; 5,26 (si, 1H, OH dT) ; 5,62 (d, 1H, H-5 ddU, J = 8,1 Hz) ; 6,02 (dd, 1H, H-1' ddU, J = 6,8 et 6,1 Hz) ; 6,20 (dd, 1H, H-1' dT, H = 6,3 et 8,0 Hz) ; 7,67 (d, 1H,
H-6 ddU, J = 8,1 Hz) ; 7,70 (s, 1H, H-6 dT) ; 11,4 (si, 2H, 2NHCO) ppm
RMN31P (DMSO-d6) : δ = -1,817 et -1,764 ppm.
O-(2'-Désoxythymidin-5'-yl) O-(2',3*-didésoxyuridin-5'-yl) O-(S-(2-b-ydroxyéthylsulfidyl) 2- thioéthyl) phosphate 27
(Composé 14)
La déprotection a été réalisée de façon analogue à celle utilisée lors de la synthèse de 23. Ainsi, 298 mg (0,249 mmol.) de 22 conduisent à 85 mg (53%) de 27 après purification par chromatographie sur colonne de silice (éluant : MeOH (0-10%) dans CH2Cl2). 27 CLHP : TR = 560s (99,7%) (18% CH3CN/AcONH4 0,1 M)
UV (H2O) : λ max 262 nm (ε 18300)
λ min 232 nm (ε 3700)
SM (FAB positif, GT) : 653 ((M+H)+, 577 (M-OCH2CH2S+H)+ RMN1H (DMSO-d6) : δ = 1,70-2,22 (m, 5H, H-2',3',3" ddU, H-2',2'' dT) ; 1,78 (s, 3H, CH3 dT) ; 2,22-2,43 (m, 1H,
H-2' ' ddU) ; 2,79 (t, 2H, HOCH2CH2, J = 6,3 Hz) ; 2,98 (t, 2H, POCH2CH2, J = 6,2 Hz) ; 3,63 (m, 2H, HOCH2CH2) ; 3,92 (m, 1H, H-4' dT) ; 4,08-4,33 (m, 8H, H-3*,5*,5" dT,
H-4',5',5' ' ddU, POCH2CH2) ; 4,90 (t, 1H, HOCH2CH2, J = 5,4 Hz) ; 5,46 (d, 1H, OH dT, J = 4,1 Hz) ; 5,59 (d, 1H, H-5 ddU, J = 7,9 Hz) ; 5,99 (m, 1H, H-1' ddU) ; 6,21 (t, 1H, H-1 l dT, J = 6,9 Hz) ; 7,48 (s, 1H, H-6, dT) ; 7,64 (d, 1H, H-6 ddU, J = 8,1 Hz) ; 11,3 (sl, 2H, 2NHC0, ddU dT) ppm RMN31P (DMSO-d6) : δ = -0,543. RMN31P (DMSO-d6) : δ = -0,543.
0,0'-bis(2',3'-didésoxyuridin-5'-yl) O-pivaloyloxyméthyl phosphate 28 (Composé 3)
Le dimère phosphodiester 10 est mis sous forme de sodium par échange sur une colonne DOWEX W50 Na+ et est ensuite lyophilisé. Une suspension de 200 mg (394 μmol.) du produit pulvérulent obtenu dans 10 ml d' acetonitrile est mise en réaction avec 940 mg (3,88 mmol.) d'iodure de pivaloyloxyméthyle à reflux. Après 15', le reflux est arrêté et le milieu reactionnel est dilué avec une solution de bicarbonate de triéthylammonium. Le solvant est évaporé et le brut purifié par chromatographie sur colonne de gel de silice (éluant : MeOH (0-5%) dans CH2Cl2) puis sur colonne de silice silanisee RP2 (éluant : EtOH (0-30%) dans l'eau) pour conduire 45 mg (19%) du composé 28 après filtration sur filtre Millipore et lyophilisation dans le mélange eau/dioxanne. 28 CLHP : TR = 600s (98,5%) (25% CH3CN/AcONH4 0,1 M)
UV (H2O) : λ max 261 nm (ε 17900)
λ min 231 nm (ε 3800)
SM (FAB positif, GT) 601 (M+H)+, 113 (BH2)+
RMN1H (DMSO-d6) : δ = 1,00 (s, 9H, (CH3)3C) ; 1,62-1,82 (m 2H, 2H-3') ; 1,82-2,02 (m, 4H, 2H-2',-3") ; 2,11-2,30
(m, 2H, 2H-2' ') ; 4,01-4,20 (m, 6H, 2H-4', 5', 5' ') ; 5,44 (d, 2H, 2H-5, J = 7,8 Hz), 5,45 (d, 2H, OCH2OP, J = 13,7 Hz) ; 5,85 (dd, 2H, 2H-1', J = 4,2 et 6,8 Hz) ; 7,49 (d, 2H, 2H-6, J = 8,1 Hz) ; 10,5 (si, 2H, 2NHCO) ppm
RMN31P (DMSO-d6) δ = -1,822 ppm.
O-(2'-désoxythymidin-3'-yl) O-(2',3'-didésoyuridin-5'-yl) O-pivaloyloxyméthyl phosphate 29 (Composé 11)
Le diester 11 est mis sous forme sodium par passage sur une colonne DOWEX W50 Na+ et est lyophilisé dans l'eau. Le produit pulvérulent obtenu (308 mg, 0,380 mmol.) est mis en suspension dans 10 ml d' acetonitrile et est traité avec 946 mg (0,888 mmol.) d'iodure de pivaloyloxyméthyle. Après 2 h, la réaction est achevée (détritylation partielle du produit d'arrivé). Du MeOH (1 ml) est ajouté et après 15' (détrityl tion totale) le solvant est évaporé. Le brut est purifié pa chromatographie sur colonne de gel de silice (éluant : MeOH (0-12%) dans CH2Cl2 puis sur colonne de silice silanisee RP2 (éluant : EtOH (0-40%) dans l'eau). Le composé 29 (87 mg, 36%) est isolé après filtration sur filtre Millipore et lyophilisation dans le mélange eau/dioxanne. 29 CLHP : TR = 428s (46,3%) et 484s (51,8%) (25% CH3CN/AcONH4 0,1 M)
UV (H2O) : λ max 262 nm (ε 18900)
λ min 232 nm (ε 5700)
SM (FAB positif, GT) : 631 (M+H)+, 127 (TH2)+, 113 (UH2)+ RMN1H (DMSO-d6) : δ = 1,67 (s, 9H, (CH3)3C), 1,74-1,90 (m, 1H, H-3' ddU) ; 1,77 (s, 3H, CH3 dT) ; 1,90-2,12 (m, 2H, H-2',3' ddU) ; 2,23-2,45 (m, 3H, H-2' ddU, H-2',2'' dT) 3,60 (t, 2H, H-5',5'' dT, J = 4,3 Hz) ; 4,07 (m, 1H, H-4 dT) ; 4,12-4,30 (m, 3H, H-4',5',5'' ddU) ; 4,97 (m, 1H, H-3' dT) ; 5,25 (m, 1H, OH dT) ; 5,60 (d, 1H, H-5 ddU,
= 7,9 Hz) ; 5,627 et 6,631 (d et d, 2H, OCH2OP, J = 12,7 et 12,2 Hz) ; 6,00 (m, 1H, H-1' ddU) ; 6,19 (m, 1H, H-1' dT) ; 7,63 et 7,65 (d et d, 1H, H-6 ddU, J = 8,2 et 8,2 Hz) ; 7,68 (s, 1H, H-6 dT) ; 11,3 (si, 2H, 2NHCO) ppm RMN31P (DMSO-d6) : δ = -2,894 et -2,938.
Figure imgf000023_0001
Les composés de l'invention ont été soumis à des essais pharmacologiques montrant leur intérêt dans le traitement de maladies virales. - Evaluation de l'activité anti-VIH 1 sur les cellules CEM
VIH = virus de l'immunodéficience humaine
CEM = cellule lymphoblastoïde T humaine.
La réplication du VIH-1 (isolât LAI) dans les cellules CEM est mesurée par un dosage de la réverse transcriptase (RTase) dans le surnageant de culture après 5 jours d'infection.
Cette activité traduit la présence de virus libéré par les cellules. Après l'adsorption du virus, les composés testés sont ajoutés à différentes concentrations dans le milieu de culture.
L'activité antivirale est exprimée par la concentration la plus faible de composé qui diminue la production de RTase d'au moins 50 % (ED50).
L'effet toxique sur les CEM non infectées est apprécié par une réaction colorimétrique basée sur la capacité des
cellules vivantes à réduire le bromure de 3-(4,5
diméthylthiazol-2-yl)-2,5 diphényltetrazolium en formazan après 5 jours d'incubation en présence de différentes
concentrations des composés. Les résultats sont exprimés par la concentration la plus faible de composé qui provoque une inhibition d'au moins 50 % de la formation de formazan
(CD50).
Les composés de l'invention ont une ED50 allant de 10-6M à 10-4M pour une CD50 de 10-5M à 10-4M.
Figure imgf000025_0001
Annexe 2
R1OH
Figure imgf000026_0003
6 R1 : 5'-ddU R1 : 5'-ddU 10 R1 : 5'-ddU
8 3'-dTMTr 7 3'dTMRTr 11 3'-dTMTr
4 5'-dTMTr 9 5'-dTMTr 12 5'-dTMTr
Figure imgf000026_0001
^
13 R1 1 : 5'-ddU R2 : CH3
14 5'-ddU CH2CH2OCH3
15 5'-ddU CH2CH2CN
16 5'-ddU CH2CH2SCOC(CH3)3
17 5'-ddU CH2CH2NHCOPhNO2
18 5'-ddU CH2CH(COOEt)NHCOOCH2Ph
19 5'ddU CH2CH2SSCH2Ch2OMTr
20 3'-dTMTr CH2CH2SSCH2CH2OMTr
21 3'-dTMTr CH2CH2SCOC(CH3)3
22 5'-dTMTr CH2CH2SSCH2CH2OMTr
Figure imgf000026_0002
11 R1 : 3'-dTMTr 23 R3 : 3'-dT Annexe 2 (suite)
Figure imgf000027_0001
19 --------H+--------→ 24 R3 : 5'-ddU R2 : CH2CH2SSCH2CH2OH
20 -------------------→ 15 3'-dT CH2CH2SSCH2CH2OH
21 -------------------→ 26 3'-dT CH2CH2SCOC(CH2)3
22 -------------------→ 27 5'-dT CH2CH2SSCH2CH2OH
/
Figure imgf000027_0002
10 R1 5'-ddU 28 R1 : 5'-ddU R3 : CH2OCOC(CH3)3
Figure imgf000027_0003
11 R1 : 3'-dTMTr 29 R2 : 3'-dT R3 : CH2OCOC(CH3)3
5'-ddU : 3'-dTMTr : 3'-dT : 5'-dTMTr : 5'-dT :
Figure imgf000027_0004

Claims

Revendications
1 . Dérivés de la ddU répondant à la formule /
^ X
dans laquelle
Figure imgf000028_0004
R' 1 est la 5 ' -ddU, la 3 ' -dT ou la 5 ' -dT,
R'2 est un cation, le radical méthyle, le radical -CH2O-CO-
C(CH3)3, -CH2CH2OCH3, -CH2CH2CN, -CH2CH2S-CO-C(CH3)3,
COOEt
/
-CH2CH2S-SCH2CH2OH,-CH2CH2-NH-CO NO2, —CH2-CH
Figure imgf000028_0003
NH-COOCH2-
Figure imgf000028_0002
βes formules des motifs -O-ddU -O-3 ' -dT et -0-5 ' -dT étant les suivantes respectivement :
Figure imgf000028_0001
2. Médicament caractérisé en ce qu'il contient un composé selon la revendication 1.
3. Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle contient un composé selon la revendication 1 en association avec tout excipient approprié.
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