WO1992011386A1 - Agent de detection de cephalosporinase - Google Patents

Agent de detection de cephalosporinase Download PDF

Info

Publication number
WO1992011386A1
WO1992011386A1 PCT/JP1991/001732 JP9101732W WO9211386A1 WO 1992011386 A1 WO1992011386 A1 WO 1992011386A1 JP 9101732 W JP9101732 W JP 9101732W WO 9211386 A1 WO9211386 A1 WO 9211386A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cephalosporinase
test agent
penicillinase
indicator
inhibitor
Prior art date
Application number
PCT/JP1991/001732
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Matsuhisa Inoue
Akira Sakai
Original Assignee
Showa Yakuhin Kako Co., Ltd.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Showa Yakuhin Kako Co., Ltd. filed Critical Showa Yakuhin Kako Co., Ltd.
Priority to EP92901447A priority Critical patent/EP0563387B1/en
Priority to US07/011,769 priority patent/US5350680A/en
Priority to JP4501473A priority patent/JP2966523B2/ja
Priority to DE69125850T priority patent/DE69125850T2/de
Publication of WO1992011386A1 publication Critical patent/WO1992011386A1/ja

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/978—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • G01N2333/986—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in cyclic amides (3.5.2), e.g. beta-lactamase (penicillinase, 3.5.2.6), creatinine amidohydrolase (creatininase, EC 3.5.2.10), N-methylhydantoinase (3.5.2.6)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2415/00—Assays, e.g. immunoassays or enzyme assays, involving penicillins or cephalosporins
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/81—Packaged device or kit
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/975—Kit

Definitions

  • the present invention relates to a cephalosporinase test agent.
  • the present invention relates to a cephalosporinase test agent capable of accurately determining whether or not a causative bacterium isolated from a patient with a bacterial infection is a cephalic sporinase-producing bacterium.
  • a penicillinase test agent containing a penicillin antibiotic and a pH indicator as a substrate and a cephalosporinase test agent containing a cephalosporin antibiotic and a pH indicator as a substrate was detected in combination with
  • these test agents when the test bacteria are penicillinase-producing bacteria and cephalosporinase-producing bacteria, respectively, are used to decompose acid by being degraded by the enzyme substrates benicillin antibiotics and cephalosporin antibiotics. This results in discoloration of the pH indicator contained in the test agent. Therefore, if both test agents determined to be positive, the test bacteria were determined to be bacteria that produce both penicillinase and cephalosporinase.
  • penicillinase specifically hydrolyzes penicillin antibiotics
  • cephalosporinase-producing bacteria specifically hydrolyze cephalosporin antibiotics.
  • some penicillins hydrolyze not only penicillins but also cephalosporins as substrates.
  • a bacterium that produces such cephalosporinase-activated penicillinase is determined by the above-described method, it is also determined to be positive even if the test agent for t or the deviation is t.
  • the bacterium that actually produces yS-lactamase classified as penicillinase is a bacterium that produces both penicillinase and cephalosporinase.
  • misjudgments can lead to incorrect selection of appropriate chemotherapeutics in clinical practice.
  • an object of the present invention is to provide a ⁇ -lactamase test agent that can accurately and easily determine the enzyme type of ⁇ -lactamase without the possibility of such erroneous determination.
  • the present inventors have provided a cephalosporinase test agent containing a penicillinase inhibitor in addition to the cephalosporin antibiotic which is a substrate of the enzyme, in detecting cephalosporinase. By doing so, it has been found that the above object is achieved. Disclosure of the invention
  • a cephalosporin test agent comprising a cephalosporin antibiotic, a benicilinase inhibitor in an amount of not more than 20% by weight based on the weight of the cephalosporin antibiotic, and a ⁇ indicator.
  • the penicillinase inhibitor contained in the cephalosporinase test agent of the present invention inhibits the action of penicillinase, which hydrolyzes cephalosporin antibiotics.
  • a bacterium that produces cephalosporinase activity penicillinase is determined to be cephalosporinase negative by the cephalosporinase test agent of the present invention.
  • cephalosporinase is not affected by penicillinase inhibitors and hydrolyzes cephalosporin antibiotics that are substrates, so bacteria that produce cephalosporinase are positive for cephalosporinase. Is determined.
  • a cephalosporinase test agent further comprising a ⁇ modulator, A test agent for cephalosbolinase supported on a carrier is provided.
  • kits for detecting cephalosporinase comprising the above-mentioned cephalosporinase test agent, and a control test agent containing a penicillinase inhibitor and a PH indicator.
  • cephalosporin antibiotic contained in the cephalosporinase test agent of the present invention any cephalosporin antibiotic that is decomposed by cephalosporinase to give an acid can be used.
  • cephalosporin antibiotics include, for example, cephalexin, cefaclor, cephaloglysin, cephadroxil, cefatrizine, cephamandole, cephrazine, cefloxazine, cephalexin, which are known and available cephalosporin antibiotics. Fapirin, cephalotin, cephaloridin, cefotiam, ceftezol, cefazolin, cefacetril and the like can be mentioned. One or more of these cephalosporins can be used.
  • penicillinase inhibitor contained in the cephalosporinase test agent of the present invention one that specifically acts on penicillinase and inhibits penicillinase activity may be used.
  • An example of such a penicillinase inhibitor is clavulanic acid.
  • the amount of the penicillinase inhibitor contained in the cephalosporinase test agent of the present invention may be an amount that does not adversely affect the action of cephalosporinase and sufficiently inhibits the activity of penicillinase. I just need.
  • the amount of penicillinase inhibitor varies depending on the type of cephalosporin antibiotic used, the type of penicillinase inhibitor, and the test target. preferable. In general, the amount of the penicillinase inhibitor is 20% by weight or less, preferably 0.5 to 5.0% by weight, based on the weight of the cephalosporin antibiotic used.
  • the pH indicator contained in the cephalosporinase test agent of the present invention is an acid produced by hydrolysis of a cephalosporin antibiotic by the action of cephalosporinase.
  • the decrease in pH due to discoloration is detected by discoloration.
  • Any pH indicator suitable for such purpose may be used.
  • a pH indicator capable of detecting a change from a pH value of about 8.8 or more to a weak pH value of about 7.2 or more Cresoluled Red can be mentioned.
  • a pH indicator that can detect a change from neutral to weakly acidic with a pH of about 5.2 or less bromphenol red can be mentioned.
  • the cephalosporinase test agent of the present invention may contain a pH regulator.
  • the pH adjusting agent include, for example, sodium hydroxide, a water-soluble sphere, and the like, which are water-soluble base compounds.
  • the pH of the cephalosporinase test agent of the present invention is preferably adjusted to a higher pH than the discoloration range of the pH indicator to be used by adding these pH adjusters.
  • the pH adjuster may be added, for example, in an amount of 2 weight or less based on S4 of the cephalosporin antibiotic.
  • the cephalosporinase test agent of the present invention may be generally produced as a composition in the form of a solid or a solution.
  • a cephalosporinase test agent when producing a cephalosporinase test agent in a solid form, it can be produced by uniformly mixing the above components in a powder form using a ball mill or a jet mill. Dispensing process, for example, room temperature of t, and it is preferably carried out at a relative humidity of 50% following conditions below room temperature, in the production of cefpodoxime Arosuporinaze test agent 0 solution form, for example water for injection, sterile The above components may be dissolved in physiological saline, sterile purified water or alcohols.
  • a cephalosporinase test agent in the form of a solution may be prepared so that the concentration of the cephalosporin antibiotic is 5 to 10% by weight.
  • the solution-form cephalosporinase test agent produced as described above may be freeze-dried.
  • an additive such as polyvinyl bilidone may be further added. These additives are generally less than 1% by weight. May be used.
  • the cephalosporinase test agent of the present invention may further contain a medium composition and the like. Examples of the medium composition include Mueller Hinton Agar containing agar and the like, Heart Infusion Agar, Brain Heart Infusion Agar, and the like. When these medium compositions are used, the cephalosporinase test agent of the present invention may be in a semi-solid form.
  • a cephalosporinase test agent carried on a carrier can be mentioned.
  • the carrier include a cellulose filter such as filter paper; a synthetic resin filter such as a sponge made of polyvinyl alcohol; a glass filter which is a porous glass; an absorbent made of a water-retaining polymer such as urethane foam; a microplate; Microwells; porous ceramics such as unglazed plates; and absorbers such as cabrilari utilizing capillary action. It is preferable to use a cellulose filter as a carrier.
  • Examples of a method for producing a cephalosporinase test agent carried on these carriers include, for example, impregnating a carrier such as a cellulose filter with the composition in the form of a solution described above, and further depending on ⁇ .
  • Examples of the method include a method of drying the filter, a method of absorbing the composition in the form of a solution in a capillaries and the like, and sealing according to the conditions.
  • the filter impregnated with the composition in the form of a solution may be dried at 60 ° C. for 1 hour. It is preferable to obtain a filter having a water content of 5% or less by the drying step.
  • a method for supporting the solid-state composition on a carrier a method described in Japanese Patent Publication No. 58-1266 can be mentioned.
  • Examples of the method for using the cephalosporinase test agent of the present invention include a method of collecting a test bacterial colony from a medium in which a test bacterium is cultured, and then smearing the cephalosporinase test agent of the present invention; and Examples of the method include dropping a concentrated bacterial solution to the cephalosporinase test agent of the present invention.
  • the above method using a cephalosporinase test agent typically involves smearing a sample onto the test agent; applying the test agent at room temperature, preferably about 25. (For about 20 to 30 minutes) and a step of observing a change in the color tone of the cephalosporinase test agent.
  • the method may include a step of impregnating the test agent with an appropriate amount of sterilized purified water, sterile physiological saline, or the like before use.
  • a cephalosporinase test agent containing bromthymol blue as a PH indicator and having a pH adjusted to about 8 before use with a pH adjuster can be used. With this test agent, the case where the color tone changes from bluish purple to yellow may be determined as cephalosporinase positive.
  • kits for testing cephalosporinase which is a combination of a control test agent containing no antibiotic and the above-mentioned cephalosporinase test agent.
  • the use of this kit enables more accurate determination of cephalosporinase. Table 1 below shows the criteria used when using the cephalosporinase test agent and the kit of the present invention.
  • Cephalosbolinase test agent A of the present invention 7.5 g of cephaloridine as a substrate for cephalosporinase, 5 Omg of clavulanic acid as a penicillinase inhibitor, 10 mg of bromcrezo-inole purple as a pH indicator, and 25 mg of sodium hydroxide as a pH adjuster in sterile purified water (1 0 Oml). 0.02 ml of the solution was impregnated into a paper disk punched out of Toyo Filter Paper No. 526 filter paper to a diameter of 8 mm, and then dried by a conventional method.
  • Example 3 50 mg of bromthymol blue as a pH indicator and 25 mg of sodium hydroxide as a pH regulator were dissolved in methanol (100 ml). 0.02 ml of this solution was impregnated into a paper disc punched out from a filter paper of Toyo Filter Paper No. 526 to a diameter of 8 mm, and then dried by a conventional method.
  • methanol 100 ml
  • Penicillinase (benicillinase II) extracted and purified from B. ccreus:
  • Cephalosporinase (cephalosporinase A) extracted and purified from E. cloacae:
  • cephalosporinase SIGMA: CSase Type IV
  • This cephalosporinase is one of the typical cephalosporinases and has low hydrolytic activity against benicillin antibiotics.
  • cephalosporinase test agent of the present invention can correctly determine the enzyme type of ⁇ -lactamase.
  • cephalosporinase-active bacteria that hydrolyze using cephalosporin antibiotics as substrates can be determined to be cephalosporinase-negative for test bacteria that produce vesicillinase, / 9-lactamase This is useful because the enzyme type can be determined accurately and easily.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Cephalosporin Compounds (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Description

明 細 書
セファロスポリナーゼ検査剤 技術分野
この発明は、 セファロスポリナーゼ検査剤に関する。
さらに詳しくは、 この発明は細菌感染症の患者より分離された起因菌がセファ 口スポリナーゼ産生菌であるか否かを正確に判定することができるセファロスポ リナーゼ検査剤に関する。 背景技術
近年、 感染症の化学療法には /3—ラクタム系抗生物質が高頻度で使用されてい る。 しかし、 3—ラクタム系抗生物質であるセファロスポリン系抗生物質やべ二 シリン系抗生物質は、 それぞれ、 微生物が産生する β—ラウ夕マーゼであるセフ ァロスポリナーゼ、 ぺニシリナーゼにより分解されて抗菌活性を失う。 このため に、 患者の感染症の起因菌がS—ラクタマーゼ産生菌である場合には、 β—ラウ タム系抗生物質による治療効果は期待できないものとなる。 従って、 感染症の治 療にお t、て薬剤を選択する場合には、 感染症の起因菌が —ラクタマーゼ産生菌 であるか否かを予め判定しておくことが重要である。
従来、 3—ラクタマーゼを検出する場合には、 基質であるペニシリン系抗生物 質及び pH指示薬を含むぺニシリナーゼ検査剤と、 基質としてセファロスポリン系 抗生物質及び pH指示薬を含むセファロスポリナーゼ検査剤とを組み合わせて検出 していた。 これらの検査剤は、 被検菌がそれぞれぺニシリナーゼ産生菌、 セファ ロスポリナーゼ産生菌である場合に、 酵素の基質であるべニシリン系抗生物質、 セファロスポリン系抗生物質力伽水分解されて酸を生じ、 その結果、 検査剤に含 まれる pH指示薬が変色するものである。 従って、 両検査剤によって陽性と判断さ れる場合には、 被検菌はぺニシリナーゼ及びセファロスポリナーゼの両者を産生 する菌であると判定されていた。
一般にぺニシリナ一ゼはぺニシリン系抗生物質を特異的に加水分解し、 またセ ファロスポリナーゼ産生菌はセファロスポリン系抗生物質を特異的に加水分解す る。 しかし、 ぺニシリナーゼのなかにはぺニシリン系抗生物質のみならずセファ ロスポリン系抗生物質をも基質として加水分解するものが存在することが知られ ている。 この様なセファロスポリナーゼ活性ぺニシリナ一ゼを産生する菌を上記 の方法によつて判定した場合には、 t、ずれの検査剤にお t、ても陽性と判断されて しまう。 この結果、 実際にはぺニシリナーゼに分類される yS—ラクタマーゼを産 生する菌が、 ぺニシリナーゼ及びセファロスポリナーゼの両者を産生する菌であ ると 定されることになる。 そして、 このような誤判定が臨床における適切な 化学療法剤の選択を誤らせることがあつた。
従つて、 本発明は、 このような誤判定の可能性がなく、 正確かつ簡便に β -ラ クタマ一ゼの酵素型を判定することができる β—ラクタマーゼ検査剤を提供する ことを目的とする。特に、 セファロスポリン系抗生物質を分解するセファロスポ リナーゼ活性ぺニシリナーゼについての誤判定を排除したセファロスポリナーゼ 検査剤を提供することを目的とするものである。本発明者は種々の研究を行つた 結果、 セファロスポリナーゼを検出するにあたり、 酵素の基質であるセファロス ポリン系抗生物質の他に、 ぺニシリナーゼ阻害剤を配合したセファロスポリナー ゼ検査剤を提供することにより、 上記の目的が達成されることを見出した。 発明の開示
本発明によれば、 セファロスポリン系抗生物質、 該セファロスポリン系抗生物 質の重量に対して 2 0重量％以下のベニシリナーゼ阻害剤、 及び ρΗ指示薬を含む セファロスポリナーゼ検査剤が提供される。
本発明のセファロスポリナーゼ検査剤に含有されるぺニシリナーゼ阻害剤は、 セファロスポリン系抗生物質を加水分解するぺニシリナーゼの作用を阻害する。 その結果、 セファロスポリナーゼ活性ぺニシリナ一ゼを産生する菌は、 本発明の セファロスポリナーゼ検査剤によってセファロスポリナーゼ陰性と判定される。 —方、 セファロスポリナーゼは、 ぺニシリナーゼ阻害剤によっては影響されずに 基質であるセファロスポリン系抗生物質を加水分解するので、 セファロスポリナ 一ゼを産生する菌はセファロスポリナ一ゼ陽性と判定される。
さらに本発明によれば、 さらに ρΗ調節剤を含むセファロスポリナーゼ検査剤、 担体に担持されたセファロスボリナーゼ検査剤が提供される。
また、 上記のセファロスポリナーゼ検査剤と、 ぺニシリナーゼ阻害剤及び PH指 示薬を含む対照検査剤とを含む、 セファロスポリナーゼ検出用キットが提供され る。 発明を実施するための最良の形態
本発明のセファロスポリナーゼ検査剤に含有されるセファロスポリン系抗生物 質としては、 セファロスポリナーゼにより分解されて酸を与えるセファロスポリ ン系抗生物質ならば、 いかなるものも使用することができる。 該セファロスポリ ン系抗生物質の例としては、 例えば、 公知の入手可能なセファロスポリン系抗生 物質であるセファレキシン、 セファクロール、 セファログリシン、 セフア ドロキ シル、 セファトリジン、 セフアマンドール、 、 セフラジン、 セフロキサジン、 セ ファピリン、 セファロチン、 セファロリジン、 セフォチアム、 セフテゾ一ル、 セ ファゾリン、 セファセトリル等を挙げることができる。 これらのセファロスポリ ン系抗生物質の 1種または 2種以上を使用することができる。
本発明のセファロスポリナーゼ検査剤に含有されるぺニシリナーゼ阻害剤とし ては、 ぺニシリナ一ゼに特異的に作用し、 ぺニシリナーゼの活性を阻害するもの を使用すればよい。 この様なぺニシリナーゼ阻害剤の例として、 クラブラン酸を 挙げることができる。
本発明のセファロスポリナーゼ検査剤に含まれる該ぺニシリナーゼ阻害剤の配 合量は、 セファロスポリナーゼの作用に悪影響を与えず、 かつ充分にぺニシリナ ーゼの活性を阻害する量であればよい。 ぺニシリナーゼ阻害剤の配合量は、 使用 するセファロスポリン系抗生物質の種類、 ぺニシリナーゼ阻害剤の種類、 被検対 象となる —ラクタマーゼの種類によつて変化するので、 適宜増減されることが 好ましい。一般には、 ぺニシリナーゼ阻害剤の配合量は、 使用するセファロスポ リン系抗生物質の重量に対して 2 0重量％以下、 好ましくは 0. 5〜5. 0重量％で 配合すればよい。
本発明のセファロスポリナーゼ検査剤に含有される pH指示薬は、 セファロスポ リン系抗生物質がセファロスポリナーゼの作用により加水分解されて生じる酸に よる pHの低下を、 変色により検出するものである。 このような目的に合致する pH 指示薬ならばいかなるものを使用してもよい。例えば、 pHが約 8. 8以上のアル力 リ性から pHが約 7. 2以上の弱アル力リ性への変化を検出できる pH指示薬として、 クレゾ一ルレツドを挙げることができる。 中性から pHが約 5. 2以下の弱酸性への 変化を検出することができる pH指示薬としては、 ブロムフヱノールレッドを挙げ ることができる。 pHが 5〜 9の範囲に変色域を有する pH指示薬を使用することが 好ましい。 この様な pH指示薬として、 ブロムクレゾ一ルパープル、 ブロムチモー ルブルー、 ニュートラルレツド等を挙げることができる。 これらの pH指示薬は、 セファロスポリン系抗生物質の重量に対して、 通常 2重量％以下で使用してもよ い o
本発明のセファロスポリナーゼ検査剤は、 pH調節剤を含有してもよい。 pH調節 剤の例としては、 例えば水溶性塩基化合物である水酸化ナトリゥム、 水酸化力リ ゥム等をあげることができる。本発明のセファロスポリナーゼ検査剤の pHは、 こ れらの pH調節剤の添加により、 使用する pH指示薬の変色域よりも高い pHに調節す ることが好ましい。 該 pH調節剤は、 セファロスポリン系抗生物質の S4に対し、 例えば 2重量 以下で添加してもよい。
本発明のセファロスポリナーゼ検査剤は、 一般には、 固体若しくは溶液の形態 の組成物として製造すればよい。例えば、 固体の形態のセファロスポリナーゼ検 查剤を製造する場合には、 粉末形態の上記成分を、 ボールミル又はジエツトミル 等を用 i、て均一に混合することにより製造できる。調剤工程は、 例えば室温な t、 し室温以下で相対湿度 5 0 %以下の条件で行うことが好まし 、0溶液形態のセフ ァロスポリナーゼ検査剤を製造する場合には、例えば注射用蒸留水、 滅菌生理食 塩水、 滅菌精製水又はアルコール類等に上記の成分を溶解すればよい。例えば、 セファロスポリン系抗生物質の濃度が 5〜1 0重量％となる様に、 溶液形態のセ ファロスポリナ一ゼ検査剤を調製すればよい。 固体状態のセファロスポリナーゼ 検査剤を製造するにあたり、 上記の様にして製造した溶液形態のセファロスポリ ナ一ゼ検査剤を凍結乾燥してもよい。
本発明のセファロスポリナーゼ '検査剤の製造にあたり、 さらにポリビニルビ口 リ ドン等の添加剤を添加してもよい。 これらの添加剤は、 一般に 1重量％以下で 使用してもよい。 本発明のセファロスポリナーゼ検査剤は、 さらに培地組成物等 を含んでもよい。培地組成物の例としては、 寒天等を含むミューラーヒントンァ ガー、 ハートインフユ一ジョンァガー、 及びブレインハートインフュージョンァ ガー等を挙げることができる。 これらの培地組成物を使用する場合、 本発明のセ ファロスポリナーゼ検査剤は半固体の形態であつてもよい。
本発明のセファロスポリナーゼ検査剤の好適な態様として、 担体に担持された セファロスポリナーゼ検査剤を挙げることができる。 担体の例としては、 濾紙等 のセルロースフィルター；ポリビニルアルコ一ノレ製スポンジ等の合成樹脂フィル ター；多孔質のガラスであるグラスフィルター；ウレタンフォーム等の保水性高 分子製の吸収体；マイクロプレート等のマイクロウェル；素焼板等の多孔質セラ ミック ；毛細管現象を利用したキヤビラリ一等の吸収体を挙げることができる。 担体として、 セルロースフィルターを使用することが好ましい。
これらの担体に担持されたセファロスポリナーゼ検査剤を製造する方法の例と しては、 例えば、 上記の溶液形態の組成物をセルロースフィルタ一等の担体に含 浸させ、 さらに ^に応じて該フィルターを乾燥する方法、 キヤビラリ一等に溶 液形態の組成物を吸収させて、 に応じて密封する方法等を例示することがで きる。 溶液形態の組成物を含浸させたフィルターの乾燥は 6 0 °Cで 1時間行えば よい。 該乾燥工程により、 水分含量が 5 %以下のフィルターを得ることが好まし い。 さらに、 固体形態の組成物を担体に担持させる方法の例としては、 特公昭 58 一 2066号公報等に記載された方法を挙げることができる。
本発明のセファロスポリナーゼ検査剤を使用する方法の例としては、 被検菌を 培養した培地から被検菌コロニーを採取した後、 本発明のセファロスポリナーゼ 検査剤に塗抹する方法；及び本発明のセファロスポリナーゼ検査剤に濃厚菌液を 滴下する等の方法を挙げることができる。 セファロスポリナーゼ検査剤を使用す る上記の方法は、 典型的には、 試料を検査剤に塗抹する工程；該検査剤を室温、 好ましくは約 2 5。(：で約 2 0〜 3 0分放置する工程；及びセファロスポリナーゼ 検査剤の色調変化を観察する工程を含む。担体に担持された乾燥セファロスポリ ナ一ゼ検査剤を使用する場合、 上記の工程に加え、 使用に先立ち適量の滅菌精製 水、 滅菌生理食塩水等を該検査剤に含浸させる工程を含んでもよ L、。 本発明の特に好ましい態様として、 PH指示薬としてブロムチモールブルーを含 み、 pH調節剤により使用前の pHが約 8付近に調節されたセファロスポリナーゼ検 査剤を使用することができる。 この検査剤では、 色調が青紫色から黄色に変化し た場合をセファロスポリナーゼ陽性と判定すればよい。 また、 市販されているぺ ニシリナーゼ検査剤と組み合わせて本発明の検査剤を使用する場合には、 以下の 判定基準により^—ラクタマーゼの型が正確に判定できる。 さらに本発明によれ ば、 抗生物質を含有しない対照検査剤と上記のセファロスポリナ一ゼ検査剤とを 組み合わせたセファロスポリナーゼ検査用キッ卜が提供される。 このキットを使 用することにより、 セファロスポリナーゼについてさらに正確な判定が可能とな る。本発明のセファロスポリナーゼ検査剤及びキットを使用する場合の判定基準 を以下の表 1に示す。 表 1
Figure imgf000008_0001
以下に本発明を実施例によりさらに具体的に説明する力 本発明はこれらの実 施例に限定されることはない。
例 1
(1) ぺニシリナーゼ検査剤 A
ぺニシリナーゼの基質としてべンジルぺニシリンカリゥム 7. 5 g、 pH指示薬と してブロムクレゾ一ルパープル 5 O mg、 及び pH調節剤として水酸化ナトリウム 2 5 mgを滅菌精製水 ( 1 0 O ml) に溶解した。該溶液 0. 0 2 mlを、 東洋濾繊 0. 526 のフィルタ一ペーパーを直径 8画に打ち抜 t、たペーパーディスクに含浸させ、 そ の後常法により乾燥した。
(2) 本発明のセファロスボリナーゼ検査剤 A セファロスポリナ一ゼの基質としてセファロリジン 7.5 g、 ぺニシリナーゼ阻 害剤としてクラブラン酸 5 Omg、 pH指示薬としてブロムクレゾ一ノレパープル 1 0 mg、 及び pH調節剤として水酸化ナトリウム 25mgを滅菌精製水 （1 0 Oml) に溶解 した。該溶液 0.02mlを、 東洋濾紙 No.526のフィルターペーパーを直径 8咖に打 ち抜いたペーパーディスクに含浸させ、 その後常法により乾燥した。
(3)対照検査剤 A
pH指示薬としてブロムクレゾ一ノレパープル 5 Omg、 及び pH調節剤として水酸化 ナトリウム 25mgを滅菌精製水 (1 00 ml) に溶解した。 該溶液 0.02mlを、 東 洋濾紙 No.526のフィルターペーパーを直径 8画に打ち抜いたペーパーディスクに 含浸させ、 その後常法により乾燥した。 例 2
(1)ぺニシリナーゼ検査剤 B
ぺニシリナ一ゼの基質としてアンピシリンナトリウム 7.5 g、 pH指示薬として ブロムチモールブルー 50mg、 及び pH調節剤として水酸化ナトリウム 25mをメ 夕ノール （100ml) に溶解した。 該溶液 0.02mlを、 東洋濾紙 No.526のフィル ターペーパーを直径 8 mmに打ち抜いたペーパーディスクに含浸させ、 その後常法 により乾燥した。
(2)本発明のセファロスポリナーゼ検査剤 B
セファロスポリナーゼの基質としてセファゾリン 7.5 g、 ぺニシリナ一ゼ阻害 剤としてクラブラン酸 50mg、 pH指示薬としてブロムチモールブルー 50mg、 及 び pH調節剤として水酸化ナトリウム 25mを、 メタノール （ 100ml) に溶解し た。 該溶液 0.02mlを、 東洋濾紙 No.526のフィルターペーパーを直径 8讓に打ち 抜いたペーパーディスクに含浸させ、 その後常法により乾燥した。
(3)対照検査剤 B
pH指示薬としてブロムチモールブルー 50mg、 及び pH調節剤として水酸化ナト リウム 25mgをメタノール （1 00ml) に溶解した。 該溶液 0.02mlを、 東洋濾 紙 No.526のフィルターペーパーを直径 8 mmに打ち抜 C、たペーパーディスクに含浸 させ、 その後常法により乾燥した。 例 3
(1 ) ぺニシリナーゼ検査剤 C
ぺニシリナ一ゼの基質としてフエネチシリン 7. 5 g、 pH指示薬としてニュート ラルレッド 5 O mg. 及び pH調節剤として水酸化カリウム 2 5 を滅菌精製水 ( 1 0 O ml) に溶解した。 該溶液 0. 0 2 mlを、 東洋濾紙 No. 526のフィルターベー パーを直径 8■に打ち抜いたペーパーディスクに含浸させ、 その後常法により乾 燥した。
(2) 本発明のセファロスポリナーゼ検査剤 C
セファロスポリナ一ゼの基質としてセファロシンナトリゥム 7. 5 g、 ぺニシリ ナーゼ阻害剤としてクラブラン酸 5 O mg, pH指示薬としてニュートラルレツド 5 O mg、 及び pH調節剤として水酸化カリウム 2 5 mgを滅菌精製水 （1 0 O ml) に 溶解した。該溶液 0. 0 2 mlを、 東洋濾紙 No. 526のフィルターペーパーを直径 8 mm に打ち抜 、たペーパーディスクに含浸させ、 その後常法により乾燥した。
(3)対照検査剤 C
pH指示薬としてニュートラルレツド 5 0 mg、 及び pH調節剤として水酸化力リウ ム 2 5 mgを、 滅菌精製水 （1 0 O ml) に溶解した。該溶液 0. 0 2 mlを、 東洋濾紙 No. 526のフィルターペーパーを直径 8鲫に打ち抜 t、たペーパーディスクに含浸さ せ、 その後常法により乾燥した。
^—タクタマーゼ酵素液の調製
酵素型及び活性既知の β—ラウタマーゼを使用して、 一ラクタマ一ゼ を以下の様にして調製した。
(1) B. ccreus より抽出精製したぺニシリナーゼ（ベニシリナーゼ Α) ：
市販のぺニシリナ一ゼ (SIMGA: PCase Type I) を用い、 Ι ϋ/ml溶液として調製 した。 このぺニシリナーゼは典型的なぺニシリナーゼの 1つであり、 セファロス ポリン系抗生物質に対しての加水分解活性はほとんどない。
(2) E. cloacaeより抽出精製したセファロスポリナーゼ （セファロスポリナーゼ A) ：
市販のセファロスポリナーゼ (SIGMA: CSase Type IV)を用い、 l U/ml溶液とし て調製した。 このセファロスポリナ一ゼは典型的なセファロスポリナーゼの 1つ であり、 ベニシリン系抗生物質に対する加水分解活性は低い。
(3 ) E. cloacae由来のセファロスポリナーゼ活性ぺニシリナーゼ （ぺニシリナ一 ゼ B ) ：
井上らの方法 β—ラクタマ一ゼの検査法一酵素の活性測定と基質特異性の求 め方一、 検査と技術、 1 6 ( 3 ) ： 2 3 9〜2 4 3、 1 9 8 8年） に従い、 クロ ァカ菌 （E. cloacae) から抽出し、 1 U/ml溶液として調製した。 このぺニシリナ ーゼの酵素型はぺニシリナーゼに分類されるが、 ベニシリン系抗生物質及びセフ ァロスポリン系抗生物質の両者に対し、 強い加水分解活性を示す。
/S—ラクタマーゼの判定
例 1記載のぺニシリナーゼ検査剤 A、 セファロスポリナーゼ検査剤 A、 及び対 照検査剤 Aに、 上記の各 —ラクタマーゼ （5 /z 1 ) を塗抹し、 室温 （約 25°C) で 3 0分間放置した後、 表 1の評価基準に従って判定を行った。結果を以下の表 2に示す。 尚、 S—ラクタマーゼ検査剤として市販の /3—ラクタマーゼ検出ディ スク P C G及び C E R (セロテック社製） を使用して同様の判定を行った結果を 比較例として表 3に示す。 表 2 検査剤 シリナ-ゼ A セファロスポリナ-ゼ A ンリナ-ゼ B
シリナ-ゼ検査剤 A + +
セファロス ゼ検査剤 A +
対照検査剤 A
判定酵素型 ^シリナ-ゼ セフ 7ロスポリナ-ゼ ^シリナ-ゼ 表 3
Figure imgf000012_0001
例 4
I 0
(1) ぺニシリナ一ゼ検査剤 D
ぺニシリナ一ゼの基質としてべンジルぺ二シリンカリウム 7. 5 g、 ρΗί旨示薬と してブロムクレゾ一ルパープル 6 O mg. 及び PH調節剤として水酸化ナトリウム 4 O mgをイソプロパノール （1 0 O ml) に均一に分散させた。 該分散液 0. 0 2 ιβ1 を、 東洋濾紙 No. 526のフィルターペーパーを直径 8隱に打ち抜いたペーパーディ 5
スクに舍浸させ、 その後常法により乾燥した。
(2) 本発明のセファロスポリナーゼ検査剤 D
セファロスポリナ一ゼの基質としてセファロリジン 7. 5 g、 ぺニシリナーゼ阻 害剤としてクラブラン酸 2 5 0 mg、 pH指示薬としてブロムクレゾ一ルパープル 6 O mg. 及び PH調節剤として水酸化ナトリウム 1 2 O mgをイソプロパノール0
( 1 0. 0 ml) に均一に分散させた。 該分散液 0. 0 2 mlを、 東洋濾紙 526のフ ィルターペーパーを直径 8讓に打ち抜いたペーパーディスクに含浸させ、 その 後常法により乾燥した。
(3) 対照検査剤 D
pH指示薬としてブロムクレゾ一ルパープル 6 0 mg、 及び pH調節剤として水酸化5
ナトリウム 4 0 mgをィソプロパノール （1 0 0 ml) に均一に分散させた。 該分 散液 0. 0 2 mlを、東洋濾紙 No. 526のフィルターペーパーを直径 8画に打ち抜い たべ一パーディスクに含浸させ、 その後常法により乾燥した。
(4) 対照検査剤 E
セファロスポリナ一ゼの基質としてセファロリジン 7. 5 g、 PH指示薬としてブ ブロムクレゾールパープル 6 O mg、 及び PH調節剤として水酸化ナ ト リウム 1 2 O mgをイソプロパノール （1 0 O ml) に均一に分散させた。 該分散液 0. 0 2 mlを、 東洋濾紙 No. 526のフィルタ一^；ーパ一を直径 8 mmに打ち抜いたペーパーデ イスクに含浸させ、 その後常法により乾燥した。 一ラクタマーゼの判定
上記の検査剤を用いて、 A T C C標準株 （1 0菌種、 2 5株） 及び臨床分離株 ( 2 5菌種、 2 6 2株） の 2 8 7菌株について、 —ラクタマーゼの型を判定 した。 結果を表 4に示す。 対照検査剤 Eは本発明のセファロスポリナ一ゼ検査 ! 0 剤 Dに比して高いセファロスポリナーゼ陽性率を示したが、 陽性判定率 4 3. 9 %のうちには、 セファロスポリナ一ゼ産生ぺニシリナ一ゼをセファロスポリナ —ゼ陽性と判定した結果が含まれていた。 表 4
I 5
0
Figure imgf000013_0001
産業上の利用可能性
以上のように、 本発明のセファロスポリナーゼ検査剤は、 ^ーラクタマーゼの 酵素型を正しく判定できる。 特にセファロスポリン系抗生物質を基質として加水5 分解するセファロスポリナーゼ活性べ二シリナ一ゼを産生する被検菌に対して、 セファロスポリナーゼ陰性と判定することができ、 /9—ラクタマーゼの酵素型を 正確かつ簡便に判定することができるので有用である。

Claims

請求の範囲
1. セファロスポリン系抗生物質、 該セファロスポリン系抗生物質の重量に対し て 2 0重量％以下のぺニシリナーゼ阻害剤、 及び pH指示薬を含むセファロスポ
5 リナ—ゼ検査剤。
2. さらに pH調節剤を含む、 請求の範囲第 1項記載のセファロスポリナーゼ検査 剤。
3. 担体に担持された、 請求の範囲第 1項記載のセファロスポリナ一ゼ検査剤。
4. 該ぺニシリナーゼ阻害剤がクラプラン酸である、 請求の範囲第 1項に記載の 1 0 セファロスポリナーゼ検査剤。
5. 該 pH指示薬が pH 5ないし 9に変色域を有する pH指示薬である、 請求の範囲第 1項に記載のセファロスポリナ一ゼ検査剤。
6. 該ぺニシリナーゼ阻^がクラブラン酸であり、 該 pH指示薬がブロムクレゾ 一ルパープルである、 請求の範囲第 1項記載のセファロスポリナーゼ検査剤。
, 5 7. ベニシリナーゼ阻害剤及び pH指示薬を含む対照検査剤と請求の範囲第 1項な いし第 6項に記載の β—ラウタマーゼ検査剤とを含む、 セファロスポリナーゼ 検出用キット。
8. (a)セファロスポリン系抗生物質、 該セファロスポリン系抗生物質の重量に対 して 2 0重量％以下のベニシリナーゼ阻害剤、 及び pH指示薬を含むセファロス 0 ポリナーゼ検査剤に被検菌を含む試料を塗抹する工程、 及び (b)室温またはそれ 以下の温度で該検査剤を一定時間放置した後に 査剤の色調変化を観察する 工程を含むセファロスポリナーゼの検査方法。
PCT/JP1991/001732 1990-12-21 1991-12-18 Agent de detection de cephalosporinase WO1992011386A1 (fr)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP92901447A EP0563387B1 (en) 1990-12-21 1991-12-18 Cephalosporinase testing agent
US07/011,769 US5350680A (en) 1990-12-21 1991-12-18 Cephalosporinase testing agent
JP4501473A JP2966523B2 (ja) 1990-12-21 1991-12-18 セファロスポリナーゼ検査剤
DE69125850T DE69125850T2 (de) 1990-12-21 1991-12-18 Cephalosporinase-testagens

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2/405144 1990-12-21
JP40514490 1990-12-21

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO1992011386A1 true WO1992011386A1 (fr) 1992-07-09

Family

ID=18514777

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP1991/001732 WO1992011386A1 (fr) 1990-12-21 1991-12-18 Agent de detection de cephalosporinase

Country Status (7)

Country Link
US (1) US5350680A (ja)
EP (1) EP0563387B1 (ja)
AT (1) ATE152178T1 (ja)
AU (1) AU9098091A (ja)
CA (1) CA2088047C (ja)
DE (1) DE69125850T2 (ja)
WO (1) WO1992011386A1 (ja)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0538447A1 (en) * 1991-05-06 1993-04-28 Baxter Diagnostics Inc RAPID SORTING TEST INDUCING A PENICILLINASE.
JP2014200200A (ja) * 2013-04-05 2014-10-27 栄研化学株式会社 β−ラクタマーゼ検出方法

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20010008614A1 (en) * 1998-11-16 2001-07-19 Jack L. Aronowitz Sample collection system and method of use thereof

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1594001A (en) * 1977-03-16 1981-07-30 Beecham Group Ltd Pellets suitable for use in the testing of microorganisms
GB2128737B (en) * 1982-10-07 1986-02-05 Beecham Group Plc Antibiotic susceptibility test material
AU2584588A (en) * 1987-12-01 1989-06-01 Abbott Laboratories Antibiotic resistance testing assay
US5026638A (en) * 1988-07-27 1991-06-25 George Saperstein Antibiotic sensitivity test for pathogenic organisms present in mastitic milk

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Antimicrob Agents Chemother, Vol. 33, No. 3, (1989), K. BUSH "Classification of beta-Iactamases: Groups 1, 2a, 2b, and 2b'" p. 264-270. *
Chemotherapy, Vol. 36, No. 3, (1990), W. CULLMANN "Interaction of beta-lactamase inhibitors with various beta-lactamases" p. 200-208. *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0538447A1 (en) * 1991-05-06 1993-04-28 Baxter Diagnostics Inc RAPID SORTING TEST INDUCING A PENICILLINASE.
EP0538447A4 (en) * 1991-05-06 1993-12-01 Baxter Diagnostics Inc. Rapid inducible beta-lactamase screen test
US6043048A (en) * 1991-05-06 2000-03-28 Dade Microscan Inc. Rapid inducible beta-lactamase screen test
JP2014200200A (ja) * 2013-04-05 2014-10-27 栄研化学株式会社 β−ラクタマーゼ検出方法

Also Published As

Publication number Publication date
CA2088047A1 (en) 1992-06-22
CA2088047C (en) 1995-08-29
US5350680A (en) 1994-09-27
DE69125850D1 (de) 1997-05-28
EP0563387A4 (en) 1993-12-01
EP0563387A1 (en) 1993-10-06
ATE152178T1 (de) 1997-05-15
EP0563387B1 (en) 1997-04-23
AU9098091A (en) 1992-07-22
DE69125850T2 (de) 1997-11-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Richmond et al. Indirect method for assessing the penetration of beta-lactamase-nonsusceptible penicillins and cephalosporins in Escherichia coli strains
Butterworth et al. OLIVANIC ACIDS, A FAMILY OF β-LACTAM ANTIBIOTICS WITH β-LACTAMASE INHIBITORY PROPERTIES PRODUCED BY STREPTOMYCES SPECIES I. DETECTION, PROPERTIES AND FERMENTATION STUDIES
US20110245105A1 (en) Methods and Kits for Direct Detection and Susceptibility Profiling of Beta-Lactam Resistant Bacteria
Jones et al. In vitro evaluation of pyridine-2-azo-p-dimethylaniline cephalosporin, a new diagnostic chromogenic reagent, and comparison with nitrocefin, cephacetrile, and other beta-lactam compounds
EP1557473A1 (en) REAGENT COMPOSITION FOR DETECTING beta-LACTAMASE, DETECTION KIT AND DETECTION METHOD
EP0037932B1 (en) Determination of antibacterial agents
WO2003078654A1 (en) Device and method for detecting antibiotic inactivating enzymes
GB2049681A (en) Chromophoric cephalosporins and process for their manufacture
Georgopapadakou et al. Binding of monobactams to penicillin-binding proteins of Escherichia coli and Staphylococcus aureus: relation to antibacterial activity
WO1992011386A1 (fr) Agent de detection de cephalosporinase
CN112946138A (zh) 一种头孢他啶有关物质的测定方法
JP2966523B2 (ja) セファロスポリナーゼ検査剤
Rolinson The history and background of Augmentin
Eley et al. Characterization of β-lactamases in clinical isolates of Bacteroides
US4383032A (en) Reagent for the determination of β-lactamase
WO2006043558A1 (ja) 細菌が産生するβ－ラクタマーゼのクラスを識別する方法
Yamaguchi et al. PHOSPHOLIPID BILAYER PERMEABILITY OF beta;-LACTAM ANTIBIOTICS
CA1126138A (en) Microporous pellets for microorganism testing
O'Callaghan Irreversible effects of serum proteins on beta-lactam antibiotics
JP2004166694A (ja) β−ラクタマーゼ検出試薬組成物、検出キット及び検出方法
GB2128737A (en) Antiobiotic susceptibility test material
Presslitz et al. DD-carboxypeptidase and peptidoglycan transpeptidase from Pseudomonas aeruginosa
JP4669962B2 (ja) クラスＣ型β−ラクタマーゼ産生菌の簡易検出法
King et al. Sensitivity to carbenicillin and ticarcillin, and the beta-lactamases of Pseudomonas aeruginosa in the UK in 1978-79.
Burnett et al. Procedures for the assay of carbenicillin in body fluids

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AU CA JP KR US

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AT BE CH DE DK ES FR GB GR IT LU MC NL SE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2088047

Country of ref document: CA

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 1992901447

Country of ref document: EP

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 1992901447

Country of ref document: EP

WWG Wipo information: grant in national office

Ref document number: 1992901447

Country of ref document: EP